KR20080043891A

KR20080043891A - 생균 백신

Info

Publication number: KR20080043891A
Application number: KR1020087010816A
Authority: KR
Inventors: 헤르만 카팅거; 안드레 에고로브; 보리스 페르코; 줄리아 로마노바; 디에트마르 카팅거
Original assignee: 폴리문 사이언티픽 임무노이비오로기쉐 포르슝 게엠베하
Priority date: 2000-09-25
Filing date: 2001-09-25
Publication date: 2008-05-19
Also published as: US7494659B2; EP1358319B1; JP2004509903A; DE60139026D1; JP5063852B2; WO2002024876A3; US20040137013A1; EP1358319A2; AU2002223560B2; KR20030061810A; ES2327103T3; AU2356002A; CN1582333B; WO2002024876A2; DK1358319T3; CA2423038C; CA2423038A1; ATE434035T1; CN1582333A; KR100927517B1

Abstract

본 발명은 적응 선별(selective selection)에 기인한 바이러스 표면 항원에서 변형이 최소화 또는 완전히 예방되는 조건하에, 다양한 출처로부터 바이러스를 분리하고 혈청-없음 Vero 세포 배양액에서 약독화된 인플루엔자 생균 백신을 생산하는 간편하고 효율적인 공정에 관한다. 상기 공정은 세포 배양액으로부터 회수된 바이러스-함유 상층액의 정제 및 HA 활성화를 위한 바이러스의 배양후 처리를 필요로 하지 않는다. 또한, 본 발명은 인플루엔자 A와 B 마스터 균주 후보 및 이로부터 만들어진 백신에 관한다.

Description

생균 백신{LIVE VACCINE}

본 발명은 바이러스학과 백신 개발 분야, 구체적으로는 바이러스 백신, 바람직하게는 약독화된 생균 백신의 향상된 제조 방법으로 수득된 백신에 관한다

인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 항원은 바이러스에 대한 숙주의 보호성 면역 반응의 주요 표적이다.

새로운 바이러스 분리물을 회수하는 과정에는 공통적으로 비강이나 인후 면봉 또는 유사한 출처로부터 회수 및 이후 자충포장(embryonated) 계란에서 분리물의 배양이 포함된다. 바이러스는 난(egg) 숙주에 적응하게 되고 바이러스의 대규모 생산이 난에서 실행될 수 있다. 하지만, 인플루엔자 백신을 생산하기 위하여 자충포장 계란을 이용하는 이런 전통적인 방법은 매주 수천개 난의 취급 및 난 단백질의 완전한 부재를 담보하기 위한 요막 유체로부터 유래된 바이러스 현탁액의 광범위한 정제를 비롯하여 극히 부담스럽다.

바이러스 생산에서 계란 이용의 다른 단점은 이런 기질이 예로써 면역원성의 현저한 감소를 비롯한 변형된 표현형으로 인하여, 항원 특이성의 측면에서 야생형 바이러스와 상이한 바이러스 변이체의 선별에는 상당히 유리하지만 백신 생산에 적 합하지 않은 바이러스를 빈번하게 초래한다는 점이다.

따라서, 당분야에는 바이러스 생산, 특히 인플루엔자 바이러스 생산을 위하여 확립된 포유동물 세포주, 예를 들면 MDCK(madin-Darby Canine Kidney) 또는 Vero(African Green Monkey Kidney) 세포를 이용하는 표준 조직 배양 기술을 활용하려는 다양한 시도가 있어 왔다.

조직 세포 배양액에서 인플루엔자 균주를 성장시키는 경우에 어려움중 한가지는 숙주 세포에서 인플루엔자 헤마글루티닌의 단백분해 절단의 필요성에 기인한다. 바이러스 HA 전구물질의 HA1과 HA2 하위단편으로의 절단은 바이러스 구성요소의 비리온으로의 조합에는 필요하지 않지만 비리온이 감염성, 즉 새로운 세포를 감염시키는 능력을 확보하는데 필요하다.

표준 세포 배양액에서 몇몇 인플루엔자 A 균주의 제한적인 복제는 조직 배양 배지에 트립신과 같은 프로테아제의 첨가에 의해 극복될 수 있는 것으로 보고되었다(Lazowitz et al., "Enhancement of the Infectivity of Influenza and B Viruses by Proteolytic Cleavage of the Hemagglutinin Polypeptide", Virology, 68:440-454, 1975). 하지만, 일부 경우에, 예를 들면 Vero 세포를 사용하는 경우에는 어려움이 여전하다.

Kaverian과 Webster(J Virol 69/4:2700-2703, 1995)는 Vero 세포 배양액, MDCK, 돼지 신장 또는 붉은 털 원숭이 신장 세포 배양액에서 충분한 수치의 감염성 비리온의 생산 부재로 인하여, 배양 시작과 함께 배지에서 트립신 활성이 급속하게 감소하여 배지에서 바이러스 축적의 실패를 초래한다고 보고한다. 이들은 트립신 저해 인자가 Vero 세포로부터 방출되는 것으로 결론내렸다. 또한, 이들은 트립신의 반복적 첨가에 의해 바이러스의 재생이 재개되고 많은 재생 사이클동안 유지되어, 좀더 높은 바이러스 수율이 결과된다는 것을 보였다.

효과적인 백신 생산을 위한 다른 방법은 US 5,753,489에서 보고하였는데, 여기서 혈청-없음 배지는 MDCK와 Vero 세포를 비롯한 다양한 포유동물 세포에서 바이러스 증식에 사용되었다. 여기에 개시된 방법은 혈청-없음 배지에서 척추동물 세포를 성장시키고, 바이러스로 상기 세포 배양액을 감소시키고, 바이러스로 감염된 세포 배양액을 배양하고, 바이러스-함유 배지의 일부를 떼어내 프로테아제와 접촉시키고, 이후 여기에 프로테아제 저해물질을 첨가하고, 이를 세포 배양액으로 환원하는 단계로 구성된다. 여기서, 성장, 감염, 배양 단계는 제 1 용기에서, 트립신-접촉과 저해물질-첨가 단계는 제 1 용기에 고리로 연결된 제 2 용기에서 실시하여, 이런 단계가 폐쇄 사이클(closed cycle)로 실시되도록 하는 것이 바람직하다. 이런 시스템은 배양액에서 세포에 의해 정상적으로 허용되는 농도보다 훨씬 높은 농도로 트립신 또는 다른 단백분해 효소의 사용을 가능하게 한다.

EP 0870508에서는 바이러스 항원 백신을 생산하는 방법을 보고하는데, 상기 방법은 동물 세포주, 예로써 Vero 세포주를 바이러스로 감염시키고, 세포 배양액에서 바이러스를 증식시키고, 바이러스 증식의 종결 시점 직전에 세포 배양액에 뉴클레아제 효소를 첨가하여 용해된 숙주 세포로부터 배지로 방출된 핵산 물질을 절단하고, 바이러스를 회수하고, 추출로 이로부터 바이러스 항원을 수득하여 바이러스 항원 백신을 만드는 단계로 구성된다. 환자에게는 바이러스 증식에 사용된 영양 배지의 종류 및 감염성 바이러스를 얻기 위한 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 최종 가공에 필요한 프로테아제의 첨가에 관하여 알리지 않는다. 상기 방법은 사용하기 용이한(ready-for-use) 백신 제형을 제공하는 다양한 정제 단계를 추가로 필요로 한다.

하지만, 숙주 기질 및 바이러스 증식에 사용된 영양 배지의 조성이 여기에서 수득되는 바이러스 후손의 면역원성과 항원성에 현저한 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 특히, 혈청-함유 배지는 바이러스 후손의 항원성을 감소시킬 뿐만 아니라 배지에서 프로테아제 활성을 감소시키고, 따라서 바이러스 성숙을 저해하고 후속으로 값비싼 정제 단계를 필요로 한다.

본 발명의 요약

본 발명은 선행 기술의 이런 단점을 극복한다. 이는 적응 선별(selective selection)에 기인한 바이러스 표면 항원에서 변형이 최소화 또는 완전히 예방되는 조건하에, 다양한 출처로부터 바이러스를 분리하고 백신, 특히 약독화된 인플루엔자 생균 백신으로 사용되는 바이러스 후손을 생산하는 간편하고 효율적인 공정에 관한다.

본 발명의 다른 목적은 난 적혈구가 아닌 사람 적혈구를 선택적으로 응집시키고 바람직하게는 초기에 접종된 바이러스 균주, 예를 들면 일차 임상적 야생형 분리물과 동일한 항원 특성을 갖는 바이러스 후손을 만드는 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법을 제시하는 것이다.

적절한 구체예에서, 증식된 바이러스의 HA 유전자 및 선택적으로 NA 유전자 의 핵산 서열은 초기에 접종된 균주(예, 전염성 균주, 감염된 환자의 일차 임상적 분리물)의 핵산 서열과 일치한다.

본 발명의 또 다른 목적은 원심분리로 세포 배양 상층액으로부터 회수된 바이러스 현탁액의 임의의 크로마토그래피 또는 다른 정제 단계, 특히 단백질 분리 또는 정제 단계를 필요로 하지 않는 단일 단계 과정동안 전체-바이러스, 특히 약독화된 생균 백신을 효과적으로 생산하는 방법을 제시하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 약독화되고 저온 적응된 온도 감수성의 인플루엔자 A와 B 균주 및 이로부터 만들어진 백신을 제시하는 것이다.

하지만, 인플루엔자 백신을 생산하기 위하여 자충포장 계란을 이용하는 이런 전통적인 방법은 매주 수천개 난의 취급 및 난 단백질의 완전한 부재를 담보하기 위한 요막 유체로부터 유래된 바이러스 현탁액의 광범위한 정제를 비롯하여 극히 부담스럽다.

바이러스 생산에서 계란 이용의 다른 단점은 이런 기질이 예로써 면역원성의 현저한 감소를 비롯한 변형된 표현형으로 인하여, 항원 특이성의 측면에서 야생형 바이러스와 상이한 바이러스 변이체의 선별에는 상당히 유리하지만 백신 생산에 적합하지 않은 바이러스를 빈번하게 초래한다는 점이다.

자충포장란(embryonated egg), MDCK, Vero 세포를 이용한 비교 실험에서 초 기 접종된 바이러스가 이들 기질중 한가지에서 성장하는 동안 항원 변형을 겪을 가능성이 높은 것으로 입증되었다.

본 출원인의 실험에서는 혈청-없음 배지에서 Vero 세포에 성장된 인플루엔자 바이러스 균주에서 변형이 최소이거나 또는 부재하는 것을 확인하였다. 게다가, 혈청-없음과 단백질-없음 배지에서 Vero 세포에 증식된 인플루엔자 A 바이러스, 적어도 H3N2 아형 균주는 난 적혈구가 아닌 사람 적혈구에 선택적인 응집을 보이는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이들은 난에서 성장하지 않았다. 이는 이들 Vero-성장 바이러스가 MDCK 세포 또는 난에서 성장된 바이러스와 비교하여, 상응하는 임상적 분리물의 야생형과 일치할 가능성이 좀더 높다는 것을 처음으로 시사한 것이다.

실제로, 비강 면봉으로부터 얻은 야생형 분리물의 HA와 NA 유전자 서열과 각각 Vero와 MDCK 세포에서 성장된 동일한 바이러스의 유전자 서열의 비교에서 면봉 분리물, Vero-성장된 바이러스, 또는 면봉 분리물과 Vero-성장된 바이러스의 HA이나 NA에 비하여 MDCK-성장된 바이러스의 HA이나 NA에서 변형이 확인되었다. 게다가, Vero-와 MDCK-성장된 야생형 바이러스로 흰족제비의 면역으로부터 수득된 실험 데이터는 MDCK-성장된 바이러스와 비교하여 Vero-성장된 바이러스의 좀더 강한 독력을 시사한다. 또한, 짧은 꼬리 원숭이에서 동물 실험동안 검사된 Vero-성장된 바이러스의 면역원성은 MDCK 세포 또는 난에서 성장된 바이러스의 면역원성보다 현저하게 높았다.

이들 발견은 하기에 좀더 상세하게 밝힌 본 발명에 따른 바이러스의 증가와 증식을 위한 공정이 초기 접종된(예, 야생형) 바이러스와 비교하여 변형되지 않거 나 또는 경미하게 변형되는 바이러스를 산출한다는 가설에 대한 강한 증거를 제공한다.

본 발명에 따른 바이러스 증식 공정은 항원 변형을 피할 뿐만 아니라, 간편하고 대규모의 산업적인 백신 생산에 극히 적합하다.

다른 실험에서는 트립신(또는 트립시노겐)의 출처가 감염성 비리온의 전체 수율에 영향을 주는 추가적인 인자라는 것을 보여준다. 실제로, 당분야에 공지된 방법(예, Kaverin and Webster, J Virol 69/4:2700-2703, 1995; 또는 US 5,753,489)에서는 트립신의 반복적인 첨가(Kaverin and Webster) 또는 높은 트립신 농도(US 5,753,489)를 이용하지만, 본 발명에 따른 공정에서는 선행 기술에 보고된 트립신 농도의 절반 이하를 이용한다. 게다가, 감염된 숙주 세포의 배양에 앞서 또는 배양의 시작시점에서 세포 배양 배지에 ㎖당 0.5 - 10 ㎍, 바람직하게는 2-5 ㎍ 트립신의 단일 첨가로도 최적 감염성 바이러스 역가에 도달하는데 충분하다. 불활화 실험에서 돼지나 사람 재조합 트립신이 소 트립신보다 Vero 또는 MDCK 세포에 의한 불활화에 덜 취약한 것으로 밝혀졌다. 소 트립신이 당분야에 가장 일반적으로 사용된다는 점에서, 다른 트립신 출처를 명시하지 않는 선행 문헌은 암묵적으로 소 트립신만을 인용할 가능성이 높다. 이는 예로써 Kaverin et al과 US 5,753,489에서 언급된 트립신의 형태와 농도를 설명하는 데에도 도움이 된다.

따라서, 본 발명에 따른 Vero 세포 배양액에 대한 혈청-없음 배지를 초기에 보충하기 위하여 돼지 또는 사람 재조합 트립신이나 트립시노겐을 이용하는 것은 극히 낮은 트립신이나 트립시노겐 농도를 이용하는 것을 가능하게 하여 바이러스- 함유 상층액의 회수이후에 노동-집중적이고 값비싼 정제 단계의 필요성을 예방한다.

본 발명에 따른 공정을 간편하게 하고, 따라서 백신 제조업자에게 매력적인 다른 단계는 바이러스 증식을 위하여 감염된 Vero 세포의 배양에 앞서 또는 배양의 시작시점에서 세포 배양 배지에 고도 활성 엔도뉴클레아제의 단일 용량 첨가이다. 상기 엔도뉴클레아제, 바람직하게는 벤조나제(benzonase)^TM은 배지 ㎖당 2 - 30, 바람직하게는 5 - 15 Unit의 매우 낮은 초기 농도로 배지에 한번 첨가되고, 세포용해 또는 용해된 숙주 세포로부터 발생된 유리 DNA와 RNA를 세포 배양 배지에서 효과적으로 제거한다. 원심분리된 상층액으로부터 수득된 사용하기 용이한 백신에 잔류하는 벤조나제 효소 농도는 용량당 5 ng이하이다.

벤조나제^TM은 Nycomed Pharma A/S Denmark의 상표로, 세라티아 마르센스(Serratia marcescens)로부터 얻은 세포외 비특이적 엔도뉴클레아제이다. 벤조나제는 다양한 형태의 DNA와 RNA를 작은 올리고뉴클레오티드로 분해시키는 유전자조작된 엔도뉴클레아제이다. 이는 세포 용해질 점도의 신속한 감소를 촉매하고, 이를 통하여 한외원심분리를 용이하게 한다. 이는 단백분해를 감소시키고 표적 단백질에서 수율을 증가시키며 예로써 재조합 단백질로부터 핵산을 완전히 제거한다. 이는 400,000 U/㎎의 예외적으로 높은 활성을 갖는다.

본 발명에 다른 과정의 세 번째 장점은 시간 인자와 이에 따른 공정 비용이다. 동물 기원의 단백질 및 바람직하게는 항생제를 함유하지 않는 혈청-없음 배지 의 이용으로, 비용과 시간을 소모시키는 정제 과정을 최소화시키거나 또는 완전히 피할 수 있다. 또한, 프로테아제(예, 트립신이나 트립시노겐)와 뉴클레아제(예, 벤조나제)와 같은 외인성 효소의 첨가가 바이러스 증식의 시작시점에서 1회 실시되기 때문에, 바이러스-함유 배양 상층액의 배양후 처리(예, HA 활성화, RNA/DNA 절단, 단백질 정제 등)에 필요한 시간을 상당부분 줄일 수 있다.

놀랍게도, 바이러스-감염된 Vero-세포 배양액에 대한 프로테아제(예, 트립신이나 트립시노겐)와 뉴클레아제(예, 벤조나제)중 적어도 한가지의 초기 첨가가 바이러스 수율에 부정적인 영향을 주지 않는 것으로 판명되었는데, 이는 본 발명의 공정동안 적용되는 극히 낮은 효소 농도에 기인하는 것으로 생각된다.

본 발명에 따른 바이러스 증식 공정은 다양한 종류의 바이러스, 특히 H3N2 아형의 인플루엔자 A 바이러스의 증식에 유용할 뿐만 아니라, 바이러스 접종물(예, 혈청 시료, 비강 세척액, 비강 면봉, 인두 면봉, 타액 등)의 종류에 상관없이 임의의 전염성 또는 실험적 인플루엔자 바이러스 균주의 분리와 재생에도 적합하다. 본 발명에 따른 공정의 원리를 활용하여 다수의 인플루엔자 A와 B 백신을 만들었는데, 이들은 본 발명의 일부로써 하기 실시예에서 좀더 상세하게 특성화한다.

이에 더하여, 본 발명에 따라 만들어진 백신에 대한 보호 효능과 백신 안정성이 확인되었다(실시예 참조).

본 발명에 따른 바이러스 증가 또는 증식 방법과 관련하여 본원에서 "단백질-없음" 또는 비-혈청 단백질이 없는"은 임의의 기능적 활성 단백질이 존재하지 않음을 의미한다. 하지만, 이는 효모 추출물이나 콩 추출물과 같은 단백질 가수분해 물(hydrolysate)로부터 기원된 비-기능성 펩티드를 배제하지 않는다. 달리 명시하지 않는 경우에, "단백질-없음"은 본원에 개시된 농도의 프로테아제와 뉴클레아제 효소의 존재를 배제하지 않는다.

적절한 구체예에서, 본 발명은 전체 바이러스 백신, 바람직하게는 약독화된 생균 백신을 제조하는 간편하고 믿을 수 있고 경제적인 방법에 관하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:

a) 원하는 바이러스로 African Green Monkey Kidney(Vero) 세포를 감염시키고, 여기서 Vero 세포는 비-혈청 단백질이 존재하지 않는 혈청-없음 배지에서 성장하고 이로부터 분리된다;

b) 프로테아제와 뉴클레아제를 제외하고 비-혈청 단백질이 존재하지 않는 적합한 혈청-없음 세포 배양 배지와 감염된 세포를 결합시키고;

c) 상기 프로테아제와 뉴클레아제의 존재하에 상기 세포를 배양하여, 감염성 바이러스의 생산 및 이와 동시에 세포 배양 배지로 방출된 핵산 물질의 절단을 가능하게 하고;

d) 세포 배양액의 원심분리로 얻은 바이러스-함유 상층액을 회수하여 감염성 바이러스를 확보하고;

e) 바이러스-함유 상층액을 여과, 농축, 동결, 동결-건조 및 안정제의 첨가에 의한 안정화에서 선택되는 적어도 한가지의 가공 단계에 적용하여 백신을 제조한다.

가급적, 증식에 사용되는 바이러스는 Vero 세포를 제외한 숙주 기질과 접촉 하지 않도록 한다. 이는 초기 바이러스(예, 비강 면봉 분리물)와 증식후에 얻은 바이러스 후손의 면역원성과 항원 동일성의 측면에서 최적 결과를 담보하게 된다.

가급적, 증식, 특히 전체-바이러스 백신, 바람직하게는 약독화된 인플루엔자 생균 백신의 제조에 사용된 바이러스는 균주 A/Sing/1/57ca, A/Sing/1/57ca/△NS87, A/Sing/1/57ca/△NSPR8, A/Sing/1/57ca/NS124PR8, B/Vienna/1/99ca, B/Vienna/99/ca37 및 이들 균주중 한가지로부터 유래된 약독화된 변이체와 재조합체(reassortant)에서 선택되는 인플루엔자 바이러스이다. 적절한 바이러스 균주, 예를 들면 마스터 균주의 유전적 특징은 하기 실시예에서 상세하게 개시한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 전체-바이러스 백신 자체, 바람직하게는 약독화된 생균 백신에 관하는데, 상기 백신은 사용하기 용이한 형태로 상기 바이러스의 생산에 사용되는 혈청-없음과 단백질-없음 Vero 세포 배양액의 본질적으로 변화되지 않은, 선별적으로 여과된 및/또는 농축된 바이러스-함유 상층액을 함유한다. 가급적, 상기 백신은 본 발명에서 개시되고 청구된 방법에 따라 생산한다.

추가적인 가공, 예를 들면 원심분리 및/또는 통상적인 여과(즉, 겔 여과 제외)이외의 정제 단계를 필요로 하지 않는 "일-단계" 백신은 FDA 승인 요건을 충족한다.

본 발명에 따른 백신 제형에서 바이러스-함유 상층액과 관련하여 본원에서 "본질적으로 변화되지 않은"은 증식된 바이러스의 회수 시점에서 상층액의 조성, 다시 말하면 상층액의 액체상에 존재하는 가용성 구성 요소와 성분의 조성을 의미한다. 성분 조성에서 약간의 변화는 바이러스-함유 상층액의 여과, 멸균 여과, 원심 분리, 농축, 건조 또는 동결-건조의 단계에 기인할 수 있는데, 이는 "본질적으로 변화되지 않은"의 범주에 속하는 것으로 간주한다. 또한, 이는 당분야에서 백신 제형에 일반적으로 이용되는 방부제 및/또는 안정제의 존재를 배제하지 않는다.

다른 적절한 구체예는 첨부된 특허청구범위에서 정의한다.

본 발명은 다음의 실시예로 좀더 상세하게 기술하지만, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이를 제한하지 않는다.

본 발명의 전체-바이러스 백신은 바이러스 감염, 특히 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다. 이들은 당분야에 공지된 루트, 예를 들면 정맥내, 피하내, 근육내 또는 가장 바람직하게는 비강내 투여할 수 있다. 하지만, 본원에 개시된 바이러스 균주 및 이로부터 만들어진 백신은 면역계에 대한 이질성 항원, 예를 들면 HIV-1 또는 간염 항원과 같은 바이러스 외피 단백질 항원을 제공하는 벡터 또는 운반체로 사용될 수도 있다.

실시예 1: 바이러스 생산

Vero / SF (혈청-없음) 세포의 배양:

SF-배지: DMEM(Biochrom FO435), Ham's F12(Biochrom FO815), 5 mM L-Gln, 0.1% SF-보충물질 (a) 또는 (b); 항생제(바이러스 분리의 첫 번째 계대배양(passage)의 경우).

SF-보충물질: 인슐린, 트랜스페린 또는 성장 인자와 같은 기능성 단백질이 존재하지 않는 비-동물 기원의 단백질 가수분해물:

a) 62.5 g hy-soy/UF, Quest 5X59100, to 500 g HQ-물,

PES 0.2 ㎛ 필터로 여과;

b) 12.5 g hy-pep 1510, Quest, to 100 g HQ-물,

PES 0.2 ㎛ 필터로 여과;

WCB Vero 세포의 깊이 동결된(액체 질소) 살균된(70% 에탄올) 앰플의 내용물은 해동하고 10 ㎖ 튜브에서 9 ㎖의 차가운 혈청-없음(SF) 배지에 첨가하며 1000 rpm(170 g)으로 10분동안 원심분리한다. 펠렛은 총 30 ㎖로 SF-배지에 부유시키고 80 ㎠ Roux 병으로 이전하며 37℃와 7% CO₂에서 적어도 15분동안 배양한다. 이후, 배지는 제거하고, 세포는 대략 0.1 ㎖/㎠ PBS def.(=Ca² ⁺와 Mg² ⁺가 없는 PBS)로 세척한다. 트립신/EDTA-용액(8-10 ㎕/㎠; 0.1% 트립신/ 0.02% EDTA-용액)을 첨가하고 실온에서 3분동안 배양한다. Roux 병을 손바닥에 부드럽게 문질러 분리시키고 트립신/EDTA 용액의 대략 1/5 부피 함량으로 SF-배지와 트립신 저해물질(Sigma, T6522)을 첨가한다. 세포 현탁액은 Roux 병이나 회전 병에 배분하고 37℃와 9% CO₂에서 배양한다.

MDCK 세포는 DMEM/Ham's F12 + 2% FCS(열 불활화됨)에서 성장시킨다; 자충포장 계란은 11-12일된 것으로 SPF(특정 병원균 없음) 기원한다.

바이러스 균주의 증식:

Vero 세포를 함유하는 회전 병의 이전 배지는 제거하고, 세포는 SF-배지상의 5 ㎖ 바이러스 현탁액을 각 회전 병에 첨가하여 바이러스로 감염시키고 대략 0.01의 MOI(감염다중도)를 결과한다. 33℃에서 45분동안 배양한 이후, 바이러스 접종물은 피펫으로 옮긴다. 0.5 - 10, 바람직하게는 2 - 5, 가장 바람직하게는 2 ㎍/㎖ 돼지 트립신(공급업자: AvP) 또는 사람 재조합 트립신이나 트립시노겐(자체 생산)과 0.5 g/ℓ중탄산나트륨으로 보충된 90 ㎖ SF-배지를 각 회전 병에 첨가하고, 이들 병은 33℃와 5% CO₂에서 배양한다. 동물 검사와 사람 임상 실험에 사용되는 약독화된 생균 백신 시료의 생산을 위하여, SF-배지는 트립신 및 추가로 배지 ㎖당 2 - 30, 바람직하게는 5 - 15, 가장 바람직하게는 10 Unit 농도의 벤조나제^TM으로 보충한다. 감염 64시간후, 바이러스는 50 ㎖ 튜브에서 10℃에서 4000 rpm(3000 g)으로 5분동안 배양 상층액의 원심분리로 회수한다. 상층액은 각 바이러스 균주에서 모으고 +4℃에 저장한다. 이들의 분취량은 백신 검사에 사용한다.

저장 목적으로, 바이러스 제형은 동결-건조시키고 안정제, 예를 들면 HEPES 완충액에 용해된 트레할로스와 락트알부민(lactalbulmin) 효소적 가수분해물을 첨가할 수 있다. 재구성은 멸균수로 실시할 수 있다.

실시예 2: 세포 배양액에서 트립신 불활화의 비교

표 1 : Vero vs. MDCK 세포 배양액에서 트립신 불활화

	Vero/MDCK
	0 h	24 h	48 h	72 h
소 트립신	0.314/0.314	0.199/0.239	0.110/0.201	0.026/0.203
돼지 트립신(고급)	0.230/0.230	0.201/0.206	0.171/0.209	0.133/0.201
돼지 트립신(저급)	0.129/0.129	0.108/0.118	0.081/0.099	0.054/0.116
사람 재조합 트립신	0.097/0.097	0.054/0.088	0.026/0.080	0.008/0.076

감염되지 않은 Vero 세포 배양액(실시예 1에서 밝힌 바와 같이 SF 배지에서 성장)으로부터 얻은 상층액과 MDCK 세포 배양액(실시예 1에서 밝힌 바와 같이 FCS-보충된 배지에서 성장)은 각각 동등한 농도로 0시 시점에 상층액에 첨가된 상이한 기원의 트립신을 활성화시키는 능력을 검사하였다. 돼지 트립신은 2가지 상이한 품질(상이한 제조업자로부터 구함), 즉 고급과 저급 활성을 갖는다. 결과는 표 1 및 도 1과 2에 제시한다.

이들 데이터는 소 트립신이 Vero 세포 상층액에서는 급속하게 불활화되고 MDCK 세포 배양 상층액에서는 조금 더 느리게 불활화된다는 것을 보여준다. 돼지와 사람 재조합 트립신(자체 생산)은 MDCK 상층액에서는 완전한 활성을 보이고, Vero 상층액에서는 소 트립신 불활화 속도의 대략 절반이하의 속도로 점진적으로 불활화된다. 검사된 돼지 트립신은 247 nm의 출발 OD-수준에서만 상이하고, 양 돼지 트립신에서 불활화 특성은 본질적으로 동일하다.

실시예 3: 상이한 숙주 세포 기질에서 성장이후 다양한 바이러스 특성의 비교

바이러스 증식은 상이한 숙주 세포 기질에 대하여 실시예 1에서 밝힌 바와 같이 실시하였다. Vero 세포에서 회수된 7개 분리물 각각은 사람 적혈구와 반응하지만 난 적혈구와 반응하지 않고, 어느 것도 자충포장란에 축적되지 않았다. 한편, MDCK 세포에서 회수된 분리물은 난과 사람의 적혈구에 모두 반응하고 난에서 성장할 수 있었다. 이들 차이가 H1N1 아형의 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔 자 B 분리물에서는 관찰되지 않았지만, 그럼에도 불구하고 Vero 세포에서 인플루엔자 바이러스의 배양이 다른 기질에서 배양보다 항원 특성을 좀더 적절하게 유지시키는 것으로 추정된다.

표 2: Vero/SF 세포에서 임상적 재료로부터 분리된 H3N2 바이러스의 특징

분리물 번호	관련된 항원	분리된 위치	HA 역가		난에서 성장
분리물 번호	관련된 항원	분리된 위치	난 적혈구	사람 적혈구	난에서 성장
A/47/96	A/Johannesburg/33/94	Vero MDCK	- +	+ +	- +
A/7729/98	A/Sydney/5/97	Vero MDCK	- +	+ +	- +
A/1143/99	A/Sydney/5/97	Vero MDCK	- +	+ +	- +
A/1144/99	A/Sydney/5/97	Vero MDCK	- +	+ +	- +
A/1179/99	A/Sydney/5/97	Vero MDCK	- +	+ +	- +
A/1180/99	A/Sydney/5/97	Vero MDCK	- +	+ +	- +
A/1182/99	A/Sydney/5/97	Vero MDCK	- +	+ +	- +

표 3의 데이터에 의하면 H1N1 인플루엔자 바이러스가 적응 선별에 조금 덜 취약한 것으로 보이는데, 그 이유는 Vero와 MDCK-성장된 분리물이 헤마글루티닌 특성과 HA 서열에서 현저한 차이를 보이지 않기 때문이다. 표 4에 기재된 B 분리물에 대하여 유사한 결론을 도출할 수 있다.

바이러스 분리와 복제를 위한 임상적 출발 재료(예, 혈청 시료, 면봉)는 다음과 같은 기관으로부터 일차적으로 얻었다:

1. Institute of Virology, Vienna, Austria(Prof. F. Heinz) 1995/96, 1996/97

2. Unite de Genetique Molecularie des Virus Respiratoires, Institute Pasteur, Paris, France(Prof. S. van der Werf) 1996/97

3. Public Health Laboratory Service, London, UK(Dr. M. Zambon) 1996/97

4. Laboratoire Central de Virologie, Hopitaux Universitaires de Geneve, Geneva, Switerzerland(Dr. W. Wunderli) 1996/97, 1997/98

5. Virus Unit, Queen Mary Hospital, Hong Kong(Dr. W. L. Lim) 1997/98

표 3: Vero/SF 세포에서 임상적 재료로부터 분리된 H1N1 바이러스의 특징

분리물 번호	관련된 항원	분리된 위치	HA 역가		난에서 성장	HA1 변화
분리물 번호	관련된 항원	분리된 위치	난 적혈구	사람 적혈구		225 위치
A/5389/95	A/Bayern/ 7/95	Vero MDCK	+ +	+ +	+ +	D D
A/1035/98	A/Beijing/ 262/95	Vero MDCK 난 면봉	+ + +	+ + +	+ + +	D D G D
A/1131/98	A/Beijing/ 262/95	Vero MDCK 면봉	+ +	+ +	+ +	D D D
A/1134/98	A/Beijing/ 262/95	Vero MDCK 난 면봉	+ + +	+ + +	+ + +	D D n.t. D

표 4: Vero/SF 세포에서 임상적 재료로부터 분리된 B 바이러스의 특징

분리물 번호	관련된 항원	분리된 위치	HA 역가		난에서 성장	HA1 변화
분리물 번호	관련된 항원	분리된 위치	난 적혈구	사람 적혈구		198 위치
B/4291/97	B/Beijing/ 184/93	Vero MDCK	+ +	+ +	+ +	동일
B/1/99	B/Beijing/ 184/93	Vero MDCK 난 면봉	+ + +	+ + +	+ + +	T(g.s) T(g.s) A T(g.s)
B/110/99	n.t.	Vero MDCK	+ +	+ +	+ +	동일
B/147/99	n.t.	Vero MDCK	+ +	+ +	+ +	동일
B/156/99	B/Beijing /184/93	Vero MDCK	+ +	+ +	+ +	동일
B/157/99	B/Beijing /184/93	Vero MDCK	+ +	+ +	+ +	동일

표 5: 상이한 숙주계에서 분리된 H3N2 인플루엔자 바이러스의 HA, NA, M 단백질에서 아미노산 변화

분리물 번호	아래 위치에서 변화
	HA						NA		M
	128	129	229	133	218	220	136	151
A/47/96 Vero A/47/96 MDCK	T(g.s) A
A/7729/98 Vero A/7729/98 MDCK		E G	R K
A/1143/99 면봉 A/1143/99 Vero A/1143/99 MDCK				N(g.s) N(g.s) D	G G E		n.t.	n.t. D G	n.t 동일
A/1144/99 면봉 A/1144/99 Vero A/1144/99 MDCK						R R G	n.t 동일		n.t 동일
A/1179/99 면봉 A/1179/99 Vero A/1179/99 MDCK	동일						n.t 동일		n.t 동일
A/1180/99 면봉 A/1180/99 Vero A/1180/99 MDCK	동일						n.t. Q R	n.t.	n.t 동일
A/1182/99 면봉 A/1182/99 Vero A/1182/99 MDCK	동일						n.t. n.t. n.t.		n.t. n.t. n.t.

이런 결과는 일부 분리물에서는 PCR 증폭으로 면봉 재료로부터 직접적으로 얻은 HA 서열과 비교하여 Vero 또는 MDCK 증식된 바이러스의 HA 서열의 변화가 없다는 것을 보여준다. MDCK 세포에서 성장된 일부 다른 분리물에서 HA 및/또는 NA 서열은 Vero 세포에서 얻은 상응하는 서열로부터 이탈하였다. 하지만, 확인된 Vero-유래된 바이러스는 면봉 분리물의 HA 서열과 비교하여 HA 서열의 이탈을 보이지 않았다.

표 6: 짧은 꼬리 원숭이에 대한 Vero-, MDCK-, 난-유래된 바이러스의 면역원성

동물 번호	면역화를 위한 바이러스	용량, PFU/㎖	혈청 HI 역가
96	A/Vienna/47/96 V	5x10⁴	256
88	A/Vienna/47/96 V	5x10⁴	128
15	A/Vienna/47/96 V	1.0x10⁶	128
95	A/Vienna/47/96 V	1.0x10⁶	256
93	A/Vienna/47/96 M	1.0x10⁶	16
128	A/Johannesburg/33/94 E	5x10⁶	32
110	A/Vienna/157/97 V	5x10⁴	128
78	A/Wuhan/359/95 E	5x10⁶	32

짧은 꼬리 원숭이는 마취없이 1 ㎖ 바이러스 현탁액으로 i.n. 면역하였다.

V - Vero-분리된 바이러스

M - MDCK-분리된 바이러스

E - 난-분리된 바이러스

표 7: 흰족제비에 대한 A/Vienna/47/96 wt 바이러스의 Vero-와 MDCK-유래된 변이체의 독력

바이러스	바이러스, 용량	열병을 앓는 동물의 개체수
	PFU/㎖	1일	2일	3일
A/Vienna/47/96 Vero	2x10² 1x10³	FF FFF	FFF FFF
A/Vienna/47/96 MDCK	5x10² 5x10³ 5x10⁴	FF	FF F	F

동물은 에테르 마취하에 1 ㎖ 바이러스 현탁액으로 i.n. 면역하였다.

N - 38.1℃ 내지 39.9℃의 정상 온도

F - 40.0℃이상의 열병

표 6에서 가장 놀랍고도 중요한 결과는 상응하는 Vero-유래된 바이러스와 비교하여 MDCK-유래된 A/Vienna/47/96 바이러스의 극히 낮은 면역원성이다. 난-유래된 바이러스가 불량한 면역원성을 보인다는 것은 그다지 놀라운 사실이 아니다.

유사하게, 표 7에 기재된 결과는 Vero-유래된 바이러스가 MDCK-유래된 바이러스와 비교하여 숙주 기질에서 적응 선별에 의한 변형이 덜하다는 것을 시사한다. 이는 MDCK-유래된 바이러스와 비교하여 Vero-유래된 바이러스가 원 바이러스와 면역학적으로 유관한, 특히 항원 특성을 좀더 많이 또는 완전히 유지한다는 것을 의미한다.

실시예 4: 적절한 균주로 백신 생산

실시예 1에 기술된 공정은 동물 검사와 사람 임상 연구를 위한 백신 시료의 생산에도 이용한다. 인지하는 바와 같이, 본원에서 밝힌 바이러스 증식 공정에는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고 당업자에 의해 제안 또는 응용될 수 있는 개변이 포함된다.

바람직한 인플루엔자 A이나 B 야생형 균주, 마스터 균주 또는 재조합 균주(하기에 좀더 상세하게 설명한다)중 적어도 한가지를 함유하는 백신 시료는 실시예 1에서 밝힌 영양 성분과 효소로 추가로 보충된 혈청-없음 배지에서 연속 Vero 세포주를 숙주 세포계(다른 숙주 기질에서 얻은 시료와 비교 목적이 아닌 경우)로 이용하여 독점적으로 생산하였다.

약독화(예, 온도 감수성), 저온 적응성, 재조합을 비롯한 야생형 바이러스를 변형하는 일부 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 예로써 WO 99/64068에서 광범위하게 재평가하고 있다.

예로써 WHO의 추천을 받은 실제 전염성 인플루엔자 바이러스의 HA와 NA 유전자와 6/2 재조합으로 약독화된 생균 백신 생산에 가장 적합한 인플루엔자 A와 B 마스터 균주 후보의 추가적인 특성은 다음의 표 8-13에 제시한다.

표 8: 인플루엔자 생균 백신에 대한 마스터 균주 후보의 특징

	인플루엔자 A A/ *Singapore* */1/57/* ca H2N2	인플루엔자 B B/ *Vienna* */1/99/* ca
계대배양 내력	A/Singapore/1/57 wt 난 유래된 H2N2 Vero/SF 세포에서 37℃에 20회 계대배양 Vero/SF 세포에서 25℃에 25회 계대배양	B/Vienna/1/99 wt Vero 유래 Vero/SF 세포에서 33℃에 1회 추가 계대배양 Vero/SF 세포에서 25℃에 22회 계대배양
약독화방법	이형성 시스템에서 최적과 준최적 온도에서 연속 계대배양	이형성 시스템에서 최적과 준최적 온도에서 연속 계대배양
표현형마커	온도 감수성(ts) 저온 적응성(ca) 생쥐 폐에서 극히 낮은 재생	온도 감수성(ts) 저온 적응성(ca) 생쥐 폐에서 극히 낮은 재생
유전형마커	돌연변이: 13(8 코딩) PB2 3(2 코딩) PB1 2(1 코딩) PA 4(3 코딩) NP 1 M 2(2 코딩) NS 1	돌연변이: 5(3 코딩) PB2 0 PB1 1 PA 0 NP 2(1 코딩) M 1 NS 1

표 9: 균주 A/Singapore/1/57/ca의 8가지 게놈 분절과 10가지 상응하는 단백질의 전장 서열

A/Singapore/1/57/ca(H2N2)
RNA 분절	뉴클레오티드 서열(cDNA)	단백질	아미노산 서열
1	SEQ ID NO. 1	PB2	SEQ ID NO. 9
2	SEQ ID NO. 2	PB1	SEQ ID NO. 10
3	SEQ ID NO. 3	PA	SEQ ID NO. 11
4	SEQ ID NO. 4	HA	SEQ ID NO. 12
5	SEQ ID NO. 5	NP	SEQ ID NO. 13
6	SEQ ID NO. 6	NA	SEQ ID NO. 14
7	SEQ ID NO. 7	M1	SEQ ID NO. 15
7	SEQ ID NO. 7	M2	SEQ ID NO. 16
8	SEQ ID NO. 8	NS1	SEQ ID NO. 17
8	SEQ ID NO. 8	NS2	SEQ ID NO. 18

ca-저온 적응성

하지만, 게놈 분절 4와 6, 다시 말하면 HA와 NA 유전자는 인플루엔자 A 마스 터 균주 후보를 특성화하는데 필요하지 않는데, 그 이유는 이들 유전자들이 실제 전염성 인플루엔자 바이러스의 상응하는 유전자로 대체되기 때문이다. 백신의 안정성에 중요한 특징, 예를 들면 온도 감수성, 또는 백신의 비강내 투여를 가능하게 하는 특징, 즉 저온 적응성(코에서 평균 온도는 통상의 신체 온도보다 낮다)은 나머지 6개의 게놈 분절에서 돌연변이에 의해 주로 유발된다.

다음의 표 10은 상응하는 야생형 균주 A/Singapore/1/57/wt 균주와 비교하여 A/Singapore/1/57/ca의 게놈 분절에서 돌연변이를 기재한다.

표 10: A/Singapore/1/57/wt 균주와 비교하여 약독화되고 저온 적응된 온도 감수성 인플루엔자 균주 A/Singapore/1/57/ca의 게놈 분절에서 돌연변이

RNA	길이	변화된 뉴클레오티드			단백질	길이	변화된 아미노산
분절	(n'ds)	위치	wt	ca		(aa)	위치	wt	ca
1	2341	252 581* 1046*	a t g	g c t	PB2	771	- 185 340	- I R	- T I
2	2341	1279* 1965	t a	a c	PB1	757	419 -	L -	I -
3	2233	707* 1425 1537* 1819*	a t a g	t a g c	PA	716	228 - 505 598	I - V Q	N - I E
5	1565	210	g	a	NP	506	-	-	-
7	1027	327* 499*	g g	a c	M1 M2	252 97	101 158 -	R Q -	K R -
8	890	813	a	g	NS1 NS2	237 121	- -	- -	- -

돌연변이의 전체 수 - 13(8 코딩)

* 코딩 돌연변이

A/Sing/1/57/ca의 바람직한 변이체는 다음의 표 11에 기재된 변이체로 구성되는데, 여기서 "△"은 "del"이나 "delta"를 의미하고, NS 유전자 분절에서 적어도 1개의 "결실(deletion)"을 보유하는 돌연변이체를 나타낸다.

표 11: A/Sing/1/57/ca의 적절한 변이체

* A/Singapore/1/57/ca로부터 기원한 게놈 분절

** A/PR8/34로부터 기원한 게놈 분절

ca - 저온 적응성; ts - 온도 감수성;

aa - 아미노산

IFN-induct. - 균주는 투여직후에 동물이나 사람 면역계뿐만 아니라 IFN 생산이 가능한 숙주 기질에서 인터페론 방출을 유인한다.

IFN-sensit. - 균주는 인터페론에 감수성이다; IFN 생산 시스템에서 복제가 감소하거나 중단된다.

Sing ca/△NS 87 - aa 위치 36-123에서 NS1 유전자상의 87개 아미노산이 결실된 균주 A/Singapore/1/57/ca.

Sing ca/△NSPR8 - 전체 NS1 유전자가 결실된 A/PR8/34("PR8")의 NS 유전자 분절을 포함하는 균주 A/Singapore/1/57/ca.

Sing ca/NS124PR8 - NS1 유전자의 aa 위치 124에서 종결 코돈을 보유하는 A/PR8/34의 NS 유전자 분절을 포함하는 균주 A/Singapore/1/57/ca.

+/-는 표현형이 추가적인 설명을 필요로 하고 아직 분명하게 정의되지 않았음을 의미한다.

다음의 표 12, 13, 13A는 각각, 바람직한 인플루엔자 B 마스터 균주 후보, 이의 변이체, 재조합체를 나타낸다.

표 12: 균주 B/Vienna/1/99/ca의 8가지 게놈 분절과 11가지 상응하는 단백질의 전장 서열

B/Vienna/1/99/ca
RNA 분절	뉴클레오티드 서열(cDNA)	단백질	아미노산 서열
1	SEQ ID NO. 19	PB2	SEQ ID NO. 27
2	SEQ ID NO. 20	PB1	SEQ ID NO. 28
3	SEQ ID NO. 21	PA	SEQ ID NO. 29
4	SEQ ID NO. 22	HAo	SEQ ID NO. 30
5	SEQ ID NO. 23	NP	SEQ ID NO. 31
6	SEQ ID NO. 24	NB	SEQ ID NO. 32
6	SEQ ID NO. 24	NA	SEQ ID NO. 33
7	SEQ ID NO. 25	M1	SEQ ID NO. 34
7	SEQ ID NO. 25	BM2	SEQ ID NO. 35
8	SEQ ID NO. 26	NS1	SEQ ID NO. 36
8	SEQ ID NO. 26	NS2	SEQ ID NO. 37

ca- 저온 적응성

원 균주 B/Vienna/1/99는 1999년 2월 오스트리아의 비엔나에서 급성 인플루엔자에 걸린 12살 여성으로부터 혈청-없음 배지로 성장된 Vero 세포 배양액에서 분리되었다. 이는 미국 애틀랜타의 질병 통제 센터(CDC)에 의해 B/Beijing/184/93-동류로 평가되었다. 33℃에서 계대배양후, 이 야생형 균주 - B/Vienna/1/99 wt로 명명됨 -은 동일 세포 배양 시스템을 이용하여 25℃에서 22회 연속 계대배양으로 약독화시켰다. 플라크 정제는 먼저 25℃에서, 이후 4회에 걸쳐 33℃에서 실시하였다. 파생된 플라크-정제된 클론은 증폭하고 -70℃로 저장하고 B/Vienna/1/99 ca(또는 간단히 BV22)로 명명하였다. B/Beijing/184/93-동류 바이러스로서의 본성은 NIBSC로부터 얻은 표준 항-혈청을 이용한 HI-분석으로 확인하였다.

표 13: Vero/SF에서 B/Vienna/1/99/wt(BVie) 1st. 계대배양과 비교하여 B/Vienna/1/99/ca(=BV22)에서 돌연변이

분절 (뉴클레오티드 길이)	변화된 뉴클레오티드			단백질 (아미노산 길이)	변화된 아미노산
분절 (뉴클레오티드 길이)	위치	BVie	BV22	단백질 (아미노산 길이)	위치	BVie	BV22
1(2396)	-	-	-	PB2(770)	-	-	-
2(2369)	594	T	C	PB1(752)	-	-	-
3(2305)	-	-	-	PA(726)	-	-	-
4(1882)	457 1299 1595	G G G	A T A	HAo(584)	142 422 521	A K G	T N E
5(1844)	128 330	C T	T C	NP(560)	23 -	S -	F -
6(1557)	- 823 1135	- G T	- A C	NB(100) NA(466)	- 257 361	- R I	- Q T
7(1190)	- 831	- A	- G	MA(248) BM2(109)	- 21	- M	- V
8(1097)	116 -	G -	A -	NS1(281) NS2(122)	25 -	A -	T -

이에 더하여, 균주 B/Vienna/1/99 ca의 15회의 추가 계대배양(즉, 혈청-없음 Vero 세포 배양액에서 총 37회 계대배양)은 BV22보다 훨씬 더 우월한 특성을 보유하는 돌연변이 B/Vienna/1/99 ca37(BV37)을 결과하였다. 이 돌연변이체는 돌연변이 BV22에 비해서 더 많은 수의 돌연변이를 보유하고, 비-재조합 인플루엔자 바이러스 돌연변이체에 기초한 전체-바이러스 백신, 특히 약독화된 인플루엔자 생균 백신의 생산을 위한 가장 유망한 후보로 부상하고 있다. 다른 돌연변이는 하기 표13A에 기재한다:

표 13A: Vero/SF에서 B/Vienna/1/99 wt 1st. 계대배양과 비교하여 BV22와 BV37에 대한 돌연변이

분절 (뉴클레오티드길이)	변화된 뉴클레오티드				단백질 (아미노산길이)	변화된 아미노산
분절 (뉴클레오티드길이)	위치	BVie	BV22	BV37	단백질 (아미노산길이)	위치	BVie	BV22	BV37
1(2396)	-	-	-	-	PB2(770)	-	-	-	-
2(2369) (BV37: 2370)	594 2348	T -	C -	C A	PB1(752)	- -	- -	- -	- -
2(2305)	-	-	-	-	PA(726)	-	-	-	-
4(1882)	457 1122 1299 1595	G C G G	A* C T A	A* A G A	HAo(584)	142 363 422 521	A F K G	T⁺ F N E	T⁺ L K E
5(1844)	128 212 330	C C T	T C C^#	T T C^#	NP(560)	23 51 -	S P -	F P -	F L -
6(1557)	- 823 1135	- G T	- A C^●	- G C^●	NB(100) NA(466)	- 257 361	- R -	- Q T^●	- R T^●
7(1190)	24 831 831 1029	G A A A	G G G A	A G G G	M1(248) BM2 (109)	- - 21 87	- - M I	- - V I	- - V V
8(1097)	116 -	G -	A -	A -	NS1(281) NS2(122)	25 -	A -	T -	T -

인플루엔자 서열 데이터베이스 2001.2.13(www.flu-lanl.gov)과의 비교:

a) 굵은 글씨로 강조된 특이적 돌연변이

b) 통상적 돌연변이:

* B/Lee/40, B/Osaka/70, B/Kadoma/1076/99(결과의 아미노산: I)

+ B/Lee/40, B/Osaka/70

# 종종: B/Lee/40, B/Ann Arbor/1/66 ca & wt, B/Singapore/222/79, B/North Dakota/83, B/Norway/1/84, B/Ibaraki/2/85, B/Ann Arbor/1/86, B/Victoria/2/87, B/Aichi/5/88

^● B/Kanagawa/73

인지하는 바와 같이, 본 발명에 따른 인플루엔자 A와 B 마스터 균주는 본원의 표에 명시된 외형과 유전적 특성뿐만 아니라, 이런 바이러스의 기능적 특징을 실질적으로 변화시키는 않은 경미한 변이를 포함할 수도 있다. 이런 변이는 예로써 바이러스 증가와 증식의 추가적인 단계(가령, 서열 분석을 위한 재료를 얻기 위해)에 기인할 수 있다.

이에 덧붙여, 본원에 기재된 유전자 서열에는 본 발명에 사용되는 프라이머 서열(각 게놈 분절의 시작과 종결 지점에 위치)이 포함되는데, 이들 프라이머 서열은 야생형과 약독화된 바이러스 균주중 적어도 한가지의 바이러스 게놈 분절의 상응하는 실제 서열과 상이할 수 있다.

실시예 5: 백신 안정성과 효능

이후의 데이터는 예로써 실시예 1에서 밝힌 바와 같이 본 발명에 따라 만들어진 인플루엔자 백신에 대한 온도 감수성과 백신 안정성을 입증한다.

표 14: 마취없이 1회 비강내 면역후 생쥐의 항체 반응

바이러스	반응자¹의 개체수	GMT³	공격접종후의 보호²
PR8/Sing ca-2/6	0/6	<4	5/6
PR8/Sing ca-△NS	4/6	6.7	5/6
PR8-wt	5/6	16.0	5/6

1 - 양성 HI 역가 > 1:4를 보이는 동물의 개체수

2 - 폐에서 바이러스가 검출되지 않은 동물의 개체수

3 - 혈청에서 항생제의 기하 평균 역가

PR8wt - 생쥐에 대하여 병원성인 인플루엔자 균주 A/PR/8/34 야생형(H1N1)

PR8/Sing ca-2/6 - 약독화된 인플루엔자 균주 A/Sing/1/57 ca와 PR8 wt 사이의 재조합체, PR8wt 바이러스로부터 2개의 유전자 및 A/Sing/1/57 ca로부터 모든 다른 유전자로 구성된다.

PR8/Sing-△NS는 PR8wt로부터 HA와 NA 유전자, A/Sing/1/57 ca로부터 5개의 유전자, NS1 코딩 서열이 결핍된 PR8 기원의 NS 유전자(NS1 결실 또는 적중)를 보유한다.

표 15: 마취하에 A/Singapore/1/57 바이러스의 상이한 변이체로 비강내 면역후 항체 반응과 보호

바이러스	반응자¹		2번의 면역후 GMT	공격접종후의 보호⁴
바이러스	1차 면역	2차 면역
A/Sing/1/57/wt va²	9/9	9/9	103.9	9/9
A/Sing/1/57/ca³	8/10	10/10	55.7	8/10
A/Sing/57/△NS 87	1/10	10/10	27.9	8/10

1 - 양성 HI 역가 > 1:4를 보이는 동물의 개체수

2 - va- Vero-적응성

3- ca- 저온-적응성

4 - 폐에서 바이러스가 검출되지 않은 동물의 개체수

표 16: 생쥐 폐^a에서 A/Singapore/1/57의 wt, va, ca 변이체의 재생

바이러스	감염후 생쥐 폐에서 바이러스 역가, PFU/㎖^b
	2일	4일	6일
A/Singapore/1/57/wt	1.6x10⁶	2.2x10⁵	1.4x10³
A/Singapore/1/57/wt va	2.5x10⁶	2.1x10⁶	1.0x10²
A/Singapore/1/57/ca	<10	<10	<10

^a 생쥐는 역가 1.0x10⁶ PFU/㎖를 갖는 50 ㎕ 바이러스 유체로 i.n. 감염시킨다.

^b MDCK 세포에서 적정된 10% 조직 현탁액의 PFU/㎖.

표 17: 흰족제비에 대한 A/Singapore/1/57 바이러스의 wt와 ca 변이체의 독력

바이러스	감염후 열병을 앓는 동물의 개체수
	1일	2일	3일
A/Singapore/1/57 wt	FFF	NNN	NNN
A/Singapore/1/57 ca	NNN	NNN	NNN

동물의 직장 온도는 일일 2회 기록하고 다음과 같이 특성화한다:

N - 38.1℃ 내지 39.9℃의 정상 온도

F - 40.0℃이상의 열병

각 군은 3마리씩 구성되는데, 이들은 에테르 마취하에 역가 2x10⁶ PFU/㎖를 갖는 1 ㎖ 바이러스 유체로 면역시켰다.

표 18: 생쥐 폐^a에서 A/Hong Kong/1035/98 wt와 A/Singapore/1/57/ca의 2/6 재조합체의 재생

바이러스	감염후 2-6일에 생쥐 폐에서 바이러스 역가, PFU/㎖^b
	2	4	6
A/Hong Kong/1035/98 wt H1N1	6.8x10⁴	2.0x10⁴	<10
A/Singapore/1/57/ca x A/Hong Kong/1035/98 wt	<10	<10	<10

^a 생쥐는 에테르 마취하에 50 ㎕ 바이러스 유체로 i.n. 감염시킨다.

^b Vero/SF 세포에서 적정된 10% 조직 현탁액의 PFU/㎖, 데이터는 6마리 생쥐에 대한 평균값으로 제시한다(각 동물의 폐는 개별적으로 처리한다).

상기 재조합체는 A/Hong Kong/1035/98 wt 야생형으로부터 HA와 NA 유전자 및 A/Singapore/1/57/ca로부터 다른 6개의 유전자를 보유한다.

표 19: 흰족제비에 대한 A/Vienna/47/96과 A/Singapore/1/57/ca의 6/2 재조합체의 독력

바이러스	바이러스 아형	열병을 앓는 동물의 개체수
바이러스	바이러스 아형	1일	2일	3일	비염^b
마스터 균주 A/Singapore/1/57/ ca	H2N2	NNN	NNN	NNN	±
전염성 바이러스 A/Vienna/47/96 wt	H3N2	NNN	FFF	FFF	+++
재조합 A/Singapore/1/57/ca x Vienna/47/96 wt	H3N2	NNN	NNN	NNN	±

생쥐는 에테르 마취하에 역가 2x10⁶ PFU/㎖를 갖는 1 ㎖ 바이러스로 i.n. 감염시킨다.

N - 38.1℃ 내지 39.9℃의 정상 온도

F - 40.0℃이상의 열병

^b +++ - 중증도 비염

±비염의 부재

표 16 내지 19에 제시된 결과는 약독화된 온도 감수성의 마스터 균주를 함유하는 백신, 또는 재조합의 경우에 약독화된 온도 감수성 마스터 균주의 "골격(6개 유전자)" 및 예로써 병원성 야생형 균주 A/Hong Kong/1035/98 wt의 HA와 NA 유전자로 구성되는 재조합된 바이러스에 기초한 백신의 안정성을 명확하게 입증한다.

표 20: B/Vienna/1/99의 Ts와 ca 표현형

바이러스	Vero 세포에서 PFU/㎖	MDCK 세포에서 PFU/㎖
바이러스	25℃	33℃	39℃
B/Vienna/1/99 wt	<300	4x10⁶	4x10⁵
B/Vienna/1/99 ca(BV22)	1x10⁶	2.4x10⁶	<20

표 21: B/Vienna/1/99 ca의 ts 표현형의 유전적 안정성

바이러스	MDCK 세포에서 PFU/㎖
바이러스	33℃	39℃
B/Vienna/1/99 wt	4x10⁶	4x10⁵
B/Vienna/1/99 ca (BV22)	2.4x10⁶	<20
33℃에서 5회 계대배양후 B/Vienna/1/99 ca (BV22)	8x10⁵	<20

균주 BV22는 Vero 세포에서 높은 MOI로 5회 계대배양하였다. 이후, ts-표현형은 한번 더 조절하였다. 상기 균주는 표 21에서 볼 수 있는 바와 같이 온도 감수성을 유지하였다.

표 22: 생쥐 폐에서 B/Vienna/1/99 ca와 wt의 독력

		감염후 PFU/㎖*
바이러스	장기	2일	3일	4일
B/Vienna/1/99 ca (BV22)	폐	<20	<20	<20
B/Vienna/1/99 ca (BV22)	코	1X10²	1X10²	20
B/Vienna/1/99 wt	폐	8X10⁴	7X10³	4.4X10³
B/Vienna/1/99 wt	코	3.8X10⁴	3.4X10⁴	1.4X10⁴

** 균주당 9마리의 생쥐는 에테르 마취하에 10⁵ PFU로 비강 면역한다. 감염후 지정된 날짜에 군당 3마리의 생쥐를 죽인다. 폐와 비갑개(nasal turbinate)는 PBS def에 용해된 10%(w/v) 현탁액에 균질화시킨다. 현탁액의 플라크 분석을 실시한다.

상기 데이터는 ca 마스터 균주 후보 BV22의 절제된 재생이 비강 점막에서는 가능한 반면 폐에서는 상기 바이러스의 ts 특성이 재생을 차단한다는 것을 보여준다.

표 23: 재조합 인플루엔자 B 균주의 Ts와 ca 표현형

바이러스	MDCK 세포에서 PFU/㎖
바이러스	33℃	39℃
B/Vienna/1/99 wt	4x10⁶	4x10⁵
B/USSR/69 wt	1.6x10⁶	4x10⁴
B/Vienna/1/99 ca(BV22)	1.4x10⁶	<20
BV22 x B/USSR/69(9/2)	8x10⁶	<20

야생형 인플루엔자 균주 B/USSR/69 wt의 HA와 NA 및 B/Vienna/1/99 ca(BV22)를 보유하는 6/2 재조합 균주가 확립되었다. 헤마글루티닌의 기원은 HI-분석으로, 모든 다른 게놈 분절은 RT-PCT 및 당분야에 공지된 방법을 이용한 제한 분석으로 검사하였다.

표 24: 생쥐 폐에서 재조합 인플루엔자 B 균주의 독력

		감염후 PFU/㎖*
바이러스	장기	2일	3일	4일
B/Vienna/1/99 ca (BV22)	폐	<20	<20	<20
B/Vienna/1/99 ca (BV22)	코	<20	1X10²	40
B/USSR/69 wt	폐	1.8X10⁵	4X10⁵	2.4X10⁴
B/USSR/69 wt	코	1.6X10⁵	2X10⁵	1.6X10⁵
BV22 x B/USSR/69 wt(6/2)	폐	<20	<20	<20
BV22 x B/USSR/69 wt(6/2)	코	2.8X10³	2X10³	4X10²

* 균주당 9마리의 생쥐는 에테르 마취하에 10⁵ PFU로 비강 면역한다. 감염후 지정된 날짜에 군당 3마리의 생쥐를 죽인다. 폐와 비갑개(nasal turbinate)는 PBS def에 용해된 10%(w/v) 현탁액에 균질화시킨다. 현탁액의 플라크 분석을 실시한다.

실시예 6: 임상 연구

다음의 백신(비강 스프레이 형태)은 본 발명에 따라 비강내 전달용으로 만들었다. ㎖당 조성(동결-건조된 재료의 재구성이후):

(1) 위약: 2x SF-배지, 40 mM HEPES 완충액, 8% 락트알부민 효소적 가수분해물, 4% 트레할로스;

(2) Vero-Vac H1: 4.3x10⁷ TCID₅₀의 A/Singapore/1/57/ca와 A/Hong Kong/1035/98의 6/2 재조합체; 2x 배양 상층액, 40 mM HEPES 완충액, 8% 락트알부민 효소적 가수분해물, 4% 트레할로스를 함유하는 A/Beijing/262/95(H1N1)-동류 제형;

(3) Vero Vac H3: 2.1x10⁷ TCID₅₀의 A/Singapore/1/57/ca와 A/SW/7729/98의 6/2 재조합체; 2x 배양 상층액, 40 mM HEPES 완충액, 8% 락트알부민 효소적 가수분해물, 4% 트레할로스를 함유하는 A/Sidney/5/97(H3N2)-동류 제형;

(4) 러시아 3가(trivalent) 백신(성인용 인플루엔자 생균 백신):

A/17/Beijing/95/25(H1N1) 1.1x10⁸ EID₅₀

A/17/Sidney/97/76(H3N2) 2.3x10⁷ EID₅₀

B/60/Petersburg/95/20 1.1x10⁷ EID50

(5) 1가 Vero 백신 BV22: 2x10⁶ TCID₅₀의 마스터 균주 후보 B/Vienna/1/99ca(=BV22); 2x 배양 상층액, 40 mM HEPES 완충액, 8% 락트알부민 효소적 가수분해물, 4% 트레할로스를 함유하는 B/Beijing/184/93-동류 제형

상기 백신은 각 백신접종(vaccination) 군당 13명의 지원자에게 투여하였다. 550 ㎕ 재구성된 백신(또는 위약)은 0일에 각 환자에 비강내 투여하고 22 ±1일에 2차로 투여한다. 결과는 하기 표 25에 요약한다.

안정성 결과:

일차와 이차 백신접종후 5일동안 부작용(AE) 발생건수는 9건의 경등도와 4건의 중등도 AE를 비롯하여 14건이었다. 1명의 지원자는 임의의 국소적 또는 전신적 증상없이, 일차 백신접종후 3시간이내에 체온이 최대 38.8℃로 상승한 것을 비롯한 중증도 AE를 보였다. 이후 4시간동안 체온은 정상으로 회복되었다. 일차 백신접종후, 7건의 AE가 관찰되었다. 이들 중 1건은 국소 증상이었고, 6건은 전신 증상이었다. 이차 백신접종후 2건의 국소 AE와 5건의 전신 AE가 관찰되었다.

안정성의 측면에서, 위약을 복용한 군을 비롯한 연구 군간에 유의성있는 차이는 관찰되지 않았다. 전술한 1명을 제외하고 백신접종과 관련된 심각한 AE는 관찰되지 않았다. 중등도 AE중 2건은 H3N2 군(한 지원자에서 3일째에 최대 37.6℃까지 온도 상승과 급성 인두염; 다른 지원자에서 비폐색, 22일-24일간 인후에서 불편함, 최대 37.5℃까지 온도 상승)에서, 1건은 H1N1 군(인후에 통증, 22일-26일간 비염, 22일-24일간 최대 37-37.8℃까지 온도 상승)에서 발생하였다.

표 25: Vero Vac 백신 및 3가 러시아 저온-적응된 난 유래된 백신의 혈청인자음성(seronegative) 지원자에 대한 반응

번호	면역화 백신	바이러스 용량, TCID₅₀/㎖ 또는 EID₅₀/㎖	지원자 수	항원에 대한 HAI 항체 역가가 4배이상 증가된 환자 %
번호	면역화 백신	바이러스 용량, TCID₅₀/㎖ 또는 EID₅₀/㎖	지원자 수	H1N1	H3N2	B
1	위약		13		(8)
2	Vero Vac H1 (H1N1)	4.3x10⁷	13	38
3	Vero Vac H3 (H3N2)	2.1x10⁷	13		67
4	러시아 3가 백신: A/17/Beijing/95/25(H1N1) A/17/Sidney/97/76(H3N2) B/60/Petersburg/95/20	1.1x10⁸ 2.3x10⁷ 1.1x10⁷	13	46	8	31
5	Vero 백신 BV22	2X10⁶	13			33

(8) 환자는 연구 과정동안 자발적인 감염이 발생하였다.

이런 임상 연구 결과는 본 발명의 바람직한 인플루엔자 A와 B 마스터 균주 후보를 이용하여 본 발명에 따라 만들어진 백신의 뛰어난 안정성을 입증한다.

표 26: 로스 알라모스 국립도서관 인플루엔자 데이터베이스(db)(Web-address: www.flu.lanl.gov)에 따른 B/Vienna/1/99 wt의 특성화

B/Vienna/1/99 wt 유전자 코딩	아미노산 서열 번호	뉴클레오티드 서열 번호	비고
PB2, 분절 1	ISDACH017	ISDACHB017	db에 분절 2로 기재
PB1, 분절 2	ISDACH016	ISDACHB016	db에 분절 1로 기재
PA, 분절 3	ISDACH015	ISDACHB015
HA, 분절 4	ISDACH018	ISDACHB018
NP, 분절 5	ISDACH013	ISDACHB013
NA, 분절 6	ISDACH012	ISDACHB012
M, 분절 7	ISDACH011	ISDACHB011
NS, 분절 8	ISDACH014	ISDACHB014

도 1 은 Vero 세포 배양액의 상층액에서 트립신 불활화의 시간 과정을 그래프로 도시한다.

도 2 는 MDCK 세포 배양액의 상층액에서 트립신 불활화의 시간 과정을 그래프로 도시한다.

SEQUENCE LISTING <110> Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH Katinger, Hermann Katinger, Dietmar Romanova, Julia Egorov, Andrej Ferko, Boris <120> INFLUENZA VACCINE AND METHOD OF MANUFACTURE <130> BEP-4847-PC (Influenza Vaccine) <140> <141> <160> 37 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2341 <212> DNA <213> Influenza virus A/Singapore/1/57/ca <400> 1 agcaaaagca ggtcaattat attcaatatg gaaagaataa aagaactacg gaatctgatg 60 tcgcagtctc gcactcgcga gatactaaca aaaaccacag tggaccatat ggccataatt 120 aagaagtaca catcagggag acaggaaaag aacccgtcac ttaggatgaa atggatgatg 180 gcaatgaaat atccgattac agctgacaag aggataacag aaatgattcc tgagagaaat 240 gagcaagggc agactctatg gagtaaaatg aatgatgccg gatcggatcg agtgatggta 300 tcacctctgg ctgtgacatg gtggaataga aatggaccaa tgacaagtac ggttcattat 360 ccaaaaatct acaaaactta ttttgagaaa gtcgaaaggt taaaacatgg aacctttggc 420 cctgtccatt ttagaaacca agtcaaaata cgccgaagag ttgacataaa tcctggtcat 480 gcagacctca gtgccaagga ggcacaggat gtaatcatgg aagttgtttt ccctaacgaa 540 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cattcttgag aagacccata acggaaagtt atgcaaacta aacggaatcc ctccacttga 240 actaggggac tgtagcattg ccggatggct ccttggaaat ccagaatgtg ataggcttct 300 aagtgtgcca gaatggtcct atataatgga gaaagaaaac ccgagagacg gtttgtgtta 360 tccaggcagc ttcaatgatt atgaagaatt gaaacatctc ctcagcagcg tgaaacattt 420 cgagaaagta aagattctgc ccaaagatag atggacacag catacaacaa ctggaggttc 480 acgggcctgc gcggtgtctg gtaatccatc attcttcagg aacatggtct ggctgacaaa 540 gaaagaatca aattatccgg ttgccaaagg atcgtacaac aatacaagcg gagaacaaat 600 gctaataatt tggggggtgc accatcccaa tgatgagaca gaacaaagaa cattgtacca 660 gaatgtggga acctatgttt ccgtaggcac atcaacattg aacaaaaggt caaccccaga 720 catagcaaca aggcctaaag tgaatggact aggaagtaga atggaattct cttggaccct 780 attggatatg tgggacacca taaattttga gagtactggt aatctaattg caccagagta 840 tggattcaaa atatcgaaaa gaggtaattc agggatcatg aaaacagaag gaacacttga 900 gaactgtgag accaaatgcc aaactccttt gggagcaata aatacaacat tgccttttca 960 caatgtccac ccactgacaa taggtgagtg ccccaaatat gtaaaatcgg agaagttggt 1020 cttagcaaca 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ggctcaggac aactgctatg ggacactgtc acaggtgtta 1440 atatggctct gtaatggagg aatggttgag tctgttctaa accctttgtt cctattttgt 1500 ttgaacaatt gtccttactg aacttaattg tttctgaaaa atgctcttgt tactact 1557 <210> 25 <211> 1190 <212> DNA <213> Influenza B/Vienna/1/99/ca <400> 25 agcagaagca cgcactttct taagatgtcg ctgtttggag acacaattgc ctacctgctt 60 tcattgacag aagatggaga aggcaaagca gaactagcag aaaaattaca ctgttggttc 120 ggtgggaaag aatttgacct agactctgcc ttggaatgga taaaaaacaa aagatgctta 180 actgatatac aaaaagcact aattggtgcc tctatctgct ttttaaaacc caaagaccag 240 gaaagaaaaa gaagattcat cacagagccc ctatcaggaa tgggaacaac agcaacaaaa 300 aagaaaggcc tgattctagc tgagagaaaa atgagaagat gtgtgagctt tcatgaagca 360 tttgaaatag cagaaggcca tgaaagctca gcgctactat attgtctcat ggtcatgtac 420 ctgaatcctg gaaattattc aatgcaagta aaactaggaa cgctctgtgc tttgtgcgag 480 aaacaagcat cacattcaca cagggctcat agcagagcag cgagatcttc agtgcccgga 540 gtgagacgag aaatgcagat ggtctcagct atgaacacag caaaaacaat gaatggaatg 600 ggaaaaggag aagacgtcca aaaactggca 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80 Gly Val Asp Ile Pro Ala Phe Ile Leu Pro Gly Leu Asn Leu Ser Glu 85 90 95 Ser Thr Pro Asn 100 <210> 33 <211> 466 <212> PRT <213> Influenza B/Vienna/1/99/ca <400> 33 Met Leu Pro Ser Thr Ile Gln Thr Leu Thr Leu Phe Leu Thr Ser Gly 1 5 10 15 Gly Val Leu Leu Ser Leu Tyr Val Ser Ala Ser Leu Ser Tyr Leu Leu 20 25 30 Tyr Ser Asp Ile Leu Leu Lys Phe Ser Pro Thr Glu Ile Thr Ala Pro 35 40 45 Thr Met Pro Leu Asp Cys Ala Asn Ala Ser Asn Val Gln Ala Val Asn 50 55 60 Arg Ser Ala Thr Lys Gly Val Thr Leu Leu Leu Pro Glu Pro Glu Trp 65 70 75 80 Thr Tyr Pro Arg Leu Ser Cys Pro Gly Ser Thr Phe Gln Lys Ala Leu 85 90 95 Leu Ile Ser Pro His Arg Phe Gly Glu Thr Lys Gly Asn Ser Ala Pro 100 105 110 Leu Ile Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ala Cys Gly Pro Lys Glu Cys Lys 115 120 125 His Phe Ala Leu Thr His Tyr Ala Ala Gln Pro Gly Gly Tyr Tyr Asn 130 135 140 Gly Thr Arg Glu Asp Arg Asn Lys Leu Arg His Leu Ile Ser Val Lys 145 150 155 160 Leu Gly Lys Ile Pro Thr Val Glu Asn Ser Ile Phe His Met Ala Ala 165 170 175 Trp Ser Gly Ser Ala Cys His Asp Gly Lys Glu Trp Thr Tyr Ile Gly 180 185 190 Val Asp Gly Pro Asp Ser Asn Ala Leu Leu Lys Ile Lys Tyr Gly Glu 195 200 205 Ala Tyr Thr Asp Thr Tyr His Ser Tyr Ala Asn Asn Ile Leu Arg Thr 210 215 220 Gln Glu Ser Ala Cys Asn Cys Ile Gly Gly Asn Cys Tyr Leu Met Ile 225 230 235 240 Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Ile Ser Glu Cys Arg Phe Leu Lys Ile 245 250 255 Gln Glu Gly Arg Ile Ile Lys Glu Ile Phe Pro Thr Gly Arg Val Glu 260 265 270 His Thr Glu Glu Cys Thr Cys Gly Phe Ala Ser Asn Lys Thr Ile Glu 275 280 285 Cys Ala Cys Arg Asp Asn Ser Tyr Thr Ala Lys Arg Pro Phe Val Lys 290 295 300 Leu Asn Val Glu Thr Asp Thr Ala Glu Ile Arg Leu Met Cys Thr Glu 305 310 315 320 Thr Tyr Leu Asp Thr Pro Arg Pro Asp Asp Gly Ser Ile Thr Gly Pro 325 330 335 Cys Glu Ser Asn Gly Asp Lys Gly Ser Gly Gly Ile Lys Gly Gly Phe 340 345 350 Val His Gln Arg Met Ala Ser Lys Thr Gly Arg Trp Tyr Ser Arg Thr 355 360 365 Met Ser Lys Thr Lys Arg Met Gly Met Gly Leu Tyr Val Lys Tyr Asp 370 375 380 Gly Asp Pro Trp Thr Asp Ser Asp Ala Leu Ala Leu Ser Gly Val Met 385 390 395 400 Val Ser Met Glu Glu Pro Gly Trp Tyr Ser Phe Gly Phe Glu Ile Lys 405 410 415 Asp Lys Lys Cys Asp Val Pro Cys Ile Gly Ile Glu Met Val His Asp 420 425 430 Gly Gly Lys Glu Thr Trp His Ser Ala Ala Thr Ala Ile Tyr Cys Leu 435 440 445 Met Gly Ser Gly Gln Leu Leu Trp Asp Thr Val Thr Gly Val Asn Met 450 455 460 Ala Leu 465 <210> 34 <211> 248 <212> PRT <213> Influenza B/Vienna/1/99/ca <400> 34 Met Ser Leu Phe Gly Asp Thr Ile Ala Tyr Leu Leu Ser Leu Thr Glu 1 5 10 15 Asp Gly Glu Gly Lys Ala Glu Leu Ala Glu Lys Leu His Cys Trp Phe 20 25 30 Gly Gly Lys Glu Phe Asp Leu Asp Ser Ala Leu Glu Trp Ile Lys Asn 35 40 45 Lys Arg Cys Leu Thr Asp Ile Gln Lys Ala Leu Ile Gly Ala Ser Ile 50 55 60 Cys Phe Leu Lys Pro Lys Asp Gln Glu Arg Lys Arg Arg Phe Ile Thr 65 70 75 80 Glu Pro Leu Ser Gly Met Gly Thr Thr Ala Thr Lys Lys Lys Gly Leu 85 90 95 Ile Leu Ala Glu Arg Lys Met Arg Arg Cys Val Ser Phe His Glu Ala 100 105 110 Phe Glu Ile Ala Glu Gly His Glu Ser Ser Ala Leu Leu Tyr Cys Leu 115 120 125 Met Val Met Tyr Leu Asn Pro Gly Asn Tyr Ser Met Gln Val Lys Leu 130 135 140 Gly Thr Leu Cys Ala Leu Cys Glu Lys Gln Ala Ser His Ser His Arg 145 150 155 160 Ala His Ser Arg Ala Ala Arg Ser Ser Val Pro Gly Val Arg Arg Glu 165 170 175 Met Gln Met Val Ser Ala Met Asn Thr Ala Lys Thr Met Asn Gly Met 180 185 190 Gly Lys Gly Glu Asp Val Gln Lys Leu Ala Glu Glu Leu Gln Ser Asn 195 200 205 Ile Gly Val Leu Arg Ser Leu Gly Ala Ser Gln Lys Asn Gly Glu Gly 210 215 220 Ile Ala Lys Asp Val Met Glu Val Leu Lys Gln Ser Ser Met Gly Asn 225 230 235 240 Ser Ala Leu Val Lys Lys Tyr Leu 245 <210> 35 <211> 109 <212> PRT <213> Influenza B/Vienna/1/99/ca <400> 35 Met Leu Glu Pro Phe Gln Ile Leu Ser Ile Cys Ser Phe Ile Leu Ser 1 5 10 15 Ala Leu His Phe Val Ala Trp Thr Ile Gly His Leu Asn Gln Ile Lys 20 25 30 Arg Gly Val Asn Met Lys Ile Arg Ile Lys Ser Pro Asn Lys Glu Thr 35 40 45 Ile Asn Arg Glu Val Ser Ile Leu Arg His Ser Tyr Gln Lys Glu Ile 50 55 60 Gln Ala Lys Glu Thr Met Lys Glu Val Leu Ser Asp Asn Met Glu Val 65 70 75 80 Leu Gly Asp His Ile Val Ile Glu Gly Leu Ser Ala Glu Glu Ile Ile 85 90 95 Lys Met Gly Glu Thr Val Leu Glu Ile Glu Glu Leu His 100 105 <210> 36 <211> 281 <212> PRT <213> Influenza B/Vienna/1/99/ca <400> 36 Met Ala Asn Asn Ile Thr Thr Thr Gln Ile Glu Val Gly Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Asn Ala Thr Ile Asn Phe Glu Thr Gly Ile Leu Glu Cys Tyr Glu 20 25 30 Arg Leu Ser Trp Gln Arg Ala Leu Asp Tyr Pro Gly Gln Asp Arg Leu 35 40 45 Asn Arg Leu Lys Arg Lys Leu Glu Ser Arg Ile Lys Thr His Asn Lys 50 55 60 Ser Glu Pro Glu Ser Lys Arg Met Ser Leu Glu Glu Arg Lys Ala Ile 65 70 75 80 Gly Val Lys Met Met Lys Val Leu Leu Phe Met Asn Pro Ser Ala Gly 85 90 95 Ile Glu Gly Phe Glu Pro Tyr Tyr Met Lys Ser Ser Ser Asn Ser Asn 100 105 110 Cys Pro Lys Tyr Asn Trp Thr Asp Tyr Pro Ser Thr Pro Gly Arg Cys 115 120 125 Leu Asp Asp Ile Glu Glu Glu Pro Glu Asp Val Asp Gly Pro Thr Glu 130 135 140 Ile Val Leu Arg Asp Met Asn Asn Lys Asp Ala Arg Gln Lys Ile Lys 145 150 155 160 Glu Glu Val Asn Thr Gln Lys Glu Gly Lys Phe Arg Leu Thr Ile Lys 165 170 175 Arg Asp Ile Arg Asn Val Leu Ser Leu Arg Val Leu Val Asn Gly Thr 180 185 190 Phe Leu Lys His Pro Asn Gly Tyr Lys Ser Leu Ser Thr Leu His Arg 195 200 205 Leu Asn Ala Tyr Asp Gln Ser Gly Arg Leu Val Ala Lys Leu Val Ala 210 215 220 Thr Asp Asp Leu Thr Val Glu Asp Glu Glu Asp Gly His Arg Ile Leu 225 230 235 240 Asn Ser Leu Phe Glu Arg Leu Asn Glu Gly His Ser Lys Pro Ile Arg 245 250 255 Ala Ala Glu Thr Ala Val Gly Val Leu Ser Gln Phe Gly Gln Glu His 260 265 270 Arg Leu Ser Pro Glu Glu Gly Asp Asn 275 280 <210> 37 <211> 122 <212> PRT <213> Influenza B/Vienna/1/99/ca <400> 37 Met Ala Asn Asn Ile Thr Thr Thr Gln Ile Glu Trp Arg Met Lys Lys 1 5 10 15 Met Ala Ile Gly Ser Ser Thr His Ser Ser Ser Val Leu Met Lys Asp 20 25 30 Ile Gln Ser Gln Phe Glu Gln Leu Lys Leu Arg Trp Glu Ser Tyr Pro 35 40 45 Asn Leu Val Lys Ser Thr Asp Tyr His Gln Lys Arg Glu Thr Ile Lys 50 55 60 Leu Val Thr Glu Glu Leu Tyr Leu Leu Ser Lys Arg Ile Asp Asp Asn 65 70 75 80 Ile Leu Phe His Lys Thr Val Ile Ala Asn Ser Ser Ile Ile Ala Asp 85 90 95 Met Val Val Ser Leu Ser Leu Leu Glu Thr Leu Tyr Glu Met Lys Asp 100 105 110 Val Val Glu Val Tyr Ser Arg Gln Cys Leu 115 120

Claims

약독화된 인플루엔자 생균 백신 형태의 온전한(whole)-바이러스 백신에 있어서,

백신은 균주 A/Sing/1/57ca, A/Sing/1/57ca/△NS87, A/Sing/1/57ca/△NSPR8, A/Sing/1/57ca/NS124PR8, B/Vienna/1/99ca, B/Vienna/1/99/ca37 및 재조합체(reassortant)에서 선택된 최소 한 가지 인플루엔자 바이러스로 구성되고, 재조합체는 HA와 뉴라미니다제(NA)이외의 단백질을 인코드하는 5개 또는 6개 인플루엔자 게놈 단편을 기본골격(backbone)으로 구성되는 것을 특징으로 하는 약독화된 인플루엔자 생균 백신 형태의 온전한(whole)-바이러스 백신.
제 1 항에 있어서, 백신은 선택적으로 병아리 적혈구에 교착하지 않으며 사람 적혈구에 교착하는 것을 특징으로 하는 백신.
제 1 항에 있어서, 기본 골격은 다섯개의 게놈 단편으로 구성된 것을 특징으로 하는 백신.
제 1 항에 있어서, 기본 골격은 여섯개의 게놈 단편으로 구성된 것을 특징으로 하는 백신.
제 1 항에 있어서, 백신은 Vero 세포에 바이러스 균주를 접종하고, 프로테아제 및 뉴클레아제를 포함하는 무혈청 및 무단백질 세포 배양 배지에서 접종된 Vero 세포를 배양하고, 원심분리 또는 여과를 이용하여 세포 배양 배지로부터 바이러스를 포함하는 상층액을 회수하여 수득된 Vero-세포 적응된 바이러스를 포함하는 세포 배양 상층액으로 구성되고,

이때 상층액에 포함된 Vero-세포 적응된 바이러스는 HA의 핵산 서열 또는 이의 항원 성질에 대해 접종에 이용되는 바이러스와 동일하며,

즉시 사용할 수 있는 형태의 온전한 바이러스는 회수 단계의 바이러스 포함 상층액으로 구성되며,

접종에 이용된 인플루엔자 바이러스는 균주, 변이체, 재조합체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 백신.
제 5 항에 있어서, Vero 세포 적응된 바이러스는 NA 유전자의 핵산 서열에 대해 접종시에 이용된 바이러스와 동일한 것을 특징으로 하는 백신.
제 5 항에 있어서, 바이러스를 포함하는 상층액을 추가로 농축시키거나 또는 동결 건조시키고 재구성된 것을 특징으로 하는 백신.
제 5 항에 있어서, 바이러스를 포함하는 상층액에 보존제, 동결 건조에 대한 안정제, 멸균수에서 선택된 최소 한 가지 첨가제를 보충시키는 것을 특징으로 하는 백신.
제 1항 또는 제 5 항에 있어서, 비강내 투여에 적합한 액체 형인 것을 특징으로 하는 백신.
제 1항 또는 제 5 항에 있어서, 바이러스 감염에 대한 예방적 또는 치료적 투여에 사용되는 것을 특징으로 하는 백신.