BRPI0616359A2 - composiÇço de anticorpo de interleucina-13 - Google Patents

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BRPI0616359A2
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Abstract

COMPOSIÇçO DE ANTICORPO DE INTERLEUCINA-13. A presente invenção se refere a urna composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de interleucina-13, mais particularmente, um anticorpo monoclonai de interleucina-13, especialmente, um anticorpo monoclonal de interleucina-13 humana, também, a um processo para purificação do dito anticorpo e ao uso do dito anticorpo no tratamento de distúrbios correlacionados à interleucina-13, tais como, asma, dermatite atópica, rinite alérgica, fibrose, doença pulmonar obstrutiva crónica, escieroderma, doença inflamatória do intestino e linfoma de Hodgkln, particularmente, asma.

Description

"COMPOSIÇÃO DE ANTICORPO DE INTERLEUCINA-13"
A presente invenção se refere a uma composiçãofarmacêutica compreendendo um anticorpo de interleucina-13,mais particularmente, um anticorpo monoclonal deinterleucina-13, especialmente, um anticorpo monoclonal deinterleucina-13 humana, também, a um processo parapurificação do dito anticorpo e ao uso do dito anticorpo notratamento de distúrbios correlacionados à interleucina-13,tal como, a asma.
A interleucina-13 (11-13) é uma citocina de 114aminoácidos com uma massa molecular não-modifiçada deaproximadamente 12 kDa. A IL-13 é mais proximamentecorrelacionada à IL-4, com a qual compartilha 30% dehomologia de seqüência ao nivel do aminoácido. O gene daIL-13 humana está localizado no cromossomo 5q31, adjacenteao gene da IL-4 [McKenzie, A. N. et al., J. Immunol., 1993,150(12), 5436-5444; Minty, A. et al., Nature, 1993,362 (6417), 248-50] .
Embora inicialmente identificada como citocinaderivada do linfócito Th2 CD4+, a IL-13 é também produzidapor células-T Thl CD4+, células NK de linfócitos CD8+ T, epopulações de células diferentes da célula T, tais como, ascélulas mastócitos, basófilos, eosinófilos, macrófagos,monócitos e as células do músculo liso das vias aéreas.
A IL-13 tem sido correlacionada a um determinadonúmero de doenças, em particular, doenças que são causadaspor uma resposta inflamatória. Por exemplo, a administraçãoda IL-13 recombinante às vias aéreas de roedores simplesnão-sensibilizados foi mostrada como causadora de diversosaspectos do fenótipo da asma, incluindo a inflamação dasvias aéreas, produção de muco e hiper-susceptibilidade dasvias aéreas (AHR) [Wills-Karp, M. et al., Science, 1998,282(5397), 2258-2261; Grunig, G. et al., Science, 1998,282(5397), 2261-2263; Venkayya, R., et al., Am. J. Respir.Cell Mol. Biol., 2002, 26(2), 202-208; Morse,. B. et al.,Am. J. Physiol., Lung Cell Mol. Physiol., 2002, 282 (1),L44-49]. Um fenótipo similar foi observado em um caraundongotransgênico no qual a IL-13 foi especificamentesobrexpressa no pulmão. Nesse modelo, uma exposição maisacentuada à IL-13 também resultou em fibrose [Zhu, Z. etal., J. Clin. Invest., 1999, 103(6), 779-788].
Um determinado número de polimorfismos genéticosno gene da IL-13 foi também correlacionado a doençasalérgicas. Em particular, uma variante do gene da IL-13, emque o resíduo de arginina no aminoácido 130 é substituídopor glutamina (Q130R), foi associada com a asma bronquial,dermatite atópica e níveis elevados de soro de IgE[Heinzmann, A. et al., Hum. Mol. Genet., 2000, 9(4), 549-559; Howard, T. D. et al., Am. J. Hum. Genet., 2002, 70 (1),230-236; Kauppi, P. et al., Genomics, 2001, 77(1-2), 35-42;Graves, Ρ. E. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 2000,105(3), 506-513]. Esta particular variante da IL-13 étambém referida como variante QllOR (resíduo de arginina noaminoácido 110 substituído por glutamina) por alguns gruposque excluem a seqüência de sinal do aminoácido 20 dacontagem do aminoácidos.
A produção da IL-13 foi também associada com aasma alérgica [van der Pouw Kraan, T. C. et al., GenesImmun., 1999, 1(1), 61-65] e elevados níveis da IL-13 forammedidos em pessoas humanas com rinite atópica (febre dofeno), dermatite alérgica (eczema) e sinusite crônica.
Além da asma, a IL-13 foi associada a outroscondicionamentos fibróticos. Os níveis elevados da IL-13,até 1000 vezes maior que da IL-4, foram medidos no soro depacientes com esclerose sistêmica e em amostras de lavageminterna bronco-alveolar (BAL) de pacientes -afetados comoutras formas de fibrose pulmonar [Hasegawa, M. et al., ;J.Rheumatol .,·. 1997 , 24 (2), 328-332; Hancock, A. et aL ;,Am.J. Respir. Cell Mol. Biol. , 1998,. 18(1) , 60-65J.
Foi demonstrado que a sobrexpressão. da IL-13 nopulmão de camundongo provocou enfisema,· elevada produção demuco e inflamação, refletindo aspectos da doença pulmonarobstrutiva crônica (COPD) [Zheng, T. et al., J. Clin.Invest., 2000, 106(9), 1081-1093].
Foi proposto que a IL-13 pode também desempenharum importante papel na patogênese da doença inflamatória dointestino [Heller, F. et al., Immunity, 2002, 17(5), 629-38] e elevados níveis da IL-13 foram detectados no soro dealguns pacientes da doença de Hodgkin, quando comparado aoscontroles normais [Fiumara, P. et al., Blood, 2001, 98(9),2877-2878] .Os inibidores de IL-13 são também acreditadoscomo sendo terapeuticamente úteis na prevenção dereincidência ou metástase de tumores [Terabe, M. et al.,Nat. Immunol., 2000, 1(6), 515-520]. A inibição da IL-13foi também mostrada como reforço de vacinas antivirais emmodelos de animais, podendo ser benéfica no tratamento deHIV e outras doenças infecciosas [Ahlers, J. D. et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 2002, 99(20), 13020-13025].
Uma abordagem dirigida ao anticorpo para inibiçãoda IL-13 foi descrita. Por exemplo, o documento de patenteWO 2005/007699 (Cambridge Antibody Technology Limited)descreve uma série de moléculas de anticorpo anti-IL-13humana, que são mostradas para neutralizar a atividade daIL-13 e que são reivindicadas çomo sendo de uso ■ ,potencialno tratamento' de distúrbios correlacionados à IL-13,
De acordo com um primeiro aspecto da invenção, éproporcionada uma composição farmacêutica compreendendo umanticorpo de IL-13 e um ou mais excipientesfarmaceuticamente aceitáveis, tamponados para um pH entre4,5-6,0 com um tampão de acetato.
É normalmente conhecido que procedimentos depurificação de anticorpo, tipicamente, requerem umdeterminado número de técnicas de separação, tais como,separações por cromatografia (por exemplo, cromatografia daProteína A, cromatografia por troca de ions e similares).Uma conseqüência desse modo de separação requer o uso de umcerto número de diferentes tampões. Por exemplo, oprocedimento de purificação de anticorpo descrito nodocumento de patente WO 2004/076485 requer o uso deglicina/glicinato 50mM, pH de 8,0, para a cromatografia daProteína A, Tris-HCl 50mM, pH de 8,0 e fosfato de sódio20mM, pH de 6,5, para a cromatograf ia de Q-Sefarose, eTris-HCl 25mM, pH de 8,6, para cromatografia DEAE-sefarose.
Ao contrário, a presente invenção requer o uso deum-simples tampão de acetato em uma concentração fixa e emum predeterminado pH presente na dita composição, o quetraz a vantagem de estar presente em todas as etapas depurificação de anticorpo de IL-13, Assim, o uso dessetampão, não apenas no começo do processo de purificação,mas também em todo o processo de purificação, resulta,portanto, numa redução do tempo de processamento, de custoe.aumento de produção do produto.
Deverá ser observado que as referências ao
"anticorpo" incluem as referências a uma imunoglobulina,natural ou produzida parcial ou totalmente sintética. 0termo também cobre qualquer polipetideo ou proteínacompreendendo um domínio de ligação a antígeno.
Fragmentos de anticorpos que compreendem um
domínio de ligação a antígeno são moléculas, tais como,Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; e diabodies (dímeros de scFv) .
É possível se tomar anticorpos monoclonais eoutros anticorpos e se utilizar técnicas de tecnologia deDNA recombinante para produzir outros anticorpos oumoléculas quiméricas que retenham a especificidade doanticorpo original. Essas técnicas podem envolver aintrodução de codificação do DNA na região deimunoglobulina variável ou em regiões de determinação decomplementaridade (CDRs), de um anticorpo para as regiõesconstantes ou regiões constantes mais regiões de estruturade uma diferente imunoglobulina. Consultar, por exemplo, osdocumentos de patentes ΕΡ-Δ-184187, GB 2,188,638-A ou EP-A-239400, e uma ampla variedade de literatura subseqüente.
Alternativamente, novas regiões de VH ou VLportadoras de seqüências derivadas de CDR podem ser geradasusando mutagênese aleatória de um ou mais genesselecionados de VH e/ou VL, a fim de gerar mutações em todoo dominio variável. Essa técnica é descrita por Gram etal. , PNAS, USA, 1992, 89, 3576-3580, que utiliza PCR depropensão a erro. Outro método que pode ser usado é dirigira mutagênese para regiões de CDR de genes VH e VL. Essastécnicas sao divulgadas por Barbas et al., PNAS, USA, 1994,91, 3809-3813 e Schier et al., J. Mol. Biol., 1996, 263,551-567.
Como os anticorpos podem ser modificados dediversas maneiras, o termo "anticorpo" deve ser consideradocomo cobrindo qualquer elemento de ligação especifica ousubstância tendo um dominio de ligação a antigeno, com anecessária especificidade. Assim, esse termo cobre osfragmentos e derivados de anticorpos, incluindo qualquerpolipetideo que compreenda um dominio de ligação aimunoglobulina, tanto natural como total ou parcialmentesintética. As moléculas quiméricas compreendendo um dominiode ligação a imunoglobulina ou equivalente, fundidas aoutro polipetideo, são, portanto, incluídas. A clonagem eexpressão de anticorpos quiméricos são descritas nosdocumentos de patentes EP-A-0120694 e EP-A-0125023 e numaampla variedade de literatura subseqüente.
Outros procedimentos disponíveis no estado datécnica de engenharia de anticorpos tornou possível seisolar anticorpos humanos e humanizados. Por exemplo, oshibridomas humanos podem ser feitos conforme descrito porKontermann et al., [2001; Antibody Engineering, SpringerLaboratory Manuais]. A exibição do fago, uma outra técnicaestabelecida para a geração de elementos de ligaçãoespecífica, foi descrita em detalhes em diversaspublicações, tais como, Kontermann et al. (supra) edocumento de patente WO 92/01047, Camundongos transgênicos,em que os genes do anticorpo do camundongo são inativados efuncionalmente substituídos por genes de anticorpo humano,deixando intacto outros componentes do sistema imune docamundongo, podem ser usados para isolamento de anticorposhumanos em· antígenos humanos. A exibição do ribossomo, umatecnologia de translação isento de célula que introduzmutações em seqüências de genes conhecidas, pode também serusada para gerar e/ou otimizar elementos de ligaçãoespecífica [Hanes e Plückthun, PNAS, USA, 1994, 94, 4937-4942; He and Taussig Nucleic Acids Res., 1997, 25, 5132-5134; Schaffitzel et al., J. Immunol. Methods, 1999, 231,119-135; He et al., J. Immunol. Methods, 1999, 231, 105-117; He et al., Methods Mol. Biol., 2004, 248, 177-189].
As moléculas de anticorpos sintéticos podem sercriadas pela expressão de genes gerados por meio deoligonucleotídeos sintetizados e construídos com adequadosvetores de expressão, por exemplo, conforme descrito porKnappik et al., J. Mol. Biol., 2000, 296, 57-86 ou porKrebs et al., Journal of Immunological Methods, 2001, 254,67-84,
Foi mostrado que os fragmentos de um anticorpointeiro podem executar a função de antígenos de ligação.Exemplos de fragmentos de ligação são: (i) o fragmento Fab,consistindo de domínios de VL, VH, CL e CHI; (ii) ofragmento Fd, consistindo de domínios de VH e CHI; (iii) ofragmento Fv, consistindo de domínios de VL e VH de umúnico anticorpo; (iv) o fragmento dAb [Ward, E. S. et al.,Nature, 1989, 341, 544-546; McCafferty et al., Nature,1990, 348, 552-554; Holt et al., Trends Biotechnol. 2003,21 (11), 484-490] que consiste de um domínio de VH ou VL;(v) regiões de CDR isoladas; (vi) F(ab'), 2 fragmentos, umfragmento bivalente compreendendo dois fragmentos de Fabligados; (vii) moléculas de Fv de cadeia única (scFv), ondeum domínio de VH e um domínio de VL são ligados por umligador de peptídeo que permite aos dois domínios seassociarem para formar um local de ligação a antígeno [Birdet al., Science, 1988, 242, 423-426; Huston et al., PNAS,USA, 1988, 85, 5879-5883]; (viii) dímeros de Fv de cadeiabi-específica única (documento de patente PCT/US92/09965);e (ix) "diabodies", fragmentos multivalentes ou multi-específicos construídos por meio de fusão de genes[documento de patente WO 94/13804; P. Holliger et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993, 90, 6444-6448]. Asmoléculas Fv, scFv ou moléculas de diabody podem serestabilizadas mediante incorporação de ligações ou pontesde dissulfeto, que ligam os domínios de VH e VL [Y. Reiteret al., Nature Biotech., 1996, 14, 1239-1245]. Minicorposcompreendendo uma scFv unida a um domínio de CH3 podemtambém ser feitos [S. Hu et al., Câncer Res., 1996, 56,3055-3061].
Quando anticorpos bi-específicos devem serusados, estes podem ser anticorpos bi-específicosconvencionais, os quais podem ser fabricados de umavariedade de maneiras [Holliger and Winter Current OpinionBiotechnol., 1993, 4, 446-449], por exemplo, preparadosquimicamente ou a partir de hibridomas híbridos ou podemser quaisquer dos fragmentos de anticorpos bi-específicosmencionados acima. Exemplos de anticorpos bi-específicosincluem aqueles da tecnologia BiTE, em que os domínios deligação de dois anticorpos com diferente especificidadepodem ser usados e diretamente ligados através de curtospeptídeos flexíveis. Isto combina dois anticorpos em umaúnica cadeia de polipetídeo curta. Os diabodies e scFvpodem ser construídos sem uma região de Fc, usando apenasdomínios variáveis, reduzindo potencialmente os efeitos dareação anti-idiotípica.
Os diabodies bi-específicos, que se opõem a todosos anticorpos bi-específicos, podem ser tambémparticularmente úteis, pelo fato de poderem ser facilmentereconstruídos e expressos na E. coli. Os diabodies (emuitos outros polipetídeos, como os fragmentos deanticorpos) de apropriada especificidade de ligação podemser facilmente selecionados usando a exibição de fagos(conforme descrito no documento de patente WO 94/13804) apartir das bibliotecas. Se um braço do diabody é para sermantido constante, por exemplo, com uma especificidadedirigida contra a IL-13, então pode ser feita umabiblioteca onde o outro braço é variado, sendo selecionadoum anticorpo de apropriada especificidade. Anticorposinteiramente bi-especificos podem ser feitos através daengenharia do tipo "botões-em-furos" [Ridgeway et al.,Protein Eng., 1996, 9, 616-621].
Deverá ser observado que as referências a um"anticorpo de IL-13" incluem as referências a um inteiroanticorpo ou fragmento de anticorpo que é capaz deneutralizar uma IL-13 de ocorrência natural, numaconcentração inferior a 500nM, conforme os ensaiosestabelecidos nos Exemplos 2-10 e 25 do documento depatente WO 2005/007699,
Preferivelmente, o anticorpo de IL-13 neutralizaa IL-13 de ocorrência natural com uma atividadefarmacológica que é igual ou melhor que a atividadefarmacológica de um local de ligação a um antigeno deIL-13, formado pelo domínio BAK502G9 VH (SEQ ID NO:15, nodocumento de patente WO 2005/007699) e domínio BAK502G9 VL(SEQ ID NO:16, no documento de patente WO 2005/007699).
Preferivelmente, o anticorpo de IL-13 é umanticorpo monoclonal de IL-13, mais preferivelmente, umanticorpo monoclonal de IL-13 humano.Um anticorpo de IL-13 particularmente preferido éum anticorpo selecionado dentre aqueles descritos nosdocumentos de patentes WO 2003/035847, WO 2003/086451, WO2005/007699 ou WO 2005/081873.
Por exemplo, em uma modalidade particularmente
preferida, o anticorpo de IL-13 é BAK278D6 HCDR1-3 e LCDRl-3 (SEQ ID NOS: 1-6, no documento de patente WO 2005/007699,respectivamente). Um conjunto de CDR's com o conjunto deBAK278D6 de CDR's, conjunto BAK278D6 de HCDR's ou BAK278D6LCDR's, ou uma ou duas substituições no mesmo, é dito comosendo da linha celular BAK278D6.
Numa outra modalidade particularmente preferida,o anticorpo de IL-13 é BAK502G9 HCDR1-3 e LCDR1-3 (SEQ IDNOS: 7-12, no documento de patente WO 2005/007699,respectivamente).
Ainda numa outra modalidade particularmentepreferida, o anticorpo de IL-13 é BAK1111D10 HCDR1-3 eLCDR1-3 (SEQ ID NOS: 91-96, no documento de patente WO2005/007699, respectivamente).
Em ainda outra modalidade particularmente
preferida, o anticorpo de IL-13 é BAK1167F2 HCDR1-3 eLCDR1-3 (SEQ ID NOS: 61-66, no documento de patente WO2005/007699, respectivamente).
Ainda numa outra modalidade particularmentepreferida, o anticorpo de IL-13 é BAK1183H4 HCDR1-3 eLCDR1-3 (SEQ ID NOS: 97-102, no documento de patente WO2005/007699, respectivamente).O adequado conjunto de CDR's é provido dentro deregiões de estrutura de anticorpo ou de outras armações deproteínas, por exemplo, fibronectina ou citocromo B [Koideet al. , J. Mol. Biol., 1998, 284, 1141-1151; Nygren et al.,Current Opinion in Structural Biology, 1997, 7, 463-469].Preferivelmente, são empregadas regiões de estrutura deanticorpo, e quando são empregadas, elas sãopreferivelmente da linha de microorganismos, maispreferivelmente, a região de estrutura de anticorpo paracadeia pesada pode ser a DP14 da família VHl, A região deestrutura preferida para cadeia leve pode ser λ3-3Η. Para oconjunto BAK502G9 de CDR's, é preferido que as regiões deestrutura de anticorpo sejam para VH FR1-3, as. SEQ ID NOS:27-29, no documento de patente WO 2005/007699,respectivamente, e para cadeia leve FR1-3, as SEQ ID NOS:30-32, no documento de patente WO 2005/007699,respectivamente. Numa modalidade preferida, um domínio deVH é provido com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:15, no documento de patente WO 2005/007699, este sendochamado de "domínio de VH BAK502G9". Numa outra modalidadealtamente preferida, é provido um domínio de VL com aseqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16, no documento depatente WO 2005/007699, este sendo chamado de "domínio deVL BAK502G9".
Numa modalidade preferida, o anticorpo de IL-13reage de forma cruzada com o cinomólogo de IL-13 e/ou avariante de IL-13, Q130R.Preferivelmente, ο anticorpo de IL-13 estápresente na composição farmacêutica numa quantidade entre 1e 200 mg/mL, mais preferivelmente, entre 50 e 100 mg/mL,especialmente, 50 mg/mL.
Preferivelmente, a composição farmacêutica étamponada para um pH de 5,2 a 5,7, mais preferivelmente, de5,5 ± 0,1, A seleção de tal pH confere uma significativaestabilidade para a composição farmacêutica. Exemplos detampões alternativos que controlam o pH nessa faixa, incluem os tampões de succinato, gliconato, histidina,citrato, fosfato, glutárico, cacodilite, maleato ácido desódio, tris-(hidroxilmetil)aminometano (Tris), ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES), imidazol e outros tampõesde ácidos orgânicos.
Preferivelmente, o tampão é um tampão de acetato,mais preferivelmente, acetato de sódio.
Preferivelmente, o tampão de acetato estápresente na composição farmacêutica numa quantidade entre 1e 100mM, mais preferivelmente, entre 30 e 70 mM,especialmente, 50 mM.
Deverá ser observado que as referências a um"excipiente farmaceuticamente aceitável" inclui asreferências a qualquer excipiente convencionalmente usadonas composições farmacêuticas. Esses excipientes podem, tipicamente, incluir um ou mais dentre tensoativos, salinorgânico ou orgânico, estabilizador, diluente,solubilizador, agente redutor, antioxidante, agentequelante, conservante e similares.Exemplos de um tensoativo típico incluem:- tensoativos não-iônicos (HLB 6 a 18), tais como, ésteresde ácido graxo de sorbitan (por exemplo, monocaprilato desorbitan, monolaurato de sorbitan, monopalmitato desorbitan), ésteres de ácido graxo de glicerina (porexemplo, monocaprilato de glicerina, monomiristato deglicerina, monoestearato de glicerina), ésteres de ácidograxo de poliglicerina (por exemplo, monoestearato dedecaglicerila, diestearato de decaglicerila, monolinoleatode decaglicerila), ésteres de ácido graxo de sorbitan-polioxietileno (por exemplo, monolaurato de sorbitan-polioxietileno, monooleato de sorbitan-polioxietileno,monoestearato de sorbitan-polioxietileno, monopalmitato desorbitan-polioxietileno, trioleato de sorbitan-
polioxietileno, triestearato de sorbitan-polioxietileno) ,ésteres de ácido graxo de sorbitol-polioxietileno (porexemplo, tetraestearato de sorbitol-polioxietileno,tetraoleato de sorbitol-polioxietileno), ésteres de ácidograxo de glicerina-polioxietileno (por exemplo,monoestearato de gliceril-polioxietileno), ésteres de ácidograxo de polietilenoglicol (por exemplo, diestearato depolietilenoglicol), éteres alquílicos de polioxietileno(por exemplo, éter laurilico de polioxietileno), éteresalquílicos de polioxietileno-polioxipropileno (por exemplo,éter de polioxietileno-polioxipropilenoglicol, éterpropílico de polioxietileno-polioxipropileno, éter cetílicode polioxietileno-polioxipropileno), éteres alquilfenílicosde polioxietileno (por exemplo, éter nonilfeníIico depolioxietileno), óleos de mamona hidrogenado-polioxietileno(por exemplo, óleo de mamona-polioxietileno, óleo de mamonahidrogenado-polioxietileno), derivados de cera de abelha-polioxietileno (por exemplo, cera de abelha de sorbitol-polioxietileno), derivados de lanolina-polioxietileno (porexemplo, lanolina-polioxietileno), e amidas de ácido graxode polioxietileno (por exemplo, estearil-amida depolioxietileno);
- tensoativos aniônicos, tais como, sais de sulfato de C10-C18 alquila (por exemplo, sulfato de cetil sódico, sulfatode lauril sódico, sulfato de oleil sódico), sais de sulfatode éter de polioxietileno C10-C18 alquila, com uma média de2 a 4 moles de óxido de etileno (por exemplo, sulfato delauril-polioxietileno sódico), e sais de éster desulfosuccinato de C8-C18 alquila (por exemplo, éster desulfosuccinato de lauril sódico); e tensoativos naturais,tais como, lecitina, glicero-fosfolipideo, esfingo-fosfolipideos (por exemplo, esfingo-mielina), e ésteres desacarose de ácidos C12-C18 graxos.
Preferivelmente, o tensoativo é selecionado deésteres de ácido graxo de sorbitan-polioxietileno.Particularmente e preferivelmente, o tensoativo éPolissorbato 20, 21, 40, 60, 65, 80, 81 e 85, maispreferivelmente, Polissorbato 20 e 80, especialmente,Polissorbato 80,
Preferivelmente, o tensoativo está presente nacomposição farmacêutica numa quantidade entre 0,001 e 0,1%(peso/peso), mais preferivelmente, entre 0,005 e 0,05(peso/peso), especialmente, numa quantidade de 0,01%(peso/peso).
Exemplos de um sal inorgânico típico incluem:cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio,fosfato de sódio, sulfato de sódio, sulfato de amônio,fosfato de potássio e bicarbonato de sódio ou qualqueroutro sal de sódio, potássio ou cálcio. Preferivelmente, osal inorgânico é cloreto de sódio.
Preferivelmente, o sal inorgânico está presentena composição farmacêutica numa quantidade entre 10 e200mM, mais preferivelmente, entre 60 e 130mM,especialmente, numa quantidade de 85mM.
Exemplos de um agente redutor incluem N-acetil-cisteína, N-acetil-homocisteína, ácido tiótico,
tiodiglicol, tioetanolamina, tioglicerol, tiossorbitol,ácido tioglicólico e um sal do mesmo, tiossulfato de sódio,glutationa e um ácido Ci-C7 tioalcanóico.
Exemplos de um antioxidante incluem ácidoeritórbico, dibutilidroxitolueno, butilidroxianisol, alfa-tocoferol, acetato de tocoferol, ácido L-ascórbico e um saldo mesmo, palmitato de ácido L-ascórbico, estearato deácido L-ascórbico, bissulfito de sódio, sulfito de sódio,gaiato de triamila e gaiato de propila.
Exemplos de um agente quelante incluemetilenodiamino-tetraacetato dissódico (EDTA), pirofosfatode sódio e metafosfato de sódio.
Exemplos de um estabilizador incluem creatinina,um aminoácido selecionado de histidina, alanina, ácidoglutâmico, glicina, leucina, fenilalanina, metionina,isoleucina, prolina, ácido aspártico, arginina, lisina etreonina, um carboidrato selecionado de sacarose, trealose,sorbitol, xilitol e manose, tensoativos selecionados depolietilenoglicol (PEG; por exemplo, PEG3350 ou PEG4000) ouésteres de ácido graxo de sorbitan-polioxietileno (porexemplo, Polissorbato 20 ou Polissorbato 80) , ou qualquercombinação dos mesmos.
Numa modalidade preferida, o estabilizadorcompreende um único carboidrato, conforme anteriormentedefinido (por exemplo, trealose).
Numa modalidade alternativamente preferida, oestabilizador compreende uma combinação de aminoácidos comum carboidrato (por exemplo, trealose e alanina outrealose, alanina e glicina).
Numa outra modalidade alternativamente preferida,o estabilizador compreende um aminoácido em combinação comum carboidrato e um tensoativo (por exemplo, trealose,alanina e PEG350, ou trealose, prolina e PEG350, outrealose, alanina e Polissorbato 80, ou trealose, prolina ePolissorbato 80, ou trealose, alanina, glicina e PEG3350,ou trealose, alanina, glicina e Polissorbato 80) .
Ainda numa outra modalidade alternativamentepreferida, o estabilizador compreende um aminoácido emcombinação com um tensoativo (por exemplo, alanina ePEG3350 ou alanina, glicina e PEG3350).
Ainda numa outra modalidade alternativamentepreferida, o estabilizador compreende um carboidrato emcombinação com um tensoativo (por exemplo, trealose ePEG3350 ou trealose e Polissorbato 80).
Exemplos de um conservante incluem cloreto deoctadecildimetilbenzil-amônio, cloreto de hexametônio,cloreto de benzalcônio (uma mistura de cloretos dealquilbenzildimetilamônio, em que os grupos alquila sãocompostos de cadeia longa), cloreto de benzetônio, alcoóisaromáticos, tais como, fenol, álcool butilico e álcoolbenzilico, alquil-parabens, tais como, metil ou propil- paraben, catecol, resorcinol, cicloexanol, 3-pentanol e m-cresol.
Numa modalidade preferida da invenção, acomposição farmacêutica compreende um anticorpo de IL-13,um tensoativo e um sal inorgânico, tamponados para um pH de5,5 ± 0,1, com um tampão de acetato.
Numa adicional modalidade preferida da invenção,a composição farmacêutica compreende um anticorpo de IL-13e Polissorbato 80, tamponados para um pH de 5,5 ± 0,1, com,um tampão de acetato de sódio.
Ainda numa outra modalidade preferida dainvenção, a composição farmacêutica compreende 50mg/mL deum anticorpo de IL-13, cloreto de sódio a 85mM ePolissorbato 80 a 0,01% (peso/peso), tamponados para um pHde 5,5 ± 0,1, com um tampão de acetato de sódio a 50mM.
De acordo com um segundo aspecto da invenção, éproporcionado um processo para purificação de um anticorpode IL-13, cujo processo compreende uma ou mais etapas deseparação cromatográfica, em que cada das ditas etapas deseparação compreende a elução com um tampão de elução, oqual compreende um ou mais excipientes farmaceuticamenteaceitáveis, tamponados para um pH de 3,5-7,0 com um tampãode acetato.
Preferivelmente, a um ou mais etapas de separação
cromatográfica são selecionadas de cromatografia deafinidade (por exemplo, cromatografia de afinidade daProteína A ou Proteína G) , cromatografia de troca de íons(por exemplo, cromatografia de troca de cátion e anion),cromatografia de interação hidrofóbica (por exemplo,cromatografia de fenila), cromatografia de hidroxiapatita,cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia deafinidade de metal imobilizado, cromatografia de interaçãohidrofílica, cromatografia de adsorção tiofílica,cromatografia de adsorção de euglobulina, cromatografia deligando de corante, ou cromatografia de boronatoimobilizado. De modo mais preferível, a separaçãocromatográfica é executada por cromatografia de afinidadeda Proteína A, seguida de cromatografia de troca de cátion(por exemplo, usando uma matriz de SP-sefarose), seguido decromatografia de troca de anion (por exemplo, usando umamatriz de Q-sefarose).
Preferivelmente, o um ou mais excipientesfarmaceuticamente aceitáveis compreendem um sal inorgânico,tal como, cloreto de sódio.
Preferivelmente, o sal inorgânico está presenteno tampão de elução numa quantidade entre 10 e 200mM, maispreferivelmente, entre 60 e 130mM, especialmente, numaquantidade de 85mM.
Exemplos de tampões alternativos que controlam opH na faixa de 3,5-7,0 incluem os tampões de succinato,gliconato, histidina, citrato, fosfato e outros tampões deácidos orgânicos.
Preferivelmente, o tampão é um tampão de acetato,mais preferivelmente, de acetato de sódio.
Preferivelmente, o tampão de acetato estápresente no tampão de elução numa quantidade entre 1 e100mM, mais preferivelmente, entre 30 e 70mM,especialmente, numa quantidade de 50mM.
Mais preferivelmente, o tampão de eluçãocompreende acetato de sódio a 50mM, e cloreto de sódio a85mM, tamponados para um pH de 5,5 ± 0,1.
Um ácido nucléico que codifica qualquer anticorpode IL-13 da invenção (por exemplo, CDR ou um conjunto deCDRs, ou um domínio de VH ou domínio de VL, ou um local deligação a antígeno de anticorpo ou molécula de anticorpo,por exemplo, scFv ou IgG4, conforme fornecido), pode serexpresso mediante cultura sob apropriadas condições decélulas recombinantes hospedeiras contendo o referido ácidonucléico. Após a produção mediante expressão de um domíniode VH ou VL ou de elemento de ligação específica, pode serisolado e/ou purificado usando qualquer técnica adequada,conforme apropriado.
Elementos de ligação específica, domínios de VHe/ou VL e moléculas e vetores codificadores de ácidonucléico podem ser fornecidos isolados e/ou purificados,por exemplo, a partir de seu ambiente natural, numa formasubstancialmente pura ou homogênea ou, no caso do ácidonucléico, livre ou substancialmente livre de ácido nucléicoou gene de origem diferente da seqüência codificadora de umpolipetideo com a necessária função. O ácido nucléico podecompreender DNA ou RNA e pode ser total ou parcialmentesintético.
Uma referência a uma seqüência de nucleotideoconforme aqui estabelecida, inclui uma molécula de DNA coma seqüência especificada e uma molécula de RNA com aseqüência especificada, em que U é substituído por T, amenos que o contexto requeira de outro modo.
Os sistemas para clonagem e expressão de umpolipetideo em uma variedade de diferentes célulashospedeiras são bem conhecidos. Adequadas célulashospedeiras incluem as bactérias, células de mamíferos,células de plantas, leveduras e sistemas de baculovirus, eplantas transgênicas e animais.
As linhas celulares de mamíferos disponíveis nosegmento da técnica para expressão de um polipetideoheterólogo incluem as células de ovário de criceto Chinês(CHO), as células HeLa, células de rins de criceto recém-nascido, células de melanoma de camundongo NSO, células dede mieloma de rato YB2/0, células de rins embriônicoshumanos, células de retina embriônica humana e muitas outras.Preferivelmente, a dita linha celular de mamíferoé uma cultura de célula de mieloma, tal como, células deNSO [Galfre and Milstein Methods Enzymology, 1981, 73, 3] .As células de mieloma são células de plasmacitoma, isto é,células da linhagem de célula de Iinfóide. Um exemplo dalinha celular NSO é, por exemplo, a linha celular ECACC No.85110503, livremente disponível da European Collection ofCell Cultures (ECACC) , Centre for Applied Microbiology &Research, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Reino Unido. Alinha celular NSO foi descoberta como sendo capaz deproporcionar o surgimento de rendimentos de produtosextremamente altos, em particular, se usada para a produçãode anticorpos recombinantes.
Uma linha celular de mamífero alternativamentepreferida inclui as células de ovário de criceto Chinês(CHO). Estas células podem ser deficientes de diidrofolatoredutase (dhfr) e, assim, dependentes da timidina ehipoxantina para o crescimento [PNAS, 1990, 77, 4216-4220].A linha celular parental de CHO dhfr é transfectada com ogene de anticorpo e o gene dhfr, o que possibilita aseleção de transformantes de célula CHO de fenótipopositivo de dhfr. A seleção é realizada mediante cultura decolônias em um meio desprovido de timidina e hipoxantina,cuja ausência impede que as células não-transformadascresçam e as células transformadas tornem a se recuperar docaminho de folato, dessa forma, escapando do sistema deseleção. Esses transformantes normalmente expressam baixosníveis do gene produto, em virtude da co-integração deambos os genes transfectados. Os níveis de expressão dogene de anticorpo podem ser aumentados através deampliação, usando metotrexato (MTX). Esta droga é uminibidor direto da enzima dhfr e permite o isolamento decolônias resistentes que amplificam seu número de cópias degene de dhfr de modo suficiente, para sobreviver sob essascondições. Uma vez que a diidrofolato redutase (dhfr) e osgenes de anticorpo estão mais proximamente ligados nostransformantes originais, ocorre uma ampliação normalmenteconcomitante e, portanto, um aumento de expressão dodesejado gene de anticorpo.
Outro sistema de seleção para uso com células deCHO ou células de mieloma é o sistema de ampliação deglutamina sintetase (GS) descrito no documento de patenteWO 87/04462, Esse sistema envolve a transfecção de umacélula com um gene codificador da enzima GS e o desejadogene de anticorpo. As células são depois selecionadas,crescendo em um meio isento de glutamina. Estas célulasselecionadas são depois submetidas à inibição da enzima GSusando metionina-sulfoximina (MSX) . As células, a fim desobreviverem, irão ampliar o gene GS com a simultâneaampliação do gene codificador do anticorpo.
A expressão de anticorpos e fragmentos deanticorpos em células procarióticas, tais como, E. coli, ébem estabelecida no segmento da técnica. Para uma melhoranálise, consultar, por exemplo, Pluckthun A.,Bio/Technology, 1991, 9, 545-551, A expressão em célulaseucarióticas na cultura é também disponível para osespecialistas versados na técnica como uma opção deprodução de um elemento de ligação especifica, por exemplo,conforme descrito por [Chadd H. E. e Chamow S.M., CurrentOpinion in Biotechnology, 2001, 12, 188-194; Andersen D.C.
e Krummen L., Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13,117; Larrick J.W. e Thomas D.W., Current opinion inBiotechnology 2001, -12, 411-418] .
Adequados vetores podem ser escolhidos ouconstruídos, contendo apropriadas seqüências reguladoras,incluindo seqüências promotoras, seqüências terminadoras,seqüências de poliadenilação, seqüências reforçadoras,genes marcadores e outras seqüências, caso apropriado. Osvetores podem ser plasmídeos, por exemplo, "fago oufagemídeo", caso apropriado. Para maiores detalhes,consultar, por exemplo, a publicação "Molecular Cloning: aLaboratory Manual"; 3a. edição, Sambrook e Russell, 2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press. Diversas técnicas eprotocolos conhecidos para manipulação de ácido nucléico,por exemplo, na preparação de construções de ácido nucléico, em mutagênese, sequenciamento, introdução de DNAem células e expressão de gene, e análise de proteínas, sãodescritas em detalhes nas publicações "Current Protocols inMolecular Biology", 2a. Edição, Ausubel et al., editores,John Wiley & Sons, 1988; "Short Protocols in MolecularBiology: A Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology", Ausubel et al., editores, John Wiley &Sons, 4a. Edição, 1999, As divulgações de Sambrook et al. Ede Ausubel et al. (ambas) são aqui incorporadas por meiodessas referências.
A introdução de um ácido nucléico em uma célulahospedeira pode utilizar qualquer técnica disponível. Paraas células eucarióticas, técnicas adequadas podem incluir atransfecção de fosfato de cálcio, eletroporação por DEAE-Dextrano, transfecção e transdução mediadas por lipossomousando retrovírus ou outros vírus, por exemplo, vacina, oupara células de insetos, baculovirus. A introdução de ácidonucléico na célula hospedeira, em particular, numa célulaeucariótica, pode utilizar um sistema viral ou à base deplasmídeo. 0 sistema de plasmídeo pode ser mantidoepissomalmente ou pode ser incorporado na célula hospedeiraou em um cromossomo artificial [Csonka E. et al., Journalof Cell Science, 2002, 113, 3207-3216; Vanderbyl S. et al.,Molecular Therapy, 2002, 5 (5), 10]. A incorporação podeser aleatória ou uma integração almejada de uma ou maiscópias em um lugar específico único ou múltiplo. Para ascélulas bacterianas, técnicas adequadas podem incluirtransformação com cloreto de cálcio, eletroporação einfecção, usando bacteriófagos.
A introdução pode ser seguida por provocação oupermissão de expressão do ácido nucléico, por exemplo,mediante cultura de células hospedeiras, sob condições paraexpressão de gene.
Em uma modalidade, o ácido nucléico da invenção éintegrado ao genoma (por exemplo, cromossomo) da célulahospedeira.A integração pode ser promovida através dainclusão de seqüências que promovem a recombinação com ogenoma, em conformidade com técnicas padrões.
De acordo com um terceiro aspecto da invenção, éproporcionado o uso de uma composição farmacêutica contendoum anticorpo, conforme anteriormente definido, nafabricação de um medicamento para o tratamento de umdistúrbio correlacionado à IL-13,
Preferivelmente, o distúrbio correlacionado à IL-13 é selecionado de asma, dermatite atópica, rinitealérgica, fibrose, doença pulmonar obstrutiva crônica,escleroderma, doença inflamatória do intestino e linfoma deHodgkin. A composição da invenção pode também ser usada notratamento de tumores e infecções virais, na medida em queos anticorpos de IL-13 irão inibir a imunossupressãomediada pela IL-13, Mais preferivelmente, o distúrbiocorrelacionado à IL-13 é a asma.
A invenção proporciona ainda um método detratamento ou profilaxia de um distúrbio correlacionado àIL-13, cujo método compreende a administração a um pacientede uma quantidade terapeuticamente efetiva de umacomposição farmacêutica contendo um anticorpo, conformeanteriormente definido.
A invenção proporciona ainda uma composiçãofarmacêutica contendo um anticorpo, conforme anteriormenteaqui definido, para uso no tratamento de um distúrbiocorrelacionado à IL-13,A composição farmacêutica da invenção pode seruma formulação liquida ou uma formulação liofilizada, aqual é reconstituída antes de ser usada. Como excipientespara uma formulação liofilizada, podem ser usados, porexemplo, alcoóis de açúcar ou sacarídeos (por exemplo,manitol ou qlicose). No caso de uma formulação líquida, acomposição farmacêutica da invenção é normalmente providana forma de frascos com volume definido, incluindo frascosde plástico ou de vidro lacrados e esterilizados, ampolas e seringas, assim como, na forma de recipientes de grandevolume, como, por exemplo, garrafas. Preferivelmente, acomposição da invenção é uma formulação líquida.
A composição farmacêutica da invenção pode seradministrada oralmente, mediante injeção (por exemplo, pelas vias subcutânea, intravenosa, intraperitoneal ouintramuscular), através de inalação ou topicamente (porexemplo, pelas vias intraocular, intranasal, retal, dentrode feridas ou sobre a pele) . A rota de administração podeser determinada pelas características físico-químicas dotratamento, por especiais considerações quanto à doença oupela necessidade de otimização da eficácia ou minimizaçãodos efeitos colaterais.
Preferivelmente, a composição da invenção éadministrada por meio de injeção subcutânea. É pretendido que o tratamento não se restrinja ao uso em uma clínica.Portanto, uma injeção subcutânea usando um dispositivoisento de agulha pode ser também preferida.De acordo com a invenção, as composições providaspodem ser administradas em indivíduos. A administração,preferivelmente, se faz numa "quantidade terapeuticamenteefetiva", esta quantidade sendo suficiente para mostrarbenefício a um paciente. Tal benefício pode ser pelo menosuma melhora de pelo menos um sintoma. A quantidadeadministrada em questão e a velocidade e período de tempode administração irão depender da natureza e gravidade dadoença que está sendo tratada. A prescrição do tratamento,por exemplo, decisões sobre a dosagem, etc., é deresponsabilidade dos clínicos gerais e de outros médicos.Doses apropriadas de anticorpos são bem conhecidas nosegmento da técnica, consultar, por exemplo, as publicaçõesde [ Ledermann J.A. et al., Int. J. Câncer, 1999, 47, 659-664; Bagshawe K. D. et al., Antibody, Immunoconjugates andRadiopharmaceuticais, 1991, 4, 915-922].
A dose exata irá depender de um determinadonúmero de fatores, incluindo o tamanho e a localização daárea a ser tratada, da exata natureza do anticorpo (porexemplo, anticorpo integral, fragmento ou diabody) e danatureza de qualquer rótulo detectável ou outra moléculafixada ao anticorpo. Uma dose de anticorpo típica será nafaixa de 100pg a 10g para aplicações sistêmicas e de Ipg a100mg para aplicações tópicas.
Tipicamente, o anticorpo será um anticorpointegral, preferivelmente, o isótipo de IgG4, Uma dose paraum único tratamento de um paciente adulto pode serproporcionalmente ajustada para meninos e crianças e tambémajustada para outros formatos de anticorpo na proporçãorelativa ao peso molecular. Os tratamentos podem serrepetidos em intervalos diários, de duas vezes por semana,semanais ou mensais, de acordo com a orientação do médico.
Em modalidades preferidas da presente invenção, otratamento é periódico e o intervalo entre asadministrações é de cerca de duas ou mais semanas,preferivelmente, de cerca de três ou mais semanas, maispreferivelmente, de cerca de quatro ou mais semanas oucerca de uma vez ao mês.
Breve Descrição das Figuras
A figura 1 mostra os resultados da análise deSDS-PAGE de amostras no dia 1 de um exame de estabilidadede 28 dias, com relação à composição da invenção.
A figura 2 mostra os resultados da análise deSDS-PAGE de amostras no dia 21 de um exame de estabilidadede 28 dias, com relação à composição da invenção.
A figura 3 mostra os resultados da análise de GP-HPLC de amostras no dia 1 de um exame de estabilidade de 28dias, com relação à composição da invenção.
A figura 4 mostra um amálgama dos resultadosobtidos da análise de GP-HPLC de diversas amostras, duranteuma determinação de estabilidade de 28 dias da composiçãoda invenção, a uma temperatura de 2-8°C.
A figura 5 mostra um amálgama dos resultadosobtidos da análise de GP-HPLC de diversas amostras, duranteuma determinação de estabilidade de 28 dias da composiçãoda invenção, a uma temperatura de 25°C.A figura 6 mostra um amálgama dos resultadosobtidos da análise de GP-HPLC de diversas amostras, duranteuma determinação de estabilidade de 28 dias da composiçãoda invenção, quando neutralizadas com diferentes tampões.
A figura 7 mostra os resultados da análise de IEFde diversas amostras, no dia 28 de uma determinação deestabilidade de 28 dias da composição da invenção.
A figura 8 mostra os resultados da análise deHPLC por filtração de gel de uma determinação deestabilidade de 12 meses, de diferentes formulaçõesarmazenadas à temperatura de -70°C.
A figura 9 mostra os resultados da análise deHPLC por filtração de gel de uma determinação deestabilidade de 12 meses, de diferentes formulações armazenadas à temperatura de +5°C.
A figura 10 mostra os resultados da análise deHPLC por filtração de gel de uma determinação deestabilidade de 12 meses, de diferentes formulaçõesarmazenadas à temperatura de +25°C.
A figura 11 mostra os resultados da análise de
HPLC por filtração de gel de uma determinação deestabilidade de 8 semanas, de diferentes formulaçõesarmazenadas à temperatura de +37°C.
A figura 12 mostra os resultados da análise deHPLC por filtração de gel de uma determinação deestabilidade de 5 dias, de diferentes formulaçõesarmazenadas à temperatura de +45°C.A figura 13 mostra os resultados da análise deSDS-PAGE em 0, 6 e 12 meses, durante uma determinação deestabilidade de 12 meses de diferentes formulaçõesarmazenadas à temperatura de -70°C.
A figura 14 mostra a percentagem abundante decadeias pesadas e leves de BAK502G9, após uma análisereduzida de SDS-PAGE, como mostrado na figura * 13, quandoarmazenadas à temperatura de -70°C.
A figura 15 mostra os resultados da análisereduzida de SDS-PAGE, em 0, 6 e 12 meses, durante umadeterminação de estabilidade de 12 meses de diferentesformulações, quando armazenadas à temperatura de +5°C.
A figura 16 mostra a percentagem abundante decadeias pesadas e leves de BAK502G9, após uma análisereduzida de SDS-PAGE, como mostrado na figura 15, quandoarmazenadas à temperatura de +5°C.
A figura 17 mostra os resultados da análisereduzida de SDS-PAGE, em 0, 6 e 12 meses, durante umadeterminação de estabilidade de 12 meses de diferentesformulações, quando armazenadas à temperatura de +25°C.
A figura 18 mostra a percentagem abundante decadeias pesadas e leves de BAK502G9, após uma análisereduzida de SDS-PAGE, como mostrado na figura 17, quandoarmazenadas à temperatura de +25°C.
A figura 19 mostra os resultados da análisereduzida de SDS-PAGE, em 0 e 8 semanas, durante umadeterminação de estabilidade de 8 semanas de diferentesformulações, quando armazenadas à temperatura de +37°C.A figura 20 mostra a percentagem abundante decadeias pesadas e leves de BAK502G9, após uma análisereduzida de SDS-PAGE, como mostrado na figura 19, guandoarmazenadas à temperatura de +37°C.
A figura 21 mostra os resultados da análisereduzida de SDS-PAGE, em 0 e 5 dias, durante umadeterminação de estabilidade de 5 dias de diferentesformulações, guando armazenadas à temperatura de +45°C.
A figura 22 mostra a percentagem abundante decadeias pesadas e leves de BAK502G9, após uma análisereduzida de SDS-PAGE, como mostrado na figura 21, guandoarmazenadas à temperatura de +45°C.
A figura 23 mostra os resultados da análise não-reduzida de SDS-PAGE, em 0, 6 e 12 meses, durante umadeterminação de estabilidade de 12 meses de diferentesformulações, guando armazenadas à temperatura de -700C.
A figura 24 mostra a percentagem abundante domonômero intacto de BAK502G9, após uma análise não-reduzidade SDS-PAGE, como mostrado na figura 23, quando armazenadasà temperatura de -70°C.
A figura 25 mostra os resultados da análise não-reduzida de SDS-PAGE, em 0, 6 e 12 meses, durante umadeterminação de estabilidade de 12 meses de diferentesformulações, quando armazenadas à temperatura de +5°C.
A figura 26 mostra a percentagem abundante domonômero intacto de BAK502G9, após uma análise não-reduzidade SDS-PAGE, como mostrado na figura 25, guando armazenadasà temperatura de +5°C.A figura 27 mostra os resultados da análise não-reduzida de SDS-PAGE, em 0, 6 e 12 meses, durante umadeterminação de estabilidade de 12 meses de diferentesformulações, quando armazenadas à temperatura de +25°C.
A figura 28 mostra a percentagem abundante domonômero intacto de BAK502G9, após uma análise não-reduzidade SDS-PAGE, como mostrado na figura 27, quando armazenadasà temperatura de +25°C.
A figura 29 mostra os resultados da análise não-reduzida de SDS-PAGE, em 0 e 8 semanas, durante umadeterminação de estabilidade de 8 semanas de diferentesformulações, quando armazenadas à temperatura de +37°C.
A figura 30 mostra a percentagem abundante domonômero intacto de BAK502G9, após uma análise não-reduzidade SDS-PAGE, como mostrado na figura 29, quando armazenadasà temperatura de +37°C.
A figura 31 mostra os resultados da análise não-reduzida de SDS-PAGE, em 0 e 5 dias, durante umadeterminação de estabilidade de 5 dias de diferentesformulações, quando armazenadas à temperatura de +45°C.
A figura 32 mostra a percentagem abundante domonômero intacto de BAK502G9, após uma análise não-reduzidade SDS-PAGE, como mostrado na figura 31, quando armazenadasà temperatura de +45°C.
A presente invenção será agora ilustrada,simplesmente por meio de exemplos, fazendo-se referênciaaos métodos e exemplos seguintes.Exemplo 1:_Expressão do Anticorpo BAK502G9
0 anticorpo BAK502G9 foi expresso em uma linhacelular GS NSO, de maneira análoga aos procedimentosdescritos nos documentos de patentes WO 87/04462 e WO2004/076485 e produziu uma cultura de sobrenadante contendo598 mg/L do anticorpo BAK502G9,
'Exemplo 2: Purificação do Anticorpo BAK502G9(a) Purificação por Sefarose da Proteína A rmp
A coluna usada para a etapa de cromatografia defluxo rápido por Sefarose de Proteína A rmp foi de 2,6 cmde diâmetro, empacotada em 0,9% (peso/volume) de cloreto desódio, em uma altura de leito de 14,5 cm, proporcionando umvolume de coluna de 77 mL. A resina foi fornecida pela GEHealthcare/Amersham Biosciences, 17-5138, A cromatografiafoi executada usando uma bomba P-50, Amersham Biosciences,um detector UVl e um fluxo celular. A coluna foi limpa comcloridrato de guanidina 6M, antes de ser usada.
A coluna de cromatografia de fluxo rápido porSefarose de Proteína A rmp foi balanceada com 350 mL de umasolução salina tamponada de fosfato, pH de 7,2, seguido delavagem com água e limpeza. Em seguida, 2,6 L de cultura desobrenadante foram introduzidos diretamente na coluna a umavelocidade de 200 cm/h e sob a temperatura ambiente.
A coluna foi depois lavada com 567 mL de umasolução salina tamponada de fosfato, pH de 7,2, seguido de568 mL de acetato de sódio 50mM, pH de 5,55, 0 anticorpoBAK502G9 foi eluído da coluna mediante lavagem com 380 mLde acetato de sódio 50mM, pH de 3,75, Após a elução, acoluna foi lavada com ácido acético 50mM, pH de 3,0.
O pico da elução foi coletado entre uma deflexãode UV de um máximo de 2%, na inclinação ascendente edescendente do pico. Em seguida, 1,5 g do anticorpoBAK502G9 foram recuperadas em 217 mL.
(b) Inativação Viral de Baixo pH
O eluato de fluxo rápido de Sefarose de ProteínaA rmp foi ajustado para um pH de 3,0 com 173 mL de ácidoacético IOOmM. O eluato ajustado foi mantido depois por 60minutos para inativação viral. Após esse período, o eluatoajustado foi neutralizado com 473 mL de hidróxido de sódio50mM para um pH de 5,50, e filtrado (0,22pm), usando umdispositivo de filtração da Millipore (número do produto,SCGPU11RE). Em seguida, foram recuperadas l,4g do anticorpoBAK502G9 em 823 mL.
(c) Purificação por SP Sefarose
A coluna usada para a etapa de cromatografia defluxo rápido por SP Sefarose foi de 1,6 cm de diâmetro,empacotada em uma solução salina de fosfato, pH de 7,2, emuma altura de leito de 15,5 cm, proporcionando um volume decoluna de 31 mL. A resina foi fornecida pela GEHealthcare/Amersham Biosciences, 17-0729, A cromatografiafoi executada usando uma bomba P-50, Amersham Biosciences,um detector UVl e um fluxo celular. A coluna foi limpa comhidróxido de sódio 0,5M, antes de ser usada.A coluna de cromatografia de fluxo rápido por SPSefarose foi balanceada com 145 mL de acetato de sódio50mM, pH de 5,50, seguido de lavagem com água e limpeza.
Em seguida, 400 mL do anticorpo BAK502G9 na formade eluato de Proteína A rmp neutralizado, foramintroduzidas na coluna a uma velocidade de 200cm/h e sob atemperatura ambiente.
A coluna foi depois lavada com 302 mL de umamistura de acetato de sódio 50mM/cloreto de sódio 30mM, pHde 5,50.
O anticorpo BAK502G9 foi eluído da colunamediante lavagem com 150 mL de acetato de sódio 50mM +cloreto de sódio 85mM, pH de 5,50. Após a elução, a colunafoi lavada com acetato de sódio 50mM + cloreto de sódio 2M,pH de 5,50.
O pico da elução foi coletado entre uma deflexãode UV de um máximo de 2%, na inclinação descendente dopico. 0 eluato foi filtrado (0,22 μιη) usando um dispositivode filtração da Millipore (número do produto, SCGP00525) .Em seguida, 0,67 g do anticorpo BAK502G9 foram recuperadasem 54 mL. Esta etapa do processo foi repetida com osrestantes 392 mL do anticorpo BAK502G9, na forma do eluatode Proteína A rmp neutralizado. Uma quantidade adicional de0,67 g do anticorpo BAK502G9 foi recuperada em 54 mL. Osdois eluatos filtrados de SP Sefarose foram agrupados,antes de seguir para a próxima etapa.(d) Cromatografia de Fluxo Rápido por Q Sefarose
A coluna usada para a etapa de cromatografia defluxo rápido por Q Sefarose foi de 1, 6 cm de diâmetro,empacotada em uma solução salina de fosfato, pH de 7,2, emuma altura de leito de 13,3 cm, proporcionando um volume decoluna de 27 mL. A resina foi fornecida pela GEHealthcare/Amersham Biosciences, 17-0510.· A cromatografiafoi executada usando uma bomba P-50, Amersham Biosciences,um detector UVl e um fluxo celular. A coluna foi limpa com hidróxido de sódio 0,5M, antes de ser usada.
A coluna de cromatografia de fluxo rápido por QSefarose foi balanceada com 138 mL de acetato de sódio 50mM+ cloreto de sódio 85mM, pH de 5,50, seguido de lavagem comágua e limpeza.
Em seguida, 44 mL do anticorpo BAK502G9 -na formade eluato de SP Sefarose foram introduzidas diretamente nacoluna a uma velocidade de 200cm/h e sob a temperaturaambiente.
A elução isocrática do anticorpo BAK502G9 foitomada através de lavagem da coluna com 124 mL de acetatode sódio 5OmM + cloreto de sódio 85mM, pH de 5,50. Após aelução, a coluna foi lavada com acetato de sódio 50mM +cloreto de sódio 2M, pH de 5,50.
O pico da elução foi coletado entre uma deflexãode UV de um máximo de 2% na inclinação ascendente e de 2%na inclinação descendente do pico. 0 eluato foi filtrado(0,22 μιη) usando um dispositivo de filtração da Millipore(número do produto, SCGPU01RE) . Em seguida, 0,52 g doanticorpo BAK502G9 foram recuperadas em 88 mL. Esta etapado processo foi repetida com os restantes 44 mL doanticorpo BAK502G9, na forma do eluato de SP Sefarose. Umaquantidade adicional de 0,54 g do anticorpo BAK502G9 foirecuperada em 51 mL. Os dois eluatos filtrados de QSefarose foram depois agrupados.
(e) Concentração
O produto foi obtido em acetato de sódio 50mM +cloreto de sódio 85mM, pH de 5,50 e não precisou dediafiltração. 95,31 g do anticorpo BAK502G9 na forma deeluato de Q Sefarose em 17,5 L, foram concentradas para ovolume de 1,5 L. Um sistema Pellicon 2 TFF da Millipore euma membrana 0,1 M2 30KDa (Millipore P2B030A01) foramusados para executar a concentração. O anticorpo BAK502G9foi então recuperado do equipamento, o equipamento foidepois descarregado do tampão com acetato de sódio 50mM +cloreto de sódio 85mM, pH de 5,50. O anticorpo concentradofoi depois misturado com a descarga do tampão. Em seguida,foram adicionados 1,67 mL de Polissorbato 80 a 10%(peso/volume) à mistura acima, proporcionando umaconcentração final do Polissorbato 80 de 0,01%(peso/volume). A mistura foi depois filtrada (0,22 μm). Emseguida, 91,6 g do anticorpo BAK502G9 foram recuperadas em1,67 L.
(f) Materiais Usados
Os produtos químicos usados para preparar ostampões descritos acima foram os seguintes:
- Cloridrato de Guanidina; Sigma Aldrich, G4505;- Orto-fosfato ácido dissódico; VWR, 1038349;
- Orto-fosfato ácido dissódico; VWR, 102454R;
- Acetato de sódio triidratado; VWR, 102354X;
- Cloreto de sódio; VWR, 10241AP;- Ácido acético; VWR, 10001CU;
- Polissorbato 80; J. T. Baker, 7394.
Exemplo 3: Análise de Estabilidade de 28 DiasMetodologia
A cromatografia de Proteína A rmp foi executadaconforme estabelecido na Tabela 1, abaixo.
Tabela 1: Parâmetros de Cromatografia da Proteína A
<table>table see original document page 40</column></row><table><table>table see original document page 41</column></row><table>
1,6 CV do tampão de elução foram necessários paraeluir o pico e para a absorbância retornar a uma deflexãode escala integral < 2% (AuFS) . Após isso, o tampão foitrocado para um tampão de extração. A inativação do víruscom um baixo pH foi depois realizada usando o eluato deProteína A, conforme estabelecido na Tabela 2, abaixo.
Tabela 2: Inativação do Vírus com baixo pH
<table>table see original document page 41</column></row><table>
Todas as amostras foram armazenadas emrecipientes de 200 mL da Hyciclone BioProcess, que sãofeitos de polietileno com tubulação fixada C-flex deentrada e saída.Além disso, um amostra de 50 raL de eluato deProteína A inativada de vírus foi neutralizada com o tampãooriginal (hidróxido de sódio 50mM) e armazenada em umrecipiente de bioprocesso à temperatura de 2 a 8 0C durantevinte e oito dias, antes da análise.
Todas as amostras foram armazenadas em uma salafria de classificação 100.000 (2 a 8°C, monitorada comregistrador de gráfico e alarme) ou em uma incubadoracontrolada termostaticamente e ajustada a uma temperaturade 25°C, conforme apropriado.
Ocorreram cinco pontos de tempo e duastemperaturas de armazenamento (2 a 8°C e 25°C), isto é, dezpontos de amostragem separados.
O filtrado neutralizado do eluato de Proteína Afoi separado em dez lotes, cinco lotes sendo armazenados emcada temperatura. Um adicional recipiente de material não-filtrado do eluato de Proteína A neutralizado foiarmazenado na temperatura de 2 a 8°C.
Para preencher cada recipiente de bioprocesso, oeluato de Proteína A neutralizado foi bombeado através dofiltro Millipak de 0,2 μιτι para dentro de um recipiente debioprocesso 200 mL. Cada recipiente de bioprocesso foienchido com aproximadamente 100 mL, de modo a se aproximarda proporção de produto para superfície de contato,idealizada para a produção em escala final de 2000 L.
Um recipiente de bioprocesso foi usado paraamostragem em cada temperatura e em cada ponto de tempo,tendo sido tomado cuidado para não deixar material natubulação durante o armazenamento.
Um recipiente de bioprocesso de cada temperaturafoi removido nos dias 1, 3, 15, 21 e 28, Os conteúdos decada recipiente de bioprocesso foram deixados alcançar atemperatura ambiente antes da amostragem.
As amostras foram tomadas em recipientes Bijouxou tubos Falcon de 50 mL. Os primeiros mililitros daamostra foram descartados, tendo em vista a possibilidadedos mesmos terem tido algum contato com a tubulação duranteo armazenamento.
A posterior amostragem dos recipientes contendo omaterial restante foi armazenada a uma temperatura de-70°C.
A análise seguinte foi realizada no dia de cadaponto de tempo e para cada temperatura de armazenamento, dedmodo a determinar a comparação dessas amostras em ter si,e o padrão de referência. Um frasco de material fresco deBAK502G9 padrao foi usado em cada ponto de tempo paracomparar a estabilidade do material em estudo. 0 materialde referência foi congelado na temperatura ambiente doarmazenamento sob temperatura de -70°C. Sabe-se que níveisde multímero podem ser ligeiramente elevados depois docongelamento desse anticorpo, de modo que finalmente possase realizar a análise de GP-HPLC.
(A) Análise de Turbidez
A turbidez foi determinada como uma medida dedecomposição da proteína no decorrer do tempo e, portento,serve como uma conveniente determinação de estabilidade dacomposição da invenção.
A turbidez foi medida ao se tomar a absorbânciamédia da amostra, entre 340 e 360 nm (Eckhardt et al.1993). Este ensaio foi realizado sem posterior filtração.
Os dados obtidos da cromatografia da Proteína Armp são resumidos na Tabela 3 e o cromatograma é mostradona figura 1.
Tabela 3: Dados de Cromatografia da Proteína A rmp
<table>table see original document page 44</column></row><table>*50 mL removido do eluato inativado de virus, para ajustecom hidróxido de sódio 50mM. 0 volume final é de amostragemposterior.
A cromatografia de Proteína A rmp executadaconforme previsto gerou volumes de tampões comparáveis aosobservados em larga escala. 0 eluato neutralizado foivisivelmente mais turvo do que normalmente observado com oeluato neutralizado com hidróxido de sódio 50mM. Durante a10 filtração nos recipientes de bioprocesso, começou a seobservar uma precipitação, isso ocorrendo depois de umahora da neutralização. A turbidez não foi testada atédepois desse tempo. A recuperação ocorreu dentro da faixaesperada de pós-filtração.
Todas as amostras do eluato foram examinadasquanto à turbidez no dia 1, Os eluatos filtradosarmazenados em ambas as temperaturas foram examinadosquanto à turbidez nos dias: 1, 3, 15, 21 e 28, Além disso,os eluatos armazenados não-filtrados (ajustados comhidróxido de sódio 50 mM ou hidróxido de sódio 100 mM)foram testados quanto à turbidez tanto antes como depois dafiltração, no dia 28, Os resultados da análise de turbidezsão mostrados na Tabela 4, onde pode ser observado queembora tenha ocorrido um acentuado aumento na turbidez daamostra armazenada à temperatura de 25°C no dia 28, asamostras foram, de um modo geral, estáveis à temperatura de25°C durante pelo menos 21 dias.Tabela 4: Medições de Turbidez do Processo e Estabilidadedas Amostras de Estudo
<table>table see original document page 46</column></row><table>
B) Análise da Concentração da Proteína
A concentração de IgG foi medida e calculada
usando absorbância em 280nm e um coeficiente de extinção deE10'"4= 1-723 .
J—'Icm
Os eluatos que foram filtrados no período de
neutralização não foram novamente filtrados antes da
absorbância ser medida em 280nm para o cálculo de
concentrações da proteína. Na medida em que ascaracterísticas de turbidez foram todas baixas, acredita-seque isso não afetaria os resultados. A absorbância em280nm foi consistente entre as temperaturas dearmazenamento e os pontos de tempo que são mostrados naTabela 5.
Tabela 5: Concentrações de Proteína de Amostras de Eluato
<table>table see original document page 47</column></row><table>
(C) Análise de SDS-PAGE
A análise reduzida e nao-reduzida de SDS-PAGE foiprocessada usando 4 a 12% de géis Bis-Tris NuPage. Os géisforam processados usando tampão de corrida de MES etingimento com gel Pierce, código azul.
A análise de SDS-PAGE demonstrou variações emníveis de meio anticorpo, mas não existe uma tendênciaaparente, sendo provável que esteja dentro da variação doensaio (ver as Figuras 1 e 2 e as Tabelas 6 e 7). No diavinte e um, algumas adicionais faixas menores foramobservadas na amostra à temperatura de 25°C. Essas faixasnão foram observadas no dia vinte e oito. Portanto, essasfaixas podem se encontrar nos limites de detecção doensaio. Essas faixas podem corresponder aos pequenos picosadicionais observados no ensaio de GP-HPLC (ver o Exemplo3D) .
As amostras não foram processadas ao final doestudo pelo fato de que não seria possível se distinguir asmesmas entre as diferenças que se faziam presentes naamostra original ou, então, foram resultado de um maiorperíodo de armazenamento. Um frasco recém-congelado dereferência padrão foi processado para cada gel. Isto foicomparável entre os pontos de tempo diferentes, indicandoque a análise foi realizada conforme o esperado. Foi tambémobservado que as faixas extras observadas no dia vinte eum, a amostra à temperatura de 25°C, não foram observadasno padrão de referência ou amostra à temperatura de 2 a8°C, processada no mesmo gel. Por razões de melhor clareza,todas as faixas na Figura 2 são indicadas com um cículo.
Tabela 6: Resultados de Densitometria de SDS-PAGE, AmostrasReduzidas
<table>table see original document page 48</column></row><table><table>table see original document page 49</column></row><table>
Tabela 7: Resultados de Densitometria de SDS-PAGE, AmostrasNão-Reduzidas
<table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table>
(D) Amálisede GP-HPLC
As amostras foram analisadas usando uma coluna deexclusão de tamanho TSK GS3000SW com fosfato de sódio 200mMe azida de sódio a 0,05%, pH de 7,0, como fase móvel edetecção em 280nm.
Todas as frações da cromatografia de Proteína Aforam examinadas no dia 1. Os eluatos armazenados em ambasas temperaturas foram depois examinados nos dias 1, 3, 15,21 e 28. As amostras de referência foram também processadasem todos os pontos de tempo. Os eluatos foram separadamenteneutralizados com hidróxido de sódio 100 mM ou hidróxido desódio 50 mM no dia 1, mas não foram filtrados até o dia 28;nesse dia 28, foram testados pelo procedimento de GP-HPLC.
Os cromatogramas da análise de GP-HPLC do dia 1são mostrados na Figura 3. Estes são como esperado, oeluato final sendo > 95% do monômero, o que atende aespecificação final para o BAK502G9.
A análise de GP-HPLC das amostras durante todo ocurso do estudo revelou um ligeiro aumento no aspectotruncado (em particular, um pequeno pico eluindo entre 9,9e 10,3 minutos) de BAK502G9 à temperatura de 25°C (Tabela 8e Figuras 4 e 5) . Os níveis de monômero foram consistentesentre 97,0 e 98,2% durante todo o estudo.
Os eluatos foram neutralizados com hidróxido desódio 50 mM e níveis mais altos do monômero (99,2% domonômero) do que o eluato neutralizado com hidróxido desódio 100 mM (97,4% de monômero), ambos sendo superiores aonível solicitado de 95% de monômero para o produto final(Tabela 9 e Figura 6) .
Os resultados obtidos da integração automáticaforam encontrados como sendo imprecisos, portanto, oscromatogramas de GP-HPLC foram reintegrados manualmente.
Tabela 8: GP-HPLC de Eluatos Armazenados em DiferentesTemperaturas
<table>table see original document page 51</column></row><table>
Tabela 9: GP-HPLC de Eluatos Neutralizados com Hidróxido de
<table>table see original document page 51</column></row><table><table>table see original document page 52</column></row><table>
(E): Análise de IEF
As amostras foram analisadas usando géis de IEF,pH de 3 a 10, da Invitrogen, usando tampões da Invitrogen.
A análise de IEF do BAK502G9 mostrou um aspectoconsistente em todo o estudo (Figura 7) . Três faixasmaiores e duas faixas menores, entre pis aproximados de 7,1e 6,4, são observadas.
(E) Análise de Endotoxina
As amostras tomadas no dia 28 de ambas astemperaturas foram examinadas quanto aos níveis deendotoxina, usando um ensaio de LAL.
Os níveis de endotoxina nas amostras armazenadasem ambas as temperaturas foram baixos. Isso demonstra quenão ocorreu contaminação por bactéria gram-negativa em todoo curso do estudo.
Eluato armazenado à temperatura de 2 a 8°C = 0,87 EU/mg.Eluato armazenado à temperatura de 25°C < 0,44 EU/mg.
Resumo dos Resultados da Análise de Estabilidade de 28 DiasO anticorpo BAK502G9 armazenado por até quinzedias à temperatura de 2 a 8°C ou 25°C é equivalente emtodos os ensaios realizados no Exemplo 3. Após vinte e umdias, algumas pequenas diferenças são observadas pelasanálises de SDS-PAGE (Exemplo 3C) e GP-HPLC (Exemplo 3D) ,mas o produto permanece comparável até vinte e oito dias.
Exemplo 4: Análise de Estabilidade de 12 Meses
A análise de estabilidade de 12 meses foiexecutada de maneira análoga à descrita na análise deestabilidade de 28 dias do Exemplo 3.
0 estudo foi idealizado para investigar aestabilidade de diferentes concentrações de BAK502G9,quando armazenado em diferentes temperaturas (por exemplo,-70, +5, +25, +37 e +45°C). As diferentes formulaçõesusadas nessa análise sao apresentadas na Tabela 10, abaixo.
Tabela 10: Composição das formulações usadas na análise deestabilidade de 12 meses.
<table>table see original document page 53</column></row><table>A análise das amostras foi verificada em pontosde tempo variados, por exemplo, as formulações armazenadasàs temperaturas de -70, +5, +25°C foram medidas em 0, 3, 6,9 e 12 meses, as formulações armazenadas à temperatura de+37°C foram medidas em 0, 1, 2, 4 e 8 semanas e asformulações armazenadas à temperatura de +45°C forammedidas em 0, 1, 2 e 5 dias.
(A) Análise de pH
O pH foi medido usando um medidor de pH PHM220(Radiometer Analytical), adaptado com um eletrodo de pH depequeno volume de (BDH) e os resultados da medição de pHdas formulações CF, TF1A, TFlB e TFlC em cada temperaturasão mostrados nas Tabelas 11-15, abaixo.
Tabela 11: pH após Armazenamento à Temperatura de -70°C
<table>table see original document page 54</column></row><table>
Tabela 12: pH após Armazenamento à Temperatura de +5°C
<table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table>
Tabela 13: pH após Armazenamento à Temperatura de +25°C Tempo (meses) nH
<table>table see original document page 55</column></row><table>
Tabela 14: pH após Armazenamento à Temperatura de +37°C Tempo (semanas) dH
<table>table see original document page 55</column></row><table>
Tabela 15: pH após Armazenamento à Temperatura de +45°C Tempo (dias) dH <table>table see original document page 55</column></row><table>(B) Análise da Concentração
As amostras foram diluídas em um nível apropriadocom o tampão adequado e sua absorbância determinada em 280nm usando um espectrofotômetro visível à UV, HP8453(Agilent Technologies). Os valores de absorbância foramconvertidos para as concentrações de BAK502G9 usando oconhecido coeficiente de extinção de 1,723. Os resultadosda medição da absorbância das formulações CF, TF1A, TFlB eTFlC em cada temperatura são mostrados nas Tabelas 16-20,abaixo.Tabela 16: Concentração do BAK502G9 após Armazenamento àTemperatura de -70°C
<table>table see original document page 57</column></row><table>
Tabela 17: Concentração do BAK502G9 após Armazenamento àTemperatura de +5°C
<table>table see original document page 57</column></row><table>
Tabela 18: Concentração do BAK502G9 após Armazenamento àTemperatura de +25°C
<table>table see original document page 57</column></row><table><table>table see original document page 58</column></row><table>
a) n=3
NT = Não Testado
(C) Análise de HPLC por Filtração de Gel
O procedimento de HPLC por filtração de gel foiexecutado em um sistema HPllOO (Agilent Technologies) . Umacoluna TSK-Gel 3000S foi balanceada com fosfato de sódio0,2M, pH de 7,5. As amostras foram diluídas para 1 mg/mLcom o tampão adequado e centrifugadas a 13.000 rpm durante10 minutos para remover qualquer matéria particulada. Emseguida, foram feitas injeções de 3 χ 20 μL de cada amostrana coluna, que foi processada a uma vazão de 1 mL/min. Umdetector de comprimento de onda variável foi usado paramonitorar a absorbância em 220 e 280nm.
Os resultados da análise de filtração de gel dasformulações CF, TF1A, TFlB e TFlC em cada temperatura sãomostrados nas Figuras 8-12.
(D) Análise de SDS-PAGE de Amostras Reduzidas
As amostras foram diluídas para 1 mg/mL com umtampão adequado e foram adicionados 16,7 pL a 12,5 μΐ, detampão de amostra (4X LDS) (Invitrogen) , 15,8 pL de águaMilli-Q e 5 pL de agente redutor (Invitrogen). As amostrasforam aquecidas à temperatura de 95°C por um minuto edepois colocadas em gelo. Em seguida, 15 pL de cada amostraforam misturados em um gel BisTris a 4-12% (Invitrogen),em um tanque contendo o tampão de processamento de MES SDS(1x) e o gel foi processado durante 35 minutos sob umacorrente constante de 500 mA. Após a eletroforese, o gelfoi removido de seu invólucro, lavado (3x) por 10 minutoscom água Milli-Q, tingido com o reagente de fingimentoGelcode® Blue (Pierce) por um mínimo de uma hora e depoisdescolorido com água Milli-Q. O gel foi fotografado eanalisado usando um sistema de documentação de gel UVPGDS8000. A relativa abundância de cadeias pesadas e levesde BAK502G9 em cada amostra foi determinada.Os resultados da análise de SDS-PAGE de amostrareduzida das formulações CF, TF1A, TFlB e TFlC em cadatemperatura são mostrados nas Figuras 13, 15, 17, 19 e 21.As medições de abundância de cadeias pesadas e leves deBAK502G9 em cada temperatura são também mostradas nasFiguras 14, 16, 18, 20 e 22.
(E) Análise de SDS-PAGE de Amostras Não-Reduzidas
As amostras foram diluídas para 1 mg/mL com umtampão adequado e foram adicionados 16,7 pL a 25 pL detampão de amostra não-redutor SDS (2X) (Tris 0,125M, pH6,8, 4% (peso/volume), glicerol 30% (vol/vol), azul debromofenol 0,004% (peso/vol), 3,3 pL de água Milli-Q e 5pL de iodoacetamida 1M. As amostras foram aquecidas àtemperatura de 95°C por um minuto e depois colocadas emgelo. Em seguida, 15 pL de cada amostra foram misturados emum gel BisTris a 4-12% (Invitrogen), em um tanque contendoo tampão de processamento de MES SDS (Ix) e o gel foiprocessado durante 35 minutos sob uma corrente constante de500 mA. Após a eletroforese, o gel foi removido de seuinvólucro, lavado (3x) por 10 minutos com água Milli-Q,tingido com o reagente de fingimento Gelcode® Blue (Pierce)por um mínimo de uma hora e depois descolorido com águaMilli-Q. O gel foi fotografado e analisado usando umsistema de documentação de gel UVP GDS8000. A relativaabundância de cadeias pesadas e leves de BAK502G9 em cadaamostra foi determinada.
Os resultados da análise de SDS-PAGE de amostranão-reduzida das formulações CF, TF1A, TFlB e TFlC em cadatemperatura são mostrados nas Figuras 23, 25, 27, 29 e 31.As medições de abundância do monômero intacto de BAK502G9em cada temperatura são também mostradas nas Figuras 24,26, 28, 30 e 32.
(F) Análise de Foco Iselétrico
Antes da introdução da amostra, o leito deeletroforese foi resfriado e um gel de IEF, pH de 3-10(Cambrex) foi pré-focado durante 10 minutos em 1 W, 2000 V,150 mA, usando um sistema de energia Apelex PS9009TX. Asamostras foram diluídas para a concentração de 1 mg/mL comum tampão apropriado. Uma máscara de amostra foi colocadasobre a superfície do gel e foram introduzidos 5 pL de cadaamostra. O gel foi pré-focado novamente e a máscara deamostra removida. O gel foi então focado por 60 minutos a25 W, 1500 V, 50 mA. Após a eletroforese, o gel foi fixadocom metanol 50% (vol/vol), ácido tricloroacético 6%(peso/volume), ácido 5-sulfossalicíIico 3,6% (peso/volume)por 30 minutos, depois, lavado com água e seco em um fornoà temperatura de 40-50°C por uma hora. O gel foi tingidopor 30 minutos usando PhastGel Blue R (Pharmacia; umcomprimido dissolvido em metanol 60% (vol/vol)) , lavado comágua Milli-Q para remover o excesso de tingimento e depoisdescolorido por aproximadamente 3 minutos com ácido acéticoglacial 9% (vol/vol) e uma solução de etanol 25% (vol/vol) .O gel foi seco em um forno à temperatura de 40-50°C por umahora. O gel seco foi fotografado e analisado usando umsistema de documentação de gel UVP GDS8000. O número e avariação de pi das isoformas em cada amostra foideterminado e os resultados observados nas formulações CF,TF1A, TFlB e TFlC em cada temperatura são mostrados nasTabelas 21-25, abaixo.
Tabela 21: Variação de pi e Número de Isoformas por IEFapós Armazenamento à Temperatura de -70°C
<table>table see original document page 62</column></row><table>
Tabela 22: Variação de pi e Número de Isoformas por IEFapós Armazenamento à Temperatura de +5°C
<table>table see original document page 62</column></row><table>
Tabela 23: Variação de pi e Número de Isoformas por IEFapós Armazenamento à Temperatura de +25°C
<table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table>
Tabela 24: Variação de pi e Número de Isoformas por IEF após Armazenamento à Temperatura de +37°C <table>table see original document page 63</column></row><table>
Tabela 25: Variação de pi e Número de Isoformas por IEF após Armazenamento à Temperatura de +45°C <table>table see original document page 63</column></row><table>
NT = Não Testado
Resumo dos Resultados da Análise de Estabilidade
Estabilidade à Temperatura de -10°C
As formulações CF e TFlA se mostraram estáveispor 12 meses à temperatura de -70°C. Os perfis analíticosforam similares em 0 e 12 meses, exceto quanto ao % de IgGintacto medido por SDS-PAGE de amostra não-reduzida, quediminuiu de 95,9% no t=0 para 89,9% em 12 meses para a CF,e de 96,2% no t=0 para 89,2% em 12 meses para a TFlA.Mediante o procedimento de HPLC, após 12 meses, apercentagem de monômero para ambas as formulações CF e TFlAfoi de 100%. Ambas as formulações CF e TFlA exibiram 4faixas no ensaio de IEF após 12 meses. Os resultadosindicaram que as formulações CF e TFlA são comparáveisnessa temperatura.
Estabilidade à Temperatura de 5cC
As formulações CF e TFlA se mostraram estáveispor 12 meses à temperatura de 5°C. Os perfis analíticosforam similares em 0 e 12 meses, exceto quanto ao % de IgGintacto medido por SDS-PAGE de amostra não-reduzida, quediminuiu de 95,9% no t=0 para 89,5% em 12 meses para a CF,e de 96,2% no t=0 para 88,9% em 12 meses para a TF1A.Mediante o procedimento de HPLC, após 12 meses, apercentagem de monômero para ambas as amostras deformulações CF e TFlA foi de 100%. Ambas as formulações CFe TFlA exibiram 4 faixas no ensaio de IEF após 12 meses. Osresultados indicaram que as formulações CF e TFlA sãocomparáveis nessa temperatura.
Estabilidade à Temperatura de 25°C
As formulações CF e TFlA se mostraram estáveispor 12 meses à temperatura de 25°C. 0 % de IgG intactomedido por SDS-PAGE de amostra não-reduzida diminuiu de95,9% no t=0 para 89,1% em 12 meses para a CF, e de 96,2%no t=0 para 87,5% em 12 meses para a TFlA. Ocorreu tambémuma faixa menor de alto peso molecular (> 220 kDa) em ambasas formulações no gel de SDS-PAGE de amostra não-reduzidaque não foi detectada no t=0. Mediante o procedimento deHPLC, após 12 meses, a percentagem de monômero para ambasas amostras de formulações CF e TFlA foi de 98,9 e 96,42%,respectivamente. Ambas as amostras de formulações CF e TFlAexibiram 4 faixas no ensaio de IEF após 12 meses. Osresultados indicaram que as formulações CF e TFlA sãocomparáveis nessa temperatura.
Estabilidade à Temperatura de 37°C
As formulações CF e TFlA se mostraram estáveispor 4 semanas à temperatura de 37 °C, mas falharam noatendimento à especificação projetada para algunsparâmetros após 8 semanas, notadamente, quanto à pureza,mediante SDS-PAGE de amostra não-reduzida (ambas asformulações) e % de monômero mediante GF-HPLC (somente aformulação TF1A; resultado da linha marginal). Osresultados indicaram que a formulação CF é mais estável queTFlA nessa temperatura durante um periodo de 8 semanas.
Estabilidade à Temperatura de 45°C
As formulações CF e TFlA se mostraram estáveispor 5 dias à temperatura de 45°C, embora tenham ocorridopequenas mudanças nos perfis analíticos depois desseperíodo (algumas adicionais faixas menores no ensaio deSDS-PAGE e géis de IEF) . Os resultados indicaram que asformulações CF e TFlA são comparáveis nessa temperaturadurante um período de 5 dias.

Claims (25)

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelofato de compreender um anticorpo de IL-13 e um ou maisexcipientes farmaceuticamente aceitáveis, tamponados paraum pH de 4,5-6,0 com um tampão de acetato.
2. Composição farmacêutica, conforme definido nareivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpode IL-13 é um anticorpo monoclonal de IL-13 humana.
3. Composição farmacêutica, conforme definido nasreivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que oanticorpo de IL-13 está presente na composição farmacêuticanuma quantidade entre 1 e 200 mg/mL.
4. Composição farmacêutica, conforme definido emquaisquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelofato de ser tamponada para um pH de 5,2 a 5,7.
5. Composição farmacêutica, conforme definido emquaisquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelofato de que ' acetato de sódio está presente na ditacomposição numa quantidade entre 1 e IOOmM.
6. Composição farmacêutica, conforme definido emquaisquer das reivindicações anteriores, caracterizada pelofato de que o excipiente farmaceuticamente aceitávelcompreende um ou mais dentre tensoativos, sal inorgânico ouorgânico, estabilizador, diluente, solubilizador, agenteredutor, antioxidante, agente quelante e/ou conservante.
7. Composição farmacêutica, conforme definido nareivindicação 6, caracterizada pelo fato de que otensoativo é selecionado de um éster de ácido graxo desorbitan-polioxietileno.
8. Composição farmacêutica, conforme definido nareivindicação 7, caracterizada pelo fato de que otensoativo utilizado é o Polissorbato 80, o qual estápresente na dita composição numa quantidade entre 0,001 e0,1% (peso/peso).
9. Composição farmacêutica, conforme definido emquaisquer das reivindicações 6 a 8, caracterizada pelo fatode que o sal inorgânico compreende cloreto de sódio,cloreto de potássio, cloreto de cálcio, fosfato de sódio,fosfato de potássio e bicarbonato de sódio.
10.. Composição farmacêutica, conforme definido nareivindicação 9, caracterizada—pelo fato de que o sal·inorgânico utilizado é o cloreto de sódio, o. qual estápresente na dita composição numa quantidade entre 10 e200mM.
11. Composição farmacêutica, conforme definido nareivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender umanticorpo de IL-13, um tensoativo e um sal inorgânico,tamponados para um pH de 5,5 ± 0,1 com um tampão deacetato.
12. Composição farmacêutica, conforme definido nareivindicação 1, caracterizada pelo. fato de compreender umanticorpo de IL-13, cloreto de sódio e Polissorbato 80,tamponados para um pH de 5,5 ± 0,1 com um tampão de acetatode sódio.
13. Composição farmacêutica, conforme definido nareivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender- 50 mg/mL de um anticorpo de IL-13, cloreto de sódio a 85mMe Polissorbato 80 a 0,01% (peso/peso), tamponados para umpH de 5,5 ± 0,1 com um tampão de acetato de sódio 50 mM.
14. Processo para purificação de um anticorpo deIL-13, o qual compreende uma ou mais etapas de separaçãocromatográf ica, caracterizado pelo fato de que cada dasditas etapas de separação compreende a elução com um tampãode elução que compreende um ou mais excipientesfarmaceuticamente aceitáveis, tamponados para um pH de 3,5a 7,0 com um tampão de acetato.
15. Processo, conforme definido na reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as etapas .de separaçãocromatográfica são selecionadas de cromatografia porafinidade e cromatografia por troca de ions.
16. Processo, conforme definido na reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a separaçãocromatográfica é realizada mediante cromatografia porafinidade com a Proteína A, seguido de cromatografia portroca de cátion e cromatografia por troca de anion.
17. Processo, conforme definido em quaisquer dasreivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que osditos um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveiscompreendem um sal inorgânico.
18. Processo, conforme definido na reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o sal inorgânico écloreto de sódio, o qual está presente no tampão de eluçãonuma quantidade entre 10 e 200mM.
19. Processo, conforme definido em quaisquer dasreivindicações 14 a 18, caracterizado pelo fato de que otampão de acetato é acetato de sódio, o qual está presenteno tampão de elução numa quantidade entre 1 e IOOmM.
20. Processo, conforme definido em quaisquer dasreivindicações 14 a 19, caracterizado pelo fato de que otampão de elução compreende acetato de sódio 50mM e cloretode sódio 8 5mM tamponados para um pH de 5,5 ± 0,1.
21. Uso de uma composição farmacêutica contendoum anticorpo, conforme definido em quaisquer dasreivindicações 1 to 13, caracterizado pelo fato de que odito uso se faz na fabricação de um .medicamento para otratamento de um distúrbio correlacionado a IL-13.
22. Uso, conforme definido na reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que o distúrbio correlacionado àIL-13 é selecionado de asma, dermatite atópica, rinitealérgica, fibrose, doença pulmonar obstrutiva crônica,escleroderma, doença inflamatória do intestino e linfoma deHodgkin.
23. Uso, conforme definido na reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que o distúrbio correlacionado àIL-13 é a asma.
24. Método de tratamento ou profilaxia de umdistúrbio correlacionado à IL-13, caracterizado pelo fatode que o dito método compreende a administração a umpaciente de uma quantidade terapeuticamente efetiva de umacomposição farmacêutica contendo um anticorpo, conformedefinido em quaisquer das reivindicações 1 a 13.
25. Composição farmacêutica contendo umanticorpo, conforme definido em quaisquer dasreivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que adita composição é para ser usada no tratamento de umdistúrbio correlacionado a IL-13.
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