KR20090006837A - 전립선 암 진단용 생물표지자 및 그의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 전립선암의 존재를 나타내는 건강상태를 예견하는 방법을 성명한 것이다. 이 방법은 건강 상태가 결정되지 않은 환자의 혈액시료에서 채취한 소위 대사산물이라 불리는 특이적인 저분자 생화학물질의 강도를 측정하고, 이 강도를 건강한 개체군에서 발견되는 강도 및/또는 전립선암-양성 개체로 확인된 군에서 이미 발견된 강도와 비교한다. 이 방법에 의해 검색 환자에 대하여 전립선암의 양성 가능성을 결정할 전문가가 될 수 있다.
Description
[0001] 본 발명은 임상적으로 전립선암-양성으로 진단된 환자와 정상 환자 간에 유의하게 다른 양 또는 강도를 가지는 것으로 보이는 저분자 또는 대사산물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 전립선 암 또는 전립선암으로 발전할 위험을 진단하는 방법에 관한 것이다.
[0002] 전립선암은 일생동안 일곱 명의 남성중에 한 명꼴로 발병하는 것으로, 미국에서만 년간 200,000명 이상 진단되고, 30,000명 이상 죽는다(1). 이것은 남성의 암으로 인한 사망의 두 번째 원인이다. 현재 전립선암의 검색방법은 혈액 시료내의 전립선-특이적인 항원 수준을 검출하는 전립선-특이적인 항원(prostate-specific antigen (PSA)) 시험법 및 디지털 직장 조사법(DRE)을 포함한다. 미국의 발병 위험이 있는 남성의 60-70%에서 PSA 검사법으로 검사를 수행하고 있지만, 전립선암 사망률은 아주 경미할 정도로만 감소하였다. 이것은 크게 두 가지 이유에 의해 기인된다: 1) PSA 검사법이 활동적인 암의 한 서브세트를 동정하는데 실패 한 점, 2) PSA 양성 검사의 약 30% 남성 만 양성 생체검사결과를 보이는 점. 다른 경우에서 일부 종양은 절대 진행되지 않아서, 치료하지 않고 놔두는 것이 더 좋을 수도 있는데 반해, 전립암 치료를 받은 남성의 약 25%는 병이 재발하여 추가적인 치료를 필요로 한다는 점에서 진단은 더 복잡해진다. 그러므로, 현재 전립선암 진단의 주요한 논점은 질병 진행의 예견에 무력하다는 것이다. 더불어, 이 통계학은 전통적인 방법의 전립선 검색이 논쟁거리가 있는 논점이 되게 하였다. 그러므로, 이상적인 전립선암 생물표지자(들)은 초기 검출에 적합할 뿐만 아니라, 질병 활동성을 예견하는 능력을 가지며, 치료하는 동안 또는 수술 후에 진행되는 질병을 이상적으로 모니터할 수 있을 것이다.
[0003] 현재, PSA는 전립선암을 위한 가장 활용적인 혈청 표지자로 인식되지만, 개선될 상당한 여지가 있다. 1990년대 초반에 시작된, PSA 검사법의 효과는 총 사망률의 감소와 동시에, 암의 전이(metastasis)로 진단된 남성수의 감소를 확인할 수 있다(2). 그러나, 이것은 PSA 검사법이 전립선암의 인식을 증가시켰다는 점에서 기인한 것이며, 이것이 더 많은 생체검사 분석을 하도록 극도로 자극하였다. PSA 검사의 수행특성(민감성과 특이성) 산출은 발병률에서 민족성과 관련된 차이 때문에 어렵고, 대부분의 연구에서, 생체검사의 백분율은 임상시험에서 일반적으로 수행되는 것보다 높게 수행된다. 전립선 암 예방 시험(PCPT)에서(3), 고질의 종양 검출에 대한 가짜-음성율은 최소 15%이고, 가짜-양성율은 70%이다(즉, 증가된 PSA 남성의 30%만 양성 생체검사결과를 보임). 내과 의사의 보건 연구(the Physician's Health Study)인 다른 연구(4)에서, 4년 이상 활동적인 암에 대한 민 감성은 87%였으나, 비활동적인 암에 대하여서는 53%로 떨어졌다. PSA 민감성을 평가하기위한 많은 다른 연구들이 수행되었지만, 가장 최근의 발견은 최대 73%의 민감성을 주장한다(5). PSA 역치를 낮추면 더 많은 암을 검출할 수는 있지만, 더 많은 가짜-양성 및 그 결과로서 더 많은 생체검사에 대한 비용이 들 것이다. 더욱 혼동스럽게도, 4 ng/ml 의 중간치(cut-point)를 갖는 PSA 검사법에 대한 민감성이 나이에 따라 감소하는 것으로 보이는데, 이것은 노령화 남성 인구에서 증가된 양성 전립선 과형성(benign prostatic hyperplasia (BPH))의 유행에 기인하는 것으로 나타난다.
[0004] PSA 단독으로는 전립선암을 진단할 수 없다. 진단은 물리적 조사, PSA 검사, 그리슨(Gleason) 정도(생체검사 시 선(glandular) 구조의 평가 정도) 및 가능한 다른 연구검사법의 결과들을 통합하여 포함하는 복잡한 과정이다.
[0005] 전립선암 검출을 개선시킬 필요가 있는 것은 명백하다. 전립선암의 위험 또는 존재를 검출할 수 있거나 높은 특이성과 민감성을 가지는 활동적인 질병을 예측할 수 있는 검사는, 전립선암 이병율에 매우 유용할 것이며 밀접할 것이다. 본 발명에서 청구되는 내용은 전립선암 환자와 정상 개체의 과하다게 차별화된 패턴을 보이는 혈청 시료에 존재하는 분자를 발견한 것에 대해 설명한다.
<본 발명의 요약>
[0006] 본 발명은 임상적으로 전립선암-양성으로 진단된 환자와 정상 환자 간에 유의하게 다른 양 또는 강도를 가지는 것으로 보이는 저분자 또는 대사산물 에 관한 것이다. 또한 본 발명은 전립선암 또는 전립선암으로 발전할 위험을 진단하는 방법에 관한 것이다.
[0007] 본 발명은 전립선암의 건강-상태 지표를 진단하기 위한 초고속 처리 검색법(high-throughput screening (HTS) assay)의 동정, 입증 및 실행하는 방법을 제공한다. 구체적인 예시에서, 그 방법은, 하기의 목적을 위하여, 전립선암-특이적인 또는 정상의 생물학적 시료의 분석에 비-표적화 FTMS 기술을 사용하여 정상과 전립선암-양성 생물학 시료간의 차이가 있는, 통계적으로 유의한 모든 대사산물의 특징을 동정한 후, 통계학과 분자의 화학적 성질을 이용하여 최적의 특징 하부세트를 선별하고, 및 크래마토그래피 분석법, 질량분광분석법(MS/MS), 핵자기공명장치(NMR)를 포함하나 이에 한정되지 않는 방법으로 특징 세트를 특징화하여 수행된다:
1. 대사산물의 지연시간을 분리 및 동정;
2. 각각의 대사산물에 특이적인, 도형화된 MS/MS 단편 패턴의 제작;
3. 분자 구조의 특징화; 및
4. 고속 처리 정량 또는 세미-정량 MS/MS에 기초한 진단 검사법의 개발.
[0008] 본 발명은 시료에 존재하는 특이적인 저분자의 수준을 측정하여 "정상" 참조의 수준과 비교함으로써 인간의 전립선암 또는 전립선암 발전 위험을 진단하는 방법을 더 제공한다. 또한, 그 방법은 대사산물로 언급되는 특이적인 저분자의 강도를 환자의 시료에서 측정하고 건강한 개체군들에서 관찰되는 강도와 비교한다.
[0009] 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 하나 또는 그 이상의 전립선암 진단용 대사산물 표지자를 동정하는 방법을 제공한다:
a) 하나 또는 그 이상의 전립선암 환자로부터 얻은 다수의 대사산물이 함유된 하나 또는 그 이상의 시료를 고해상 질량 분광계에 도입하는 단계;
b) 대사산물의 정량 데이터를 획득하는 단계;
c) 상기 정량 데이터의 데이터베이스를 생성하는 단계;
d) 시료로 부터 동정하고 정량한 상기 데이터를 하나 또는 그 이상의 참조 시료 중의 하나의 시료의 대응되는 데이터와 비교하는 단계; 및
e) 상기 시료와 하나 또는 그 이상의 상기 참조 시료간의 차이가 있는 하나 또는 그 이상의 대사산물 지표를 동정하는 단계.
[0010] 대사산물 표지자는 표 1에 나열된 대사산물 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 이 방법은 최적의 진단에 필요한 최소수의 대사산물 표지자를 선별하는 것을 더 포함할 수도 있다. 고해상 질량 분광계는 푸리에 변이 이온 사이클로트론 공명 질량 분광계(Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer (FTMS))일 수 있다.
[0011] 또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 환자에서 전립선암 또는 전립선암의 위험을 진단하는 방법을 제공한다:
a) 상기 환자로부터 시료를 획득하는 단계;
b) 상기 시료를 분석하여 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자에 대한 정량 데이터를 획득하는 단계;
c) 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자에 대한 정량 데이터를 하나 또는 그 이상의 참조 시료에서 획득한 대응되는 데이터와 비교하는 단계; 및
d) 상기 비교를 이용하여 전립선암 또는 전립선암의 위험을 차별적으로 진단하는 단계.
[0012] 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자는 표 1에 나열된 대사산물 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 상기 진단 방법은 단계 b)에서 액체 크로마토그래피 질량 분광분석(liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS))에 의한 시료분석을 포함할 수 있다. 양자택일로, 그 방법이 초고속 처리 방법일 때는, 단계 b)는 액체 크로마토그래피 또는 직접 주입한 다음, 선형 이온 트랩 직렬 질량 분광분석(linear ion trap tandem mass spetrometery)에 의한 시료분석을 포함할 수 있다.
[0013 ] 상기에서 기술한 방법에서, 하나 또는 그 이상의 참조 시료는 대조 개체에서 채취한 다수의 시료; 초기 환자에서 채취한 하나 또는 그 이상의 기준선 시료 ; 또는 그의 조합일 수 있다.
[0014] 본 발명의 다른 실시예에서, 하기 단계를 포함하는, 환자에서 전립선암 또는 전립선암의 위험을 진단하기 위한 방법을 제공한다:
a) 상기 환자로부터 시료를 획득하는 단계;
b) 상기 시료를 분석하여 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자에 대한 정량 데이터를 획득하는 단계;
c) 내부 대조 대사산물에 대한 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자 각각의 비율을 획득하는 단계;
d) 내부 대조 대사산물에 대한 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자의 각각의 비율을, 하나 또는 그 이상의 참조시료로부터 획득한 대응되는 데이터와 비교하는 단계; 및
e) 상기 비교를 이용하여 전립선암 또는 전립선암의 위험을 진단하는 단계.
[0015] 상기 진단 방법은 표 1에 나열된 대사산물 또는 그의 조합으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자를 포함할 수 있다. 상기 진단 방법은 단계 b)에서 액체 크로마토그래피 질량 분광분석(LC-MS)에 의한 시료분석을 포함할 수 있다. 양자택일로, 그 방법이 초고속 처리 방법일 때는, 단계 b)는 직접 주입 또는 액체 크로마토그래피 및 선형 이온 트랩 직렬 질량 분광분석에 의한 시료분석을 포함할 수 있다.
[0016] 상기에 기술된 방법에서, 하나 또는 그 이상의 참조 시료는 대조 개체에서 채취한 다수의 시료; 초기 환자에서 채취한 하나 또는 그 이상의 기준선 시료; 또는 그의 조합일 수 있다.
[0017] 본 발명은, 하기를 포함하는 전립선암 환자를 치료하기위한 치료 효능성을 평가하는 방법을 더 제공한다:
a) 상기 환자로부터 시료를 획득하는 단계;
b) 상기 시료를 분석하여 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자에 대한 정량 데이터를 획득하는 단계;
c) 상기 정량 데이터를 하나 또는 그 이상의 참조시료로부터 획득한 대응되 는 데이터와 비교하는 단계; 및
d) 상기 비교를 이용하여 이 치료가 환자의 건강상태를 호전시킬 것인지를 결정하는 단계,
[0018] 여기에서 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자는 표 1에 나열된 대사산물 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 상기 진단 방법은 단계 b)에서 액체 크로마토그래피 질량 분광분석(LC-MS)에 의한 시료분석을 포함할 수 있다. 양자택일로, 그 방법이 초고속 처리 방법일 때는, 단계 b)는 직접 주입 또는 액체 크로마토그래피 및 선형 이온 트랩 직렬 질량 분광분석에 의한 시료분석을 포함할 수 있다.
[0019] 상기에 기술된 방법에서, 하나 또는 그 이상의 참조 시료는 대조 개체에서 채취한 다수의 시료; 환자에서 채취한 하나 또는 그 이상의 치료전 기준선 시료; 또는 그의 조합일 수 있다.
[0020] 본 발명의 또 다른 실시예에서, 하기를 포함하는, 전립선암을 치료하기 위한 치료 효능성을 평가하는 방법을 제공한다:
a) 상기 환자로부터 시료를 획득하는 단계;
b) 상기 시료를 분석하여 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자에 대한 정량 데이터를 획득하는 단계;
c) 내부 대조 대사산물에 대한 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자 각각의 비율을 획득하는 단계;
d) 내부 대조 대사산물에 대한 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자의 각각의 비율을, 하나 또는 그 이상의 참조시료로부터 획득한 대응되는 데이터와 비 교하는 단계; 및
e) 상기 비교를 이용하여 이 치료가 환자의 건강상태를 호전시킬 것인지를 결정하는 단계,
[0021 ] 여기에서 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자는 표 1에 나열된 대사산물 또는 그의 조합으로부터 선택된다. 상기 진단 방법은 단계 b)에서 액체 크로마토그래피 질량 분광분석(LC-MS)에 의한 시료분석을 포함할 수 있다. 양자택일로, 그 방법이 초고속 처리 방법일 때는, 단계 b)는 직접 주입 또는 액체 크로마토그래피 및 선형 이온 트랩 직렬 질량 분광분석에 의한 시료분석을 포함할 수 있다.
[0022] 상기에 기술된 방법에서, 하나 또는 그 이상의 참조 시료는 대조 개체에서 채취한 다수의 시료; 환자에서 채취한 하나 또는 그 이상의 치료 전 기준선 시료; 또는 그의 조합일 수 있다.
[0023] 본 명세서에 기술된 방법은 전립선암을 모니터 하기 위한 다른 방법, 예를 들어 PSA 검사와 조합될 수 있다.
[0024] 상기에서 기술된 진단방법 및 치료 효능성의 평가방법에서, 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자는 라이소포스파티딜콜린, 라이소포스파티딜에탄올아민, 라이소포스파티딜디메틸에탄올아민, 라이소포스파티딜세린, 라이소스핑고실포스포릴콜린, 라이소포스파티딜글리세롤, 라이소포스파티딜이노시톨을 포함하는 라이소포스포리피드, 혈소판 활성화 인자 (PAFs) 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자는 a) 495.3328, b) 517.3148, c) 519.3328, d) 521.3480, e) 523.3640, f) 541.3148, g) 545.3460,h) 481.3171, i) 531.3123, j) 541.3422, k) 555.3101, 1) 565.3394, m) 567.3546 및 n) 569.3687 달톤의 정밀질량 또는 실질적으로 등가인 대사산물을 포함할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 대사산물에 대한 정량 데이터를 비교하는 방법에서, 이들 대사산물들이 전립선암 환자에서 감소되어 관찰되었다. 하나 또는 그 이상의 대사산물 대 내부 대조 대사산물의 비율을 비교하는 방법에서, 내부 대조 대사산물에 대산 대사산물의 비율이 전립선암 환자에서 감소된다.
[0025] 대사산물 a)- g)는 라이소포스파티딜콜린-관련 화합물이고, 대사산물 h)- n)은 가상의 N,N-디메틸 라이소포스파티딜에탄올아민-관련 화합물이다. 대사산물 a)- n)은 각각 a) 도 7에 보여지는 MS/MS 스펙트럼 및/또는 표 3에 기술된 결과; b) 도 8에 보여지는 및/또는 표4에 기술된 결과; c) 도 9에 보여지는 및/또는 표 5에 기술된 결과; d) 도 10에 보여지는 및/또는 표 6에 기술된 결과; e) 도 11에 보여지는 및/또는 표 7에 기술된 결과; f) 도 12에 보여지는 및/또는 도 8에 기술된 결과; g) 도 13 및/또는 표 9에 기술된 결과; h) 도 14, 및/또는 표 12에 기술된 결과; i) 도 15 및/또는 표 13에 기술된 결과; j) 도 16 및/또는 표 14에 기술된 결과; k) 도 17에 보여지는 및/또는 표 15에 기술된 결과; 1) 도 18에 보여지는 및/또는 표 16에 기술된 결과; m) 도 19에 보여지는 및/또는 표 17에 기술된 결과; 및 n) 도 20 및/또는 표 18에 기술된 결에서 보여지는 각각의 MS/MS 스펙트럼에 의해 더 특징될 수 있다.
[0026] 추가적으로, 상기의 하나 또는 그 이상의 대사산물은, 각각 분자식 a) C24H50NO7P, b) C26H48NO7P, c) C26H5oN07P, d) C26H52NO7P, e) C26H54NO7P, f) C28H48NO7P, g) C28H52NO7P, h) C23H48NO7P, i) C30H46NO5P, j) C25H52NO9P, k) C25H50NO10P, 1) C27H52NO9P, m) C27H54NO9P 및 n) C27H56NO9P으로 더 특징화 될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 대사산물의 구조는 각각 하기로서 특징될 수 있다:
[0027] 또한 본 발명은 신규한 화합물을 제공한다. 이들 화합물은 정밀질량이 a) 531.3123, b) 541.3422, c) 555.3101, d) 565.3394, e) 567.3546, 및 f) 569.3687 달톤으로 측정되거나 실질적으로 등가의 대사산물들로 구성되는 군으로부터 선택된다.
[0028] 상기에서 기술된 화합물들은,
a) 도 15 및/또는 표 13에 기술된 결과;
b) 도 16 및/또는 표 14에 기술된 결과;
c) 도 17 및/또는 표 15에 기술된 결과;
d) 도 18 및/또는 표 16에 기술된 결과;
e) 도 19 및/또는 표 17에 기술된 결과; 및
f) 도 20 및/또는 표 18에 기술된 결과에서 보여지는 각각의 MS/MS 스펙트럼 에 의해 더 특징될 수 있다.
[0029] 마찬가지로, 상기에서 기술된 화합물들은 각각 표 12 내지 18에서 보여지는 MS/MS 스펙트럼에 의해 더 특징될 수 있다.
[0030] 또한 화합물들은 각각 분자식 a) C30H46NO5P, b) C25H52NO9P, c) C25H50NO10P, d) C27H52NO9P, e) C27H54NO9P 및 f) C27H56NO9P 으로 더 특징화될 수 있다. 추가로, 화합물은
각각의 가상의 구조로 더 특징될 수 있다.
[0031 ] 본 발명의 신규한 화합물들은 전립선암의 진단 또는 환자에서 전립선암의 치료 효능성을 평가하기 위한 용도로 사용될 수 있다.
[0032] 본 발명은 전립선암 또는 전립선암의 위험에 대한 검출 능력에 유의하게 영향을 미칠지도 모르며, 생명을 구할 수도 있다. 이들 시료에 기초를 둔 검사의 통계학적인 성과는, 이 검사가 전립선암에 대한 혈청에 기초를 둔 다른 진단검사인 PSA 검사를 능가할 것이라는 것을 제시한다. 양자택일로, 이 명세서에 기술된 방법 및 PSA 검사의 조합은 각 검사의 전체적인 진단 성과를 향상시킬 것이다.
[0033] HTS 검사를 포함한 본 발명의 방법은 하기에 사용될 수 있으며, 여기에서 언급한 특이적인 "건강-상태"는 전립선암에 관한 것이나, 이에 한정되지 않는다:
[0034] 1. 각 개체에서 채취한 혈청 시료와 같은 어떤 생물학적 시료를 이용하여 전립선 암-양성 개체들 및 전립선 암-음성 개체들 간에 구별될 수 있는 저분자 대사산물 생물표지자를 동정할 때;
[0035] 2. 혈청, 혈장, 전혈 및/또는 이 명세서에 기재된 기타 조직의 생검과 같은 시료에서 동정된 대사산물을 이용하여 전립선암을 특이적으로 진단할 때;
[0036] 3. 단일변이 또는 다중변이 통계학적인 방법 및 이 명세서에 언급된 분자에 대한 관련된 화학정보를 이용한 최적의 진단 검사 수행 통계학에 요구되는 최소수의 대사산물 특징을 선택할 때;
[0037] 4. LC-MS/MS, MS" 및 NMR을 이용한 비표적화 대사체학적 분석으로부터 선택된 대사산물 생물표지자의 구조적인 특성을 동정할 때;
[0038] 5. 시료에서 선택된 대사산물 수준을 검사하기 위하여 초고속 3중-4 중극 MS/MS 방법을 개발할 때;
[0039] 6. 질량 분광계, NMR, UV 검출, ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay), 화학반응, 영상 분석 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 어떠한 방법을 이용하여 환자 시료의 FTMS 분석에서 밝혀진 대사산물 특성의 어떤 조합 수준을 결정하여 전립선암 또는 전립선암으로 발전할 위험을 진단할 때;
[0040] 7. 약물 (화학치료), 방사선 치료, 외과수술, 식이요법, 생활스타일의 효과 등을 포함하는, 전립선암의 어떠한 치료학적 처리를 모니터링할 때; 및/또는
[0041] 9. 이 방법에서 밝혀진 특징의 어떤 단독 또는 조합으로 전립선암의 일반적인 개체군의 장기적인 모니터링 또는 검색 시.
[0042] 전립선암의 진단에서의 본 발명의 효과는 대단할 것이며, 이는 위험을 평가하는데 있어서 사실상 모든 사람에 대하여 그들의 일생을 통하여 장기간에 걸쳐 검색할 수 있기 때문이다. 본 발명의 검사의 수행 특성이 일반적인 개체군(일반인)에 대하여 대표적임을 감안한다면, 이 검사 단독은 현재 활용가능한 다른 어떠한 검색방법보다 우수할 것이며, 이는 이 검사법이 위급한 임상적 증상이 나타나기 전에 질병의 경과를 검출하는 잠재성을 가질 수 있기 때문이다.
[0043] 본 발명의 요약은 발명의 모든 특징을 서술할 필요는 없다.
[0069] 본 발명은 임상적으로 전립선암-양성으로 진단된 환자와 정상 환자 간에 유의하게 차이가 있는 양 또는 강도를 가지는 것으로 보이는 저분자 또는 대사산물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 전립선 암 또는 전립선암으로 발전할 위험을 진단하는 방법에 관한 것이다.
[0070] 본 발명은 전립선암에 대한 진단방법의 발견, 확인 및 수단의 새로운 방법을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서, 하기 단계를 포함하는 전립선암을 진단하기위한 특이적인 생물표지자를 동정하는 방법을 제공한다: 하나 또는 그 이상의 전립선암 환자로 부터 얻은, 다수의 대사산물을 포함하는 하나 또는 그 이상의 시료를 고해상 질량 분광계(예를 들면, 푸리에 변형 이온 싸이클로트론 공명 질량 분광계 (FTMS)이나, 이에 한정되지 않는)에 도입하는 단계; 대사산물에 대한 데이터를 획득, 동정, 정량하는 단계; 상기 정량 데이터의 데이터베이스를 구출하는 단계; 상기 시료로 부터 얻은 정량 데이터를 대조 환자로 부터 얻은 하나 또는 그 이상의 시료로 부터 획득한 대응되는 데이터와 비교하는 단계; 차이가 있는 하나 또는 그 이상의 대사산물을 동정하는 단계. 본 발명의 방법에 의해 동정된 대사산물 표지자들은 표 1에 나열된 대사산물들을 포함할 수 있다. 이 방법은 최적의 진단을 위해 필요한 최소수의 대사산물 표지자를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
[0071] 특별한 개체군에서 주어진 건강 상태의 생화학적 표지자를 결정하기 위하여, 건강 상태(즉 특별한 질병) 의 환자 대표 그룹 및/또는 "정상" 또는 "대조군" 대조구 그룹(즉, 특별한 건강상태에 대한 고통이 없는 개체)이 요구된다. 그런 다음, 특별한 건강상태의 환자에서 채취한 생물 시료는 두 그룹간의 생화학적 차이를 동정하는 바램에서 정상 개체군에서 채취한 동일 시료뿐 만 아니라 유사한 건강 상태 카테고리의 환자와 비교될 수 있으며, 비교 방법은 FTMS 및/또는 LC-MS를 포함하는 분석방법을 이용하여 시료 내에 존재하는 생화학물을 분석하는 것이나, 이에 한정되지 않는다.
[0072] 상기에서 상술한 바와 같이 대사산물 표지자의 발견 방법은, 비표적화 대사체학적 전략법 또는 방법으로 수행될 수 있다. 다중 비표적화 대사체학 전략법은 NMR (6), GC-MS (7), LC-MS (8) 및 FTMS 전략법 (9-11)을 포함하며, 과학문헌에 설명되어 있다. 본 발명에서 차별적으로 발현되는 대사산물의 발견에 기여하는 대사적 프로파일링 전략법은 페노미넘 디스커버리사에 의한 비표적화된 FTMS 전략법이었다[21, 24-27; 미합중국 공개출원번호 제 2004-0029120 A1, 캐나다 출원번호 제 2,298,181 호 및 국제공개출원번호 제 0157518 호 참조]. 비표적화 분석은, 분석 전에 어떠한 사전 지식이나 성분의 선별없이, 시료에서 가능한 많은 분자를 측정하는 것을 포함한다. 그러므로, 신규한 대사산물 생물표지자를 발견하려는 비표적화 분석의 잠재성은, 미리 정해진 분자 리스트를 검출하는 표적화 방법에 비해 높다. 본 발명은 전립선암 개체와 대조 개체(즉, 전림선암이 걸리지 않은 개체)간에 차이가 있는 혈청시료의 대사산물 성분을 동정하는 비표적화 방법을 사용한다. 예컨대, 대사산물을 검출하는 기타의 방법으로는 예를 들어, MS에 기초한 플랫폼, ELISA, 비색 측정분석 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
[0073] 그러나, 이 분야에 숙련된 사람은 알 수 있는 것으로써, 다른 대사산물 프로파일링 전략법이 본 발명에서 밝혀진 차별적으로 조절된 대사산물의 일부 또는 전부를 발견하는데 사용될 수 있으며, 여기에서 설명되나, 발견되거나 측정되지 않은 대사산물들은 그것들을 검출하고 측정하기위해 사용될 수 있는 분석 기술에 독립적인, 독특한 화학적 실체를 나타낸다.
[0074] 또한 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 환자에서 전립선암 또는 전립선암으로 발전할 위험을 진단하는 방법을 제공한다:
a) 상기 환자로부터 시료를 획득하는 단계;
b) 상기 시료를 분석하여 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자에 대한 정량 데이터를 획득하는 단계;
c) 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자에 대한 정량 데이터를 하나 또는 그 이상의 참조 시료에서 획득한 대응되는 데이터와 비교하는 단계; 및
d) 상기 비교를 이용하여 전립선암 또는 전립선암의 위험을 진단하는 단계.
[0075] 시료를 분석하는 단계(단계 b)는 질량 분광계(MS)를 이용하여 시료를 분석하는 것을 포함한다. 예를 들어, 어떤 질량 분광계는 FTMS, 오비트랩, 비행시간(time-of-flight; TOF) 또는 4 중극 형태가 될 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다. 양자택일로, 질량 분광계는 추가적인 전-검출기 질량 필터를 갖출 수도 있다. 예를 들면, 어떤 기기는 일반적으로 4중극-FTMS (Q-FTMS), 4중극 -TOF (Q-TOF) 또는 3중 4중극 (TQ 또는 QQQ)으로 언급되는 기기이며, 이에 한정되지 않는다. 추가로, 질량 분광계는 모이온 검출 모드(MS) 또는 MSn 모드에서 작동될 수도 있으며, 여기에서 n>=2이다. MSn은 충돌 유발 분해(collision induced dissociation (CID)) 또는 단편 이온을 만들기 위한 다른 단편화 과정에 의해 모이온이 단편화되는 곳이며, 그런 다음 하나 또는 그 이상의 상기 단편이 질량 분광계에서 검출된다. 그 때, 어떤 단편은 그 이상의 단편을 만들기 위하여 더 단편화될 수 있다. 양자택일로, 시료는 액체 또는 가스 크로마토그래피 시스템을 이용하거나 직접 주입법에 의해 도입할 수도 있다.
[0076] 본 발명의 방법에서, 어떤 형태의 생물시료는 신체의 어느 곳에서부터 유래될 수 있으며, 예를 들어, 혈액(혈청/혈장), CSF, 소변, 대변(stool), 입김(breath), 침, 또는 종양, 인근 정상 조직, 평활근 및 골격근, 지방조직, 간, 피부, 모발, 뇌, 신장, 췌장, 허파, 대장, 위장 또는 다른 부분의 일부 고형 조직의 생검이 사용되며, 이에 한정되지 않는다. 특히, 혈청 시료가 흥미로운 대상이다. 또한, 이 명세서에서, 용어,"혈청"이 사용되었으나, 혈장 또는 전혈 또는 전혈의 아분획(sub-fraction)도 사용될 수 있다는 것을 이 분야의 기술자라면 누구나 알 수 있다.
[0077] 생물 시료는 정상 및 전립선암-양성 그룹에서, 나이, 민족성, 체중, 직업 및 다양한 비-전립선암 관련 건강상태 범위의 다양한 개체군으로부터 채취될 수도 있다. 그러나, 이 방법에서 대상 선택이 데이터세트에 더욱 다양성을 부여하고, 결국 더욱 확고한 생물표지자 세트에 기인하는, 잠재적인 혼란편견을 줄인다(많은 다른 변수의 존재에서도 여전히 질병을 검출할 수 있기 때문이다).
[0078] 비-제한 시료에서 혈액시료가 환자로부터 채취되면, 몇 가지 방법으로 시료를 처리할 수 있다. 처리 과정의 범위는, 거의 아무것도 하지 않거나(즉, 전혈 냉동), 특정 세포 타입을 분리하는 것 처럼 복잡할 수 있다. 가장 일반적이고 일상적인 처리과정은 전혈로부터 혈청이나 혈장을 분리하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명에서, 거름종이 또는 다른 부동성 재료와 같은 고형상 지지대에 혈액 시료를 떨어뜨리는 것을 포함하는 모든 혈액시료 처리방법이 고려되어진다.
[0079] 어떠한 방법에 한정되지는 않겠지만, 상기에 기술된 처리 혈액이나 혈청 또는 시료는, 처리 혈청 또는 혈액 시료 내에 함유된 대사물질들을 검출하고 측정하는 방법적인 분석 기술과 호환 가능하도록 추가적으로 처리될 수 있다. 처리 형태는 추가 처리가 없는 최소한의 공정에서부터 미분 추출 및 화학적 유도체화와 같은 복잡한 공정의 범위로 분류될 수 있다. 추출방법은, 메탄올, 에탄올, 함수 알코올 또는 에틸 아세테이트나 헥산 등의 유기용매와 같은 전형적인 용매에서 초음파, 속슬렛 추출, 마이크로웨이브 보조 추출(microwave assisted extraction ;MAE), 초임계 유체 추출 (SFE), 가속 용매 추출 (ASE), 가압 액체 추출 (PLE), 가압 고온수 추출 (PHWE), 및/또는 계면활성제 보조 추출을 포함할 수 있다. FTMS 비-표적화 분석뿐만 아니라, 3중 4중극 질량 분광계에 직접 주입을 위한 특별히 기대되는 대사산물 추출방법은, 비극성 대사산물이 유기용매에 용해되는데 반해 극성 대사산물은 수용성 용매에 용해되는, 액체/액체 추출을 수행하는 것이다.
[0080] 추출시료는 당업계에 알려진 적합한 방법으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 이에 한정되진 않겠지만, 생물 시료 추출물은 직접 주입 또는 뒤이은 크로마토그래피에 의한 분리방법 중의 하나의 방법에 의해 질량 분광분석법 플랫폼에서 필수적으로 분석되도록 검사될 수 있다. 전형적인 질량 분광계는 시료내의 분자를 이온화하는 소스(source) 및 이온화 분자 또는 분자단편을 검출하는 검출기를 포함한다. 제한되지 않은 시료의 일반적인 소스의 예는 전자 임펙트(impact), 전자분무 이온화(ESI), 대기압 화학 이온화(APCI), 대기압 광 이온화(APPI), 기질 보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI), 표면 향상 레이저 탈착 이온화 (SELDI) 및 그의 변형체를 포함한다. 일반적인 질량 분리 및 검출 시스템은 4중극, 4중극 이온트랩, 선형 이온 트랩, 비행시간형(time-of-flight;TOF), 자석부, 이온 사이클로트론(FTMS), 오비트랩 및 그의 변형체 및 그의 조합을 포함할 수 있다. 다른 MS에 기초초한 플랫폼 상의 FTMS의 이점은,더 낮은 분해 기기들은 놓칠 수 있는 단지 수백 달톤으로 구분되는 대사산물을 분리하는 높은 분해능이다.
[0081] 용어, "대사산물"은, 시료에서 측정되는 수준 또는 강도의 특이적인 저분자를 의미하는 것으로, 질병 상태를 진단하는 표지자로 사용될 수도 있다. 또한, 이 저분자들은 본 명세서에서, "대사산물 표지자", "대사산물 구성성분", "생물표지자", "생화학적 표지자"또는 "대사산물 특징(feature)"으로 언급될 수도 있다.
[0082] 대사산물들은 상기 방법에서 사용된 질량 분광계 기술로 측정되는 그들의 정밀 질량에 의해 점점 특징화되어졌다. 또한 그 정밀 질량은 "정밀 중성 질량", "중성 질량"으로 언급된다. 본 명세서에서 대사산물의 정밀 질량은 달톤(Da) 또는 실질적으로 등가의 질량이다. "실질적으로 등가의"는 정밀 질량과 +/- 5 ppm (백만분의 1)의 차이가 있는 것으로, 당업게의 숙련된 사람에 의해 동일한 대사산물로 인식되는 것을 의미한다. 질량의 정확도는 이론적인 질량과 측정된 질량간에 보이는 차이이다: 델타 질량 정확도(Δm)= 실질량(mreal) - 측정질량(mmeasured)이며, 종종 백만분의 1(ppm)으로 나타낸다. Ppm은 1 ,000,000 * Δm 정확도 / 측정질량을 의미한다 (예를 들어, 이론적인 질량은 1000이고, 측정된 질량이 999.9이면, 에러는 100 ppm이다).
[0083] 정밀 질량은 중성 대사산물의 질량을 의미한다. 시료를 분석하는 동안 발생되는 대사산물들의 이온화는 대사산물에서 하나 또는 그 이상의 수소원자의 손실 또는 부가되거나 전자의 손실 또는 부가되어 발생될 수 있다는 것은 이 분야의 기술자이라면 누구나 알 수 있다. 정밀 질량과 "이온화 질량"의 차이는, 정밀 질량에 대하여 이온화되는 동안 손실되거나 부가된 수소 및 전자의 질량만큼의 차이이다. 특별하지 않은 경우라면, 본 명세서에서 정밀 중성 질량으로 언급될 것이다.
[0084] 유사하게, 분자식이나 구조에 의해 대사산물이 서술될 때, 특별하지 않은 경우라면, 중성 대사산물의 분자식이나 구조가 언급될 것이다. 물론, 이온화된 대사산물의 분자식이나 구조는 중성 분자식이나 구조와는 이온화되는 동안 잃거나 부가된 수소수 만큼의 차이가 있을 것이다.
[0085] 하나 또는 그 이상의 대사산물에 대한 분석 및 정량 데이터가 획득되어 데이터가 모아진다. "정량 데이터"는 시료에 존재하는 특이적인 대사산물의 수준 또는 강도를 측정하여 획득한다. 측정은 상대적인 측정(예, 또 다른 시료 또는 분포에 대한 강도 비교)이 될 수 도 있고, 정량적인 측정(예, X mg/ml과 같은 농도)이 될 수도 있다.
[0086] 정량 데이터는 하나 또는 그 이상의 참조 시료의 대응하는 데이터와 비교된다. 또한 본 명세서에서 "대조 시료"로서 언급되는 "참조 시료"는, 특별한 질병 상태에 대하여 적합한 참조 시료이다. 예를 들면, 어떠한 방법으로 한정되지는 않겠지만, 본 발명에서 참조 시료는 대조 개체 즉, 전립선암으로 고통 받지 않는 사람의 시료(또한 본 명세서에서는 "정상", "대조(또는 대조군)", "참조" 개체 또는 환자로 언급됨)가 될 것이며; 또한 참조 시료는 전립선암 환자로부터 채취될 수도 있다. 하나 또는 그 이상의 참조 시료가 정량 데이터에 대한 비교로서 사용될 수 있다는 것을 이 분야의 기술자라면 누구나 알 수 있다. 예를 들어, 이에 한정되지는 않겠지만, 하나 또는 그 이상의 참조 시료는 대조 개체에서 채취된 첫 번째 참조 시료일 수도 있다. 또한, 하나 또는 그 이상의 참조 시료는 환자가 초기 일 때 채취될 수도 있으며; 환자의 생애에 걸쳐 환자의 건강상태를 장기적으로 모니터하는데 사용될 수 있다. 어떤 시료는 연속적인 시간간격으로 채취될 수 있다. 또한 다른 시료의 경우에서, 참조 시료는 투약된 치료 효능성을 모니터하기 위해 치료 전(즉, 치료전)의 전립선암 환자에서 채취될 수 있다. 또한, 참조 시료들의 조합이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있으며, 이 분야의 숙련된 사람이라면 누구나 알 수 있다.
[0087] 또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 동정된 신규한 화합물을 제공한다. 이 신규한 화합물들은, 상기에서 서술하고 있듯이, 전립선암 또는 전립선암으로 발전될 위험을 진단하는 대사산물 표지자로 사용될 수 있다.
[0088] 일 실시예에서, 화합물은 표 1에 나열된 대사산물 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 대사산물들의 최적의 패널은 표 1에 나타낸 492개 대사산물 군으로 부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 이에 한정되지는 않겠지만, 최적의 대사산물의 패널은 (달톤으로 측정된)정밀 질량이 519.3328, 541.3148, 545.3460, 555.3101, 541.3422, 565.3394, 521.3480, 517.3148, 567.3546, 523.3640, 531.3123, 481.3171, 495.3328, 569.3687인 대사산물일 수 있으며, +/- 5 ppm 차이는 동일한 대사산물로 나타낼 수 있다. 특히, 혈청 또는 조직에서 측정될 때, (질병이 없는)대조 개체와 상대적으로 전립선암-양성 대상에서 낮은 농도를 보여주는 14개의 대사산물들을 표시하여 여기에 나타내었다.
[0089] 상기에서 상술한 14개 대사산물 표지자는 수용성 추출물에서 검출되는 이온화 경향성이 양성인지 음성인지에 따라 2 그룹 중의 하나의 카테고리에 포함될 수 있다. 정밀 질량이 495.3328, 517.3148, 519.3328, 521.3480, 523.3640, 541.3148 및 545.3460의 (달톤으로 측정된) 대사산물들( +/- 5 ppm 차이는 동일한 대사산물을 나타냄)은 현재 상술된 방법을 사용하면 양이온으로 검출되며; 정밀질량이 481.3171, 531.3123, 541.3422, 555.3101, 565.3394, 567.3546 및 569.3687의 (달톤으로 측정되는) 대사산물들(여기에서 +/- 5 ppm의 차이는 동일한 대사산물을 나타냄)은 앞서 상술한 방법을 사용하여 음이온으로 검출된다.
[0090] 상술한 4개 대사산물들은 라이소포스포리피드(라이소인지질) 계, 예를 들면, 라이소포스파티딜콜린, 라이소포스파티딜에탄올아민류, 라이소포스파티딜디메틸에탄올아민류, 라이소포스파티딜세린류, 라이소스핑고실포스파티딜콜린류, 라이소포스파티딜글리세롤류, 라이소포스파티딜이노시톨류, 혈소판 활성인자(PAFs) 및 그의 조합에 관한 것이다.
[0091] 라이소포스포리피드 종을 포함하는 상기의 특이적인 대사산물의 농도는, 전립선암 또는 전립선암의 위험을 진단하기 위하여 검출된다. 상기 대사산물의 어떤 조합은 진단결과가 산출될 때까지 순차적인 방법이나 다른 조합으로 지속적으로 측정될 수 있다.
[0092] 상기 대사산물들의 구조적 특징은 이 분야의 숙련된 사람에게 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있다. 대사산물로 특징되는 주요 특징은 정밀 질량, 분자식, 극성, 산/염기 성질, NMR 스펙트럼 및 MS/MS 또는 MSn 스펙트럼을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이 특징들을 결정하는데 사용된 기술은 MS 분석이 뒤따르는 C18 컬럼을 이용한 역상 LC-MS, 충돌 유발 분해(CID)를 이용한 MS/MS 단편화, NMR 및 추출이 있으며, 이에 한정되지 않는다. 획득한 데이터는 특이적인 실험 조건하에서 특이적인 대사산물의 지문(fingerprints) 또는 독특한 식별자(표지자)로 사용될 수 있다. 앞서 설명된 대사산물의 일부 또는 전부는 대사산물의 추가적인 정보, 예를 들면, 분자의 구조 및 성질을 제공하는 다양한 조건하에서 지문화될 수 있다.
[0093] 상술한 대사산물 표지자의 최적의 패널내의 대사산물들은 충돌 유발 분해의 결과에서 기인되는 그들의 MS/MS 단편화 패턴에 의해 더 특징화될 수 있다. 특히 하기의 대사산물이 이에 해당한다:
[0094] 정밀 질량 495.3328은 496.3401의 이온화 질량을 가진다 ([M + H]+, C24H51NO7P+에 대해 496.3398로 산출). MS/MS 단편 (MS/MS m/z) (상대 강도)은: 496 ([M + H]+, 90%), 478 (5%), 419 (1%), 313 (1%), 283 (1%), 258 (1%), 239 (1%), 184 (90%), 166 (1%), 104 (100%), 86 (70%)이며; 도 7, 표 3 참조.
[0095] 정밀 질량 517.3148은 518.3219의 이온화 질량을 가진다 ([M + H]+, C26H49NO7P+에 대해 518.3241로 산출). MS/MS 단편 (MS/MS m/z) (상대 강도)은: 518 ([M + H]+, 90%), 459 (10%), 415 (1%), 359 (1%), 341 (1%), 313 (1%), 281 (1%), 221 (1%), 104 (100%), 86 (30%)이다; 도 8, 표 4 참조.
[0096] 정밀 질량 519.3328은 520.3401의 이온화 질량을 가진다 ([M + H]+, C26H51NO7P+에 대해 520.3398로 산출). MS/MS 단편 (MS/MS m/z) (상대 강도)은: 520 ([M + H]+, 10%), 502 (1%), 461 (5%), 281 (1%), 221 (1%), 184 (100%), 166 (5%), 124 (1%), 86 (30%)이다; 도 9, 표 5 참조.
[0097] 정밀 질량 521.3480은 522.3554의 이온화 질량을 가진다 ([M + H]+, C26H53NO7P+에 대해 522.3554로 산출). MS/MS 단편 (MS/MS m/z) (상대 강도)은: 522 ([M + H]+, 100%), 504 (7%), 478 (1%), 357 (1%), 258 (1%), 221 (1%), 184 (60%), 124 (5%), 104 (80%), 86 (30%)이다; 도 10, 표 6 참조.
[0098] 정밀 질량 523.3640은 524.3713의 이온화 질량을 가진다 ([M + H]+, C26H55NO7P+에 대해 524.3711로 산출). MS/MS 단편 (MS/MS m/z) (상대 강도)은: 524 ([M + H]+, 100%), 506 (5%), 496 (1%), 478 (1%), 331 (1%), 313 (1%), 285 (1%), 258 (1%), 184 (70%), 166 (2%), 124 (5%), 104 (70%), 86 (30%)이다; 도 11, 표 7 참조.
[0099] 정밀 질량 541.3148은 542.3219의 이온화 질량을 가진다 ([M + H]+, C28H49NO7P+에 대해 542.3241로 산출). MS/MS 단편 (MS/MS m/z) (상대 강도)은: 542 ([M + H]+, 80%), 483 (25%), 284 (1%), 225 (1%), 184 (1%), 104 (100%), 86 (30%)이다; 도 12, 표 8 참조.
[00100] 정밀 질량 545.3460은 546.3534의 이온화 질량을 가진다 ([M + H]+, C28H35NO7P+에 대해 546.3554로 산출). MS/MS 단편 (MS/MS m/z) (상대 강도)은: 546 ([M + H]+, 90%), 528 (1%), 514 (1%), 487 (30%), 104 (100%), 86 (30%)이다; 도 13, 표 9 참조.
[00101] 정밀 질량 481.3171은 480.3091의 이온화 질량을 가진다 ([M - H]-, C23H47NO7P-에 대해 480.308로 산출). MS/MS 단편 (MS/MS m/z) (상대 강도)은: 480 ([M - H]-, 100%), 255 (100%), 242 (10%), 224 (15%), 168 (10%), 153 (10%), 79 (25%)이다; 도 14, 표 12 참조.
[00102] 정밀 질량 531.3123은 530.3035의 이온화 질량을 가진다 ([M - H]-, C30H46NO5P에 대해 531.3114로 산출). MS/MS 단편 (MS/MS m/z) (상대 강도)은: (530, 100%), 480 (100%), 255 (100%), 242 (10%), 224 (15%), 168 (10%), 153 (10%), 79 (25%)이다; 도 15, 표 13 참조.
[00103] 정밀 질량 541.3422은 540.3335의 이온화 질량을 가진다 ([M - H]-, C25H51NO9P-에 대해 540.3293로 산출). MS/MS 단편 (MS/MS m/z) (상대 강도)은: 540 ([M - H]-, 10%), 480 (100%), 255 (100%), 242 (10%), 224 (15%), 168 (10%), 153 (10%), 79 (25%)이다; 도 16, 표 14 참조.
[00104] 정밀 질량 555.3101은 554.3013의 이온화 질량을 가진다 ([M - H]-, C25H50NO10P에 대해 555.3172로 산출). MS/MS 단편 (MS/MS m/z) (상대 강도)은: 554 ([M - H]-, 10%), 494 (100%), 269 (100%), 242 (10%), 224 (15%), 168 (10%), 153 (10%), 79 (25%)이다; 도 17, 표 15 참조.
[00105] 정밀 질량 565.3394은 564.3306의 이온화 질량을 가진다 ([M - H]-, C27H5INO9P-에 대해 564.3293로 산출). MS/MS 단편 (MS/MS m/z) (상대 강도)은: 564 ([M - H]-, 100%), 504 (100%), 279 (100%), 242 (10%), 224 (15%), 168 (10%), 153 (10%), 79 (25%)이다; 도 18, 표 16 참조.
[00106] 정밀 질량 567.3546은 566.3459 의 이온화 질량을 가진다 ([M - H]-, C27H53NO9P-에 대해 566.3449로 산출). MS/MS 단편 (MS/MS m/z) (상대 강도)은: 566 ([M - H]-, 10%), 506 (100%), 281 (100%), 242 (10%), 224(15%), 168 (10%), 153 (10%), 79 (25%)이다; 도 19, 표 17 참조.
[00107] 정밀 질량 569.3687은 568.3598 의 이온화 질량을 가진다 ([M - H]-, C27H55NO9P-에 대해 568.3605로 산출). MS/MS 단편 (MS/MS m/z) (상대 강도)은: 568 (m/z는 [M + H]+ 질량을 나타냄), 10%), 508 (100%), 283 (100%), 242 (10%), 224 (15%), 168 (10%), 153 (10%), 79 (25%)이다; 도 20, 표 18 참조.
[00108] 전립선 암 진단을 위해 선별된 14개 대사산물 표지자의 구조적인 특징에 기초하여, 대사산물들은 라이소포스포리피드(라이소인지질)과 관련된 분자이다. 보다 엄밀히는, 대사산물들은 라이소포스파티딜콜린(lysoPC), 라이소포스파티딜에탄올아민(lysoPE), 라이소포스파티딜디메틸에탄올아민(lysoPdmE), 라이소포스파티딜세린(lysoPS), 라이소포스파티딜이노시톨(lysoPI) 및 라이소포스파티딜글리세롤(lysoPG), 및 혈소판 활성인자(PAFs)이나, 이에 한정되지 않으며, 상기 글리세롤 골격은 SNl 또는 SN2 중의 하나의 자리에 지방산, 예를 들면, 16:0, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:3, 20:4, 20:5, 22:6, 세라마이드 또는 기타에 부착되어 있고, 그리고 SN3에 존재하는 인산-함유 콜린, 에탄올아민, 디메틸에탄올아민, 세린, 글리세롤 또는 이노시톨에 부착되어있다.
[00109] 포스파티딜콜린(PC) 및 포스파티딜에탄올아민(PE)은 생물막을 이루는 2가지 주요한 성분을 나타낸다. PC 및 PE는 SN3 자리의 에탄올아민 또는 콜린에 부착된 인산기를 함유하는 글리세롤 골격과, 아실, 에테르 또는 비닐-에테르 결합으로 통해 SNl 및 SN2 자리에 결합된 두 개의 지방산을 포함한다. 지방산은 포화(SN1에 더욱 일반적임)되거나 또는 불포화(SN2에 더욱 일반적임)될 수 있다. PC 및 PE 같은 인지질이 다양한 인지질분해효소에 의해 가수분해 되면, lysoPC와 같은 라이소인지질은 지방산과 함께 생성된다. 라이소인지질은 칼슘 신호, 아테롬성 동맥경화증 및 염증과 같은 수많은 생물학적 경로 및 질병과 관련되어 있다(12).
[00110] 미합중국 공개된 특허출원번호 US 2004/0137541 (Mills 등)은 암의 발전 또는 발전과정 동안의 주요한 사건으로서 lysoPCs의 증가에 초점을 두었다. Mills 등은 특히, 부인과 암에서 lysoPCs의 증가를 개시한다. 이것은 14개의 생물 표지자(즉, 519.3328, 541.3148, 545.3460, 555.3101, 541.3422, 565.3394, 521.3480, 517.3148, 567.3546, 523.3640, 531.3123, 481.3171, 495.3328, 569.3687의 정밀 질량을 갖는 대사산물들)의 패널이 전립선 암 환자의 혈청에서 감소하는 것을 보여주는 본 발명과는 대조적인 것이다.
[00111] 본 발명은 또한 전립선 암 진단을 위한 고속처리 방법을 제공한다. 이 방법은 부모분자의 단편을 포함한다: 어떤 비제한 시료에서, 이것은 Q-Trap™ 시스템에 의해 수행된다. 대사산물의 검출은 비색 화학 분석(UV 또는 기타 파장), 항체에 기초한 효소면역분석법(ELISAs), 칩에 기초한/중합사슬반응에 의한 핵산검출법(chip-based and polymerase-chain reaction for nucleic acid detection assays), 비드에 기초한 핵산 검출법(bead-based nucleic-acid detection methods), 소변 화학검사(dipstick chemical assays) 또는 기타 화학반응, 자기공명영상(MRI)과 같은 영상분석, 양전자 방출 단층촬영(PET) 검색, 컴퓨터 단층촬영(CT) 검색, 핵자기공명(NMR), 및 다양한 질량 분광학에 기초한 시스템을 포함하는 다양한 분석 플랫폼 중의 하나를 이용하여 수행될 수 있다.
[00112] 본 발명의 다른 예시에서는, 환자에서 전립선암 또는 전립선암의 위험을 진단하는 방법을 제공한다. 이 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 상기 환자로부터 시료를 획득하는 단계;
b) 상기 시료를 분석하여 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자에 대한 정량 데이터를 획득하는 단계;
c) 내부 대조 대사산물에 대한 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자 각각의 비율을 획득하는 단계;
d) 내부 대조 대사산물에 대한 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자의 각각의 비율을, 하나 또는 그 이상의 참조시료로부터 획득한 대응되는 데이터와 비교하는 단계; 및
e) 상기 비교를 이용하여 전립선암 또는 전립선암의 위험을 진단하는 단계.
[00113] 시료의 분석 단계(단계 b)는 질량 분광계(MS)를 이용한 분석을 포함할 수 있다. 예를 들면, 어떠한 질량 분광계로 제한되지 않겠지만, FTMS, 오비트랩, 비행시간(TOF) 또는 4중극 형태일 수 있다. 양자택일로, 질량분광계는 추가적인 전-검출기 질량 필터를 갖출 수도 있다. 예를 들면, 어떠한 기기로 제한되지는 않겠지만, 일반적으로 4중극-FTMS (Q-FTMS), 4중극 - TOF (Q-TOF) 또는 3중 4중극 (TQ or QQQ)을 나타낼 수 있다. 추가로, 질량 분광계는 부모 이온 검출 모드(MS) 또는 MSn 모드에서 작동될 수 있으며, 이때 n>=2이다. MSn은 부모이온이 충돌 유발 분해(CID) 또는 단편이온을 생성하는 다른 단편화 처리되는 상황을 나타내며, 그 다음 하나 또는 그 이상의 상기 단편들은 분광 광도계로 검출된다. 이러한 단편들은 추가적인 단편을 생성하기 위해서 더 단편화될 수 있다. 양자택일로, 시료는 액체 또는 가스 크로마토그래피 시스템을 이용하거나 직접 주입으로 분광 광도계에 도입되될 수 있다.
[00114] 바로 전에 상술한 방법에서, 하나 또는 그 이상의 참조 시료는 대조군 개체로부터 채취한 첫 번째 기준선 참조시료일 수 있다.
[00115] 상술한 방법에서, 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자는 표 1에 나열된 대사산물들로부터 선택될 수 있으며, 또는 대사산물들은 상술한 14개의 대사산물들일 수도 있다. "내부 대조 대사산물"은 부모에 자연적으로 존재하는 내재성 대사산물을 말하며, 제공된 대사산물을 질병과 연관되어 있지도, 질병상태 상에서 변하지도 않으며; 양자택일로, "내부 대조 대사산물"은 또한 분석 전에 혈청 시료에 고정된 외재성 표준을 말한다. 예를 들면, 제한되지는 않겠지만, 이 비율은 시험 대상에 대한 진단 점수를 결정할 때 사용될 수 있다.
[00116] 내부 대조 대사산물에 대한 대사산물 표지자 비율의 사용은, 대사산물 표지자의 절대적인 수준에 대한 측정법에 비해 더 안정하고 재현가능한 측정법을 제공한다. 모든 시료에 존재하나, 다양한 질병 상태 상에서 변하지 않는 내부 대조 대사산물이 존재한다면, (조작, 추출 등에 기인하는) 시료 대 시료의 다양성이 최소화된다.
[00117] 본 발명의 진단방법에서, 대사산물 농도의 변화 및 전립선암 또는 전립선암으로 발전할 위험의 가능성을 결정하기 위하여, 대사산물 표지자의 측정은 검사 대상에서 장기간으로 연장된 시간에서 수행될 수 있다. 필수적인 기준 값을 확립하기 위하여 검사 대상은 시작점에서 시료를 제공할 수 있으며; 그런 다음 시작점 시료와 비교할 연장된 시간의 시료를 제공할 수 있다. 예를 들면, 비록 제한되지는 않겠지만, 상술한 14개 대사산물의 강도의 증가는 전립선암의 위험이 감소된 것을 나타낼 것이며, 강도의 감소는 전립선암의 위험이 증가된 것을 나타낼 것이다.
[00118] 본 발명의 다른 실시예에서, 다음을 포함하는, 환자에서 전립선암의 치료를 위한 치료 효능성을 평가하는 방법을 제공한다:
a) 상기 환자로부터 시료를 획득하는 단계;
b) 상기 시료를 분석하여 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자에 대한 정량 데이터를 획득하는 단계;
c) 상기 정량 데이터를 하나 또는 그 이상의 참조시료로부터 획득한 대응되는 데이터와 비교하는 단계; 및
d) 상기 비교를 이용하여 이 치료가 환자의 건강상태를 호전시킬 것인지를 결정하는 단계.
[00119] 선택적으로, 분석단계(단계 b) 후에, 내부 대조 대사산물에 대한 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자 각각의 비율을 얻을 수 있다. 이러한 경우, 하나 또는 그 이상의 참조 시료로부터 획득한 대응되는 데이터의 내부 대조 대사산물에 대한 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자 각각의 비율은 치료(법)의 효능성을 평가에 비교된다.
[00120] 분석 단계(단계 b)는 액체 크로마토그래피 질량 분광분석법(LC-MS)에 의해 시료를 분석하는 것을 포함할 수 있으며, 또는 다른 방법으로 이 방법이 초고속 처리 방법일 때, 직접 주입이나 액체 크로마토그래피 및 선형 이온 트랩 직렬 질량 분광분석법에 의해 시료를 분석하는 것을 포함할 수 있다.
[00121 ] 용어, "치료법(요법)" 또는 "치료"는, 평가될 환자의 건상상태를 개선하기위해 시도되는 치료법의 어떠한 적합한 과정을 의미한다. 치료법의 효능성을 평가할 때, 환자의 건강상태를 개선시키거나 악화시키는 특별한 치료법의 효과가 측정되어질 수 있다. 그렇게, 이 분야의 숙련된 사람이라면, 이 치료법이 전립선암을 치료하기에 효과적인지 어떤지를 결정 가능할 것이다. 이러한 치료는 면역요법(예를 들어, 바실러스 카메트-구에린(Calmette-Guerin) 주입법), 방사성 전립선 절제술, 화학요법, 방사선 요법, 호르몬 치료법(항안드로겐 포함) 등을 포함하며, 이에 한정되지 않는다.
[00122] 상기 상술한 방법에서, 하나 또는 그 이상의 참조 시료는 어떤 적합한 참조 시료일 수 있다. 예를 들어, 어떤 방법에 제한되지는 않겠지만, 참조 시료는 대조 개체로부터 채취한 다수의 시료 또는 환자에서 채취한 하나 또는 그 이상의 치료전 기준선 시료; 또는 이의 조합일 수도 있다. 환자의 치료전 기준선 시료는 특히 유용한데, 이는 대사산물의 다양성이 환자에 특이적이기 때문일 것이다.
[00123] 상기 상술한 방법에서, 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자는 표 1에 나열된 대사산물로부터 선택될 수 있으며, 또는 대사산물들은 상술한 14개의 대사산물일 수도 있다.
[00124] 상기 상술한 치료법의 효능성은 대사산물의 측정 및 참조시료에 대한 비교에 기초하여 평가되며, 그것에 따라 정상 범위로 대사산물이 회복되어 양성 치료 효과를 나타낼 것이다.
[00125] 전림선암을 치료하기 위한 치료 효능성을 평가하는 다른 방법에서, 내부 대조 대사산물에 대한 하나 또는 그 이상의 대사사물의 각각의 비율은 단계 b)에서 획득될 수 있으며; 그런 다음, 내부 대조 대사산물에 대한 하나 또는 그 이상의 대사사물의 각각의 비율은 단계 c에서 하나 또는 그 이상의 참조 시료에서 획득된 대응되는 데이터와 비교될 수 있다.
[00126] 또한 본 발명은 전립선암 진단의 초고속 방법을 제공한다. 이 방법은 부모이온의 단편화를 포함할 수 있으며; 일부 비-제한 예시에서, 이것은 Q-Trap™ 시스템에 의해 성취될 수 있다. 대사산물의 검출은 비색 화학 분석(UV 또는 기타 파장), 항체에 기초한 효소면역분석법(ELISAs), 칩에 기초한/중합사슬반응에 의한 핵산검출법(chip-based and polymerase-chain reaction for nucleic acid detection assays), 비드에 기초한 핵산 검출법(bead-based nucleic-acid detection methods), 소변 화학검사(dipstick chemical assays) 또는 기타 화학반응, 자기공명영상(MRI)과 같은 영상분석, 양전자 방출 단층촬영(PET) 검색, 컴퓨터 단층촬영(CT) 검색, 핵자기공명(NMR), 및 다양한 질량 분광학에 기초한 시스템을 포함하는 다양한 검사 플랫폼 중의 하나로 수행될 수 있다.
[00127] HTS 방법은 생물표지자에 대하여 각각의 선택된 딸이온 뿐만 아니라, 각 시료에 추가된 하나 또는 그 이상의 내부 표준에 대한 딸이온들의 강도, 피크면적 또는 합산된 스캔을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 그런 다음, 비율은 각각의 생물표지자 전이를 내부 표준 전이로 나누므로써 생성된다. 내부 표준은 기기 민감성을 표시하며, 다중의 시료추출을 통한 생물표지자 전이 신호를 정규화시킨다. 질병이 없거나 건강한 개체군에 대한 비율은 "정상" 분포에 대한 명확한 파라메터가 된다. 그런 다음, 정상 및 전립선 양성을 포함하는 시료의 확인 세트는 분석한 후 정상 분포와 비교되었다. 이것은 하나의 정상 개체군과 하나의 전립선-양성 개체군인 필수적인 두 분포에서 기인된다. 그리고 나서, 두 분포사이의 컷-오프 비율은 생물표지자 검사의 민감성과 특이성을 결정하는데 선택된다.
[00128] 본 발명의 방법에서, 이 명세서에서 설명한 어떤 개체의 또는 대사산물의 조합은 진단/예측 산출에 도달하도록 현존하는 암 표지자와 함께 조합될 수 있다. 이러한 현존하는 표지자는 전립선특이항원(PSA), 종양배아항원(CEA), 암항원(CA) 19-9, C15-3 또는 CA125을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
[00129] 상기 방법은 암이 검출되는 시기의 대상에 대하여 적합한 치료 요법을 잘 결정하기 위한 검사를 할 수 있는 의학 전문가를 제공할 수 있다. 진단방법이 비교적 비-침입성이기 때문에, 다른 방법으로 진단되지 않는 수많은 사례, 특히 의학 전문가에 의해 특수 조정으로 투약되어야 할 초기 사례가 동정될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 의학적 증상이 나타나기 이전에 재발가능성이 있는 암의 재발을 검출하는데 사용될 수도 있다. 어떤 지식은, 재발을 막기 위해 개선된 기회를 갖는 직접치료요법에 이어서 사용될 수 있다.
[00130] 전립선암의 진단에서의 본 발명의 효과는 대단할 것이며, 이는 위험을 평가하는데 있어서 사실상 모든사람에 대하여 그들의 일생을 통하여 장기간에 걸쳐 검색할 수 있기 때문이다. 본 발명의 검사의 수행 특성이 일반적인 개체군(일반인)에 대하여 대표적임을 감안한다면, 이 검사 단독은 현재 활용가능한 다른 어떠한 검색방법보다 우수할 것이며, 이는 이 검사법이 위급한 임상적 증상이 나타나기 전에 질병의 경과를 검출하는 잠재성을 가질 수 있기 때문이다.
[00131 ] 본 발명은 다음의 예시로 더 설명될 수 있다. 하기에 나열된 각각의 예시를 포함하는 본 발명의 개요은 도 1에 나타내었다.
[0044] 본 발명 및 본 발명의 다른 특징은 참조로서 여기에 첨부되는 도의 설명으로부터 더욱 명확해 질 것이다:
[0045] 도 1은 전립선암의 존재와 관련된 라이소포스포리피드 종과 연관된 대사산물을 포함하는, 대사산물의 발견, 동정, 특징화를 포함하는 단계를 요약하여 나타낸 것이다.
[0046] 도 2는 P 값이 0.05 미만인 492개의 질량에서 산출한 기본 조성 분석(principle component analysis:PCA) 플랏을 나타낸 것이다. 각 플랏 점은 한 환자의 시료를 나타내는 것이며, 점선은 대부분의 전립선암 대상(검은색)과 대조군(회색) 사이를 구분할 수 있는 경계선을 표시한다.
[0047] 도 3은 p 값이 <0.05인 492개의 질량으로부터 선택한 14개 질량의 대상에 대하여 산출된 PCA 플랏을 나타낸 것이다. 전립선암 대상(검은점)과 대조군 대상(회색점) 간의 구별정도가 높은 것은 14개 질량만을 이용하여 결과를 나타내었기 때문이다. 점선은 두 코허트간의 경계선을 보여주는 것으로 컷오프 값이 84%의 민감성(검출된 암의 84%) 및 100%의 특이성(어떤 대조군도 암으로 분류되지 않았으며, 가짜 양성율도 없음)을 나타낸다.
[0048] 도 4는 대조군(회색)과 전립선암 대상(검은색)에서의 선택된 14개 질량의 평균 상대 강도를 막대그래프로 나타낸 것이다. 에러 바는 ± 1s.d 임.
[0049] 도 5는 HPLC에서 크로마토그래피 분리에서 비행시간으로 검출시 16 및 18분 사이에서 용출된 대사산물의 추출 질량 스펙트럼 시리즈를 보여주는 것이다. 네모칸은 대조군 혈청(A)에서 약 450 내지 600 달톤으로 검출되지만, 전립선암-양성 혈청(B)에는 없는 대사산물 질량의 영역을 표시한 것이다. 더 아래의 패널 (C)는 대조군과 전립선암 스팩트럼을 합산한 전체 차이(총 차이)를 표시한다.
[0050] 도 6 은 HPLC후에 TOF-MS를 사용하여 검출한 상기 14개의 대사산물을 그래프로 나타낸 것이다. 에러바는 ±s.d임.
[0051] 도 7 은 각각의 충돌 에너지 전압 20 (A), 35 (B) 및 50 볼트에서 495.3328 (496.3401 [M+H])의 MS/MS 추출 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
[0052] 도 8 은 각각의 충돌 에너지 전압 20 (A), 35 (B) 및 50 볼트에서 517.3148 (518.3219 [M+H])의 MS/MS 추출 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
[0053] 도 9 은 각각의 충돌 에너지 전압 20 (A), 35 (B) 및 50 볼트에서 519.3328 (520.3401 [M+H])의 MS/MS 추출 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
[0054] 도 10 은 각각의 충돌 에너지 전압 20 (A), 35 (B) 및 50 볼트에서 521.3480 (522.3554 [M+H])의 MS/MS 추출 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
[0055] 도 11 은 각각의 충돌 에너지 전압 20 (A), 35 (B) 및 50 볼트에서 523.3640 (524.3713 [M+H])의 MS/MS 추출 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
[0056] 도 12 은 각각의 충돌 에너지 전압 20 (A), 35 (B) 및 50 볼트에서 541.3148 (542.3219 [M+H])의 MS/MS 추출 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
[0057] 도 13 은 각각의 충돌 에너지 전압 20 (A), 35 (B) 및 50 볼트에서 545.3460 (546.3534 [M+H])의 MS/MS 추출 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
[0058] 도 14은 각각의 충돌 에너지 전압 20 (A), 35 (B) 및 50 볼트에서 481.3171 (480.3091 [M-H])의 MS/MS 추출 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
[0059] 도 15 은 각각의 충돌 에너지 전압 20 (A), 35 (B) 및 50 볼트에서 531.3123 (530.3035 [M-H])의 MS/MS 추출 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
[0060] 도 16 은 각각의 충돌 에너지 전압 20 (A), 35 (B) 및 50 볼트에서 541.3422 (540.3335[M-H])의 MS/MS 추출 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
[0061] 도 17 은 각각의 충돌 에너지 전압 20 (A), 35 (B) 및 50 볼트에서 555.3101 (554.3013 [M-H])의 MS/MS 추출 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
[0062] 도 18 은 각각의 충돌 에너지 전압 20 (A), 35 (B) 및 50 볼트에서 565.3394 (564.3306 [M-H])의 MS/MS 추출 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
[0063] 도 19 은 각각의 충돌 에너지 전압 20 (A), 35 (B) 및 50 볼트에서 567.3546 (566.3459 [M-H])의 MS/MS 추출 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
[0064] 도 20 은 각각의 충돌 에너지 전압 20 (A), 35 (B) 및 50 볼트에서 569.3687 (568.3598 [M-H])의 MS/MS 추출 질량 스펙트럼을 나타낸 것이다.
[0065] 도 21의 A)는 양성 ESI 3중-4중극 HTS방법에 의한 부모-딸이온 전이의 리스트뿐만 아니라 5개의 희석 시료를 연결하는 기울기에 대한 R-구획 상관계수를 나타낸 것이고, B)는 496.3/184.2al 전이에 대한 표준 곡선을 나타낸 것이고, C)는 전립선(검은색)과 대조군(회식) 대상의 각 전이에 대한 평균 비율(생물표지자:IS 피크면적)을 나타낸 것이다.
[0066] 도 22의 A)는 147명의 남성 대조군(회색 사각형)과 24명의 전립선암 환자(검은 삼각형)에 대한 양성 ESI HTS 환자 점수의 흩어진 플랏을 나타낸 것이고, B)는 환자점수에 따라 대조군(회색)과 전립선암 대상(검은색)의 분포를 빈도수 막대그래프로 나타낸 것이다.
[0067] 도 23의 A)는 음성 ESI 3중-4중극 HTS방법에 의한 부모-딸이온 전이 의 리스트뿐만 아니라 5개의 희석 시료를 연결하는 기울기에 대한 R-구획 상관계수를 나타낸 것이고, B)는 480.3/255.4al 전이에 대한 표준 곡선을 나타낸 것이고, C)는 전립선(검은색)과 대조군(회식) 대상의 각 전이에 대한 평균 비율(생물표지자:IS 피크면적)을 나타낸 것이다.
[0068] 도 24의 A)는 147명의 남성 대조군(회색 사각형)과 24명의 전립선암 환자(검은 삼각형)에 대한 음성 ESI HTS 환자 점수의 흩어진 플랏을 나타낸 것이고, B)는 환자점수에 따라 대조군(회색)과 전립선암 대상(검은색)의 분포를 빈도수 막대그래프로 나타낸 것이다.
실시예 1 : 차별적으로 발현되는 대사산물들의 발견 및 동정
[00132] 임상적으로 전립선암-양성으로 진단되는 환자와 정상 환자 간에 차별적으로 발현되는 대사산물들이 동정되었다.
[00133] 임상 시료들. 상술된 전립선암 검색 검사를 위해서, 전립선암이 아닌 건강한 대표 개체군과 전문적으로 전립선암-양성으로 진단받은 환자들로부터 혈청 시료를 채취하였다(SeraCare LifeSciences, Inc). 하기에 서술된 전립선암의 생화학적 표지자들은 24명의 전립선암-양성 환자 혈청 시료와 25명의 건강한 대조군의 혈청시료에서 유래되었다. 두 그룹의 시료들은 나이, 민족성(인종), 체중, 직업 및 다양한 비-전립선암-관련 건강 상태를 나타내는 다양한 개체군으로부터 유래된다. 모든 시료들은 단회(single time-point)에 수집되었으며, 전립선암 시료들은 종양의 외과절제 전에 또는 바로 다음에 즉시 채취되었다. 모든 시료는 화학 치료 또는 방사선 치료 전에 채취되었다.
[00134] 49개의 혈청 시료 내에 포함된 대사산물들은 초음파 및 격렬한 혼합(볼텍스 믹싱)하여 극성 및 비극성 추출방법으로 분리하였다.
[00135] (24명의 전립선암, 25명의 정상의) 혈청 추출물은 FTMS에 직접 주입 및 양성 또는 음성 모드에서 전자분무이온화(ESI) 또는 대기압 화학 이온화(APCI)로 이온화하여 분석하였다. 시료 추출물은 음성 이온화 모드에서 메탄올 :0.1%(v/v) 암모늄 하이드록사이드 (50:50, v/v) 또는 양성 이온화 모드에서 메탄올:0.1% (v/v) 포름산 (50:50, v/v)으로 3 또는 6배 희석하였다. APCI용으로는, 시료 추출물을 희석없이 바로 주입하였다. 모든 분석은 7.0 T 활성 차폐 초전도 자석이 장착된 버커 달토닉스 아펙스(Bruker Daltonics APEX) III FTMS (Bruker Daltonics, Billerica, MA)에서 수행되었다. 시료들은 ESI 및 APCI를 이용하여 시간당 600 μL 유입율로 직접 주입되었다. 이온 전달/검출 검량계(parameter)들은 세린, 테트라-알라닌, 레세핀, 헤일렛-페카드 조정(tuning) 혼합물 및 아드레노코티토트로픽 호르몬 단편 4-10으로 최적화시켰다. 게다가, 기기의 상태는 기기 매뉴얼(사용설명서)의 권고에 따라, 이온강도 및 전체 밴드들이 100- 1000 amu 질량의 범위 상에 있도록 최적화하여 조정하였다. 상기 언급된 표준 혼합물은 각 시료의 스펙트럼에 대하여 100-1000 amu 범위 상에서 얻은 정확한 질량으로 내부적으로 보정하여 사용하였다.
[00136] 전체적으로, 각각의 시료에 대하여 추출물과 이온화 모드를 조합시켜 6개의 분리 분석을 수행하였다:
수용성 추출물
1. 양성 ESI (분석모드 1101)
2. 음성 ESI (분석모드 1102)
유기 추출물
3. 양성 ESI (분석모드 1201)
4. 음성 ESI (분석모드 1202)
5. 양성 APCI (분석모드 1203)
6. 음성 APCI (분석모드 1204)
[00137] 질량 분광계 데이터 프로세싱. 선형 최소제곱회귀선을 이용하여, 각각의 내부 표준 질량 피크가 이론적 질량과 비교하여 1 ppm 이하의 오차값을 갖도록 질량축 값을 보정하였다. 버커 달토닉스 사의 소프트웨어 XMASS를 이용하여, 1 메가 단어의 데이터 총 크기를 얻었으며, 2 메가 단어로 덮어씌웠다(zero-filled). sinm 데이터 변환은 푸리에 변환 및 광도 계산 전에 수행되었다. 각 분석으로 얻은 질량 스펙트럼들은 정밀 질량과 각 피크의 절대적인 강도를 포함하는 피크 리스트를 생성하도록 통합시킨다. 100-2000 m/z 범위의 화합물들이 분석되었다. 서로 다른 이온화 모드 및 극성에 따른 데이터를 비교 요약하기 위하여, 모든 검출된 질량 피크는 수소 부가물 형성에 영향을 미치는 중성 질량으로 전환하였다. DISCOVAmetrics™ 소프트웨어(Phenomenome Discoveries사, Saskatoon, SK, 캐나다)를 사용하여 2차원적인 어레이( 질량 대 시료 강도)를 자동 산출하였다. 다중 파일로부터 얻은 데이터를 병합한 후, 이 병합한 파일은 모두 특유한 질량 값을 결 정하기위해 처리되었다. 각 특유의 질량에 대한 평균값이 결정되었으며, y-축으로 나타내었다. 이 값은 통계학적으로 등가인 것으로 결정된 검출된 정밀질량 모두에 대한 평균값을 나타낸다. 정밀 질량 기기의 눈금 측정 표준이 약 1ppm인 것을 고려한다면, 이들 평균 질량들은 평균질량에 대하여 +/- 2 ppm 이내, 심지어 +/- 5 ppm이내의 모든 질량을 포함한다는 것을 이 분야의 숙련된 사람이라면 알 수 있다. 분석을 위하여 최초에 선별된 각 파일에 대한 컬럼을 생성하였으며, x 축에 표시하였다. 각각의 파일에서 얻은 각 질량에 대한 강도는 이것의 대표적인 x, y좌표에 채워 넣었다. 강도 값을 가지지 않은 좌표들은 비워 두었다. 한번 (데이터가 좌표에) 정렬되면, 데이터를 추가하여 처리하고, 가시화하고, 해석하였으며, 가상의 화학적 동정을 확인하였다. 그런 다음, 각각의 스펙트럼들의 피크로서 검출된 모든 대사산물의 질량과 강도를 구하였다. 그런 다음, 모든 모드의 데이터들을 합하여 각 시료 당 하나의 데이터 파일을 생성하였다. 그리고 나서, 총 90개의 시료의 데이터를 합하고 정렬하여 2-차 대사산물 배열을 만들어, 각 시료를 컬럼으로 나타내고, 특유의 각각 대사산물은 한 선에 나타내었다. 구해진 대사산물 시료 조합에 대응하는 셀(cell)에서, 상기 시료의 대사산물의 강도를 표시하였다. 데이터가 이 형식으로 표시되면, 시료의 그룹( 예로서 정상과 암 그룹) 간에 차이가 있는 대사산물들을 결정할 수 있다.
[00138] 향상된 데이터 해석. 스튜던트 T-테스트는 정상과 CRC-양성 시료 사이에 차이가 있는 대사산물(p<0.05)을 선별하기 위하여 사용되었다. 대사산물들(492)은 표 1에 나타낸 판정기준을 적용하였다. 각각의 특징은 두 개체 간에 통 계적으로 유의하게 다르며, 따라서 각각은 잠재적인 진단 유용성을 가진다. 이 특징은 정밀 질량과 분석 모드로서 설명되며, 이것들은 서로 각 대사산물의 가상의 분자식과 화학적 특징(예컨대, 극성 및 가상의 기능기)을 제공하기에 충분하였다. 대조군과 전립선암 혈청 간에 구별되는 492개의 대사산물들의 능력은 도 2의 PCA 플랏으로 나타내었다. 대조군(회색) 및 전립선암(검정) 간의 상대적으로 명확한 구분(점선으로 나타냄)이 그어질 수 있으며, 이것으로 492개의 대사산물이 서로 함께 대조군 시료에 상대적인 전립선암-양성 혈청 시료를 진단할 수 있다.
[00139] 그러나, 상업적으로 유용한 검사에 492개의 신호들을 병합하고 개발하는 것은 비현실적이며, 따라서 추가적인 특성으로서 일변량 분석과 화학 정보를 조합하여 사용하므로써, 492개로부터 14개의 대사산물 서브세트로 보다 더 선별하였다. 선별된 14개의 대사산물들의 서브세트는 두 가지 다른 모드에서 검출되었다: 정밀 질량이 495.3328, 517.3148, 519.3328, 521.3480, 523.3640, 541.3148 및 545.3460의 (달톤으로 측정된) 대사산물들( +/- 5 ppm 차이는 동일한 대사산물을 나타냄)은 본 명세서에 상술된 방법을 사용하여 양이온으로 검출되었으며; 정밀질량이 481.3171, 531.3123, 541.3422, 555.3101, 565.3394, 567.3546 및 569.3687의 (달톤으로 측정되는) 대사산물들(여기에서 +/- 5 ppm의 차이는 동일한 대사산물을 나타냄)은 본 명세서에 상술된 방법을 사용하여 음이온으로 검출되었다. 모든 대사산물 질량은 12C 분자로 나타내었다.
[00140] 14개 질량의 진단 정확성은 도 3의 PCA 플랏으로 알 수 있으며, 이 플랏은 질병과 대조군 간의 명확한 구분을 보여준다. 사실상, 전립선암에 대하여 대조군을 점선으로 구분하여 84%의 민감성과 100%의 특이성을 얻었다. FTICR에서 검출된 14개의 질량의 상대 강도에 대한 그래프를 도 4에 도시하였다(각 질량당 0에서 1의 눈금으로 표시). 각각의 표지자는 전립선암 혈청들에 대한 대조군 혈청들에서 약 50%(평균적으로)의 감소 또는 결핍을 보였다.
[00141] 이 결과에 기초하여, 전립선-양성 환자와 건강한(전립선암에 음성인) 개체들 간의 명확한 구분이 만들어질 수 있다. 따라서, 전립선암-양성과 전립선-음성 혈청에서 동정되고 구분될 수 있는 이들 표지자들은, 지금 설명되고 있는 전립선암 진단검사를 위한 기초를 만들 수 있다.
실시예 2: 발견된 대사산물들의 독립적인 방법 확립
[00142] 실시예 1에서 설명된 임상적으로 다양성을 갖는 대사산물들 및 그들의 조합은 독립적인 질량 분광분석 시스템을 사용하여 더 확립하였다. 각각의 다양한 그룹(10개의 대조군과 9개의 전립선암)의 대표적인 수용성 시료 추출물은 HP 1050 고성능 액체 크로마토그래피 또는 ABI Q-STAR에 장착된 등가물을 이용한 LC-MS 또는 등가의 질량 분광광도계로 재분석하여, 연구 하의 임상적 다양성 간의 강도 차이를 보이는 대사산물에 대한 동정을 위하여 질량 및 강도 정보를 구하였다. ESI 양성모드 및 음성모드 둘 모두에서 풀-스캔으로 검출하여 데이터를 구하였으며, 결과 스팩트럼 데이터를 페노미넘 프로파일러 소프트웨어(Phenomenome Profiler software)로 눈금을 정학 정렬하였다. 발명자들은 특수 크로마토그래피 조건 하에서 지연시간 창(retention time window) (HPLC 컬럼의 분자종 용출이 끝나는 시간)이 약 28 내지 34분임을 확인하였다. 도 5는 지연시간 범위 내에서 대조군(A), 전립선암(B) 그리고 대조군과 전립선암의 합산된 전체 차이(C)의 추출 질량 스펙트럼들을 나타낸다. (점선의) 네모 영역은 앞서 설명한 14개의 질량 서브세트가 재검출된 질량범위를 나타낸다. 앞서 관찰되듯이, 이 분자들은 전립선암 혈청에서의 강도가 대조군과 비교하여 유의하게 낮았다. HPLC-짝지음 TOF-MSA을 이용하여 검출한 14개 각각의 대사산물들에 대한 실측 강도의 평균값의 바 그래프(0에서 1까지 눈금됨)는 도 6에 나타내었다.
실시예 3: 14개 대사산물 서브세트의 MS/MS 특성화
[00143 ] 대사산물의 구조 해명에 사용할 수 있는 다양한 특성들은 정밀 질량과 분자식 결정, 극성, 산/염기 특성, NMR 스펙트럼 및 MS/MS 또는 MSn 스펙트럼을 포함한다. 이 데이터는 특정 대사산물의 지문으로 사용될 수 있으며, 완전한 구조가 결정되는지의 여부에 관계없이 특정 대사산물에 대한 고유의 식별자이다. 이 데이터는 다음을 포함한다:
[00144] 1. LC 지연 시간. 표준화된 조건 하에서 흥미로운 대사산물을 포함하는 추출물을 C18 컬럼과 MS분석을 이용하는 역상 LC-MS에 적용시켜 그들의 지연시간을 결정하였다. 추출물을 LC/MS 분석으로 적용시, 모든 14개 대사산물들은 26-34분의 범위에서 함께 용출되었다.
[00145] 2. MS/MS 스펙트럼들. 충돌 유발 분해(CID)를 사용하여 MS/MS 단편 화를 수행하여, 흥미로운 14개 대사산물들을 보다 더 특성화하였다. 이 MS/MS 분석은 실시간(즉, 크로마토그래피 용출 과정 동안) 또는 크로마토그래피 분리과정에서 분획을 모은 후에 실시하였다.
[00146] 9개의 전립선암과 10개의 정상 시료 추출물의 수용성 분획을 질소 가스 하에서 말려서 증발시키고, 100 uL의 물 : 메탄올 : 포름산 (97.9:2:0.1)에 재용해시켰다. 재용해된 5 μL의 시료를 풀스캔용 HPLC(메타실 AQ 3 um, Cl8, 100 x 2.0 mm 컬럼이 장착된 애질런트 1100 시스템, 배리안 사)와 MS/MS에 사용하였다. 유동층은 물 : 메탄올 : 포름산 (97.9:2:0.1)의 용매 A 및 메탄올에 녹인 0.1% 포름산 용액인 용매 B로 구성되었다. 0.2 ml/분의 유속율로, 다음과 같은 용매 기울기가 형성되었다: 용매 A는 최초 1분 동안 100%로 유지되었으며, 다음 10분 이상 동안 선형 기울기 형태로 20%의 용매 A와 80%의 용매 B로 변하였으며, 그런 다음 9분 동안 20%의 용매 A, 80%의 용매 B로 유지되었으며; 그 다음 10분 동안은 선형 기울기형태로 100%의 용매 B까지 변하였으며, 그리고 15분 동안 100%를 유지하였다. 결국, 용매를 컬럼의 눈금을 조정하기 위하여 20분 동안 100%의 용매 A에서 유지하였다(총 경과시간 65분). HPLC 용출은 ESI(TurboIonSpray™) 소스가 장착된 ABI QSTARㄾ XL 질량 분광계를 이용하여, 양성 및 음성 모드에서 분석하였다.
[00147] 비행시간 풀스캔 모드에 대하여, "TOF-MS" 스캔 형태는 축적시간 1.0 초, 질량범위 50 내지 1500 Da, 그리고 지속시간 60분으로 실시되었다. 양성 ESI 모드에서의 소스 파라메터는 다음과 같다: 이온 소스 가스 1 (GSl) 55; 이온 소스 가스 2 (GS2) 90; 가리개 가스 (CUR) 40; 유동 분무기(Nebulizer Current) (NC) 3.0; 온도 400℃; 광택 제거능(Declustering Potential) (DP) 60; 초점능(Focusing Potential) (FP) 265; 광택 제거능 2 (DP2) 15. 음성 ESI 모드에서의 소스 파라메터는 다음과 같다: 이온 소스 가스 1 (GSl) 55; 이온 소스 가스 2 (GS2) 70; 가리개 가스 (CUR) 40; 유동 분무기(Nebulizer Current) (NC) 0; 온도 400℃; 광택 제거능(Declustering Potential) (DP) -55; 초점능(Focusing Potential) (FP) -265; 광택제거능 2 (DP2) -15.
[00148] MS/MS 모드에서, '생산 이온(product ion)' 검색 형태는 축적시간 1.0 초, 검색범위 50 내지 650 Da 그리고, 지연시간 60분으로 실시되었다. 모든 소스 파라미터는 양성모드에서 충돌 에너지 (CE) 구성 20 V, 35V, 50V 및 음성모드에서 -20 V, -35V, 50V로 상기와 동일하였다. 충돌가스(CAD, 질소)는 5로 구성하였다.
[00149] 해당 분자 구조는 제한된 조건하에서 특별한 단편화 패턴을 나타내며, 고유한 것으로, (사람의 지문과 같은) 분자-심지어, 분자구조의 미세한 차이가 차별적인 단편화 패턴을 만든다. 분자 동정에 대한 지문을 제공하는 것에 추가하여, CID에 의해 만들어진 단편들은 대사산물의 구조에 대한 견해를 얻는데 사용된다.
[00150] 양성 모드 생물 표지자 패널(즉, 정밀질량이 495.3328, 517.3148, 519.3328, 521.3480, 523.3640, 541.3148 및 545.3460인 대사산물)에 대한 가능한 분자식을 구성하는데 있어서, 7개의 생물 표지자 모두 RNO7P과 유사식을 가진다는 것이 밝혀졌으며(R은 가변성의 지방산 형태), 그들은 인지질 콜린-관련 화합물일 수 있다는 것을 나타낸다. MS/MS 해석에 기초하여 제안된 구조는 표 2에 요약하여 나타내었다. 양성 이온화 모드에서 검출되는 7개 대사산물에 대한 단편화 스펙트럼은 도 7 내지 13에 나타내었으며(붕괴 에너지 20 (A), 35 (B) 및 50 (C) 볼트), 단편들의 질량과 분자식 부분은 표 3 내지 9에 나열하였다. 각 표는 CID의 결과에 의한 딸이온 뿐만 아니라, 단편이온의 제안된 구조와 단편소실도 나열하였다.
[00151 ] 양성 모드 ESI에서 얻은 MS/MS 데이터는, 각각의 7개 대사산물이 그들의 MS/MS 스펙트럼에서 분자이온([M+H]+)에 동반하여 생기는 양성자를 추출한다는 것을 나타낸다. 이는 부모이온에서 양성으로 대전된 4가 암모늄이온을 제거하여, 인산기의 양성자화를 암시한다. 모든 대사산물들에서 관찰되는 4가 아민기, (CH3)3NH+, [M+H-60]+)의 손실의 증거는, 이 대사산물들의 콜린 헤드 그룹의 존재로서 확인된다. 포스포콜린(인콜린)(C5H15NO4P+, m/z 184)과 에탄올-4가 아민(C5H14NO+, m/z 104)에서 기인되는 단편이온은 포스포콜린-형태 구조를 제시하는 다른 표시이다. 또한 분자이온에서 H2O의 소실은 라이소지질-형태 구조에 내재되어 있는 sn-2 자리에 유리 하이드록시 그룹의 존재로서 확인 관찰되었다.
[00152] 약하지만, 단편이온들이 sn-1 지방산 곁사슬 또는 그의 소실이 관찰되었다. 예를 들어, 팔미트산이 sn-1 지방산이 되는 곳이라고 생각되는 대사산물 495.3328에 관해서는, m/z 458을 나타내는 단편이온은 그럴듯하게도 C16H32O 단편 소 실 때문인 것으로 확인되었다. 또한 강도는 낮지만 m/z 239 (C16H31O+)의 다른 단편이온은 sn-1 지방산 그 자체를 의미한다는 것을 나타낸다. 이 결과에 기초하여, 이 구조는 2-하이드록시-l-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린으로 제안된다. 495.3328의 구조는 그들의 LC/MS와 MS/MS 스펙트럼 데이터의 비교(표 10에 단편이온 비교를 나타냄)로서 2-하이드록시-l-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (상업적 표준)임이 확인되었다.
[00153 ] 나머지 6개의 대사산물들의 MS/MS 스펙트럼 데이터는 495.3328와 매우 유사하며, 다만 sn-1 지방산 곁사슬에서 차이가 있었다. 대사산물 519.3328 (520 M-H), 521.3481 (522 M-H) 및 523.3640 (524 M-H)의 경우, 그들의 부모 이온(parent ions)에서 H2O의 소실은 단편이온 m/z 518, 520 및 522 각각에 의해 기인되며, 이는 그들의 지방산 곁사슬의 불포화 증가정도가 다양함을 주장한다. 520의 경우에서, sn-1 곁사슬은 리놀레인산이 m/z 281의 단편 이온에서 기인하여 추론되었다. 522 및 524에서, m/z 258의 일반적인 단편은, 그들의 부모이온에서 결국 올레인산과 스테아린산 곁사슬로 각각 확인되는, 오레일 (C15H33O) 및 스테아릴 (C15H35O) 치환기의 소실에 기인되는 것으로 생각되었다. 대사산물 541.3148 (542 M-H)의 경우에서, m/z 225에서의 단편 이온은 에이코사펜타노일 곁사슬의 손실로부터 추론되었다. 상기에서 논의된 MS/MS 데이터를 사용하여, 이 7개의 전립선암 생물표지자의 구조가 제안되었으며, 표 2에 나타내었다.
[00154] 음성 이온화 모드에서 검출된 7개의 대사산물의 단편화 스펙트럼들(즉, 정밀 질량이 481.3171, 531.3123, 541.3422, 555.3101, 565.3394, 567.3546 및 569.3687인 대사산물들)은, 도 14 내지 20에 나타내었다(충돌 에너지 20, 35 및 50 볼트). 분자식에서, 7개의 생물표지자 중 4개(541.3422, 565.3394, 567.3546, 569.3687)는 포스포리피드 에탄올아민 관련 화합물임을 나타내는 RNO9P와 유사한 분자식(R은 가변적인 지방산 형태임)임이 제시하였다. 표 11은 MS/MS 데이터에 기초한 분자식과 분자의 가상 구조를 간략하게 요약하였다. 표 12 내지 18은 단편이온 질량들, 가상의 분자식 및 단편소실 뿐만 아니라, 각 단편의 가상 구조를 나열하여 나타내었다.
[00155] 전자스프레이 이온화(ESI)- 음성모드에서, 각각의 7개의 분자들은 그들의 MS/MS 스펙트럼에서 분자 이온([M-H+]-) 각각의 7개 대사산물이 그들의 MS/MS 스펙트럼에서 분자이온([M+H]+)와 동반하여 생기는 양성자를 잃어버린다. 이는 부모이온에서 음성으로 대전된 인산이온을 제거하여, 인산기의 탈-양성자화를 암시한다. 단편 이온들은 그들의 MS/MS 스펙트럼의 우세한 신호인 생물표지자 481.3168와 541.3422 (팔미틸, C16H31O2, m/z 255), 565.3394 (리놀레일, C18H31O2, m/z 279), 567.3546 (올레일, C18H33O2, m/z 281) 및 569.3687 (스테아릴, C18H35O2, m/z 283)에 대한 sn-1 지방산 곁사슬로서 관찰되었다. 569.3687의 MS/MS 스펙트럼을 그에 대응하는 라이소포스포리피드 에탄올아민 대조구인 2-하이드록시-1-스테아 릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (C23H48NO7P, 추출 질량: 481.317) (상업적 표준)과 비교하여, 다수의 유사성이 발견되었다(표 19 참조). 569.3687의 부모 이온[M+H]- 에서의 초기 단편소실은 화학식 C2H4O2와 관련된 60 달톤 단위의 질량 소실과 동일하였다. 이 단편 소실은, sn2-하이드록시포스포에탄올아민 형태인 일반제형과 유사한 C23H48NO7P 화학식을 갖는 481.3171을 제외하고는, 상기 패널의 모든 표지자에 대하여 일정하였다. 569.3687의 m/z 508 단편을 그의 라이소포스포리피드에탄올아민 상업적 표준(m/z 480)의 부모이온과 비교하여, 단지 28 달톤 단위의 차이가 관찰되었는데, 이는 생물표지자 패널에 대한 N,N-디메틸 포스포에탄올아민 형태의 유도체로 이르게 하였다. sn2 지방산, m/z 242, 168, 153 및 79의 소실 후의 단편소실은 분자의 그럴싸한 디메틸 에탄올아민 형태 골격을 더 확인하는 7개 생물표지자 모두에서 일정하게 관찰되었다.
[00156] 보고된 MS/MS 데이터가 라이소포스포리피드 종 분자와 일치하는 동안, 본 발명은 또한 기능기 또는 보고된 단편이 현재 지적되지 않은 방법과 관련되어 있는 구조를 포함한다.
실시예 4: 초고속 상업적 방법의 개발
[00157] 초고속 처리 검색(HTS) 방법은 전립선암 진단용으로 개발되었다. 하기에 설명한 이 방법은 통상의 실험 방법 및 세계 많은 실험실에 있는 3중-4중극 질량 분광계와 양립 가능하다(13, 14).
[00158] 초고속 분석 검색(HTS)은 Agilent 1100 LC 시스템과 연결된 선형 이온 트랩 질량 분광계(Q-trap 4000, Applied Biosystem)로 수행되었다. 혈청 시료는 실시예 1에서 설명한 바대로 추출하였다. 수용성 분획은 아세토니트릴과 1:3으로 혼합하여 각 시료 분석에 사용하기 전에 단백질을 침전시켰다. 15μL의 내부 표준 (메탄올에 녹인 리서핀(reserpine): 1 OOμg/mL 음성 ESI용; 1 μg/mL 양성 ESI용)과 108μL 의 3 : 1 (아세토니트릴):(2차 증류수에 녹인 l% 포름산)을 각 12μL 로 분배한 시료에 첨가하여 총 135μL을 만들었다. 자동시료기를 이용하여 lOOμL 의 시료를 ABI 4000QTRAP에 흐름-주입 분석(flow-injection analysis (FIA))방법으로 주입하였다. 담체 용매는 60:40 (메탄올):(2차 증류수에 녹인 l% 포름산)이며, APCI 소스에 450μL/분의 유속율로 수행하였다.
[00159] MS/MS HTS 방법은, 터보 V™ 소스, APCI 탐침자가 장착된, 4중극 직선 이온 트랩 ABI 4000QTrap 질량 분광광도계에서 전개시켰다. 소스 가스 파라미터는 하기와 같다: 음성 ESI: (CUR: 10.0, CAD: 6, IS: -4500, TEM: 500, GSl: 50, GS2: 60, 간섭 온풍기 켬. "화합물" 세팅은 하기와 같다: 엔트랜스능(entrance potential) (EP): -10, 및 충돌 세포 출구능 (collision cell exit potential:CXP): -10.0); 음성 ESI: (CUR: 10.0, CAD: 6, IS: 5500, TEM: 500, GSl: 30, GS2: 60, 간섭 온풍기 켬. "화합물" 세팅은 하기와 같다: 엔트랜스능(entrance potential) (EP): 10, 및 충돌 세포 출구능 (collision cell exit potential:CXP): 15.0).
[00160] 이 방법은 각 대사산물들에 대한 2 MRM 전이의 다중 반응 모니터 링(multiple reaction monitoring :MRM) 및 각 방법에 대하여 총 16 MRM의 내부 표준에 대한 2 MRM(러서핀, 다른 화합물이 사용될 수 있음)에 기초하였다. 각각의 전이는 양성 및 음성 ESI 모드에 대하여 100초 또는 70초 동안 각각 모니터하였다. 시료당 총 수집 시간은 약 1분이다. 간단하게, (7명의 환자로부터 채취한) 14개의 생물표지자 각각의 MRM 전이의 강도 및 (1명의 환자로부터 채취한) 2개의 내부 표준 (IS) MRM 전이를 각각의 방법으로 측정하여 표 20에 나타내었다. 그런 다음, 환자당 7개의 생물 표지자:IS 전이의 비율을 최소 평균-표준화 로그(2)(lowest mean-normalized log(2) 값으로 변환하여 결정하여 환자 점수를 책정하였다. 그런 다음 이 값을 정상 개체의 분배점수와 비교하므로써, 전립선암 유험요인을 확인하였다. 상기에서 기술된 방법을 사용하여 각 방법의 7개의 생물 표지자에 대한 생물 표지자 전이 대 내부 표준 전이의 피크 면적의 비율을 구획하여 ABI 4000QTRAP로 MRM 전이 피크 면적을 정확하게 측정할 수 있다는 것을 확인하였다. 게다가, HTS 방법은 또한 추출한 인간참조혈청물질을 희석한 시리즈들을 사용하여 기기에 의한 데이터의 직선성(직선 기울기)을 결정 및 확정시켰다. 만약 눈금조정곡선이 R2 값 < 0.98이면, 그때 시료 분석은 실패한 것으로 생각하고 시료를 다시 분석할 필요가 있다.
[00161] 상술하듯이, 전립선암 HTS 3중-4중극 방법은, 분자의 반은 음성 모드에서검출되고, 나머지 반은 양성모드에서 검출되는 점 때문에 두 가지 독립적인 데이터 수집 장치를 포함한다.
[00162] 양성모드에서 검출된 7개의 라이소포스파티딜콜린 분자(즉, 정밀질량이 495.3328, 517.3148, 519.3328, 521.3480, 523.3640, 541.3148 및 545.3460인 대사산물)에 대하여, 측정에 사용한 전이는 도 21A에 나타냈으며, 각 생물 표지자에 대한 분자당 2개의 딸이온 전이(1개 전이가 사용된 546.3를 제외한, a 및 b)및 시료당 2개의 내부 표준 전이(1 및 2)를 포함한다. 그러므로, 각 생물 표지자 전이를 각 내부 표준 전이로 나누면 생물 표지자당 26개 비율이 얻어진다. 또한 정상 참조 혈청시료는 R-구획 계수를 산출할 수 있는 기기 직선성(직선 기울기)을 얻기 위해 다양하게 희석하어 분석된다. 하기 각 전이 비율에 대한 획득된 데이터 평균 R-구획값은 도 21A에 나타내었다. 희석에 의한 496.3/184.2al의 평균 강도 시료 플랏은 도 21B에 나타내었다. 그런 다음, 비율 데이터는 대조구 개체군의 실측값과 log(2) 변환으로 일반화시켰다. 그리고 나서, 환자에 대한 최소 비율값을 최종 산출 점수로 선별하였다. 그런 다음 최적의 진단 컷-오프 값을 결정하기 위하여 이 환자 점수 분포를 가시화하였다.
[00163 ] 이 방법을 이용하여 대사산물의 발견에 사용되었던 동일한 24개의 전립선암 혈청 시료를 147명의 남성 대조구 시료의 독립된 세트로 확장하여 재분석하였다. 대조군과 전립선암 코허트에서 26개 전이 각각에 대한 평균비율을 도 21C에 나타내었다. 기대하는바와 같이, 각 비율의 강도는 전립선암 코허트가 대조군보다 더 낮다.
[00164] 이 대상에 대한 최종 환자 점수(환자 당 최저 검출 log 비율)는 도 22A에 흩어진 플랏으로 나타내었다. 이 결과들은 24개의 전립선 암 환자(검은 삼 각형)의 환자 점수가 대부분의 질병이 없는 남성 대상(연회색 사각형)에 비해 유의하게 낮음을 명확히 보여준다. 표 22B에서 보여지듯이, 환자 점수에 기초한 플랏 분포는 이전의 발견을 반영하고 있으며, 전립선암(검은 막대기)의 분포가 왼쪽으로 옮겨져 있음을 알 수 있는데, 이는 대조군에 대한 상대적인 전립선암의 환자 점수가 전체적으로 낮은 것을 나타낸다. 도 22A에서 점선으로 표시한 컷오프 환자 점수 -1.25는 약 75% 민감성 (암 환자의 75%가 -1.25보다 낮은 점수를 가짐), 및 91% 특이성(대조군 남성의 91%가 -1.25보다 높은 점수를 가짐)을 나타낸다. 환자 점수를 이용하여 t-test로부터 산출한 대조군 및 전립선암 시료 간의 P-값은 1.09E-14였다.
[00165] 음성모드에서 검출된 7개의 라이소지질 종(481.3171, 531.3123, 541.3422, 555.3101, 565.3394, 567.3546 및 569.3687)에 대하여, HTS 방법의 딸이온 전이를 도 23 A에 나타내었다. 이 방법은 부모이온 당 4개의 비율(2개의 내부 표준 측정 포함)을 산출하고, 환자 시료당 28개 총 비율을 얻는 점에서 양성 모드와 유사하다. 각 비율에 대한 다중 희석 혈청 시료를 분석하여 얻은 평균 R-구획 값을 도 23A에 나타내었다. 첫 번째 전이 비율(480.3/255.4al)에 대한 표준곡선 플랏을 도 23B에 예시로 나타내었다. 기대하는 바와 같이, 각 전이에 대한 비율은 대조군과 비교하여 전립선암 코허트가 상대적으로 낮았으며, 도 23C에 막대그래프로 나타내었다.
[00166] 음성모드에서 검출된 7개의 대사산물에 대한 최종 환자 점수(환자당 최저 검출 log 비율)는 도 24A에 흩어진 플랏으로 나타내었다. 이 결과들은 24개 의 전립선 암 환자(검은 삼각형)의 환자 점수가 대부분의 질병이 없는 남성 대상(연회색 사각형)에 비해 유의하게 낮음을 명확히 보여준다. 표 24B에서 보여지듯이, 환자 점수에 기초한 플랏 분포는 이전의 발견을 반영하고 있으며, 전립선암(검은 막대기)의 분포가 왼쪽으로 옮겨져 있음을 알 수 있는데, 이는 대조군에 대한 상대적인 전립선암의 환자 점수가 전체적으로 낮은 것을 나타낸다. 도 24A에서 점선으로 표시한 컷오프 환자 점수 -1.00는 약 79% 민감성 (암 환자의 79%가 -1.00보다 낮은 점수를 가짐), 및 81% 특이성(대조군 남성의 81%가 -1.00보다 높은 점수를 가짐)을 나타낸다. 환자 점수를 이용하여 t-test로부터 산출한 대조군 및 전립선암 시료 간의 P-값은 4.11E- 14였다.
[00167] 이 분야의 숙련된 사람이라면 알 수 있듯이, 컷오프 값은 민감성 또는 특이성 각각에 따라 올라가거나 내려갈 수 있다. 이 수행은 PSA 검사에서 수행할 수 있는 최상의 것이다. 이 방법이 정확하고 혈청시료에서 재빨리 수행할 수 있기 빼문에, 다른 방법으로 미검출된 경우에 대한 남성 개체군 검사의 확인을 기대할 수 있으며, 따라서 전림선암 사망률에 주요한 효과를 가질 수 있다.
[00168] 또한 당업계에 숙련된 사람이라면 알 수 있듯이, 다양한 서브세트의 전이와 그의 비율은 진단의 정확성을 최적화하기위해 사용될 수 있다. 마찬가지로, 각각의 양성 및 음성 모드 시리즈를 수행하고, 그 결과를 모으고, 조합하는 것은 또한 민감성과 특이성을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, (양성 모드의) 한 가지 방법만을 사용하여 부정확하게 진단된 환자들은 음성모드로 정확하게 분류될 수 있으며, 반대로도 가능하다. 양자택일로, 양성 및 음성 모드 모두로부터 얻은 데이 터가 먼저 수집된 다음, 총 누적된 데이터세트에 기초하여 한 환자에 대한 점수를 산출할 수 있다.
[00169] 모든 인용문은 참조로서 여기에 병합된다.
[00170] 본 발명은 하나 또는 그 이상의 예시로서 설명되었다. 그러나, 많은 변종과 변형이 청구범위에 정의한 본 발명의 범위를 벗어나지 않는다는 것은 이 분야의 숙련된 사람에게는 명백할 것이다.
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Claims (45)
- 하기 단계를 포함하는, 전립선암을 진단하기 위한 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자를 동정하는 방법:a) 하나 또는 그 이상의 전립선암 환자로부터 다수의 대사산물이 함유된 하나 또는 그 이상의 시료를 고해상 질량 분광계에 도입하는 단계;b) 대사산물의 정량 데이터를 획득하는 단계;c) 상기 정량 데이터의 데이터베이스를 생성하는 단계;d) 상기 시료로 부터 얻은 상기 정량 데이터를 하나 또는 그 이상의 참조 시료 중의 하나의 시료의 대응되는 데이터와 비교하는 단계; 및e) 상기 시료와 하나 또는 그 이상의 상기 참조 시료간의 차이가 있는 하나 또는 그 이상의 대사산물 지표를 동정하는 단계,여기에서 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자는 표 1에 나열된 대사산물 또는 그의 조합으로부터 선택되는 것임.
- 제 1 항에 있어서, 최적의 진단을 위하여 필요한 대사산물 표지자의 최소수를 선택하는 것을 더 포함하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 고해상 질량 분광계는 푸리에 변이 이온 사이클로트론 공명 질량 분광계(FTMS)인 방법.
- 하기의 단계를 포함하는, 환자에서 전립선암 또는 전립선암의 위험을 진단하는 방법:a) 상기 환자로부터 시료를 획득하는 단계;b) 상기 시료를 분석하여 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자에 대한 정량 데이터를 획득하는 단계;c) 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자에 대한 정량 데이터를 하나 또는 그 이상의 참조 시료에서 획득한 대응되는 데이터와 비교하는 단계; 및d) 상기 비교를 이용하여 전립선암 또는 전립선암의 위험을 진단하는 단계,여기에서 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자는 표 1에 나열된 대사산물 또는 그의 조합으로부터 선택됨.
- 제 4 항에 있어서, 상기 단계 b)는 액체 크로마토그래피 질량 분광분석(LC-MS)에 의해 시료를 분석하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 방법은 초고속 처리 방법이며, 단계 b)는 직접주입 또는 액체 크로마토그래피 및 선형 이온 트랩 직렬 질량 분광분석에 의한 시료분석을 포함하는 것인 방법.
- 제 4 항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 참조시료는 대조 개체에서 채취한 다수의 시료; 초기 환자에서 채취한 하나 또는 그 이상의 기준선 시료; 또는 그의 조합인 것인 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자는 라이소포스파티딜콜린, 라이소포스파티딜에탄올아민, 라이소포스파티딜디메틸에탄올아민, 라이소포스파티딜세린, 라이소스핑고실포스포릴콜린, 라이소포스파티딜글리세롤, 라이소포스파티딜이노시톨을 포함하는 라이소포스포리피드, 혈소판 활성화 인자 (PAFs) 및 그의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자는 a) 495.3328, b) 517.3148, c) 519.3328, d) 521.3480, e) 523.3640, f) 541.3148, g) 545.3460,h) 481.3171, i) 531.3123, j) 541.3422, k) 555.3101, 1) 565.3394, m) 567.3546 및 n) 569.3687 달톤의 정밀질량 또는 실질적으로 등가인 대사산물을 포함하며; 및 상기 대사산물은 전립선암 환자에서 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 대사산물 a) 내지 g)는 라이소포스파티딜콜린-관련 화합물이고, 대사산물 h) 내지 n)는 N,N-디메틸 라이소포스포에탄올아민-관련 화합물인 방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물은 각각,a) 도 7 및/또는 표 3;b) 도 8 및/또는 표 4;c) 도 9 및/또는 표 5;d) 도 10 및/또는 표 6;e) 도 11 및/또는 표 7;f) 도 12 및/또는 도 8;g) 도 13 및/또는 표 9;h) 도 14 및/또는 표 12;i) 도 15 및/또는 표 13;j) 도 16 및/또는 표 14;k) 도 17 및/또는 표 15;1) 도 18 및/또는 표 16;m) 도 19 및/또는 표 17; 및n) 도 20 및/또는 표 18 에서 보여지는 MS/MS 스펙트럼에 의해 더 특징되는 것인 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물은 각각 분자식 a) C24H50NO7P, b) C26H48NO7P, c) C26H50NO7P, d)C26H52NO7P, e) C26H54NO7P, f) C28H48NO7P, g) C28H52NO7P, h) C23H48NO7P, i) C30H46NO5PJ) C25H52NO9P, k) C25H50NO10P, 1) C27H52NO9P, m) C27H54NO9P 및 n) C27H56NO9P으로 더 특징되는 것인 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물은 각각,
의 구조로 더 특징되는 것인 방법. - 하기의 단계를 포함하는, 환자에서 전립선암 또는 전립선암의 위험을 진단하는 방법:a) 상기 환자로부터 시료를 획득하는 단계;b) 상기 시료를 분석하여 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자에 대한 정량 데이터를 획득하는 단계;c) 내부 대조 대사산물에 대한 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자 각각의 비율을 획득하는 단계;d) 내부 대조 대사산물에 대한 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자의 각각의 비율을, 하나 또는 그 이상의 참조시료로부터 획득한 대응되는 데이터와 비교하는 단계; 및e) 상기 비교를 이용하여 전립선암 또는 전립선암의 위험을 진단하는 단계,여기에서 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자는 표 1에 나열된 대사산물 또는 그의 조합으로부터 선택됨.
- 제 14 항에 있어서, 상기 단계 b)는 액체 크로마토그래피 질량 분광분석(LC-MS)에 의해 시료를 분석하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제 14 항에 있어서, 상기 방법은 초고속 처리 방법이며, 단계 b)는 직접주입 또는 액체 크로마토그래피 및 선형 이온 트랩 직렬 질량 분광분석에 의한 시료분석을 포함하는 것인 방법.
- 제 14 항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 참조시료는 대조 개체에서 채취한 다수의 시료; 초기 환자에서 채취한 하나 또는 그 이상의 기준선 시료; 또는 그의 조합인 것인 방법.
- 제 14 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자는 라이소포스파티딜콜린, 라이소포스파티딜에탄올아민, 라이소포스파티딜디메틸에탄올아민, 라이소포스파티딜세린, 라이소스핑고실포스포릴콜린, 라이소포스파티딜글리세롤, 라이소포스파티딜이노시톨을 포함하는 라이소포스포리피드, 혈소판 활성화 인자 (PAFs) 및 그의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제 14 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자는 a) 495.3328, b) 517.3148, c) 519.3328, d) 521.3480, e) 523.3640, f) 541.3148, g) 545.3460,h) 481.3171, i) 531.3123, j) 541.3422, k) 555.3101, 1) 565.3394, m) 567.3546 및 n) 569.3687 달톤의 정밀질량 또는 실질적으로 등가인 대사산물을 포함하며; 및 내부 조절 대사산물에 대한 대사산물의 비율이 전립선암 환자에서 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 19 항에 있어서, 상기 대사산물 a) 내지 g)는 라이소포스파티딜콜린-관련 화합물이고, 대사산물 h) 내지 n)는 N,N-디메틸 라이소포스포에탄올아민-관련 화합물인 방법.
- 제 19 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물은 각각,a) 도 7 및/또는 표 3;b) 도 8 및/또는 표 4;c) 도 9 및/또는 표 5;d) 도 10 및/또는 표 6;e) 도 11 및/또는 표 7;f) 도 12 및/또는 도 8;g) 도 13 및/또는 표 9;h) 도 14 및/또는 표 12;i) 도 15 및/또는 표 13;j) 도 16 및/또는 표 14;k) 도 17 및/또는 표 15;1) 도 18 및/또는 표 16;m) 도 19 및/또는 표 17; 및n) 도 20 및/또는 표 18 에서 보여지는 MS/MS 스펙트럼에 의해 더 특징되는 것인 방법.
- 제 21 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물은 각각 분자식 a) C24H50NO7P, b) C26H48NO7P, c) C26H50NO7P, d)C26H52NO7P, e) C26H54NO7P, f) C28H48NO7P, g) C28H52NO7P, h) C23H48NO7P, i) C30H46NO5PJ) C25H52NO9P, k) C25H50NO10P, 1) C27H52NO9P, m) C27H54NO9P 및 n) C27H56NO9P으로 더 특징되는 것인 방법.
- 제 22 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물은 각각,
의 구조로 더 특징되는 것인 방법. - 하기의 단계를 포함하는, 전립선암 환자의 치료에 대한 치료 효능성을 평가하는 방법:a) 상기 환자로부터 시료를 획득하는 단계;b) 상기 시료를 분석하여 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자에 대한 정량 데이터를 획득하는 단계;c) 상기 정량 데이터를 하나 또는 그 이상의 참조시료로부터 획득한 대응되는 데이터와 비교하는 단계; 및d) 상기 비교를 이용하여 이 치료가 환자의 건강상태를 호전시킬 것인지를 결정하는 단계,여기에서 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자는 표 1에 나열된 대사산물 또는 그의 조합으로부터 선택됨.
- 제 24 항에 있어서, 상기 단계 b)는 액체 크로마토그래피 질량 분광분석(LC-MS)에 의해 시료를 분석하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제 24 항에 있어서, 상기 방법은 초고속 처리 방법이며, 단계 b)는 직접주입 또는 액체 크로마토그래피 및 선형 이온 트랩 직렬 질량 분광분석에 의한 시료분석을 포함하는 것인 방법.
- 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 참조시료는 대조 개체에서 채취한 다수의 시료; 환자로 부터 채취한 하나 또는 그 이상의 치료전 기준선 시료; 또는 그의 조합인 것인 방법.
- 제 24 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자는 a) 495.3328, b) 517.3148, c) 519.3328, d) 521.3480, e) 523.3640, f) 541.3148, g) 545.3460,h) 481.3171, i) 531.3123, j) 541.3422, k) 555.3101, 1) 565.3394, m) 567.3546 및 n) 569.3687 달톤의 정밀질량 또는 실질적으로 등가인 대사산물을 포함하며; 및 상기 대사산물은 전립선암 환자에서 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 28 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물은 각각,a) 도 7 및/또는 표 3;b) 도 8 및/또는 표 4;c) 도 9 및/또는 표 5;d) 도 10 및/또는 표 6;e) 도 11 및/또는 표 7;f) 도 12 및/또는 도 8;g) 도 13 및/또는 표 9;h) 도 14 및/또는 표 12;i) 도 15 및/또는 표 13;j) 도 16 및/또는 표 14;k) 도 17 및/또는 표 15;1) 도 18 및/또는 표 16;m) 도 19 및/또는 표 17; 및n) 도 20 및/또는 표 18에서 보여지는 MS/MS 스펙트럼에 의해 더 특징되는 것인 방법.
- 제 29 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물은 각각 분자식 a) C24H50NO7P, b) C26H48NO7P, c) C26H50NO7P, d)C26H52NO7P, e) C26H54NO7P, f) C28H48NO7P, g) C28H52NO7P, h) C23H48NO7P, i) C30H46NO5PJ) C25H52NO9P, k) C25H50NO10P, 1) C27H52NO9P, m) C27H54NO9P 및 n) C27H56NO9P으로 더 특징되는 것인 방법.
- 제 30 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물은 각각,
의 구조로 더 특징되는 것인 방법. - 하기를 포함하는, 전립선암 환자의 치료에 대한 치료 효능성을 평가하는 방법:a) 상기 환자로부터 시료를 획득하는 단계;b) 상기 시료를 분석하여 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자에 대한 정량 데이터를 획득하는 단계;c) 내부 대조 대사산물에 대한 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자 각각의 비율을 획득하는 단계;d) 내부 대조 대사산물에 대한 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자의 각각의 비율을, 하나 또는 그 이상의 참조시료로부터 획득한 대응되는 데이터와 비교하는 단계; 및e) 상기 비교를 이용하여 이 치료가 환자의 건강상태를 호전시킬 것인지를 결정하는 단계,여기에서 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자는 표 1에 나열된 대사산물 또는 그의 조합으로부터 선택됨.
- 제 32 항에 있어서, 상기 단계 b)는 액체 크로마토그래피 질량 분광분석(LC-MS)에 의해 시료를 분석하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제 32 항에 있어서, 상기 방법은 초고속 처리 방법이며, 단계 b)는 직접주입 또는 액체 크로마토그래피 및 선형 이온 트랩 직렬 질량 분광분석에 의한 시료분석을 포함하는 것인 방법.
- 제 32 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 참조시료는 대조 개체에서 채취한 다수의 시료; 환자로 부터 채취한 하나 또는 그 이상의 치료전 기준선 시료; 또는 그의 조합인 것인 방법.
- 제 32 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자는 a) 495.3328, b) 517.3148, c) 519.3328, d) 521.3480, e) 523.3640, f) 541.3148, g) 545.3460,h) 481.3171, i) 531.3123, j) 541.3422, k) 555.3101, 1) 565.3394, m) 567.3546 및 n) 569.3687 달톤의 정밀질량 또는 실질적으로 등가인 대사산물을 포함하며; 및 상기에서 내부 대조 대사산물에 대한 대사산물의 비율이 전립선암 환자에서 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 36 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물은 각각,a) 도 7 및/또는 표 3;b) 도 8 및/또는 표 4;c) 도 9 및/또는 표 5;d) 도 10 및/또는 표 6;e) 도 11 및/또는 표 7;f) 도 12 및/또는 도 8;g) 도 13 및/또는 표 9;h) 도 14 및/또는 표 12;i) 도 15 및/또는 표 13;j) 도 16 및/또는 표 14;k) 도 17 및/또는 표 15;1) 도 18 및/또는 표 16;m) 도 19 및/또는 표 17; 및n) 도 20 및/또는 표 18 에서 보여지는 MS/MS 스펙트럼에 의해 더 특징되는 것인 방법.
- 제 37 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물은 각각 분자식 a) C24H50NO7P, b) C26H48NO7P, c) C26H50NO7P, d)C26H52NO7P, e) C26H54NO7P, f) C28H48NO7P, g) C28H52NO7P, h) C23H48NO7P, i) C30H46NO5PJ) C25H52NO9P, k) C25H50NO10P, 1) C27H52NO9P, m) C27H54NO9P 및 n) C27H56NO9P으로 더 특징되는 것인 방법.
- 제 38 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물은 각각,
의 구조로 더 특징되는 것인 방법. - 정밀질량이 a) 531.3123, b) 541.3422, c) 555.3101, d) 565.3394, e) 567.3546, 및 f) 569.3687 달톤으로 측정되거나 실질적으로 등가의 대사산물들로 구성되는 군으로부터 선택되는 화합물.
- 제 40 항에 있어서, 상기 화합물들은 각각,a) 도 15 및/또는 표 13;b) 도 16 및/또는 표 14;c) 도 17 및/또는 표 15;d) 도 18 및/또는 표 16;e) 도 19 및/또는 표 17; 및f) 도 20 및/또는 표 18에서 보여지는 MS/MS 스펙트럼에 의해 더 특징되는 것인 화합물.
- 제 41 항에 있어서, 상기 화합물들은 각각 분자식 a) C30H46NO5P, b) C25H52NO9P, c) C25H50NO10P, d) C27H52NO9P, e) C27H54NO9P 및 f) C27H56NO9P 으로 더 특징되는 것인 화합물.
- 제 42 항에 있어서, 상기 화합물들은 각각,
의 구조로 더 특징되는 것인 화합물. - 전립선암의 진단을 위한 제 40 항 내지 제 43 항 중의 어느 한 항의 하나 또는 그 이상의 화합물의 용도.
- 전립선암 환자의 치료 효능성을 평가하기 위한 제 40 항 내지 제 43 항 중의 어느 한 항의 하나 또는 그 이상의 화합물의 용도.
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