CN111484540B - 含双核苷酸结构的化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种结构新颖的含双核苷酸结构的化合物。还提供了所述含双核苷酸结构的化合物的制备方法，以及其在制备治疗病毒感染，特别是乙型肝炎病毒(HBV)感染和与HBV有关的肝脏疾病药物的应用。本发明另一方面，还涉及分离得到光学异构体纯的含双核苷酸结构的化合物。本发明提供的这些含双核苷酸结构的化合物具有显著的抗HBV DNA活性，并使用剂量低，安全性高等优点，并且还具有良好的药代动力学特性。

Description

含双核苷酸结构的化合物
技术领域
本发明涉及一种结构新颖的含双核苷酸结构的化合物。还涉及本发明的含双核苷酸结构的化合物的制备方法，以及其在制备治疗病毒感染，特别是乙型肝炎病毒(HBV)感染和与HBV有关的肝脏疾病药物的应用。
背景技术
乙肝是我国社会负担最大的疾病之一。目前，我国约有1亿左右的人群为乙肝病毒携带者，约占我国总人口数的8％-10％，慢性乙肝患者(肝脏已出现炎性病变)约2000万人。据估计，全世界有3亿5千万慢性HBV携带者。根据疾病控制中心，每年将近3到7百万人死于与感染有关的并发症，例如，肝硬化和肝细胞癌变。大量接受肝移植的病人还持续需要抗-HBV治疗。HBV被认为是一种重要的病原，能够导致很多人类癌症。HBV感染还导致暴发型肝炎，这是一种致命的疾病，在此疾病中肝脏被破坏。慢性肝炎感染导致慢性持续的肝炎、衰竭、肝硬化、肝癌和死亡。乙肝病毒对患者的危害很大。患者感染乙肝病毒后，短期内对身体健康并不会造成很大的损失，而发病时，往往已发展成慢性乙肝，治疗困难，且预后较差。
目前临床上有多种药物用于HBV感染的治疗，例如拉米夫定(lamivudine)、恩替卡韦(entacavir)、替诺福韦艾拉酚胺(tenofovir alafenamide)、阿德福韦双特戊酰氧基甲酯(adefovir dipivoxil)等。但是由于耐药性的出现及剂量相关的毒副作用，这些药物远远不能满足临床需求。
使用一些前体药物策略可用来改善化合物的稳定性、提高靶向性、克服首过效应、改进生物利用率等。
尽管前体药物的概念是已知的且对于制备许多化合物，包括核苷和单核苷酸的前体药物存在许多策略，但是本领域普通技术人员仍不能推知或明显的预料到双核苷酸类似的前体药物可能具有的口服生物利用率并因此可以发展成为可口服使用。已知口服生物利用率不仅仅与在胃粘膜中的稳定性有关系。例如，即使具有提高的稳定性，也仍然不知道这种相对大分子量的双核苷酸前体药物(分子量＞700道尔顿)是否能够被运输穿过粘膜屏障。实际上，人们对这种可以通过主动输送机制促进这些新型化合物传输穿过粘膜的具体转运装置是否存在知之甚少。按照里宾斯基原则(Lipinski′s rule)(Lipinski，C.A.，Adv.DrugDel.Rev.23，3，1997)，通过被动扩散用于口服吸收的药物分子应该具有小于500道尔顿的分子量、不超过5个氢键供体(OH和NH基团)、不超过10个氢键受体(值得注意的是氮和氧)、分子量低于500，LogP值低于5。实际上，双核苷酸前体药物都是具有较高分子量的化合物，因此在很多方面不能满足用于口腔吸收的里宾斯基标准。
发明内容
本发明提供了一含双核苷酸结构的化合物；本发明另一方面还提供了这些含双核苷酸结构的化合物的制备方法以及其在制备治疗HBV感染的药物中的应用。
首先，本发明提供了由式I表示的化合物或其盐及其由式Sp-I和Rp-I表示的相应基于手性磷原子P的非对应异构体或其盐：
其中，G为五元杂环基；
R1、R2独立的选自H、被一种或多种取代基取代或未被取代的C1～6烷基、环烷基、芳基、芳烷基，C2～6烯基或杂环基；
所述的五元杂环基G任选的被一种或多种取代基取代；所述取代基独立的选自卤素、-OH，含保护基的羟基、-NO2、-CN、-NH2、含保护基的氨基、烷氧基、烷基氨基、C2-C12烯基取代氨基、环烷基取代氨基、芳基氨基、烷基羰基、芳基羰基、烷基羧基、芳基羧基、酰胺基；*P表示手性磷原子。
进一步的优选，式I化合物中，五元杂环基中含有两个杂原子，两个杂原子之间存在环羰基，并且至少含有一个环内双键或环外双键，杂原子，羰基以及双键构成共轭体系。
在本发明的另一优选实施方式中，所述式(I)化合物，其中，G为下式所示的基团：
其中，
A、B独立的选自-NR6-，-O-和-CH2-，但A和B不同时为-CH2-；进一步的优选，A和B同时为-O-；或者A和B中至少一个为-O-，另一个为-NR6-，或-CH2-；
R3、R4、R5、R6独立的选自H、C1～6烷基、C3～12环烷基、和C5～12芳基；
所述C1～6烷基和C5～12芳基任选的被一种或多种取代基取代，所述取代基独立的选自卤素、-OH，含保护基的羟基、-NO2、-CN、-NH2、含保护基的氨基、烷氧基、烷基氨基、C2-C12烯基取代氨基、环烷基取代氨基、芳基氨基、烷基羰基、芳基羰基、烷基羧基、芳基羧基和酰胺基。
进一步的优选，R1、R2、R3、R4、R5、R6各自独立的选自H、C1～6烷基、C3～12环烷基、和C5～12芳基；所述C1～6烷基和C5～12芳基任选的被一种或多种取代基取代，所述取代基独立的选自卤素、-OH，C1～6烷氧基、-NO2、-CN、-NH2、C1～6烷基氨基。
更进一步的优选，A和B同时为-O-，或者A和B中一个为-O-，另一个为-NH-；R1、R2、R3、R4、R5各自独立的选自H、C1～6烷基、C5～12芳基，C1～6烷基取代的C5～12芳基，C1～6烷氧基取代的C5～12芳基，卤素取代的C1～6烷基，和卤素取代的C5～12芳基。
其中，所述C1～6烷基优选为甲基，乙基，异丙基，叔丁基，正丁基；所述卤素为F，Cl，Br，I，优选F，Cl，所述C5～12芳基优选为苯基，噻吩基，吡咯基，呋喃基。
在本发明的另一个优选实施例中，本发明还提供了由式Ia表示的化合物及其由式Rp-Ia和Sp-Ia表示的相应基于手性磷原子P的非对映异构体；
其中，
A和B独立的选自-O-和-NH-；优选，A和B同时为-O-，或者A和B中一个为-O-，另一个为-NH-；R1、R3各自独立的选自H、C1～6烷基，如甲基、乙基、异丙基、正丁基、叔丁基，C5～12芳基，C1～6烷氧基，C1～6烯基，或被一种或多种取代基取代的C5～12芳基，C1～6烷氧基，C1～6烯基，C1～6烷基。
进一步的优选，式(I)化合物中，A和B同时为-O-或-NH-；R1、R3同时为H，或者R1为H，R3为甲基，乙基，异丙基，叔丁基，C5～12芳基，或被一种或多种取代基取代的C5～12芳基；或者，A和B其中一个为-O-，另一个为-NH-，R1为H，R3为甲基，乙基，异丙基，叔丁基，C5～12芳基，或被一种或多种取代基取代的C5～12芳基；
所述取代基独立的选自C1～6烷基，C1～6烷氧基，卤素，优选甲基，乙基，异丙基，叔丁基，F，Cl，Br，甲氧基，乙氧基，三氟甲氧基，氯代乙氧基；所述C5～12芳基，为苯基，噻吩基，吡咯基，呋喃基；所述C1～6烷基取代的C5～12芳基优选为对甲基苯基，三氟甲基苯基，和二甲基苯基。
更进一步的，本发明优选的代表化合物，用式(Ia)表示，其中，R1为H，A，B，R3如下表所示：
*P表示手性磷原子。
相应的，本发明还提供了上述化合物BG001～化合物BG011基于手性磷原子P的两种非对映异构体。
在本发明的另一个优选实施例中，本发明还提供了由式Ib表示的化合物及其由式Rp-Ib和Sp-Ib表示的相应基于手性磷原子P的非对应异构体；
其中，
A和B独立的选自-O-和-NH-；优选，A和B同时为-O-，或者A和B中一个为-O-，另一个为-NH-；R1、R4、R5各自独立的选自H、C1～6烷基，如甲基、乙基、异丙基、正丁基、叔丁基，C5～12芳基，C1～6烷氧基，C1～6烯基，或被一种或多种取代基取代的C5～12芳基，C1～6烷氧基，C1～6烯基，C1～6烷基。
优选，R1、R4、R5均为H。
进一步的优选，式(Ib)化合物中，A和B同时为-O-，R1、R4、R5同时为H，或者R4、R5为H，R1为C1～6烷基，如甲基、乙基、异丙基、正丁基、叔丁基，C5～12芳基，C1～6烷氧基，C1～6烯基，或被一种或多种取代基取代的C5～12芳基，C1～6烷氧基，C1～6烯基，C1～6烷基；或者，优选A和B同时为-NH-，R1、R4、R5同时为H；或者R4、R5为H，R1为C1～6烷基，如甲基、乙基、异丙基、正丁基、叔丁基，C5～12芳基，C1～6烷氧基，C1～6烯基，或被一种或多种取代基取代的C5～12芳基，C1～6烷氧基，C1～6烯基，C1～6烷基；
所述取代基独立的选自C1～6烷基，如甲基、乙基、异丙基、叔丁基，C1～6烷氧基，如甲氧基、乙氧基、三氟甲氧基、氯代乙氧基，卤素，优选，F、Cl、Br；所述C5～12芳基，优选为苯基，噻吩基，吡咯基，呋喃基；所述C1～6烷基取代的C5～12芳基优选为对甲基苯基，三氟甲基苯基，和二甲基苯基，3,4-亚甲基二氧基苯基；所述的C1～6烯基，例如，乙烯基，丙烯基，取代的C1～6烯基，例如苯乙烯基等。
更进一步的，本发明优选的代表化合物，用式(Ib)表示，其中，R4、R5同时为H，R1如下表所示：
*P表示手性磷原子。
对应的，本发明还提供了上述化合物BG012～化合物BG023基于手性磷原子P的两种非对映异构体。
在本发明的另一方面，更优选的化合物具有如下结构：
本发明所述的术语“芳基”是指具有一个或两个芳环的单环或多环碳环系统，所述芳环包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。本发明的芳基包括任何一种未取代的芳基、取代的芳基、杂芳基和取代的杂芳基。
术语“杂芳基”是指一种单环或多环的(例如，二、或三环的，或更多环的)芳基，在芳基环原子中，一个或一个以上环原子选自S、O和N，而剩余的环原子是碳，其中环内包含的任何一种N或S可以任选地被氧化。杂芳基包括，但不仅限于，吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、呋喃基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑、噁二唑、苯硫基、呋喃基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基等。
术语“烷基”是指饱和的、直链或含有支链的烃基基团，分别包含一到十二个碳原子，优选一到六个碳原子。C1-12烷基基团的例子包括，但不仅限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、新戊基和正己基、辛基、癸基、十二烷基等；C1-6烷基基团的例子包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、新戊基和正己基。
术语“芳烷基”或“芳基烷基”是指包含芳基取代的烷基，例如苯甲基、二苯甲基、三苯甲基、苯乙基、和二苯基乙基。
术语“环烷基”表示一种通过除去单一氢原子产生的单环或多环饱和碳环化合物的单价基团。例子包括但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、二环[2.2.1]庚基、和二环[2.2.2]辛基。
术语“杂环基”是指一种5-元、6-元或7-元的非芳香族环或二或三环基团融合的系统，其中(i)每个环包含一到三个杂原子，独立的选自氧、硫和氮，(ii)每个5-元环具有0到1个双链且每个6-元环具有0到2个双链，(iii)氮和硫杂原子可以任选地被氧化，(iv)氮杂原子可以任选地被季铵化，(iv)上述任何一种环可以任选地与一种苯环融合，和(v)其他的环原子是可以被任选氧取代的碳原子。典型的杂环烷基基团包括，但不仅限于，[1，3]二氧戊环、吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉酮、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑啉基、喹喔啉基、哒嗪基、和四氢呋喃。这种杂环基团可以进一步被取代。
术语“烯基”是指具有一个或两个双键，优选具有一个双键，具有2-10个碳原子的不饱和烃链基团。
所述的取代芳基、取代烷基、取代环烷基是指所述的芳基、烷基中的一个或多个氢原子被取代基所置换的如前述定义的芳基、烷基、环烷基，所述取代基包括但不限于卤素(如-F，-Cl，-Br，-I)，-OH，保护的羟基，-NO3，-CN，-NH2，保护的氨基，烷氧基(如CH3O-，C2H5O-等)、烷基氨基(如CH3NH-，C2H5NH-，异丙基氨基等)、C2-C12烯基取代氨基(例如，包括但不限于CH2＝CHNH-，CH3CH＝CHNH-，CH2＝CHCH2NH-等)、环烷基取代氨基(例如，包括但不限于环己烷氨基，环戊烷氨基等)、芳基氨基(例如，包括但不限于苯胺基，对甲苯氨基等)、烷基羰基(例如，包括但不限于乙酰基、丙酰基等)、芳基羰基(例如，包括但不限于苯甲酰基)、烷基羧基(例如，包括但不限于CH3COO-，C2H5COO-等)、芳基羧基(例如，包括但不限于苯甲羧基)、酰胺基(例如，包括但不限于乙酰氨基，甲酰胺基等)；其中烷基氨基优选-NH-C1-12-烷基，如-NH-甲基；环烷基取代氨基优选-NH-C3-12-环烷基。
术语“含保护基的羟基”是指羟基被保护基保护，所述的羟基保护基为本领域常用的如参见文献(“Protective Groups in Organic Synthesis”，5Th Ed.T.W.Greene&P.G.M.Wuts)中的羟基保护基团。作为示例，优选地，所述的羟基保护基可以是(C1-10烷基或芳基)3硅烷基，例如：三乙基硅基，三异丙基硅基，叔丁基二甲基硅基，叔丁基二苯基硅基等；可以是C1-10烷基或取代烷基，例如：甲基，叔丁基，烯丙基，苄基，甲氧基甲基，乙氧基乙基，2-四氢吡喃基(THP)等；可以是(C1-10烷基或芳香基)酰基，例如：甲酰基，乙酰基，苯甲酰基等；可以是(C1-6烷基或C6-10芳基)磺酰基；也可以是(C1-6烷氧基或C6-10芳基氧基)羰基。
术语“含保护基的氨基”是指氨基被氨基保护基保护，常用的氨基保护基例如可以是，苄氧羰基，叔丁氧羰基，丙烯氧羰基(Alloc)等。
术语“离去基团”对本领域技术人员而言其功能以及可选择性是已知的(AdvancedOrganic Chemistry:reactions,mechanisms and structure第4版，由Jerry March,JohnWiley和Sons编；1992，第351-357页)，在底物分子进行取代反应时(如亲核取代反应)，离去基团随后被取代；离去基团包括但不限于：卤素(F，Cl,Br和I)，优选Cl，Br或I；甲苯磺酸酯基，甲磺酸酯基，三氟甲基磺酸酯基，乙酸酯基等。
本发明所使用的“任选的”或“任选地”是指后续描述的事件或事项可能发生但未必繁琐，并且这一描述包括事件或事项发生的情况和事件或事项不发生的情况，举例说明，“任选的，进一步将化合物I分离得到非对映异构体Rp-I和Sp-I”是指可以将化合物I进一步分离得到非对映异构体Rp-I和Sp-I，也可以不对化合物I做进一步的分离。
术语“*P”是表示磷原子是手性的，并且其具有对应的“R”或“S”的Cahn-Ingold-Prelog命名，其具有本领域公认的常规含义。
本发明说明书中提到的“化合物SM3”，“SM3”以及“SB9000”和“化合物SB9000”具有相同的含义，均是指具有如下结构的化合物：
另一方面，本发明还提供了所述双核苷前体化合物的制备方法，包括：
使化合物SM3与NBI反应，转化成式(I)化合物：
任选的，进一步将化合物I分离得到分对映异构体Rp-I和Sp-I；
其中，L为离去基团，所述离去基团选自：卤素，如Cl、Br、I，对甲苯磺酸基、甲基磺酸基、或三氟乙酸基；
R1、R2各自独立的选自H、C1～6烷基、环烷基、芳基、芳烷基，C1～6烯基或杂环基；
所述的五元杂环基G任选的被一种或多种取代基取代；所述取代基独立的选自卤素、-OH，含保护基的羟基、-NO2、-CN、-NH2、含保护基的氨基、烷氧基、烷基氨基、C2-C12烯基取代氨基、环烷基取代氨基、芳基氨基、烷基羰基、芳基羰基、烷基羧基、芳基羧基、酰胺基；
优选的，将化合物NBI(其中L为离去基团，优选为Cl，Br，I)与SM3在合适的溶剂溶剂(优选N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲亚砜、乙腈、四氢呋喃、1,4-二氧六环)中反应，转化成式(I)化合物，优选反应体系中加入缚酸剂如DIEA，以及催化剂碘化钠。
在反应结束后，经高效液相制备纯化，冻干，得到纯化后的通式(I)化合物，使用1H-NMR和13C-NMR对其定性。
举例说明的，本发明提供了一种式(Ia)化合物的制备方法，包括：使化合物SM3与化合物NBII反应，转化成化合物Ia，具体如下方案A:
任选的，进一步将化合物Ia分离得到分对映异构体Rp-Ia和Sp-Ia。
上述方案中式NBII所示化合物根据A、B、R1、R3的具体取代基进行合成。举例说明的，例如当A，B均为O，时，NBII可以按照如下方案1a或方案2a制备：
R3选自H、C1～6烷基、C3～12环烷基、和C5～12芳基；
所述C1～6烷基和C5～12芳基任选的被一种或多种取代基取代，所述取代基独立的选自卤素、-OH，含保护基的羟基、-NO2、-CN、-NH2、含保护基的氨基、烷氧基、烷基氨基、C2-C12烯基取代氨基、环烷基取代氨基、芳基氨基、烷基羰基、芳基羰基、烷基羧基、芳基羧基和酰胺基。
进一步的，优选R3为H,Me，乙基，异丙基，t-Bu，苯基，对甲基苯基，对甲氧基苯基，2-氯-4-甲氧基苯基，或三氟甲基苯基等，更进一步的优选R3为甲基。
反应条件：(a)KO2CCH2CO2Et，MgCl2，Et3N/CH3CN；(b)PhCH2OH,DMAP(cat.)，甲苯；(c)4-N-acetylphenylsufonyllazide,Et3N/CH3CN；(d)Rh2(OAc)4(cat.),THF/H2O(2:1)；(e)COCl2，iPr2Net；甲苯或者N,N'-羰基二咪唑,iPr2NEt(cat.)，CH2Cl2；(f)H2，Pd(OH)2,EtOH；(g)i(COCl)2，DMF(cat.)，CH2Cl2；ii Bu4NBH4,CH2Cl2；(h)Ph3P，CBr4，CH2Cl2。
制备方法可以参考文献：Tetrahedron Letters 43(2002)1161-1164。
本发明所述的化合物BG001～BG011均可按照上述化合物Ia所述的方法制得。
进一步的，举例说明，通式(Ib)所示化合物可按照方案B描述的方法，将化合物NBⅢ(其中L为离去基团，如Cl，Br，I等)与SM3在氮气保护下，在溶剂(优选N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲亚砜、乙腈、四氢呋喃、1,4-二氧六环)中反应，优选反应体系中加入缚酸剂如DIEA，以及催化剂碘化钠。
在反应结束后，经高效液相制备纯化，冻干，得到纯化后的通式(Ib)化合物，使用1H-NMR和13C-NMR对其定性。
任选的，进一步将化合物Ib分离得到分对映异构体Rp-Ib和Sp-Ib。
上述方案中式NBⅢ所示化合物根据A、B，R1的具体取代基情况进行合成。举例说明的，例如当A，B均为O，时，NBIII可以按照如下方案1b制备：
以THF和水做溶剂，室温反应条件下，R1CHO与进行反应，然后将反应底物在二氯甲烷作溶剂，三苯基磷存在条件下，进行溴代反应，得到化合物NBIII，文献Tetrahedron Letters 43(2002)1161-1164也公开了此反应具体方法，其公开的内容引入本发明中。
本发明提供的化合物BG012～BG023均可按照上述方案B的方法制得。
进一步的，举例说明，通式(Ic)化合物可按照方案C描述的方法制备，如将化合物NBⅣ(其中L为离去基团，如Cl，Br，I等)与SM3在氮气保护下，在溶剂(优选N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲亚砜、乙腈、四氢呋喃、1,4-二氧六环)中反应，优选反应体系中加入缚酸剂如DIEA，以及催化剂碘化钠。
在反应结束后，经高效液相制备纯化，冻干，得到纯化后的通式(Ic)化合物，使用1H-NMR和13C-NMR对其定性。
文献Tetrahedron Letters 43(2002)1161-1164和文献ORGANIC LETTERS2011Vol.13，No.174720-4723等也都公开了上述制备NBI的类似反应，当A、B，R1，R3，R4，R5为本发明前述其他基团时候，均可参考类似方法制备得到相应的化合物NBI，制备这些不同取代基替换的化合物NBI是本领普通技术人员在本发明公开的方法基础上通过常规调整反应底物可以实现的。
当本发明的化合物(I)是游离形式时，通过本身已知的方法或类似的方法可以将其转化成目标盐。反之，当获得的化合物(I)是盐时，通过本身已知的方法或类似方法可以将其转化为游离形式或不同的目标盐。
当本化合物(I)存在光学异构体时，这样的单个光学异构体及其混合物当然包括在本发明范围内。
化合物(I)可以是结晶，并可以是单晶或多种结晶的混合形式。根据已知的结晶方法通过结晶可以制备晶型。
化合物(I)可以是溶剂化物(如水合物等)，溶剂化物和非溶剂化物都包含在本发明范围内。
本发明所述的化合物(I)的盐，包括任何一种药学上可接受的盐，比如，化合物(I)与无机碱如钠、钾等，碱土金属如钙，镁等、有机碱如有机胺如三乙胺，三甲胺，叔丁胺，吡啶，等，碱性氨基酸如精氨酸，赖氨酸，鸟氨酸等，以及氨等形成的盐；优选的所示盐为钾盐或钠盐。
本发明人通过研究大量的化合物药效活性，以及分析检测这些化合物的体内代谢过程，最终确定，化合物I通式中，五元杂环、杂原子A和B之间的羰基以及五元环内或环外含有一个双键构成的共轭体系，是化合物I的重要药效基团，也是满足这类化合物能够在体内吸收，分布以及释放活性物质SM3，发挥药效的关键。
发明人通过对不同结构系列的化合物及体内外药效药代研究，初步认为，化合物Ia和化合物Ib，在体内微环境中，碳酸酯先水解，然后得到含双键的化合物Iaa和化合物Ibb，化合物Iaa和化合物Ibb中通过烯醇式或席夫碱进行异构化，最终化合物Iaa和化合物Ibb异构化均得到化合物SMP，SMP最终在体内分解成化合物SM3发挥药效作。体内分解机制如下所示：
本发明提供了一种结构新颖的双核苷酸前体化合物，这类化合物在体内显示出优异的抗HBV活性和良好的生物利用度，与现有的双核苷酸前体药物相比：
(1)本发明提供的化合物(I)具有药效活性高，使用剂量低，毒副作用小等多方面意料不到的技术效果；在对对小鼠进行35S标记的双核苷酸前体化合物以BG002为代表给药表明，在吸收之后，化合物迅速地从中央室分布到血管外的组织中。并在肝脏大量的集中，在其他组织中只观察到很少剂量。研究表明，在吸收之后，化合物BG002在肝脏中发生显著的分布。由于肝脏是HBV和HCV的靶器官，这一研究显示本发明提供的双核苷酸前体化合物能够容易的进入肝细胞。这些双核苷酸前体化合物在老鼠模型中的有效抗病毒活性也可以被上述研究支持。
(2)实验表明本发明提供的化合物(I)能使肝HBV DNA显著降低，并且这些降低具有统计学意义。
(3)实验表明本发明提供的双核苷前体化合物(I)体细胞毒性小，安全性好。
(4)本发明提供了一种化合物I的制备方法，操作简便，收率和纯度高；另外，本发明还分离出化合物I的两种非对映异构体纯的化合物，经过发明人的初步研究发现其中S构型的化合物在溶解性方面具有显著的优势，这意味着，S构型的化合物在制备制剂方面可能具备优势。
具体实施例
以下结合具体实施例对本发明的内容以及有益效果做进一步说明。应当理解，下面这些实施是本发明的一些优选实施方式的进一步阐释，不应该用于限制本发明。
实施例1化合物BG002的合成方法：
氮气保护下，反应瓶中，依次加入SM3(4.5g，7.7mmol)、DMF(100ml)、二异丙基乙胺(1.1g，8.5mmol)、碘化钠(0.58g，5.8mmol)、4-氯甲基-5-甲基-1,3-二氧杂环戊烯-2-酮(1.2g，8.4mmol)，加毕，室温搅拌反应过夜，反应液经柱层析，纯化得BG002 2.0g，纯度98.08％，收率57.3％。
MS Calcd:699；MS Found:700[M+H]+。
1H-NMR(DMSO-d6,400Hz):
δ2.0177-2.0411(d,3H)；2.3059-2.3700(m,1H)；2.8201-2.9104(m,1H)；3.33(s,3H)；3.5887(s,2H)；3.9426-3.9976(m,2H)；4.0326-4.1349(m,3H)；4.1831-4.2859(m,1H)；4.3294-4.4024(m,1H)；4.4879-4.5206(m,1H)；4.9859-5.0385(m,1H)；5.3439-5.3860(t,1H)；5.5369-5.5509(dd,1H)；5.7020-5.7325(m,1H)；5.8897-5.9135(m,1H)；6.3617-6.3993(m,1H)；7.2728(s,2H)；7.8637-7.8938(m,1H)；8.1423(s,1H)；8.2848-8.2965(d,1H)；11.4335(s,1H)。
13C-NMR(DMSO-d6,400Hz):
δ9.13,9.18,23.34,38.66,38.84,58.35,58.42,60.74,60.85,67.97,70.87,70.92,75.21,80.88,80.93,81.06,83.96,84.04,84.11,84.24,85.09,103.01,119.68,119.74,134.25,134.29,138.01,139.96,140.15,140.62,149.49,149.53,151.03,151.04,152.18,153.01,156.50,163.39。
分离光学纯化合物BG002a、BG002b：
向反应液中加入0.3g BG002用50mL的50％CH3CN/H2O混合液溶解，经0.45um有机滤膜过滤，滤液经制备HPLC纯化，然后制备HPLC除盐，浓缩除去大部分的CH3CN，冻干，得到白色固体BG002a 47mg，BG002b 60mg，HPLC≥99％。
制备纯化方法
/>
经测定分离得到的BG002的两种光学纯的非对映异构体的1H-NMR和13C-NMR数据如下：
(1)1H-NMR(DMSO-d6,400Hz):δ2.02(d,3H)；2.31-2.37(m,1H)；2.82-2.91(m,1H)；3.33(s,3H)；3.59(s,2H)；3.94-4.00(m,2H)；4.03-4.13(m,3H)；4.18-4.29(m,1H)；4.33-4.40(m,1H)；4.49-4.52(m,1H)；4.99-5.04(m,1H)；5.34-5.3860(t,1H)；5.54-5.55(dd,1H)；5.70-5.73(m,1H)；5.89-5.91(m,1H)；6.36-6.40(m,1H)；7.27(s,2H)；7.86-7.89(m,1H)；8.15(s,1H)；8.31(s,1H)；11.43(s,1H)；
13C-NMR(DMSO-d6,400Hz):δ9.13,23.37,38.65,,58.35,58.42,60.73,68.00,70.85,75.28,80.94,84.04,84.11,84.32,,103.02,119.73,134.21,134.25,138.01,140.20,140.61,149.48,151.04,152.18,152.91,156.44,163.39。
(2)1H-NMR(DMSO-d6,400Hz):δ2.04(d,3H)；2.31-2.37(m,1H)；2.82-2.91(m,1H)；3.33(s,3H)；3.59(s,2H)；3.94-4.00(m,2H)；4.03-4.13(m,3H)；4.18-4.29(m,1H)；4.33-4.40(m,1H)；4.49-4.52(m,1H)；4.99-5.04(m,1H)；5.34-5.3860(t,1H)；5.54-5.55(dd,1H)；5.70-5.73(m,1H)；5.89-5.91(m,1H)；6.36-6.40(m,1H)；7.27(s,2H)；7.88-7.91(d,1H)；8.18(s,1H)；8.32(s,1H)；11.43(s,1H)；
13C-NMR(DMSO-d6,400Hz):δ9.18,23.36,38.89,58.35,60.84,67.94,68.00,70.86,75.30,81.10,84.08,85.05,103.01,119.62,134.25,134.29,138.01,140.23,140.65,149.41,151.06,152.18,152.29,155.92,163.41。
实施例2化合物BG004的合成方法：
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(1)BG004-03制备：
N2保护，在0℃，于反应瓶依次加入乙腈(420ml)、BG004-02(12.0g，51.3mmol)、对甲苯磺酰叠氮(12.3g，51.3mmol)，之后加入三乙胺(21.4ml，15.4mmol)，维持0℃，搅拌30min，之后室温反应4h。反应液减压浓缩干，用150ml×2乙醚/石油醚＝2:1混合试剂打浆。抽滤。滤液减压浓缩干，用乙酸乙酯/正己烷混合溶剂柱层析纯化得油状物BG004-0312.79g，收率96％。
(2)BG004-04制备：
于反应瓶依次加入四氢呋喃(250ml)、纯化水(120ml)、BG004-03(12.7g，48.7mmol)、Rh(OAc)4(165mg，0.37mmol)，回流反应5h。反应结束，降至室温。减压浓缩，剩余溶液用乙酸乙酯萃取3次。合并有机层饱和氯化钠水溶液萃洗。有机层无水硫酸钠干燥。过滤，浓缩，得黄色油状物BG004-04(12.0g)。
(3)BG004-06制备：
N2保护下，量取无水四氢呋喃(230ml)，加入BG004-04(11.76g，46.9mmol)，搅拌溶清。降温至0℃加入CDI(15.3g，94.4mmol)，加毕滴加DIEA(19mmol)。维持0℃搅拌反应5h，室温反应过夜。反应液减压浓缩。浓缩结束加入乙酸乙酯和5％KHSO4水溶液，搅拌均匀，静置分层。有机层依次用水、饱和氯化钠萃洗。无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得油状物。经乙酸乙酯正庚烷柱层析得无色油状物BG004-06(9.99g)。
(4)BG004-07制备：
称量BG004-06(9.98g，36.1mmol)加入无水乙醇(230ml)，搅拌溶解。之后加入氢氧化钯碳(20％，490mg)，氢气球置换三次，搅拌反应70min。过滤，减压浓缩滤液。得白色固体BG004-07(6.56g，98％)。
(5)BG004-08制备：
氮气保护下，量取无水二氯甲烷150ml，加入BG004-07(6.47g，34.7mmol)、无水DMF(350μl)，控温0℃，滴加草酰氯(3.33ml，38.2mmol)。滴加结束，维持0℃，搅拌反应30min，室温反应1h。随后减压浓缩至干。残余物加入无水二氯甲烷(200ml)搅拌溶解。N2保护下，控温-78℃，滴加Bu4NBH4(9.86g，38.3mmol)二氯甲烷(60ml)溶液。滴加结束后，维持-78℃搅拌反应1h，滴加0.1N盐酸(100ml)淬灭反应。缓慢升至室温。减压浓缩，剩余物加入乙酸乙酯(200ml)、水(50ml)。摇匀，分液。水层加入氯化钠至饱和，加入乙酸乙酯(100ml)萃取。合并乙酸乙酯层。饱和氯化钠水溶液萃洗。无水硫酸钠干燥，减压浓缩得油状物，经乙酸乙酯/正己烷柱层析纯化得油状物BG004-08(4.25g，收率69％)。
(6)BG004-09制备：
氮气保护下，量取二氯甲烷150ml，加入BG004-08(2.0g，11.6mmol)，降温至0℃。随后依次加入四溴化碳(4.62g，13.9mmol)、三苯基磷(3.35g，12.8mmol)。维持0℃搅拌反应30min，室温搅拌反应1h。反应液减压浓缩。经柱层析纯化得BG004-09(2.15g，收率79％)。
(7)BG004制备：
氮气保护下，反应瓶中，依次加入SM3(4.5g，7.7mmol)、DMF(100ml)、二异丙基乙胺(1.1g，8.5mmol)、碘化钠(0.58g，5.8mmol)、BG004-09(1.9g，8.4mmol)，加毕，室温搅拌反应过夜，反应液经柱层析，纯化得BG004 4.56g，纯度97％，收率80％。MS Calcd:741；MSFound:742[M+H]+。
参考实施例2方法制备化合物BG001，BG003，BG005～BG011：
化合物编号 MS Calcd MS Found：[M+H]+ 化合物编号 MS Calcd MS Found：[M+H]+
BG001 685 686 BG008 829 830
BG003 713 714 BG009 791 792
BG005 727 728 BG010 684 685
BG006 727 728 BG011 683 684
BG007 741 742
实施例3化合物BG012的合成方法：
(1)BG012-02制备：
氮气保护下，于反应瓶加入羟基丙酮(21.0g，280mmol)、二氯甲烷(200ml)。降温至0℃，加入三光气(30.0g，110mmol)。控温≤-8℃，滴加N,N-二甲基苯胺(37.0g，300mmol)。控温0℃，搅拌反应15min，之后室温反应2h以上。反应液降温至5℃，依次用冰冻3M稀盐酸(40ml)、水(30ml)、饱和氯化钠(30ml)。有机层加入无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩至1/2体积，回流3h。之后浓缩至干，得油状物，升温至170℃搅拌2.5h，此时反应液为暗灰色。随后经减压蒸馏(130-140℃/30mmHg)，得淡黄色油状物BG012-02(15g)。
(2)BG012-03制备：
于反应瓶中，依次加入四氯化碳(200ml)、BG012-02(10g，100mmol)，加毕搅拌溶清。之后加入NBS(23g，130mmol)、AIBN(10mg)。回流反应1.5h。降压浓缩至一半体积，过滤，滤液浓缩至干，经减压蒸馏得BG012-03(14g)。
(3)BG012-04制备：
于四氢呋喃水溶液中，加入铟，苯甲醛，BG012-03，室温搅拌反应15min。反应结束，过滤，浓缩，经纯化得BG012-04(收率96％)。
(4)BG012-05制备：
氮气保护下，量取二氯甲烷150ml，加入BG012-04(10g，49mmol)，降温至0℃。随后依次加入四溴化碳(19.3g，58mmol)、三苯基磷(14.0g，53.4mmol)。维持0℃搅拌反应30min，室温搅拌反应1h。反应液减压浓缩。经柱层析纯化得BG012-05(10.5，收率80％)。
(5)BG012制备：
氮气保护下，反应瓶中，依次加入SM3(2g，3.4mmol)、DMF(20ml)、二异丙基乙胺(0.52g，4.0mmol)、碘化钠(0.52g，3.5mmol)、BG012-05(1.08g，4.0mmol)，加毕，室温搅拌反应过夜，反应液经柱层析，纯化得BG012 1.60g，纯度98.5％，收率61％。MS Calcd:775；MSFound:776[M+H]+
参考实施3类似方法制备化合物BG013～BG023；
实施例4：受试化合物抗HBV活性研究
选取约200只HBV转基因阳性C57小鼠(雄性，6-8周龄)，称重和大体观察，对不适合实验的动物提前剔除掉。初筛后的小鼠取血，检测血清HBV DNA指标。
以HBV小鼠血清HBV DNA为主要指标，选取176只小鼠入组进行实验。176只小鼠分成22组，每组8只。具体分组及每组小鼠给药情况如下：
序号 组别 剂量(mg/kg) 给药方式 给药频率 动物数(只)
1 生理盐水 0 灌胃 每天 8♂
2 SB9200 50 灌胃 每天 8♂
3 BG001 50 灌胃 每天 8♂
4 BG002 50 灌胃 每天 8♂
5 BG003 50 灌胃 每天 8♂
6 BG004 50 灌胃 每天 8♂
7 BG005 50 灌胃 每天 8♂
8 BG006 50 灌胃 每天 8♂
9 BG007 50 灌胃 每天 8♂
10 BG008 50 灌胃 每天 8♂
11 BG009 50 灌胃 每天 8♂
12 BG010 50 灌胃 每天 8♂
13 BG011 50 灌胃 每天 8♂
14 BG012 50 灌胃 每天 8♂
15 BG013 50 灌胃 每天 8♂
16 BG014 50 灌胃 每天 8♂
17 BG015 50 灌胃 每天 8♂
18 BG016 50 灌胃 每天 8♂
19 BG017 50 灌胃 每天 8♂
20 BG018 50 灌胃 每天 8♂
21 BG019 50 灌胃 每天 8♂
22 BG020 50 灌胃 每天 8♂
给药当天为D1，随后的8周每天下午给药，各组小鼠在D15/29/43/57上午称重，并眼眶取血并检测血液中HBV DNA拷贝数。8周后处死动物。D0为给药前一天。
实验结果：
20种受试化合物的抗HBV效果均优于对照化合物SB9200，其中BG001、BG002、BG003、BG004和BG005的抗病毒效果都较好。在所有受试化合物中，BG002的效果最突出，随着给药天数的持续增加，病毒DNA拷贝数下降幅度最大。
化合物各次检测的HBV DNA拷贝数
上述结果表明，与对照组相比，结构修饰的前体化合物BG001～BG020，特别是BG001，BG002，BG004，BGB005等能使肝HBV DNA显著降低，并且这些降低具有统计学意义。
实施5：本发明化合物在SD大鼠体内的药代动力学研究
选取6-8周龄雄性SD大鼠63只(维通利华实验动物技术有限公司)，动物饲养在SPF动物房内。动物房装备空调系统，通风良好，室内温度维持在20～26℃范围，湿度维持在40％～70％范围内。动物房内采用人工照明，明暗各12小时(因实验操作、清洁需开启工作照明等情况除外)，实验动物自由采食和饮水。经兽医检验，体征状况良好的大鼠入选本实验，每只大鼠均用尾标号标记。所有动物给药前禁食，禁食时间不少于12h，于给药后4h恢复给食，保持所有动物在实验过程中均可自由饮水。SB9200和受试化合物均以0.5％CMC-Na配制灌胃制剂。
动物分组及给药信息详见下表。
。每只大鼠于给药前、给药结束后0.25、0.5、1、2、4、8、12和24h由颈静脉采血约0.15mL，置于EDTA-K2抗凝管中，存放于湿冰上，并于1h之内，离心(1500～1600g)10min，分离血浆，将所得血浆样品保存于-40～-20℃环境中。实验结束后，采用二氧化碳窒息法或者颈椎脱臼法对大鼠实施安乐死。
建立测定SD大鼠血浆中活性代谢产物SB9000浓度测定的LC-MS/MS分析方法，用于本实验获得的生物样品的浓度测定。采用Pharsight Phoenix 8.0中的非房室模型计算相应的药代动力学参数。
实验结果如下所示：
从上述实验结果中可以看出，SD大鼠灌胃给予本发明所述化合物后，其活性代谢产物SB9000的药代动力学性质均优于对照化合物SB9200，其中BG001、BG002、BG003、BG004和BG005的药代动力学性质较为突出。在所有受试化合物中，BG002的药代性质最突出，Cmax和AUC0-t均为对照化合物SB9200的2.5倍左右。
实施例6：体外细胞毒性：
用CTG方法测试化合物BG001，BG002，BG007，BG009，BG015，BG018，BG021，BG022和SB9200在人正常肺成纤维细胞(MRC-9)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞增殖50％抑制浓度(IC50)。
收集处于指数生长期的细胞并用Vi-Cell XR细胞计数仪进行活细胞计数。用各细胞相应培养基调整细胞悬液浓度。每孔加90μl细胞悬液于96-孔细胞培养板，最终细胞浓度为3000细胞/孔。以DMSO溶解各供试化合物为10mM储存液。用储存液和DMSO制备3.16X系列梯度稀释液。然后分别用培养基稀释100倍。最后每株细胞每孔分别加入10μl相应的10倍溶液，每个药物浓度各3个复孔，。置于37℃,5％CO2孵箱中培养72小时。药物处理72小时后，按照CTG操作说明，每孔加入50μl(1/2培养体积)预先融化并平衡到室温的CTG溶液，用微孔板震荡器混匀2分钟，于室温放置10分钟后用Envision2104读板仪测定萤光信号值。应用GraphPad Prism 5.0软件,使用非线性回归模型绘制S型剂量-存活率曲线并计算IC50值。供试化合物在2个细胞系的细胞增殖IC50结果如下所示。
化合物在MRC-9和HUVEC细胞系的细胞增殖IC50结果
由以上结果可以看出，本发明提供的化合物具有较低的体细胞毒性。
将本发明提供的其他化合物进行同样的抗HBV活性研究，药代动力学研究及体外细胞毒性研究，实验结果显示与SB9200相比，均取得显著的改善。

Claims (11)

1.式(Ⅰ)表示的化合物或其盐：
其中G为下式所示的基团：
其中，
A、B同时选自-O-；R4、R5同时选自H；
R2选自H；
R1选自H、被一种或多种取代基取代或未被取代的C1～6烷基、C5～12芳基、C2～6烯基；所述取代基独立的选自卤素、-OH、-NO2、-CN、-NH2、C1～6烷氧基；
*P表示手性磷原子。
2.式(Ib)所示化合物，其特征在于，具有如下结构：
其中，A、B同时选自-O-；R4、R5同时选自H；
R1选自H、C1～6烷基、C5～12芳基、C1～6烷氧基、C1～6烷基取代的C5～12芳基、C1～6烷氧基取代的C5～12芳基、C1～6烷基取代的C2～6烯基；
*P表示手性磷原子。
3.式(Ib)所示化合物，其特征在于，具有如下结构：
其中，其中，A、B同时选自-O-；R4、R5同时选自H；
R1选自H、C1～6烷基、对甲基苯基、三氟甲基苯基、二甲基苯基、丙烯基、苯氧甲基、苯乙烯、噻吩基、苯基；
*P表示手性磷原子。
4.式(Ib)所示化合物，其特征在于，具有如下结构：
其中，R4、R5同时为H，A、B、R1如下所示：
*P表示手性磷原子。
5.根据权利要求1～4任一项所述化合物，其特征在于，所述化合物包含两种非对映异构体，表示为Rp-Ib和Sp-Ib，其中，A、B同时选自-O-；R4、R5同时选自H；R1取代基如权利要求1～4任一项定义所述：
6.一种权利要求1～4任一项所述化合物的制备方法，包括：使化合物SM3与NBI反应，转化成式(I)化合物：
任选的，进一步将化合物I分离得到非对映异构体Rp-I和Sp-I；
其中，L为离去基团，所述离去基团选自：卤素，对甲苯磺酸基、甲基磺酸基、和三氟乙酸基；
G为下式所示的基团：
R2为H；R1取代基如权利要求1～4任一项定义所述；
*P表示手性磷原子。
7.根据权利要求6所述制备方法，包括向反应体系中加入缚酸剂DIEA，以及催化剂碘化钠。
8.一种权利要求1～4任一项所述的化合物在制备用于治疗病毒感染的药物中的应用；其中，所述病毒感染是指乙肝病毒(HBV)。
9.一种药物组合物，包含权利要求1～4任一项所述化合物和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
10.根据权利要求9所述药物组合物，所述药物组合物制备成片剂，胶囊剂，口服混悬剂或固体分散体。
11.权利要求9所述的药物组合物在制备用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)的药物中的应用。
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