KR20080052510A - 비-단백질 안정화된 클로스트리디움계 독소 약제학적조성물 - Google Patents

비-단백질 안정화된 클로스트리디움계 독소 약제학적조성물 Download PDF

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KR20080052510A
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Abstract

보툴리눔 독소와 같은 클로스트리디움계 독소를 포함하는 클로스트리디움계 독소 약제학적 조성물로서, 약제하적 조성물 중에 존재하는 클로스트리디움계 독소가 폴리비닐피롤리돈, 이당류, 삼당류, 다당류, 알콜, 금속, 아미노산, 계면활성제 및/또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비-단백질 부형제에 의해서 안정화된다.

Description

비-단백질 안정화된 클로스트리디움계 독소 약제학적 조성물{NON-PROTEIN STABILIZED CLOSTRIDIAL TOXIN PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS}
교차참조
본 발명은 본 명세서에 출원 전체가 참조로 병합되어 있는, 2005년 10월 6일 출원된관련 가출원 번호 60/725,126를 우선권으로 주장하는 정규특허출원이다.
본 발명은 클로스트리디움계 독소 약제학적 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 약제학적 조성물 중에 존재하는 클로스트리디움계 독소(보툴리눔 독소와 같은)를 안정화시키는 작용을 하는 비-단백질 부형제를 갖는 클로스트리디움게 독소 약제학적 조성물에 관한 것이다.
약제학적 조성물은 적어도 하나의 활성 성분(클로스트리디움계 독소와 같은)뿐아니라, 예를 들어, 하나 이상의 부형제, 완충제, 캐리어, 안정화제, 방부제 및/또는 벌크제(bulking agent)를 포함하며, 환자에 투여하여 원하는 진단 결과 또는 치료 효과를 얻기에 적합한 제제이다. 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 진단, 치료 및/또는 연구에 유용하다.
저장 안정성 및 취급 용이성을 위하여, 약제학적 조성물은 환자에 투여하기 전에 염수 또는 물과 같은 적합한 유체를 사용하여 재구성할 수 있는 동결건조(즉, 냉동 건조) 또는 진공 건조된 분말로서 제형될 수 있다. 이와 달리, 약제학적 조성물은 수용액 또는 현탁액으로서 제형될 수 있다. 약제학적 조성물은 단백질성 활성 성분을 포함할 수 있다. 불행하게도, 단백질 활성 성분은 멸균(즉, 생물학적 활성의 손실이 최소화되는 상태로 유지)하기가 매우 어려울 수 있으며, 따라서 제형, 재구성(필요시)하는 동안 및 단백질 함유 약제학적 조성물의 사용전 저장기간 동안 단백질의 손실 및/또는 단백질 활성의 손실을 가져올 수 있다. 단백질 변성, 열화, 이합체화 및/또는 중합으로 인하여 안정성 문제가 발생할 수 있다. 알부민 및 젤라틴과 같은 다양한 부형제가, 성공 정도를 달리하여, 약제학적 조성물 중에 존재하는 단백질 활성 성분을 안정화하는 데 사용되어 왔다. 또한, 알콜과 같은 동결방지제가 동결 건조의 냉동 조건 하에서 단백질 변성을 감소시키는 데 사용되어 왔다.
단백질 부형제
알부민 및 젤라틴과 같은 다양한 단백질이 약제학적 조성물 중에 존재하는 보툴리눔 독소를 안정화시키는 데 사용되어 왔다. 알부민은 작은 크기의, 풍부한 혈장 단백질이다. 사람 혈청 알부민은 약 69 킬로달톤(kD)이며, 약제학적 조성물 중에 존재하는 어떤 단백질 활성 성분에 대한 벌크 캐리어 및 안정화제의 역할을 할 수 있는 경우에, 약제학적 조성물에서 비활성 성분으로 사용된다.
약제학적 조성물에서 알부민의 안정화 작용은, 약제학적 조성물의 멀티스텝 제조 동안, 그리고, 이후 제조된 약제학적 조성물의 재구성시에 제공될 수 있다. 그러므로, 알부민에 의해서, 예를 들어, (1) 실험실 유리제품이나 용기의 표면과 같은 표면, 약제학적 조성물이 재구성되는 바이알, 및 약제학적 조성물을 주사하는 데 사용되는 주사기 안쪽 표면에 단백질 활성 성분이 부착되는 것(보통 "끈적거림"이라고 말함)을 감소시킴으로써, (단백질 활성 성분의 표면 부착은 활성 성분의 손실 및 남아있는 단백질 활성 성분의 변성을 가져올 수 있으며, 이는 모두 약제학적 조성물 중에 존재하는 활성 성분의 전체 활성을 감소시킨다); 그리고, (2) 활성 성분의 희석 용액의 제조시에 나타날 수 있는 활성 성분의 변성을 감소시킴으로써, 약제학적 조성물의 단백질성 활성 성분에 안정성이 부여될 수 있다.
약제학적 조성물에서 단백질 활성성분을 안정화할 수 있을 뿐아니라, 알부민은 또한 사람 환자에 주사되는 경우, 일반적으로 면역원성 (immunogenicity)이 무시할 수 있을 정도라는 장점이 있다. 감지할 수 있을 정도의 면역원성을 가지는 화합물은 그에 대한 항체의 생성을 유발할 수 있으며, 이로 인해, 과민반응 (anaphylactic reaction) 및/또는 약물 내성이 나타나, 치료하려는 질환 또는 장애를 면역성 구성성분을 가지는 약제학적 조성물로는 치료하기 어렵게 될 가능성이 있다.
재조합 알부민이 보툴리눔 독소 약제학적 조성물 중에서 안정화제로서 제안되었다. 즉, 미국 특허출원 2003 0118598 (Hunt)는 약제학적 조성물에 존재하는 보툴리눔 독소를 안정화하기 위한 재조합 알부민, 콜라겐 또는 녹말과 같은 다양한 부형제의 사용을 개시한다.
콜라겐은 신체내 모든 단백질의 약 1/4을 차지하는 포유류에 가장 풍부한 단백질이며 피부, 인대 및 힘줄과 같은 결합 조직(connective tissue)의 주요 구성요 소이다. 천연 콜라겐은 3가지 고분자량 단백질의 3중 나선이다. 콜라겐 나서늘 구성하는 3가지 단백질 사슬 각각은 1400개 이상의 아미노산을 가진다. 적어도 25가지의 상이한 종류의 콜라겐이 사람에서 확인되었다.
콜라겐은 미소선(smile line) 홈 및 찌푸림선(frown line), 미간 접힘, 눈가 주름 및 입술 위 아래의 수직 잔주름을 매끄럽게 하기 위한 것과 같은 피부 윤곽 문제를 처치하기 위한 필러 물질로서 미용을 목적으로 사용되어 왔다. 콜라겐은 또한 특정한 수술후 흉터 또는 여드름 흉터 및 수두자국과 같은 바이러스성 얽은 자국(viral pock marks)을 매끄럽게 하는 데 유용하다. 이러한 목적을 위해, 콜라겐을 진피에 주사하여 피부가 올라오게 한다.
젤라틴은 콜라겐을 가수분해하여 얻을 수 있다. 젤라틴은 몇몇 단백질 활성 성분 약제학적 조성물에 알부민 대체물질로서 사용되어 왔다. 특히, 젤라틴은 동물 유래 단백질이므로, 사람 혈청 알부민에 의해서 나타날 수 있는 잠재적인 전염성에 대해 동일한 위험성을 가진다. 중국 특허 CN 1215084은 천연 젤라틴(콜라겐 가수분해물), 동물 유래 단백질, 덱스트란 및 수크로오스를 가지며 알부민이 없는 보툴리눔 독소 타입 A를 개시한다. 미국 특허 제6,087,327호는 또한 천연 젤라틴과 함께 조성된 보툴리눔 독소 타입 A 및 B의 조성물을 개시한다.
불행히도, 안정화 효과가 알려져 있음에도, 약제학적 조성물에 알부민 또는 젤라틴과 같은 단백질 부형제를 사용하는 데는 심각한 문제가 있다. 예를 들어, 알부민 및 젤라틴은 값이 비싸고, 점점 입수하기가 어려워지고 있다. 게다가, 환자에 투여할 경우, 알부민 및 젤라틴과 같은 혈액 제품 또는 동물 유래 제품은 환 자가 혈액 유래 병원균 또는 전염성 미생물에 감염되는 잠재적인 위험성을 초래할 수 있다. 즉, 약제학적 조성물 중에 동물 유래 단백질 부형제가 존재함으로써, 의도하지 않게 감염성 요소들이 약제학적 조성물 중에 포함될 수 있는 가능성이 있다고 알려져 있다. 예를 들어, 사람 혈청 알부민의 사용이 약제학적 조성물 내로 프리온을 이동시킬 수 있다고 보고 되었다. 프리온(prion)은 단백질성 감염성 입자로서, 정상 단백질을 만드는 동일한 핵산 서열로부터 비정상적인 구조의 이성질체(isoform)로서 나타난다는 가설이 있다. 또한, 번역후 단계(post translation level)에서 프리온 단백질 이성질체에 대한 정상적인 이성질체 단백질의 "보충 반응 (recruitment reaction)"에 감염성이 있다는 가설이 있다. 정상적인 내재성 세포 단백질이 병원성 프리온 구조로 잘못 접히는 것(misfold)을 유도하는 것으로 여겨진다.
따라서, 보툴리눔 독소 약제학적 조성물 중에 존재하는 보툴리눔 독소를 안정화하는 데 사용할 수 있는 적합한 부형제를 알아내는 것이 요구된다. 바람직하게, 보툴리눔 독소 안정화제는 동물(즉, 포유류) 공급원으로부터 유래한 단백질이 아니다.
보툴리눔 독소
혐기성, 그람 양성 박테리아인 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)은 강력한 폴리펩티드 신경독인, 보툴리눔 독소를 생성하며, 이 독은 사람 및 동물에서 보툴리즘이라는 신경마비 질환을 유발한다. 클로스트리디움 보툴리눔 및 이의 포자는 보통 토양에서 발견되며, 이 박테리아는 집에서 통조림할 때 제대로 살균되지 않고 밀봉된 식품 용기에서 배양될 수 있어, 이러한 것들이 많은 경우 보툴리즘의 원인이 된다. 보툴리즘 증상은 전형적으로 클로스트리디움 보툴리눔 배양물 또는 포자에 감염된 음식물을 먹은 후 18 내지 36시간이 지나서 나타난다. 보툴리눔 독은 독성이 감소되지 않은채로 장 내막을 통과하여 말초 운동 뉴런을 공격할 수 있는 것으로 보인다. 보툴리눔 독소 중독의 증상은 보행장애, 연하장애 및 언어장애로부터 호흡근육의 마비 및 죽음으로 진행될 수 있다.
보툴리눔 독소 타입 A은 사람에게 알려진 가장 치명적인 천연 생물학제이다. 마우스에서 보툴리눔 독소(정제된 신경독 복합체) 타입 A의 LD50은 약 50 피코그램이다. 흥미롭게도, 몰을 기준으로 할때, 보툴리눔 독소 타입 A는 디프테리아보다 18억배, 시안화 나트륨보다 6억배, 코브로톡신(cobrotoxin)보다 3천만배, 그리고, 콜레라보다 1천2백만배 더 치명적이다. Singh, Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, page 63-84(chapter 4) of Natural Toxins II, edited by B.R.Sigh et al., Plenum Press, New York(1976)(보툴리눔 독소 타입 A의 상기한 LD50 0.3ng이 1U과 동일하다는 것은 약 0.05ng의 BOTOX®가 1유닛이라는 사실에 의해 보정된다). 보툴리눔 독소 1 유닛(U)은, 체중이 각각 18-20g인 암컷 스위스 웹스터 마우스(Swiss Webster mice)에 복강내 주사시 LD50로서 정의할 수 있다. 다시 말해, 보툴리눔 독소 1유닛은 암컷 스위스 웹스터 마우스 그룹의 50%를 죽게 하는 보툴리눔 독소의 양이다. 7개의 면역학적으로 구별되는 보툴리눔 신경독은, 타입-특이적인 항체로 중화하여 구별되는, 각각 보툴리눔 신경독 세로타입(serotype) A, B, C1, D, E, F 및 G로 특징지워진다. 상이한 세로타입의 보툴리눔 독소는 작용하는 동물 종 및 일으키는 마비의 정도 및 지속시간에 따라 차이가 있다. 예를 들어, 래트에서 발생하는 마비율로 측정할 때, 보툴리눔 독소 타입 A는 보툴리눔 독소 타입 B에 비하여 500배 더 강력한 것으로 측정되었다. 또한, 보툴리눔 독소 타입 B는, 보툴리눔 독소 타입 A 영장류 LD50의 약 12배인 480U/kg을 영장류에 투여할 때도 독성이 없는 것으로 측정되었다. 보툴리눔 독소들은 콜린성 운동 뉴런에 강한 친화도를 가지고 결합하고, 뉴런으로 들어가 아세틸콜린의 시냅스전 방출을 억제하는 것으로 여겨진다.
보툴리눔 독소는 활동항진성 골격근을 특징으로 하는 신경근 장애의 치료를 위해 임상 세팅에 사용되고 있다. 보툴리눔 독소 타입 A는 1989년 미국 식품의약청에 의해서, 12세 이상 환자에서의 본태성 안검경련, 사시 및 반측안면 경련의 치료에 사용되는 것이 허가되었다. 말초 주사(즉, 근육내 또는 피하 주사)된 보툴리눔 독소 타입 A의 임상 효과는 보통 주사 후 1주 이내, 및 종종 주사후 몇시간 이내에 나타난다. 일회 보툴리눔 독소 타입 A의 근육내 주사에 의한 증상 구제(즉, 이완 근육 마비)의 전형적인 지속시간은 약 3개월 내지 약 6개월일 수 있다.
모든 보툴리눔 독소 세로타입이 신경근 접합부에서 신경전달물질 아세틸콜린의 방출을 억제하는 것으로 여겨지지만, 이들은 상이한 신경분비성 단백질에서 작용하며, 및/또는 이 단백질을 상이한 부위에서 절단한다. 보툴리눔 독소 A는 특이적으로 세포내, 소포(vesicle) 관련 단백질 SNAP-25의 펩티드 결합을 가수분해할 수 있는, 아연 엔도펩티다아제이다. 보툴리눔 독소 타입 A와 비교할 때, 보툴리눔 타입 E가 또한 25kD 시냅토솜 관련 단백질(SNAP-25)을 절단하지만, 이 단백질의 상이한 아미노산 서열을 표적으로 한다. 보툴리눔 독소 타입 B, D, F 및 G는 소포 관련 단백질(VAMP, 소위 시냅토브레빈)에 작용하며, 각각의 세로타입은 이 단백질의 상이한 부위를 절단한다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 타입 C1은 신택신 및 SNAP-5를 모두 절단하는 것으로 보인다. 이러한 작용 메카니즘의 상이성은 여러 보툴리눔 독소 세로타입들의 작용에 의한 상대적인 효력 및/또는 지속시간에 영향을 미칠 것이다.
세로타입에 관계없이, 독소 중독의 분자적 메카니즘은 유사하며, 적어도 3 단계로 구성되는 것으로 보인다. 이 과정의 첫번째 단계에서는, 중쇄(H 사슬)와 세포 표면 수용체의 특이적인 상호작용에 의해서, 독소가 표적 뉴런의 시냅스전 막에 결합한다; 이 수용체는 보툴리눔 독소 타입 및 파상풍 독소 타입 각각에 따라 다른 것으로 여겨진다. 세포 표면에 대한 독소의 표적화에는 H 사슬의 카르복실 말단 단편, Hc이 중요한 것으로 여겨진다.
두번째 단계에서는, 독소가 중독된 세포의 원형질막을 가로질러 통과한다. 일차로 독소는 수용체-매개 엔도시토시스를 통하여 세포에 의해서 감싸져서, 독소를 포함하는 엔도좀이 형성된다. 그리고 나서, 독소는 엔도좀을 빠져나와 세포의 세포질로 들어간다. 이 마지막 단계는 약 pH 5.5 이하에서 독소의 구조 변경을 유발하는 H 사슬의 아미노 말단 단편, HN에 의해서 매개되는 것으로 여겨진다. 엔도좀 은 엔도좀 내부 pH를 감소시키는 양성자 펌프를 가지는 것으로 알려져 있다. 구조적 위치이동으로 인해 독소의 소수성 잔기가 노출되어, 독소가 엔도솜 막으로 둘러싸일 수 있게 된다. 그리고 나서, 독소는 엔도솜 막을 통하여 시토졸로 전위된다.
보툴리눔 독소 활성화 메카니즘의 마지막 단계는 중쇄, H 사슬과 경쇄, L 사슬을 연결하는 디설파이드 결합의 환원을 포함하는 것으로 여겨진다. 보툴리눔 및 파상풍 독소의 전체 독성 활성은 완전독(holotoxin)의 L 사슬에 포함되며; L 사슬은 인식, 및 신경전달물질-함유 소포(vesicle)와 원형질 막의 세포질 표면과의 도킹, 및 원형질 막과 소포와의 융합에 꼭 필요한 단백질을 선택적으로 절단하는 아연(Zn++) 엔도펩티다아제이다. 파상풍 신경독, 보툴리눔독소 타입 B,D,F 및 G는 시냅토브레빈(또는 소포-관련 막 단백질(VAMP)라 칭함), 시냅토솜 막 단백질의 분해를 야기한다. 시냅스 소포의 세포질 표면에 존재하는 VAMP은 대부분 이러한 분해작용 중 하나의 결과로 제거된다. 각각의 독소는 특이적으로 상이한 결합을 절단한다.
보툴리눔 독소 단백질 분자의 분자량은, 알려진 보툴리눔 독소 세로타입 7가지 모두에서, 약 150kD이다. 흥미롭게도, 보툴리눔 독소는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서, 관련된 비독성 단백질과 함께 150kD 보툴리눔 독소 단백질 분자를 포함하는 복합체(complex)로서 방출된다. 그러므로, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서, 900k, 500Dk 및 300kD 형으로 생성될 수 있다. 보툴리눔 독소 타입 B 및 C1은 500kD 복합체로서만 생성되는 것으로 보인다. 보툴리눔 독소 타입 D는 300kD 및 500kD 복합체로서 생성된다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 타입 E 및 F는 약 300kD 복합체로서만 생성된다. 이 복합체들(즉, 분자량이 약 150kD 보다 큰 것)은 비독성 적혈구응집소 단백질 및 비독소 및 비독성 비적혈구응집소 단백질을 포함하는 것으로 여겨진다. 이러한 두가지 비독성 단백질(보툴리눔 독소 분자와 함께 관련 신경독 복합체를 구성할 수 있는)은 보툴리눔 독소 분자 변성에 대한 안정성 및 독소가 섭취될 때 소화성 산에 대한 보호를 제공하는 데에 작용할 것이다. 또한, 보툴리눔 독소 복합체가 더 클수록(분자량이 약 150kD 이상), 보툴리눔 독소 복합체가 근육 주사된 부위로부터 보툴리눔 독소가 더 천천히 확산될 것이다. 독소 복합체를 pH 7.3에서 적혈구 세포로 처리하여, 복합체를 독소 단백질 및 적혈구응집소 단백질로 분리할 수 있다. 적혈구응집소 단백질의 제거시, 독소 단백질은 현저한 불안정성을 가진다.
클로스트리디움 보툴리눔 박테리아에서 생성된 보툴리눔 독소 세로타입은 모두 비활성 단일사슬 단백질이며, 신경활성을 가지려면 프로테아제로 절단하거나 닉(nick)을 내어야만 한다. 보툴리눔 독소 세로타입 A 및 G를 생성하는 박테리아 균주는 내재성 프로테아제를 지니며, 따라서 세로타입 A 및 G는 박테리아 배양물로부터 주로 활성형으로서 회수될 수 있다. 이와 대조적으로, 보툴리눔 독소 세로타입 C1, D 및 E는 비단백분해성 균주에 의해 합성되므로, 배양물에서 회수될 때 전형적으로 비활성화된 상태이다. 세로타입 B 및 F는 단백분해성 및 비단백분해성 균주 모두에 의해서 생성되므로, 활성 또는 비활성 형으로 회수될 수 있다. 그러나, 예를 들어, 보툴리눔 독소 타입 B 세로타입을 생성하는 단백분해성 균주는 생성된 독소의 일부만을 절단한다. 닉을 내지 않은 분자에 대한 닉을 낸 분자의 정확한 비율은 배양시간 및 배양물의 온도에 따라 다르다. 그러므로, 아마도 알려진대로 보툴리눔 독소 타입 A에 비해 보툴리눔 독소 타입 B은 효력이 상당히 낮기 때문에, 예를 들어, 소정 백분율의 어떤 표본의 보툴리눔 독소 타입 B 독소도 비활성일 것이다. 임상 표본에서 비활성 보툴리눔 독소 분자의 존재는 표본의 총체적인 단백질 부하에 기여할 것이며, 이는 임상적인 효과에는 기여하지 않으면서 항원성의 증가와 연관된다. 또한, 동일한 투여량 레벨에서 보툴리눔 독소 타입 B는 보툴리눔 독소 타입 A에 비하여, 근육 주사시, 활성의 지속시간이 더 짧고 또한 효력이 떨어지는 것으로 알려져 있다.
in vitro 연구에서, 보툴리눔 독소가, 뇌간 조직의 일차 세포 배양물로부터 아세틸콜린 및 노르에피네프린의 칼륨 양이온 유도 방출을 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 보툴리눔 독소는 척수 뉴런의 일차 배양물에서 글리신 및 글루타메이트의 유발 방출을 억제하며, 뇌 시냅토솜 표본에서 신경전달물질 아세틸콜린, 도파민, 노르에피네프린, CGRP 및 글루타메이트 각각의 방출을 억제하는 것으로 보고되었다.
클로스트리디움 보툴리눔의 홀 A 종(Hall A strain)으로부터 ≥3 X 107U/mg이고, A260/A278이 0.60 이하이고, 겔 전기영동에서 독특한 밴드 패턴을 보이는 특징을 가지는, 질 높은 결정형 보툴리눔 독소 타입 A를 얻을 수 있다. Shantz, E.J. et al., Properties and use of Botulinum toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine, Microbiol Rev. 56:80-99(1992)에 기재된 바와 같은, 공지의 산츠 프로세스(Shantz process)를 결정형 보툴리눔 독소 타입 A를 얻는데 사용할 수 있다. 일반적으로, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체는 적절한 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A를 배양한 혐기성 발효물로부터 분리 및 정제될 수 있다. 황산으로 침전시키고, 한외여과로 농축시켜, 정제하지 않은 독소(raw toxin)를 수확할 수 있다. 산 침전물을 염화칼슘 중에 용해시켜 정제할 수 있다. 그리고 나서, 독소를 차가운 에탄올로 침전시킬 수 있다. 이 침전물은 인산 나트륨 버퍼용액 중에 용해시키고, 원심분리할 수 있다. 그리고나서 건조하면, 특이적인 효력이 3 X 107 LD50 U/mg 이상인, 약 900kD의 결정형 보툴리눔 독소 타입 A 복합체를 얻을 수 있다. 이러한 공지의 프로세스는 또한, 예를 들어: 분자량이 약 150 kD이고, 특이적인 효력이 1-2 X 108 LD50 U/mg 이상인 보툴리눔 독소 타입 A를 정제하거나; 분자량이 약 156 kD이고, 특이적인 효력이 1-2 X 108 LD50 U/mg 이상인 보툴리눔 독소 타입 B를 정제하거나; 분자량이 약 155 kD이고, 특이적인 효력이 1-2 X 107 LD50 U/mg 이상인 보툴리눔 독소 타입 F를 정제하는 등의, 비독성 단백질들로부터 순수한 보툴리눔 독소들을 분리하여 얻는데 사용할 수 있다.
보툴리눔 독소 및/또는 보툴리눔 독소 복합체를, 예를 들어,List Biological Laboratories, Inc., Campbell, California; the Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, U.K.; Wako (Osaka, Japan)뿐아니라 Sigma Chemicals of St Louis, Missouri로부터 입수할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 보툴리눔 독소 함유 약제학적 조성물은 Allergan, Inc., of Irvine, Califonia으로부터 입수가능한, 사용 전에 0.9% 소듐 클로라이드로 재구성되는 동결건조 분말로서, 100유닛 바이알의 BOTOX®(사람 혈청 알부민 및 소듐 클로라이드를 갖는 보툴리눔 독소 타입 A 신경독 복합체), 사용 전에 0.9% 소듐 클로라이드로 재구성되는 동결건조 분말로서, lpsen Limited, Berkshire, U.K.로부터 입수가능한 Dysport® (조성 중에 사람 혈청 알부민 및 락토오스를 가지는 클로스트리디움 보툴리눔 독소 타입 A 적혈구응집소 복합체) 및 MyoBloc™(Solstice Neurosciences, Inc., South San Francisco, California로부터 입수가능한 pH 5.6에서 보툴리눔 독소 타입 B, 사람 혈청 알부민, 소듐 숙시네이트 및 소듐 클로라이드를 포함하는 주사용 용액)를 포함한다.
보툴리눔 독소 타입 A이 다양한 임상 조건을 처치하는데 성공함에 따라 다른 보툴리눔 독소 세로타입도 관심을 끌었다. 또한, 순수한 보툴리눔 독소가 사람을 처치하는 데 사용되고 있다. 예를 들어,Kohl A., et al., Comparison of the effect of botulinum toxin A (Botox (R)) with the highly-purified neurotoxin (NT 201) in the extensor digitorum brevis muscle test, Mov Disord 2000;15(Suppl 3):165 참조. 그러므로, 약제학적 조성물이 순수한 보툴리눔 독소를 사용하여 제조될 있다.
타입 A 보툴리눔 독소는 pH 4-6.8의 묽은 수용액에 용해되는 것으로 알려져 있다. 약 7 이상의 pH에서는, 특히 pH 및 온도가 상승함에 따라 신경독으로부터 안정화 비독성 단백질이 분리되어, 독성이 점진적으로 손실된다. Schantz EJ. , et al Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment (특히 44-45 페이지), being chapter 3 of Jankovic, J., et al, Therapy with Botulinum Toxin, Marcel Dekker, lnc (1994) 참조.
2002년 7월 31일 등록된 유럽 특허 EP1112082("Stable liquid formulations of botulinum toxin")는 완충제(pH 5-6) 및 보툴리눔 독소를 포함하는 안정한 액체 약제학적 보툴리눔 독소 제제를 청구하며, 이 독소 제제는 액체로서 0-10℃의 온도에서 적어도 1년간 또는 10 내지 30℃ 온도에서 적어도 6 개월간 안정하다. 이러한 보툴리눔 독소 약제학적 제제(이의 실시형태가 Solstice Neurosciences, Inc., of San Diego, California에 의해서 상표명 MyoBloc® 또는 NeuroBloc®으로 시판중임)는 사용전 재구성이 필요없는 액체 용액(동결건조 또는 진공건조를 실시하지 않음)으로서 제조된다.
"Pharmaceutical Composition of Botulinum Neurotoxin and Method of Preparation"라는 명칭의 미국 특허 5,512,547 (Johnson et al)가 1996년 4월 30일 등록되었으며, 37℃에서 저장안정성이 있는 알부민 및 트레할로오스를 포함하는 순수한 보툴리눔 타입 A 제제를 청구한다.
미국 특허 5,756,468 (Johnson et al)("Pharmaceutical Compositions of Botulinum Toxin or Botulinum Neurotoxin and Method of Preparation")가 1998년 5월 26일 등록되었으며, 25℃ 내지 42℃에서 저장할 수 있는, 티오알킬, 알부민 및 트레할로오스를 포함하는 동결건조된 보툴리눔 독소 제제를 청구한다.
"Pharmaceutical Composition Containing Botulinum B Complex"라는 명칭의 미국 특허 5,696,077 (Johnson et al)가 1997년 12월 9일에 등록되었으며, 타입 B 복합체 및 단백질 부형제를 포함하는 냉동 건조된, 소듐 클로라이드가 없는 보툴리눔 타입 B 복합체 제제를 청구한다.
Goodnough M. C, et al., Stabilization of botulinum toxin type A during lyophilization, Appl Environ Microbiol 1992;58(10):3426-3428, 및; Goodnough M. C, et al., Recovery of type-A botulinal toxin following lyophilization, Acs Symposium Series 1994;567(-): 193-203이 개시되어 있다.
중국 특허 CN 1215084A는 젤라틴, 동물 유래 단백질로 구성된 알부민이 없는 보툴리눔 독소 타입 A를 개시한다. 미국 특허 제6,087,327호는 또한 젤라틴과 함께 조성된 보툴리눔 독소 타입 A 및 B의 조성물을 개시한다. 따라서, 이러한 제제들은 동물 유래 단백질 또는 수반되는 감염성 요소를 옮기는 위험성이 제거되지 않는다.
하기와 같이, 임상 세팅에서 보툴리눔 독소 타입 A를 사용하는 것이 보고되었다:
(1) 1회 근육내 주사(다수 근육) 당 약 75-125 유닛의 BOTOX®를 사용하여, 경부 디스토니아(cervical dystonia)를 처치;
(2) 근육내 주사당 5-10 유닛의 BOTOX®를 사용하여, 미간 주름(이마 주름) 을 처치(5 유닛을 비근근에 근육내 주사하고, 10 유닛을 각각의 추미근에 근육내 주사)
(3) 치골직장근에 약 30-80 유닛의 BOTOX®를 괄약근내 주사하여 변비를 처치
(4) 윗눈꺼풀의 측면연골전 안윤근 및 아래 눈꺼풀의 측면연골전 안윤근에, 근육당 약 1-5 유닛의 BOTOX®를 근육내 주사하여 안검경련을 처치
(5) 외안근에 약 1-5 유닛의 BOTOX®를 근육내 주사하여 사시를 치료, 주사량은 주사하는 근육의 크기 및 원하는 근육마비 정도(즉, 원하는 디옵터 교정 량)에 따라 달라짐.
(6) 하기와 같이, 상이한 5부위의 상지 굴근에 BOTOX®를 근육내 주사하여 졸중 후의 상지 경련을 처치
(a) 심지굴근 : 7.5 U 내지 30 U
(b) 천지굴근 : 7.5 U 내지 30 U
(c) 척측수근굴근 : 10 U 내지 40 U
(d) 요측수근굴근 : 15 U 내지 60 U
(e) 상완이두근 : 50 U 내지 200 U
동일한 처치 기간(session)에 각각 상기한 5가지 근육에 주사하여, 각 처치 기간마다 환자의 상지 굴근에 90 U 내지 360 U의 BOTOX®를 근육내 주사.
(7) 25 U의 BOTOX®를 두부 주위에 주사(미간, 전두근 및 측두근에 대칭적으로 주사)하여 편두통을 처치
25 U을 주사한 후 3개월간 편두통의 발생빈도, 최대강도, 수반되는 구토 및 급성의 약물사용의 감소정도로 측정할 때, 편두통의 예방처치로서 비히클에 견줄만한 상당한 장점을 제공한다.
보툴리눔 독소 타입 A는 12 개월까지 효력을 지속할 수 있으며(European J. Neurology 6 (Supp 4): S111-S1150 : 1999), 어떤 상황에서는 27 개월동안 지속될 수 있다. The Laryngoscope 109:1344-1346:1999 참조. 그러나, BOTOX®의 근육내 주사의 일반적인 지속시간은 전형적으로 약 3 내지 4개월이다.
보툴리눔 독소 타입 A이 다양한 임상 조건을 처치하는데 성공함에 따라 다른 보툴리눔 독소 세로타입도 관심을 끌었다. 또한, 순수한 보툴리눔 독소가 사람을 처치하는 데 사용되고 있다. 예를 들어, Kohl A., et al., Comparison of the effect of botulinum toxin A (Botox (R)) with the highly-purified neurotoxin (NT 201) in the extensor digitorum brevis muscle test, Mov Disord 2000;15(Suppl 3):165 참조. 그러므로, 약제학적 조성물이 순수한 보툴리눔 독소를 사용하여 제조될 있다.
보툴리눔 독소 분자(약 150kDa)뿐아니라, 독소 타입 A 복합체와 같은 보툴리눔 독소 복합체(약 300-900 kDa)가 또한 표면 변성, 열 및 알칼리 조건으로 인한 변성에 극도로 민감하다. 비활성화 독소는 면역원성일 수 있는 톡소이드 단백질을 형성한다. 그 결과로 생긴 항체는 환자를 독소 주사에 반응하지 않게 만들 수 있다.
일반적으로 효소에서 그렇듯이, 보툴리눔 독소들(이들은 세포내 펩티다아제 임)의 생물학적 활성은, 적어도 일부분, 그들의 3차원적 구조에 따라 달라진다. 그러므로, 보툴리눔 독소 타입 A는 열, 다양한 화학물질, 표면 긁힘 및 표면 건조에 의해서 독성이 제거될 수 있다. 또한, 공지의 배양, 발효 및 정제에 의해 얻어진 독소 복합체를 훨씬 더 낮은 독소 농도로 희석하여 약제학적 조성물 제제에 사용하는 경우, 적합한 안정화제가 없으면, 독소의 독성이 빠르게 제거된다는 것이 공지되어 있다. 대량으로 희석하면 특이적 독성이 빠르게 손실되기 때문에, 수 밀리그램 양의 독소를 밀리리터당 수 나노그램을 함유하는 용액으로 희석하는 것은 상당히 어렵다. 독소를 함유하는 약제학적 조성물을 제조한 후, 수개월 또는 수년동안 사용할 수 있기 때문에, 독소는 안정화제를 사용하여 안정화하여야만 한다. 현재까지 이러한 목적을 위한 유일하게 성공적인 안정화제로는 동물 유래 단백질 사람 혈청 알부민 및 젤라틴이 사용되어 왔다.
상업적으로 입수가능한 보툴리눔 독소 함유 약제학적 조성물은 BOTOX®(Allergan, Inc., of Irvine, Califonia으로부터 입수가능)라는 상표로 시중에 유통되고 있다. BOTOX®는 정제 보툴리눔 독소 타입 A 복합체, 사람 혈청 알부민 및 소듐 클로라이드로 구성되며, 살균, 진공건조 형태로 포장된다. 보툴리눔 독소 타입 A는, N-Z 아민 및 효모 추출물을 함유하는 배지에서 배양된 클로스트리디움 보툴리눔 홀 종(Hall strain)의 배양물로부터 제조한다. 보툴리눔 독소 타입 A 복합체를 배양물 용액으로부터 일련의 산 침전을 통하여, 활성 고분자량 독소 단백질 및 관련 적혈구응집소 단백질로 구성되는 결정형 복합체로 정제한다. 결정형 복합체를 염수 및 알부민에 재-용해하고, 살균 여과(0.2미크론)한 후, 진공건조한다. 근육내 주사 전에, BOTOX®는 살균된, 방부제없는 염수로 재구성(reconstitute)될 수 있다. 각각의 BOTOX® 바이알은 방부제없는, 살균된, 진공-건조 형태로서, 약 100 유닛(U)의 클로스트리디움 보툴리눔 독소 타입 A 복합체, 0.5 밀리그램의 사람 혈청 알부민 및 0.9 밀리그램의 염화나트륨을 함유한다.
진공-건조된 BOTOX®를 재구성하기 위해서, 방부제없는, 살균된 일반 염수(0.9% 염화 나트륨 주사액)을 사용하여, 적정량의 희석제를 알맞은 크기의 주사기에 넣는다. BOTOX®는 거품내기 또는 유사한 격렬한 교반에 의해서 변성되므로, 희석제는 서서히 바이알에 주입한다. 멸균성 때문에, BOTOX®는 재구성 후 4시간 내에 투여하여야 한다. 이 기간 동안, 재구성된 BOTOX®는 냉장고(2 내지 8℃)에 보관한다. 재구성된 BOTOX®는 맑고 무색이며, 입자 물질이 없다. 진공-건조된 제품은 5℃ 이하의 냉동고에 보관한다.
보툴리눔 독소 안정화제로서 사람 혈청 알부민을 대체할 안정한 대체물질로 또다른 단백질 또는 이와달리 저분자량 화합물(단백질이 아닌)이 보고되었다. Carpender et al., Interactions of Stabilizing Additive with Proteins During Freeze -Thawing and Freeze - Drying, International Symposium on Biological Product freeze-Drying and Formulation, 24-26 October 1990; Karger(1992), 225-239.
약제학적 조성물에서 보통 캐리어 및 벌크제로 사용되는 많은 물질들이, 신경독 함유 약제학적 조성물 중에서 알부민 대체물질로서는 불안정하다는 것이 입증된 바 있다. 예를 들어, 이당류 셀로비오스는 본 독소의 안정화제로서는 불안정하 다는 것이 판명되었다. 즉, 알부민 및 염화 나트륨과 함께, 부형제로서 셀로비오스를 사용하면, 이러한 부형제가 있는 결정형 보툴리눔 독소 타입 A의 동결건조 후 독성(10% 회복)은, 사람 혈청 알부민만 있는 것의 동결건조 후 독성(>75% 내지 >90% 회복)과 비교할 때 훨씬 낮아진다고 알려져 있다. Goodnough et al., Stabilization of Botulinum Toxin Type A During Lyophilization, App & Envir. Micro. 58(10)3426-3428(1992).
게다가, 다당류를 포함하는 당류는 일반적으로 단백질 안정화제로서는 별로 좋지 않다. 즉, 단백질 제제가 당류(글루코오스 또는 글루코오스의 중합체와 같은) 또는 탄수화물을 포함하여 이루어지는 경우에는, 단백질과 글루코오스가 서로 상호작용하여 잘 알려진 마이얄 반응(Millard reaction)을 하는 것으로 알려져 있기 때문에, 즉, 글루코오스 및 글루코오스 중합체의 성질을 환원시키므로, 단백질 활성 성분을 함유하는 약제학적 조성물은 원래 불안정하다고 알려져 있다. 예를 들어, 수분의 감소 또는 비-환원당의 사용 등, 이러한 단백질-당류 반응을 방지하려는 많은 시도들이 대부분 성공하지 못했다. 두드러지게, 마이얄 반응의 분해 경로로 인해, 단백질 활성 성분이 치료학적으로 불충분하게 된다. 그러므로, 단백질 및, 글루코오스 중합체와 같은, 환원당류, 탄수화물 또는 당을 함유하는 약제학적 조성물은 원래 불안정하며, 장기간 보관시 활성성분 단백질의 바람직한 생물학적 활성이 상당히 손실된다.
헤타스타치와 같은 특별한 고분자량 다당류(녹말)가 보툴리눔 독소 약제학적 조성물 중에 존재하는 보툴리눔 독소의 안정화제로서 보고되었다. 예를 들어, 2005년 4월 27일 등록된 유럽 특허 EP 1 253 932 참조.
현저하게, 약제학적 조성물에서 알부민 또는 젤라틴이 단백질 활성 성분의 안정화제로서 효과적으로 작용할 수 있는 이유 중의 하나는 단백질인 알부민은 약제학적 조성물의 단백질 활성 성분과 마이얄 반응을 하지 않는다는 점이다. 따라서, 보툴리눔 독소 약제학적 조성물 중에 존재하는 보툴리눔 독소를 안정화하는 데 사용되는 이러한 단백질 부형제의 대체물질을 다른 단백질들 중에서 찾을 수 있을 것으로 기대된다.
보툴리눔 독소 및 적합한 약제학적 조성물로의 조성의 독특한 특성들은 보툴리눔 독소 함유 약제학적 제제에서 단백질 안정화제를 대체할 물질을 찾는 것을 더욱 어렵게 한다. 이러한 독특한 특성의 4가지 예를 하기에 기재하였다.
첫째, 약제학적 조성물에 포함시키기에는 보툴리눔 독소는 비교적 큰 단백질이므로(보툴리눔 독소 타입 A 복합체의 분자량은 900kD), 본래 깨지기 쉬우며 불안정하다. 이러한 독소 복합체의 크기때문에, 독소 복합체는 더 작고, 덜 복합된 단백질에 비해서 부스러지기 쉽고 불안정하며, 이로 인해 독소의 안정성을 유지하여야 하는 경우, 제제 조성 및 취급이 용이하지 않다. 그러므로, 알부민 대체물질은 변성되거나, 쪼개지거나 또는 독소 분자의 독성을 제거하거나, 독소 복합체에 존재하는 비독성 단백질의 분리를 야기하지 않는 방법으로 독소와 상호작용할 수 있어야만 한다.
둘째, 알려지 것 중 가장 치명적인 생물학적 생성물이기 때문에, 보툴리눔 독소 함유 약제학적 조성물 제조의 모든 단계에서, 특별한 안정성, 정밀함 및 정확 성이 요구된다. 그러므로, 보툴리눔 독소 안정화제는 그 자체로 독성이 없고, 취급이 용이하여야만 하고, 그렇지 않아도 지극히 엄격한 보툴리눔 독소 함유 약제학적 조성물 제조 요건을 강화시켜서는 안된다.
셋째, 보툴리눔 독소는 미생물 독소로는 맨 처음으로 사람 질병의 처치에 주사하도록 허가(1989년 FDA에 의해서)되었기 때문에, 보툴리눔 독소의 배양, 벌크 생산, 약제학적 조성물 제조 및 용도에 대하여 특이적인 프로토콜이 개발 및 허가되었다. 중요하게 고려해야할 점은 독소의 순도 및 주사 투여량이다. 흔적량이라도 최종 제품을 오염시키거나, 환자에서 예기치 못한 반응을 야기할 수 있는 어떠한 기질에도 독소가 노출되지 않도록, 배양 및 정제에 의한 생산이 이루어져야만 한다. 이러한 제한으로 인해, 동물 고기 제품이 사용되지 않은 단순 배지에서 배양하고, 합성 용매 또는 수지를 포함하지 않는 방법으로 정제하는 것이 요구된다. 크로마토그래피 칼럼 및 합성 용매에 존재하는 것과 같은, 효소, 다양한 교환기를 사용한 독소의 정제는 오염을 일으킬 수 있으므로, 바람직한 제조방법에서 제외된다. 게다가, 보툴리눔 독소 타입 A는 40℃ 이상의 온도에서 쉽게 변성되고, 공기/액체 계면에서 거품형태인 경우 독성이 손실되며, 질소 또는 이산화탄소의 존재하에 변성된다.
넷째, 타입 A는 분자량이 약 150kD인 독소가 분자량이 약 750kD인 비독성 단백질과 비공유 결합되어 구성되기 때문에, 보툴리눔 독소 타입 A를 안정화하는 데는 특별한 어려움이 있다. 비독성 단백질은 독성에 영향을 미치는 2차 및 3차 구조를 보존하거나 안정화하는 것을 도와줄 것으로 여겨진다. 단백질이 아닌 것들 또는 비교적 더 작은 단백질을 안정화하는 데 적용할 수 있는 방법 또는 프로토콜은, 900kD 보툴리눔 독소 타입 A 복합체와 같은 보툴리눔 독소 복합체를 안정화해야하는 문제에 근본적으로 적용할 수 없다. 즉, pH 3.5 내지 6.8인 경우에는 타입 A 독소 및 비독성 단백질이 비공유적으로 결합하며, 약간 알칼리인 조건 (pH>7.1)에서는 매우 불안정한 독소가 독소 복합체에서 분리된다. 앞서 설명한 바와 같이, 순수한 보툴리눔 독소(즉, 150kD 분자)가 약제학적 조성물 중의 활성 성분으로 제안되었다.
보툴리눔 독소의 독특한 성질 및 상기한 필요조건들의 관점에서, 현재 보툴리눔 독소 함유 약제학적 조성물에서 사용되는 단백질 안정화제를 대체할 적합한 비-단백질 안정화제를 찾아낼 수 있는 확률은 현실적으로 거의 제로에 가깝다고 볼수 있다. 본 발명에 전에는, 동물 유래 단백질, 사람 혈청 알부민 및 젤라틴만이 약제학적 조성물에 존재하는 보툴리눔 독소의 적합한 안정화제로 사용될 수 있는 것으로 알려져 있었다. 그러므로, 알부민이, 그 자체로, 또는 인산나트륨이나 시트르산나트륨과 같은 하나 또는 추가의 기질들과 함께, 동결건조 후의 보툴리눔 독소 타입 A의 독성을 높게 회복할 수 있게 하는 것으로 알려져 있다. 불행히도, 이미 상기한 바와 같이, 사람 혈청 알부민은 풀 혈액 제품(pooled blood product)이기 때문에, 약제학적 조성물에 존재하는 경우, 적어도 잠재적으로나마, 전염성 또는 질환유발 요소들을 옮길 수 있다. 사실, 사람 혈청 알부민 또는 젤라틴과 같은 임의의 동물 제품 또는 단백질은 또한 잠재적으로 환자에게 주사될때 역반응을 야기할 수 있는 발열원(pyrogen) 또는 다른 기질들을 포함한다.
따라서, 클로스트리디움계 독소(보툴리눔 독소와 같은)가 비-단백질 부형제에 의해서 안정화된 클로스트리디움계 독소 약제학적 조성물이 요구된다.
개요
본 발명은 이러한 요구를 충족시키며, 비-단백질 부형제에 의해서 안정화된 클로스트리디움계 독소 약제학적 조성물을 제공한다.
정의
본 명세서에서 사용할 때, 하기한 단어들 및 용어들은 다음과 같이 정의된다.
"약"이라는 단어는 정량된 아이템, 파라미터 또는 기간이, 언급한 아이템, 파라미터 또는 기간의 상하로 ± 10%의 범위에 포함됨을 의미한다.
"투여" 또는 "투여하다"는 대상에 약제학적 조성물을 부여하는(즉, 투여하는) 것을 의미한다. 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 예를 들어, 근육내(i.m.), 피부내, 피부하 투여, 초내 투여, 복강내 (i.p.) 투여, 국소(경피) 및 임플란트(즉, 중합체 임플란트 또는 미니 삼투압 펌프와 같은 서방형 장치) 투여 경로에 의해서 "국소 투여된다".
"동물 단백질이 없는"은 혈액 유래, 혈액 풀링된 및 다른 동물 유래 산물 또는 화합물이 없음을 의미한다. "동물"은 포유류(사람과 같은), 조류, 파충류, 어류, 곤충류, 거미류 또는 다른 동물 종을 의미한다. "동물"은 박테리아와 같은 미생물은 배제한다. 따라서, 본 발명의 범주에 속하는 동물 단백질이 없는 약제학적 조성물은 클로스트리디움계 신경독을 포함할 수 있다. 예를 들어, 동물 단백질이 없는 약제학적 조성물은 혈청 유래 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 다른 동물 유래 단백질이 실질적으로 없거나 또는 본질적으로 없거나 또는 완전히 없는 약제학적 조성물을 의미한다. 동물 단백질이 없는 약제학적 조성물의 예는 보툴리눔 독소(활성성분으로서) 및 안정화제 또는 부형제로서 적합한 다당류를 포함하거나 이것들로 구성된 약제학적 조성물이다.
"보툴리눔 독소"는 클로스트리디움 보툴리눔에 의해서 생성된 신경독뿐아니라, 비-클로스트리디움계 종에 의해서 재조합적으로 제조된 보툴리눔 독소(또는 이의 경쇄 또는 중쇄)를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, "보툴리눔 독소"라는 용어는 보툴리눔 독소 세로타입 A, B, C, D, E, F 및 G를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, 보툴리눔 독소는 또한 보툴리눔 독소 복합체(즉, 300, 600 및 900kDa 복합체) 뿐아니라 정제된 보툴리눔 독소(즉, 약 150kDa)를 모두 포함한다. "정제된 보툴리눔 독소"는 보툴리눔 독소 복합체를 형성하는 단백질들을 포함하는, 다른 단백질들로부터 분리된, 또는 실질적으로 분리된 보툴리눔 독소로서 정의된다. 정제된 보툴리눔 독소는 순도가 95% 이상일 수 있으며, 바람직하게는 99% 이상이다. 보툴리눔 C2 및 C3 사이토톡신은, 신경독이 아니며, 본 발명의 범주에서 배제된다.
"클로스트리디움계 신경독"은, 클로스트리디움 보툴리눔, 클로스트리디움 부티리쿰 또는 클로스트리디움 베라티와 같은 클로스트리디움계 박테리아로부터 생성된, 또는 천연의 신경독뿐아니라, 비-클로스트리디움계 종에 의해서 재조합적으로 제조된 클로스트리디움계 신경독을 의미한다.
"완전히 없는"(즉, "구성되는")은 사용되는 장비 또는 방법의 검출 범위 내에서, 물질이 검출될 수 없거나, 그 존재가 확인될 수 없다는 것을 의미한다.
"본질적으로 없는"(또는 "본질적으로 구성되는")은 단지 흔적량의 물질이 검출될 수 있다는 것을 의미한다.
"변형 보툴리눔 독소"는 천연 보툴리눔 독소와 비교할 때, 그 아미노산의 적어도 하나가 삭제, 변형 또는 치환된 보툴리눔 독소를 의미한다. 또한, 변형 보툴리눔 독소는 재조합적으로 생성된 신경독, 또는 재조합적으로 생성된 신경독의 유도체 또는 단편일 수 있다. 변형 보툴리눔 독소는, 보툴리눔 독소 수용체에 결합하는 능력 또는 뉴런으로부터 신경전달물질 방출을 억제하는 능력과 같은, 천연 보툴리눔 독소의 생물학적 활성 중 적어도 하나를 유지한다. 변형 보툴리눔 독소의 일례로는 하나의 보툴리눔 독소 세로타입(세로타입 A와 같은)으로부터의 경쇄, 및 이와 상이한 보툴리눔 독소 세로타입(세로타입 B와 같은)으로부터의 중쇄를 가지는 보툴리눔 독소가 있다. 변형 보툴리눔 독소의 또다른 예로는, 물질 P(substance P)와 같은 신경전달물질과 커플링된 보툴리눔 독소가 있다.
"약제학적 조성물"은 활성 성분이 보툴리눔 독소와 같은 클로스트리디움계 독소일 수 있는 제제를 의미한다. "제제(formulation)"이라는 용어는 약제학적 조성물 중에 클로스트리디움계 신경독 활성 성분 외에 적어도 하나의 추가적인 성분이 있다는 것을 의미한다. 따라서, 약제학적 조성물은, 사람 환자와 같은 대상에, 진단적 또는 치료적으로 투여하기에 (즉, 근육내 또는 피하 주사에 의해서, 또는 저장소 또는 임플란트의 삽입에 의해서) 적합한 제제이다. 약제학적 조성물은: 동결건조 또는 진공건조된 상태; 동결건조 또는 진공건조된 약제학적 조성물을 염수 또는 물로 재구성한 후 형성된 용액; 또는 재구성이 필요없는 용액일 수 있다. 신경독 활성 성분은 보툴리눔 독소 세로타입 A, B, C1, D, E, F 및 G 또는 파상풍 독소 중 하나 또는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서 천연적으로 만들어질 수 있는 모든 보툴리눔 독소일 수 있다. 상기한 바와 같이, 약제학적 조성물은 액체 또는 고체일 수 있으며, 예를 들어, 진공건조될 수 있다. 약제학적 조성물의 구성 성분들이 단일 조성물 중에 포함될 수 있으며(즉, 필요한 재구성 유액을 제외한 모든 구성성분
이 약제학적 조성물의 최종 조성시에 존재함), 또는 2-성분 시스템, 예를 들어, 약제학적 조성물의 최초 조성시에는 존재하지 않는 성분을 포함하는, 염수와 같은 희석액으로 재구성된 진공건조된 조성물로서 포함될 수 있다. 2-성분 시스템
(two-component system)은 2-성분 시스템의 제 1 성분과 함께 장기간 저장하기 쉽지 않은 성분들의 병합을 가능하게 하는 이점을 제공한다. 예를 들어, 재구성 비히클 또는 희석액은 사용기간 동안, 예를 들어, 1주일간의 냉장 저장시 미생물
성장으로부터 충분한 보호를 제공할 수 있는 보존제를 포함할 수 있으며, 보존제는 독소가 변성될 수 있는 기간인 2년의 냉동 저장 기간 동안에는 존재하지 않는다. 클로스트리디움계 독소 또는 장기저장시 다른 성분들과 함께 존재할 수 없는 다른 성분들을 이러한 방법으로 병합할 수 있다; 즉, 사용할 시점 근처에 제 2 비히클에 (즉, 재구성 유액 중에) 가한다.
"안정화제"(또는 "주요 안정화제(primary stabilizer)")는 생물학적 구조(즉, 3차원 배열) 및/또는 단백질(보툴리눔 독소와 같은 클로스트리디움계 신경독과 같은)의 생물학적 활성을 보존 또는 유지하는 것을 돕는 화학 제제이다. 본 명세서에서 사용되는 안정화제는 비-단백질이다. 주요 안정화제는 주요 안정화제를 포함하는 조성물을 투여한 대상에서 면역원 반응을 제공하지 않는(또는 감쇠된 면역 반응을 제공하는) 합성 제제일 수 있다. 추가적인 안정화제가 또한 약제학적 조성물 중에 포함될 수 있다. 이러한 추가적인 또는 부수적인 안정화제는 단독으로 또는 주요 안정화제와 조합하여 사용될 수 있다. 부수적인 안정화제의 예로는 이에 제한되지는 않지만 비-산화 아미노산 유도체(트립토판 유도체와 같은, N-아세틸-트립토판("NAT")와 같은), 카프릴레이트(즉, 소듐 카프릴레이트), 폴리소르베이트(즉, P80), 아미노산, 및 아연과 같은 2가 금속 양이온이 포함된다. 약제학적 조성물은 또한 벤질 알콜, 벤조산, 페놀, 파라벤 및 소르브산과 같은 방부제를 포함할 수 있다.
"안정화하는", "안정화하다" 또는 "안정화"는 약제학적 활성 성분("PAI")이 PAI를 안정화하는 또는 안정화를 제공하는 화합물의 존재 하에 적어도 20% 및 100% 이하의 생물학적 활성(생체 내 LD50 또는 ED50 측정에 의한 효력 또는 독성으로 측정될 수 있는)을 유지하는 것을 의미한다. 예를 들어, (1) 벌크 또는 저장 용액으로부터 계열 희석하여 제조시, 또는 (2) 6개월 내지 4년간 약 -2℃ 또는 그 이하로 저장된 동결건조 또는 진공건조 보툴리눔 독소 함유 약제학적 조성물을 염수 또는 물로 재구성시, 또는 (3) 6개월 내지 4년간 약 -2℃ 내지 약 8℃에서 저장된 수용액 보툴리눔 독소 함유 약제학적 조성물에서, 재구성된 또는 수용액 약제학적 조성물 중에 존재하는 보툴리눔 독소는 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소가 약제학적 조성물로 병합되기 전에 가지는 효력 또는 독성의 약 20% 이상 및 약 100% 이하를 가진다.
"실질적으로 없는"은 약제학적 조성물 중에 1 중량% 이하의 레벨로 존재하는 것을 의미한다
"치료학적 제제"은 말초 근육의 활동항진상태(즉, 경련성)와 같은 질병 및 질환과 같은 질병 및 질환을 처치하여 완화시키는 데 사용될 수 있는 제제를 의미한다.
보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 복합체(즉, 특정 보툴리눔 독소 세로타입에 따라 약 300 내지 약 900 킬로달톤 복합체)로서 존재할 수 있으며, 또는 보툴리눔 독소는 순수한 또는 정제된 보툴리눔 독소(즉, 약 150 킬로달톤의 보툴리눔 독소 분자)로서 존재할 수 있다.
본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 재구성시 또는 주사시에 약 5 내지 7.3의 pH를 가질 수 있다.
본 발명은 보툴리눔 독소 타입 A를 포함하는 조성물을 사용하여 실시될 수 있다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 보툴리눔 독소 타입 B를 포함하는 조성물을 사용하여 상기한 방법을 실시할 수 있다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 본 방법은 보툴리눔 독소 세로타입 A, B, C1, D, E, F 및 G로 구성된 군으로부터 선택된 보툴리눔 독소 세로타입과 같은 다수의 보툴리눔 독소 세로타입을 포함하는 조성물을 사용하여 실시할 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 정제된 보툴리눔 독소가 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 변형 보툴리눔 독소가 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 상기한 방법에 사용되는 조성물은 근육내로 환자에 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 조성물은 피하로 및/또는 초내로 투여될 수 있다.
본 발명은 보툴리눔 독소 및 폴리비닐피롤리돈을 포함하는(또는 이들로 구성되는 또는 본질적으로 구성되는) 약제학적 조성물을 포함한다. 보툴리눔 독소는 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소이고 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A, B, C, D, E, F 및 G로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게, 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 타입 A이다. 약제학적 조성물 중에 존재하는 폴리비닐피롤리돈의 기능은 보툴리눔 독소를 안정화시키는 것이다.
본 발명은 또한 보툴리눔 독소, 및 약 100 유닛의 보툴리눔 독소당 약 5g 내지 약 20g의 폴리비닐피롤리돈을 포함하는(또는 이들로 구성되는 또는 본질적으로 구성되는) 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 보툴리눔 독소 -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제로 안정화되지 않음- 및 폴리비닐피롤리돈을 포함하며(또는 이들로 구성되며 또는 본질적으로 구성되며), 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적인 최대 효력의 약 40% 이상인 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 보툴리눔 독소 -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제로 안정화되지 않음- 및 폴리비닐피롤리돈을 포함하며(또는 이들로 구성되며 또는 본질적으로 구성되며), 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적인 최대 효력의 약 50% 이상인 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 보툴리눔 독소 -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제로 안정화되지 않음-, 폴리비닐피롤리돈 및 이당류를 포함하며(또는 이들로 구성되며 또는 본질적으로 구성되며), 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적인 최대 효력의 약 40% 이상인 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 보툴리눔 독소 -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제로 안정화되지 않음-, 폴리비닐피롤리돈 및 이당류를 포함하며(또는 이들로 구성되며 또는 본질적으로 구성되며), 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적인 최대 효력의 약 50% 이상인 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 보툴리눔 독소 -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제로 안정화되지 않음-, 폴리비닐피롤리돈 및 이당류를 포함하며(또는 이들로 구성되며 또는 본질적으로 구성되며), 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적인 최대 효력의 약 60% 이상인 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 보툴리눔 독소 -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제로 안정화되지 않음-, 폴리비닐피롤리돈 및 이당류를 포함하며(또는 이들로 구성되며 또는 본질적으로 구성되며), 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적인 최대 효력의 약 70% 이상인 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 보툴리눔 독소 -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제로 안정화되지 않음-, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리에틸렌글리콜을 포함하며(또는 이들로 구성되며 또는 본질적으로 구성되며), 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적인 최대 효력의 약 40% 이상인 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 보툴리눔 독소 -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제로 안정화되지 않음-, 제 1 단당류, 제 1 이당류, 제 1 삼당류 및 제 1 단당류를 환원시켜 제조된 제 1 알콜로 구성된 군으로부터 선택된 화합물, 폴리에틸렌글리콜, 제 2 단당류, 제 2 이당류, 제 2 삼당류, 금속, 제 2 알콜 및 아미노산로 구성된 군으로부터 선택된 화합물 -여기서, 상기 제 2 단당류, 제 2 이당류 및 제 2 삼당류는 각각 제 1 단당류, 제 1 이당류 및 제 1 삼당류와 상이함-을 포함하며(또는 이들로 구성되며 또는 본질적으로 구성되며), 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적인 최대 효력의 약 40% 이상인 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 보툴리눔 독소 -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제로 안정화되지 않음-, 폴리에틸렌 글리콜, 및 단당류, 이당류, 삼당류, 금속, 알콜 및 아미노산로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 포함하며(또는 이들로 구성되며 또는 본질적으로 구성되며), 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적인 최대 효력의 약 20% 이상인 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 보툴리눔 독소 -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제로 안정화되지 않음-, 폴리에틸렌 글리콜, 및 단당류, 이당류, 삼당류, 금속, 알콜 및 아미노산로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 포함하며(또는 이들로 구성되며 또는 본질적으로 구성되며), 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적인 최대 효력의 약 30% 이상인 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 보툴리눔 독소 -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제로 안정화되지 않음-, 폴리에틸렌 글리콜, 및 단당류, 이당류, 삼당류, 금속, 알콜 및 아미노산로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 포함하며(또는 이들로 구성되며 또는 본질적으로 구성되며), 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적인 최대 효력의 약 40% 이상인 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 보툴리눔 독소 -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제로 안정화되지 않음-, 폴리에틸렌 글리콜, 및 단당류, 이당류, 삼당류, 금속, 알콜 및 아미노산로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 포함하며(또는 이들로 구성되며 또는 본질적으로 구성되며), 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적인 최대 효력의 약 50% 이상인 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 보툴리눔 독소 -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제로 안정화되지 않음-, 폴리에틸렌 글리콜, 및 단당류, 이당류, 삼당류, 금속, 알콜 및 아미노산로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 포함하며(또는 이들로 구성되며 또는 본질적으로 구성되며), 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적인 최대 효력의 약 60% 이상인 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 보툴리눔 독소 -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제로 안정화되지 않음-, 폴리에틸렌 글리콜, 및 단당류, 이당류, 삼당류, 금속, 알콜 및 아미노산로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 포함하며(또는 이들로 구성되며 또는 본질적으로 구성되며), 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적인 최대 효력의 약 70% 이상인 약제학적 조성물을 포함한다.
상세한 설명
본 발명은 안정화된 클로스트리디움계 독소를 가지는 클로스트리디움계 독소 약제학적 조성물이, 클로스트리디움계 독소의 주요 안정화제로서 비-단백질 부형제를 사용하여 제조될 수 있다는 것을 알아낸 것에 기초한다.
클로스트리디움계 독소 약제학적 조성물에서 알부민 또는 젤라틴과 같은 단백질 부형제의 적합한 대체물질이 비-단백질 화합물일 수 있음을 알아내었다.
본 발명에 사용되는 비-단백질 부형제에 의해서, (1) 실험실 유리제품이나 용기의 표면과 같은 표면, 약제학적 조성물이 재구성되는 바이알, 및 약제학적 조성물을 주사하는 데 사용되는 주사기 안쪽 표면에 보툴리눔 독소가 부착되는 것(보통 "끈적거림"이라고 말함)을 감소시킴으로써, (보툴리눔 독소의 표면 부착은 보툴리눔 독소의 손실 및 남아있는 보툴리눔 독소의 변성을 가져올 수 있으며, 이는 모두 약제학적 조성물 중에 존재하는 보툴리눔의 독성을 감소시킨다); (2) 보툴리눔 독소의 변성 및/또는 보툴리눔 독소 복합체에 존재하는 다른 비-독성 단백질로부터의 보툴리눔 독소의 해리를 감소시킴으로써- 여기서, 변성 및/또는 해리는 약제학적 조성물(즉, 동결건조 또는 진공 건조) 및 재구성된 약제학적 조성물 중에 존재하는 보툴리눔 독소의 낮은 희석으로 인해 발생할 수 있음-; 그리고, (3) 약제학적 조성물의 제조, 가공 및 재구성 동안 나타나는 상당한 pH 및 농도 변화동안 보툴리눔 독소의 손실을 감소시킴으로써, 약제학적 조성물 중에 존재하는, 보툴리눔 독소와 같은, 신경독 활성 성분에 안정성이 부여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 비-단백질 안정화제에 의해서 제공되는 3가지 타입의 보툴리눔 독소 안정화가 약제학적 조성물의 주사 전에 고유한 독성을 가진 보툴리눔 독소를 보호 및 보존한다.
본 발명이 특정 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 다수의 보툴리눔 독소 세로타입을 포함할 수 있다. 다시 말해, 본 조성물은 둘 이상의 상이한 보툴리눔 독소 세로타입을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 보툴리눔 독소 t세로타입 A 및 B를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 보툴리눔 독소 세로타입 A 및 E를 포함할 수 있다. 보툴리눔 독소 세로타입의 조합을 사용하면 처치되는 질환에 기초하여 원하는 효과를 얻도록 조성물을 커스터마이징하는 것을 도울 수 있을 것이다. 본 발명의 추가적인 실시형태에서, 조성물은 변형 보툴리눔 독소를 포함할 수 있다. 변형 보툴리눔 독소는 바람직하게 뉴런으로부터의 신경전달물질 방출을 억제할 것이지만, 비변형 보툴리눔 독소보다 더 크거나 더 작은 효력을 가지거나, 또는 비변형 보툴리눔 독소보다 더 크거나 더 작은 생물학적 효과를 가질 수 있다. 본 발명의 조성물은 비교적 장기간의 동물 처치에 사용될 수 있기 때문에, 조성물은 비교적 순수한 형태로 제공될 수 있다. 일 실시형태에서, 조성물은 약제학적 등급(pharmaceutical grade)이다. 특정 실시형태에서, 클로스트리디움계 신경독은 95%를 초과하는 순도를 가진다. 추가적인 실시형태에서, 클로스트리디움계 신경독은 99%를 초과하는 순도를 가진다.
본 발명은 또한 희석물 또는 제형 그 자체에 방부제를 추가하여 연장된 저장을 가능하게 하는 것을 포함한다. 바람직한 방부제는 벤질 알콜을 포함하는 방부 염수(preserved saline)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 종래의 투여 모드를 사용하여 투여될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 조성물은 근육내 또는 피하로 대상에 주사된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 초내(intrathecally)로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 진통제 또는 마취제와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물을 위한 가장 효과적인 투여 모드 및 투여 계획은 처치될 질환의 종류, 위중도 및 추이, 동물의 건강상태 및 처치에 대한 반응, 및 담당의사의 판단에 따라 달라진다. 따라서, 조성물의 방법 및 투여량은 개별 대상에 따라 맞춰져야만 한다.
예로서, 이에 제한되지는 않지만, 본 발명의 조성물을 근육내로 투여하여 근육 경련을 감소시키는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 또한 다양한 질환을 처치하기 위한 보툴리눔 독소 및 콜라겐을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한며, 보툴리눔 독소는 근육을 마비시키는 작용을 하고 콜라겐은 피부 필러를 제공하는 작용을 한다.
다른 세로타입의 보툴리눔 독소를 포함하는 조성물은 상이한 투여량의 보툴리눔 독소를 포함할 것이다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 타입 B는 보툴리눔 독소 타입 A를 포함하는 조성물보다 더 큰 투여량으로 조성물 중에 제공될 수 있다. 본 발명에서 일 실시형태에서, 보툴리눔 독소 타입 B는 약 1 U/kg 내지 150 U/kg의 양으로 투여될 수 있다. 보툴리눔 독소 타입 B는 또한 20,000 U(마우스 유닛, 상기한 바와 같음) 이하의 양으로 투여될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 보툴리눔 독소 타입 E 또는 F는 약 0.1 U/kg 내지 150 U/kg의 농도로 투여될 수 있다. 또한, 한가지 이상의 타입의 보툴리눔 독소를 포함하는 조성물에서, 각각의 타입의 보툴리눔 독소는 전형적으로 단일 보툴리눔 독소 세로타입에 대해 사용되는 투여량보다 비교적 작은 양으로 제공될 수 있다. 보툴리눔 독소 세로타입들의 조합은 신경독의 확산을 증가시키지 않으면서 적합한 정도 및 지속시간이 마비를 제공할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 6,087,327 참조).
다음 실시예는 본 발명의 구체적인 실시형태를 나타내며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
하기 실시예에서 주지된 마우스 치사 투여량50 어세이(mouse lethal dose50 assay)("MLD50 어세이")를 사용하여 보툴리늄 독소 효력을 결정하였다. 상황에 따라, "효력"은 동결건조(lyophilization) 전 보툴리눔 독소의 효력 또는 보툴리눔 독소의 회복된(recovered) 효력을 의미할 수 있다. 회복된 효력은 재구성(reconstitution) 효력, 회복(recovery) 효력 및 재구성시의 효력과 동의어이다. MLD50 어세이는 그 마우스 50% 치사 투여량 또는 "LD50"의 관점에서 보툴리눔 독소의 효력을 결정하게 한다. 따라서, 보툴리눔 독소의 1 단위(U)는 어세이의 시작시 에 각각 17 내지 22 g으로 칭량되는 Swiss Webster 마우스 암컷 그룹의 50%(즉, LD50)를 복강내 주입시에 치사시키는 보툴리눔 독소의 양으로서 정의된다. MLD50 어세이는 재구성된 보툴리눔 독소 또는 재구성된 보툴리눔 독소 조성물의 효력을 측정하기 위한 확인된 방법이다. 각 마우스는 그 머리를 아래로 기울인, 반듯이 누운 위치로 유지되고, 일반 염수 중의 보툴리눔 독소의 수회 계열 희석물 중 하나와 함께 25 내지 27 게이지 3/8" 내지 5/8" 니들을 사용하여 약 30도의 각도로 오른쪽 하복부에 복강내 주입된다. 각 희석에 뒤따르는 72 시간에 걸쳐 사망률을 기록한다. 1.33 투여량 간격으로 최소 6 희석물이 제조되고, 일반적으로 10 마리가 각 용량 그룹에 사용된다(따라서, 60마리 마우스가 사용됨). 두마리의 기준 표준 어세이(reference standard assay)를 동시에 실시한다(추가 60 마리 마우스를 사용). 최대 농도 희석물로 주입된 마우스에서 80% 이상의 사망률이 얻어지며, 최소 농도 희석물로 주입된 마우스에서 20% 이하의 사망률이 얻어진다. 사망률이 단조로운 감소 범위에 속하는 최소 네개의 희석물이 존재해야 한다. 단조로운 감소 범위는 80% 이상의 사망률로 시작된다. 넷 이상의 단조로운 감소 범위 내에서, 2 개의 가장 큰 비율 및 2 개의 가장 작은 비율이 감소하고 있어야 한다(즉, 동등하지 않음). 주입 관찰 기간 후 3일 내에 마우스의 50%가 사망하는 희석물이 보툴리눔 독소의 1 단위(1 U)를 포함하는 희석물로서 정의된다. 1.15 투여량 간격의 더 적은(6 대신 5) 희석물 및 시험된 희석물 당 더 적은 마우스(10 대신 6)를 사용하는 개량된(refined) MLD50 어세이가 개발되었다.
실시예 1
사람 혈청 알부민(종래 기술)을 포함하는 보툴리눔 독소 약제학적 조성물
N-Z 아민 및 효모 추출물을 포함하는 배지 내에서 성장시킨 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)의 Hall 종 배양액으로부터 보툴리눔 독소 타입 A 복합체를 얻었다. 보툴리눔 독소 타입 A 복합체를 배양액으로부터 일련의 산침전에 의해 활성 고분자량 독소 단백질 및 관련 적혈구응집소(hemagglutinin) 단백질로 구성되는 결정질 복합체로 정제하였다. 이어서, 결정질 복합체를 염수 및 알부민을 포함하는 용액 내에 용해시키고, 진공-건조 전에 멸균 여과시켰다(0.2 미크론). 진공 건조된 조성물을 주입 전에 멸균, 비-방부(non-preserved) 염수로 재구성하였다. 진공 건조된 조성물의 각 바이알은 방부제 없이 멸균, 진공-건조된형태의 약 100 유닛(U)의 클로스트리디움 보툴리눔 독소 타입 A 복합체, 0.5 밀리그램의 사람 혈청 알부민 및 0.9 밀리그램의 염화나트륨을 포함한다. 이 약제학적 조성물은 주입 전 염수 재구성을 위해 100 유닛 바이알 내에 상표명 BOTOX® 하에 시판된다.
실시예 2
비-단백질 안정화된 보툴리눔 독소 조성물
하나 이상의 상이한 비-단백질 안정화 부형제(stabilizing excipient)를 사용하여 다중 보툴리눔 독소 조성물을 제조하기 위해 실험을 실시하였다. 각 조성물이 보툴리눔 독소 조성물 내에 존재하는 상이한 비-단백질 부형제 또는 부형제들을 사용하거나 또는 상이한 양의 비-단백질 부형제 또는 비-단백질 부형제들을 사용하 여 제조되는 것을 제외하고는, 모든 조성물이 동일한 방법으로 컴파운딩되고(compounded), 동결건조되고, 재구성되고 효력 평가되었고, 각 조성물 중에 동일한 타입의 보툴리눔 독소를 사용되었다.
이러한 실험에서 만들어진 조성물 중에 사용된(개별적으로 또는 조합하여) 비-단백질 부형제에는 다음이 포함된다: 폴리비닐피롤리돈(포비돈이라고도 함, 콜리돈 17(Kollidon 17) 등); 다양한 이당류(락토오스 및 트레할로오스(trehalose) 등); 삼당류(라피노오스 등); 다당류(이눌린(inulin) 등); 알콜(단당류[프럭토오스 등] 또는 만니톨 등을 환원시켜 제조된 알콜 등); 금속(아연 등); 아미노산(글리신 등), 및; 폴리에틸렌 글리콜(폴록사머 188 및/또는 PEG 3350 등). 단백질이 폴리아미노산이므로, 본 명세서에 기재된 조성물 내에 하나 이상의 단일아미노산을 사용하는 것은 이러한 조성물 내에 단백질 부형제를 제공하는 것이 아니었다.
이 실시예에 개시된 조성물은 먼저 지시된 양의 비-단백질 부형제(들)를 주입용 멸균수에 첨가하여 용액을 형성함으로써 제조되었다. 이어서, 100 내지 200 단위의 보툴리눔 독소 타입 A 복합체(클로스트리디움 보툴리눔의 Hall 종의 혐기 발효 후 발효 배지 내에 방출되고 이로부터 제거된 보툴리눔 독소를 정제함으로써 얻어짐. 예를 들어 실시예 1 및 문헌(Schantz E.J. et al., Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine, Microbiol Rev 1992 Mar; 56(1): 80-99) 참조)를 용액에 첨가함으로써 보툴리눔 독소 조성물을 형성하였고, 이는 동의어로 보툴리눔 독소 약제학적 조성물로서, 또는 단순히 조성물로서 언급될 수 있다. 사용된 보툴리눔 독소의 동결건조 전 효력은 용액에 보툴리 눔 독소를 첨가하기 전의 마우스 LD50 어세이로 결정하였고, 약 100 유닛 내지 약 200 유닛이었다.
이어서, 조성물을 동결건조(lyophilized)(또는 동결 건조(freeze dried) 또는 진공 건조)한 후 일반 염수로 재구성하였다. 재구성된 조성물 내에 존재하는 보툴리눔 독소의 회복된 효력을 동일한 마우스 LD50 어세이를 적용함으로써 결정하였다.
표 1 내지 5의 "% 회복"은 조성물의 동결건조 전 보툴리눔 독소의 효력의 %로서 나타낸 재구성 후의 보툴리눔 독소의 효력(따라서 "회복된 효력")이다. 따라서, 예를 들어 60%의 % 회복은 재구성 후의 보툴리눔 독소의 효력이 동결건조 전의 보툴리눔 독소의 효력의 60% 였다는 것을 의미한다. 최대 이론적 회복된 효력은 100%이다. % 회복 값은 조성물이 동결건조된 후 바로 재구성함으로써 얻어졌다.
표 1 내지 6은 조성물이 상기된 대로 제조된, 이 실시예에서 실시된 실험의 결과를 나타낸다.
단일 비-단백질 부형제를 가지며 회복된 효력이 없는 보툴리눔 독소 제제
부형제 양(mg) % 회복
1. 콜리돈 17 0.5 0
2. 콜리돈 17 50 0
3. 콜리돈 17 100 0
4. 콜리돈 17 250 0
5. 락토오스 5 0
6. 수크로오스 5 0
7. 수크로오스 10 0
8. 수크로오스 50 0
9. 수크로오스 100 0
10. 수크로오스 250 0
11. 글리신 5 0
12. 글리신 10 0
13. 글리신 50 0
14. ZnCl 0.1 0
15. ZnCl 0.01 0
16. ZnCl 0.001 0
17. 만니톨 5 0
18. 만니톨 10 0
19. 만니톨 50 0
20. 이눌린 5 0
21. 이눌린 10 0
22. 이눌린 50 0
23. 트레할로오스 5 0
24. 트레할로오스 10 0
25. 트레할로오스 50 0
26. 라피노오스 5 0
27. 라피노오스 10 0
28. 라피노오스 50 0
29. PEG 3350 50 0
30. 폴록사머 188 50 0
단일 비-단백질 부형제를 가지며 회복된 효력이 있는 보툴리눔 독소 제제
부형제 양(mg) % 회복
1. 콜리돈 17 5 48
2. 콜리돈 17 10 52
3. 콜리돈 17 20 39
4. 락토오스 10 15
5. 락토오스 50 35
단일 비-단백질 부형제를 가지며 회복된 효력이 없는 보툴리눔 독소 제제
부형제 1 부형제 2 양 1(mg) 양 2(mg) %회복
1. 콜리돈 17 락토오스 0.5 0.5 0
2. 콜리돈 17 락토오스 50 0.5 0
3. 콜리돈 17 락토오스 100 5 0
4. 콜리돈 17 수크로오스 0.5 0.5 0
5. 콜리돈 17 수크로오스 50 0.5 0
6. 콜리돈 17 수크로오스 0.5 5 0
7. 콜리돈 17 수크로오스 100 5 0
8. 수크로오스 ZnCl 50 0.000005 0
9. 만니톨 ZnCl 50 0.000005 0
10. 만니톨 PEG 3350 5 50 0
11. 만니톨 수크로오스 50 5 0
12. 만니톨 수크로오스 5 50 0
13. 만니톨 ZnCl 50 1 0
14. 만니톨 ZnCl 50 0.1 0
15. 만니톨 ZnCl 5 1 0
16. 만니톨 트레할로오스 50 50 0
17. 만니톨 트레할로오스 50 5 0
18. 만니톨 트레할로오스 5 50 0
19. 수크로오스 글리신 50 50 0
20. 수크로오스 글리신 50 5 0
21. 수크로오스 글리신 5 50 0
22. 수크로오스 ZnCl 50 1 0
23. 수크로오스 ZnCl 50 0.1 0
24. 수크로오스 ZnCl 5 1 0
25. 수크로오스 트레할로오스 50 50 0
26. 수크로오스 트레할로오스 50 5 0
27. 수크로오스 트레할로오스 5 50 0
28. ZnCl 글리신 1 50 0
29. ZnCl 글리신 1 5 0
30. ZnCl 글리신 0.1 50 0
31. 폴록사머 188 ZnCl 50 1 0
32. 폴록사머 188 ZnCl 5 1 0
33. 트레할로오스 ZnCl 50 1 0
34. 트레할로오스 ZnCl 5 1 0
35. 트레할로오스 ZnCl 50 0.1 0
36. PEG 3350 ZnCl 50 1 0
37. PEG 3350 ZnCl 50 0.1 0
38. 폴록사머 188 글리신 5 50 0
39. 폴록사머 188 PEG 3350 50 50 0
40. 폴록사머 188 PEG 3350 50 5 0
41. 폴록사머 188 PEG 3350 5 50 0
42. 트레할로오스 글리신 50 50 0
43. 트레할로오스 글리신 50 5 0
44. 트레할로오스 글리신 5 50 0
45. 트레할로오스 PEG 3350 50 50 0
46. PEG 3350 글리신 50 50 0
47. PEG 3350 글리신 50 5 0
48. PEG 3350 글리신 5 50 0
단일 비-단백질 부형제를 가지며 회복된 효력이 있는 보툴리눔 독소 제제
부형제 1 부형제 2 양 1(mg) 양 2(mg) %회복
1. 콜리돈 17 락토오스 5 0.5 65
2. 콜리돈 17 락토오스 10 0.5 47
3. 콜리돈 17 락토오스 20 0.5 65
4. 콜리돈 17 락토오스 0.5 5 52
5. 콜리돈 17 락토오스 5 5 57
6. 콜리돈 17 락토오스 10 5 65
7. 콜리돈 17 락토오스 20 5 49
8. 콜리돈 17 락토오스 50 5 52
9. 콜리돈 17 수크로오스 5 0.5 58
10. 콜리돈 17 수크로오스 10 0.5 46
11. 콜리돈 17 수크로오스 20 0.5 49
12. 콜리돈 17 수크로오스 5 5 49
13. 콜리돈 17 수크로오스 10 5 58
14. 콜리돈 17 수크로오스 20 5 47
15. 콜리돈 17 수크로오스 50 5 39
16. 콜리돈 17 수크로오스 250 250 39
17. 콜리돈 17 수크로오스 10 250 58
18. 콜리돈 17 PEG 3350 50 50 35
19. 락토오스 PEG 3350 50 50 53
20. 락토오스 수크로오스 50 50 27
21. 락토오스 ZnCl 50 0.000005 19
22. 락토오스 만니톨 50 50 23
23. 수크로오스 만니톨 50 50 24
24. 만니톨 PEG 3350 50 50 26
25. 만니톨 PEG 3350 50 5 30
26. 만니톨 수크로오스 50 50 29
27. 만니톨 폴록사머 188 50 50 33
28. 만니톨 폴록사머 188 50 5 35
29. 만니톨 폴록사머 188 5 50 30
30. 수크로오스 폴록사머 188 50 50 59
31. 수크로오스 폴록사머 188 50 5 43
32. 수크로오스 폴록사머 188 5 50 55
33. 수크로오스 PEG 3350 50 50 44
34. 수크로오스 PEG 3350 50 5 41
35. 수크로오스 PEG 3350 5 50 35
36. 폴록사머 188 ZnCl 50 0.1 38
37. PEG 3350 ZnCl 5 1 23
38. 폴록사머 188 글리신 50 50 26
39. 폴록사머 188 글리신 50 5 33
40. 폴록사머 188 트레할로오스 50 50 53
41. 폴록사머 188 트레할로오스 50 5 75
42. 폴록사머 188 트레할로오스 5 50 50
43. 트레할로오스 PEG 3350 50 5 41
44. 트레할로오스 PEG 3350 5 50 36
표 5는 두 비-단백질 부형제를 포함하고 특정된 완충제가 있거나 없는 보툴리눔 독소 조성물을 사용한 실험의 결과를 나타낸다. 보툴리눔 독소의 효력을 측정하였다: (1) 동결건조 및 즉각적인 재구성("초기 효력") 후, 및; (2) 동결건조, 두 상이한 저장 조건(-40 ℃에서 또는 20 ℃에서) 중 하나 하에서 3개월동안 저장 및 재구성 후.
표 5의 결과는, PVP 비-단백질 부형제를 포함하는 보툴리눔 독소 약제학적 조성물은 시트레이트 완충제과 함께 조성되지 않으면 큰 실온 안정성을 갖지 않는다는 것을 나타낸다. 본 발명자는 동일한 pH에서조차 포스페이트 완충제는 이러한 조성물에 대해 원하는 실온 안정성을 제공하지 않을 것임을 밝혀냈다.
두가지 비-단백질 부형제를 가지는 보툴리눔 독소 제제
비-단백질 부형제 효력 (초기) 효력(냉동고에서3개월) 효력(실온에서 3개월)
20mg 수크로오스 10mg 폴록사머 101% 117% 87%
20mg 수크로오스 10mg 폴록사머 10mM 시트레이트 (pH 5.5) 77% 81% 81%
20mg 수크로오스 10mg 폴록사머 10mM 포스페이트 (pH 5.5) 112% 113% 113%
20mg 수크로오스 10mg 폴록사머 10mM 시트레이트 (pH 6.5) 90% 얻어지지 않음 91%
20mg 수크로오스 10mg 폴록사머 10mM 포스페이트 (pH 6.5) 95% 119% 88%
20mg PVP 10mg 폴록사머 71% 101% <39%
20mg PVP 10mg 폴록사머 10mM 시트레이트 (pH 5.5) 65% 101% 65%
20mg PVP 10mg 폴록사머 10mM 포스페이트 (pH 5.5) 71% 79% <39%
20mg PVP 10mg 폴록사머 10mM 시트레이트 (pH 6.5) 87% 97% <39%
20mg PVP 10mg 폴록사머 10mM 포스페이트 (pH 6.5) 65% 63% <39%
표 6은 세가지 비-단백질 부형제를 포함하고 특정된 완충제가 있거나 없는 보툴리눔 독소 조성물을 사용한 실험의 결과를 나타낸다. 보툴리눔 독소의 효력은 동결건조에 이어 즉각적 재구성 후에 측정되었다("초기 효력").
표 6의 결과는 동일한 조성물 내에 존재하는 세가지 비-단백질 부형제를 사용함으로써 보툴리눔 독소 약제학적 조성물이 안정화될 수 있다는 것과, 조성물 내에 조성물 중의 시트레이트 완충제를 사용하는 것이 초기 효력을 증진시킨다는 것을 보여준다. 다른 세가지 상이한 비-단백질 부형제로 안정화되고 상당한 회복된 효력을 갖는 보툴리눔 독소 약제학적 조성물도 제조되었다.
3가지 비-단백질 부형제를 가지는 보툴리눔 독소 제제
비-단백질 부형제 효력(초기)
20mg 수크로오스 20mg PVP 20mg 폴록사머 67%
20mg 수크로오스 20mg PVP 20mg 폴록사머 10mM 시트레이트 (pH 5.5) 98%
이러한 실험으로 알아낸 것들 가운데에는 다음의 것들이 있었다:
1. 폴리비닐피롤리돈(콜리돈 17 등)인 특정 농도의 단일 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 회복된 효력을 보이지 않을 수 있다(표 1의 1 내지 4행 참조).
2. 폴리비닐피롤리돈(콜리돈 17 등)인 상이한 특정 농도의 단일 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 39% 내지 52%의 회복된 효력을 보일 수 있다(표 2의 1 내지 3행 참조). 상기 1.의 관점에서, 이는 놀랍고 예상치 못한 발견이다.
3. 비-단백질 부형제 중 하나가 폴리비닐피롤리돈(콜리돈 17 등)인 두 상이한 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 회복된 효력을 보이지 않을 수 있다(표 3의 1 내지 7행 참조).
4. 비-단백질 부형제 중 하나가 폴리비닐피롤리돈(콜리돈 17 등)인 두 상이한 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 65%만큼 높은 회복된 효력을 보일 수 있다(표 4의 1 내지 18행 참조). 상기 1. 및 3.의 관점에서, 이는 놀랍고 예상치 못한 발견이다.
5. 이당류(락토오스 등)인 특정 농도의 단일 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 회복된 효력을 보이지 않을 수 있다(표 1의 5행 참조).
6. 이당류(락토오스 등)인 상이한 특정 농도의 단일 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 15% 내지 35%의 회복된 효력을 보일 수 있다(표 2의 4 내지 5행 참조). 상기 5.의 관점에서, 이는 놀랍고 예상치 못한 발견이다.
7. 비-단백질 부형제 중 하나가 이당류(락토오스 등)인 두 상이한 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 회복된 효력을 보이지 않을 수 있다(표 3의 1 내지 3행 참조).
8. 비-단백질 부형제 중 하나가 이당류(락토오스 등)인 두 상이한 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 65%만큼 높은 회복된 효력을 보일 수 있다(표 4의 1 내지 8행 및 19행 내지 22행 참조). 상기 5. 및 7.의 관점에서, 이는 놀랍고 예상치 못한 발견이다.
9. 이당류(수크로오스 등)인 단일 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 회복된 효력을 보이지 않을 수 있다(표 1의 6 내지 10행 참조).
10. 비-단백질 부형제 중 하나가 이당류(수크로오스 등)인 두 상이한 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 회복된 효력을 보이지 않을 수 있다(표 3의 4 내지 8행, 11 내지 12행 및 19행 내지 27행 참조).
11. 비-단백질 부형제 중 하나가 이당류(수크로오스 등)인 두 상이한 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 59%만큼 높은 회복된 효력을 보일 수 있다(표 4의 9 내지 17행, 20행, 23행, 26행 및 30 내지 35행 참조). 상기 9. 의 관점에서, 이는 놀랍고 예상치 못한 발견이다.
12. 아미노산(글리신 등)인 단일 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 회복된 효력을 보이지 않을 수 있다(표 1의 11 내지 13행 참조).
13. 비-단백질 부형제 중 하나가 아미노산(글리신 등)인 두 상이한 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 회복된 효력을 보이지 않을 수 있다(표 3의 19 내지 21행, 28 내지 30행, 38행, 42 내지 44행 및 46행 내지 48행 참조).
14. 비-단백질 부형제 중 하나가 아미노산(글리신 등)인 상이한 특정 농도의 두 상이한 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 33%만큼 높은 회복된 효력을 보일 수 있다(표 4의 38 내지 39행 참조). 상기 12-13.의 관점에서, 이는 놀랍고 예상치 못한 발견이다.
15. 금속(아연 등)인 단일 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 회복된 효력을 보이지 않을 수 있다(표 1의 14 내지 16행 참조).
16. 비-단백질 부형제 중 하나가 금속(아연 등)인 두 상이한 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 회복된 효력을 보이지 않을 수 있다(표 3의 8 내지 9행, 13 내지 15행, 22 내지 24행, 및 28 내지 37행 참조).
17. 비-단백질 부형제 중 하나가 금속(아연 등)인 상이한 특정 농도의 두 상이한 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 38%만큼 높은 회복된 효력을 보일 수 있다(표 4의 21행 및 36 내지 37행 참조). 상기 15-16.의 관점에서, 이는 놀랍고 예상치 못한 발견이다.
18. 금속(아연 등)인 단일 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 회복된 효력을 보이지 않을 수 있다(표 1의 17 내지 19행 참조).
19. 비-단백질 부형제 중 하나가 알콜(만니톨 등)인 두 상이한 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 회복된 효력을 보이지 않을 수 있다(표 3의 9 내지 18행 참조).
20. 비-단백질 부형제 중 하나가 알콜(만니톨 등)인 상이한 특정 농도의 두 상이한 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 35%만큼 높은 회복된 효력을 보일 수 있다(표 4의 22행 및 29행 참조). 상기 17-18.의 관점에서, 이는 놀랍고 예상치 못한 발견이다.
21. 이당류(트레할로오스 등)인 단일 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 회복된 효력을 보이지 않을 수 있다(표 1의 23 내지 25행 참조).
22. 비-단백질 부형제 중 하나가 이당류(트레할로오스 등)인 두 상이한 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 회복된 효력을 보이지 않을 수 있다(표 3의 16 내지 18행, 25 내지 27행, 33 내지 35행 및 42 내지 45행 참조).
23. 비-단백질 부형제 중 하나가 이당류(트레할로오스 등)인 상이한 특정 농도의 두 상이한 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 75%만큼 높은 회복된 효력을 보일 수 있다(표 4의 40 내지 44행 참조). 상기 21-22.의 관점에서, 이는 놀랍고 예상치 못한 발견이다.
24. 폴리에틸렌 글리콜(PEG 3350 또는 폴록사머 188 등)인 단일 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 회복된 효력을 보이지 않을 수 있다(표 1의 29 내지 30행 참조).
25. 비-단백질 부형제 중 하나가 폴리에틸렌 글리콜(PEG 3350 또는 폴록사머 188 등)인 두 상이한 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 회복된 효력을 보이지 않을 수 있다(표 3의 10행, 31 내지 32행, 36 내지 41행 및 45 내지 48행 참조).
26. 비-단백질 부형제 중 하나가 폴리에틸렌 글리콜(PEG 3350 또는 폴록사머 188 등)인 상이한 특정 농도의 두 상이한 비-단백질 부형제로 제조된 보툴리눔 독소 조성물은 75%만큼 높은 회복된 효력을 보일 수 있다(표 4의 18 내지 19행, 24 내지 25행, 27 내지 44행 참조). 상기 24-25.의 관점에서, 이는 놀랍고 예상치 못한 발견이다.
27. 비-단백질 안정화제 락토오스 및 폴리비닐피롤리돈("PVP")(즉 콜리돈 17)은 각각 보툴리눔 독소 약제학적 조성물 중에 존재하는 보툴리눔 독소의 비-단백질 안정화제로서 사용될 때 상당한 회복 효력을 제공하였다(표 2 참조).
28. 사용된 락토오스 및 PVP가 모두 동일한 보툴리눔 독소 약제학적 조성물의 비-단백질 안정화제로서 사용되었을 때, 사용된 락토오스 및 PVP가 개별적으로 비-단백질 안정화제로서 사용되었을 때 관찰된 회복 효력에 비해 회복 효력이 개선되었다(예를 들어, 표 4, 1 내지 8 행 참조).
29. 락토오스 및/또는 PVP가 상기된 하나 이상의 다른 비-단백질 부형제와 함께 사용되었을 때 (재구성된 보툴리눔 독소 약제학적 조성물에 존재하는 보툴리눔 독소의) 회복 효력이 개선되었다(표 4, 19 내지 22행 및 표 4, 9 내지 18행을 각각 참조).
30. (재구성된 보툴리눔 독소 약제학적 조성물에 존재하는 보툴리눔 독소의 비-단백질 안정화제로서) 부형제의 특정 조합물을 사용하는 것은, 어느 한 이러한 비단백질 부형제가 보툴리눔 독소 약제학적 조성물 중에 존재하는 보툴리눔 독소의 비-단백질 안정화제로서 단독으로 사용되었을 때 회복 효력이 얻어지지 않았던 경우에도 상당한 회복 효력을 제공하였다. 예를 들어, (1) 표 1, 1 내지 4행 및 표 1, 6 내지 10행과 표 4, 9 내지 17행; (2) 표 1, 23 내지 25행 및 표 1, 29행과 표 4, 43 내지 44행을 비교한다.
31. 회복 효력은 보툴리눔 독소 약제학적 조성물 내에 존재하는 비-단백질 안정화제의 농도에 다소 좌우되었다.
32. 완충제를 첨가하여 회복 효력 및 저장 안정성을 개선할 수 있었다. 개별 완충제는 이 효과를 발휘하기 위한 완충제의 능력이 상이했다. 완충제는 최적 pH를 얻고, 최적 pH를 유지하고, 경우에 따라(예를 들어, 시트레이트) 산화에 대해 보호하도록 작용한다.
이러한 실험으로부터의 일반적인 결론은 다음의 관찰결과를 포함한다:
(a) 보툴리눔 독소 약제학적 조성물 중에 존재하는 보툴리눔 독소는 조성물을 둘 이상의 일반적인 비-단백질 부형제와 함께 조성함으로써 안정화될 수 있다(그리고 우수한 회복 효력으로 알 수 있다).
(b) 폴리비닐피롤리돈(콜리돈 17 등) 및 이당류(락토오스 등)는 어떤 다른 비-단백질 안정화제가 존재하지 않는 보툴리눔 독소 조성물 내에서 비-단백질 안정화제(부형제)로서 작용할 수 있다.
(c) 동일한 비-단백질 안정화제 또는 안정화제들을 사용하면, 회복된 효력은 보툴리눔 독소 조성물 중에 사용된 비-단백질 안정화제 또는 안정화제들의 농도 및/또는 비율에 좌우될 수 있다.
(d) 특정한 비-단백질 안정화제(폴리비닐피롤리돈[콜리돈 17 등] 및 이당류[락토오스 등] 등)는, 재구성된 조성물의 더 고도의 회복된 효력에 의해 결정되는 바와 같이, 함께 사용되는 경우에 보툴리눔 독소 조성물 중에서 보툴리눔 독소를 안정화하도록 작용할 뿐 아니라 함께 사용되는 경우에 안정화 증진을 제공할 수 있다.
(e) 공통적으로 사용된 약제학적 부형제(폴리비닐피롤리돈, 락토오스, 수크로오스 등)는 안정화제로서 사용될 때 작용하지 않았고, 또는 특정 농도로 사용될 때 비-단백질 보툴리눔 독소 조성물, 폴리비닐피롤리돈(콜리돈 17 등) 및 이당류(락토오스 등) 중에서 보툴리눔 독소의 안정화제로서 단지 작용하였다.
(f) 많은 부형제가 폴리비닐피롤리돈(콜리돈 17 등)과 또는 이당류(락토오스 등)와 조합될 때 비-단백질 보툴리눔 독소 조성물 중에서 보툴리눔 독소의 더 우수한 안정화제로서 작용하였다.
(g) 특정 PVP "콜리돈 17"이 사용되었으나, 다른 PVP로 제조된 다수의 보툴리눔 독소 조성물이 본 발명의 범주 내에 속한다.
(h) 특정 폴록사머 "폴리옥사머 188"가 사용되었으나, 다른 폴록사머로 제조된 다수의 보툴리눔 독소 조성물이 본 발명의 범주 내에 속한다.
(i) 계면활성제 폴리소르베이트(Tween)가 유사한 결과와 함께 폴록사머 188 대신 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 범위 내의 보툴리눔 독소 약제학적 조성물에 사용가능한 다른 비-단백질 부형제에는 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT) 및 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA)과 같은 항산화제 및 시스테인 및 메티오닌과 같은 아미노산이 포함된다. 동결건조된 보툴리눔 독소 조성물은 재구성 또는 주입 후 성능에 영향을 주기 위해 염수, 물과 함께 또는 통상의 희석제와 함께 재구성될 수 있다.
실시예 3
보툴리눔 독소 약제학적 조성물의 사용
48세 남성이 경부 디스토니아(cervical dystonia)과 같은 근육 경직 상태(spastic muscle condition)로 진단받는다. 락토오스 및 PVP를 포함하는 조성의 약 10-3 U/kg 내지 약 35 U/kg의 보툴리눔 독소 타입 A 약제학적 조성물을 환자에게 근육내 주입한다. 1 내지 7일 내에 경축근 상태의 증상이 완화되고 증상 완화가 적어도 약 2개월 내지 약 6개월동안 지속된다.
본 명세서에 개시된 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 많은 장점을 가지며, 다음의 것들이 포함된다:
1. 약제학적 조성물은 알부민과 같은 어떤 혈액 제품이 없이, 그리고 따라서 프라이온(prion)과 같은 어떤 혈액 제품 감염 요소가 없이 제조될 수 있다.
2. 약제학적 조성물은 현재 이용가능한 약제학적 조성물로 얻어지는 것과 유사하거나 더 우수한 독소 효력의 고도의 % 회복 및 안정성을 갖는다.
3. 근육내 또는 정맥내 투여에 의해 평가될 때, 감소된 독성.
4. 감소된 항원성(antigenicity).
다양한 공개문헌, 특허 및/또는 참조문헌이 본 명세서에 인용되었으며, 그 내용은 본 명세서에 그 전체가 참조 병합되어 있다.
본 발명이 특정 바람직한 방법과 관련하여 상세히 기재되어 있다 할지라도, 본 발명의 범위 내에서 다른 실시형태, 변형 및 변화가 가능하다. 예를 들어, 다양한 안정화 다당류 및 아미노산이 본 발명의 범위 내에 있다.
따라서, 이하 특허청구범위의 정신 및 범위는 상기된 바람직한 실시형태의 상세한설명으로 제한되지 않아야 한다.

Claims (26)

  1. (a) 보툴리눔 독소, 및;
    (b) 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 약제학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소가 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소인 약제학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소가 보툴리눔 독소 타입 A, B, C, D, E, F 및 G로 구성된 그룹에서 선택되는 약제학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소가 보툴리눔 독소 타입 A인 약제학적 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리비닐피롤리돈의 기능이 상기 보툴리눔 독소를 안정화시키는 것인 약제학적 조성물.
  6. (a) 보툴리눔 독소, 및;
    (b) 약 100 유닛의 보툴리눔 독소 당 약 5g 내지 약 20g의 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 약제학적 조성물.
  7. (a) 보툴리눔 독소, 및;
    (b) 폴리비닐피롤리돈을 포함하며, 상기 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적 최대 효력의 적어도 약 40%인 약제학적 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소가 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소인 약제학적 조성물.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소가 보툴리눔 독소 타입 A, B, C, D, E, F 및 G로 구성된 그룹에서 선택되는 약제학적 조성물.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소가 보툴리눔 독소 타입 A인 약제학적 조성물.
  11. 제 7 항에 있어서, 상기 폴리비닐피롤리돈의 기능이 상기 보툴리눔 독소를 안정화시키는 것인 약제학적 조성물.
  12. (a) 보툴리눔 독소, -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제에 의해서 안정화되지 않음- 및;
    (b) 폴리비닐피롤리돈을 포함하며, 상기 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적 최대 효력의 적어도 약 50%인 약제학적 조성물.
  13. (a) 보툴리눔 독소, -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제에 의해서 안정화되지 않음-;
    (b) 폴리비닐피롤리돈, 및;
    (c) 이당류를 포함하며, 상기 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적 최대 효력의 적어도 약 40%인 약제학적 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소가 보툴리눔 독소 타입 A, B, C, D, E, F 및 G로 구성된 그룹에서 선택되는 약제학적 조성물.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소가 보툴리눔 독소 타입 A인 약제학적 조성물.
  16. (a) 보툴리눔 독소, -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제에 의해서 안정화되지 않음-;
    (b) 폴리비닐피롤리돈, 및;
    (c) 이당류를 포함하며, 상기 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적 최대 효력의 적어도 약 50%인 약제학적 조성물.
  17. (a) 보툴리눔 독소, -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제에 의해서 안정화되지 않음-;
    (b) 폴리비닐피롤리돈, 및;
    (c) 이당류를 포함하며, 상기 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적 최대 효력의 적어도 약 60%인 약제학적 조성물.
  18. (a) 보툴리눔 독소, -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제에 의해서 안정화되지 않음-;
    (b) 폴리비닐피롤리돈, 및;
    (c) 이당류를 포함하며, 상기 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적 최대 효력의 적어도 약 70%인 약제학적 조성물.
  19. (a) 보툴리눔 독소, -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제에 의해서 안정화되지 않음-;
    (b) 폴리비닐피롤리돈, 및;
    (c) 폴리에틸렌 글리콜을 포함하며, 상기 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적 최대 효력의 적어도 약 40%인 약제학적 조성물.
  20. (a) 보툴리눔 독소, -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제에 의해서 안정화되지 않음-;
    (b) 제 1 단당류, 제 1 이당류, 제 1 삼당류 및 제 1 단당류를 환원시켜 제조된 제 1 알콜로 구성된 군으로부터 선택된 화합물, 및;
    (c) 폴리에틸렌글리콜, 제 2 단당류, 제 2 이당류, 제 2 삼당류, 금속, 제 2 알콜 및 아미노산로 구성된 군으로부터 선택된 화합물 -여기서, 상기 제 2 단당류, 제 2 이당류 및 제 2 삼당류는 각각 제 1 단당류, 제 1 이당류 및 제 1 삼당류와 상이함-을 포함하며, 상기 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적 최대 효력의 적어도 약 40%인 약제학적 조성물
  21. (a) 보툴리눔 독소, -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제에 의해서 안정화되지 않음-;
    (b) 폴리에틸렌 글리콜, 및;
    (c) 단당류, 이당류, 삼당류, 금속, 알콜 및 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 포함하며, 상기 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적 최대 효력의 적어도 약 20%인 약제학적 조성물.
  22. (a) 보툴리눔 독소, -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제에 의해서 안정화되지 않음-;
    (b) 폴리에틸렌 글리콜, 및;
    (c) 단당류, 이당류, 삼당류, 금속, 알콜 및 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 포함하며, 상기 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론 적 최대 효력의 적어도 약 30%인 약제학적 조성물.
  23. (a) 보툴리눔 독소, -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제에 의해서 안정화되지 않음-;
    (b) 폴리에틸렌 글리콜, 및;
    (c) 단당류, 이당류, 삼당류, 금속, 알콜 및 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 포함하며, 상기 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적 최대 효력의 적어도 약 40%인 약제학적 조성물.
  24. (a) 보툴리눔 독소, -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제에 의해서 안정화되지 않음-;
    (b) 폴리에틸렌 글리콜, 및;
    (c) 단당류, 이당류, 삼당류, 금속, 알콜 및 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 포함하며, 상기 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적 최대 효력의 적어도 약 50%인 약제학적 조성물.
  25. (a) 보툴리눔 독소, -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제에 의해서 안정화되지 않음-;
    (b) 폴리에틸렌 글리콜, 및;
    (c) 단당류, 이당류, 삼당류, 금속, 알콜 및 아미노산으로 구성된 군으로부 터 선택된 화합물을 포함하며, 상기 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적 최대 효력의 적어도 약 60%인 약제학적 조성물.
  26. (a) 보툴리눔 독소, -여기서, 보툴리눔 독소는 단백질 부형제에 의해서 안정화되지 않음-;
    (b) 폴리에틸렌 글리콜, 및;
    (c) 단당류, 이당류, 삼당류, 금속, 알콜 및 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 포함하며, 상기 보툴리눔 독소의 효력이 보툴리눔 독소의 이론적 최대 효력의 적어도 약 70%인 약제학적 조성물.
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