KR20080072084A - 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 전구약물 - Google Patents

뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 전구약물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항바이러스 성질을 나타내는 하기 화학식 (I)의 화합물을 기술한 것이다. 본 발명은 또한 항-HBV 치료를 필요로 하는 피검체에 투여하기 위한 상술된 화합물을 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 화합물을 포함하는 약제 조성물을 투여하므로써 피검체에서 HBV 감염증을 치료하는 방법에 관한 것이다:

Description

뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 전구약물 {NUCLEOTIDE AND OLIGONUCLEOTIDE PRODRUGS}
본 발명은 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드의 전구약물 유사체의 디자인, 합성 및 평가에 관한 것이다. 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법은 B형 간염 바이러스(HBV) 감염증 및 HBV와 관련된 간질환의 치료에 유용하다. 상세하게는, 화합물 및 조성물들은 신규한 항-HBV 제제 포스포로티오에이트 디- 및 트리-뉴클레오티드의 S-알킬 에스테르와 관련이 있다. 화합물 및 조합물은 단독으로 또는 다른 항-HBV 제제와 조합하여 투여될 수 있다.
B형 간염 바이러스(HBV)에 의해 야기되는 급성 및 만성 간 감염증은 미국에서 1백7십만명을 포함하여 거의 20억명에게 영향을 미치는 주요한 공중 보건 위기로 선정되었다(WHO 리포트). 전세계에 3억5천만명의 HBV의 만성 보균자가 있는 것으로 추정되고 있다. 질병관리 센터에 따르면, 매년 거의 3백만명 내지 7백만명의 사람들이 간의 간경변 및 간세포 암종과 같은 감염증과 관련된 합병증으로 사망한다. 상당한 수의 간 이식 수령자는 효과적인 항-HBV 치료법을 계속적으로 필요로 한다. HBV는 많은 수의 인간 암을 야기시키는 중요한 병인체로서 인식된다. HBV 감염증은 또한 간을 파괴하는 치명적인 질환인 전격성 간염을 초래한다. 만성 간 염 감염증은 만성 지속성 감염, 피로, 간경변, 간암 및 사망을 초래한다. HBV 감염증의 전염병학은 인간면역결핍바이러스(HIV)의 것과 유사하다. 수많은 HIV 보균자는 HBV와 동시 감염된다. 그러나, HBV는 HIV 보다 100배 높은 감염성을 나타낸다.
현재 세개의 항-HBV 약물이 임상 사용을 위하여 승인되었지만, 내성의 빠른 발생, 및 치료법과 관련된 투약-제한 독성으로 인해 상당한 요구되는 의학적 필요성이 존재한다. 임상적 사용을 위해 승인된 약물로는 알파 인터페론, 유전공학처리된 단백질, 및 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 라미부딘, 및 엔타카비르를 포함한다. 다른 승인된 항-HBV 약물로는 모노뉴클레오티드 포스포네이트 유사체로 여겨지는 아데포비르 디피복실이 있다.
많은 합성 뉴클레오시드가 항-HBV 제제로서 개발되고 있다. 예를 들어, 라미부딘 또는 3-TC로 공지된 BCH-189 (2'3'-디데옥시-3'-티아시티딘)의 (-)-거울상이성질체는 리오타(Liotta) 등에 의해 미국특허 제5,530,116호에 청구되었다.
FTC 또는 베타-2-히드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1,3-옥사티올란은 리오타 등에 의해 미국특허번호 제5,5814,639호 및 제5,914,331호에 청구되었다[참조; Furman et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2686-2692, 1992]. L-FMAU 또는 2'-플루오로-5-메틸-베타-L-아라비노푸라노일 우리딘은 미국특허 제5,565438호, 제5,567,688호 및 제5,587,362호에 기술되어 있다.
PMEA로 언급되는 아데포비르 또는 (9-[2-(포스포노-메톡시)에틸]아데닌은 미국특허 제5,641,763호 및 제5,142,051호에 기술되어 있다. 아데포비르 디비폭실로 서 언급되는 상응하는 전구약물은 경구 활성 항-HBV 제제로서 임상적으로 승인된 것이다.
미국특허 제5,444,063호 및 제5,684,010호에서는 HBV를 치료하기 위한 베타-D-1,3-디옥솔란 뉴클레오시드의 거울상이성질체의 용도가 기재되어 있다.
미국특허번호 제6,881,831호(Iyer et al.)에서는 HBV의 치료에서 사용하기 위한 뉴클레오티드간 연결에 의해 연결된 두개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 리보뉴클레오티드 단량체를 포함하는 화합물이 기재되어 있다.
상이한 구조의 L 뉴클레오시드는 출원 WO 08/40164, WO/95/07287 및 WO 00/09531에서 항-HBV 제제로서 청구되었다.
청구된 다른 항-HBV 제제는 (1) 베타-D-3'아지도-2,3-디데옥시 5-플루오로시티딘[Mahmoudian, Pharm Research 8, 1198-203, 1991]; (2) 2'-베타-D-F-2',3'-디데옥시뉴클레오시드 유사체[Tsai et al., Biochem Pharmacol. 48, 1477-1481, 1994]; (3) 5-카르복시미도-, 또는 5-플루오로-2,3 불포화 또는 3'-개질된 피리미딘 뉴클레오시드를 포함한다.
아데포비르 이외에, 몇몇 뉴클레오티드 유사체로는 항-HBV 제제로 청구되었다. 이들은 9[1-포스포노메톡시시클로프로필)메틸구아닌], PMCG 및 이의 디피발록실 전구약물, PMCDG 및 트리플루오로메틸 유사체, MCC-478을 포함한다[참조; Iyer et al., Current Opinion in Pharmacol 5, 520-528, 2005].
환형 뉴클레오시드 포스포네이트 유사체 및 전구약물 유도체는 또한 항-HBV 활성을 갖는 뉴클레오티드 유사체이다. 상응하는 포스포라미데이트 전구약물 유사 체는 아마도 에스테라제 효소에 의해 포스포네이트 유도체로 전환된다[참조; Iyer et al., Current Opinion in Pharmacol., 5, 520-528, 2005].
전구약물 유사체로서 화학적으로 개질된 약물을 사용한다는 개념은 여러 상이한 약물들의 약제학적 개발에서 확립된 패러다임이다. 전구약물 전략은 (a) 화학적 안정성을 개선시키고, (b) 수용성을 변경시키고, (c) 생체이용률을 개선시키고, (d) 특정 조직을 타겟화하고, (e) 상승적 약물 조합을 촉진하고, (f) 제1-통과 대사효과를 극복하고, (g) 친수성 약물을 위한 친유성 담체로서 제공하고, (h) 지연된 약물 전달을 위한 화학적 데포트로서 제공하기 위하여 약물의 물리화학적 성질의 일시적 개질을 허용한다.
몇몇 전구약물 전략은 생체이용률을 개선시키고, 간조직 분포를 향상시키고, 항바이러스 효능을 개선시키기 위해 사용되었다. 예를 들어, 포스페이트기의 상응하는 아미노산 포스포라미데이트로서의 개질은 더욱 강력한 항바이러스제를 초래한다[Gudmundsson et al., Nucleosides. Nucleotides, 23, 1929-1937, 2004. Cahard et al., Mini Reviews Med Chem., 4,371-381, 2004]. 뉴클레오시드의 글리세릴 포스페이트 및 포스포지질 전구약물은 또한 경구 생체이용률을 개선시키기 위하여 개발되었다[Hostetler et al., Antimicrob Agents and Chemotherapy, 44, 1064-1069, 2000]. S-아실티오에틸(SATE) 및 시클릭 살리실 유도체(시클로살)는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드의 전구약물 유도체화의 다른 예이다[Peyrottes, et al., Mini Rev. Med. Chem., 4, 395-408, 2004; 및 Meier et al., Mini Rev Med Chem 4, 383-394, 2004]. 다른 전구약물 전략은 간 효소에 의해 산화성 분열을 수행하여 활성 뉴클레오티드를 세포내로 방출하기 위해 디자인된 4-아릴치환된 시클릭 1,3-프로파닐 에스테르(HepDirect 유사체)를 포함한다[Erion et al., J. Am. Chem. Soc., 126, 5154-5163, 2004].
일반적으로, 모든 뉴클레오시드는 이들이 HBV 폴리머라제의 억제제가 되기 전에 뉴클레오시드 모노-, 디-, 및 트리포스페이트로 포스포릴화되어야 한다. 따라서, 뉴클레오시드는 생체내에서 활성화되어야 하는 전구약물로서 여겨질 수 있다. 대부분의 뉴클레오시드가 바이러스 폴리머라제를 타겟으로 하고 유사한 작용 메카니즘에 의해 작용하기 때문에, 인간 감마 폴리머라제의 억제로 인한 미토콘드리아 독성과 같은 부작용의 발생 및 내성의 빠른 발생 가능성이 있다. 항바이러스 치료법이 지닌 다른 문제점은 치료법의 중지 후에 바이러스가 재결합하는 것이다.
전구약물 전략은 또한 올리고뉴클레오티드(18 내지 30 량체)의 경우에서 적용되는 것으로서, 이는 아프타머(aptamer), 안티센스, 리보자임, RNA 방해, 및 면역자극과 같은 기술을 이용하여 잠재적으로 신규한 부류의 치료제로서 발달되고 있다[참조; (a) Szymkowski, D. E. Drug Disc. Today 1996, 1, 415; (b) Uhlmann E.; Peyman A. Chem. Rev. 1990, 90, 543 (c) Uhlenbech O. C. Nature 1987, 328, 596; (d) Zamore P. D. Science, 2002, 296, 1265; (e) Manoharan, M. Curr. Op. Chem. Biol. 2004, 8, 570; (f) Iyer, R. P.; Kuchimanchi, S.; Pandey, R. K. Drugs of the Future 2003, 28, 51 (g) Uhlmann, E.; Vollmer, J. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2003, 6, 204].
고도로 하전된 고분자량 화합물이 존재하는 경우, 올리고뉴클레오티드는 침 습적 확산에 의한 세포 투과를 위해 바람직하게 물리화학적으로 기여하지 않는다. 결론적으로, 올리고뉴클레오티드의 전구약물 유사체의 디자인은 생체가역성의 친유성 기에 의해 이들의 네가티브로 하전된 골격의 일부를 부분적으로 마스킹(masking)하는데 주로 촛점이 맞추어져 있다. 수개의 이러한 유사체가 합성되었으며, 생체가역성은 시험관내에서 증명되었다. 그러나, 하나 이상의 뉴클레오티드의 초기 비마스킹이 빠르게 발생함에도 불구하고, 완전한 비마스킹은 수시간 또는 심지어 수일이 소요된다. 예를 들어, 이어(Iyer) 등은 혼합된 PO-PS 올리고뉴클레오티드의 S-아실옥시알킬 유도체를 제조하였으며, 시험관내에서, 이것이 모 올리고뉴클레오티드로 비록 천천히 다시 전환될 수 있음을 확인하였다. 유사한 SATE 전구약물 전략은 올리고뉴클레오티드 전구약물을 위해 사용되었다. 그러나, 올리고뉴클레오티드의 약력동력학의 개선 또는 생물학적 활성의 향상 측면에서 이들의 생체내 가능성이 증명되지 않았다. 또한, 올리고뉴클레오티드 전구약물의 생체내 경구 생체이용률 연구 또는 생체내 생물학적 활성에 대한 증명이 보고된 바 없다.
20량체 올리고뉴클레오티드와 비교하여 보다 낮은 전하의 값 및 보다 적은 분자량을 지닌 보다 짧은 사슬의 올리고뉴클레오티드(8량체 미만)는 잠재적 치료 및 진단 성질을 지닌 신규한 분자의 가망성 있는 부류를 나타낸다. 게다가, 최근 보고서들은 모노-, 디-, 트리-, 및 짧은 사슬 올리고뉴클레오티드가 치료학적 적용을 위해 이용될 수 있는 우수한 생물학적 활성을 지니는 것으로 제시되고 있다.
그러나, 비효율적인 세포 투과능력과 결합된 경구, 경피 및 다른 비-침습성 환자-순응 전달 시스템의 부족은 이러한 분자의 치료학적 발전에 상당한 장애물이 다.
발명의 개요
디-, 및 트리-뉴클레오티드의 경구 생체이용가능한 유사체의 개발하기 위한 노력으로, 모델 디뉴클레오티드의 다수의 S-작용화된 비하전된 프로뉴클레오티드 유도체의 합성 및 평가를 수행하였다. 프로뉴클레오티드 유도체의 디자인은 잠재적 작용성을 차단하지 않아서 생체내에서 모 뉴클레오티드를 나타내는 타겟 효소의 능력을 기초로 한 것이다. 본원에서는 특히 HBV의 치료를 위해 유용한 다양한 화합물의 디자인, 합성, 안정성, 생체가역성 및 세포독성 연구의 결과를 기술하고 있다.
본 발명은 하기 화학식 (I)의 프로뉴클레오티드, 또는 이의 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체 또는 토오토머를 제공한다:
Figure 112008046444914-PCT00001
(I)
상기 식에서,
X는 부재이거나, O, NH, NR 또는 S이며;
X1은 부재이거나, 0 또는 NH이며;
A는 부재이거나, 아릴 또는 아르알킬이며;
n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며;
R은 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬, 헤테로시클릭, O-알킬, 0-헤테로아릴 또는 스테로이달(steroidal)이며;
R1, R2는 독립적으로 H, OH, 0-알킬, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬, 헤테로시클릭, 0-아릴, 0-헤테로아릴아릴 또는 헤테로시클릭이며;
R3는 수소, 알킬, 치환된 알킬, C(O)-알킬, C(0)0-알킬, C(O)-아릴, C(0)0-아릴, C(O)NH-알킬 및 C(O)NH-아릴로부터 선택되며;
Y, Z는 독립적으로 0 및 S이며;
B1, B2는 독립적으로 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 우라실 또는 개질된 뉴클레오시드이며;
m은 1 내지 40이다.
본 발명에 따른 전구약물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 이들 화합물을 함유한 약제학적으로 허용되는 제형은 HBV 감염증, 및 간 염증, 간경변, 급성 간염, 지속성 간염, 만성 간염, 및 다른 간 질환과 같은 HBV에 의해 야기되는 다른 병태의 예방 및 치료에 유용하다. 본 발명의 화합물 및 제형은 또한 HBV-감염된 개체에서 질환 진행을 예방하기 위해 예방적으로 사용될 수 있다.
유효량의 전구약물의 약제학적 활성 염을 포함하는 본 발명의 전구약물을 단독으로, 또는 다른 또는 기타 항-HBV 제제(들)과 조합하거나 순차적으로 투여함을 포함하여, 인간을 포함한 숙주에서의 HBV 감염증의 치료를 위한 방법이 또한 기재되어 있다. 본 발명의 바람직한 전구약물은 3-dApsU2'-OMe, 3'dApsA7데아자, 및 3'-dApsTpsC 및 이들의 유사체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 디-, 및 트리-뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 "ps"는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 칭한다.
이러한 상황에서, 본 출원인은 최근에 특정 디-, 및 트리-뉴클레오시드 포스포로티오에이트(PS) 및 포스포라미데이트 유사체가 시험관내 및 생체내에서 강력한 항-HBV 활성을 나타냄을 보고하였다. 이량체 및 삼량체 PS 유사체가 네가티브로 하전된 작은 분자이지만, 랫트에서 35S-라벨링된 화합물의 연구는 이러한 화합물들이 경구적으로 생체이용가능하지 못함을 나타내었다. 경구 생체이용성의 부족은 (a) 뉴클레오티드의 실질적 퇴화를 야기하는 위의 산성 환경, (b) 장점막 베리어(barrier)를 통한 뉴클레오티드의 투과를 억제하는 골격 상의 네가티브 전하, 및 (c) 화합물을 분해하는 GI계에서의 다양한 소화 효소의 존재를 포함하는 다수의 인자로 기인할 수 있다. 보다 긴 사슬의 올리고뉴클레오티드 및 보다 짧은 사슬의 올리고뉴클레오티드가 경구적으로 생체이용가능하지 않음을 제공하는 경우, 화합물의 보다 작은 뉴클레오티드 부류의 경우에, 화합물의 크기 보다 적은 전하는 생체이용성을 결정하는데 더욱 중요한 인자일 수 있으며, 골격상의 네가티브 전하의 마스킹은 잠재적으로 경구적으로 생체이용가능한 뉴클레오티드 화합물을 제공할 수 있다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 상기 및 다른 목적, 특징 및 장점은 유사한 참조번호가 상이한 도면에서 동일한 부분을 칭하는 첨부된 도면에 묘사된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 구체예의 보다 구체적인 설명으로 자명하게 될 것이다. 도면은 반드시 일정한 비율로 나타낸 것이 아니며, 대신에 본 발명의 원리를 묘사하는데 강조하도록 기재된다.
도 1은 통상적인 프로뉴클레오티드의 31P NMR 선이다.
도 2는 본 발명의 조성물을 이용하여 생체내 실험 결과를 나타낸 산점도이다.
발명의 상세한 설명
제 1 구체예에서, 본 발명의 화합물은 상기 기술된 화학식 (I)로 표시되는 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체, 또는 토오토머이다.
제 2 구체예에서, 본 발명의 화합물은 하기 기술된 화학식 (II)로 표시되는 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체, 또는 토오토머이다:
Figure 112008046444914-PCT00002
(II)
상기 식에서, m은 1, 2 또는 3이며; R, X, X1, A, n, R1, R2, R3, B1 및 B2는 상기에서 규정된 바와 같다.
제 3 구체예에서, 본 발명의 화합물은 하기 기술된 화학식 (III)으로 표시되는 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체, 또는 토오토머이다:
Figure 112008046444914-PCT00003
(III)
상기 식에서, R, X, A, n, B1 및 B2는 상기에서 규정된 바와 같다.
제 4 구체예에서, 본 발명의 화합물은 하기 기술된 화학식 (IV)로 표시되는 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체, 또는 토오토머이다:
Figure 112008046444914-PCT00004
(IV)
상기 식에서, R4는 수소, 수소, C(O)-알킬, C(O)O-알킬, C(O)-아릴, C(O)O-아릴, C(O)NH-알킬 및 C(O)NH-아릴로부터 선택되며; R, R3, X, X1, A 및 n은 상기에서 규정된 바와 같다.
제 5 구체예에서, 본 발명의 화합물은 하기 기술된 화학식 (V)로 표시되는 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체, 또는 토오토머이다:
Figure 112008046444914-PCT00005
(V)
상기 식에서, R, R3, R4, X, X1, A 및 n은 상기에서 규정된 바와 같다.
제 6 구체예에서, 본 발명의 화합물은 하기 기술된 화학식 (VI)으로 표시되는 화합물, 또는 이의 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체, 또는 토오토머이다:
Figure 112008046444914-PCT00006
(VI)
상기 식에서, R, R3, X, X1, A 및 n은 상기에서 규정된 바와 같다.
본 발명에 따른 대표적인 화합물은 하기 화학식 (A1)의 화합물 (1) 내지 (8)로 구성된 군으로부터 선택된 것이다:
Figure 112008046444914-PCT00007
(A1)
상기 식에서, R, XI, R3 및 R4는 하기 표 1에서의 각 예에 대해 기술된다.
표 1
Figure 112008046444914-PCT00008
본 발명에 따른 대표적인 화합물은 하기 화학식 (B1)의 화합물 (9) 내지 (16)으로 구성된 군으로부터 선택된 것이다:
Figure 112008046444914-PCT00009
(B1)
상기 식에서, R, X1, R3 및 R4는 하기 표 2에서의 각 예에 대해 기술된다.
표 2
Figure 112008046444914-PCT00010
다른 약물과 조합하여 사용될 수 있는 신규한 작용 메카니즘을 갖는 신규한 화학 물질인 항-HBV 약물에 대한 개발이 시급히 필요하다. 본 발명의 디- 및 트리-뉴클레오티드 유사체는 항-HBV 치료제로서 유용하고, 항-HBV 제제의 전통적인 뉴클레오시드 부류와 상이한 항바이러제 발견에서 신규한 패러다임을 나타낸다. 이어(Iyer) 등에 의해 등록된 미국특허 제6,881,831호(이들 전문이 본원에 참고문헌으로 통합됨)에서는 항-HBV 활성을 갖는 디-, 및 트리-뉴클레오티드가 기재되어 있다. 수많은 이러한 화합물들은 또한 HBV의 내성 균주에 대한 활성을 가지며[Iyer et al., Antimicrob. Agents and Chemotherapy, 48, 2199-2205, 2004], 디뉴클레오티드 3-dApsU2'-OMe (메톡시 부분을 지닌 당의 2' 위치에서 개질된 우라실과 함께 포스포로티오에이트 링커에 의해 우라실에 연결된 3-데옥시 아데닌)는 HBV 감염증의 유전자 도입 마우스 모델에서 우수한 항-HBV 활성을 나타내었다[Iyer et al., Antimicrob. Agents and Chemotherapy, 48, 2318-2320, 2004].
여러 연구는 3-dApsU2'-OMe 및 다른 디-, 트리-뉴클레오티드의 우수한 신진대사가 마우스 및 인간 간 마이크로솜의 존재하에 시험관내에서 발생하지 않음을 제시하고 있다. 이는 3-dApsU2'-OMe 및 다른 디-, 및 트리-뉴클레오티드의 항바이러스 활성이 본래 뉴클레오티드 구조로 기인한 것이지 이의 신진대사에 기인한 것이 아니라는 가설을 뒷받침한다. 이는 전통적인 항바이러스 뉴클레오시드와 상반되는 것으로서, 신진대사 활성 및 이의 작용에 대한 트리포스페이트 유도체로의 전환을 요구한다.
마멋(woodchuck)에서의 3-dApsU2'-OMe의 약력동력학적 연구는 정맥내(IV) 투여 후에, 3-dApsU2'-OMe의 상당한 혈장 수준이 약 1시간의 반감기로 나타남을 나타내었다. 디뉴클레오티드 3-dApsU2'-OMe는 거의 본래의 물질로서 소변으로 제거되었으며, 이는 간에서 상당한 신진대사의 부족을 제시하는 것이다. 이러한 관찰은 인간 간 마이크로솜을 이용하여 시험관내 3-dApsU2'-OMe의 상당한 신진대사의 결핍과 일치하며, 이에 따라 3-dApsU2'-OMe의 항바이러스 활성이 본래 뉴클레오티드 구조로 기인한 것이지 이의 신진대사에 기인한 것이 아니라는 가설을 뒷받침한다. 이는 통상적인 항바이러스 뉴클레오시드와 상반되는 것으로, 이는 신진대사 활성 및 이러한 작용을 위한 트리포스페이트 유도체로의 전환을 요구한다.
랫트에서 35-라벨링된 디- 및 트리뉴클레오티드의 정맥내(IV) 투여는 흡수 후에, 화합물이 중심 구획으로부터 혈관 밖 조직으로 매우 빠르게 분산됨을 제시한다. 화합물은 다른 조직에서는 소량으로 나타나면서 간 및 신장에서 진하게 농축되었다. 화합물의 제거는 느린 것으로 나타났다. 이러한 연구는 간에서 화합물의 현저한 분포가 흡수 후에 발생함을 나타내는 것이다. 간이 HBV에 대한 타겟 기관이기 때문에, 이러한 연구는 디- 및 트리-뉴클레오티드가 용이하게 간 세포에 들어감을 나타내는 것이다. 유전자 도입 마우스 모델에서의 디뉴크레오티드 3-dApsU2'-OMe의 강력한 항바이러스 활성은 상기 연구 모두에 의해 뒷받침된다.
카코-2 세포를 사용한 디- 및 트리뉴클레오티드의 시험관내 세포 투과 연구는 이러한 하전된 분자의 장 흡수가 일어나지 않음을 제시한다. 카코-2 세포가 경구 생체이용성이 다소 예상되기 때문에, 이러한 연구는 신규한 제형/약물 전달 전략이 이용되지 않는 한, 디-, 및 트리-뉴클레오티드가 침습성 확산에 의해 장 점막으로부터 흡수되지 않을 수 있음을 제시한다. 경구 생체이용성의 부족은 (a) 뉴클레오티드의 실질적 퇴화를 야기하는 위의 산성 환경, (b) 장점막 베리어를 통한 뉴클레오티드의 투과를 억제하는 골격 상의 네가티브 전하, 및 (c) 화합물을 분해하는 GI계에서의 다양한 소화 효소의 존재를 포함하는 다수의 인자로 기인할 수 있다. 보다 긴 사슬의 올리고뉴클레오티드 및 보다 짧은 사슬의 올리고뉴클레오티드가 경구적으로 생체이용가능하지 않음을 제공하는 경우, 화합물의 보다 작은 뉴클레오티드 부류의 경우에, 화합물의 크기 보다 적은 전하는 생체이용성을 결정하는데 더욱 중요한 인자일 수 있으며, 골격상의 네가티브 전하의 마스킹은 잠재적으로 경구적으로 생체이용가능한 뉴클레오티드 화합물을 제공할 수 있다.
당해 분야에서, 일반적으로 뉴클레오시드는 경구적으로 불량한 생체이용가능성을 지니며, 약물 유도체화는 경구 생체이용성을 향상시키기 위한 전략으로서 개조되는 것으로 이해된다. 임바치(Imbach) 등에 의해 청구된 미국특허 제6,875,751호에서는 경구적 생체이용성이 개선된 L-뉴클레오시드의 전구약물로서 2'-데옥시-베타-L-뉴클레오시드의 3'-아미노산 전구약물이 기재되어 있다. 유사하게는, SATE 전구약물 전략은 또한 뉴클레오시드에 대해 유사하게 적용되었다.
그러나, 뉴클레오티드 및 디뉴클레오티드의 경우에서의 문제는 이들이 이의 구조에 고도로 산-불안정 푸린 및 피리미딘 부분을 함유한다는 것이다. 따라서, 이러한 분자의 네가티브 전하의 마스킹이 친유성을 증가시켜 이의 세포 확산에 도움을 줌에도 불구하고, 이들이 경구적으로 흡수되어 위점막에서 충분히 길게 안정한지의 여부는 알려지지 않았다. 통상적으로, 예를 들어 디뉴클레오티드 3-dApsU2'-OMe는 10분 미만의 반감기로 자극화된 위 유체에서 빠르게 분해되었다. 이러한 분해 공정은 뉴클레오염기 중의 질소의 초기 양자화 후에 탈푸린화 및 당 고리의 분열에 의해 일어나는 것으로 알려져 있다.
따라서, 산-매개된 분해로의 3-dApsU2'-OMe의 민감성이 제공되는 경우, 골격 상에서 전하의 마스킹이 이들의 분해에 대해 보호되고, 위의 산성 환경에서 이들의 안정성을 증가시키고, 이에 따라 경구 흡수를 촉진할 수 있는 지의 여부를 선험적으로 예상할 수 없다. 또한, 경구 생체이용성은 단순하게 위 점막에서의 안정성과 관련되지 않은 것으로 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 안정성이 향상되어도, 비교적 큰 분자량 디-, 및 트리-뉴클레오티드 전구약물(MW>700 달톤)이 점막 베리어를 가로질러 이동될 수 있지는지의 여부는 알려지지 않았다. 게다가, 활성 이동 메카니즘에 의해 점막을 가로지르는 이러한 신규한 화합물의 이동을 촉진시킬 수 있는 특정 이동체가 존재하는지의 여부는 많이 공지되어 있지 않다. 리핀스키의 법칙(Lipinski's rule; Lipinski, C. A., Adv. Drug Del. Rev. 23, 3, 1997]에 따르면, 약물 분자는 침습성 확산에 의한 경구 흡수를 위해 500 달톤 미만의 분자량, 5 이하의 수소 결합 공여체(OH 및 NH기), 10 이하의 수소 결합 수용체(특히, N 및 O), 500 이하의 분자량, 5 이하의 LogP를 가져야 한다. 게다가, 디- 및 트리뉴클레오티드 전구약물은 보다 높은 분자량을 지니고, 경구 흡수를 위한 많은 리핀스키 기준을 충족하지 못한다.
본 발명의 디- 및 트리뉴클레오티드 전구약물은 고리 및 뉴클레오염기에서 신규한 개질 또는 치환을 갖는다. 에스테라제 또는 다른 효소가 활성에 대해 특정 구조 및 위상 요구사항을 가지기 때문에, 디- 및 트리-뉴클레오티드 전구약물이 효소에 대한 기질일 것으로 예상되지 않을 것이다. 또한, 본원에 기술된 많은 화합물들은 이성질체 혼합물이며, 효소가 입체-특이적인 것으로 알려져 있기 때문에, 개개 이성질체가 기질일 수 있는지의 여부 또는 모분자로의 전환율이 이들이 약물 후보물질로서 덜 매력적으로 이루어지는데 크게 상이한지의 여부가 알려져 있지 않다.
따라서, 전구약물의 개념이 공지되어 있고 수많은 전략이 뉴클레오시드 및 모노뉴클레오티드를 포함한 수많은 화합물들의 전구약물을 제조하기 위해 존재하지만, 디- 및 트리-뉴클레오티드의 유사한 전구약물이 경구 생체이용성을 가지고, 결론적으로 경구적으로 생체이용가능한 약물로서 개발될 수 있는지를 선험적으로 예상할 수 없거나 당업자에게 자명하지 않을 것이다. 본 발명은 이러한 조성물을 제공한다.
반응식 1
Figure 112008046444914-PCT00011
일 예에서, 다수의 S-작용화된 비하전된 전구약물 유도체가 청구된다. 전구약물 유도체의 디자인은 잠재적 작용성을 비마스킹하여 생체내에서 모 뉴클레오티드를 나타내는 타겟 효소의 능력을 기초로 한다. 대표적인 예로서, 모 이량체(4)로의 이의 에스테라제-매개된 전환을 위한 예상되는 메카니즘 및 유도된 디뉴클레오티드 유도체(1-3)의 일반 구조는 반응식 1에 기술되어 있으며, 하기 (a) - (c)를 포함한다: (a) S-(아실옥시알킬)티오포스페이트 유사체(1). 항생제 피밤피실린, 바캄피실린, 및 최근 승인된 항-HBV 제제 아데포비르 디피복실로 예시되는 아실옥시알킬 유사체는 임상적으로 경구 생체이용가능한 에스테르 전구약물 유사체로 사용되었다. 이들의 흡수 후에, 전구약물의 모 분자로의 전환은 포름알데히드 및 카르복실산의 유리를 수반하면서 혈장 및/또는 간에서 에스테라제-매개된 가수분해를 통해 이루어지는 것으로 여겨진다. (b) S-(아실옥시아릴)티오포스페이트 유사체(2). 다우노루비신, 독소루비신, 포스포로디아미드 머스타드(mustard), 아시비신, 및 PEG-다우노루비신 콘주게이트의 아실옥시아릴 유사체는 널리 알려져 있으며2b, 시험관내 및 생체내에서 광범위하게 평가되었다[Bundgaard, H. In Bio-reversible carriers in drug design. Theory and Application. Roche, E.B. Ed.; Pergamon Press: New York, 1987; pp 13-94; 참조: Oliyai, R.; Stella, V. J. Annu. Rev Pharmacol. Toxicol. 1993, 32, 521; Papot, S.; Tranoy, I.; Tillequin, F.; Florent, J.-C.; Gesson, J.-P. Cum. Med. Chem. 2002, 2, 155]. 반응성 메틸렌 퀴논 중간체가 이러한 전구약물의 가수분해시에 일시적으로 방출되지만, 세미-퀴논 중간체에 의한 물 분자의 빠른 포집은 무해한 벤질 알코올 종으로의 이의 전환을 초래하며, 이에 따라 임의의 세포 손상을 최소화한다. 이러한 원리를 사용하여, 본 발명의 특정 뉴클레오티드 유사체 또는 프로뉴클레오티드는 에스테르 유사체(분자에 보다 큰 친수성을 부여하는 장쇄 알콕시기를 지님), 및 아미드 유사체를 포함하도록 디자인되며; (c) 말단 작용기 S-알킬 유도체 (3)는 효소-매개된 가수분해 공정 동안 잠재적 뉴클레오티드 기가 발견되지 않도록 디자인되며, 여기서 이는 친전자성 탄소 알파를 티오포스페이트 부분에 공격하도록 병렬배치되어 모 디뉴클레오티드의 방출을 초래한다.
본 발명의 전구약물 또는 프로뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드, 디뉴클레오티드, 트리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드의 특정 유도체 및 콘주게이트에 관한 것이다. 콘주게이팅 부분은 상이한 화학적 및 구조 타입을 가질 수 있으며, 에스테르, 아미드, 이소시아네이트, 우레아, 티오우레아, 카르바메이트 또는 공유 결합의 다른 타입에 의해 뉴클레오시드 및 올리고뉴클레오티드에서 뉴클레오티드 또는 다른 작용성의 히드록시, 아미노, 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 골격에 연결될 수 있다. 상기에서 기술된 효소 작용의 예상가능하지 않은 특성을 제공하는 경우, 특정 콘주게이트는 시험관내 또는 생체내에서 모 뉴클레오티드를 화학적으로 또는 효소적으로 재생시키거나 재생시키지 않을 수 있고, 또한 생물학적 활성이 콘주게이트 또는 모 뉴클레오티드, 또는 둘 모두에 잔류할 수 있다. 상세하게는, 수개의 디-, 트리-, 및 테트라-뉴클레오티드 및 이들의 유사체는 항-HBV 제제로서 종래에 동정되었다[미국특허 10/146,175 및 CIP]. 그러므로, 본 발명에서 보고된 유도체 및 콘주게이트는 또한 이들 작용에서 인용된 화합물에 적용가능하다.
3-dApsU2'-OMe의 모든 전구약물은 3-dApsU2'-OMe로부터 유도된 이성질체 Rp,Sp 화합물로부터 유도된 Rp,Sp 이성질체의 혼합물이다. 유사한 논쟁은 트리- 및 테트라뉴클레오티드에 대해 갖는다.
본 발명의 일 구체예에서, 콘주게이팅 부분은 R은 반응식 1에 도시된 일반 구조식의 화학식 (A)의 골격에 연결될 수 있는 "마스킹 기", "R"로 표시되며, 여기서 아실옥시 알킬, 아릴, 및 헤테로아릴 에스테르, 카르보네이트, 카르바메이트, 아미드 등이다. 헤테로시클릭 고리는 바람직하게는 다른 고리에 융합되거나 부재인 O, N 또는 S 고리 원자를 함유한 5- 또는 6-원을 함유한다.
하전된 골격의 마스킹은 위장계(다양한 소화 효소를 지님)의 산성 및 염기성 환경에 대한 뉴클레오티드의 안정성을 개선시킬 수 있으며, 이에 따라 경구 흡수를 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 네가티브로 하전된 포스포릭 디에스테르 또는 포스포로티오에이트 연결의 존재는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레아제-매개된 퇴화를 위해 필수적인 것으로 여겨진다. 그러나, S-알킬화된 유도체의 제조에 의해 네가티브 전하를 마스킹하므로써, 폴리뉴클레오티드의 화학적 및 효소-매개된 퇴화 작용은 억제될 수 있으며, 이에 따라 폴리뉴클레오티드의 안정성을 향상시킬 수 있다.
Figure 112008046444914-PCT00012
본 발명의 다른 구체예에서, 콘주게이팅 부분은 포유동물 세포 또는 박테리아 세포벽의 지질 이중층)과 같은 생물학적 베리어를 가로질러 약물의 이동을 촉진시키는 친지성 기일 수 있다. 친지성 기의 예로는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 콜레스테롤, 콜산, 포스포지질 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 친지성 기는 디뉴클레오티드 포스포로티오에이트, 3'dApsU2'OMe의 콜산 유사체의 구조로 도시되는 화합물 (B) 또는 하기 화학식으로 도시된 바와 같이 하나 이상의 사이트에서 당 히드록실, 뉴클레오염기, 또는 뉴클레오티드간 포스페이트 및 포스포로티오에이트 연결에 연결된다:
Figure 112008046444914-PCT00013
당 히드록실, 뉴클레오염기에서, 및 뉴클레오티드간 포스포로티오에이트 연결에서 아미노산 및 펩티드에 콘주게이트된 디뉴클레오티드의 통상적인 구조는 화합물 (C-I)로 표시된다.
Figure 112008046444914-PCT00014
본 발명의 다른 구체예에서, 콘주게이팅 부분은 다양한 세포 베리어를 가로질러 뉴클레오티드의 활성 이동을 촉진시키는 기일 수 있다. 이러한 부분은 아미노산, 펩티드 및 폴리펩티드를 포함하는 천연 또는 합성 기원일 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 콘주게이팅 부분은 특정 조직 또는 기관에 대한 약물의 타겟화를 촉진시킬 수 있다. 이러한 부분은 모노클로날 항체 또는 다른 천연 산물을 포함하며, 이는 특정 타겟 조직에서 국소화되는 성질을 지닌다.
천연 산물의 두가지 예인, 트리뉴클레오티드에 콘주게이팅된 쿠루쿠민 및 아스피린은 각각 반응식 2 및 3에 도시되어 있다. 도시된 바와 같이, 콘주게이팅 부분은 당 히드록실 또는 뉴클레오염기 아미노기를 통해 결합될 수 있다.
뉴클레오시드 유닛은 라인 도면의 국제적으로 허용된 협약에 의해 표시된다. 하기 예에서, 2'-치환된 리보뉴클레오시드는 통상적인 구조 및 상응하는 라인 도면 포멧으로 표시된다:
Figure 112008046444914-PCT00015
α 또는 β N- 또는 C-뉴클레오시드를 발생시키는 B1 및 B2에 부착된 당 유닛으로는 푸라노즈, 데옥시리보푸라노즈, 리보즈, 및 아라비노즈를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "아릴"은 페닐, 나프틸, 테트라히드로나프틸, 인다닐, 이데닐 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 방향족 고리를 지닌 모노- 도는 폴리시클릭 카르보시클릭 고리 시스템을 칭한다.
본원에서 사용되는 "헤테로아릴"은 5개 내지 10개의 고리 원자를 지닌 고리는 모노- 또는 폴리시클릭(예를 들어, 비- 또는 트리-시클릭 또는 이를 초과) 방향족 라디칼을 칭하는 것으로서, 여기서 하나 이상의 고리 원자는 예를 들어, S, O 및 Z로부터 선택되며; 0, 1개 또는 2개의 고리 원자는 예를 들어 S, O 및 N으로부터 독립적으로 선택된 추가 헤테로원자이며, 나머지 고리 원자는 탄소이고, 여기서 고리내에 함유된 임의의 N 또는 S는 임의적으로 산화될 수 있다. 헤테로아릴은 피리디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이소옥사졸릴, 티아디아졸릴, 옥사디아졸릴, 티오페닐, 푸라닐, 퀴놀리닐, 이소키놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조옥사졸릴, 퀴녹살리닐 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따라, 본원에 기술된 임의의 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴 및 치환된 헤테로아릴은 임의의 방향족 기일 수 있다. 방향족 기는 치환되거나 비치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "알킬"은 각각 1개 내지 6개, 또는 1개 내지 12개의 탄소워나를 함유한 포화된 직쇄- 또는 분지쇄 탄화수소 라디칼을 칭한다. C1-C6 알킬 라디칼의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 3차-부틸, 네오펜틸 및 n-헥실 라디칼을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며; C1-C12 알킬 라디칼의 예로는 에틸, 프로필, 이소프로필, n-헥실, 옥틸, 데실, 도데실 라디칼을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "아르알킬" 또는 "아릴알킬"은 아릴-치환된 알킬 라디칼, 예를 들어, 벤질, 디페닐메틸, 트리페닐메틸, 페닐에틸, 및 디페닐에틸을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "헤테로시클릭"은 비방향족 5-, 6- 또는 7-원 고리 또는 비- 또는 트리-시클릭기 융합된 시스템을 칭하는 것으로, 여기서 (i) 각 고리는 산소, 황 및 질소로부터 독립적으로 선택된 1개 내지 3개의 헤테로원자를 함유하며, (ii) 각 5-원 고리는 0 내지 1개의 이중 결합을 지니고, 각 6-원 고리는 0 내지 2개의 이중 결합을 지니며, (iii) 질소 및 황 헤테로원자는 임의적으로 산화될 수 있으며, (iv) 질소 헤테로원자는 임의적으로 4차화될 수 있으며, (iv) 임의의 상기 고리는 벤젠 고리에 융합될 수 있으며, (v) 나머지 고리 원자는 임의적으로 옥소-치환될 수 있는 탄소원자이다. 대표적인 헤테로시클로알킬기로는 [1,3]디옥솔란, 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이쇠아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 및 테트라히드로푸릴을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 헤테로시클릭 기는 추가로 치화될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "시클로알킬"은 단일 수소 원자의 제거에 의해 모노시클릭 또는 폴리시클릭 포화된 카르보실클릭 고리 화합물로부터 유도된 일가 기를 의미한다. 예로는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 비시클로[2.2.1]헵틸, 및 비시클로[2.2.2]옥틸을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "치환된 아릴," "치환된 알킬," "시클로알킬"은 1개, 2개 또는 3개 이상의 수소 원자를, -F, -Cl, -Br, -I, -OH, 보호된 히드록실, -NO2, -CN, -NH2, 보호된 아미노, -NH-C1-C12-알킬, -NH-C2-C12-알케닐, -NH -C2-C12-알케닐, -NH -C3-C12-시클로알킬, -NH -아릴, -NH -헤테로아릴, -NH -헤테로시클로알킬, -디알킬아미노, -디아릴아미노, -디헤테로아릴아미노, -0-C1-C12-알킬, -O-C2-C12-알케닐, -O-C2-C12-알케닐, -O-C3-C12-시클로알킬, -0-아릴, -0-헤테로아릴, -0-헤테로시클로알킬, -C(O)-C1-C12-알킬, -C(O)-C2-C12-알케닐, -C(O)-C2-C12-알케닐, -C(O)-C3-C12-시클로알킬, -C(O)-아릴, -C(O)-헤테로아릴, -C(O)-헤테로시클로알킬, -CONH2, -CONH- C1-C12-알킬, -CONH-C2-C12-알케닐, -CONH-C2-C12-알케닐, -CONH-C3-C12-시클로알킬, -CONH-아릴, -CONH-헤테로아릴, -CONH-헤테로시클로알킬, -0002-C1-C12-알킬, -OC02-C2-C12-알케닐, -0C02-C2-C12-알케닐, -0C02-C3-C12-시클로알킬, -0C02-아릴, -0C02-헤테로아릴, -0C02-헤테로시클로알킬, -OCONH2, -OCONH-C1-C12-알킬, -OCONH-C2-C12-알케닐, -OCONH-C2-C12-알케닐, -OCONH-C3-C12-시클로알킬, -OCONH-아릴, -OCONH- 헤테로아릴, -OCONH-헤테로시클로알킬, -NHC(O)-C1-C12-알킬, -NHC(O)-C2-C12-알케닐, -NHC(O)-C2-C12-알케닐, -NHC(O)-C3-C12-시클로알킬, -NHC(O)-아릴, -NHC(O)-헤테로아릴, -NHC(O)-헤테로시클로알킬, NHCO2-C1-C12-알킬, -NHCO2-C2-C12-알케닐, -NHCO2-C2-C12-알케닐, -NHCO2-C3-C12-시클로알킬, -NHCO2-아릴, -NHCO2-헤테로아릴, -NHCO2-헤테로시클로알킬, -NHC(O)NH2, -NHC(O)NH-C1-C12-알킬, -NHC(O)NH-C2-C12-알케닐, -NHC(O)NH-C2-C12-알케닐, -NHC(O)NH-C3-C12-시클로알킬, -NHC(O)NH-아릴, - NHC(O)NH-헤테로아릴, -NHC(O)NH-헤테로시클로알킬, NHC(S)NH2, NHC(S)NH-C1-C12-알킬, -NHC(S)NH-C2-C12-알케닐, -NHC(S)NH-C2-C12-알케닐, -NHC(S)NH-C3-C12-시클로알킬, -NHC(S)NH-아릴, -NHC(S)NH-헤테로아릴, - NHC(S)NH-헤테로시클로알킬, -NHC(NH)NH2, -NHC(NH)NH-C1-C12-알킬, -NHC(NH)NH-C2-C12-알케닐, -NHC(NH)NH-C2-C12-알케닐, -NHC(NH)NH-C3-C12-시클로알킬, -NHC(NH)NH-아릴, -NHC(NH)NH-헤테로아릴, -NHC(NH)NH-헤테로시클로알킬, -NHC(NH)-C1-C12-알킬, -NHC(NH)-C2-C12-알케닐, -NHC(NH)-C2-C12-알케닐, -NHC(NH)-C3-C12-시클로알킬, -NHC(NH)-아릴, -NHC(NH)-헤테로아릴, -NHC(NH)-헤테로시클로알킬, -C(NH)NH-Cl-C12-알킬, -C(NH)NH-C2-C12-알케닐, -C(NH)NH-C2-C12-알케닐, -C(NH)NH-C3-C12-시클로알킬, -C(NH)NH-아릴, -C(NH)NH-헤테로아릴, -C(NH)NH-헤테로시클로알킬, -S(O)-C1-C12-알킬, -S(O)-C2-C12-알케닐, -S(O)-C2-C12-알케닐, -S(O)-C3-C12-시클로알킬, -S(O)-아릴, -S(O)-헤테로아릴, -S(O)-헤테로시클로알킬 -SO2NH2, -SO2NH-C1-C12-알킬, -SO2NH-C2-C12-알케닐, -SO2NH-C2-C12-알케닐, -SO2NH-C3-C12-시클로알킬, -SO2NH-아릴, -SO2NH-헤테로아릴, -SO2NH-헤테로시클로알킬, -NHSO2-C1-C12-알킬, -NHSO2-C2-C12-알케닐, -NHS02-C2-C12-알케닐, -NHSO2-C3-C12-시클로알킬, - NHSO2-아릴, -NHSO2-헤테로아릴, -NHSO2-헤테로시클로알킬, -CH2NH2, -CH2S02CH3, -아릴, -아릴알킬, -헤테로아릴, -헤테로아릴알킬, -헤테로시클로알킬, -C3-C12-시클로알킬, 폴리알콕시알킬, 폴리알콕시, -메톡시메톡시, -메톡시에톡시, -SH, -S-C1-C12-알킬, -S-C2-C12-알케닐, -S-C2-C12-알케닐, -S-C3-C12-시클로알킬, -S-아릴, -S-헤테로아릴, -S-헤테로시클로알킬, 또는 메틸티오메틸을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 치환기로 독립 치환에 의해 치환된 상기 규정된 바와 같은 아릴, 알킬, 및 시클로알킬 기를 칭한다. 아릴, 헤테로아릴, 알킬, 등은 추가로 치환될 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 용어 "스테로이달"은 스테롤 및 바일산(bile acid), 아드레날 및 성 호르몬, 특정 천연 약물, 예를 들어 디기탈리스 화합물, 특정 비타민의 전구체를 포함하고, 4개의 고리에 배열된 기본 17개 탄소원자를 지닌 임의의 수많은 천연발생 또는 합성 지방-가용성 유기 화합물을 칭한다. 스테로이달 구조의 예로는 콜레스테롤, 콜레스타놀, 3α-시클로-5-α-콜레스탄-6-β-올, 콜산, 콜레스테릴 포르미에이트, 콜레스타닐 포르미에이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "개질된 뉴클레오시드"는 개질된 헤테로시클릭 염기, 개질딘 당 부분, 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 뉴클레오시드를 칭한다. 일부 구체예에서, 개질된 뉴클레오시드는 본원에 기술된 바와 같이 비-천연 피리미딘 또는 푸린 뉴클레오시드이다. 개질된 뉴클레오시드의 예로는 2'-치환된 리보뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드 또는 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노시드, 데아자아데닌, 데아자구아닌을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
반응식 2
Figure 112008046444914-PCT00016
반응식 3
Figure 112008046444914-PCT00017
실시예
실시예 1: 반응물 및 방법
선택된 전구약물(프로뉴클레오티드) 및 콘주게이트의 합성 및 평가를 위한 통상적인 예가 본원에 보고되었다. 디뉴클레오티드 3-dApsU2'-OMe에 대한 대표적인 데이타는 적절하게 변형하여 기재되었으며, 이는 본 발명에서 청구된 다른 화합물에 대해 사용될 수 있다.
본 연구에서, 포스포로티오에이트 유사체 3-dApsU2'-OMe (5)의 Rp,Sp 혼합물을 특별하게 제작된 LOTUS 반응기®(Padmanabhan, S.; Coughlin, J. E.; Iyer, R. P. Tetrahedron Lett. 2005, 46, 343; Iyer, R. P.; Coughlin, J. E.; Padmanabhan, S. Org. Prep. Proc. Intl. 2005, 37, 205)와 함께 고체상 포스포라미디트 화학을 이용하여 대용량으로(1 밀리몰의 뉴클레오시드-로딩된 제어된-공극 유리 (CPG) 지지체) 합성하였다[Beaucage, S. L.; Iyer, R. P. Tetrahedron 1993, 49, 1925]. 본 출원인이 최근에 발견한 초고속 작용화 및 고체 지지체를 위한 로딩 공정을 이용하여 dA-연결 CPG 지지체를 제조하였다. 뉴클레오티드간 디뉴클레오시드 포스피트 커플링된 생산물을 황화시키기 위하여, 3H-1,2-벤조디티올-3-온-1,1-디옥시드 (무수 CH3CN 중 0.4M)의 용액을 사용하였다[Iyer, R. P.; Regan, J. B.; Egan, W.; Beaucage, S. L. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 1253]. 가공, 크로마토그래피 정제 및 동결건조 후에, Rp,Sp (5)(~60:40 혼합물)의 나트륨염을 >96% 순도로 수득하였으며, 31P 및 1H NMR로 특징을 나타내었다. 표 3은 디자인되고, 합성되고, 평가된 (5)의 특정된 전구약물의 구조를 제공한 것이다.
표 3
Figure 112008046444914-PCT00018
Figure 112008046444914-PCT00019
추가로, 수성 아세톤 또는 메탄올에서 상응하는 요오도- 또는 브로모-유도체(7a-j)로 화학선택적 S-알킬화시킨 후 워크-업하고, 크로마토그래피 정제하여 전구약물 또는 프로뉴클레오티드 유도체 (6a-j)를 50 내지 70%의 수율로 합성하였다.
프로뉴클레오티드의 합성: 프로뉴클레오티드 (6a)의 대표적인 제법. 수(1 mL) 중 디뉴클레오티드 나트륨 염 (50 mg, 0.082 mmol)의 용액에, 아세톤 (2 mL) 중 요오도메틸 피발레이트 (7a (표 4), 85 mg, 0.35 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응을 어두운 곳에서 하룻밤 동안 교반하고, 수 mg의 나트륨 비술피트로 농축하였다. 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하고, 6a를 DCM/MeOH(90/10)의 혼합물로 용리하였다. 진공 중에서 농축하여, 크로마토그래피적으로 순수한 백색 고형물을 수득하였다(31P NMR, 28.7, 27.9 δ ppm). 모든 유사체를 유사한 과정을 이용하여 제조하였다 (표 4).
표 4
Figure 112008046444914-PCT00020
＠ CsI/BF3.Et2O-16a와 R-OH의 반응에 의해 제조됨, # SOBr2/DCM을 지닌 ROH, §SOCl2/DMF/KI를 지닌 ROH;16b % 디-요오도부탄과 나트륨 니코티네이트의 반응에 의해 수득됨 * 상업적 소스로부터 수득됨 * 관찰된 모 (5)로의 전환; ＠ 반감기는 에스테르의 가수분해 및 (5)가 발생하지 않는 추가 전환을 칭한다; % 프로뉴클레오티드는 혈청에서 24시간 후에도 변하지 않고 잔류함; § 화합물이 DMSO에 가용성이지 않은 것으로 측정되지 않음
필수 중간체 (7a-j)를 상응하는 히드록시 화합물로부터 직접적으로 (Hayat, S.; Rahman, A-U, Khan, K. M.; Choudhary, M. I.; Maharvi, G. M.; Ullah, Z.; Bayer, E. Synth. Commun.2003, 33, 2531; Fernandez, I.; Garcia, B.; Munoz, S.; Pedro, R.; de la Salud, R. Synlett. 1993, 489) 또는 상응하는 클로로 유도체로부터 할로겐 교환 반응으로(반응식 4 참조) 합성하였다.
반응식 4
Figure 112008046444914-PCT00021
각 프로뉴클레오티드 유사체 (6a-j)의 31P NMR은 Rp,Sp 이성질체의 ~55:45 비율에 상응하는 28 내지 34 ppm (티오포스페이트 트리에스테르 부분의 특징)의 범위에서 두개의 피크를 나타내었다(참조, 도 1). 프로뉴클레오티드의 생체가역성의 평가를 37℃, 포스페이트 완충액 중에서 토끼 혈청으로 수행하였다. 프로뉴클레오티드의 디뉴클레오티드 (5)로의 가수분해물 전환을 모니터링하기 위하여, 인큐베이션물의 분취액을 상이한 시점에서 제거하고, 처리하고, 역상 HPLC를 이용하여 분석하였다. 유사체(6a) 및 (6b)가 각각 60분 및 30분의 반감기(t1/2)를 갖는 모 화합물(5)로 용이하게 전환되었음을 확인하였다. 또한, 6a 및 6b의 모 화합물(5)로의 완전한 전환은 ~3 시간에 이루어졌다. 유사체 (6a) 및 (6b)는 포스페이트 완충액(0.1 M, pH 7.2)에서 24 시간 까지 안정하였다. 더욱이, 혼합물 중 Rp,Sp의 가수분해 동안 임의의 현저한 입체구별 또는 탈황화의 증거가 나타나지 않았다. 흥미롭게도, 6a 및 6b 모두는 돼지 간 에스테라제(PLE) 및 소 키모트립신의 가수분해 작용에 대해 내성이었으며(데이타 미도시됨), 이에 따라 유사체가 본래 프로뉴클레오티드의 경구 흡수를 촉진시킬 수 있는 GI 관에서 현저한 반감기를 지닐 수 있음을 시사한다. 이러한 관찰은 Rp,Sp TT-PS 이량체의 상응하는 프로뉴클레오티드의 거동과는 반대되는 것으로, 여기서 현저한 입체구별이 혈청 및 PLE에서의 가수분해의 매우 늦은 속도와 함께 확인되었다[Iyer, R. P.; Yu, D.; Agrawal, S. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1995, 4, 2471]. 티미딘(C2'-엔도)과 비교하여 2'-OMe-우리딘(C3'-엔도)에서의 상이한 당 퍼커링(puckering) 모드로 인해 6a 및 6b의 전체 형태는 TT 이량체 프로뉴클레오티드에 상응하는 것과 현저하게 차이가 날 수 있다. 결론적으로, 6a 및 6b에서의 에스테르기는 에스테라제의 친핵체 부위에 의한 공격을 위해 더욱 바람직하게는 유지될 수 있다.
더욱이, 모든 유사체는 동결건조된 분말로서 -20℃에서 저장될 때 무기한적으로 안정하였다. 본 출원인은 이후 상이한 세포주, 예를 들어 MDBK, Vero, 및 HFF에서의 프로뉴클레오티드 유도체의 세포독성 프로파일을 시험하였다. 반응식 4에 나타낸 바와 같이, 6c를 제외한 대부분의 유사체는 이러한 세포주에서 CC50>1000 μM을 가졌으며, 이는 이러한 화합물에 대해 높은 안정성 프로파일을 나타내는 것이다.
실시예 2. 3'dApsU 2'OMe 의 S-이소프로필카르보닐옥시메틸 티오포스페이트 유도체 (6k)
Figure 112008046444914-PCT00022
타겟 화합물 (6k)을 두단계로 제조하였다.
단계 1. 요오도메틸이소프로필 카르보네이트의 제조: 무수 아세토니트릴 (20 mL) 중 무수 나트륨 요오다이드 (6 g, 40 mmol)의 용액에, 무수 아세토니트릴 (10 mL) 중 클로로메틸 이소프로필 카르보네이트 (2.9g, 19 mmol)를 20분에 걸쳐 적가하였다. 알루미늄 호일로 덮혀진 반응 혼합물(빛으로부터 보호됨)을 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 분리된 고형물을 여과하고, 아세토니트릴로 세척하고, 여과물을 감압하에서 농축하였다. 잔류물을 물 (10 mL)에 용해시키고, 유기물을 에테르 (25 mL)로 추출하였다. 에테르 추출물을 나트륨 비술피트 (5%, 10 mL), 이후 염수 (10 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 나트륨 술페이트로 건조시키고, 여과하고, 건조된 고진공하에서 건조시켰다. 수율 2.72 g (58%); 1H-NMR δ 1.3 (d, 6H), 4.95 (m, IH), 5.95 (s, 2H).
단계 2. 디뉴클레오티드, 3'-ApsU2'OMe의 알킬화: 교반하, 수 (HPLC, 400 mL) 중 디뉴클레오티드 (60 mg, 0. 098mmol)의 용액에, 아세톤 (1 mL) 중 요오도메틸 이소프로필 카르보네이트 (80 mg, 0.0166 mmol, 3.33 당량)의 용액을 첨가하였다. 추가 아세톤 (1 mL)을 첨가하여 알킬화제의 오일 방울의 임의의 분리를 방지하여 맑은 용액을 얻었다. 알루미늄 호일로 덮혀진 반응 혼합물을 3 시간 동안 교반하고, 회전증발기(rotavap) 조건하에서 농축한 후 고진공 중에 농축하여 반응 혼합물을 백색 고형물로서 수득하였다. 이를 초기에 클로로포름을 사용하고 서서히 2% 메탄올을 함유시키면서 마지막에 8% 메탄올을 함유한 클로로포름을 사용하여 실리카 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 주성분을 함유한 분획물을 합치고, 농축하고, 고진공하에서 하룻밤 동안 건조하였다. 요망되는 순수한 생성물 (6k)을 거의 정량적 수율 (68 mg)로 분리하였다; 31P-NMR (MeOH-d4) δ 27.7, 28.6.
실시예 3. 3'dApsU 2'OMe 의 S-메틸 콜산 에스테르 (61)의 제조
Figure 112008046444914-PCT00023
단계 1. 클로로메틸 데옥시콜레이트의 합성: 에탄올 (4 mL) 중 데옥시콜산 (120 mg, 0.306 mmol)에 수 (3 mL) 중 세슘 카르보네이트 (53 mg, 0.160 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 교반하고, 에탄올을 초기에 회전증발기하에서 제거한 후, 고진공하에서 제거하였다. 잔류물을 동결건조시켜 백색 분말의 세슘 염을 수득하였다. 실온에서 N,N-디메틸포름아미드(DMF, 3 mL) 중 세슘 용액에 브로모클로로메탄 (10 mL)을 첨가하고, 알루미늄 호일로 덮혀진 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 용매를 제거하고, 반응 혼합물을 디클로로메탄 (20 mL)으로 추출하고, 물 (5 mL), 염수 (5 mL)로 세척하고, 무수 나트륨 술페이트로 건조시킨 후에 용매를 제거하여 클로로메틸 화합물 (100 mg, 74%)을 수득하였다. 이를 상응하는 요오도메틸 유도체로 전환하기 위해 임의의 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 2. 요오도메틸 데옥시콜레이트의 제조: 무수 아세토니트릴 (3 mL) 중 나트륨 요오다이드 (304 mg, 2.03 mmol)의 용액에, 아세토니트릴 (6 mL) 및 디클로로메탄 (2 mL)의 혼합물 중 클로로메틸 에스테르 (438 mg, 0.99 mmol)를 서서히 첨가하였다. 빛으로부터 보호된 반응 혼합물을 실온에서 48시간에 걸쳐 교반하였다. 농축 후에, 반응 혼합물을 디클로로메탄 (15 mL)으로 추출하고, 유기층을 물 (5 mL), 나트륨 비술피트(5%, 5 mL)로 세척하고, 마지막으로 염수 (5 mL) 처리하였다. 무수 나트륨 술페이트로 건조시키고, 용매를 제거한 후 수득된 미정제 생성물을 실리카 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 요오도 화합물 (110 mg, 21%)을 수득하였다.
단계 3. 요오도메틸 데옥시콜레이트의 커플링: 수 (400 mL) 중 3'dApsU2'OMe (50 mg, 0.082 mmol)의 용액에 아세톤 (3 mL) 중 요오도메틸 데옥시콜레이트 (110 mg, 2.066 mmol)의 용액을 첨가하였다. 분리된 고형물을 추가 아세톤 (~ 6 mL)을 첨가하여 용해하고, 반응 혼합물을 하룻밤 동안 교반하였다. 진공하에서 농축하고, 클로로포름 내지 메탄올 함유 클로로포름(2 내지 10%)을 이용하여 실리카 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 분획물을 합치고, 농축하고, 고진공하에서 건조시켜 요망되는 생성물 (61) (40 mg, 49%)을 수득하였다; 31P-NMR (MeOH) δ 28.2, 29.1.
실시예 4. 3'dApsU 2'OMe 의 N-(t-부톡시카르보닐)-L-페닐알라니네이트 유사체 (6m)의 제조
Figure 112008046444914-PCT00024
요오도메틸 N-(t-부톡시카르보닐)-L-페닐알라니네이트. 에탄올 (3 mL) 중 N-(t-부톡시카르보닐)-L-페닐글리신 (663 mg, 2.49 mmol)에, 수 (2 mL) 중 세슘 카르보네이트 (427 mg, 1.31 mmol) 용액을 첨가하였다. 가스 방출이 중지된 후에, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 용매를 제거하고, 동결건조시켜 세슘염을 수득하였다. N,N-디메틸포름아미드 (DMF, 2 mL) 중 세슘 염 (270 mg, 0.82 mmol)의 용액에 브로모클로로메탄 (5 mL)을 첨가하고, 알루미늄 호일로 덮혀진 반응 혼합물과 함께 하룻밤 동안 교반하였다. 분리된 고형물을 여과하고, DMF (2 mL)로 고형물을 세척하고, 여과물을 고진공하에서 농축하였다. 생성물 (206 mg, 80%)은 TLC (Hex: EtOAc 4:1)로 순수한 것으로 확인되었다. 이러한 중간체를 추가 정제 없이 요오도 화합물로의 전환을 위하여 사용하였다. 무수 아세토니트릴 (3 mL) 중 나트륨 요오다이드 (196 mg, 1.31 mmol)의 용액에 무수 아세토니트릴 (1 mL) 중 클로로메틸 페닐알라니에이트 유도체 (206 mg, 0.656 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 빛으로부터 보호하면서 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 여과하고, DMF (3 mL)로 고형물을 세척하고, 진공하에서 여과물을 농축하였다. 잔류물을 디클로로메탄 (10 mL) 및 물 (5 mL)로 추출하고, 유기층을 NaHSO3 (5%, 5 mL) 및 염수 (포화된 5 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 농축하여 요망되는 요오도 화합물 (199 mg, 75%)을 수득하였다.
3'dApsU2'OMe의 알킬화. 수 (400 ㎕) 중 3'dApsU2'OMe (44 mg, 0.072 mmol)의 용액에, 아세톤 (800 ㎕) 중 요오다이드 (100 mg, 0.25 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 하룻밤 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공하에서 농축하고, 동결건조하고, 클로로포름 및 클로로포름과 메탄올 (2 내지 10%) 함유한 혼합물을 이용하여 실리카 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 분획물을 수집하고, 합치고, 고진공하에서 건조시켜 t-Boc 보호된 페닐알라닌 커플링된 생성물 (6m) (40 mg, 65%)을 수득하였다; 31P-NMR (MeOH-d4) δ 28.7, 27.9.
실시예 5. 3' dApsU 2'OMe 의 4-아세트아미도벤질 유도체 (6n)의 제조
4-아세트아미도벤질 알코올의 제조. 메탄올 (100 mL) 중 4-아세트아미도벤즈알데히드 (10 g, 61.3 mmol)의 용액에 나트륨 보로히드리드 (800 mg)를 실온에서 조금씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 하룻밤 동안 교반하고, 반응 과정을 용리액으로서 4:1 헥산::EtOAc를 이용하여 TLC로 체크하였다. 출발 물질의 부재로 환원의 완결을 지시하였으며, 반응 혼합물을 회전증발기에서 농축하였다. 잔류물을 물 (25 mL)과 에틸 아세테이트 (4×50 mL)로 분별하고, 유기층을 염수 (25 mL)로 세척하였다. 에틸 아세테이트 층을 무수 나트륨 술페이트로 건조하고, 용매를 제거하여 엷은 황색 고형물의 알코올을 수득하고, 이를 고진공하에서 건조하였다. 8.6 g (85%); 1H NMR (DMSO-d6): δ 2.0 (s, 3H), 4.5 (d, 2H), 5.2 (t, 1H), 7.25 (d, 2H), 7.55 (d, 2H), 9.95 (s, 1H).
Figure 112008046444914-PCT00025
4-아세트아미도벤질 요오다이드의 제조. 무수 DMF (5 mL)의 냉각된 용액에 티오닐 클로라이드 (0.2 mL, 2.8 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 교반하고, 무수 DMF (12 mL) 중 KI (2.49g, 15 mmol)의 용액을 첨가한 후, 알코올 (0.165 g, 1 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 얼음욕에서 3시간 동안 교반하고, 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음물 (25 mL)에 붓고, 에테르 (3X 25 mL)로 추출하였다. 에테르 층을 염수로 세척하고, 무수 나트륨 술페이트로 건조시키고, 농축하여 용매를 제거하였다. 생성물을 투명한 황색 고형물로서 수득하였다 (138 mg, 50%). (TLC Hex: EtOAc (1:1). 1H NMR (CDCl3): δ 2.17 (s, 3H), 4.45 (s, 2H), 7.17(br.s, 1 H), 7.33 (d, 2H), 7.43 (d, 2H). 이러한 화합물을 또한 아세토니트릴 중 세슘 요오다이드 및 붕소 트리플루오라이드 에테르에이트를 이용하여 개선된 수율로 제조하였다 (~75%). 4-아세트아미도벤질 요오다이드와 3'dApsU2'OMe의 커플링을 상기 콜산 유사체에 대해 기술된 바와 같이 수행하였다.
실시예 6. 3'dApsU 2'OMe 의 4-벤즈아미도부틸 유사체 (6o)의 제조
Figure 112008046444914-PCT00026
4-벤즈아미도부틸 요오다이드의 제조: 0 내지 5℃의 냉각된 무수 DMF (5 mL)에 티오닐 클로라이드 (0.2 mL)를 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 무수 DMF (8 mL) 중 칼륨 요오다이드 (2.4 g, 5 mmol)의 용액을 첨가한 후 무수 DMF (2 mL) 중 4-벤즈아미도부탄올 (193 mg, 1 mmol)의 용액을 첨가하였다. 칼라를 갖는 반응 혼합물을 하룻밤 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음물 (~ 10 mL)에 부어 워크업하고, 에테르 (3 × 15 mL)로 추출하였다. 마지막으로, 에테르층을 물, 염수로 세척하고, 무수 나트륨 술페이트로 건조시켰다. 여과하고 용매를 제거한 후 얻어진 미정제 생성물을 헥산과 에틸 아세테이트(4:1)의 혼합물을 이용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 오일의 요오도 화합물을 수득하였다. 45%; 1H NMR (CDCl3): δ 1.77 (m, 2H), 1.93 (m, 2H), 3.23 (t, 2H), 3.55 (q, 2H), 6.26 (br.s, 1H), 7.48 (m, 3H), 7.75 (m, 2H).
4-벤즈아미도부틸 요오다이드와 3'dApsU2'OMe의 커플링을 상기와 같이 수행하여 표제 화합물 (6o)를 수득하였다.
실시예 7. 3'dApsU 2'OMe 의 5-벤조일옥시펜틸 유사체의 합성
Figure 112008046444914-PCT00027
5-벤조일옥시펜탄-1-올의 제조: 벤조산 (1 g), 1,5-펜탄디올 (5 mL) 및 p-톨루엔술폰산 (110 mg)의 혼합물을 100℃, 오일욕에서 하룻밤 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물 (50mL)에 붓고, EtOAc (2×25 mL)로 추출하고, 나트륨 카르보네이트 (5%, 20mL)로 세척한 후 염수 (15 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 나트륨 술페이트로 건조시키고, 여과하고, 농축하여 거의 순수한 생성물 (1.15g, 67%)을 수득하였다.
5-벤조일옥시-1-요오도펜탄의 제조. 36% 수율. 1H NMR (CDCl3): δ 1.57 (m, 2H), 1.85 (m, 4H), 3.22 (t, 2H), 4.33 (t, 2H), 7.44 (m, 2H), 7.57 (m, 1H), 8.04 (m, 2H).
5-벤조일옥시-1-요오도펜탄과 3'dApsU2'OMe의 커플링을 상기와 같이 수행하였다.
5-벤조일옥시부탄-1-올의 제조: 5-벤조일펜탄-1-올을 위한 과정에서 1,4-부탄디올을 사용하여 이를 73% 수율로 제조하였다.
실시예 8. 3'dApsU 2'OMe 의 4-아세톡시벤질 유사체 (6q)의 합성
Figure 112008046444914-PCT00028
단계 1. 4-아세톡시벤질 알코올의 제조: 얼음욕 중에서의, 에틸 아세테이트 (25 mL) 중 4-히드록시벤질 알코올 (1.95g, 14 mmol)의 냉각된 현탁액에 트리에틸아민 (2.1 mL, 14.9 mmol)을 교반하면서 수회에 걸쳐 첨가하였다. 에틸 아세테이트 (12 mL) 중 아세틸 클로라이드 (1.1 mL, 15.5 mmol)의 용액을 첨가 깔대기로부터 적가하였다. 반응 혼합물을 하룻밤 동안 교반하였다. 고형물을 여과하고, 에틸 아세테이트로 세척하고, 농축한 후 잔류물을 초기에 헥산을 사용하고 이후 점진적으로 40% 에틸 아세테이트를 사용하여 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 수율 40%. 1H-NMR (CDC13), δ 2.02 (br. s, 1H), 2.29 (s, 3H), 4.65 (s, 2H), 7.07 (d, 2H), 7.36 (d, 2H).
단계 2. 4-아세톡시벤질 요오다이드의 제조: 질소하, 무수 아세토니트릴 (10 mL) 중 4-아세톡시벤질 알코올 (0.332 g, 2 mmol), 및 세슘 요오다이드 (0.571 g, 2.2 mmol)의 용액에, 아세토니트릴 (5 mL) 중 붕소 트리플루오라이드 에테르에이트 (0.28 mL, 2.2 mmol)를 도입하였다. 하룻밤 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 얼음물 (20 mL)에 붓고, 분리된 고형물을 여과하고, 물로 세척한 후 헥산으로 세척하였다. 생성물을 고진공하에서 건조시켰다. 수율, 0.39g, 71%; TLC, 헥산:EtOAC (4:1). 1H NMR (CDCl3): δ 2.3 (s, 3H), 4.35 (s, 2H), 7.05 (d, 2H), 7.5 (d, 2H).
단계 3. 3'dApsU2'OMe의 4-아세톡시벤질 유사체의 제조. 3'dApsU2'OMe과 4-아세톡시벤질 요오다이드의 알킬화를 상기와 같이 수행하였다.
실시예 9. 세포독성 검정: 표준 MTT 검정을 96-웰 플레이트 기록기(ThermoMax,Molecular devices)가 결합된 프로메가 셀적정96 비-방사활성 세포 증식 검정 키트를 사용하고, MDBK, Vero, 및 HFF 세포주 (ATCC로부터 입수)를 이용하여 96-웰 플레이트에서 수행하였다. 뉴클레오시드 유사체 3TC, AZT, 및 ddC, 및 약물이 존재하지 않는 매질을 포함한 여러 대조군을 사용하였다. SDS를 포지티브 세포독성 대조군으로서 사용하였다. 모든 프로뉴클레오티드를 100, 300 및 1000 μM의 농도에서 세번씩 시험하였다. 세포를 시험 물질과 함께 24시간 인큐베이션한 후에, MTT 검정을 수행하였다. 데이타는 하기 표 5에 나타내었다.
표 5. 선택된 전구약물에 대한 31P-NMR 및 세포독성 데이타
Figure 112008046444914-PCT00029
실시예 10. 전구약물의 생체가역성 평가
생체가역성 연구를 하기와 같이 수행하였다: 2 mg을 100 ㎕ DMSO에 용해시켜 각 유사체의 모액을 제조하였다. 10 ㎕ 분취액을 90 ㎕의 포스페이트 완충액(0.1 M, pH 7.0) 및 100 ㎕ 분취액의 토끼 혈청으로 희석하였다. 혼합물을 수욕, 37℃에서 인큐베이션하였다. 분취액을 상이한 시점에 제거하고, 200 ㎕의 메탄올로 희석하여 반응을 중지시켰다. 인큐베이션물을 이후 원심분리하고, 상청액을 고속으로 농축하고, 200 ㎕의 0.1M 암모늄 아세테이트 완충액으로 희석시킨 후 HPLC에 주입하였다. 역상 HPLC 분석을 600E구배 제어기가 장착된 워터스 인스트루먼트(Waters Instrument), 및 밀레니움 소프트웨어를 구비한 996 광다이오드 배열 검출기를 이용하여 수행하였다. X-terra MS C18 2.5 ㎛, 2.1×20 mm 컬럼 및 30분에 걸쳐 완충액 A(0.1M NH4OAc) 및 완충액 B(80:20, CH3CN:NH4OAc)의 100% A 내지80% B의 작동 구배를 사용하였다. 전구약물에 대한 전류 시간은 16 내지 18분이었지만 Rp,Sp 디뉴클레오티드 (5)는 13.5, 13.8분이었다.
통상적으로 예를 들어, 아미노산 유도된 전구약물 (6m) 및 카르보네이트 유도체 (6k)는 혈청 처리 상에서 ~3 시간에 3'dApsU2'OMe로 거의 완전하게 전환되었다. 다른 전구약물은 모 디뉴클레오티드로의 상이한 전환 속도를 가졌다. 일부 전구약물은 실험 조건 하에서 모 디뉴클레오티드로 다시 전환되지 않았다.
실시예 11. 안정성. 자극화된 위 유체(SGF) 및 자극화된 장 유체(SIF)에서의 전구약물의 안정성을 37℃에서 시험하였다. SGF 및 SIF를 하기 보고된 과정 후에 제조하였으며, 전구약물을 37℃에서 1시간 동안 SGF 및 SIF와 함께 별도로 인큐베이션하고, 처리하고, 역상 HPLC를 이용하여 분석하였다. 모 디뉴클레오티드 3'dApsU2'OMe는 약 15분에 분해되어 SGF에서 안정하지 않지만 비교적 SIF에 안정적인 것으로 밝혀졌다. 모든 전구약물은 1 내지 3 시간의 반감기를 지녀 SGF에서 상당히 안정하였다. SIF에서, S-아실옥시알킬 전구약물은 약 1 시간의 반감기로 모 디뉴클레오티드로 전환되었다.
실시예 12. 경구 생체이용률. 전구약물의 경구 생체이용률을 CD-1 마우스에서 측정하였다. 대표적인 전구약물 (6a, 6k, 6l) 각각을 물에 용해하고, 경구 위관영양법으로 마우스의 군에 투여하였다. 20 내지 30 g의 스위스-웹스터 마우스(Charles River Labs)를 연구를 위하여 사용하였다. 5, 15, 30, 60 및 120분의 지정된 시점에, 마우스를 희생시키고, 혈액을 심장 천공으로 수집하였다. 간, 신장, 위, 십이지장, 공장, 회장 및 뇌를 제거하고, 처리할 때까지 드라이 아이스에서 냉동시켰다. 혈장을 원심분리로 혈액으로부터 분리하고, 역상 HPLC로 약물 함량의 분석을 위하여 처리하였다. 각 전구약물 및/또는 모 3'dApsU2'OMe의 수준을 분석용 HPLC로 측정하였다. 조직 샘플(원칙적으로 간)을 0.1 M NaOAc의 존재하, 1% SDS 중에 균질화시킨 후 처리하였다. 균질화물을 PALL 50K 농축기에 첨가하고, 3000 rpm에서 2 시간 동안 원심분리하였다. 샘플을 역상 HPLC 컬럼 (2.1×20 mm X-Terra 컬럼), 유속 1ml/분, 100% A(0.1 M NH4OAc) 내지 100% B(아세토니트릴:0.1M NH4OAc, 80:20)의 30분 구배상으로 진행하였다. 혈액의 경우에, 전구약물은 이른 시점에서 검출되었지만, 늦은 시점에서는 주로 모 디뉴클레오티드 3'dApsU2'OMe가 나타났다. 간의 경우에, 주로 3'dApsU2'OMe가 나타났다. 이러한 관찰은 전구약물의 3'dApsU2'OMe로의 효소-매개 전환에 의한 후 전구약물의 경구 흡수와 일치한다. 대부분, 전구약물을 3'dApsU2'OMe로 전환시킬 수 있는 효소는 혈액 및 조직 모두에서 발견된 에스테라제이다. 경구 생체이용률의 추정치는 혈장 및 간에서 5 내지 15%범위이다.
실시예 13. 전구약물의 생체내 항-HBV 활성. 특정 전구약물을 HBV 감염증의 유전자이식 마우스 모델에서 평가하였다. 78 일령 내지 108일령의 HBV로 감염된 수컷 유전자이식 마우스를 사용하였다. 전구약물 (6a) 및 (6k)를 초기에 300 내지 400 mg/kg의 단일 용량으로, 경구 위관 영양법으로 14일 동안 매일 투여하여 평가하였다. 화합물을 시트르산 중에서 투여하고, 아데포비르 디피복실을 포지티브 대조군으로서 사용하였다. 비히클을 수용한 대조군을 네가티브 대조군으로서 사용하였다. 처리한 후에, 마우스를 희생시키고, 간 조직을 서던 블롯 분석을 이용하여 HBV DNA에 대해 분석하였다. 데이타를 크루스칼-발리스 비-파마미터 ANOVA를 이용하여 통계학적으로 평가하고, 플롯은 도 2에 나타내었다. 전구약물 (6a) 및 (6k) 모두는 미처리된 대조군과 비교하여 간 HBV DNA의 2 log 이하의 감소를 나타내었으며, 이는 0.01 내지 0.001의 p 수치로 통계학적으로 유의하였다.
실시예 14. 유전자이식 마우스에서 B형 간염 바이러스에 대한 화합물 6a 및 6k의 경구 투여 효과
수컷 및 암컷 유전자이식 마우스(founder 1.3.32)를 인간 B형 감염 바이러스로 감염시켰다. 감염 후에, 동물을 화합물 6a 또는 6k, 0.05 M 시트르산의 위약을 pH 2.0으로 하루에 한번씩 14일 동안 경구 투여하였다. 용량은 화합물 6a에 대해 400 mg/kg/d이고, 화합물 6k에 대해 300 mg/kg/d이었다. 포지티브 대조군인 ADV를 10 mg/kg/d로 투여하였다. 데이타를 하기 표 6 및 7에 요약하였다. 통계학적 유의성은 위약 비히클과 비교하여 *P≤0.05, **P≤0.01, ***P≤0.001로 지시되었다. 혈청 HBeAg, PEI의 측정은 폴 에흐리치 인터내셔날 유닛(Paul Ehrlich International Units (PEIU))을 이용한 국제 면역 진단 표준 검정법에 따라 보고된 것이다. 본 연구는 또한 고용량에서 어떠한 독성도 나타나지 않음이 입증되었다.
표 6
Figure 112008046444914-PCT00030
표 7
Figure 112008046444914-PCT00031
본 특허 및 본원에서 언급된 과학 문헌은 당업자에게 이용가능한 지식을 확립한다. 본원에 인용된 모든 미국특허및 공개되거나 비공개된 미국특허출원은 참고문헌으로 통합된다. 본원에 인용된 모든 공개된 외국 특허 및 특허출원은 이에 따라 참고문헌으로 통합된다. 본원에 인용된 모든 다른 공개된 참고문헌, 문헌, 원고 및 과학 문헌은 이에 따라 참고문헌으로 통합된다.
본 발명이 이의 바람직한 구체예와 관련하여 구체적으로 도시되고 기술되어 있지만, 다양한 변형 형태 및 상세한 설명이 첨부된 청구범위에 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 이해될 것이다.

Claims (13)

  1. 하기 화학식 (I)의 프로뉴클레오티드, 또는 이의 라세미체, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체 또는 토오토머:
    Figure 112008046444914-PCT00032
    (I)
    상기 식에서,
    X는 부재이거나, O, NH, NR 또는 S이며;
    X1은 부재이거나, 0 또는 NH이며;
    A는 부재이거나, 아릴 또는 아르알킬이며;
    n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이며;
    R은 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬, 헤테로시클릭, O-알킬, 0-헤테로아릴 또는 스테로이달(steroidal)이며;
    R1, R2는 독립적으로 H, OH, 0-알킬, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬, 헤테로시클릭, 0-아릴, 0-헤테로아릴아릴 또는 헤테로시클릭이며;
    R3는 수소, 알킬, 치환된 알킬, C(O)-알킬, C(0)0-알킬, C(O)-아릴, C(0)0-아릴, C(O)NH-알킬 또는 C(O)NH-아릴로부터 선택되며;
    Y, Z는 독립적으로 0 및 S이며;
    B1, B2는 독립적으로 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 우라실 또는 개질된 뉴클레오시드이며;
    m은 1 내지 40이다.
  2. 제 1항에 있어서, 하기 화학식 (II)로 표시되는 프로뉴클레오티드:
    Figure 112008046444914-PCT00033
    (II)
    상기 식에서, m은 1, 2 또는 3이며; R, X, X1, A, n, R1, R2, R3, B1 및 B2는 상기 제 1항에서 정의된 바와 같다.
  3. 제 1항에 있어서, 하기 화학식 (III)으로 표시되는 프로뉴클레오티드:
    Figure 112008046444914-PCT00034
    (III)
    상기 식에서, R, X, XI, A, n, R3, B1 및 B2는 상기 제 1항에서 정의된 바와 같다.
  4. 제 1항에 있어서, 하기 화학식 (IV)로 표시되는 프로뉴클레오티드:
    Figure 112008046444914-PCT00035
    (IV)
    상기 식에서, R4는 수소, C(O)-알킬, C(O)O-알킬, C(O)-아릴, C(O)O-아릴, C(O)NH-알킬 또는 C(O)NH-아릴로부터 선택되며; R, R3, X, X1, A 및 n은 상기 제 1항에서 정의된 바와 같다.
  5. 제 4항에 있어서, 하기 표 1의 화합물 1 내지 8로부터 선택된 하기 화학식 (A1)을 갖는 화합물:
    Figure 112008046444914-PCT00036
    (A1)
    상기 식에서, R, XI, R3 및 R4는 하기 표 1에서의 각 예에 대해 기술된다.
    표 1
    Figure 112008046444914-PCT00037
  6. 제 1항에 있어서, 하기 화학식 (V)로 표시되는 프로뉴클레오티드:
    Figure 112008046444914-PCT00038
    (V)
    상기 식에서, R, R3, R4, X, X1, A 및 n은 상기 제 1항에서 정의된 바와 같다.
  7. 제 6항에 있어서, 하기 표 2의 화합물 9 내지 16으로부터 선택된 하기 화학식 (B1)을 갖는 화합물:
    Figure 112008046444914-PCT00039
    (B1)
    상기 식에서, R, X1, R3 및 R4는 하기 표 2에서의 각 예에 대해 기술된다.
    표 2
    Figure 112008046444914-PCT00040
  8. 제 1항에 있어서, 하기 화학식 (VI)으로 표시되는 프로뉴클레오티드:
    Figure 112008046444914-PCT00041
    (VI)
    상기 식에서, R, R3, X, X1, A 및 n은 상기 제 1항에서 정의된 바와 같다.
  9. 치료학적 유효량의 제 1항에 따른 화합물을 HBV 치료를 필요로 하는 피검체에 투여함을 포함하여, HBV 치료를 필요로 하는 피검체에서 HBV를 치료하는 방법.
  10. 치료학적 유효량의 제 1항에 따른 화합물을 다른 제제와 조합하여, HBV 치료를 필요로 하는 피검체에 투여함을 포함하여, HBV 치료를 필요로 하는 피검체에서 HBV를 치료하는 방법.
  11. 치료학적 유효량의 제 1항의 화합물을 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여, HBV 치료를 필요로 하는 피검체에 투여함을 포함하여, HBV 치료를 필요로 하는 HBV의 내성 균주로 감염된 피검체에서 HBV를 치료하는 방법.
  12. 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 조합하여 치료학적 유효량의 제 1항의 화합물을 포함하는 약제 조성물.
  13. 치료학적 유효량의 제 7항의 약제 조성물을 HBV 치료를 필요로 하는 피검체에 투여함을 포함하여, HBV 치료를 필요로 하는 피검체에서 HBV를 치료하는 방법.
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