KR20080054429A

KR20080054429A - 인터루킨―１３ 항체 조성물

Info

Publication number: KR20080054429A
Application number: KR1020087010374A
Authority: KR
Inventors: 브렌단 코믹 피쉬; 쟈넷 엘리자베스 랭스턴; 카렌 바니스터; 클레어 루이스 호프
Original assignee: 메디뮨 리미티드
Priority date: 2005-09-30
Filing date: 2006-09-29
Publication date: 2008-06-17
Also published as: AU2006296399A8; IL189983A0; NO344859B1; AU2006296399B2; IL246674B; HK1210724A1; LTPA2021528I1; PL1942939T5; JP2014040461A; KR101363777B1; CA2623429A1; IL246674A0; JP5820450B2; US20080248048A1; IL189983A; FIC20210042I1; GB0619204D0; JP2009510046A; EP1942939B2; GB2430883B

Abstract

본 발명은 인터루킨-13 항체, 보다 특히 모노클로날 인터루킨-13 항체, 특히 인간 인터루킨-13 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물, 상기 항체의 정제 방법, 및 인터루킨-13 관련 장애, 예를 들어 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 피부 경화증, 염증성 장 질환 및 호지킨 (Hodgkin) 림프종, 특히 천식을 치료하는데 있어서의 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.

인터루킨-13 (IL-13) 항체 조성물, IL-13 관련 장애, 천식 치료, 아세테이트 완충제

Description

인터루킨―１３ 항체 조성물 {Interleukin-13 Antibody Composition}

본 발명은 인터루킨-13 항체, 보다 특히 모노클로날 인터루킨-13 항체, 특히 인간 인터루킨-13 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물, 상기 항체의 정제 방법, 및 인터루킨-13 관련 장애, 예를 들어 천식을 치료하는데 있어서의 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.

인터루킨 (IL)-13은 변형되지 않은 분자량이 대략 12 kDa인 114개의 아미노산으로 된 사이토킨이다. IL-13은 IL-4와 가장 밀접한 관계가 있는데, 아미노산 수준 상의 서열 상동성이 30％이다. 인간 IL-13 유전자는 IL-4 유전자와 인접한 염색체 5q31 상에 위치한다 [참고: McKenzie, A.N. et al., J Immunol, 1993. 150(12), 5436-5444; Minty, A. et al., Nature, 1993. 362(6417), 248-50].

IL-13이 초기에는 Th2 CD4+ 림프구 유래된 사이토킨으로서 확인되었지만, 이는 Th1 CD4+ T-세포, CD8+ T 림프구 NK 세포, 및 비-T-세포 집단, 예를 들어 비만 세포, 호염기구, 호산구, 대식 세포, 단핵구 및 기도 평활근 세포에 의해 생성되기도 한다.

IL-13은 수 많은 질병, 특히 염증 반응에 의해 유발되는 질병과 관련이 있어 왔다. 예를 들어, 재조합 IL-13을 타고난 본래의 비-감작화 설치류의 기도에 투여 하면, 기도 염증, 점액 생성 및 기도 과민반응성 (AHR)을 포함한 많은 국면의 천식 표현형이 유발되는 것으로 밝혀졌다 [참고: Wills-Karp, M. et al., Science, 1998. 282(5397), 2258-2261; Grunig, G. et al., Science, 1998. 282(5397), 2261-2263; Venkayya, R., et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 2002. 26(2), 202-208; Morse, B. et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2002. 282(1), L44-49]. IL-13이 폐에서 특이적으로 과발현된 트랜스제닉 (transgenic) 마우스에서 유사한 표현형이 관찰되었다. 이 모델에서는, IL-13에 대한 보다 만성적인 노출로 인해 섬유증이 발생하기도 하였다 [참고: Zhu, Z. et al., J Clin Invest, 1999. 103(6), 779-788].

IL-13 유전자 상의 수 많은 유전적 다형성이 또한, 알레르기성 질환과 연관이 있어 왔다. 특히, 아미노산 130에서의 아르기닌 잔기를 글루타민으로 치환시킨 (Q13OR) IL-13 유전자의 변이체는 기관지 천식, 아토피성 피부염 및 혈청 IgE 수준 상승과 연관이 있어 왔다 [참고: Heinzmann, A. et al., Hum Mol Genet, 2000. 9(4), 549-559; Howard, T. D. et al., Am J Hum Genet, 2002. 70(1), 230-236; Kauppi, P. et al., Genomics, 2001. 77(1-2), 35-42; Graves, P. E. et al., J Allergy Clin Immunol, 2000. 105(3), 506-513]. 이러한 특별한 IL-13 변이체는 또한, 아미노산 계수치로부터 20개 아미노산 신호 서열을 제외한 몇몇 그룹에 의해 Q11OR 변이체 (아미노산 110에서의 아르기닌 잔기가 글루타민으로 치환된다)로서 지칭된다.

IL-13 생성은 또한 알레르기성 천식과 연관이 있으며 [참고: van der Pouw Kraan, T. C. et al., Genes Immun, 1999. 1(1), 61-65], IL-13 수준 상승은 아토피성 비염 (건초열), 알레르기성 피부염 (습진) 및 만성 부비동염이 있는 인간 대상체에게서 측정되었다.

천식 이외에도, IL-13은 기타 섬유성 질환과 연관이 있어 왔다. 전신성 경화증 환자의 혈청에서 및 기타 형태의 폐 섬유증에 걸린 환자로부터의 기관지폐포성 세정 (BAL) 샘플에서는 IL-4 보다 최대 1000배 더 증가된 수준의 IL-13이 측정되었다 [참고: Hasegawa, M. et al., J Rheumatol, 1997. 24(2), 328-332; Hancock, A. et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 1998. 18(1), 60-65].

IL-13이 마우스 폐에서 과발현되면 폐기종, 점액 생성 상승 및 염증이 유발되는데, 이는 인간 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 국면을 반영하는 것으로 입증되었다 [참고: Zheng, T. et al., J Clin Invest, 2000. 106(9), 1081-1093].

IL-13이 염증성 장 질환의 발병 기전에 일정 역할을 할 수도 있다고 제안되었고 [참고: Heller, F. et al., Immunity, 2002. 17(5), 629-38], IL-13 수준 상승이 정상 대조군과 비교해서 몇몇 호지킨병 (Hodgkin's disease) 환자의 혈청에서 탐지되었다 [참고: Fiumara, P. et al., Blood, 2001. 98(9), 2877-2878].

IL-13 억제제는 또한, 종양 재발 또는 전이를 예방하는데 있어 치료적으로 유용한 것으로 여겨진다 [참고: Terabe, M. et al., Nat Immunol, 2000. 1(6), 515-520]. IL-13의 억제는 또한, 동물 모델에서 항바이러스성 백신을 증강시키는 것으로 밝혀졌고 HIV 및 기타 감염성 질환을 치료하는데 유익할 수 있다 [참고: Ahlers, J. D. et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(20), 13020-13025].

IL-13 억제에 대해 유도된 항체 접근 방식이 보고되었다. 예를 들어, WO 2005/007699 (Cambridge Antibody Technology Limited)에는 IL-13 활성을 중화시키는 것으로 밝혀지고 IL-13 관련 장애를 치료하는데 잠재적으로 유용하다고 청구한 일련의 인간 항-IL-13 항체 분자가 기재되어 있다.

본 발명의 제1 국면에 따르면, 아세테이트 완충제를 이용하여 pH 4.5 내지 6.0으로 완충시킨 하나 이상의 제약상 허용가능한 부형제와 IL-13 항체를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.

항체 정제 과정에는 전형적으로 수 많은 분리 기술, 예를 들어 크로마토그래피 분리 (예를 들어, 단백질 A 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등)이 요구되는 것으로 통상 공지되어 있다. 이러한 분리 방식에 따른 결과로서, 상이한 수 많은 완충제가 요구된다. 예를 들어, WO 2004/076485에 기재된 항체 정제 과정에서는, 단백질 A 크로마토그래피의 경우 5O mM 글리신/글리시네이트 pH 8.0이 필요하고, Q-세파로스 크로마토그래피의 경우에는 5O mM 트리스 (Tris) HCl pH 8.0 및 2O mM 인산나트륨 pH 6.5이 필요하며, DEAE-세파로스 크로마토그래피의 경우에는 25 mM 트리스 HCl pH 8.6이 필요하다.

이와는 달리, 본 발명에서는 모든 IL-13 항체 정제 단계 내내 존재하는 이점을 지니고 있는 본 발명의 조성물 내에 존재하는 단일 아세테이트 완충제를 고정된 농도의 소정의 pH로 사용해야 한다. 따라서, 이러한 완충제를 정제 공정 초기에 사용할 뿐만 아니라 전체 정제 공정 내내 사용하게 되면, 공정 시간과 비용이 단축 및 절감되고 생성물 수율이 증가된다.

"항체"에 관한 언급은 천연적으로 생성되든지 아니면 부분 또는 전부가 합성적으로 생성되든지 간에 면역글로불린에 관한 언급이 포함된다는 것을 인지해야 할 것이다. 상기 용어는 또한, 항원 결합성 도메인을 포함하는 모든 폴리펩티드 또는 단백질을 포괄한다.

항원 결합성 도메인을 포함하는 항체 단편은 Fab, scFv, Fv, dAb, Fd와 같은 분자; 및 디아보디 (diabody)이다.

모노클로날 및 기타 항체를 취하고, 본래 항체의 특이성을 보유하고 있는 기타 항체 또는 키메라 항체를 생성하기 위해 재조합 DNA 기술을 사용하는 것이 가능하다. 이러한 기술은 특정 항체의 면역글로불린 가변 영역, 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 코딩하는 DNA를 상이한 면역글로불린의 불변 영역, 또는 불변 영역 + 골격 영역에 도입하는 것을 포함할 수 있다 [참고: 예를 들어, EP-A-184187, GB2188638A 또는 EP-A-239400, 및 후속 문헌의 대부분 본문 내용].

또 다른 한편, CDR-유래된 서열을 수반하는 신규한 VH 또는 VL 영역은 하나 이상의 선별된 VH 및/또는 VL 유전자를 무작위로 돌연변이 유발시켜 전체 가변 도메인 내에 돌연변이를 생성시킴으로써 생성시킬 수 있다. 이러한 기술은 변이성 (error prone) PCR을 사용하는 것으로 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Gram et al., PNAS USA, 1992. 89, 3576-3580]. 사용될 수 있는 또 다른 방법은 VH 및 VL 유전자의 CDR 영역에 대한 돌연변이 유발을 지시하는 것이다. 이러한 기술은 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Barbas et al., PNAS USA 1994. 91, 3809-3813 and Schier et al., J. Mol. Biol. 1996. 263, 551-567].

항체는 수 많은 방식으로 변형될 수 있기 때문에, 용어 "항체"는 요구되는 특이성을 지닌 항원 결합성 도메인을 갖는 모든 특이적 결합 구성원 또는 물질을 포괄하는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 상기 용어는 항체 단편 및 유도체를 포괄하는데, 이에는 천연이든지 아니면 전체 또는 일부가 합성된 것이든지 간에 면역글로불린 결합성 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 포함된다. 따라서, 또 다른 폴리펩티드와 융합된, 면역글로불린 결합성 도메인 또는 등가물을 포함하는 키메라 분자가 포함된다. 키메라 항체의 클로닝과 발현이 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: EP-A-0120694 및 EP-A-0125023, 및 후속 문헌의 대부분 본문 내용].

항체 공학 분야에서 이용 가능한 추가의 기술로 인해, 인간 및 인간화 항체를 분리하는 것이 가능해졌다. 예를 들어, 인간 하이브리도마는 문헌 [참고: Kontermann et al., 2001; Antibody Engineering, Springer Laboratory Manuals]에 기재된 바와 같이 만들 수 있다. 특이적 결합 구성원을 생성시키기 위해 확립된 또 다른 기술인 파아지 디스플레이 (phage display)가 수 많은 공보에 상세히 기재되었다 [참고: Kontermann et al. (상기 참고) and W0 92/01047]. 마우스 면역계의 본래의 기타 성분들은 남겨두면서, 마우스 항체 유전자를 불활성화시키고 이를 인간 항체 유전자로 기능적으로 대체시킨 트랜스제닉 마우스를 사용하여 인간 항체 대 인간 항원을 분리시킬 수 있다. 돌연변이를 공지된 유전자 서열 내로 도입시키는 세포 무함유 번역 기술인 리보솜 디스플레이를 또한 사용하여 특이적 결합 구성원을 생성시키고/시키거나 최적화할 수 있다 [참고: Hanes and Pluckthun PNAS USA, 1994. 94, 4937-4942; He and Taussig Nucleic Acids Res. 1997. 25, 5132-5134; Schaffitzel et al., J. Immunol. Methods, 1999. 231, 119-135; He et al., J. Immunol. Methods, 1999. 231, 105-117; He et al., Methods Mol. Biol. 2004. 248, 177-189].

합성 항체 분자는, 예를 들어 문헌 [참고: Knappik et al., J. Mol. Biol. 2000. 296, 57-86 or Krebs et al., Journal of Immunological Methods 2001. 254, 67-84]에 기재된 바와 같이, 적합한 발현 벡터 내에서 합성되고 어셈블리된 올리고뉴클레오티드를 통하여 생성된 유전자로부터의 발현에 의해 창출될 수 있다.

완전한 항체의 단편이 결합성 항원 기능을 수행할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 결합성 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 또는 VL 도메인으로 이루어진 dAb 단편 [참고: Ward, E. S. et al., Nature, 1989. 341, 544-546; McCafferty et al., Nature, 1990. 348, 552-554; Holt et al., Trends Biotechnol. 2003. 21(11), 484-490]; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인과 VL 도메인이 서로 연합하여 항원 결합 부위를 형성할 수 있도록 해주는 펩티드 링커에 의해 연결되는 단일 쇄 Fv 분자 (scFv) [참고: Bird et al., Science, 1988. 242, 423-426; Huston et al., PNAS USA, 1988. 85, 5879-5883]; (viii) 이중-특이적 (bispecific) 단일 쇄 Fv 이량체 [참고: PCT/US92/09965] 및 (ix) 유전자 융합에 의해 구축된 "디아보디", 다가 또는 다중-특이적 단편이다 [참고: W094/13804; P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993. 90, 6444-6448]. Fv, scFv 또는 디아보디 분자는 VH 도메인과 VL 도메인을 연결하는 디설피드 가교를 혼입시킴으로써 안정화시킬 수 있다 [참고: Y. Reiter et al., Nature Biotech., 1996. 14, 1239-1245]. CH3 도메인과 연결된 scFv를 포함하는 미니보디 (minibody)를 만들 수도 있다 [참고: S. Hu et al., Cancer Res,, 1996. 56, 3055-3061].

이중-특이적 항체를 사용해야 하는 경우에는, 이들이 각종 방식으로 제작될 수 있는 [참고: Holliger and Winter Current Opinion Biotechnol. 1993. 4, 446-449], 예를 들어 화학적으로 제조되거나 하이브리드 하이브리도마로부터 제조될 수 있는 통상적인 이중-특이적 항체일 수 있거나, 또는 상기 언급된 이중-특이적 항체 단편 중 어느 것일 수도 있다. 이중-특이적 항체의 예에는 상이한 특이성을 지닌 두 항체의 결합성 도메인을 사용하고 이를 저분자 가요성 펩티드를 통하여 직접 연결시킬 수 있는 BiTE 기술의 항체가 포함된다. 이로써 두 항체가 저분자 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 조합된다. 디아보디 및 scFv는 단지 가변 도메인 만을 사용하여 Fc 영역 없이 구축할 수 있는데, 이는 잠재적으로 항-개체특이형(anti-idiotypic) 반응 효과를 저하시킬 수 있다.

이중-특이적 완전 항체와는 달리 이중-특이적 디아보디가 특히 유용할 수도 있는데, 이는 이들 디아보디가 이. 콜라이 (E. coli)에서 용이하게 구축 및 발현될 수 있기 때문이다. 적당한 결합 특이성의 디아보디 (및 기타 많은 폴리펩티드, 예를 들어 항체 단편)는 파아지 디스플레이를 사용하여 라이브러리로부터 용이하게 선별할 수 있다 [참고: WO 94/13804]. 디아보디의 하나의 암 (arm)이, 예를 들어 IL-13에 대항하여 유도된 특이성을 지니면서 일정하게 유지시켜야 하는 경우에는, 다른 암이 다양하고 적당한 특이성의 항체가 선별되는 라이브러리를 만들 수 있다. 이중-특이적 완전 항체는 크놉스-인투-홀스 (knobs-into-holes) 공학에 의해 만들 수 있다 [참고: Ridgeway et al., Protein Eng., 1996. 9, 616-621].

"IL-13 항체"에 관한 언급에는 WO 2005/007699의 실시예 2-10 및 25에 제시된 바와 같은 검정을 수행함으로써 500 nM 미만 농도에서 천연 발생적 IL-13을 중화시킬 수 있는 완전 항체 또는 항체 단편에 관한 언급이 포함된다는 것을 인지해야 할 것이다.

바람직하게, IL-13 항체는 BAK502G9 VH 도메인 (WO 2005/007699 중의 서열 15) 및 BAK502G9 VL 도메인 (WO 2005/007699 중의 서열 16)에 의해 형성된 IL-13 항원 결합 부위의 효력과 동등하거나 그 보다 더 우수한 효력을 지닌 천연 발생적 IL-13을 중화시킨다.

바람직하게, IL-13 항체는 모노클로날 IL-13 항체, 보다 바람직하게 인간 IL-13 모노클로날 항체이다.

특히 바람직한 IL-13 항체는 WO 2003/035847, WO 2003/086451, WO 2005/007699 또는 WO 2005/081873에 기재된 것 중에서 선택된 항체이다.

예를 들어, 한 가지 특히 바람직한 양태에서, IL-13 항체는 BAK278D6 HCDR1-3 및 LCDR1-3이다 (각각 WO 2005/007699 중의 서열 1 내지 6). BAK278D6 CDR 세트, BAK278D6 HCDR 세트 또는 BAK278D6 LCDR을 수반한 CDR 세트, 또는 그 내부에서의 1개 또는 2개 치환물이 BAK278D6 계통인 것으로 지칭된다.

추가의 특히 바람직한 양태에서, IL-13 항체는 BAK502G9 HCDR1-3 및 LCDR1-3이다 (각각 WO 2005/007699 중의 서열 7 내지 12).

추가의 특히 바람직한 양태에서, IL-13 항체는 BAK1111D10 HCDR1-3 및 LCDR1-3이다 (각각 WO 2005/007699 중의 서열 91 내지 96).

추가의 특히 바람직한 양태에서, IL-13 항체는 BAK1167F2 HCDR1-3 및 LCDR1-3이다 (각각 WO 2005/007699 중의 서열 61 내지 66).

추가의 특히 바람직한 양태에서, IL-13 항체는 BAK1183H4 HCDR1-3 및 LCDR1-3이다 (각각 WO 2005/007699 중의 서열 97 내지 102).

관련 CDR 세트는 항체 골격 영역 또는 기타 단백질 스캐폴드, 예를 들어 피브로넥틴 또는 시토크롬 B 내에 제공된다 [참고: Koide et al., J. Mol. Biol. 1998. 284, 1141-1151; Nygren et al., Current Opinion in Structural Biology, 1997. 7, 463-469]. 바람직하게 항체 골격 영역이 이용되고, 이들 영역이 이용되는 경우, 이들은 바람직하게 생식세포계이며, 보다 바람직하게 중쇄에 대한 항체 골격 영역은 VH1 계열로부터의 DP14일 수 있다. 경쇄에 대한 바람직한 골격 영역은 λ3-3H일 수 있다. BAK502G9 CDR 세트의 경우에는, 항체 골격 영역이 VH FR1 -3, (각각 WO 2005/007699 중의 서열 27 내지 29), 및 경쇄 FR1-3 (각각 WO 2005/007699 중의 서열 30 내지 32)에 대해서인 것이 바람직하다. 바람직한 양태에서, VH 도메인은 WO 2005/007699 중의 서열 15의 아미노산 서열에 제공되는데, 이는 "BAK502G9 VH 도메인"으로 명명된다. 고도로 바람직한 추가의 양태에서, VL 도메인은 WO 2005/007699 중의 서열 16의 아미노산 서열에 제공되는데, 이는 "BAK502G9 VL 도메인"으로 명명된다.

바람직한 양태에서는, IL-13 항체가 시노몰로구스 (cynomologous) IL-13 및/또는 IL-13 변이체 Q130R과 교차 반응한다.

바람직하게, IL-13 항체는 제약 조성물 내에 1 내지 200 mg/ml, 보다 바람직하게 50 내지 100 mg/ml, 특히 50 mg/ml의 양으로 존재한다.

바람직하게, 제약 조성물은 pH 5.2 내지 5.7, 보다 바람직하게 5.5 ± 0.1로 완충된다. 이러한 pH의 선택은 제약 조성물에 상당한 안정성을 부여해 준다. 이러한 범위의 pH를 제어하는 또 다른 완충제의 예에는 석시네이트, 글루코네이트, 히스티딘, 시트레이트, 포스페이트, 글루타르산, 카코딜리트, 나트륨 수소 말레에이트, 트리스-(히드록실메틸)아미노메탄 (트리스), 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 (MES), 이미다졸 및 기타 유기 산 완충제가 포함된다.

바람직하게, 완충제는 아세테이트 완충제, 보다 바람직하게 나트륨 아세테이트이다.

바람직하게, 아세테이트 완충제는 제약 조성물 내에 1 내지 10O mM, 보다 바람직하게 30 내지 7O mM, 특히 5O mM의 양으로 존재한다.

"제약상 허용가능한 부형제"에 관한 언급에는 제약 조성물에 통상적으로 사용되고 있는 모든 부형제에 관한 언급이 포함된다는 것을 인지해야 할 것이다. 이러한 부형제에는 전형적으로, 하나 이상의 계면활성제, 무기 또는 유기 염, 안정화제, 희석제, 가용화제, 환원제, 항산화제, 킬레이트제, 방부제 등이 포함될 수 있다.

전형적인 계면활성제의 예에는 다음이 포함된다: 비이온성 계면활성제 (HLB 6 내지 18), 예를 들어 솔비탄 지방산 에스테르 (예: 솔비탄 모노카프릴레이트, 솔비탄 모노라우레이트, 솔비탄 모노팔미테이트), 글리세린 지방산 에스테르 (예: 글리세린 모노카프릴레이트, 글리세린 모노미리스테이트, 글리세린 모노스테아레이트), 폴리글리세린 지방산 에스테르 (예: 데카글리세릴 모노스테아레이트, 데카글리세릴 디스테아레이트, 데카글리세릴 모노리놀레이트), 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르 (예: 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 트리올레에이트, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 트리스테아레이트), 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르 (예: 폴리옥시에틸렌 솔비탄 테트라스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 테트라올레에이트), 폴리옥시에틸렌 글리세린 지방산 에스테르 (예: 폴리옥시에틸렌 글리세릴 모노스테아레이트), 폴리에틸렌 글리콜 지방산 에스테르 (예: 폴리에틸렌 글리콜 디스테아레이트), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 (예: 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르), 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬 에테르 (예: 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜 에테르, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 프로필 에테르, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 세틸 에테르), 폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르 (예: 폴리옥시에틸렌 노닐페닐 에테르), 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 (예: 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유), 폴리옥시에틸렌 밀랍 유도체 (예: 폴리옥시에틸렌 솔비톨 밀랍), 폴리옥시에틸렌 라놀린 유도체 (예: 폴리옥시에틸렌 라놀린), 및 폴리옥시에틸렌 지방산 아미드 (예: 폴리옥시에틸렌 스테아릴 아미드); 음이온성 계면활성제, 예를 들어 C₁₀-C₁₈ 알킬 설페이트 염 (예: 나트륨 세틸 설페이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 올레일 설페이트), 평균 2 내지 4 몰의 에틸렌 옥사이드를 수반한 폴리옥시에틸렌 C₁₀-C₁₈ 알킬 에테르 설페이트 염 (예: 나트륨 폴리옥시에틸렌 라우릴 설페이트), 및 C₈-C₁₈ 알킬 설포석시네이트 에스테르 염 (예: 나트륨 라우릴 설포석시네이트 에스테르); 및 천연 계면활성제, 예를 들어 레시틴, 글리세로포스포리피드, 스핑고포스포리피드 (예: 스핑고미엘린), 및 C₁₂-C₁₈ 지방산의 슈크로스 에스테르.

바람직하게, 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르 중에서 선택된다. 특히 바람직하게, 계면활성제는 폴리솔베이트 (Polysorbate) 20, 21, 40, 60, 65, 80, 81 및 85, 가장 바람직하게 20 및 80, 특히 폴리솔베이트 80이다.

바람직하게, 계면활성제는 제약 조성물 내에 0.001 내지 0.1％ (w/w), 보다 바람직하게 0.005 내지 0.05％ (w/w), 특히 0.01％ (w/w)의 양으로 존재한다.

전형적인 무기 염의 예에는 다음이 포함된다: 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 인산나트륨, 황산나트륨, 황산암모늄, 인산칼륨 및 중탄산나트륨, 또는 기타 모든 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염. 바람직하게, 무기 염은 염화나트륨이다.

바람직하게, 무기 염은 제약 조성물 내에 10 내지 20O mM, 보다 바람직하게 60 내지 13O mM, 특히 85 mM의 양으로 존재한다.

환원제의 예에는 N-아세틸시스테인, N-아세틸호모시스테인, 티옥트산, 티오디글리콜, 티오에탄올아민, 티오글리세롤, 티오솔비톨, 티오글리콜산 및 그의 염, 나트륨 티오설페이트, 글루타치온, 및 C1-C7 티오알카노산이 포함된다.

항산화제의 예에는 에리소르빈산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, 알파-토코페롤, 토코페롤 아세테이트, L-아스코르브산 및 그의 염, L-아스코르브산 팔미테이트, L-아스코르브산 스테아레이트, 중아황산나트륨, 아황산나트륨, 트리아밀 갈레이트 및 프로필 갈레이트가 포함된다.

킬레이트제의 예에는 이나트륨 에틸렌디아민테트라아세테이트 (EDTA), 나트륨 피로포스페이트 및 나트륨 메타포스페이트가 포함된다.

안정화제의 예에는 크레아티닌; 히스티딘, 알라닌, 글루탐산, 글리신, 루이신, 페닐알라닌, 메티오닌, 이소루이신, 프롤린, 아스파르트산, 아르기닌, 리신 및 트레오닌 중에서 선택된 아미노산; 슈크로스, 트레할로스, 솔비톨, 크실리톨 및 만노스 중에서 선택된 탄수화물; 폴리에틸렌 글리콜 (PEG; 예를 들어, PEG3350 또는 PEG4000) 또는 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르 (예: 폴리솔베이트 20 또는 폴리솔베이트 80) 중에서 선택된 계면활성제; 또는 그의 모든 조합물이 포함된다.

한 가지 바람직한 양태에서, 안정화제는 전술된 바와 같은 단일 탄수화물 (예: 트레할로스)을 포함한다.

또 다르게 바람직한 양태에서는, 안정화제가 아미노산을 탄수화물과 조합하여 포함한다 (예를 들어, 트레할로스와 알라닌 또는 트레할로스, 알라닌과 글리신).

추가의 또 다르게 바람직한 양태에서는, 안정화제가 아미노산을 탄수화물 및 계면활성제와 조합하여 포함한다 (예를 들어, 트레할로스, 알라닌과 PEG3350 또는 트레할로스, 프롤린과 PEG3350 또는 트레할로스, 알라닌과 폴리솔베이트 80 또는 트레할로스, 프롤린과 폴리솔베이트 80 또는 트레할로스, 알라닌, 글리신과 PEG3350 또는 트레할로스, 알라닌, 글리신과 폴리솔베이트 80).

추가의 또 다르게 바람직한 양태에서는, 안정화제가 아미노산을 계면활성제와 조합하여 포함한다 (예를 들어, 알라닌과 PEG3350 또는 알라닌, 글리신과 PEG3350).

추가의 또 다르게 바람직한 양태에서는, 안정화제가 탄수화물을 계면활성제와 조합하여 포함한다 (예를 들어, 트레할로스와 PEG3350 또는 트레할로스와 폴리솔베이트 80).

방부제의 예에는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드 (알킬 기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물), 벤제토늄 클로라이드, 방향족 알코올, 예를 들어 페놀, 부틸 및 벤질 알코올, 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 시클로헥사놀, 3-펜타놀, 및 m-크레솔이 포함된다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 제약 조성물은 아세테이트 완충제를 이용하여 pH 5.5 ± 0.1로 완충시킨 무기 염, 계면활성제 및 IL-13 항체를 포함한다.

본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 제약 조성물은 나트륨 아세테이트 완충제를 이용하여 pH 5.5 ± 0.1로 완충시킨 폴리솔베이트 80, 염화나트륨 및 IL-13 항체를 포함한다.

본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 제약 조성물은 50 mM 나트륨 아세테이트 완충제를 이용하여 pH 5.5 ± 0.1로 완충시킨 0.01％ (w/w) 폴리솔베이트 80, 85 mM 염화나트륨 및 50 mg/ml의 IL-13 항체를 포함한다.

본 발명의 제2 국면에 따르면, 하나 이상의 크로마토그래피 분리 단계를 포함하는 IL-13 항체의 정제 방법이 제공되는데, 상기 분리 단계 각각은 아세테이트 완충제를 이용하여 pH 3.5 내지 7.0으로 완충시킨 하나 이상의 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 용출 완충액으로의 용출을 포함한다.

바람직하게, 하나 이상의 크로마토그래피 분리 단계는 친화성 크로마토그래피 (예: 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피 (예: 양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피), 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (예: 페닐 크로마토그래피), 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피, 친수성 상호 작용 크로마토그래피, 친황성 흡착 크로마토그래피, 에우글로불린 흡착 크로마토그래피, 염료 리간드 크로마토그래피 또는 고정화 붕산염 크로마토그래피 중에서 선택된다. 가장 바람직하게, 크로마토그래피 분리는 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 이어서 양이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어, SP-세파로스 매트릭스를 사용함)에 이어서 음이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어, Q-세파로스 매트릭스를 사용함)하여 수행한다.

바람직하게, 하나 이상의 제약상 허용가능한 부형제는 염화나트륨과 같은 무기 염을 포함한다.

바람직하게, 무기 염은 용출 완충액 내에 10 내지 20O mM, 보다 바람직하게 60 내지 13O mM, 특히 85 mM의 양으로 존재한다.

3.5 내지 7.0 범위의 pH를 제어하는 또 다른 완충제의 예에는 석시네이트, 글루코네이트, 히스티딘, 시트레이트, 포스페이트 및 기타 유기 산 완충제가 포함된다.

바람직하게, 아세테이트 완충제는 용출 완충액 내에 1 내지 10O mM, 보다 바람직하게 30 내지 7O mM, 특히 50 mM의 양으로 존재한다.

가장 바람직하게, 용출 완충액은 pH 5.5 ± 0.1로 완충시킨 85 mM 염화나트륨 및 50 mM 나트륨 아세테이트를 포함한다.

본 발명의 모든 IL-13 항체 (예를 들어, CDR 또는 CDR 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원 결합 부위 또는 항체 분자, 예를 들어 제공된 바와 같은 scFv 또는 IgG4)를 코딩하는 핵산은 이러한 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 적당한 조건 하에 배양함으로써 발현시킬 수 있다. 발현에 의한 생성을 수행한 후, VH 또는 VL 도메인, 또는 특이적 결합 구성원을 적합한 모든 기술을 사용하여 분리 및/또는 정제한 다음, 적당히 사용할 수 있다.

특이적 결합 구성원, VH 및/또는 VL 도메인, 및 코딩 핵산 분자 및 벡터는, 예를 들어 그들의 천연 환경으로부터 분리 및/또는 정제된 형태로, 실질적으로 순수하거나 균질한 형태로, 또는 핵산의 경우에는 요구되는 기능을 수반한 폴리펩티드를 코딩하는 서열 이외의 유전자 기원이나 핵산이 없거나 실질적으로 없도록 제공될 수 있다. 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고, 전체 또는 일부가 합성된 것일 수 있다.

본원에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열에 관한 언급은 지정된 서열을 수반한 DNA 분자를 포괄하고, 지정된 서열을 수반한 RNA 분자를 포괄하는데, 여기서는 달리 요구되지 않는 한 T가 U로 대체된다.

각종 상이한 숙주 세포에서 폴리펩티드를 클로닝 및 발현하기 위한 시스템은 널리 공지되어 있다. 적합한 숙주 세포에는 세균, 포유류 세포, 식물 세포, 효모 및 바쿨로바이러스 (baculovirus) 시스템 및 트랜스제닉 식물 및 동물이 포함된다.

이종 폴리펩티드를 발현하기 위해 당해 분야에서 이용 가능한 포유류 세포주에는 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 세포, NS0 마우스 흑색종 세포, YB2/0 랫트 골수종 세포, 인간 배아 신장 세포, 인간 배아 망막 세포 등이 포함된다.

바람직하게, 상기 포유류 세포주는 골수종 세포 배양물, 예를 들어 NS0 세포이다 [참고: Galfre and Milstein Methods Enzymology, 1981. 73, 3]. 골수종 세포는 형질세포종 세포, 즉 림프계 세포 계통의 세포이다. 예시되는 NS0 세포주는, 예를 들어 다음 공급처 [the European Collection of Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, United Kingdom]로부터 자유로이 입수 가능한 세포주 ECACC No. 85110503이다. NS0는 특히 재조합 항체를 생성시키기 위해 사용되는 경우에, 극도로 높은 생성물 수율을 가져다 줄 수 있는 것으로 밝혀졌다.

또 다르게 바람직한 포유류 세포주는 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 이들은 디히드로폴레이트 리덕타제 (dhfr) 결핍성이므로, 성장을 위해 티미딘과 히포크산틴에 좌우될 수 있다 [참고: PNAS, 1990. 77, 4216-4220]. 모 dhfr CHO 세포주는 dhfr 양성 표현형의 CHO 세포 형질전환체를 선별할 수 있게 해주는 dhfr 유전자 및 항체 유전자를 이용하여 형질감염시킨다. 선별은 티미딘과 히포크산틴이 결여된 배지 상에서 해당 집락을 배양함으로써 수행하는데, 이들이 부재하면 형질전환되지 않은 세포는 성장하지 못하고 형질전환된 세포는 폴레이트 경로를 재구제(resalvage)하지 못함으로써, 선별 시스템을 우회한다. 이들 형질전환체는 통상적으로, 형질감염된 양 유전자의 공동-통합을 통하여 저 수준의 생성물 유전자를 발현한다. 항체 유전자의 발현 수준은 메토트렉세이트 (MTX)를 이용한 증폭에 의해 증가시킬 수 있다. 이 약물은 dhfr 효소의 직접적인 억제제이고, 이들 조건 하에 생존하기에 충분한 정도로 그의 dhfr 유전자 카피 수를 증폭시켜 주는 내성 집락을 분리시켜 준다. dhfr과 항체 유전자는 본래의 형질전환체에서 보다 밀접하게 연결되기 때문에, 통상적으로 증폭이 동시에 일어나므로, 목적하는 항체 유전자의 발현이 증가된다.

CHO 또는 골수종 세포와 함께 사용하기 위한 또 다른 선별 시스템은 WO 87/04462에 기재된 글루타민 합성효소 (GS) 증폭 시스템이다. 이러한 시스템은 특정 세포를, GS 효소를 코딩하는 유전자 및 목적하는 항체 유전자로 형질감염시키는 것을 포함한다. 이어서, 글루타민 무함유 배지에서 성장하는 세포를 선별한다. 그 다음, 이들 선별된 클론을 대상으로 하여, 메티오닌 설폭시민 (MSX)을 사용하여 GS 효소를 억제시킨다. 세포가 생존하기 위해서는, 항체를 코딩하는 유전자를 동시에 증폭시키면서 GS 유전자를 증폭시킬 것이다.

항체 또는 항체 단편을 원핵 세포, 예를 들어 이. 콜라이에서 발현시키는 것은 당해 분야에 널리 확립되어 있다 [참고: 예를 들어, Pluckthun, A. Bio/Technology 1991. 9, 545-551]. 특이적 결합 구성원을 생성하기 위한 한 가지 선택 사항으로서, 배양 중인 진핵 세포에서 발현시키는 것이 당업자에게 또한 이용 가능하다 [참고: Chadd, H. E. and Chamow, S. M., Current Opinion in Biotechnology 2001. 12, 188-194; Andersen, D. C. and Krummen, L. Current Opinion in Biotechnology 2002. 13, 117; Larrick, J. W. and Thomas, D. W. Current opinion in Biotechnology 2001. 12, 411-418].

적당한 조절성 서열, 예를 들어 프로모터 서열, 종결인자 서열, 폴리아데닐화 서열, 증강인자 서열, 마커 유전자 및 적당한 기타 서열을 함유하는 적합한 벡터를 선택하거나 구축할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스성, 예를 들어 적당한 파아지 또는 파아지미드일 수 있다. 추가의 상세 내역에 관해서는, 예를 들어 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Molecular Cloning : a Laboratory Manual: 3rd edition, Sambrook and Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press]. 예를 들어, 핵산 구조물을 제조하는데 있어서의 핵산 조작, 돌연변이 유발, 서열 분석, 세포 내로의 DNA 도입 및 유전자 발현, 및 단백질 분석하기 위한 많은 공지된 기술 및 프로토콜은 다음 문헌에 상세히 기재되어 있다 [참고: Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1988, Short Protocols in Molecular Biology. A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 4th edition 1999; 이들 문헌은 본원에 참고로 도입된다].

핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 것은 이용 가능한 어떠한 기술을 이용할 수도 있다. 진핵 세포의 경우에 적합한 기술에는 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포솜-매개된 형질감염, 및 레트로바이러스 또는 기타 바이러스, 예를 들어 백시니아 또는 곤충 세포의 경우에는, 바쿨로바이러스를 사용한 형질도입이 포함될 수 있다. 핵산을 숙주 세포, 특히 진핵 세포에 도입하는 것은 바이러스성 또는 플라스미드에 의거한 시스템을 이용할 수 있다. 플라스미드 시스템은 에피솜적으로 유지할 수 있거나, 또는 숙주 세포 내로 또는 인공 염색체 내로 혼입시킬 수 있다 [참고: Csonka, E. et al., Journal of Cell Science, 200. 113, 3207-3216; Vanderbyl, S. et al., Molecular Therapy, 2002. 5 (5), 10]. 혼입은 단일 또는 다중 유전자 자리에서 1개 이상의 카피를 무작위로 또는 표적화 통합시킴으로써 수행될 수 있다. 세균성 세포의 경우에 적합한 기술에는 염화칼슘 형질전환, 전기천공 및 박테리오파아지를 이용한 감염이 포함될 수 있다.

도입에 이어서, 예를 들어 숙주 세포를 유전자 발현을 위한 조건 하에 배양함으로써 핵산으로부터의 발현을 유발시키거나 허용할 수 있다.

한 양태에서는, 본 발명의 핵산을 숙주 세포의 게놈 (예: 염색체) 내로 통합시킨다.

통합은 표준 기술에 따라서, 게놈과의 재조합을 증진시켜 주는 서열을 봉입시킴으로써 증진시킬 수 있다.

본 발명의 제3 국면에 따르면, IL-13 관련 장애를 치료하기 위한 약물을 제조하는데 있어서의, 본원에 규정된 바와 같은 항체 제약 조성물의 용도가 제공된다.

바람직하게, IL-13 관련 장애는 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 피부 경화증, 염증성 장 질환 및 호지킨 림프종 중에서 선택된다. 본 발명의 조성물은 종양 및 바이러스성 감염증을 치료하는데 사용할 수도 있는데, 이는 IL-13 항체가 IL-13 매개된 면역억제를 억제시킬 것이기 때문이다. 가장 바람직하게, IL-13 관련 장애는 천식이다.

본 발명은 추가로, 치료적 유효량의 본원에 규정된 바와 같은 항체 제약 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, IL-13 관련 장애의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로, IL-13 관련 장애를 치료하는데 사용하기 위한, 본원에 규정된 바와 같은 항체 제약 조성물을 제공한다.

본 발명의 제약 조성물은 액상 제제 또는 동결건조형 제제 (이는 사용 전에 재구성된다)일 수 있다. 동결건조형 제제에 대한 부형제로서, 예를 들어 당 알코올 또는 당류 (예: 만니톨 또는 글루코스)를 사용할 수 있다. 액상 제제의 경우, 본 발명의 제약 조성물은 통상적으로, 규정된 용적의 용기 형태, 예를 들어 밀봉되고 멸균된 플라스틱 또는 유리 바이알, 앰풀 및 주사기 형태 뿐만 아니라 병과 같은 대용량 용기 형태에 제공된다. 바람직하게, 본 발명의 조성물은 액상 제제이다.

본 발명의 제약 조성물은 경구, 주사 (예를 들어, 피하, 정맥내, 복강내 또는 근육내), 흡입, 또는 국소 (예를 들어, 안내, 비내, 직장, 상처 내로, 피부 상으로) 투여할 수 있다. 투여 경로는 치료의 물리화학적 특징, 질병에 관한 특수 고려 사항, 또는 효능을 최적화하거나 부작용을 최소화하기 위한 요구 사항에 의해 결정될 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 조성물은 피하 주사하여 투여한다. 치료가 임상에 사용되는 것으로만 제한되지 않을 것으로 고려된다. 따라서, 바늘이 없는 장치를 이용한 피하 주사가 바람직할 수도 있다.

본 발명에 따라서, 제공된 조성물은 개개인에게 투여할 수 있다. 투여는 "치료적 유효량"으로 하는 것이 바람직한데, 이는 환자에게 혜택을 제공하기에 충분한 양이다. 이러한 혜택은 적어도 한 가지 이상 증상의 개선일 수 있다. 투여된 실제량, 및 투여 속도 및 투여 시간은 치료받는 질병의 종류와 중증도에 좌우될 것이다. 치료 처방, 예를 들어 투여량에 관한 결정 등은 일반 시술자 및 기타 의사의 책임 내이다. 적당한 항체 용량은 당해 분야에 널리 공지되어 있다 [참고: Ledermann, J. A. et al., Int. J. Cancer, 1999. 47, 659-664; Bagshawe, K. D. et al., Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, 1991. 4, 915-922].

정확한 용량은 수 많은 요인들, 예를 들어 치료받고자 하는 부위의 크기와 위치, 항체의 정확한 특성 (예를 들어, 완전 항체, 단편 또는 디아보디), 및 항체에 부착된 탐지 가능한 표지 또는 기타 분자의 종류에 좌우될 것이다. 전형적인 항체 용량은 전신 투여의 경우에는 1OO pg 내지 1O g이고, 국소 투여의 경우에는 1 ㎍ 내지 1OO mg의 범위일 것이다.

전형적으로, 항체는 완전 항체, 바람직하게 IgG4 이소형일 것이다.

성인 환자의 1회 치료 용량을 소아 및 유아용에 맞게 조정할 수 있고, 또한 분자량에 비례하여 기타 항체 포맷에 맞도록 조정할 수 있다. 치료는 의사의 판단 하에 매일, 1주에 2회, 매주 또는 매달 간격으로 반복할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서는, 치료가 주기적이고 투여 사이의 주기는 약 2주 이상, 바람직하게 약 3주 이상, 보다 바람직하게 약 4주 이상, 또는 1개월에 1회이다.

도 1은 본 발명의 조성물을 대상으로 한 28일 안정성 평가 1일째의 샘플의 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다.

도 2는 본 발명의 조성물을 대상으로 한 28일 안정성 평가 21일째의 샘플의 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다.

도 3은 본 발명의 조성물을 대상으로 한 28일 안정성 평가 1일째의 샘플의 GP-HPLC 분석 결과를 도시한 것이다.

도 4는 2 내지 8℃ 하에 본 발명의 조성물을 대상으로 한 28일 안정성 평가 동안 샘플의 GP-HPLC 분석으로부터 수득한 결과의 혼합을 도시한 것이다.

도 5는 25℃ 하에 본 발명의 조성물을 대상으로 한 28일 안정성 평가 동안 샘플의 GP-HPLC 분석으로부터 수득한 결과의 혼합을 도시한 것이다.

도 6은 상이한 완충제로 중화시킨 경우에 본 발명의 조성물을 대상으로 한 28일 안정성 평가 동안 샘플의 GP-HPLC 분석으로부터 수득한 결과의 혼합을 도시한 것이다.

도 7은 본 발명의 조성물을 대상으로 한 28일 안정성 평가 28일째의 샘플의 IEF 분석 결과를 도시한 것이다.

도 8은 -70℃ 하에 저장한 상이한 제제를 대상으로 한 12개월 안정성 평가의 겔 여과 HPLC 분석 결과를 도시한 것이다.

도 9는 +5℃ 하에 저장한 상이한 제제를 대상으로 한 12개월 안정성 평가의 겔 여과 HPLC 분석 결과를 도시한 것이다.

도 10은 +25℃ 하에 저장한 상이한 제제를 대상으로 한 12개월 안정성 평가의 겔 여과 HPLC 분석 결과를 도시한 것이다.

도 11은 +37℃ 하에 저장한 상이한 제제를 대상으로 한 8주 안정성 평가의 겔 여과 HPLC 분석 결과를 도시한 것이다.

도 12는 +45℃ 하에 저장한 상이한 제제를 대상으로 한 5일 안정성 평가의 겔 여과 HPLC 분석 결과를 도시한 것이다.

도 13은 -70℃ 하에 저장한 경우에 상이한 제제를 대상으로 한 12개월 안정성 평가 동안 0, 6 및 12개월째의 환원 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다.

도 14는 -70℃ 하에 저장한 경우에 도 13에서의 환원 SDS-PAGE 분석을 수행 한 후 BAK502G9 중쇄 및 경쇄의 존재비 (％)를 도시한 것이다.

도 15는 +5℃ 하에 저장한 경우에 상이한 제제의 12개월 안정성 평가 동안 0, 6 및 12개월째의 환원 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다.

도 16은 +5℃ 하에 저장한 경우에 도 15에서의 환원 SDS-PAGE 분석을 수행한 후 BAK502G9 중쇄 및 경쇄의 존재비 (％)를 도시한 것이다.

도 17은 +25℃ 하에 저장한 경우에 상이한 제제를 대상으로 한 12개월 안정성 평가 동안 0, 6 및 12개월째의 환원 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다.

도 18은 +25℃ 하에 저장한 경우에 도 17에서의 환원 SDS-PAGE 분석을 수행한 후 BAK502G9 중쇄 및 경쇄의 존재비 (％)를 도시한 것이다.

도 19는 +37℃ 하에 저장한 경우에 상이한 제제를 대상으로 한 8주 안정성 평가 동안 0 및 8주째의 환원 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다.

도 20은 +37℃ 하에 저장한 경우에 도 19에서의 환원 SDS-PAGE 분석을 수행한 후 BAK502G9 중쇄 및 경쇄의 존재비 (％)를 도시한 것이다.

도 21은 +45℃ 하에 저장한 경우에 상이한 제제를 대상으로 한 5일 안정성 평가 동안 0 및 5일째의 환원 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다.

도 22는 +45℃ 하에 저장한 경우에 도 21에서의 환원 SDS-PAGE 분석을 수행한 후 BAK502G9 중쇄 및 경쇄의 존재비 (％)를 도시한 것이다.

도 23은 -70℃ 하에 저장한 경우에 상이한 제제를 대상으로 한 12개월 안정성 평가 동안 0, 6 및 12개월째의 비-환원 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다.

도 24는 -70℃ 하에 저장한 경우에 도 23에서의 비-환원 SDS-PAGE 분석을 수 행한 후 본래의 BAK502G9 단량체의 존재비 (％)를 도시한 것이다.

도 25는 +5℃ 하에 저장한 경우에 상이한 제제를 대상으로 한 12개월 안정성 평가 동안 0, 6 및 12개월째의 비-환원 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다.

도 26은 +5℃ 하에 저장한 경우에 도 25에서의 비-환원 SDS-PAGE 분석을 수행한 후 본래의 BAK502G9 단량체의 존재비 (％)를 도시한 것이다.

도 27은 +25℃ 하에 저장한 경우에 상이한 제제를 대상으로 한 12개월 안정성 평가 동안 0, 6 및 12개월째의 비-환원 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다.

도 28은 +25℃ 하에 저장한 경우에 도 27에서의 비-환원 SDS-PAGE 분석을 수행한 후 본래의 BAK502G9 단량체의 존재비 (％)를 도시한 것이다.

도 29는 +37℃ 하에 저장한 경우에 상이한 제제를 대상으로 한 8주 안정성 평가 동안 0 및 8주째의 비-환원 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다.

도 30은 +37℃ 하에 저장한 경우에 도 29에서의 비-환원 SDS-PAGE 분석을 수행한 후 본래의 BAK502G9 단량체의 존재비 (％)를 도시한 것이다.

도 31은 +45℃ 하에 저장한 경우에 상이한 제제를 대상으로 한 5일 안정성 평가 동안 0 및 5일째의 비-환원 SDS-PAGE 분석 결과를 도시한 것이다.

도 32는 +45℃ 하에 저장한 경우에 도 31에서의 비-환원 SDS-PAGE 분석을 수행한 후 본래의 BAK502G9 단량체의 존재비 (％)를 도시한 것이다.

본 발명은 다음 방법 및 실시예를 참고로 하여 예시될 것이지만, 이로써 제한되지 않는다.

실시예 1: BAK502G9의 발현

BAK502G9는 WO 87/04462 및 WO 2004/076485에 기재된 과정과 유사한 방식으로 GS NS0 세포에서 발현시켰고, 598 mg/l BAK502G9 항체를 함유하는 배양 상등액을 수득하였다.

실시예 2: BAK502G9의 정제

(a) rmp 단백질 A 세파로스 정제

rmp 단백질 A 세파로스 고속 유동 크로마토그래피 단계에 사용된 칼럼은 직경이 2.6 cm으로, 0.9％ w/v 염화나트륨에 상 높이 14.5 cm로 패킹되어 칼럼 용적 77 ml을 제공하였다. 수지의 출처는 다음과 같다 [GE Healthcare / Amersham Biosciences 17-5138]. 아머샴 바이오사이언스 (Amersham Biosciences) P-50 펌프, UVl 탐지기 및 플로 셀을 사용하여 크로마토그래피를 수행하였다. 칼럼을 사용하기에 앞서 6M 구아니딘 히드로클로라이드로 세정하였다.

연속해서, rmp 단백질 A 세파로스 고속 유동 칼럼을 물 세척과 세정 후에 350 ml 인산염 완충 식염수 pH 7.2로 평형시켰다. 2.6 ℓ 배양 상등액을 실온 하에 시간당 200 cm으로 칼럼 상에 직접 부하하였다.

이어서, 칼럼을 567 ml 인산염 완충 식염수 pH 7.2로 세척한 다음, 568 ml 5O mM 나트륨 아세테이트 pH 5.55로 세척하였다. BAK502G9 항체를 380 ml 5O mM 나트륨 아세테이트 pH 3.75로 세척함으로써 상기 칼럼으로부터 용출시켰다. 용출시킨 후, 칼럼을 5O mM 아세트산 pH 3.0으로 세척하였다. 피크의 하부 기울기와 상부 기울기 상의 2％ 최대 UV 편향 사이에서 용출 피크를 수집하였다. 1.5 g BAK502G9 항체를 217 ml로 회수하였다.

(b) 저 pH 바이러스 불활성화

173 ml 10O mM 아세트산을 사용하여 rmp 단백질 A 세파로스 고속 유동 용출액의 pH를 3.70으로 조정하였다. 이어서, 이와 같이 조정한 용출액을 바이러스 불활성화를 위해 60분 동안 유지시켰다. 이 후, 조정된 용출액을 437 ml 5O mM 수산화나트륨으로 중화시켜 pH 5.50이 되도록 하고, 밀리포어 스테리컵 (Millipore stericup) (제품 번호 SCGPU11RE)을 사용하여 0.22 ㎛ 여과시켰다. 1.4 g BAK502G9 항체를 823 ml로 회수하였다.

(c) SP 세파로스 정제

SP 세파로스 고속 유동 크로마토그래피 단계에 사용된 칼럼은 직경이 1.6 cm으로, 인산염 완충 식염수 pH 7.2에 상 높이 15.5 cm로 패킹되어 칼럼 용적 31 ml을 제공하였다. 수지의 출처는 다음과 같다 [GE Healthcare / Amersham Biosciences 17-0729]. 아머샴 바이오사이언스 P-50 펌프, UVl 탐지기 및 플로 셀을 사용하여 크로마토그래피를 수행하였다. 칼럼을 사용하기에 앞서 0.5 M 수산화나트륨으로 세정하였다.

연속해서, SP 세파로스 고속 유동 칼럼을 물 세척과 세정 후에 145 ml 50 mM 나트륨 아세테이트 pH 5.50로 평형시켰다.

중화시킨 rmp 단백질 A 용출액으로서 400 ml BAK502G9 항체를 실온 하에 시간당 200 cm으로 칼럼 상에 직접 부하하였다.

이어서, 칼럼을 302 ml 50 mM 나트륨 아세테이트 + 30 mM 염화나트륨 pH 5.50으로 세척하였다.

BAK502G9 항체를 150 ml 50 mM 나트륨 아세테이트 + 85 mM 염화나트륨 pH 5.50으로 세척함으로써 상기 칼럼으로부터 용출시켰다. 용출시킨 후, 칼럼을 50 mM 나트륨 아세테이트 + 2 M 염화나트륨 pH 5.50으로 세척하였다.

피크의 상부 기울기 상의 2％ 최대 UV 편향과 피크의 하부 기울기 상의 30％ 사이에서 용출 피크를 수집하였다. 밀리포어 스테리플립 (steriflip) (제품 번호 SCGPOO525)을 사용하여 용출액을 0.22 ㎛ 여과시켰다. 0.67 g BAK502G9 항체를 54 ml로 회수하였다.

중화시킨 rmp 단백질 A 용출액으로서 나머지 392 ml BAK502G9 항체를 사용하여 상기 공정 단계를 반복하였다. 추가의 0.67 g BAK502G9 항체를 54 ml로 회수하였다. 다음 단계에 앞서, 상기 2개의 여과된 SP 세파로스 용출액을 모았다.

(d) Q 세파로스 고속 유동 크로마토그래피

Q 세파로스 고속 유동 크로마토그래피 단계에 사용된 칼럼은 직경이 1.6 cm으로, 인산염 완충 식염수 pH 7.2에 상 높이 13.3 cm로 패킹되어 칼럼 용적 27 ml을 제공하였다. 수지의 출처는 다음과 같다 [GE Healthcare / Amersham Biosciences 17-0510]. 아머샴 바이오사이언스 P-50 펌프, UVl 탐지기 및 플로 셀을 사용하여 크로마토그래피를 수행하였다. 칼럼을 사용하기에 앞서 0.5 M 수산화나트륨으로 세정하였다.

연속해서, Q 세파로스 고속 유동 칼럼을 물 세척과 세정 후에 138 ml 50 mM 나트륨 아세테이트 + 85 mM 염화나트륨 pH 5.50으로 평형시켰다.

SP 세파로스 용출액으로서 44 ml BAK502G9 항체를 실온 하에 시간당 200 cm으로 칼럼 상에 직접 부하하였다.

이어서, 칼럼을 124 ml 50 mM 나트륨 아세테이트 + 85 mM 염화나트륨 pH 5.50으로 세척함으로써, BAK502G9 항체의 동용매 용출을 수행하였다. 용출시킨 후, 칼럼을 50 mM 나트륨 아세테이트 + 2 M 염화나트륨 pH 5.50으로 세척하였다.

피크의 상부 기울기 상의 2％ 최대 UV 편향과 피크의 하부 기울기 상의 2％ 사이에서 용출 피크를 수집하였다. 밀리포어 스테리컵 (제품 번호 SCGPU01RE)을 사용하여 용출액을 0.22 ㎛ 여과시켰다. 0.52 g BAK502G9 항체를 88 ml로 회수하였다. SP 세파로스 용출액으로서 나머지 44 ml BAK502G9 항체를 사용하여 상기 공정 단계를 반복하였다. 추가의 0.54 g BAK502G9 항체를 51 ml로 회수하였다. 그 다음, 상기 2개의 여과된 Q 세파로스 용출액을 모았다.

(e) 농축

생성물을 50 mM 나트륨 아세테이트 + 85 mM 염화나트륨 pH 5.50에서 수득하였고, 이는 투석여과를 요구하지 않았다.

17.5 ℓ 중의 Q 세파로스 용출액으로서 95.31 g BAK502G9 항체를 1.5 ℓ로 농축시켰다. 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 2 TFF 시스템 및 0.1 M² 30 KDa 막 (Millipore P2B030A01)을 사용하여 농축을 수행하였다. 이어서, BAK502G9 항체를 상기 장비로부터 회수한 다음, 이 장비를 50 mM 나트륨 아세테이트 + 85 mM 염화나트륨 pH 5.50으로 완충제 수세하였다. 그 다음, 농축된 항체를 완충제 수세 물과 합하였다. 1.67ml 10％ w/v 폴리솔베이트 80을 풀에 가하여 최종 폴리솔베이트 80 농도 0.01％ w/v을 수득하였다. 이어서, 상기 풀을 0.22 ㎛ 여과시켰다. 91.6 g BAK502G9 항체를 1.67 ℓ로 회수하였다.

(f) 사용된 물질

상기 완충액을 제조하기 위해 사용된 화학물질은 다음과 같다:

구아니딘 히드로클로라이드 [Sigma Aldrich. G4505].

이나트륨 수소 오르토포스페이트 [VWR. 1038349].

나트륨 이수소 오르토포스페이트 [VWR. 102454R].

나트륨 아세테이트 3-수화물 [VWR. 102354X].

염화나트륨 [VWR. 10241AP].

아세트산 [VWR. 1OOO1CU].

폴리솔베이트 80 [J. T. Baker. 7394].

실시예 3: 28일 안정성 분석

방법론

rmp 단백질 A 크로마토그래피를 다음 표 1에 제시된 바와 같이 수행하였다:

단백질 A 크로마토그래피 파라미터

매트릭스:	rmp 단백질 A 세파로스
상 높이:	14.2 cm
칼럼 직경:	5.0 cm
칼럼 용적:	278 ml
선형 유속:	150 cm/hr
평형 완충액 & CV:	인산염 완충 식염수, pH 7.2, 5 CV
부하 물질:	정화시킨 배양 수거물
부하 용량 (mg IgG/ml 매트릭스):	16.6 mg/ml 매트릭스
세척 1 완충액 및 CV:	인산염 완충 식염수, pH 7.2, 7.5 CV
세척 2 완충액 및 CV:	50 mM 나트륨 아세테이트, pH 5.50 ± 0.10, 7.5 CV
용출 완충액	50 mM 나트륨 아세테이트, pH 3.75 ± 0.10, 1.6 CV
스트립/세정 완충액 및 CV:	50 mM 나트륨 아세테이트, pH 3.0 ± 0.10, 2 CV

피크를 용출시키고 흡광도를 <2％ 전면적 편향 (AuFS)으로 복귀시키기 위해서는 1.6 CV의 용출 완충액이 요구되었다. 이 후에, 상기 완충액을 스트립 완충액으로 변화시켰다.

그 다음, 다음 표 2에 제시된 바와 같이 단백질 A 용출액을 사용하여 저 pH 바이러스 불활성화를 수행하였다:

저 pH 바이러스 불활성화

출발 물질:	단백질 A 용출액
pH 감소:	pH 3.7로 감소됨
pH를 감소시키기 위한 완충제:	100 mM 아세트산
부가 속도:	8.6 ml/min (19.0 ml/min/l 용출액)
저 pH 하에서의 유지 시간:	pH 조정 후 60분
바이러스 불활성화 후 중화:	100 mM 수산화나트륨을 점차적으로 부가함으로써 pH 5.48로 만듬
부가 속도:	17.8 ml/min (39.3 ml/min/l 용출액 - 샘플용으로 조정시킴)
중화 후 여과:	밀리파크 (Millipak) 20

모든 샘플은 C-플렉스 유입 튜브와 배출 튜브가 부착된, 폴리에틸렌로 만든 200 ml용 하이클론 바이오프로세스 (Hyclone BioProcess) 용기에 저장하였다.

또한, 바이러스 불활성화 단백질 A 용출액의 50 ml 샘플을 본래의 완충제 (5O mM 수산화나트륨)로 중화시키고, 분석전 28일 동안 2 내지 8℃ 하에 바이오프로세스 용기에 저장하였다.

모든 샘플은 경우에 따라, 클래스 100,000 냉방 (2 내지 8℃, 차트 기록기와 알람을 이용하여 모니터링함)에 저장하거나 또는 25℃로 설정된 온도 조절성 항온 배양기에 저장하였다.

5개의 시점과 2개의 저장 온도 (2 내지 8℃ 및 25℃), 즉 10개의 별개의 샘플링 점이 있다.

여과시키고 중화시킨 단백질 A 용출액을 10개 분획으로 나누었다: 5개 분획을 각각의 온도에 저장하였다. 여과시키지 않고 중화시킨 단백질 A 용출액의 추가의 용기를 2 내지 8℃ 하에 저장하였다.

각 바이오프로세스 용기를 충전시키기 위해, 중화시킨 단백질 A 용출액을 0.2 ㎛ 밀리파크 필터를 통하여 200 ml 바이오프로세스 용기 내로 펌핑하였다. 최종 2,000 ℓ 규모 생산을 위해 계획된 생성물 대 표면 접촉 비를 모방하기 위해, 각 바이오프로세스 용기에 대략 100 ml를 충전시켰다.

각 온도 및 각 시점에 대한 샘플링을 위해 하나의 바이오프로세스 용기를 사용하였고, 물질이 저장 동안 튜브에 남아있지 않도록 주의하였다.

각 온도로부터의 하나의 바이오프로세스 용기를 1, 3, 15, 21 및 28일째에 꺼냈다. 각 바이오프로세스 용기의 내용물을 샘플링에 앞서 실온에 도달하도록 하였다.

샘플을 비조우 (Bijoux) 용기 또는 50 ml용 팔콘 (Falcon) 튜브 내로 취하였다. 첫 번째 수 ml의 샘플은 경사 제거하였는데, 이는 이들 샘플이 저장 동안 튜브와 일부 접촉할 수도 있었기 때문이다.

샘플링 후, 잔여 물질을 함유하는 용기를 -70℃ 하에 냉동시켰다.

다음 분석을 각 시점일에 각 저장 온도에 대해 수행하여 이들 샘플을 서로 비교하는 것이 가능한지 그리고 이들 샘플을 기준 표준물과 비교하는 것이 가능한지를 결정하였다. 안정성 연구 물질과 비교하기 위해 BAK502G9 표준물의 신선한 바이알을 각 시점에 사용하였다. 기준물을 -70℃ 저장으로부터 실온 하에 해동시켰다. 상기 항체를 해동시킨 직후에 다량체 수준이 상승될 수 있는 것으로 공지되어 있기 때문에, GP-HPLC 분석을 마지막에 수행하였다.

(A) 혼탁도 분석

혼탁도는 시간 경과에 따른 단백질 분해 측정치로서 평가하였으므로, 이는 본 발명의 조성물에 관한 유용한 안정성 평가 요인으로서 제공되었다.

혼탁도는 A340과 360 nm 사이의 샘플의 평균 흡광도를 취함으로써 측정하였다 [참고: Eckhardt et al. 1993]. 이러한 검정은 추가의 여과없이 수행하였다.

rmp 단백질 A 크로마토그래피로부터 수득한 데이터를 표 3에 요약하였고 크로마토그램이 도 1에 도시되었다.

rmp 단백질 A 크로마토그래피 데이터

단계 상세 내역	결과
칼럼 용적	278 ml
총 부하 용적	3204 ml
부하된 총 생성물	4620 mg
용출액 용적	453 ml (1.6 CV)
용출액의 농도	8.42 mg/ml
용출시 pH	4.40
부가된 100 mM 아세트산의 용적	665 ml (2.4 CV)
부가된 100 mM 수산화나트륨의 용적	838 ml (3.0 CV; 3.2 CV 조정됨*)
여과 공정 전의 용적	1900 ml* (6.8 CV)
여과 공정 후의 농도	2.28 mg/ml
여과 공정 후의 총 생성물	4327 mg
여과 공정 후의 회수율 (％)	93.7％

*50 mM 수산화나트륨을 이용하여 조정하기 위해 바이러스-불활성화 용출액으로부터 50 ml를 꺼냈다. 최종 용적은 샘플링 후의 용적이다.

대규모로 관찰된 것과 거의 동등한 수준의 완충액 용적을 생성시키는 것으로 예상되는 바와 같은 rmp 단백질 A 크로마토그래피를 수행하였다. 중화시킨 용출액은 50 mM 수산화나트륨을 이용하여 중화시킨 용출액의 경우에 통상 관찰되는 것 보다 가시적으로 더 혼탁하였다. 바이오프로세스 용기 내로의 여과 동안 침전이 관찰되기 시작하였는데, 이는 중화시킨지 1시간 내에 일어났다. 이 시간 후까지는 혼탁도를 검정하지 않았다. 여과 후 예상된 범위 내에서 회수가 이루어졌다.

모든 용출액 샘플을 대상으로 하여 1일째에 혼탁도에 관해 검정하였다. 양 온도에서 저장한 여과시킨 용출액을 대상으로 하여 1일, 3일, 15일, 21일 및 28일째에 혼탁도에 관해 검정하였다. 또한, 여과시키지 않은 채로 저장한 용출액 (50 mM 수산화나트륨 또는 100 mM 수산화나트륨을 이용하여 조정시킴)을 대상으로 하여 28일째에 여과 전 및 여과 후에 혼탁도에 관해 검정하였다. 혼탁도 분석 결과가 표 4에 제시되었는데, 여기서는 25℃ 하에 저장한 28일째 샘플의 혼탁도가 현저한 수준으로 증가하긴 하였지만, 이 샘플은 일반적으로 25℃ 하에서 적어도 21일 동안 안정적이었다는 것을 알 수 있다.

공정 및 안정성 연구 샘플의 혼탁도 측정

샘플		평균 혼탁도		카테고리
조정시키지 않은 용출액		0.0640		유백색
바이러스 불활성화		0.0247		약간 유백색
여과 전에 중화시킴		0.2856		혼탁함
여과시킨 용출액		0.0093		청정함
일	2 내지 8℃		25℃
일	혼탁도	카테고리	혼탁도	카테고리
1일째	0.0093	청정함	0.0132	청정함
3일째	0.0115	청정함	0.0176	약간 유백색
15일째	0.0208	약간 유백색	0.0203	약간 유백색
21일째	0.0120	청정함	0.0202	약간 유백색
28일째	0.0140	청정함	0.0412	유백색

(B) 단백질 농도 분석

280 nm 하에서의 흡광도 및 Ｅ_1cm ^0.1％ = 1.723의 흡광 계수를 사용하여 IgG 농도를 측정 및 계산하였다.

중화시에 여과시킨 용출액은 단백질 농도를 계산하기 위해 280 nm 하에서의 흡광도를 측정하기에 앞서 재여과시키지 않았다. 혼탁도가 모두 낮기 때문에, 이는 결과에 영향을 미치지 않을 것으로 여겨진다. 280 nm 하에서의 흡광도는 저장 온도와 시점 간에 일관되었고, 이는 표 5에 제시되었다.

용출액 샘플의 단백질 농도

	단백질 농도 (mg/ml)
샘플: 100 mM 수산화나트륨을 이용하여 중화시킨, 여과되시키고 중화시킨 단백질 A 용출액 일:	온도
샘플: 100 mM 수산화나트륨을 이용하여 중화시킨, 여과되시키고 중화시킨 단백질 A 용출액 일:	2 내지 8℃	25℃
1일째	2.28	2.28
3일째	2.29	2.29
15일째	2.28	2.29
21일째	2.29	2.28
28일째	2.28	2.26
28일째 재여과시킴	2.29	-

(C) SDS-PAGE 분석

4 내지 12％ 비스-트리스 NuPAGE 겔을 사용하여 환원 및 비-환원 SDS-PAGE를 수행하였다. MES 수행 완충액을 사용하여 겔을 수행하고 피어스 (Pierce) 겔 코드 블루로 염색시켰다.

SDS PAGE 분석 결과, 절반 항체 수준 상의 변동이 입증되었지만, 명백한 경향은 없었으며 이는 검정 상의 변동 내인 것으로 예상된다 (도 1 및 2, 및 표 6 및 7 참고). 21일째에는 몇몇 부가의 소수 밴드가 25℃ 샘플에서 관찰되었다. 이들 밴드는 28일째에는 관찰되지 않았다. 따라서, 이들은 검정 탐지의 한계치일 수 있다. 이들 밴드는 GP-HPLC 상에서 관찰된 작은 부가 피크에 상응할 수 있다 (실시예 3D 참고).

연구가 끝날 무렵에는 샘플을 수행하지 않았는데, 이는 본래의 샘플 내에 존재하는 차이, 또는 보다 장기간 저장에 따른 차이 간을 구별하는 것이 가능하지 않을 수 있기 때문이다. 신선하게 해동시킨 기준 표준물의 바이알을 각 겔 상에서 수행하였다. 이는 상이한 시점 간에 거의 동등한 수준이었는데, 분석이 예상된 바와 같이 수행되었다는 지표이다. 21일째에 25℃ 샘플에서 관찰된 여분의 밴드가 동일한 겔 상에서 수행된 기준 표준물이나 2 내지 8℃ 샘플에서는 관찰되지 않았다는 사실은 주목할 만한 일이다. 명확하게 하기 위해, 도 2에서의 모든 밴드는 동그라미로 표시하였다.

(D) GP-HPLC 분석

이동 상으로서 200 mM 인산나트륨 및 0.05％ 나트륨 아지드 pH 7.0을 이용한 TSK GS3000SW 크기 배제 칼럼을 사용하고 280 nm에서 탐지함으로써 샘플을 분석하였다.

단백질 A 크로마토그래피로부터의 모든 분획을 1일째에 검정하였다. 이어서, 양 온도에서 저장한 용출액을 1일째, 3일째, 15일째, 21일째 및 28일째에 검정하였다. 기준 샘플을 또한 모든 시점에서 수행하였다. 1일째에 100 mM 수산화나트륨 또는 50 mM 수산화나트륨을 이용하여 별개로 중화시켰지만, 28일째까지는 여과시키지 않은 용출액을 28일째에 GP-HPLC에 의해 검정하였다.

1일째 GP-HPLC 분석으로부터의 크로마토그램이 도 3에 도시되었다. 이들은 예상된 바와 같이 최종 용출액이 >95％ 단량체였는데, 이는 BAK502G9에 관한 최종 세부사항을 충족시켜 준다.

연구 전 과정에 걸쳐 샘플을 GP-HPLC 분석한 결과, 25℃ 하에서 절단된 (특히, 9.9분과 10.3분 사이에 용출되는 작은 피크) BAK502G9가 약간 증가한 것으로 밝혀졌다 (표 8 및 도 4 및 5). 단량체 수준은 전 연구 기간에 걸쳐 일관되게 97.0 내지 98.2％였다.

50 mM 수산화나트륨을 이용하여 중화시킨 용출액은 단량체 수준 (99.2％ 단량체)이 100 mM 수산화나트륨을 이용하여 중화시킨 용출액의 단량체 수준 (97.4％ 단량체) 보다 높았는데, 이들 둘 다는 최종 생성물에 대해 요구되는 95％ 단량체 수준 보다 더 높다 (표 9 및 도 6).

자동 통합으로부터 수득한 결과는 부정확하므로, GP-HPLC 크로마토그램을 수동으로 재통합하였다.

(E): IEF 분석

인비트로겐 (Invitrogen) 완충제를 사용하여, 인비트로겐 pH 3 내지 10 IEF 겔을 이용하여 샘플을 분석하였다.

BAK502G9를 IEF 분석한 결과, 본 연구 내내 일관된 외관이 나타났다 (도 7). 대략 pI 7.1 내지 6.4 사이에 3개의 주요 밴드와 2개의 소수 밴드가 관찰되었다.

(F): 내독소 분석

두 가지 저장 온도로부터 28일째에 취한 샘플을 대상으로 하여 LAL 검정을 사용하여 내독소 수준에 관해 검정하였다.

두 가지 온도에서 저장한 샘플 중의 내독소 수준은 낮았다. 이는 연구 과정 전반에 걸쳐 그람-음성 세균에 의한 오염이 없었다는 것을 입증해준다.

2 내지 8℃ 하에 저장한 용출액 = 0.87 EU/mg.

25℃ 하에 저장한 용출액 < 0.44 EU/mg.

28일 안정성 분석 결과에 관한 요약

2 내지 8℃ 또는 25℃ 하에 15일까지 동안 저장한 BAK502G9는 실시예 3에서 수행한 검정 모두에서 등가였다. 21일 후에는 몇몇 작은 차이가 SDS PAGE (실시예 3C) 및 GP HPLC (실시예 3D) 분석에 의해 관찰되었지만, 생성물은 28일까지 거의 동등한 수준으로 유지되었다.

실시예 4: 12개월 안정성 분석

12개월 안정성 분석은 실시예 3의 28일 안정성 분석에 대해 기재된 바와 유사한 방식으로 수행하였다.

본 연구는 상이한 온도 (예를 들어, -70, +5, +25, +37 및 +45℃)에서 저장한 경우에 상이한 농도의 BAK502G9의 안정성을 연구 조사하기 위해 설계되었다. 이러한 분석에 사용된 상이한 제제가 다음 표 10에 제시되었다:

12개월 안정성 분석에 사용된 제제의 조성

제제	공칭 농도 (mg/ml)	조성
대조군 (CF)	10	50 mM 나트륨 아세테이트/85 mM 염화나트륨 pH 5.5
시험 1A (TF1A)	50	50 mM 나트륨 아세테이트/85 mM 염화나트륨/0.01％ 폴리솔베이트 80 pH 5.5
시험 1B (TF1B)	100	50 mM 나트륨 아세테이트/85 mM 염화나트륨/0.01％ 폴리솔베이트 80 pH 5.5
시험 1C (TF1C)	150	50 mM 나트륨 아세테이트/85 mM 염화나트륨/0.01％ 폴리솔베이트 80 pH 5.5

시점을 다양하게 하여 샘플을 분석하였는데, 예를 들어 -70, +5, +25℃ 하에 저장한 제제를 0, 3, 6, 9 및 12개월째에 측정하였고, +37℃ 하에 저장한 제제를 0, 1, 2, 4 및 8주째에 측정하였으며, +45℃ 하에 저장한 제제를 0, 1, 2 및 5일째에 측정하였다.

(A) pH 분석

소용량 pH 전극 (BDH)이 장착된 PHM220 pH 측정기 (공급처: Radiometer Analytical)를 사용하여 pH를 측정하였고, 각 온도에서의 제제 CF, TF1A, TF1B 및 TF1C의 pH 측정 결과가 다음 표 11 내지 15에 제시되었다:

(B) 농도 분석

관련 완충제를 이용하여 샘플을 적당한 수준으로 희석시키고, HP8453 UV/가시광선 분광광도계 (공급처: Agilent Technologies)를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 결정하였다. 공지된 흡광 계수 1.723을 사용하여 흡광도 값을 BAK502G9 농도로 전환시켰다. 각 온도에서의 제제 CF, TF1A, TF1B 및 TF1C의 흡광도 측정 결과가 다음 표 16 내지 20에 제시되었다:

(C) 겔 여과 HPLC 분석

겔 여과 HPLC를 HP11OO 시스템 (공급처: Agilent Technologies) 상에서 수행하였다. TSK-겔 3000S 칼럼을 0.2 M 인산나트륨 pH 7.5로 평형시켰다. 관련 완충제를 이용하여 샘플을 1 mg/ml로 희석시키고 13,000 rpm 하에 10분 동안 원심분리시켜 모든 미립자를 제거하였다. 각 샘플의 3 x 20 ㎕ 주사제를 칼럼 상에서 만들고, 이를 1 ml/min의 유속으로 수행하였다. 가변적 파장 탐지기를 사용하여 220 및 280 nm 하에서의 흡광도를 모니터링하였다.

각 온도에서의 제제 CF, TF1A, TF1B 및 TF1C의 겔 여과 분석 결과가 도 8 내지 12에 제시되었다.

(D) 환원 SDS-PAGE 분석

관련 완충제를 사용하여 샘플을 1 mg/ml로 희석시키고 16.7 ㎕를 12.5 ㎕의 4X LDS 샘플 완충액 (공급처: Invitrogen), 15.8 ㎕의 밀리-Q 수 및 5 ㎕ 환원제 (공급처: Invitrogen)에 가하였다. 샘플을 95℃ 하에 1분 동안 가열한 다음, 얼음 위에 놓아두었다. 각 샘플 15 ㎕를, 1 x MES SDS 수행 완충액을 함유하는 탱크에서 4 내지 12％ 비스트리스 겔 (공급처: Invitrogen) 상으로 부하하고, 겔을 50O mA의 일정 전류 하에 35분 동안 수행하였다. 전기영동 후, 겔을 그의 주조로부터 꺼내고, 밀리-Q 수로 3 x 10분 동안 세정하며, Gelcode^® 블루 염색 시약 (공급처: Pierce)으로 최소 1시간 동안 염색시킨 다음, 밀리-Q 수로 탈염시켰다. 겔 사진을 찍고, UVP GDS8000 겔 문서 시스템을 사용하여 분석하였다. 각 샘플 중의 BAK502G9 중쇄 및 경쇄의 상대 존재비를 결정하였다.

각 온도에서의 제제 CF, TF1A, TF1B 및 TF1C의 환원 SDS-PAGE 분석 결과가 도 13, 15, 17, 19 및 21에 제시되었다. 각 온도에서의 BAK502G9 중쇄 및 경쇄의 존재비의 측정치가 도 14, 16, 18, 20 및 22에 제시되었다.

(E) 비-환원 SDS-PAGE 분석

관련 완충제를 사용하여 샘플을 1 mg/ml로 희석시키고 16.7 ㎕를 25 ㎕의 2X 비-환원성 샘플 완충액 [0.125 M 트리스, pH 6.8, 4％ (w/v) SDS, 30％ (v/v) 글리세롤, 0.004％ (w/v) 브로모페놀 블루], 3.3 ㎕의 밀리-Q 수 및 5 ㎕ 1 M 요오도아세트아미드에 가하였다. 샘플을 95℃ 하에 1분 동안 가열한 다음, 얼음 위에 놓아두었다. 각 샘플 15 ㎕를, 1 x MES SDS 수행 완충액을 함유하는 탱크에서 4 내지 12％ 비스트리스 겔 (공급처: Invitrogen) 상으로 부하하고, 겔을 50O mA의 일정 전류 하에 35분 동안 수행하였다. 전기영동 후, 겔을 그의 주조로부터 꺼내고, 밀리-Q 수로 3 x 10분 동안 세정하며, Gelcode^® 블루 염색 시약 (공급처: Pierce)으로 최소 1시간 동안 염색시킨 다음, 밀리-Q 수로 탈염시켰다. 겔 사진을 찍고, UVP GDS8000 겔 문서 시스템을 사용하여 분석하였다. 각 샘플 중의 BAK502G9 단량체의 상대 존재비를 결정하였다.

각 온도에서의 제제 CF, TF1A, TF1B 및 TF1C의 비-환원 SDS-PAGE 분석 결과가 도 23, 25, 27, 29 및 31에 제시되었다. 각 온도에서의 본래의 BAK502G9 단량체의 존재비의 측정치가 도 24, 26, 28, 30 및 32에 제시되었다.

(F) 등전점 포커싱 분석

샘플 부하에 앞서, 전기영동 층을 냉각시키고, 아펠렉스 (Apelex) PS9009TX 전력 팩을 사용하여 1 W, 2000 V, 15O mA에서 10분 동안 pH3-10 IEF 겔 (Cambrex)을 정초점으로 하였다. 관련 완충제를 사용하여 샘플을 1 mg/ml으로 희석시켰다. 샘플 마스크를 겔 표면 상에 놓아두고 각 샘플 5 ㎕을 부하하였다. 겔을 다시 정초점으로 하고 샘플 마스크를 제거하였다. 그 다음, 25 W, 1500 V, 5O mA 하에 60분 동안 겔에 초점을 맞추었다. 전기영동 후, 겔을 50％ (v/v) 메탄올, 6％ (w/v) 트리클로로아세트산, 3.6％ (w/v) 5-설포살리실산으로 30분 동안 고정시킨 다음, 물로 세척하고 40 내지 50℃하 오븐에서 1시간 동안 건조시켰다. 패스트겔 (PhastGel) 블루 R [공급처: Pharmacia; 60％ (v/v) 메탄올에 용해된 1개 정제]을 사용하여 상기 겔을 30분 동안 염색시키고, 밀리-Q 수로 세척하여 과량의 염색을 제거한 다음, 9％ (v/v) 빙초산, 25％ (v/v) 에탄올 용액을 사용하여 대략 3분 동안 탈염시켰다. 겔을 40 내지 50℃하 오븐에서 1시간 동안 건조시켰다. 이와 같이 건조시킨 겔의 사진을 찍고 UVP GDS8000 겔 문서 시스템을 사용하여 분석하였다. 각 샘플 중의 이소형의 수와 pI 범위를 결정하였고, 각 온도에서 제제 CF, TF1A, TF1B 및 TF1C을 이용한 경우에 관찰된 결과가 다음 표 21 내지 25에 제시되었다:

안정성 분석 결과에 관한 요약

-70℃ 하에서의 안정성

CF와 TF1A 둘 다는 -70℃ 하에서 12개월 동안 안정적이었다. 분석적 프로파일은 0개월 및 12개월째에 유사하였는데, 단 비-환원 SDS-PAGE에 의한 본래 IgG ％는 CF의 경우에 t=0에서의 95.9％에서 12개월째의 89.9％로 감소되었고, TF1A의 경우에는 t=0에서의 96.2％에서 12개월째의 89.2％로 감소되었다. 12개월 후에 HPLC하면, CF와 TF1A 샘플 둘 다에 대한 단량체 비율(％)은 100％였다. CF와 TF1A 샘플 둘 다는 12개월 후에 IEF 상에 4개의 밴드를 표시하였다. 이러한 결과는 CF와 TF1A가 상기 온도에서 거의 동등한 수준이라는 지표이다.

5℃ 하에서의 안정성

CF와 TF1A 둘 다는 5℃ 하에서 12개월 동안 안정적이었다. 분석적 프로파일은 0개월 및 12개월째에 유사하였는데, 단 비-환원 SDS-PAGE에 의한 본래 IgG ％는 CF의 경우에 t=0에서의 95.9％에서 12개월째의 89.5％로 감소되었고, TF1A의 경우에는 t=0에서의 96.2％에서 12개월째의 88.9％로 감소되었다. 12개월 후에 HPLC하면, CF와 TF1A 샘플 둘 다에 대한 단량체 비율(％)은 100％였다. CF와 TF1A 샘플 둘 다는 12개월 후에 IEF 상에 4개의 밴드를 표시하였다. 이러한 결과는 CF와 TF1A가 상기 온도에서 거의 동등한 수준이라는 지표이다.

25℃ 하에서의 안정성

CF와 TF1A 둘 다는 25℃ 하에서 12개월 동안 안정적이었다. 비-환원 SDS-PAGE에 의한 본래 IgG ％는 CF의 경우에 t=0에서의 95.9％에서 12개월째의 89.1％로 감소되었고, TF1A의 경우에는 t=0에서의 96.2％에서 12개월째의 87.5％로 감소되었다. t=0에서는 탐지되지 않았던 비-환원 SDS-PAGE 겔 상에서 양 제제는 소수의 고분자량 (>220 kDa) 밴드를 나타내기도 하였다. 12개월 후에 HPLC하면, CF와 TF1A 샘플 둘 다에 대한 단량체 비율(％)은 각각 98.9％ 및 96.42％였다. CF와 TF1A 샘플 둘 다는 12개월 후에 IEF 상에 4개의 밴드를 표시하였다. 이러한 결과는 CF와 TF1A가 상기 온도에서 거의 동등한 수준이라는 지표이다.

37℃ 하에서의 안정성

CF와 TF1A 둘 다는 37℃ 하에서 4주 동안 안정적이었지만, 8주 후에는 몇몇 파라미터, 즉 환원 SDS-PAGE에 의한 순도 (양 제제) 및 GF-HPLC에 의한 단량체 ％ (단지 TF1A; 경계선 상의 결과)에 대한 초안 세부사항을 충족시키지 못하였다. 이 결과는 CF가 8주 기간에 걸쳐 상기 온도에서 TF1A 보다 더 안정적이란 지표이다.

45℃ 하에서의 안정성

CF와 TF1A 둘 다는 45℃ 하에서 5일 동안 안정적이었지만, 이 시간 후에는 분석적 프로파일 상의 약간의 변화가 있었다 (SDS-PAGE 및 IEF 겔 상에 몇몇 부가의 소수 밴드가 나타남). 이 결과는 CF와 TF1A가 5일 기간에 걸쳐 상기 온도에서 거의 동등한 수준이라는 지표이다.

Claims

아세테이트 완충제를 이용하여 pH 4.5 내지 6.0으로 완충시킨 하나 이상의 제약상 허용가능한 부형제와 IL-13 항체를 포함하는 제약 조성물.
제1항에 있어서, IL-13 항체가 인간 IL-13 모노클로날 항체인 제약 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, IL-13 항체가 제약 조성물 내에 1 내지 200 mg/ml의 양으로 존재하는 것인 제약 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, pH 5.2 내지 5.7로 완충시킨 제약 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물 내에 1 내지 100 mM의 양으로 존재하는 나트륨 아세테이트를 포함하는 제약 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제약상 허용가능한 부형제가 하나 이상의 계면활성제, 무기 또는 유기 염, 안정화제, 희석제, 가용화제, 환원제, 항산화제, 킬레이트제 및/또는 방부제를 포함하는 것인 제약 조성물.
제6항에 있어서, 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르 중에서 선택되는 것인 제약 조성물.
제7항에 있어서, 계면활성제가 제약 조성물 내에 0.001 내지 0.1％ (w/w)의 양으로 존재하는 폴리솔베이트(Polysorbate) 80인 제약 조성물.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 무기 염이 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 인산나트륨, 인산칼륨 및 중탄산나트륨을 포함하는 것인 제약 조성물.
제9항에 있어서, 무기 염이 제약 조성물 내에 10 내지 200 mM의 양으로 존재하는 염화나트륨인 제약 조성물.
제1항에 있어서, 아세테이트 완충제를 이용하여 pH 5.5 ± 0.1로 완충시킨 무기 염, 계면활성제 및 IL-13 항체를 포함하는 제약 조성물.
제1항에 있어서, 나트륨 아세테이트 완충제를 이용하여 pH 5.5 ± 0.1로 완충시킨 폴리솔베이트 80, 염화나트륨 및 IL-13 항체를 포함하는 제약 조성물.
제1항에 있어서, 50 mM 나트륨 아세테이트 완충제를 이용하여 pH 5.5 ± 0.1 로 완충시킨 0.01％ (w/w) 폴리솔베이트 80, 85 mM 염화나트륨 및 50 mg/ml의 IL-13 항체를 포함하는 제약 조성물.
하나 이상의 크로마토그래피 분리 단계를 포함하며, 이러한 분리 단계 각각이 아세테이트 완충제를 이용하여 pH 3.5 내지 7.0으로 완충시킨 하나 이상의 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 용출 완충액으로의 용출을 포함하는 것인, IL-13 항체의 정제 방법.
제14항에 있어서, 크로마토그래피 분리 단계가 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피 중에서 선택되는 것인 방법.
제15항에 있어서, 크로마토그래피 분리가 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 이어서 양이온 교환 크로마토그래피에 의해, 그 다음 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행되는 것인 방법.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제약상 허용가능한 부형제가 무기 염을 포함하는 것인 방법.
제17항에 있어서, 무기 염이 용출 완충액 내에 10 내지 200 mM의 양으로 존재하는 염화나트륨인 방법.
제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 아세테이트 완충제가 용출 완충액 내에 1 내지 100 mM의 양으로 존재하는 나트륨 아세테이트인 방법.
제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 용출 완충액이 pH 5.5 ± 0.1로 완충시킨 85 mM 염화나트륨 및 50 mM 나트륨 아세테이트를 포함하는 것인 방법.
IL-13 관련 장애를 치료하기 위한 약물을 제조하는데 있어서의, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체 제약 조성물의 용도.
제21항에 있어서, IL-13 관련 장애가 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 피부 경화증, 염증성 장 질환 및 호지킨 (Hodgkin) 림프종 중에서 선택되는 것인 용도.
제22항에 있어서, IL-13 관련 장애가 천식인 용도.
치료적 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체 제약 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, IL-13 관련 장애의 치료 또는 예방 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, IL-13 관련 장애를 치료하는데 사용하기 위한 항체 제약 조성물.