IT202100017018A1 - Imaging simultaneo multispecie in super-risoluzione mediante multiplazione temporale e array di rivelatori a fotone singolo - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Imaging simultaneo multispecie in super-risoluzione mediante multiplazione temporale e array di rivelatori a fotone singolo"
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda in generale le tecniche di microscopia a fluorescenza multispecie.
La microscopia confocale a scansione laser (CLSM) a fluorescenza ? uno strumento di imaging ampiamente usato per la biologia cellulare e molecolare. Tale tecnica offre la possibilit? di effettuare imaging tridimensionale, imaging profondo, imaging di cellule vive e imaging quantitativo, tutti insieme e combinati con gli attuali sviluppi della microscopia a fluorescenza. Oggi, un?ampia variet? di coloranti fluorescenti (ad es. molecole di coloranti sintetiche, proteine fluorescenti e nanoparticelle inorganiche) pu? essere legata a bersagli biologici con elevata specificit? e attraverso numerose strategie di accoppiamento, fornendo potenzialmente un ritratto completo del campione osservato. Il cosiddetto imaging a fluorescenza multispecie (o multi-etichetta) permette di rilevare pi? bersagli, consentendo l?osservazione di interazioni e dell?organizzazione spaziale relativa fra differenti strutture cellulari con contrasto molecolare specifico. Inoltre, la recente introduzione di array di rivelatori veloci (nell?intervallo dei MHz) ha permesso una trasparente e versatile implementazione della microscopia a scansione di immagini (ISM), che ha portato la CLSM ad essere annoverata fra le tecniche a super-risoluzione. In tale implementazione ISM (descritta ad esempio in WO 2019/145889 A1), un array di rivelatori ? la cui dimensione proiettata sul piano del campione ? di 1-1.5 unit? airy (AU) ? sostituisce il foro stenopeico e il rivelatore a singolo elemento, tipicamente usati nella CLSM, per fornire un?immagine del volume fluorescente. Tale informazione spaziale addizionale fornita dall?array di rivelatori pu? essere usata per ricostruire un?immagine super-risolta con due volte la risoluzione della microscopia convenzionale e un rapporto segnale/rumore (SNR) pi? elevato. Ciascun elemento dell?array di rivelatori agisce come un singolo foro stenopeico fisico che produce una serie di immagini super-risolte ma a basso SNR. Poich? la maggior parte del segnale di fluorescenza ? acquisito in parallelo dagli elementi rivelatori, pu? essere ottenuta un?immagine a SNR elevato combinando tutte le immagini raccolte mediante riassegnazione di pixel o deconvoluzione multi-immagine.
Nella CLSM convenzionale, l?imaging simultaneo multispecie ? implementato separando le differenti sonde ? o meglio, i differenti segnali fluorescenti ? sulla base delle propriet? fotofisiche di ciascuna sonda. In particolare, si utilizzano tipicamente tre differenti propriet?: lo spettro di eccitazione, lo spettro di emissione e la vita media di fluorescenza (figura 1). Ogni strategia che si basi su una sola di tali propriet? presenta punti di forza e limiti. Per questo motivo si preferiscono gli approcci combinati. Tuttavia, le implementazioni risultanti sono sempre un compromesso fra la complessit? del sistema, il numero di specie separabili, la capacit? di effettuare un imaging simultaneo e i costi. Le implementazioni ISM basate su un array di rivelatori (nel seguito, semplicemente ISM), le strategie multispecie dimostrate finora esplorano solo gli spettri di eccitazione ed emissione, e consistono di copie degli approcci CLSM di base. In effetti, l?implementazione degli approcci CLSM multispecie pi? sofisticati richiede architetture costose e poco scalabili ? in termini di numero di specie separabili -, oppure non pu? essere nemmeno implementata.
CLSM multispecie
Il metodo pi? utilizzato per l?imaging CLSM simultaneo multispecie separa i segnali delle differenti sonde esplorando le firme dei loro spettri di emissione. Tutte le sonde sono eccitate simultaneamente con uno o pi? fasci laser monocromatici
Il segnale fluorescente viene quindi isolato dalla luce di eccitazione e suddiviso in una serie di finestre spettrali dove indica il valore centrale della banda spettrale) ? una per ciascuna sonda ? da una combinazione di filtri, specchi dicroici e/o filtri acusto-ottici regolabili. Infine un rivelatore per ciascuna banda spettrale, quindi sonda, registra il segnale di fluorescenza. Tale implementazione spettrale multi-rivelatore presenta due grossi limiti: il numero di rivelatori richiesti aumenta con il numero di sonde; i cross-talk fra gli spettri di emissione delle differenti sonde degradano l?immagine.
Il secondo problema pu? essere parzialmente risolto rompendo la simultaneit? delle eccitazioni per aggiungere l?informazione sugli spettri di eccitazione delle sonde nell?implementazione. In questo caso, i fasci laser di eccitazione vengono attivati/modulati sequenzialmente, e viene registrata una serie di immagini: una per ciascuna coppia di valori relativi a banda di rivelatore e lunghezza d?onda del fascio di eccitazione Per ciascuna sonda viene selezionata l?immagine formata dalle corrispondenti migliori lunghezze d?onda di eccitazione ed emissione. Quindi, il cross-talk rimanente pu? essere eliminato usando algoritmi di unmixing lineare. A causa dell?attivazione sequenziale dei fasci di eccitazione laser ? cruciale adottare una modulazione veloce per ottenere efficacemente un imaging simultaneo. Ad esempio, una modulazione frame per frame o linea per linea pu? essere troppo lenta per fare l?imaging di strutture dinamiche. Poich? i processi biologici veloci si verificano con scale temporali sub-millisecondo (le variazioni delle conformazioni delle proteine si verificano con scale molto pi? piccole, fino ai microsecondi, ma l?imaging non ? in ogni caso un?opzione per osservare tali processi) e il tipico tempo di permanenza del pixel ? nell?intervallo delle decine di microsecondi o inferiore, la modulazione dei fasci laser pixel per pixel garantisce un simultaneo imaging multispecie.
Recentemente ? stato proposto di modulare i fasci di eccitazione con una frequenza maggiore di quella data dal tempo di permanenza del pixel (US 9231575 B2). Tale implementazione CLSM multispecie multipla i fasci di eccitazione nel dominio delle frequenze. Di conseguenza, la demodulazione viene ottenuta filtrando nel dominio delle frequenze. Inoltre, tale implementazione usa un singolo rivelatore senza riguardo al numero delle sonde da separare, riducendo quindi fortemente i costi dell?implementazione. Per contro, l?uso di un singolo rivelatore preclude l?esplorazione degli spettri di eccitazione ed emissione delle sonde.
Una CLSM multispecie che usa un singolo rivelatore ma esplora lo spettro di emissione pu? essere implementata usando un array di rivelatori lineare (US 20190361213 A1). Qui, il segnale di fluorescenza ? indotto da uno o pi? fasci di eccitazione ? viene spettralmente decomposto nello spazio usando un prisma (o un reticolo), e ciascuna lunghezza d?onda viene mappata su una specifica posizione/elemento del rivelatore lineare. L?immagine tridimensionale (x, y, ?), la cosiddetta immagine spettrale di emissione, viene processata da un algoritmo di (blind) unmixing spettrale per formare l?immagine multispecie finale potenzialmente priva di artefatti dovuti al cross-talk dei segnali. In questa classe di implementazioni CLSM, tipicamente chiamate implementazioni iper-spettrali, ? anche possibile esplorare gli spettri di eccitazione modulando i fasci di eccitazione come sopra descritto. Implementazioni CLSM iper-spettrali potrebbero anche essere ottenute registrando sequenzialmente gli spettri di emissione; il segnale di fluorescenza viene cio? spettralmente disperso nello spazio, una doppia fenditura regolabile filtra selettivamente solo una parte dello spettro, e un sensore a singolo elemento registra il segnale selezionato. Ciononostante, la registrazione sequenziale degli spettri impedisce (per definizione) l?imaging simultaneo multispecie.
Tutte le implementazioni CLSM multispecie sopra descritte usano la firma di emissione e/o la firma di eccitazione per separare le differenti sonde.
Un?altra firma di sonda da esplorare ? la vita media di fluorescenza e, pi? in generale, la distribuzione di decadimento temporale. Analogamente agli spettri di eccitazione ed emissione, una sonda pu? essere caratterizzata da uno spettro temporale che descrive la probabilit? che una molecola/sonda eccitata emetta un fotone spontaneo (fotone fluorescente) a un dato tempo ? dopo l?evento di eccitazione. Il tempo medio che la molecola passa nello stato eccitato ? chiamato vita media di fluorescenza ?. Nel caso di un puro fluoroforo organico, tale distribuzione pu? essere descritta da un singolo esponenziale ma modelli pi? convoluti sono necessari in molti casi pratici. Nella CLSM, la distribuzione di decadimento di vita media di una sonda fluorescente viene ottenuta implementando un esperimento di conteggio di singolo fotone correlato nel tempo (TCSPC): un fascio laser pulsato (tipicamente con una lunghezza di impulso di poche decine di picosecondi) eccita la sonda a un tempo specifico (? = 0); un rivelatore a fotone singolo con un basso jitter di temporizzazione (da decine di picosecondi fino a poche centinaia di picosecondi) registra i fotoni fluorescenti emessi dalle sonde; un convertitore tempo/digitale (TDC) o un digitalizzatore ad alta frequenza misura la differenza temporale fra gli eventi di eccitazione e gli eventi di registrazione. L?istogramma del tempo di arrivo dei fotoni viene misurato ripetendo gli esperimenti (tipicamente, il laser pulsato ha un tasso di ripetizione dell?ordine delle decine di MHz). In una CLSM basata su TCSPC, l?imaging multispecie pu? essere implementato registrando l?istogramma di arrivo dei fotoni per ciascun pixel e decomponendo tale istogramma (secondo la distribuzione di decadimento delle differenti sonde) usando differenti algoritmi di computazione basati su fitting, deconvoluzione, decomposizione di fasori o unmixing lineare. Un?interessante propriet? di tale implementazione ? la possibilit? di separare specie con spettri di eccitazione ed emissione molto simili, usando cos? un singolo fascio di eccitazione e una singola banda di rilevamento, cio? un singolo rivelatore, il che non solo comporta benefici in termini di complessit?, ma anche permette di evitare artefatti di imaging dovuti alle aberrazioni cromatiche. Lo stesso sistema CLSM basato su TCSPC pu? essere usato per implementare la modulazione del laser di eccitazione sopra descritta in una modalit? impulso per impulso, permettendo cos? l?esplorazione della firma spettrale di eccitazione per l?imaging multispecie. Gli impulsi di una serie di laser monocromatici vengono sottoposti a interleaving (con un ritardo pi? lungo della vita media di fluorescenza), e l?istogramma del tempo di arrivo dei fotoni viene usato per implementare un rilevamento time-gated e separare il segnale associato a ciascuna sonda. Tale approccio di interleaving degli impulsi pu? anche essere combinato con approcci di separazione spettrale di emissione per aumentare il numero di sonde da separare, ma sono necessari pi? rivelatori.
ISM multispecie
Uno dei vantaggi pi? rilevanti dell?implementazione ISM basata su un array di rivelatori veloci ? la sua compatibilit? con molti metodi, tecniche e protocolli di etichettatura implementati nella CLSM a fluorescenza, comprese molte delle tecniche di imaging multispecie sopra descritte.
ISM ? pienamente compatibile con l?approccio spettrale multi-rivelatore, con l?approccio multieccitazione modulato, e con le loro combinazioni. Di conseguenza, un tecnico del ramo pu? facilmente integrare tali approcci simultanei multispecie nella ISM. Tuttavia, finora sono state dimostrate solo lente implementazioni ISM multi-eccitazione modulate frame per frame. In questo caso, differenti lunghezze d?onda di eccitazione e finestre spettrali vengono alternate tramite lenti filtri motorizzati usando un singolo array di rivelatori; tuttavia, ? precluso un vero imaging simultaneo quale quello dimostrato nella CLSM.
Al contrario, i metodi iper-spettrali non sono pienamente compatibili con l?ISM. Il principio di base dei metodi iper-spettrali ? quello di decodificare l?informazione spettrale nello spazio, cio? di decomporre gli spettri di emissione spazialmente. Tale decomposizione spaziale interferisce con l?ISM poich? nell?ISM i canali di informazione spaziale sono gi? utilizzati per trasferire l?immagine del volume di rilevamento. Poich? le informazioni spaziale e spettrale sono fuse nello stesso canale e nella stessa scala, la loro decomposizione non ? banale. Per completezza, un?implementazione ISM iper-spettrale ? stata proposta e usata per ricostruire immagini ISM a due specie. Tuttavia, per le stesse ragioni sopra descritte, tale implementazione ? soggetta ad artefatti importanti sia nella risoluzione spaziale sia nella separazione delle specie.
La recente introduzione di array di rivelatori a fotone singolo (quali il rivelatore ad array di diodi a valanga a fotone singolo (SPAD)) permette anche l?implementazione di metodi di imaging multispecie basati sulla firma di vita media a fluorescenza. In effetti, la capacit? della ISM basata su array SPAD di implementare misurazioni TCSPC ? stata pienamente dimostrata. Tuttavia, in questo caso, non ? stata riportata alcuna dimostrazione di ISM multispecie basata sulla vita media a fluorescenza.
Grazie all?introduzione di rivelatori ad array SPAD asincroni, molti dei metodi di imaging simultaneo multispecie dimostrati nella CLSM possono essere in principio estesi alla ISM, con qualche limitazione sostanziale riguardo agli approcci iperspettrali. Tuttavia, analogamente alla CLSM, non esiste un singolo metodo in grado di esplorare, al contempo, lo spettro di eccitazione, lo spettro di emissione e la firma di vita media a fluorescenza. I vincoli diventano ancora pi? importanti quando nell?implementazione pu? essere utilizzato solo un singolo rivelatore.
Uno scopo dell?invenzione ? quello di proporre una nuova architettura per imaging ISM multispecie che fornisca imaging simultaneo, un?elevata scalabilit? in termini di numero di specie, e costi ridotti. Un altro scopo dell?invenzione ? quello di proporre una nuova architettura che offra simili benefici anche per la CLSM, e pi? in generale, per qualsiasi tecnica a fluorescenza basata sulla microscopia a scansione laser (LSM), ad esempio la microscopia a deplezione mediante emissione stimolata (STED), la microscopia di eccitazione a due fotoni (TPE) e la spettroscopia a fluttuazione di fluorescenza (FFS).
A fronte di tali scopi, forma oggetto dell?invenzione un microscopio a scansione laser configurato per illuminare un campione con una pluralit? di fasci pulsati di luce di eccitazione comprendente differenti componenti spettrali, nel seguito componenti spettrali di eccitazione, detto campione contenendo una pluralit? di specie fluorescenti, in cui il microscopio comprende
un rivelatore a singolo fotone configurato per rilevare un segnale di fluorescenza emesso dal campione, detto segnale di fluorescenza comprendendo differenti componenti spettrali, nel seguito componenti spettrali di emissione,
un codificatore dello spettro di eccitazione configurato per imporre un rispettivo ritardo temporale a ciascuna componente spettrale di eccitazione, in modo tale che ciascuna componente spettrale di eccitazione illumini il campione a un tempo differente rispetto alle altre componenti spettrali di eccitazione,
un codificatore dello spettro di emissione configurato per imporre un rispettivo ritardo temporale a ciascuna componente spettrale di emissione, in modo tale che ciascuna componente spettrale di emissione raggiunga il rivelatore a singolo fotone a un tempo differente rispetto alle altre componenti spettrali di emissione,
un sistema di acquisizione dati configurato per acquisire un segnale di misurazione fornito dal rivelatore a singolo fotone e rendere disponibile un?immagine risolta nel tempo del campione, e
un decodificatore multispecie configurato per decodificare lo spettro di eccitazione, lo spettro di emissione e la curva di decadimento di fluorescenza per ciascuna di dette specie fluorescenti, sulla base di detta immagine risolta nel tempo del campione.
Forma inoltre oggetto dell?invenzione un metodo di microscopia a scansione laser, comprendente illuminare un campione con una pluralit? di fasci pulsati di luce di eccitazione comprendente differenti componenti spettrali, nel seguito componenti spettrali di eccitazione, detto campione contenendo una pluralit? di specie fluorescenti, in cui illuminare il campione comprende:
- imporre un rispettivo ritardo temporale a ciascuna componente spettrale di eccitazione, in modo tale che ciascuna componente spettrale di eccitazione illumini il campione a un tempo differente rispetto alle altre componenti spettrali di eccitazione,
rilevare un segnale di fluorescenza emesso dalle specie fluorescenti del campione con un rivelatore a singolo fotone, detto segnale di fluorescenza comprendendo differenti componenti spettrali, nel seguito componenti spettrali di emissione, in cui rilevare il segnale di fluorescenza comprende:
- imporre un rispettivo ritardo temporale a ciascuna componente spettrale di emissione, in modo tale che ciascuna componente spettrale di emissione raggiunga il rivelatore a singolo fotone a un tempo differente rispetto alle altre componenti spettrali di emissione,
acquisire un segnale di misurazione fornito dal rivelatore a singolo fotone e rendere disponibile un?immagine risolta nel tempo del campione, e decodificare lo spettro di eccitazione, lo spettro di emissione e la curva di decadimento di fluorescenza per ciascuna di dette specie fluorescenti, sulla base di detta immagine risolta nel tempo del campione.
I rivelatori a singolo fotone consentono l?accesso a un ampio intervallo di scale temporali (con l?unico limite inferiore alla scala sub-nanosecondo) grazie al loro basso jitter di temporizzazione dei fotoni (quando un elemento del rivelatore accoglie un fotone, attiva un segnale con una precisione fino a 200 ps), il ridotto tempo di attesa (fino a 50 MHz, cio?, dopo che un fotone ? stato raccolto, l?elemento rimane cieco per 20 ns), e la lettura asincrona (cio? ciascun elemento del rivelatore e pienamente indipendente rispetto agli altri).
Mentre l?informazione di vita media a fluorescenza ? nella scala temporale sub-nanosecondo/nanosecondo, i processi biologici pi? veloci e il processo di scansione laser si manifestano nell?intervallo dei microsecondi. Cos?, una LSM simultanea multispecie sarebbe fattibile anche con rivelatori che coprono solo una scala temporale fino al microsecondo, ma l?implementazione di ISM multispecie basata sulla vita media a fluorescenza della sonda richiederebbe di accedere alla scala temporale dei nanosecondi. In sintesi, la scala temporale dalle decine di nanosecondi al microsecondo ? poco usata e pu? essere adottata per trasferire informazione addizionale (in pratica, nella LSM e usata per migliorare il SNR).
L?idea alla base dell?invenzione ? pertanto quella di utilizzare tale banda disponibile per trasferire informazione utile a separare le sonde nella ISM simultanea multispecie. Qui, in particolare, tale banda disponibile e usata per codificare le firme spettrali di eccitazione ed emissione delle sonde. Tale idea si traduce in una misurazione ISM basata su TCSPC, dove l?istogramma del tempo di arrivo dei fotoni ? usato per codificare: (i) la firma di vita media a fluorescenza delle sonde, come nei tipici esperimenti TCSPC; (ii) la firma spettrale di eccitazione delle sonde, multiplando in fase differenti fasci di eccitazione; (iii) la firma spettrale di emissione delle sonde, separando temporalmente le differenti componenti spettrali del segnale fluorescente.
Si noti che i metodi iper-spettrali separano la componente spettrale del segnale fluorescente nello spazio piuttosto che nel tempo. Una volta che l?istogramma del tempo di arrivo dei fotoni ? stato registrato, metodi computazionali ben affermati quali (blind) unmixing lineare, unmixing basato su fasori, fitting, deconvoluzione o machine learning possono essere usati per decodificare le firme delle sonde per ottenere un?immagine ISM multispecie. Dato che tutte le operazioni di codifica sono effettuate usando il canale temporale, l?approccio proposto pu? usare un singolo rivelatore. Inoltre, poich? la codifica usa la scala temporale sub-microsecondo, l?approccio multispecie simultaneo ? garantito. Si noti che la stessa strategia pu? essere applicata per CLSM con un tipico rivelatore a fotone singolo a singolo elemento, ma le immagini super-risolte in questo caso non sono ottenibili.
I vantaggi principali offerti dalla soluzione proposta rispetto agli approcci di imaging multispecie esistenti sono:
- compatibilit? con CLSM standard senza necessit? di modifiche pesanti del setup. Il rivelatore a singolo fotone e il sistema di acquisizione dati sono le uniche variazioni o aggiornamenti necessari rispetto all?architettura CLSM standard;
- compatibilit? con approcci ISM. La soluzione permette l?imaging multispecie mantenendo il miglioramento della risoluzione spaziale offerto dalla ISM;
- La soluzione permette una piena esplorazione delle tre firme principali delle sonde (spettro di eccitazione, spettro di emissione, vita media di fluorescenza) da sole e combinate (firma colore-temporale) in modo da ottenere un imaging multispecie in modo scalabile e semplice;
- compatibilit? con algoritmi noti di unmixing spettrale, deconvoluzione, fasori, fitting e machine learning.
Ulteriori caratteristiche e vantaggi dell?invenzione verranno presentati nella seguente descrizione dettagliata, che si riferisce ai disegni allegati, forniti unicamente a titolo di esempio non limitativo, in cui:
- la figura 1 riporta grafici relativi allo spettro di assorbimento (I), spettro di emissione (II) e decadimento di vita media a fluorescenza per le sonde fluorescenti ATTO 488 e ATTO 565 prodotte da Merck KGaA;
- la figura 2 ? una rappresentazione grafica funzionale di un?apparecchiatura secondo l?invenzione; - la figura 3 riporta: I) uno schema di eccitazione a interleaving di impulsi, II-III) firme colore-temporali delle sonde ATTO 488 e ATTO 565, IV) una firma colore-temporale data dalla combinazione delle firme dei riquadri II e III; e
- la figura 4 riporta un prototipo sperimentale di un microscopio secondo l?invenzione.
Metodi secondo l?invenzione possono essere implementati usando, come architettura del microscopio di partenza, una configurazione ISM basata su TCSPC (come descritto in ?A robust and versatile platform for image scanning microscopy enabling super-resolution FLIM? [1]) o basata su eterodina digitale.
In breve, il microscopio di partenza ? rappresentato da un microscopio confocale a fluorescenza con multi-fascio laser pulsato dove il foro stenopeico ? completamente aperto, e il rivelatore convenzionale a singolo elemento tipicamente usato in CLSM ? sostituito con un rivelatore a singolo fotone (ad esempio un rivelatore ad array SPAD), indicato con 40 nelle figure. Le differenti componenti spettrali definite dai fasci di eccitazione sono indicate con B1 e B2 nelle figure 2 e 4, mentre il segnale di fluorescenza ? indicato con F. Per preservare la capacit? di sezionamento ottico del sistema, un telescopio (o una lente di ingrandimento) garantisce una dimensione proiettata dell?array del rivelatore fra 1 e 1.5 AU. Per implementare misurazioni risolte nel tempo, ciascun elemento del rivelatore ? collegato a una DAQ card di etichettatura temporale multicanale (o a un sistema digitale a vita media di fluorescenza nel dominio delle frequenze multi-canale o a un digitalizzatore veloce multi-canale), sincronizzata con gli impulsi del fascio laser. Tre aggiornamenti principali devono essere introdotti nell?architettura sopra descritta per implementare i metodi secondo l?invenzione (si vedano le figure 2 e 4):
- un codificatore dello spettro di eccitazione, indicato con 50 nelle figure. Si tratta di un sistema che codifica la firma spettrale di eccitazione delle sonde/specie fluorescenti nel canale temporale del sistema del microscopio. Tale sistema agisce sulla distribuzione temporale dei differenti impulsi dei fasci di eccitazione laser. Nel seguito si descriver? una realizzazione tecnica del codificatore dello spettro di eccitazione, basata su interleaving di impulsi;
- un codificatore dello spettro di emissione, indicato con 60 nelle figure. Si tratta di un sistema che codifica la firma spettrale di emissione delle sonde/specie fluorescenti nel canale temporale del microscopio. Tale sistema suddivide il segnale fluorescente nelle sue componenti spettrali, in maniera analoga a uno spettrometro. Tuttavia, invece di separarle spazialmente (cio? ciascuna componente viene proiettata su una differente posizione di un array lineare di rivelatori), ? in grado di suddividerle temporalmente (cio? ogni componente viene ritardato in modo differente prima di raggiungere il rivelatore). Nel seguito si descriver? una realizzazione tecnica basata su linee di ritardo ottico;
- un decodificatore multispecie, indicato con 70 nelle figure. Si tratta di un sistema che decodifica lo spettro di eccitazione, lo spettro di emissione e il decadimento di vita media a fluorescenza per ciascuna sonda/specie fluorescente, insieme con le concentrazioni delle sonde nel campione (o meglio in ciascuna posizione del campione, dato che l?intera pipeline viene implementata pixel per pixel/posizione per posizione mediante scansione del campione tramite i fasci laser).
Grazie ai due codificatori e allo schema di eccitazione a impulsi, ciascuna sonda ? caratterizzata da una specifica firma temporale, che nel seguito verr? definita firma colore-temporale. Il rivelatore a singolo fotone 40 registra una combinazione lineare di tali firme, i cui coefficienti sono proporzionali alle concentrazioni delle sonde. Per questo motivo, il compito primario del decodificatore 70 ? di recuperare computazionalmente i coefficienti di tale combinazione lineare (ed eventualmente anche le firme colore-temporali). In pratica, il decodificatore 70 viene implementato usando algoritmi di (blind) unmixing spettrale, deconvoluzione (blind), decomposizione fasoriale, fitting (se ? fornito un modello della firma) o machine learning. Nel seguito verr? descritto pi? in dettaglio l?approccio di (blind) unmixing spettrale.
Teoria generale
La pi? importante propriet? e condizione da soddisfare nelle implementazioni pratiche del metodo proposto ? che il segnale di fluorescenza generato dalla misurazione risolta nel tempo (cio? l?istogramma del tempo di arrivo dei fotoni) nella posizione del campione (cio? il pixel dell?immagine) e al tempo ? una composizione lineare delle firme colore-temporali e dei relativi contributi/concentrazioni ??,? delle differenti sonde:
dove ? ? il numero di posizioni spaziali nel campione (pixel dell?immagine), e ? ? il numero di sonde da separare. Il numero di sonde ? tipicamente noto in ogni esperimento di imaging a fluorescenza multispecie. Come sopra indicato, la firma colore-temporale ??(?) ? una funzione della firma della vita media di fluorescenza della firma spettrale di eccitazione e della firma spettrale di emissione della sonda. Due esempi di una firma colore-temporale come funzione di e sono riportati in figura 3, riquadri II e III, rispettivamente riferiti ai coloranti fluorescenti ATTO 488 e ATTO 565. La figura 3 fa riferimento a un esempio dove i fasci di eccitazione comprendono due componenti spettrali di eccitazione, indicate con exc. 1 e exc. 2, i cui impulsi illuminano il campione in maniera alternata, a intervalli di 12.5 ns (ritardo exc.). Il segnale emesso da ciascuna delle sonde fluorescenti ATTO 488 e ATTO 565 viene suddiviso in due componenti spettrali di emissione, in particolare in una prima componente spettrale (det.
1) le cui lunghezze d?onda sono inferiori a una lunghezza d?onda discriminante determinata da un filtro dicroico, e una seconda componente spettrale (det.
2) le cui lunghezze d?onda sono superiori alla lunghezza d?onda discriminante suddetta, e che viene ritardata rispetto alla prima componente spettrale di emissione (ritardo em.) di 6,25 ns. Cos?, in ciascuno dei grafici temporali dei riquadri II e III sono individuabili quattro finestre a, b, c, d, e rispettivamente e, f, g, h, determinate dagli impulsi di eccitazione e dai ritardi di emissione, rispettivamente per la sonda ATTO 488 e per la sonda ATTO 565. Ad esempio, la finestra a della firma 1 ? relativo alla prima componente spettrale di emissione di ATTO 488 eccitata da exc. 1, mentre nella finestra b a tale componente si somma la seconda componente spettrale di emissione di ATTO 488 eccitata da exc. 1. Nelle finestre c e d (successive all?illuminazione del campione da parte della componente di eccitazione exc. 2), tali componenti decadono senza essere eccitate da exc. 2. Analogamente, la finestra e della firma 2 ? relativa alla prima componente spettrale di emissione di ATTO 565 eccitata da exc. 1, mentre nella finestra f a tale componente si somma la seconda componente spettrale di emissione di ATTO 565 eccitata da exc. 1. Tali componenti sono piccole ma non nulle dal momento che la lunghezza d?onda di exc. 1 cade marginalmente nello spettro di assorbimento di ATTO 565. Nelle finestre g e h (successive all?illuminazione del campione da parte della componente di eccitazione exc. 2), si aggiungono i contributi della prima componente spettrale e della seconda componente spettrale eccitate da exc. 2.
Per implementare un blind imaging multispecie, lo scopo del decodificatore 70 ? quello di stimare, per ciascuna posizione del campione, le concentrazioni e le firme colore-temporali partendo dalla loro ?miscela? (si veda la figura 3, riquadro IV, dove nelle quattro finestre temporali dell?esempio sopra descritto si ha la somma dei contributi di ATTO 488 e ATTO 565: a+b, b+f, c+g, d+h).
Considerando la misurazione risolta nel tempo dopo la discretizzazione temporale e la finestra di campionamento temporale del tempo di arrivo dei fotoni, l?equazione 1 pu? essere scritta in notazione vettoriale come:
dove ? l?istogramma del tempo di arrivo dei fotoni misurato nel ?-esimo pixel e
? la firma colore-temporale per la
esima specie. Quindi, passando alla notazione vet-<toriale:>
dove con Infine, incorporando tutti i campioni spaziali (cio? tutti i pixel), il modello della miscela (equazione 1) pu? essere descritto da tre matrici:
dove ? la matrice di misurazione complessiva risolta nel tempo, con ? la concentrazione di ciascuna specie in ciascuna posizione disponibile del campione, con
Dato che nella microscopia a fluorescenza il campione ? tipicamente etichettato artificialmente, non solo il numero di specie ? noto, ma anche le firme colore-temporali possono essere individualmente calibrate e stimate a priori. Tuttavia, ? necessario tenere in conto che le firme calibrate possono talvolta essere fortemente dipendenti dalle condizioni di imaging e dal protocollo di etichettatura (possono quindi cambiare da campione a campione).
Quindi, si considera sia la situazione pi? ardua, dove le firme colore-temporali non sono note, sia il caso pi? semplice dove le firme coloretemporali sono note. Se gli spettri colore-temporali sono noti, pu? essere calcolata da mediante unmixing lineare, diversamente il problema diventa un problema di blind unmixing lineare.
Si descrive ora un esempio di come risolvere il problema blind. Il problema non-blind ? chiaramente una semplificazione di tale problema pi? generale e tipicamente viene risolto sequenzialmente (pixel per pixel) usando l?equazione 3 invece che l?equazione 4. Con la notazione matriciale dell?equazione 4, l?operazione di decodifica, cio? il problema di unmixing, pu? essere scritta come un problema di minimizzazione della differenza fra la ?miscela? misurata e la ?miscela? modellata/predetta Una differente formulazione di tale problema di minimizzazione pu? essere ottenuta sulla base di assunti alternativi, quali la distribuzione di probabilit? del rumore che contamina le misurazioni (ad es. rumore gaussiano o poissoniano), e su altri assunti sulle firme colore-temporali e i valori di concentrazione, tipicamente introdotti tramite termini di regolarizzazione nel problema di minimizzazione. Si riporta qui una formulazione dove si usa la norma di Frobenius [2]:
(5)
Vincoli tipici da introdurre nel problema di minimizzazione sono la normalizzazione e la non-negativit? delle firme colore-temporali:
e la non-negativit? dei coefficienti:
Inoltre, poich? nel problema blind la minimizzazione ? ottenuta considerando tutte le posizioni del campione insieme, ? pratica comune imporre una normalizzazione di intensit? sui dati misurati in ciascuna posizione del campione (pixel dell?immagine), cio? che si traduce nei seguenti vincoli sui coefficienti:
L?intensit? assoluta di ciascuna specie ? e ciascun pixel viene ottenuta moltiplicando il relativo coefficiente ottenuto per l?intensit? iniziale totale misurata non-normalizzata
Una tipica soluzione del problema di blind unmixing lineare ? ottenuta con una procedura ai minimi quadrati inversa che minimizza la differenza fra la miscela misurata e la miscela modellata/predetta [3]. Un altro esempio di come trasformare i problemi di unmixing blind e non-blind, considerando il rumore poissoniano nella miscela misurata, pu? essere trovato in [4]. Si noti che l?approccio di minimizzazione qui descritto ? solo uno dei differenti modi per trasformare il problema di unmixing delle equazioni 4 e 5. Ad esempio, il problema di unmixing pu? essere risolto usando altri approcci computazionali quali trasformazione fasoriale, fitting o machine learning. Si noti inoltre che tutti gli esempi sopra riportati sono usati per risolvere il problema di unmixing nel contesto della CLSM e solo dove si usano le tipiche misure iper-spettrali o le misure di istogramma di vita media a fluorescenza.
L?approccio secondo l?invenzione misura una firma appositamente definita; la firma colore-temporale, che codifica tutte le caratteristiche fotofisiche delle sonde fluorescenti nella misurazione risolta nel tempo. Quindi, algoritmi di unmixing convenzionali vengono usati per calcolare i coefficienti/concentrazioni delle sonde dalla firma colore-temporale misurata.
Implementazione con un codificatore dello spettro di emissione discreto
Come sopra menzionato, si descrive ora una prima implementazione pratica per codificare efficacemente gli spettri di eccitazione ed emissione delle sonde nell?istogramma del tempo di arrivo dei fotoni. Per il codificatore dello spettro di eccitazione 50 si usa un interleaving di impulsi per codificare gli spettri di eccitazione, cio? si implementa una sequenza di impulsi di eccitazione a differenti lunghezze d?onda che viene ripetuta periodicamente con una frequenza predeterminata (si veda la figura 3-I). Cos?, le differenti specie/sonde nel campione vengono eccitate con una differente probabilit?, che dipende dai loro spettri di eccitazione con
Un?implementazione efficace di interleaving di impulsi, che si basa solo su componenti elettronici, pu? essere ottenuta usando un set di diodi pulsati triggerabili, i cui impulsi possono essere elettronicamente sincronizzati fra loro con specifici ritardi. I fasci di eccitazione vengono quindi focalizzati sul campione, il segnale di fluorescenza viene raccolto da una lente di obiettivo e fornito al codificatore dello spettro di emissione 60. L?, il segnale di fluorescenza viene suddiviso da una serie di specchi dicroici in finestre spettrali Ciascuna finestra ? in grado di contenere differenti porzioni della fluorescenza delle sonde in funzione dei loro spettri di emissione con Successivamente, le differenti componenti vengono guidate attraverso percorsi ottici con differenti lunghezze (ad esempio una linea di ritardo ottico) per introdurre specifici ritardi temporali. Infine, tutte le componenti vengono ricombinate da una seconda serie di specchi dicroici e rinviate sul rivelatore a singolo fotone 40 (un esempio semplificato di quanto ottenuto con tale processo ? rappresentato nella figura 3, riquadri II-IV). Grazie a tale specifico encoder, la firma colore-temporale della sonda ? -esima ? data da:
<con >
dove ? denota l?operatore convoluzione; ? la firma di vita media di fluorescenza per la sonda
esima; ? il ritardo del fascio di eccitazione laser ?-esimo; ? il ritardo della -esima finestra spettrale di rilevamento. In breve, ? la probabilit? di eccitare la sonda ?-esima con il fascio laser -esimo, e ? la probabilit? che l?emissione dalla sonda ?-esima cada nella esima finestra temporale. Con qualche semplice calcolo, si ottiene la seguente equazione per la firma coloretemporale:
In pratica, la sequenza di impulsi viene ripetuta con una frequenza cos? ? il valore massimo del tempo di arrivo dei fotoni misurato;
Inoltre, per evitare la sovrapposizione delle copie di firma di vita media di fluorescenza, il ritardo di eccitazione e il ritardo di emissione dovrebbero essere separati da un tempo maggiore della vita media di tutte le sonde
Si noti che la sequenza di impulsi di eccitazione pu? essere disposta in modo da implementare una codifica di Hadamard per migliorare il SNR della misurazione, e qui il ritardo pu? anche essere uguale.
Implementazione con un codificatore dello spettro di emissione continuo
In questa implementazione pratica alternativa, il codificatore dello spettro di emissione 60 cambia mentre il codificatore dello spettro di eccitazione 50 rimane invariato. In tale codificatore continuo lo spettro di emissione non viene separato in finestre discrete, ma viene spazialmente separato da un prisma, un reticolo o altro dispositivo simile. Ciascuna componente dello spettro di emissione (continuo) segue un percorso differente (con lunghezza crescente linearmente) in modo da introdurre un differente ritardo in funzione della lunghezza d?onda.
Successivamente, tutte le componenti vengono ricombinate spazialmente e inviate al rivelatore a singolo fotone 40.
In questo caso, definendo la variazione di coordinate che ritarda linearmente lo spettro di emissione nel tempo in funzione di una costante temporale la firma colore-temporale ? data da:
<Con qualche semplice calcolo si ottiene che:>
Descrizione passo dopo passo
1. Un set di fasci pulsati multi-colore (da una serie di laser o da una sorgente supercontinua) entra nel codificatore dello spettro di eccitazione 50 che impone un preciso e ben noto ritardo temporale a ciascuna componente spettrale del fascio di eccitazione.
2. Il fascio di eccitazione multi-colore viene focalizzato da una lente di obiettivo su una specifica posizione del campione, che ? stato precedentemente etichettato con una serie di differenti sonde fluorescenti per mirare precise sottostrutture.
3. La fluorescenza emessa dal campione viene raccolta dallo stesso obiettivo, e il fascio di fluorescenza viene inviato al codificatore dello spettro di emissione 60 che impone a ciascuna componente spettrale del fascio di fluorescenza uno specifico ritardo temporale.
4. Il segnale di fluorescenza viene filtrato dalla luce di eccitazione e proiettato da una lente di ingrandimento sul rivelatore a singolo fotone 40. 5. Il segnale di uscita del rivelatore a singolo fotone 40 viene acquisito da un sistema di acquisizione risolto nel tempo (ad esempio una TCSPC card) che genera immagini, una per ciascun elemento del rivelatore a fotone singolo 40. Le immagini hanno una dimensione di dove ? il numero totale di posizioni spaziali (cio? pixel o voxel nel caso di 3D imaging) e ? il numero di canali dell?istogramma del tempo di arrivo dei fotoni.
6. Le immagini vengono fuse insieme mediante riassegnazione di pixel (o altro algoritmo di ricostruzione) per produrre l?immagine super-risolta ISM risolta nel tempo e ad elevato SNR, di dimensione
7. Il decodificatore multispecie 70 risolve il problema di unmixing lineare invertendo sequenzialmente (pixel per pixel) il sistema lineare dell?equazione 3 o globalmente il sistema lineare dell?equazione 4. In particolare, i differenti coefficienti di concentrazione vengono estratti dall?immagine ISM risolta nel tempo e usati per costruire l?immagine ISM finale multispecie super-risolta.
Un prototipo del microscopio (figura 4) ? stato costruito dagli inventori. Valori numerici sono riportati in figura 4 a titolo di esempio, e non sono da intendersi come limitativi dell?invenzione.
Il rilevamento di un microscopio a scansione laser confocale (CLSM) tradizionale su un banco ottico ? stato modificato. Lo strumento tradizionale ? equipaggiato con due sorgenti laser di eccitazione aventi rispettive lunghezze d?onda di 485 nm (LDH-P-C-485B, PicoQuant) e 560 nm (LDH-D-TA-560, Pico-Quant).
Uno schema di eccitazione a interleaving di impulsi (codificatore dello spettro di eccitazione 50) ? implementato comandando i laser con segnali TTL da un sistema di controllo FPGA (tasso di ripetizione 40MHz (periodo laser 25ns), ritardo di 12.5ns fra ciascun impulso).
Il campione viene scansionato dal fascio laser tramite una coppia di specchi galvanometrici (6215HM40B, CTI-Cambridge) e una lente di obiettivo (CFI Plan Apo VC60x oil, Nikon). I fotoni fluorescenti vengono raccolti dalla stessa lente di obiettivo, de-scansionati e filtrati da uno specchio dicroico multibanda (ZT-488-561-640-775, AHF Analysentechnik). Il segnale fluorescente viene quindi inviato al codificatore dello spettro di emissione 60, che ? formato da uno specchio dicroico (filtro passa basso 575nm, Edmund Optics) e quattro specchi che definiscono una linea di ritardo a 6.25ns (corrispondente a una lunghezza del percorso ottico di circa 1.87m) per la fluorescenza con lunghezze d?onda maggiori di 575nm.
Infine, il fascio viene espanso e proiettato su un array di rivelatori SPAD 40. L?array di rivelatori ha 25 elementi disposti in una matrice 5 per 5; ? montato su un supporto commerciale con viti micrometriche per l?allineamento fine su tre assi. Le prestazioni spaziali e temporali del rivelatore sono state valutate, mostrando una risoluzione temporale di 200 ps e un jittering temporale fra 110 e 160 ps nell?area attiva.
L?array di rivelatori ? comandato da una scheda operativa dedicata tradizionale che fornisce l?alimentazione ed effettua il condizionamento dei segnali elettrici. La scheda fornisce 25 canali digitali di uscita (ciascuno legato all?arrivo di un fotone su uno specifico elemento dell?array di rivelatori), che sono immessi in un sistema di acquisizione dati.
Il sistema di acquisizione dati ? stato sviluppato con una scheda di sviluppo FPGA commerciale (National Instruments USB-7856R), equipaggiata con un processore FPGA Kintex7 e collegata a un personal computer. Le linee digitali di clock pixel/linea/frame standard sono usate per sincronizzare il sistema di acquisizione con il sistema di controllo del microscopio.
Un?eterodina digitale nel dominio delle frequenze ? implementata nel sistema di controllo FPGA per calcolare l?istogramma del tempo di arrivo dei fotoni.
Claims (7)
1. Microscopio a scansione laser configurato per illuminare un campione con una pluralit? di fasci pulsati di luce di eccitazione comprendente differenti componenti spettrali (B1, B2), nel seguito componenti spettrali di eccitazione, detto campione contenendo una pluralit? di specie fluorescenti, in cui il microscopio comprende
un rivelatore a singolo fotone (40) configurato per rilevare un segnale di fluorescenza emesso dal campione, detto segnale di fluorescenza comprendendo differenti componenti spettrali, nel seguito componenti spettrali di emissione,
un codificatore dello spettro di eccitazione (50) configurato per imporre un rispettivo ritardo temporale a ciascuna componente spettrale di eccitazione, in modo tale che ciascuna componente spettrale di eccitazione illumini il campione a un tempo differente rispetto alle altre componenti spettrali di eccitazione,
un codificatore dello spettro di emissione (60) configurato per imporre un rispettivo ritardo temporale a ciascuna componente spettrale di emissione, in modo tale che ciascuna componente spettrale di emissione raggiunga il rivelatore a singolo fotone (40) a un tempo differente rispetto alle altre componenti spettrali di emissione,
un sistema di acquisizione dati configurato per acquisire un segnale di misurazione fornito dal rivelatore a singolo fotone (40) e rendere disponibile un?immagine risolta nel tempo del campione, e
un decodificatore multispecie (70) configurato per decodificare lo spettro di eccitazione, lo spettro di emissione e la curva di decadimento di fluorescenza per ciascuna di dette specie fluorescenti, sulla base di detta immagine risolta nel tempo del campione.
2. Microscopio secondo la rivendicazione 1, in cui detto rivelatore a singolo fotone comprende un array di elementi sensibili al segnale di fluorescenza emesso dal campione, ciascuno di detti elementi sensibili essendo in grado di fornire una rispettiva immagine risolta nel tempo del campione, e in cui il sistema di acquisizione dati ? configurato per fondere le immagini risolte nel tempo fornite dagli elementi sensibili, mediante un algoritmo di ricostruzione, per produrre un?immagine super-risolta del campione.
3. Microscopio secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui il sistema di acquisizione dati ? sincronizzato con detti fasci pulsati di luce di eccitazione.
4. Microscopio secondo una delle rivendicazioni precedenti, in cui il codificatore dello spettro di eccitazione (50) ? configurato per implementare una sequenza di impulsi di eccitazione ripetuta periodicamente con una frequenza predeterminata, ciascuno di detti impulsi di eccitazione corrispondendo a una di dette componenti spettrali di eccitazione.
5. Microscopio secondo la rivendicazione 4, in cui il codificatore dello spettro di emissione (60) comprende
mezzi di divisione configurati per dividere detto segnale di fluorescenza in una pluralit? di finestre spettrali, ciascuna di dette finestre spettrali contenendo una di dette componenti spettrali di emissione,
mezzi di ritardo configurati per imporre un rispettivo ritardo temporale a ciascuna di dette componenti spettrali di emissione, e
mezzi di ricombinazione configurati per ricombinare dette componenti spettrali di emissione e rinviarle al rivelatore a singolo fotone (40).
6. Microscopio secondo la rivendicazione 4, in cui il codificatore dello spettro di emissione (60) comprende
mezzi di divisione configurati per separare spazialmente le componenti spettrali di emissione dal segnale di fluorescenza e imporre un rispettivo ritardo temporale a ciascuna di dette componenti spettrali di emissione, e
mezzi di ricombinazione configurati per ricombinare dette componenti spettrali di emissione e rinviarle al rivelatore a singolo fotone (40).
7. Metodo di microscopia a scansione laser, comprendente
illuminare un campione con una pluralit? di fasci pulsati di luce di eccitazione comprendente differenti componenti spettrali (B1, B2), nel seguito componenti spettrali di eccitazione, detto campione contenendo una pluralit? di specie fluorescenti, in cui illuminare il campione comprende:
- imporre un rispettivo ritardo temporale a ciascuna componente spettrale di eccitazione, in modo tale che ciascuna componente spettrale di eccitazione illumini il campione a un tempo differente rispetto alle altre componenti spettrali di eccitazione,
rilevare un segnale di fluorescenza emesso dal campione con un rivelatore a singolo fotone (40), detto segnale di fluorescenza comprendendo differenti componenti spettrali, nel seguito componenti spettrali di emissione, in cui rilevare il segnale di fluorescenza comprende:
- imporre un rispettivo ritardo temporale a ciascuna componente spettrale di emissione, in modo tale che ciascuna componente spettrale di emissione raggiunga il rivelatore a singolo fotone (40) a un tempo differente rispetto alle altre componenti spettrali di emissione,
acquisire un segnale di misurazione fornito dal rivelatore a singolo fotone (40) e rendere disponibile un?immagine risolta nel tempo del campione, e decodificare lo spettro di eccitazione, lo spettro di emissione e la curva di decadimento di fluorescenza per ciascuna di dette specie fluorescenti, sulla base di detta immagine risolta nel tempo del campione.
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Citations (6)
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Patent Citations (6)
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