KR20080090515A - 생물학적 샘플의 이미징 방법 - Google Patents

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폴 오렌지
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퍼킨엘머 싱가포르 피티이 리미티드
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Abstract

본 발명은 생물학적 샘플의 이미징 방법 및 장치를 제공한다. 더욱 특히, 이는 이러한 샘플의 구조 및 동력을 연구하기 위해 샘플중에 존재하는 형광종으로부터의 방사광을 검출하는 것에 관한 것이다. 이러한 분석 방법은 샘플을 여기 에너지 펄스로 조사하여 샘플중의 형광종이 형광을 발하게 하고; 펄스 후 소정의 기간 동안 샘플로부터의 방사광을 검출하고; 적어도 시간에 대해 검출된 광의 파장을 생성시키고 저장하고; 상기 소정의 기간의 적어도 일부 동안 동시에 광을 방사하는 3개 또는 그 초과의 상이한 형광종으로부터의 각각의 방사광으로서, 이들의 파장 또는 수명 단독에 의해서는 서로 구별될 수 없는 방사광의 존재를 검출하기 위해 형광종의 각 수명을 참조로 하여 데이타를 분석하는 것을 포함한다.

Description

생물학적 샘플의 이미징 방법 {IMPROVEMENTS IN AND RELATING TO IMAGING OF BIOLOGICAL SAMPLES}
본 발명은 생물학적 샘플의 이미징에 관한 것이며, 더욱 특히, 이러한 샘플의 구조 및 동력을 연구하기 위해 샘플중에 존재하는 형광종으로부터의 방사광을 검출하는 방법에 관한 것이다.
세포는 고도의 복합체이며, 이들의 연구는 다중 상호작용 성분에 대한 정보 수집이 필요하며, 따라서, 다중 파라미터 (멀티플렉싱: multiplexing)가 요구된다. 통상적인 방법은 샘플로 유입되는 다중 형광종 (예를 들어, FITC) 또는 샘플내에서 합성되는 다중 형광종 (예를 들어, GFP), 및 샘플중에서 자연 발생하는 다중 형광종 (예를 들어, NADH)을 사용하고, (상이한 방사 파장에 대한) 검출 채널을 매칭하여 이러한 정보 즉, 라벨당 하나의 채널 수집을 사용하는 것이다. 이러한 방법은 일반적으로, 라벨의 스펙트럼 방사 중복 및 낮은 광 조건하에 검출기의 스펙트럼 구별 능력으로 인해 약 3개 또는 4개 (N = 3 또는 4)의 다중 멀티플렉싱 형광종에 제한된다. 대안적으로, 형광종은 이들의 형광 수명에 기초하여 구별될 수 있다. 또한, 이는 1회에 적당한 수의 검출 채널에 제한된다 (M = 2 또는 3). 통상적으로, 이들 검출 양식은 상이한 장치에서 이용가능하며, 수득된 정보는 실험간에 서 로 상관되어야 한다. 게다가, 측정은 전형적으로 큐벳 (cuvette)에서 이루어지며, 이는 여러 성분의 복합 혼합물을 함유할 수 있다.
스펙트럼 분해 형광
형광종 (형광물)은 전형적으로, 단파장 범위내의 여기 스펙트럼 (피크 형태) 및 장파장 범위내의 방출 스펙트럼 (피크 형태)을 나타내며 (도 1a), 여기 스펙트럼은 파장에 따라 바닥 상태에서 형광종을 여기시키는 입사광자의 가능성을 설명한다. 짧은 기간 후, 여기된 종은 전형적으로 광자를 방사하여 바닥 상태로 복귀된다. 방사된 광자가 특정 파장을 가질 가능성이 방사 스펙트럼에 의해 기술된다.
형광 공정은 비효과적이며, 방사광은 사용된 여기광 보다 세기가 훨씬 낮으며, 전형적으로 1% 보다 훨씬 낮다. 특정 구체예에서, 특정 종은 전형적으로, 특정 여기 파장밴드에 걸쳐 방사된 광을 갖는 공급원으로부의 광에 의해 여기된다. 방사된 광중에서, 특정 방사 또는 검출 파장밴드는 검출 하위시스템으로 전달하기 위해 선택될 수 있다 (도 1b). 여기는 레이저와 같은 좁은 밴드 공급원이거나 램프 (예를 들어, 크세논 또는 수은)와 같은 넓은 밴드 공급원일 수 있으며, 이로부터 적합한 파장밴드가 선택된다. 방사 파장밴드는 광학 필터를 사용함으로써 선택될 수 있다.
전형적으로 형광종의 여기 스펙트럼과 방사 스텍트럼간에는 중복되는 부분이 존재하기 때문에, 사용될 수 있는 방사 또는 검출 파장밴드와 여기 파장밴드에 대한 실제적인 제약이 존재한다. 넓은 방사 또는 검출 파장밴드를 이용하는 것이 바람직한데, 이는 방사광이 검출될 가능성이 더 클수록, 장치가 이러한 종에 더욱 민 감할 수 있기 때문이다. 여기광은 전형적으로 방사광보다 세기가 더욱 크기 때문에, 일반적으로 검출기에 대해 이용가능한 광의 방사 파장밴드는 사용된 여기 파장밴드의 일부를 포함해서는 안되며, 그렇지 않으면 이는 검출기를 압도하거나, 형광종의 부재하에 거짓 배경 시그널을 초래할 것이다. 대상 형광종이 저농도로 존재하는 경우, 낮은 배경을 유지하는 것이 특히 중요하다. 따라서, 검출 효율을 증가시키기 위해 단파장에 대한 방사 또는 검출 파장밴드를 확장시키기 위해서는, 여기 파장밴드가 더욱 단파장 쪽으로 그리고, 여기 피크로부터 가능한 멀리 위치해야 하나, 이는 빈약한 여기 효율을 초래한다. 특정 구체예는 전형적으로, 여기 파장밴드 및 방사 또는 검출 파장밴드 선택의 주의 깊은 균형을 포함한다.
샘플이 2개 또는 그 초과의 형광종을 포함하는 경우, 상황은 더욱 복잡해지는데, 여기에는 추가적인 균형이 이루어져야 한다. 개별 형광종은, 하나의 형광종이 신호를 보낸 후 잇따라서 또 다른 형광종이 신호를 보내거나 (일시적 멀티플렉싱), 다중 여기 파장밴드 및 방사 파장밴드가 간섭되지 않도록 선택되어야 한다. 파장밴드 폭 및 위치의 선택이 더욱 제한되기 때문에, 단일 형광종으로의 검출과 비교하여 매우 민감한 것으로 여겨진다 (도 1c). 어느 경우이든, 사용된 형광종은 주의깊게 선택되어야 하는데, 매우 유사한 여기 및 방사 스펙트럼을 갖는 형광종은 구별되지 않을 수 있기 때문이다. 게다가, 일부 형광종은 이들의 여기 및 방사 스펙트럼에서 현저한 이차 피크를 가지며, 이는 다중 형광종의 검출을 간섭하여, 이용가능한 감도 및 계조를 제한한다.
형광 검출 방법은 큐벳 또는 웰의 샘플에 적용될 수 있으며, 예를 들어, 퍼 킨엘머 (PerkinElmer), 써모 일렉트론 바리오스칸 (Thermo Electron Varioskan) 및 테칸 (Tecan)에 의해 판매되는 많은 시중의 장치에서 사용가능하다. 추가적인 성분을 적합하게 선택하면서, 이들은 이미지 양식으로 적용될 수 있어 세포 또는 조직과 같은 샘플의 이미지를 생성시킬 수 있으며, 여기서 각 화소는 이러한 지점에 대해 측정된 값에 상응하는 수치로 나타낸다. 적합한 형광 현미경은 제이스 (Zeiss), 니콘 (Nikon), 올림푸스 (Olympus) 및 레이카 (Leica)와 같은 공급업체로부터 입수가능하며, 적합한 성분은 CRI와 같은 공급업체로부터 입수가능하다.
다중 스펙트럼 감광성 검출기가 장착된 이미징 장치가 기술되어 있다 (예를 들어, 32 in Zeiss 510 META). 그러나, 넓은 방사 피크를 갖는 많은 형광종에 있어서, 채널당 포획된 광자 수는 통계학적으로 유사하여, 스펙트럼 중복 및 민감성의 제한을 극복하는 것이 불가능하다 [Neher 2004]. 전형적으로, 자외선 및 적외선으로 연장된다면 (250nm 내지 1100nm), 장치는 가시 파장밴드 (400nm 내지 700nm) 및 4개의 형광종을 사용하는 경우 3개 이하의 형광종을 측정하도록 제한된다.
연구 및 약물 개발을 포함하는 생물 시스템 연구에서 특유의 중요한 한 적용 분야는 FRET (형광 공명 에너지 전이)로서 공지된 시스템이다 [Berney 2003]. 본 기법에서, 대상 종은 하나의 형광 라벨 (도너)로 라벨링되며, 제 1 종과 상호작용하는 것으로 여겨지는 제 2 종은 추가의 형광 라벨 (어셉터)로 라벨링되며, 이러한 제 2종의 형광 라벨은 도너의 여기 스펙트럼이 어셉터의 여기 스펙트럼과 스펙트럼 중복되도록 주의 깊게 선택된다. 대상의 두 종이 매우 근접한 경우 (그리고, 양극 자 배향과 같은 다른 인자가 유리한 경우), 에너지는 여기된 도너로부터 어셉터로 전이될 수 있으며, 그 후, 어셉터는 광자를 방출한다. 양 도너와 어셉터의 방사 변화를 측정하여 FRET의 존재 여부 또는 다른 것을 결정할 수 있으며, 이렇게 해서, 대상이 되는 두 종이 매우 밀접한 경우, 상호작용할 것이다. 본 방법은 감지될 특정 종에 민감한 도메인이 두개의 형광물 (하나는 도메인으로서 작용하고, 다른 하나는 어셉터로 작용함)와 결합되고, 감지될 종의 존재로 인해 바이오센서의 기하학적 배열을 변형되어 두 형광물의 형상이 변형되고, FRET가 증가하거나 저하되는, 바이오센서 프로브와 함께 사용되는 경우 특히 강력하다. 많은 세포 시그널 종에 대해 민감한 이러한 바이오센서는 기술되어 있으며, 이는 연구할 경로를 제공해준다 [Schultz 2005].
그러나, FRET 기법은, 종종 적당한 제어기에 의해 다루어질 수 있지만, 여기 및 측정 채널에서의 혼선으로 인해 스펙트럼 수단을 이용하여 신뢰할 만한 측정치 수득의 려움을 포함하는 많은 문제가 있다 [Berney 2003]. 도너 및 어셉터 여기 및 방사 피크에 의해 흡수된 실제적인 스펙트럼 밴드폭은 제공된 샘플내에 하나 초과의 FRET 시스템을 수행하는 것을 배제시킨다.
형광종이 잘 규정된 여기 및 방사 스펙트럼을 갖는 경우, 상황이 단순화될 수 있으며, 일부 멀티플렉싱 성능을 달성할 수 있다. 예를 들어, 양자점은 공통의 여기 스펙트럼 및 매우 좁은 방사 피크를 갖는 것으로 널리 공지되어 있다. 이와 같이, 단일의 여기 파장은 수개의 좁은 밴드 방사 필터와 사용되어 동시에 수개의 종을 검출할 수 있다.
시분해형광 (time resolved fluoresence)
형광종을 검출하고 구별하기 위한 대안적인 방법은 고속으로 여기 에너지를 변조시키고, 방사 에너지의 생성 변조를 시험하는 것이다. 많은 형광종이 수명 (원래 세기의 1/e가 되는 시간)으로서 기술된 여기와 방사간의 특성 붕괴 (소수 밀리세컨드 내지 나노세컨드 미만)를 나타낸다. 이러한 파라미터는 종을 구별하는데 사용될 수 있다.
도 2에서, 특징적 수명 T1이 T2보다 훨씬 짧은 경우, 여기 펄스는 특성 수명 T1 및 T2를 갖는 종 S1 및 S2를 자극한다. 전형적으로, 이러한 기능은 여기 공급원을 펄싱시키거나, 방출된 광자의 도달 시간을 측정하거나 (시간상관 단일 광자 계수 또는 TCSPC), 여기 펄스 (또는 시분해 형광 수명) 후 주어진 시간 영역에서 수집된 광을 측정하거나 주파수 변조 공급원과 검출 시그널간의 상 이동을 측정함으로써 (주파수-도메인 방법) 수행될 수 있다. 시간 영역을 변경하고, 적합한 교정치를 적용함으로써, 화학종이 구별될 수 있다. [Munster 2005] 참조.
일부 분자는 매우 긴 수명을 갖는데, 희토류 (란탄족) 화합물 등 (예를 들어, 루테늄)은 1000 이하의 마이크로세컨드의 수명을 나타내며, 생명과학연구에 유용한 분석 방법론의 범위를 신장시키는데 사용되었다. 이는 산란 및 자가-형광을 제거하여 더욱 양호한 선택성 및 대비성을 유도하는 시분해 특성으로 인해, 단독으로 스펙트럼 판별에 기초한 것보다 더 높은 민감도 및 더 큰 계조를 특징으로 한다.
많은 소분자는 나노세컨트 범위의 수명을 갖는다 [ISS website]. 예를 들 어, PURETIME 범위의 분자는 2ns 내지 300ns의 수명을 갖는다. 고유종 예컨대, FAD 및 NADH (자가-형광)으로 인한 단파장광 (500nm 및 그 미만)으로 여기되는 경우 일부 생물학적 조직 및 세포 샘플은 형광을 나타낸다. 이들 종은 전형적으로, 짧은 수명을 갖는 넓은 범위의 방사를 나타낸다. 이는 추가적인 라벨링 종 없이 반대되는 공급원으로써 사용될 수 있거나, 대상 형광종의 관찰을 방해할 수 있다.
희토류 (란탄족)에 기초한 수명 검출 기법 및 적용은 시분해 형광 (TRF) 및 나노세컨트 수명으로서 통상적으로 이용가능하다. 많은 시중의 장치는 큐벳 또는 웰 예컨대, 퍼킨엘머 엔비젼 (PerkinElmer EnVision), 써모 일렉트론 바리오스칸 (Thermo Electron Varioskan), 테칸 울트라 (Tecan Ultra)로부터의 판독을 위해 사용될 수 있으며, 이들은 플래쉬 램프 또는 펄싱된 다이오드 공급원을 사용한다. 적합한 소프트웨어는 수명 추정치로 수집된 지연 커브를 전환시킨다. 현존하는 시스템은 특정 범위의 수명 종에 대해 구성되며, 2-3개 초과의 종을 처리할 수 없다.
추가적인 성분을 적합하게 선택하면서, 형광 수명 측정치는 이미징 양식으로 적용되어 세포 또는 조직과 같은 샘플의 이미지를 생성시키며, 여기서, 각각의 픽셀 (pixel)은 이러한 지점에 대해 측정된 값에 상응하는 수를 대표한다. 시중의 다중-광자 마이크로스코프; CCD 카메라가 구비된 다중-채널 플레이트 (MCP) 또는 게이팅된 광증폭기를 사용하는 맞춰진 주파수 도메인; 및 수명 추정치를 컴퓨터처리하는데 필요한 후속 처리를 다시 수행되는 공급업체 예컨대, 베커 (Becker) 및 히클 (Hickl)로부터의 TCSPC 시스템으로 업그레이딩된 것을 포함하는 많은 이러한 현미경이 개발되었다 [Munster 2005]. 그러나, 이들 시스템은 매우 느리며, 단일 이미지를 수집하는데 많은 시간이 소모되게 하여 동역학 과정을 모니터링하는 것이 어렵다.
적합한 어셉터의 존재하에 도너의 형광 수명이 저하될 수 있기 때문에, FRET는 형광 수명 측정 시스템에 대한 대중적인 적용법이다 (도 3a). 도너 수명의 변화 측정은 종종 초기에 기술된 스펙트럼 FRET 방법보다 인공물에 덜 민감하다. 최근에는, '다크' 어셉터 (비방사성 붕괴 경로를 가져, 광을 방사하지 않는 어셉터) [Ganesan 2006]를 사용함으로써, 단지 도너 방사만이 관찰되어 (도 3b) 요구되는 스펙트럼 밴드폭이 감소된 클리너 시스템을 유도할 것이다.
멀티플렉싱 (Multiplexing)
형광종들을 구별하기 위한 현존하는 방법은 일반적으로 도 4a에 도시된 바와 같은 단지 파장길이를 이용하거나; 도 4b에 도시된 바와 같이 단지 수명을 이용한다. 도 4a에서, 두개의 종 A 및 B는 유사한 수명을 가지며, 상이한 방사 스펙트럼을 가져, 그래프는 스펙트럼 축에서의 광자에 대해서는 두개의 피크를 나타낼 것이나, 수명에 있어서는 단지 하나를 나타낸다. 다른 한편, 도 4b에서는, A 및 C는 유사한 방사 스펙트럼을 가지나, 두개의 구별되는 수명을 나타내어, 그그래프는 수명에 있어서는 두개의 피크를 가지나, 파장밴드 축에서는 단지 하나의 피크를 나타낸다.
제한된 시간 및 스펙트럼 분해 멀티플렉싱은 문헌 [Vikstroem 2004]에 기술되어 있으며, 여기서 두개의 란탄족 (430nm에서 여기하고, 615nm에서 방사하며, 수명이 730us인 유러퓸; 및 340nm에서 여기하고, 643nm에서 방사하며, 수명이 50us인 사마륨) 및 하나의 즉발성 형광 (prompt fluorescence) 라벨 (485nm에서 여기하며, 535nm에서 방사하는 SYTO24)이 기술되어 있다. 그러나, 파장에 있어서 하나의 종을 검출하고, 수명에 있어서 두개의 종을 검출하는 것을 넘어서는 완전한 멀티플렉싱은 기술되어 있지 않다. 도 4c에서 F는 나노세컨드의 수명을 가지며, 535nm에서 방사되는 소분자이며, D 및 E는 긴 수명 라벨 (둘 모두 615-640nm에서 730us 및 50us)이다. 도시된 바와 같이, 단독의 특징적인 방사 스펙트럼 또는 수명을 지닌 라벨을 구별할 수 있지만, 535nm 채널의 수명은 측정되지 않았다.
추가적인 문헌 [Vikstroem 2004b]에는 다음과 같은 4개의 판독결과를 분석하는 방법이 기술되어 있다: 흡착제, 시분해 형광 및 형광 판독 모드의 조합을 이용한 세포 스트레스 (흡착 염료 이용), 세포 증식 (사마륨-기재 라벨 이용), DNA 단편화 (유러퓸-기재 라벨 이용) 및 세포 수 (형광 염료 이용). 언급된 이점은 동일한 웰로부터 모든 필요한 판독값을 얻을 수 있어, 전형적인 방사성 판독결과와 비교하여 재료 및 수고가 덜 든다. 그러나, 판독결과들은 동일한 시점에서 얻을 수 없으며, 특히, 세포는 시분해 형광 및 형광 판독 전에 고정되고 항체로 라벨링된다. 이러한 방법은 또한, 측정을 위한 포인트 (PMT) 검출기가 구비된 웰 플레이트 리더 (well plate reader) (EnVision system from PerkinElmer)를 사용하며, 따라서, 어떠한 이미징도 사용하지 않으며; 시간에 따른 판독값을 유도하지 못한다.
문헌 [Hanley 2002]에는, 조합된 스펙트럼-수명 현미경이 기술되어 있으며, 공간 광변조기 (SLM) 코딩 시스템 및 MCP/CCD 검출기가 구비된 주파수-도메인 시스템에 기초한 이러한 시간은 측정치가 스펙트럼 (430nm 내지 750nm 범위에 걸친 50 밴드) 및 수명 둘 모두로 이루어지게 하며, 하드마드 (Hadmard) 변환을 이용하여 재구성되게 한다. 제시된 데이타는 도 4d에 도시된 바와 같으며, 여기서 두개의 군집 A 및 B는 동일한 방사 영역에 걸쳐 상이한 수명을 나타내며, 도 4e의 두개의 군집 A 및 B는 방사 파장밴드에 따른 다양한 수명을 나타낸다. 문헌 [Hanley 2001] 참조.
멀티플렉싱을 위한 추가의 방법은 금속 이온 [Komatsu 2005] 또는 키나아제/포스포리파아제 [Schultz 2005]의 존재하에 여기-방사 스펙트럼을 변화시킴으로써 하나 초과의 생화학 종에 대해 민감한 바이오센서를 사용하였다. 그러나, 이는 이들의 세기가 바이오센서 및 바이오센서에 민감한 종의 농도의 측정치이며, 이 둘을 혼동한다는 단점을 갖는다. 절대 추정치가 수득되는 경우 기타 대조군은 정위에 위치해야 한다.
본 발명의 요약
본 발명은
(a) 다수의 형광 종을 포함하는 생물학적 샘플을 제공하고;
(b) 여기 에너지의 펄스 (pulse)로 샘플을 조사하여 샘플중의 형광종이 형광을 발하게 하고;
(c) 펄스 후 소정의 기간 동안 샘플로부터 방사광을 검출하고;
(d) 적어도 시간에 대한 검출된 광의 파장을 표시하는 데이타를 생성시키고 저장하고;
(e) 형광종 각각의 수명을 참조하여 데이타를 분석하여, 상기 소정 기간의 적어도 일부 동안 동시에 광을 방사하는 3개 또는 그 초과의 상이한 형광종으로부터의 각각의 방사광으로서, 이들의 파장 또는 수명 단독에 기초하여서는 서로 구별될 수 없는 방사광의 존재를 검출하는 것을 포함하여, 생물학적 샘플을 분석하는 방법을 제공한다.
본 방법은 다수의 형광종을 함유하는 샘플로부터 더 많은 측정치의 획득을 용이하게 하며, 샘플의 구조 및 계조로 통찰범위를 더 크게 할 수 있다. 항상 샘플은 여기 에너지로 방사되며, 이는 샘플을 변형시키고/거나 손상시킬 위험이 있으며, 따라서, 각 여기로부터 도출될 수 있는 데이타 및 정보의 양을 최대화시켜야 한다.
현 발명은 조합된 파장 및 수명 측정 기법의 이용을 제안한다. 파장 측정에 의해 N 종간을 구별할 수 있으며, 수명 측정에 의해 M 종간을 구별할 수 있다면, 여기 및 검출 하위시스템의 면밀한 파리미터화에 의해 전체 MxN 종간을 구별하는 것이 가능하다는 개념이다. 본 발명자들은 이를 완전 또는 진정 멀티플렉싱으로 칭하였다. 예를 들어, 도 5에 제시된 시스템에서, 주의 깊의 형광물 선택을 통해, 파장 측정 및 수명 측정을 수행하고, 필요한 대수를 적용시킴으로써 네개의 종 A B C 및 D를 구별할 수 있다. 이 경우, 전형적으로 최대치 (M, N) 및 적어도 M+N-1 내지 MxN으로 가능한 샘플의 수를 증가시킨다. M=2이고, N=3인 경우 (오늘날 기법에 각각 정당한 수), 3 또는 (2+3-1=)4 종 내지 (2x3=)6 종이라는 증가를 나타낸다. 신속한 획득에 의한 연구할 공정이 더욱 신속해지고 광-탈색이 덜해진다는 이점이 있다. 이러한 방식으로, 라벨의 스펙트럼 및 수명 특징 둘 모두가 활용될 수 있으며, 크게 증가된 융통성을 실험 개발자에게 제공할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 검출 단계 (c)는 상기 소정의 기간 동안 파장 영역에 걸쳐 샘플로부터의 방사광의 세기 분포를 검출하고, 상기 소장의 기간 동안 샘플로부터의 방사광의 조합된 세기를 검출하는 것을 포함한다. 그 후, 이러한 검출 과정에 의해 유도된 시그널을 분석용 데이타로서 저장한다. 예를 들어, 대수 기법을 이용하여 수집된 데이타로부터 샘플중의 3개 또는 그 초과의 상이한 형광종으로부터 각각의 방사광의 존재를 추론하였다. 샘플중에 존재하는 형광종에 대한 정보가 있는 경우, 검출된 세기를 개별 종의 방사에 관련시키는 연립방정식이 전개된 후, 수집된 데이타를 이용하여 풀 수 있다.
샘플은 여기 에너지 범위를 스캐닝함으로써 조사될 수 있다. 또한, 샘플은 샘플의 다수의 여기 에너지 펄스 또는 각각의 여기 에너지 범위에 의해 조사될 수 있다.
추가의 수행시, 샘플로부터의 방사광의 양극화와 관련된 데이타가 저장되고 분석될 수 있다. 기타 파라미터 예컨대, 여기 파장 및 양극화에 대한 광 검출을 확대시켜 더 큰 멀티플렉싱을 가능하게 하고, 심지어 더 많은 수의 형광종의 구별을 가능하게 한다.
바람직하게는, 샘플로부터의 방사광의 공간 분포를 검출하고 저장한다.
광은 소정의 기간 동안 일련의 간격을 두고 또는 소정의 기간 동안 연속적으로 검출될 수 있다.
본 발명은 추가로, 소정의 기간의 적어도 일부 동안 광을 동시에 방사하는 3 개 또는 그 초과의 상이한 형광종으로부터의 각각의 방사광으로서, 이들의 파장 또는 수명 단독에 기초하여서는 서로 구별될 수 없는 방사광의 존재를 검출하기 위해, 상기 소정의 기간 동안 샘플로부터의 방사광을 기록한 데이타를 분석하기 위한 처리 수단을 포함하는, 다수의 형광종을 포함하는 생물학적 샘플을 분석하기 위한 장치를 제공한다.
본 장치는 하기로부터 선택된 광 검출 수단을 포함할 수 있다: 하나 이상의 PMT, 공간 민감성 검출기 (a spatially senstive dectector), 이미징 검출기, 공간 분할 이미징 검출기, 및 파장 민감성 검출기 어레이.
본 발명의 추가의 양태에 있어서, 소정의 연속된 펄스를 방출하기 위해 형상화될 수 있는 여기 광 공급원이 사용될 수 있다. 기간, 모든 펄스 또는 각 펄스의 파장밴드 및/또는 세기, 및/또는 펄스간의 길이의 사전 선택이 용이해질 수 있다.
본 발명의 구체예에 의해 제공된 이점은 다중 형광종을 멀티플렉싱함으로써 세포 시스템에 대한 더 많은 관련 정보 및 더 많은 특이적 정보에 접근할 수 있다는 것을 포함한다. 특히;
ㆍ 유사한 형광종 분리. 유사한 화학 구조를 갖는 형광종은 유사한 화학 특성을 가질 것이며, 유사한 형광 여기/방사 특성을 가질 것이다. 추가적인 대조군 필요 없이 수명에 기초하여 이들을 구별하는 것이 가능할 수 있는데, 이들 대조군이 내재 측정치에 의해 제공되기 때문이다.
ㆍ 배경 제거. 강하게 간섭하는 배경 시그널을 생성하는 유리 형광종이 결합된 형광종과 구별될 수 있다. 이는 세척 단계를 생략하고, 액체 상 분석을 허용 하고, 더 높은 속도의 수명 이미징을 허용하는데 유용하며, 이는 생 세포 성향, 동력, 세포 활성 및 독소 반응의 조절에 대한 정보에 접근할 수 있게 한다.
ㆍ 멀티플렉싱은 세포 생존도 (생/사) 및 이종성 세포 유형의 실험(공간 이미징)을 포함하는 기능성 정보를 통합시킬 수 있다.
ㆍ 형광종의 수명 및 스펙트럼 특성은 종의 미세환경에 따라 변할 것이다. 다중 측정치로 변화를 실험하여 다중 형광종의 존재에 대한 정보 및 종의 미세환경에 대한 정보에 접근할 수 있다.
수득된 파라미터는 약물 개발 동안 분석 종말점을 결정하기 위한 스크리닝 및 독성 시험에 이용될 수 있다. 다중 파라미터가 자극 후 이미지 세트의 공간적 및/또는 시간적 분석으로부터 도출된 다중 측정치 (전위 등)로부터 결정될 수 있는 고함량 스크리닝 시스템이 최근 개발되었다. 이러한 방법은 또한, 본원에 기술된 방법을 이용하여 도출된 측정치에 적용될 수 있다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 구체예는 첨부된 개략도를 참조하여 예로서 기술될 것이다:
도 1a 내지 1c는 종래 형광 검출 기법을 나타내는 파장에 대한 증폭의 플롯이다;
도 2는 종래 기술에 따른 형광 수명을 나타내는 시간에 대한 증폭의 플롯이다;
도 3a 및 3b는 공지된 FRET 기법을 나타내는 파장에 대한 수명의 플롯이다;
도 4a 내지 4e는 종래 기술에 따른 형광종간의 구별을 나타내는 파장에 대한 수명의 플롯이다;
도 5는 본 발명의 구체예에 따른 다중 형광종간의 구별을 나타내는 파장에 대한 수명의 플롯이다;
도 6은 본 발명의 추가의 구체예에 따른 다중 형광종간의 구별을 나타내는 파장에 대한 수명의 플롯이다;
도 7은 본 발명의 추가의 구체예에 따른 파라미터 범위에 기초한 형광종간의 구별을 나타낸다;
도 8은 본 발명의 구체예에 따른 형광 검출 장치 배치를 나타낸 흐름도이다;
도 9는 본 발명을 이용한 FRET 적용을 위한 파장에 대한 수명의 플롯이다;
도 10a 내지 10c는 본 발명을 이용한 3개의 추가의 적용예에 대한 파장에 대한 수명의 플롯이다.
본 발명의 구체예는 도 6에 도시되어 있으며, 여기서 종 A, B, C, D, E 및 F는 본원에 기술된 기법을 이용하여 조합된 파장 및 수명 도메인으로 구별될 수 있다. 파장 단독의 측정은 B/C/F로부터 A/E/D를 구별해낼 수 있으나, A, D 및 E를 구별할 수 없으며, B, C 및 F에 있어서도 마찬가지다. 반면, 수명 단독의 측정은 A/F, B/E 및 C/D를 구별할 것이나, 이들 쌍 간에는 구별할 수 없다. 실제로, 이들 6개 종을 구별하기 위한 단순한 파장 단독의 또는 수명 단독의 방법의 조합은 존재하지 않는다.
상기 도면은 종으로 밀집되는 큰 유리 영역에 의해 더 큰 멀티플렉싱 (검출, 시간 등의 제한하에)을 허용한다는 것을 명백히 보여주고 있다. 이는 낮은 배경으로 인해 노이즈 (noise)에 대한 개선된 시그널을 제공한다. 자가-형광 간섭은 전형적으로 짧은 수명 영역 (<2ns)에서 나타나며, 점점 엷어진다. 검출은 여기 및/또는 방사 파장 스캐닝, 추정된 선광에 대한 양극화 (도 7) 및 이들의 조합에 의해 확대될 수 있다.
형광 검출 장치의 구체예는 도 8에 도시되어 있다. 이는 하기를 포함한다:
- 적어도 시간내에 변조될 수 있으며, 여기 밴드가 선택될 수 있는 여기 광원 (1);
- 이러한 여기 에너지를 샘플에 전달하기 위한 전달 수단 (2);
- 적어도 형광을 나타낼 가능성을 갖는 하나 이상의 종 (3a)을 함유하는 샘플 홀더중의 샘플 (3);
- 샘플로부터의 방사 에너지를 검출기로 전달하기 위한 전달 수단 (4);
- 타임 게이팅 및 필터의 조합을 이용하여 적어도 시간 및 파장을 포함하는 방사 에너지의 일부 특이적 양태에 민감하며, 방사 에너지가 인도되는 하나 이상의 검출기 (5);
- 검출기로부터 추가의 처리, 분석 및 디스플레이 (7)를 위한 디지탈 저장 기기 예컨대, 컴퓨터 메모리로 시그널을 포획하기 위한 수단 (6).
바람직한 구체예에서, 방사 광원 (1)은 애자일 (agile)이다. 즉, 이는 특이적 펄스 프로토콜을 방사하도록 프로그래밍될 수 있으며, 여기서 펄스 기간, 각 펄스의 파장밴드 및 파워, 및 펄스간의 시점이 특정화될 수 있으며 신속하게 변화될 수 있다. 이는 넓은 영역에 걸쳐 특정 펄스 유형 및 붕괴 수명에 대한 상기 종의 민감도에 따라 샘플중의 포화된 특정 종을 선택적으로 여기시키는데 사용될 수 있으며, 예를 들어, 긴 ms 수명의 란탄족과 짧은 ns 수명 소분자 종을 조합하여, 현존하는 장치의 조계 범위를 극복하고, 포획 속도를 향상시킬 수 있다.
추가의 구체예에서, 검출기 (5)는 상이한 파장밴드에 대한 민감한 영역을 갖도록 형상화되어, 모든 광자가 포획될 수 있다. 유입 광자는 먼저 다이클로익 미러 (dichroic mirror)에 의해 이들의 파장 밴드에 따라 두개의 빔으로 분리된다. 그 후, 광자는 두개의 타임-게이팅된 검출기중 하나로 투영된다. 이는 특정 시간 영역내의 모든 광자가 하나 또는 다른 하나의 검출기에 의해 포획되게 한다. 이는 파장 및 수명 데이타 둘의 수집을 가능하게 하여, 더욱 효과적이며 더욱 신속하며, 탈색이 덜 발생한다.
또 다른 구체예에서, 검출기 (5)는 광자 에너지 및 타이밍 둘 모두에 민감한 검출기로 대체된다 [Fraser 2003]. 이는 파장 및 수명 데이타 둘의 수집을 가능하게 하여, 더욱 효과적이며 더욱 신속하며, 탈색이 덜 발생한다.
여기 광원 (1)은 하나 또는 그 초과의 레이저, 다이오드 레이저, DPSS, 광방사 다이오드 및/또는 초광대역 광원을 포함할 수 있다.
전달 수단 (2)은 하나 또는 그 초과의 렌즈 어셈블리, 광학 섬유, 미러, 다이클로익 등을 포함할 수 있다.
샘플 (3)은 세포, 흡착 세포층, 세포의 현탁액, 또는 비드 어셈블리를 포함할 수 있다. 샘플 홀더는 Z 축에 따라 수송하기 위한 메카니즘, 캐리지, 및 XY에서의 수송기, 및 생 세포를 위한 인큐베이버, 유체 분산 및 온도 조절을 위한 수단을 포함할 수 있다. 형광종 (3a)은 하나 또는 그 초과의 형광 소분자 예컨대, 플루오로세인, 유전자 엔코딩된 형광 분자 예컨대, GFP, 고유의 종 예컨대, FAD 및 NADH, 퓨어타임 염료 (puretime dye), Eu-킬레이트, 바이오센서 예컨대, 푸라 (Fura), 양자점 (Quantum dot) 등을 포함할 수 있다.
검출기 (5)는 이미징을 위한 타임 영역, 파장밴드 및 스캐닝 메커니즘을 포함하는 하나 또는 그 초과의 선택 메카니즘과 조합된, 하나 이상의 PMT, 공간 민감성 검출기, 게이팅 엘리먼트 (gating element) 예컨대, MCP, 이미징 검출기, 공간 분할된 이미징 검출기, 파장 민감성 검출기 어레이를 포함할 수 있다.
데이타 포획 및 처리 시스템 (6, 7)은 분석을 위한 수단 예컨대, 디컨볼루션 (deconvoulation) 및 기타 변형체, 및 동력 데이타를 계산하기 위해 시간 경과 시리즈를 수집하기 위한 수단을 포함할 수 있다.
본 방법은 FRET-FILM 방법을 이용하여 FRET 실험을 수행가능하게 하며, 다중 FRET 시스템이 예를 들어, 특정 세포 경로내의 연속되는 이벤트를 한번에 측정할 수 있게 한다. 도 9에 도시된 바와 같이, 하나의 FRET 공정은 특정 파장밴드에서 도너 D1의 수명 변화를 관찰함으로써 연구될 수 있는 반면, 또 다른 FRET 공정은 또 다른 파장밴드에서 도너 D2의 수명 변화를 관찰함으로써 연구될 수 있다.
본 발명을 이용한 일부 추가의 적용 예는 도 10a 내지 10c에 도시되어 있다. 이들은 대상의 특징을 확인하고 집중시키기 위해 조합된 방사 및 수명을 이용한다는 이점을 나타낸다. 이들 예는 단지 설명을 위한 것이며, 본래의 (자연적으로 존재하는) 형광물을 포함하는 다른 라벨과의 다른 조합이 가능하다는 것이 자명할 것이다.
대상의 가능한 특징은 (1) 생물학적 기능 - 예를 들어, 단백질-단백질 상호작용 (FRET 시그널에 의해 지시된 바와 같이), (2) 미세-환경 예를 들어, 이온 농도 예컨대, pH, 및 (3) 구조적 또는 생화학적 종 예를 들어, DNA 또는 RNA의 존재를 포함한다. 이들 세개의 특징은 자극에 대해 반응하기 때문에, 약물 개발시 생 세포의 상태를 이해하는데 종종 중요하다.
도 10a는 약 488nm의 여기 파장밴드에 대한 조합된 방사 및 수명 분석 시스템의 이용을 나타내며, 하기를 포함한다:
- FRET 쌍의 도너를 나타내는 작용성 프로브 D, 예를 들어, 상호작용 상태 (FRET/비 FRET)에 따라 505-530nm에서 방사되며, 수명이 1.5ns 내지 2.5ns인 GFP-YFP FRET 시스템으로부터의 GFP;
- 미세 환경을 감지하는 프로브, 여기서, B 및 F는 약 580nm에서 방사되며 수명이 0.5 내지 3ns인 극단의 pH 프로브 레소루핀 (Resorufin)를 나타냄;
- 구조적 프로브 C 예컨대, 500-520nm에서 방사되며 수명이 6ns인 핵 염색 BODIPY.
또한, E는 625nm에서 방사되며 복잡한 수명을 갖는 작용성 양자점 프로브를 나타낸다.
도 10b는 약 488nm에서의 여기 파장 밴드를 이용한 또 다른 예이며, 여기서, D는 핵산 프로브 예컨대, 510-550nm에서 방사되며, AT-풍부 DNA에 결합하는 경우에는 수명이 1.5ns이며, GC 풍부 DNA에 결합하는 경우에는 4.1ns인 YOYO-1이며,
C는 560nm에서 방사되며 수명이 22ns인 퓨어타임22 염료 (Puretime22 dye)에 기초한 작용성 프로브이며;
B 및 F는 극단의 환경 프로브 예컨대, 약 570-630nm에서 방사되며, 수명이 1.8 내지 3.6ns인 립 오더 다이 (lip order dye) Di-4-ANEPPDHQ이며;
E는 700nm에서 방사되며, 복잡한 수명을 갖는 작용성화된 양자점 프로브를 나타낸다.
이러한 도식의 이점은, 매우 적은 수의 정성적 질문에 대해서만 가능한 통상적인 방법과 비교하여, 여러 유형의 정성적 (구조가 존재하는가?) 및 정량적 (pH는 어떻게 되는가?) 질문이 한번에 시스템에 제시될 수 있다.
488nm 또는 이와 유사한 여기 파장에 대한 예가 존재한다. 이러한 예는 다른 여기 파장 및 다중 여기 파장에 대한 것으로 확대될 수 있다. 예를 들어, 여기 밴드는 GFP2-YFP FRET 쌍에 있어서 405nm로부터 eGFP-YFP FRET 쌍에 있어서 488nm로 스위칭될 수 있다.
추가의 예 (도 10c)에서, 약 360nm의 여기 파장 밴드가 사용될 수 있으며, 450nm에서 방사되며 수명이 3ns인 코마린 유도체에 기초한 작용성 프로브 B가 이용될 수 있으며;
클로라이드 이온의 존재는 프로브 C 예컨대, 460nm의 방사 밴드 및 25ns의 특징적 수명을 갖는 MQAE를 사용하여 감지될 수 있다;
구조적 성분 D 예컨대, 핵은 460nm에서 방사되며, 수명이 0.2-2ns인 DAPI 프로브를 사용하여 감지될 수 있다.
본 시스템은 전형적으로 500nm 내지 800nm 초과의 양자점에 따라 선택되는 파장밴드에서 방사되며 360nm에서 여기되는 작용성화된 양자점에 기초한 일련의 프로브 (E)를 동시에 사용할 수 있다.
참고문헌
Figure 112008058978302-PCT00001
Figure 112008058978302-PCT00002

Claims (9)

  1. (a) 다수의 형광종을 포함하는 생물학적 샘플을 제공하고;
    (b) 여기 에너지의 펄스 (pulse)로 샘플을 조사하여 샘플중의 형광종이 형광을 발하게 하고;
    (c) 펄스 후 소정의 기간 동안 샘플로부터 방사광을 검출하고;
    (d) 적어도 시간에 대한 검출된 광의 파장을 표시하는 데이타를 생성시키고 저장하고;
    (e) 형광종 각각의 수명을 참조하여 데이타를 분석하여, 상기 소정 기간의 적어도 일부 동안 동시에 광을 방사하는 3개 또는 그 초과의 상이한 형광종으로부터의 각각의 방사광으로서, 이들의 파장 또는 수명 단독에 기초하여서는 서로 구별될 수 없는 방사광의 존재를 검출하는 것을 포함하여, 생물학적 샘플을 분석하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 검출 단계 (c)가 상기 소정의 기간 동안 파장 범위에 걸쳐 샘플로부터의 방사광의 세기 분포를 검출하고, 상기 소정의 기간 동안 샘플로부터의 방사광의 합한 세기를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 샘플이 여기 에너지 범위를 스캐닝함으로써 조사되는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항중의 어느 한 항에 있어서, 샘플이 다수의 여기 에너지 펄스에 의해 단계 (b)에서 조사되는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항중의 어느 한 항에 있어서, 샘플로부터의 방사광의 양극화와 관련된 데이타가 단계 (d)에서 저장되고, 분석 단계 (e)에서 이용되는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항중의 어느 한 항에 있어서, 샘플로부터의 방사광의 공간 분포가 검출되고 기록되는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항중의 어느 한 항에 있어서, 광이 소정의 기간 동안 일련의 소정 간격을 두고 검출되는 방법.
  8. 소정의 기간의 적어도 일부 동안 광을 동시에 방사하는 3개 또는 그 초과의 상이한 형광종으로부터의 각각의 방사광으로서, 이들의 파장 또는 수명 단독에 기초하여서는 서로 구별될 수 없는 방사광의 존재를 검출하기 위해, 형광종 각각의 수명을 참조하여, 적어도 상기 소정의 기간 동안 샘플로부터의 방사광의 파장을 시간에 대해 기록한 데이타를 분석하기 위한 처리 수단을 포함하는, 다수의 형광종을 포함하는 생물학적 샘플을 분석하기 위한 장치.
  9. 제 8항에 있어서, 하나 이상의 PMT, 공간 민감성 검출기 (a spatially senstive dectector), 이미징 검출기 (imaging detector), 공간 분할 이미징 검출기, 및 파장 민감성 검출기 어레이 (array)로부터 선택된 광 검출 수단을 포함하는 장치.
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