KR20070108535A - 폴리펩티드와 5당류의 접합체 - Google Patents

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KR20070108535A
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미르티너스 얀 스미트
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Abstract

본 발명은 폴리펩티드와 올리고당의 접합체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것으로, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 올리고당-스페이서 잔기에 접합되며, 상기 올리고당은 4∼18개의 단당류 단위를 포함하고 그 자체로 항트로빈 III에 대한 친화성을 갖는 합성 황산화 올리고당이며 상기 스페이서는 결합이거나 필수적으로 약리학적 불활성의 연성 연결 잔기이다.
본 발명의 접합체는 본래 폴리펩티드(즉, 원래의 비-접합 폴리펩티드에 상응함)와 비교하여 개선된 약동리학적 특성을 갖는다.
접합체, 혈액, 응고, 올리고당

Description

폴리펩티드와 5당류의 접합체{CONJUGATES OF A POLYPEPTIDE AND A PENTASACCHARIDE}
본 발명은 폴리펩티드와 올리고당의 신규 접합체, 이의 제조 방법, 활성 성분으로 상기 화합물을 함유하는 약학 조성물, 및 약물 제조용으로서의 상기 화합물의 용도에 관한 것이다.
최근 재조합 DNA 기술의 발전 및 펩티드 합성 방법의 진보로 인하여 치료성 펩티드를 의학적으로 유용한 분량으로 대량 생산하는 것이 가능하게 되었다. 그러나, 다수의 치료성 펩티드의 반감기가 짧음으로 인해서 지금까지 사실적으로 이들 화합물의 투여는 어려움에 직면해 있는 실정이다. 현재 사용되고 있는 몇몇 중요한 폴리펩티드계 약물 중에는 반감기를 증가시키는 것이 이득이 될 수 있는 것들이 존재한다. 예를 들어서, (유의적으로) 수 시간 이하의 반감기를 갖는, 에리트로포이어틴, 인슐린, 인터페론 α-2b, 인터페론 β, 인터페론 γ, 그래뉼로사이트 콜로니 자극 인자, 인간 성장 호르몬, 그래뉼로사이트 마크로파지 콜로니 자극 인자, 릴랙신, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성 인자, 칼시토닌, 인터루킨-2 및 종양 괴사 인자 등이 있다. 예를 들어, 인슐린은 인간 내에서 반감기가 경우 약 12분이다. 기타 강력한 치료 제제로 개발되었으나 짧은 반감기로 문제가 되 는 폴리펩티드의 예로는 아드레노메듈린, 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1) 및 키스펩틴(메타스틴) 등이 있다. 치료성 폴리펩티드의 반감기를 연장시킴으로써 투약 용량 및 투약 빈도를 줄여서 현행 치료법을 개선시킬 수 있다(Curr.Opin.Drug Disc.Dev. 2005, 8, 590-600).
많은 단백질들에 대하여 생체내 반감기를 연장시키기 위한 목적으로 예를 들어, PEG화 변형 등을 적용(즉, ~1 내지 30 kDa 폴리에틸렌 글리콜-부분을 접합시킴; Drug Discovery Today 2005, 10, 1451-1458)하는 연구가 이미 수행되어 왔다. 예컨대 반감기를 연장시킨 인슐린의 PET화 유사체가 현재 이용가능하다. 제거율이 감소되는 것뿐만 아니라, 상기 인슐린 유도체의 중요한 측면은 면역원성이 감소되고(예를 들어, 미국특허 제4,179,337호 참조) 가용성이 감소한다는 점이다. 또한, PET화 인슐린의 개발로 인해서 천연 인슐린에 비하여 물리적으로 그리고 단백질 분해적으로 보다 안정한 접합체를 얻었다(예컨대, 국제공개특허 제2004/091494호, 국제공개특허 제2002/098232호, 미국특허 제2005/0152848호 등을 참조).
혈청 반감기가 길어진 PET화 에리트로포이어틴은 예를 들어 국제공개특허 제2004/022577호에 개시되어 있다. 에리트로포이어틴의 글리코실화를 변경시켜서 반감기를 증가시킬 수 있다는 것이 더욱 밝혀졌다. 또한, 에리트로포이어틴의 과글리코실화 유사체가 생체내에서의 활성이 보다 높은 것으로 보고되었다(국제공개특허 제2000/24893호). 작용기간이 길어진 PEG화 (폴리)펩티드의 기타 예로는 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1)(국제공개특허 제2005/058954호, 국제공개특허 제2004/093823호; Bio접합체 Chem. 2005, 16, 377-382; Biomaterials, 2005, 26, 3597-3606), 글 루코스-의존성 인슐린분비성 폴리펩티드(GIP)(Bioorg.Med.Chem.Lett., 2005, 15, 4114-4117), 칼시토닌(Pharm.Dev.Technol. 1999, 4, 269-275) 및 옥트레오티드(Pharm.Res. 2005, 22, 743-749) 등이 있다.
그러나, 여전히 PEG 사용은 제한적이다. PEG는 화학 합성으로 얻어지는데, 다른 합성 중합체와 유사하게, 다분산성이다. 이는 PET 뱃치들이 상이한 수의 단량체를 갖는 분자로 이루어져서 그 결과 분자량 분포가 가우스 분포가 된다는 것을 의미한다. 폴리펩티드가 PET화된 경우, 이는 상이한 생물학적 특성, 구체적으로 반감기 및 면역원성이 다를 수 있는 접합체 수집물이 되어 버린다. 따라서 PET화 폴리펩티드의 약리학적 활성의 재현성이 이 기술의 심각한 결점이 될 수 있다. 또한, 알려진 바에 의하면 단백질의 PEG화로 인해 종종 생물학적 활성 손실이 수반된다는 것이다. 게다가, PEG의 사용은 신체 배출과 관련된 문제를 야기할 수 있다. 고분자량 PEG는 간에 축적될 수 있으며, 이는 거대분자 증후군을 야기한다. 결과적으로, 약물의 PEG화는 많은 주의를 기울여 수행해야한다.
다당류, 구체적으로 폴리시알산 사슬을 통한 폴리펩티드 유도화를 통해서도 PEG화와 유사한 결과가 얻어졌다(예를 들어, 국제공개특허 제92/22331호 및 국제공개특허 제2001/87922호 참조). 일본공개특허 제02/231077호에는, 헤파린-수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 접합체가 개시되어 있다. 바람직하게, 다수의 헤파린 분자를 SOD에 부착시켜서 효소 활성의 약 90%를 유지하면서 천연 SOD보다 반감기가 증강된 접합체를 얻었다.
기타 반감기가 증강된 폴리펩티드의 접합체의 예로는 순환 혈청 알부민에 결 합하는 GLP(Bioorg.Med.Chem.Lett., 2004, 14, 4395-4398) 또는 인슐린의 접합 유도체(국제공개특허 제2003/013573호, 국제공개특허 제05/012346호)를 들 수 있다. 이들 화합물들에서 혈청 알부민과의 결합은 구체적으로 인간 혈청 알부민과의 접합체 내 결합 부분의 소수성 상호작용에 기초한다. 상기 부분의 소수성이 높을수록, 인간 혈청 알부민에 대한 결합 친화성도 강해진다. 광범위한 결합 부분이 적합하지만, 이러한 접합체의 결점은 인간 혈청 알부민과 접합체의 상호작용 선택성 및 친화성이 낮아서 그 결과 약동력적 양태에 대한 예측성이 극히 낮다는 것이다. 다르게는, 인간 인슐린 유전자를 인간 혈청 알부민 유전자와 융합시켜서, 피하 투여 후 장기간 동안 혈액 글루코스 농도를 감소시키는 활성을 지속시키는 인슐린을 얻을 수 있었다(Duttaroy 등, Diabetes 2005, 54, 251-258). 그러나, 이 경우 상기 융합 폴리펩티드는 이의 생체이용률 뿐만 아니라 표적 수용체에 대한 결합 친화성도 저하되었다.
또한, 국제공개특허 제2000/40253호에는 예컨대 펩티드 구체적으로 글리코스아미노글리칸 사슬의 접합체가 개시되어 있는데, 이는 합성 프로테오글리칸으로 간주된다. 이들 접합체에서 접합된 글리코스아미노글리칸의 약리학적 활성은 접합체의 치료적 활성에 상당한 영향을 준다. 또한, 약학적 활성 화합물의 가용성을 증가시키기 위하여 올리고당을 부착시킨 경우도 있다(국제공개특허 제2004/03971호).
본 발명은 반감기가 증가된 신규한 폴리펩티드 접합체, 즉, 폴리펩티드와 올리고당의 접합체, 또는 이의 약학적 허용 염에 관한 것으로, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 합성 황산화 올리고당-스페이서 잔기에 접합되며, 상기 올리고당은 4∼18 단당류 단위를 포함하고 그 자체로 항트롬빈 III에 대한 친화성을 가지며, 상기 스페이서는 결합이거나 필수적으로 약리학적 불활성의 연성 연결 잔기이다. 바람직한 올리고당은 4∼6개의 단당류 단위로 이루어지며 특히 바람직하게는 5당류이다. 본 발명의 접합체는 본래 폴리펩티드(즉, 원래의 비접합 폴리펩티드에 상응함)와 비교하여 개선된 약력학적 특성을 가지며 따라서 개선된 약리학적 특성을 갖는다.
본 발명은 또한 폴리펩티드를 포함하며 무시할정도로 미미한 항혈전성 활성을 보유한 치료학적 활성 접합체의 제조 방법을 기초로 한 신규 기술에 관한 것으로, 이는 그 자체로 항트롬빈 III(ATIII)에 대한 친화성을 갖는 합성 황산화 올리고당, 구체적으로 결합 또는 필수적으로 약리학적 불활성의 연성 연결 잔기를 통하여 5당류를 폴리펩티드와 공유 결합시키는 단계를 포함한다.
ATIII은 세린 프로테아제 억제제로, 혈장에 존재하며, 귀환회로(feed back loop)를 제공하기 위하여 응고 캐스케이드를 방해한다. 황산화 5당류는 필수적으로 ATIII에 대한 친화성을 기초로 한다(예컨대, 문헌 [F.Paolucci et al. Clin.Pharmacokinet., 2002; 41 Suppl. 2:11-18). 본 발명의 접합체는 본래 폴리펩티드의 반감기에 비하여 혈청 반감기가 증가하는데 접합체의 반감기는 대부분 5당류의 반감기에 의한 것이다. 또한, 본 발명의 접합체는 보다 긴 반감기를 가질뿐만 아니라 접합체의 5당류 부분과 ATIII 사이의 특정 상호작용(이 상호작용은 예컨대 [Westerduin et al. Bioorg.Med.Chem., 1994, 1267-1280; van Amsterdam et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1995; 15:495-503] 등에 기술되어 있다)을 기초로 조율가능한 약력학적 특성을 갖는다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 올리고당-폴리펩티드 접합체(상기 올리고당은 구체적으로 4∼6 단당류 단위로 이루어지며 보다 구체적으로는 5당류임)는 혈장 순환 농도가 ≤ 50 nM이다. 상기 최대 농도에서 올리고당(구체적으로 5당류)의 ATIII-매개 항응고 활성은 구체적으로 출혈 위험성면에 있어서는 유의하지 않다(예컨대, [(1) F. Donat et al., Clin. Pharmacokinet. 2002; 41 Suppl. 2: 1-9; (2) S. J. Keam et al. Drugs 2002; 62 (11):1673-1685 및 (3) The Rembrandt Investigators Circulation 2000; 102: 2726-2731] 참조).
본 발명의 구체예에 따르면, 상기 접합체에서 사용하는 올리고당(구체적으로 4∼6개의 단당류 단위로 이루어지고 보다 구체적으로는 5당류)은 폴리펩티드 자체의 약리학적 활성과 비교하여 그 자체로 치료적 수준 이하의 항응고 활성을 갖는다. 여기서 치료적 수준 이하는 치료 효능보다 낮으며 출혈 위험성 등의 부작용이 없다는 의미이다. 예컨대, 제I형 당뇨병 환자는 ~[0.1-1.0] nM의 (기초) 치료적 혈장 농도를 보충하기 위하여 (긴 반감기의) 인슐린 주입이 요구되는데, 상기 농도는 본 발명에서 사용하는 5당류의 치료적 수준 이하의 범위로서 충분하다. 당 분야의 당업자라면 폴리펩티드의 치료적 수준과 5당류의 치료적 수준 간에 적절한 균형을 이루도록 접합체를 어떻게 선택해야하는지 알 것이다. 본 발명의 접합체의 폴리펩티드는 그 자체의 생활성을 유지한다. 또한, 본 발명의 접합체의 ATIII-결합 5당류의 1차(linear) 약력학적 양태를 통하여 접합된 폴리펩티드의 치료 효능을 고도로 예측가능한데, 이는 상기 접합체가 i.v. 또는 s.c. 투약 이후 대부분 혈관내 구획에 남아있기 때문이다.
본 발명의 접합체의 올리고당 잔기는 그 자체로 항트롬빈 III(ATIII)에 대한 친화성을 갖는 합성 황산화 올리고당에서 유래한 잔기이다. 황산화 올리고당, 구체적으로 5당류는 일반적으로 ATIII에 대한 친화성을 가지는데, 당 분야의 당업자라면 ATIII에 대한 올리고당의 친화성을 용이하게 확인하여 목적하는 친화성 수준을 선택할 수 있다(van Amsterdam et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1995;15:495-503). 적절한 합성 올리고당 잔기, 구체적으로 5당류 잔기는 유럽특허 제0,454,220호, 유럽특허 제0,529,715호, 국제공개특허 제98/03554호, 국제공개특허 제99/36428호, 문헌[J. Med. Chem. 2005; 48, 349-352, Angew. Chem. Intl. Ed. Engl. 1994, 32,1671-1690] 등에 개시된 올리고당 및 5당류로부터 유도할 수 있다.
상기 올리고당 잔기 및 5당류 잔기는 폴리펩티드에 직접 접합되거나 또는 5당류 잔기 내 임의의 화학적으로 적절한 위치에 부착된 연결 잔기를 통하여 접합된다. 따라서, 본 발명의 구체예에서 상기 접합체는 올리고당-스페이서 잔기가 하기 화학식 I의 구조를 갖는 접합체이다.
Figure 112007063778710-PCT00001
상기 식에서, 하나의 필수적으로 약리학적 불활성의 연성 연결 잔기가 존재하고, 여기서 R은 독립적으로 OSO3 -, (1-8C)알콕시 또는 필수적으로 약리학적 불활 성의 연성 연결 잔기이며, Ra는 독립적으로 OSO3 -, (1-8C)알콕시, 필수적으로 약리학적 불활성의 연성 연결 잔기이거나 또는 1∼13개의 단당류 단위를 포함하는 올리고당이고, Rb는 독립적으로 (1-8C)알콕시, 필수적으로 약리학적 불활성의 연성 연결 잔기 또는 1∼13개의 단당류 단위이며, 상기 전하는 양으로 하전된 반대 이온으로 상쇄된다. 보다 바람직하게는 올리고당-스페이서 잔기가 하기 화학식 II의 구조를 갖는 5당류-스페이서 잔기인 접합체이다.
Figure 112007063778710-PCT00002
상기 식에서, 하나의 필수적으로 약리학적 불활성의 연성 연결 잔기가 존재하고 R은 독립적으로 OSO3 - 또는 (1-8C)알콕시이거나, 또는 필수적으로 약리학적 불활성의 연성 연결 잔기이고, 상기 전하는 양으로 하전된 반대 이온으로 상쇄된다. 더욱 바람직하게는 5당류 잔기가 하기 화학식 III의 구조를 갖는 접합체이다.
Figure 112007063778710-PCT00003
상기 식에서, R은 독립적으로 OSO3 - 또는 (1-8C)알콕시이며, 상기 전하는 양으로 하전된 반대 이온으로 상쇄된다. 본 발명에 따른 화합물은 가장 바람직하게는 5당류 잔기가 하기 화학식 IV의 구조를 갖는 화합물이다.
Figure 112007063778710-PCT00004
상기 식에서, R은 독립적으로 ℃H3 또는 OSO3 -인데,구체적으로 화학식 II의 모든 R기는 OSO3 -이다.
본 발명에 따르면, ATIII에 대한 친화성이 있는, 합성 황산화 올리고당 잔기, 구체적으로 5당류 잔기를 임의 폴리펩티드에 접합시킬 수 있다. 예컨대, 상기 폴리펩티드는 생활성 펩티드(예를 들어, 5 내지 50 아미노산 길이)이거나 촉매 활성을 보유하거나 보유하지 않는 보다 긴 폴리펩티드일 수 있다. 생활성 펩티드의 예로는 신경전달물질 예컨대, 코난토킨 G, 다이놀핀, 엔돌핀, 엔케팔린, 또는 뉴로테신; 위 활성인자 예컨대, 봄베신, 모틸린, 또는 가스트린; 칼슘 조절인자 예컨대 칼시토닌 또는 파라티로이드 호르몬(PTH); 골흡수 조정인자 예컨대, 오스테오프로 테게린(OPG); 골형성 활성의 자극인자 예컨대 아드레노메듈린 또는 이의 절두형 유도체 예컨대 ADM(27-52); 호르몬 예컨대 혈관활동성 장관 폴리펩티드, 코르티코트로핀, 테그레틴; 호르몬 억제제 예컨대, 소마토스타틴; 호르몬 자극인자 예컨대, 멜라노사이트 자극 호르몬, 황체형성 호르몬 방출 인자, 또는 세르모렐린; 항당뇨 제제 예컨대 글루카곤, 아밀린, 글루카곤-유사 펩티드-1(GLP-1) 또는 이의 절두형 유도체 예컨대 GLP-1(7-36), GLP-2, 글루코스-의존성 인슐린 분비성 폴리펩티드(GIP) 또는 인슐린("휴뮬린", Eli Lilly); 항감염제 예컨대 라이소스타핀; 식욕 억제 호르몬 예컨대 오베스타틴; 혈관 수축제 예컨대 안지오텐신 II; 혈관 확장제 예컨대 브라디키닌, 기질 P 또는 칼리딘; 나트륨이뇨 증가제 예컨대 심방성 나트륨이뇨 폴리펩티드(ANP); 항이뇨성 호르몬 예컨대 바소프레신 또는 데스모프로센; 및 자궁 수축제 예컨대 옥시토신 등을 포함하는데 이에 제한되지는 않는다. 사용할 수 있는 폴리펩티드의 추가적인 예로는 인간 성장 호르몬("인간trope," Genentech); rLH; rG-CSF ("Neupogen," Amgen); 에리트로포이어틴("Epogen," Amgen); 인터페론 α-2a, 인터페론 α-2b, 인터페론 β, 또는 인터페론 γ; 인자 VIII 또는 기타 혈액 응고 인자 예컨대 단백질 C 또는 인자 VIIa; 난포 자극 호르몬(FSH); 사이토카인 예컨대 인터루킨(IL)(예컨대, IL-1, -2, -3, -4, - 5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, or -18); 헤모글로빈; 수퍼옥사이드 디스뮤타제; 가용성 CD4 또는 CD4 수용체; 혈소판 GpIIb/IIIa 유사체 및 이들의 수용체("ReoPro," Johnson & Johnson); 글루코세레프로시다제("Ceredase" or "Cerezyme," Genzyme); ACTH; 소마토트로핀; 파라티로이드 호르몬, 항이뇨성 호르몬; 프로락틴; rHGH, 예컨대, 페그 비소만트("Somavert", Pfizer); GnRH 작용제 예컨대 루프로리드("Lupron", "Leprorelin", Takeda) 또는 나파렐린("Synarel", R℃he) 및 GnRH 길항제 예컨대, 가니릴렉스("Antagon", Organon); GHRH 작용제 예컨대, 세르모렐린("Geref", Serono); 옥트레오티드("Sandostatin", Novartis); 또는 혈전 용해제 예컨대 스트렙토키나제, 스타필로키나제, 우로키타네, 또는 조직 플라스미노겐 활성인자("Activase," Genentech); 메타스틴(KISS1 or kisspeptin-54) 또는 이의 절두형 유도체 예컨대 키스펩티-10 등을 포함할 수 있다.
바람직한 폴리펩티드는 분자량이 ~0.3 내지 50 kDa이다. 기타 바람직한 폴리펩티드는 분자량이 ~0.3 내지 20 kDa이다. 또한 분자량이 ~0.3 내지 7.5 kDa인 폴리펩티드도 바람직하다. 더욱 바람직한 폴리펩티드는 인슐린(t1/2 = 12 분; Mw = 5.8 kDa), 칼시토닌(t1/2 = 20 분; Mw = 3.4 kDa), GLP-1(7-36)(t1/2 = 6 분; Mw = 3.4 kDa), 아드레노메듈린(t1/2 = 20 분; Mw = 6.0 kDa), ADM(27-52) (Mw 3.0 kDa), 옥트레오티드(t1/2= 1.7 시간, Mw = 1.0 kDa), 인터루킨-2 (t1/2 = 20 분; Mw = 15 kDa) 및 가니릴릭스(t1/2 = 12 시간; Mw = 1.6 kDa) 등이다. 구체적으로 바람직하게는 인슐린 및 [D-Ala8]-GLP-1(7-36)이다. 본 발명의 다른 구체예에서는 5당류-스페이서 잔기로 단일치환된 폴리펩티드 접합체이다.
상기 스페이서는 결합이거나 필수적으로 약리학적 불활성의, 연성, 연결 잔 기이다. 바람직하게, 상기 스페이서는 필수적으로 약리학적 불활성의 연성 연결 잔기, 구체적으로 올리고당의 산소는 포함시키지 않고, 스페이서의 "골격"에서 계산한 10∼50 원자를 갖는 것이다. 본 발명에서 사용되는 용어 "필수적으로 약리학적 불활성"은 본 발명의 화합물이 치료적으로 효능이 있는 용량에서 상기 스페이서가 그 자체로 약리학적 활성을 나타내는 원자 또는 기를 함유하지 않는다는 의미이다. 따라서, 본 발명의 화합물이 치료 약물로 사용될 때의 용량에서, 상기 스페이서의 성질로 인하여 명백한 약리학적 부작용이 야기되지 않는다. 상기 스페이서는 (어느 정도의) 강체(rigid elements), 예컨대 고리 구조 및 불포화 결합 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 화합물의 스페이서는 바람직하게 연성이다. 적절한 스페이서는 당 분야의 당업자라면 용이하게 설계할 수 있다. 그러나, 합성적인 이유로 보다 긴 스페이서는 그다지 적합하지 않은 것으로 간주되지만, 그럼에도 본 발명의 화합물에는 보다 긴 스페이서가 성공적으로 적용될 수 있다. 바람직한 스페이서는 하나 이상의 -(CH2CH2-O)-성분(element)을 포함한다.
본 발명의 접합체로 대표적인 예로는 다음의 구조를 갖는 접합체 또는 이의 기타 염이며, 또한 스페이서가 다른 것이거나 또는 또 다른 위치에서 5당류에 부착된 것인 접합체이다. 바람직하게는 나트륨 염이다.
Figure 112007063778710-PCT00005
여기서, R1 = R2 = H이고, R3 =
Figure 112007063778710-PCT00006
이거나, 또는 R1 = R3 = H이고, R2 =
Figure 112007063778710-PCT00007
이며, 여기서 Y는 하기의 화학식 A, B, C, 및 D로부터 선택된다. 바람직하게, Y는 화학식 A 및 B로부터 선택된다.
Figure 112007063778710-PCT00008
본 발명에서 명백하게 정의하지 않은 공통적으로 사용되는 화학 약어들은 문헌 [The American Chemical S℃iety Style Guide, Second Edition, American Chemical S℃iety, Washington, DC (1997), "2001 Guidelines for Authors" J. Org. Chem. 66(1), 24A (2001), "A Short Guide to Abbreviations and Their Use in Polypeptide Science" J. Polypeptide. Sci. 5, 465-471 (1999)] 등에서 확인할 수 있다.
용어 폴리펩티드는 번역후 변형에 상관없이, 3개 이상의 아미노산의 사슬을 의미한다. 폴리펩티드는 천연적으로 발생시키거나, 화학적으로 합성하거나, 재조합 생산한 아미노산의 중합체일 수 있다. 통상 3 내지 50개의 아미노산을 보유한 폴리펩티드를 펩티드로 분류한다. 어구 "촉매 활성을 갖는 폴리펩티드"는 효소를 의미한다. 본 발명에서 사용하는 용어 인슐린은 인간, 래트, 귀니아 돼지, 및 토끼를 포함하는 포유류에서 발견되는 천연적으로 발생하는 저혈당성 폴리펩티드를 비롯하여, 예컨대 미국 특허 제4,652,525호, 제4,431,740호, 제5,268,453호, 제5,506,202호, 제5,514, 646호, 및 제5,700,662호 등에 개시된 재조합 인슐린 및 유사한 저혈당성 폴리펩티드 등을 의미한다.
본 발명의 접합체에 대한 구체적인 설명에서 이하의 정의들을 더욱 사용한다. 용어 (1-4C)알킬 및 (1-8C)알킬은 각각 탄소 원자 수가 1 내지 4 및 1 내지 8인 분지형 또는 비분지형 알킬기를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, tert-부틸, 헥실 및 옥틸 등이다. 메틸 및 에틸이 바람직한 알킬기이다. 용어 (1-8C)알콕시는 탄소 원자 수가 1 내지 8일 알콕시기를 의 미하며, 상기 알킬 부분은 상기에서 정의한 의미를 갖는다. 메톡시가 바람직한 알콕시기이다. 상기 스페이서의 길이는 스페이서와 연결된 올리고당 잔기의 산소 원자는 계산하지 않고, 올리고당 잔기와 폴리펩티드 사이의 가장 짧은 사슬을 따라서 계산한 스페이서의 원자 수이다.
본 발명의 구체예는 또한 폴리펩티드를 포함하는 치료적으로 활성인 접합체의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 그 자체로 항트롬빈 III에 대한 친화성을 갖는 4 내지 6개의 단당류 단위로 이루어진 합성 황산화 올리고당, 가장 바람직하게는 황산화 5당류를 선택적으로, 본질적으로 약리학적 불활성의 연성 연결 잔기를 통해서 폴리펩티드에 부착하는 단계를 포함하며, 상기 접합체는 무시할 정도로 미미한 항혈전 활성을 가지며, 생활성은 필수적으로 유지하면서 본래 폴리펩티드보다는 증가된 혈장 반감기를 갖는다.
일반적인 합성 및 분석측면
5당류의 합성
본 발명의 화합물의 ATIII-결합 올리고당, 구체적으로 5당류는 예를 들어, 문헌 [Angew. Chem. Intl. Ed. Engl. 1994, 32,1671-1690]에 기술된 바 대로 제조할 수 있다. ATIII에 대한 친화성을 변경시킨 상이한 올리고당 및 5당류를 다양한 중간체 단당류, 이당류 또는 4당류 빌딩 블록을 통해 얻을 수 있는데, 예를 들어 (영구적인) 일킬기를 도입하거나 상이한 보호기를 (일시적으로) 적용하여서 제어된 방식으로, 상이하게 황산화된 올리고당 및 5당류를 얻을 수 있다(예를 들어, [W에스테르duin et. al. Bioorg. Med. Chem. 1994, 1267] 참조). 상기 스페이서는 예컨 대 국제공개특허 제2001/42262호에 기재된 바와 같이 도입할 수 있다. 상기 올리고당 및 5당류-스페이서 분자는 연결 잔기 예컨대 감마-말레이미도 부티릴(GMB)기, N-히드록시숙신이미드(NHS)기 또는 임의로 보호된 티올기(예를 들어, [Angew. Chem. Intl. Ed. Engl. 1996, 35, 331-333] 참조)로 더욱 유도화시켜서 임의로 변형된 폴리펩티드와 직접 커플링되도록 할 수 있다.
접합 반응(conjugation)
일반적으로, 본 발명의 접합체는 (a) 폴리펩티드를 접합하기에 적합하도록 하는 임의 단계, 및 (b) 임의로 적합화시킨 폴리펩티드를 올리고당-스페이서 분자 또는 5당류-스페이서 분자와 반응시키는 커플링 단계를 포함하는 방법에 따라 생산된다.
생접합체 생산에 대한 일반적인 합성 방법은 문헌 [Bioconjugate Techniques by Greg T. Hermanson, 1996, Academic Press]에 기술되어 있다. 또한, 접합 반응을 위하여 스타우딩어 결찰법(Staudinger ligation)(예컨대, 문헌[K.L. Kiick et al.Pr℃. Nat. Acad. Sci. 2002; 99:19-24] 참조) 또는 알킨 또는 아지드 작용기로 독립적으로 변형된 폴리펩티드 및 5당류 유도체를 사용하는 후이스겐(Huisgen)의 및 1,3-이극성 고리첨가 반응 등을 고려할 수 있다. 다르게는, 효소 반응 예컨대 N-말단에서 폴리펩티드의 위치선택적(regioselective) IgA 프로테아제 매개 연장 반응(예컨대 문헌[M. Lewinska et al. in Bio접합체 Chem. 2004, 15, 231-234]에 기재된 방법 등) 또는 트랜스글루타미나제에 의해 촉매되는 아미노 스페이서 함유 올리고당의 도입(예컨대, 문헌 [M. Sato et al. in J. Am. Chem. S℃. 2004, 126, 14013-14022]에 기재된 방법 등) 등을 통해서 임의 변형된 폴리펩티드와 5당류 스페이서 잔기의 접합에 적용할 수 있다. 또한, 예컨대 인슐린, GLP-1 및 옥트레오티드의 PET화는 보고가 매우 잘 되어 있다. 이들 단백질에서, 이들의 생물학적 활성을 제거하지 않고 ~5 내지 30 kDa PEG-부분을 도입할 수 있는데, 이러한 방법은 5당류(스페이서)-부분의 (부위-특이적) 도입이 수반될 수 있다. 또한, 전제되어야 할 것은 ATIII(~50 kDa)와 5당류-접합체의 결합이 폴리펩티드의 생물학적 활성에 실질적으로 유해한 영향이 없어야 한다는 것이다.
인슐린 : N-말단 B-1 및 C-말단 근처 B-29 라이신 아미노 산의 기능은 인슐린의 생활성에 필수적이지 않다. N-히드록시숙신이미드(NHS) 활성화 PEG 유도체와 de-N-B℃-보포 인슐린의 반응을 통해서 총 수율 20%로 B1-PEG화 인슐린을 제조하였다(S.W. Kim et al., Adv. Drug Del. Rev. 2002, 54, 505-530). 2작용성 커플링 시약 예컨대 N-말레이미도부티릴옥시 숙신이미드 에스테르(GMBS)를 이용한 유사한 반응을 통해서 B1-변형된 인슐린 5당류 접합체를 얻었다. 다르게는 ~60%의 수율로, 비보호된 Zn2+-인슐린의 B29 Lys 잔기를 pH 10∼11에서 과량의 NHS로 선택적으로 변형시킬 수 있다. 기타 인슐린에 대한 위치특이적 접합에 대해 확립이 잘된 방법 들이 예컨대 국제공개특허 제98/02460호, 국제공개특허 제2004/091494호, 국제공개특허 제2005/012346호, 미국특허출원 제2005-0152848호, 문헌 [Jensen et al. J. Pept. Sci. 2005, 11, 339-346, Lee et al. Bi℃onj. Chem. 2005, 16, 615-620, Jain et al. Bi℃him. Biophys. Act. 2003, 1622, 42-49, Tessmar et al. Tissue Engin. 2004, 10, 3, 441-453)]에 기술되어 있다.
가니릴릭스 : 5당류의 NHS 에스테르 유도체를 de-N-Ac 가니릴릭스의 자유 N-말단 아미노기에 접합시키거나 아미노 스페이서 함유 5당류 유도체를 임의로 추가 스페이서를 통해서, 데사미도 가니릴릭스의 자유 말단 카르복시산기에 접합시킬 수 있는데, 상기 데사미도 가니릴릭스는 고급 (고체상) 펩티드 합성법 예컨대 문헌 [J. Med. Chem. 1992, 35, 3942-3948]에 기술된 방법을 통해 얻을 수 있다.
옥트레오티드 : 시판되는 옥트레오티드의 N-말단 D-Phe 아미노산 잔기를 이의 생활성을 파괴하지 않고 최대 5 kDa PEG를 사용하여 변형시킬 수 있다(D. Hee et al. Pharm. Res. 2005, 22, 743-749). pH ∼6에서 과량의 이작용성 NHS 에스테르 연결 시약을 사용하여 상기 N-말단 아미노기의 위치 특이적 작용성을 얻을 수 있는데, 이때 상기 기술한 바와 같은 생접합체를 생산하는 일반적인 합성 방법에 따라서 캐리어 5당류와의 추가적인 접합 반응을 실시할 수 있다(예를 들어, 티올기를 함유하는 5당류 스페이서 잔기를 옥트레오티드의 말레이미드 유도체에 접합시켜서 실시).
ADM(27-52)　: 전장 아드레노메듈린(ADM)의 N-말단 절반은 이의 골형성 활성 및 혈관 석회화에 대한 억제 효능에 필수적이지 않다. ADM(27-52)의 N-말단 Ala 잔기와 5당류-스페이서 잔기의 위치 특이적 접합은 통상의 잘 확립된 고체상 펩티드 합성 및 상기 설명한 바와 같은 생접합체를 생산하는 일반적인 합성 방법을 사용하여 임의로 N-말단을 변형시킨 ADM(27-52)를 합성하여 얻을 수 있다.
[D-Ala 8 ]-GLP-1(7-36) : GLP-1(7-36)의 C-말단부 및 이의 유도체 예컨대 엑센딘-4(1-39)은 수용체 결합에 중요한 아미노산이 노출되어 있는 α-나선 구조를 형성한다. 예컨대 국제공개특허 2005/058954호에 기술된 바와 같은 변형 고체상 펩티드 합성법을 사용하여 말레이미드 작용성으로 Ne-위치를 변형시킨 추가의 라이신 잔기로 상기 아미노산 서열을 연장시킨 결과 인간 혈청 알부민의 Cys34 아미노산에 공유 결합 후 생체 내 기능 활성 및 수용체 결합성을 여전히 나타내었으며 한편, 단백질 가수분해 안정성은 위치 2에 D-Ala 잔기를 도입하여서 (더) 개선시킬 수 있다(Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 4395-4398). 유사한 방식으로 GLP-1(7-36) 또는 이의 유사체를 적절하게 작용성화시킨 5당류-스페이서 부분(예컨대, 티올기를 함유)에 접합시킬 수 있다. 다르게는 펩티드 서열, 바람직하게는 위치(들) 11, 12, 16, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 34, 35 또는 36에 Cys 아미노산을 도입하거나 위치 37에 부가할 수 있으며, 이를 GLP1 유도체의 PEG화에 대하여 기술한 바와 유사한 방법(국제공개특허 제2004/093823호)을 사용하여, 적절하게 작용화된 5당류-스페이서 부분(예를 들어, 말레이미드기 함유)에 커플링시킬 수 있다. 또한, GLP-1의 접합체는 이작용성 NHS 에스테르 연결 시약을 GLP-1에 직접 커플링시키고, 이어서 위치이성질체를 분리시키며(예컨대 [Lee et al. Bio접합체 Chem. 2005, 16, 377-382)] 등에 의한 GLP-1의 직접 PEG화에 대해 기술한 바 대로) 적절하게 작용화된 5당류-스페이서 부분에 커플링하여 얻을 수 있다.
인터루킨-2 (IL-2): 시판되는 천연 recH-IL2의 자유 Cys125 아미노산, 또는 여전히 생물학적으로 활성인 IL2 뮤테인의 자유 (부가) Cys 아미노산을, PEG-말레이미드로 IL2를 PEG화하는 것에 대하여 기술된 바와 유사한 프로토콜(미국특허 제5,206,344호)에 따라서 말레이미드기를 함유하는 5당류-스페이서 부분과 반응시킬 수 있다.
본 발명의 화합물을 제조하기 위하여 상기 기술한 방법에서 실행할 수 있는절차 단계인, 펩티드 커플링은 펩티드 단편의 커플링 또는 축합에 대한 당 분야의 통상 공지인 방법 예컨대 아지드법, 혼합 무수물법, 활성 에스테르법, 카르보디이미드법, 또는 바람직하게, TBTU와 같은 암모늄/우로늄 염의 영향하에서, 특히 촉매 및 라세미화 억제 화합물 예컨대 N-히드록시숙신이미드, N-히드록시벤조트리아졸 및 7-아자-N-히드록시벤조트리아졸 등의 부가를 통해서 수행할 수 있다. 기타 문헌 [The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3, E. Gross and J. Meienhofer, eds. (Academic Press, New York, 1981) 및 Peptides: Chemistry and Biology, N. Sewald and H.-D. Jakubke (Wiley-VCH, Weinheim, 2002)] 등에서 개략적으로 확인할 수 있다.
상기 화합물에 존재하는 아민 작용성은 N-보호기를 통하여 합성 과정중 보호화할 수 있는데, 상기 N-보호기는 α-아미노기의 보호를 위하여 펩티드 화학분야에서 통상 사용되는 기를 의미하는 것으로 예컨대 tert-부틸옥시카르보닐(Boc) 기, 벤질옥시카르보닐(Z) 기, 9-프루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 기 또는 프탈로 일(Phth) 기 등이며, 또는 아지드 부분의 탈마스크를 통하여 아민 작용성을 도입할 수 있다. 아미노 보호기 및 이들의 제거 방법은 개략적으로 문헌 [The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3 and Peptides: Chemistry and Biology] 등에 언급되어 있다.
본 발명의 화합물은 자유 염기의 형태일 수 있으며, 이는 약학적 허용 염의 형태로 반응 혼합물에서 분리할 수 있다. 상기 약학적 허용 염은 또한 유기산 또는 무기산 예컨대 염화수소, 브롬화수소, 요오드화수소, 황산, 인산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 말레산, 말론산, 메탄설폰산, 푸마르산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 아스코르브산 등으로, 화학식 I의 자유 염기를 처리하여 얻을 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 이의 중간체는 키랄 탄소 원자를 보유할 수 있으며, 따라서 이들은 순수한 거울상 이성질체로 얻어지거나, 또는 거울상 이성질체의 혼합물, 또는 부분입체이성질체를 함유하는 혼합물로 얻어질 수 있다. 순수한 거울상 이성질체를 얻는 방법은 당 분야에서 공지인데, 예를 들어 광학적 활성산 및 라세미 혼합물로부터 얻은 염의 결정화, 또는 키랄 컬럼을 사용한 크로마토그래피 등이 있다. 부분입체이성질체를 위해서는 정상(straight phase) 또는 역상 컬럼을 사용할 수 있다.
물리화학 및 생화학 분석법
단백질의 생활성에 대한 2작용성 링커 및/또는 반응성 5당류-부분의 효과를 모니터링하기 위한 몇몇 기술들이 이용가능하다. 이러한 면에서, 보체 결합제(인슐 린)로 가용성 수용체 분자를 사용하는 생분자 상호작용 분석법(BIA) 및 효소 활성 결정법 등이 유용한 수단이다. ATIII에 대한 5당류-접합체의 결합 실험 역시 이러한 분석법을 포함할 수 있다. 이온 교환, 크기별 배제 크로마토그래피 및 ATIII 친화성 크로마토그래피 등이 5당류 접합체의 소분류(subfractionation)에 이용가능한 방법들이며, 한편, 전기영동법은 오르소고날, 정성 분석 및 정량 분석(예를 들어, SDS-PAGE, CZE)에 적합하다. 접합 부위는 상기 접합체의 MALDI-TOF MS 분석 및 N-말단 서열 분석 등으로 확인할 수 있다.
약력학적 실험(Pharmacokinetic (PK) studies)
비변형 폴리펩티드 및 상응하는 5당류 접합체의 생체내 반감기를 측정하기 위한 PK 실험은 래트에서 수행할 수 있다. 몇몇 선택법이 이용가능한데, 예를 들어 아이오도겐을 이용하는 125I으로의 동위원소 표지법이나 친전자성 치환을 유도하기 위한 락토퍼옥시다제 이온화법 또는 표지 부분으로 볼튼-헌터 시약을 이용하고 혈장 샘플 내 감마 방사선을 측정하는 방법 등이 있다. 기타 당 분야의 공지의 방법들은 비표지화한 접합체를 주입하고 ELISA 또는 Luminex 기술 등을 통하여 면역 화학분석을 수행하는 것을 기초로 한다.
약리학적 평가(Pharmacological evaluation )
본 발명의 폴리펩티드와 ATIII 결합 5당류의 접합에 대한 약리학적 효능은 이하 기술하는 바와 같이 시험관 내 분석 및 동물 모델에서의 생체내 분석으로 수행할 수 있다.
인슐린은 2개의 이황화 브릿지를 통하여 서로 연결되는 2개의 펩티드 사슬로 이루어진 5.8 kDa의 단백질이다. Lys ε-아미노기 또는 N-말단 α-아미노기 중 하나에 대한 부위-특이적 화학 변형법이 잘 보고되어 있다. 인슐린과 5당류의 접합 효능은 글루코스, 인슐린 및 C-펩티드 함량(내인성 인슐린 분비를 보정하기 위한 바이오마커)에 대하여 혈청 샘플을 분석하여 수행할 수 있다. 글루코미터 및 인간 인슐린 및 C-펩티드 방사면역분석법 등은 시판되는 것을 이용할 수 있다. 혈액 글루코스 농도에 대한 인슐린의 생체내 효능은 래트 또는 비글개에서 측정할 수 있다.
데카펩티드 모의체 GnRH 길항제 가니릴릭스와 5당류의 접합체에 대한 시험관 내 및 생체내 약리학적 효능은 확립되어 있는 분석법 및 동물 모델에서 실험할 수 있다. 마우스 및 래트에서 난모세포 성숙화 및 배란을 블록킹하는 가니릴릭스에 필적할 만한 효능이 있는, 특성이 명확한 분자를 고급 폴리펩티드 합성법으로 얻을 수 있다. 가니릴릭스 및 이의 5당류-접합된 대응물의 생물학적 반감기의 비교는 예컨대 투여 이후 성숙화 및 배란의 자연적인 프로세스가 회복되는 시점을 측정하여 확인할 수 있다.
GLP-1(7-36)는 잘 알려져 있으며 연구가 잘 되어 있는 인슐린 분비성 내분비 호르몬으로 다양한 생물학적 효과 예컨대 인슐린 분비 자극, 글루카곤 분비 억제, 위 또는 장의 운동성, 글루코스 이용성 강화 및 체중 저하 유도 등을 유도한다. 상기 호르몬은 디펩티딜 펩티다제 IV(DPPIV)에 의해 빠르게 분해된다. 이의 미성숙한 분해는 예컨대 위치 8의 아미노산 잔기를 치환(예를 들어, D-알라닌으로)하여 피할 수 있다. 기타 접근법 예컨대 큰 지방산 사슬이나 PEG를 이용한 변형으로 생물학적으로 활성인 GLP-1 또는 이의 유사체를 생성할 수 있다(예컨대 국제공개특허 제2004/093823호에 정의된 바와 같음). 캐리어 5당류와 임의 변형된 GLP-1(7-36) 유도체의 접합을 통하 (추가) 안정화 효과는 DPPIV의 존재하의 시험관 내에서 접합체의 안정성을 측정하여 확인할 수 있고 생체내에서 면역화학 분석법을 사용하여 혈장 반감기를 측정하여 확인할 수 있다. GLP-1 5당류 접합체의 기능적 활성은 GLP-1 수용체에 대한 결합능 및 활성화 능력을 시험관내에서 측정할 수 있고, 생체내에서 약력학적 효과는 글루코스 및 인슐린에 대하여 혈청 샘플을 분석하여 확인할 수 있다.
아드레노메듈린은 다양한 생물학적 기능 예컨대 혈관확장, 기관지확장, 신경전달, 성장 조절 및 골형성 조절 등의 다양한 기능을 수행하는 52개 아미노산의 폴리펩티드이다. 절두형 단편 ADM(27-52)은 혈관확장 인자 활성에 필요한 구조적 요구조건이 결여되어 있지만, 용량 의존적 방식으로, 래트의 조골세포 배양물 성장을 여전히 자극할 수 있다(Regulatory Peptides 2003, 112, 79-86). 또한, 최근에 확립된 바에 의하면 ADM(27-52)는 래트에서 혈관 석회화를 억제하며(Regulatory Peptides 2005, 129, 125-132) 따라서 동맥 석회화의 예방에 적용할 수 있는 강력한 치료적 응용성을 갖는다. ADM(27-52)를 캐리어 5당류에 접합시키는 효과는 활발하게 성장하는 태아 래트 조골세포의 배양물에서 시험관내 골형성 활성을 측정하거나 골 형성 계수의 생체내 증가(골 재흡수에 영향없이)를 측정하여, 확립이 잘되어 있는 분석법으로 평가할 수 있다.
옥트레오티드는 소마토스타틴의 합성 옥타펩티드 유사체이며 말단 비대증 및 특정 내분비성 종양의 치료에서 임상적으로 사용된다. 알려진 바에 의하면 장기 작용성 디팟 제제들(예컨대 Sanostatin LAR depot, Novartis Pharma, Basel, Switzerland)은 하루 3회 피하 주입으로 비교하여 적어도 혈장 성장 호르몬 및 인슐린 유사 성장 인자(IGF-I) 농도를 저하시키는 데는 효과적이다. 옥트레오티드와 5당류의 접합이 이의 약력학 및 약동력학적 특성에 미치는 효과는 접합된 옥트레오티드의 농도 및 IGF-I의 변화 농도를 결정하기 위하여 확립된 방사성 면역분석법을 사용하여 숫컷 래트에서 확인할 수 있다.
인터루킨-2(IL-2)는 백혈구(T-림포사이트)에 의해 신체내에서 자연적으로 생산되는 단백질이며 면역계의 중요 단백질이다. 이는 약물로서 시판되며(Aldesleukin, Proleukin Chiron, U.S.), 일부 유형의 암(모양 세포성 백혈병) 치료에 사용되며, 항-HIV 치료 시 CD4 세포수 증가를 유도하도록 항-HIV 치료제와 함께 사용된다. 5당류-IL2 접합체의 특이적 생활성은 Gillis 등(J. Immunol. 1978, 120, 2027-2032)이 기술한 IL2 세포 증식 생분석법을 사용하여 시험관 내에서 결정할 수 있다.
약학 제형(Pharmaceutical formulations)
본 발명의 접합체는 장관이나 또는 장관이외의 비경구적으로 투여될 수 있다. 이들 화합물 및 이의 조성물의 정확한 용량 및 처방은 반드시 폴리펩티드 자체의 생물학적 활성, 상기 약물이 투여될 개별 대상의 요구, 통증이나 요구 정도 또는 담당의의 판단에 따라 좌우되어야 한다. 일반적으로, 비경구 투여는 흡수성에 의해 보다 좌우되는 다른 투여법들에 비하여 낮은 용량이 요구된다. 그러나, 1일 용량은 인간의 경우 바람직하게 체중 1 kg 당 0.0001∼1 mg, 보다 바람직하게는 체중 1 kg 당 0.001∼0.1 mg이다.
본 발명의 화합물을 이용하여 제조되는 약물은 또한 치료요법에서 보강제(adjuvant)로 사용될 수 있다. 이러한 경우, 상기 약물은 임의의 질병 상태를 치료하는데 유용한 기타 화합물과 함께 투여된다. 표준 참조 문헌 [Gennaro et al., Re분gton's Pharmaceutical Sciences, (18th ed., Mack Publishing Company, 1990, see especially Part 8: Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture)]에 기술된 바와 같이 약학적으로 적합한 보조제와 혼합되어서, 상기 화합물은 고형 단위 제형, 예컨대 알약, 정제 등으로 압착되거나 캡슐 또는 좌제 등으로 가공될 수 있다. 약학적으로 적합한 액체를 통하여 상기 화합물은 또한 액제, 현탁제, 에멀션제의 형태이거나, 주입 조제물이나, 스프레이로 사용하기에 적합한 형태로도 사용될 수 있다.
단위 제형, 예컨대 정제 등을 제조하기 위하여, 통상의 첨가제 예컨대 충진재, 착색제, 중합성 결합제 등의 사용을 고려할 수 있다. 일반적으로 활성 화합물의 기능을 방해하지 않는 임의의 약학적 허용 첨가제를 사용할 수 있다.
조성물과 함께 투여할 수 있는 적절한 담체로는 락토스, 스타치, 셀룰로스 유도체 등, 또는 이의 혼합물을 포함하며 적절한 양으로 사용한다. 정맥 내 투여시, 약학 조성물은 볼러스로 제공되거나, 투여 시간별로 나눠지는 2 이상의 용량으로 제공되거나, 또는 지속형 또는 비선형 유량 주입물 등으로 제공되다. 따라서, 본 발명의 조성물은 어떠한 투여 경로용으로도 제형화할 수 있다.
통상적으로 정맥 내 투여용 조성물은 멸균한 등장성 수용성 완충제 용액이다. 필요한 경우, 상기 조성물은 또한 가용화제, 안정화제, 및 주입 부위의 통증을 경감시키기 위한 국소 마취제 예컨대 리도카인 등을 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분들은 개별적으로, 예컨대 키트로 제공되거나, 단위 제형 형태, 예컨대 동결 건조 분말 또는 무수 농축물 형태로 함께 혼합되어 제공된다. 상기 조성물은 기밀 밀봉된 용기 예컨대 활성 단위로 활성 제제의 양을 표시하는 샤세트 또는 앰플로 보관될 수 있다. 상기 조성물이 주입용 바틀 형태로 투여되는 경우, 이는 멸균된 약학 등급의 "주입수", 식염수, 또는 기타 적절한 정맥 유체 등을 함유하는 주입 용기내에 조제될 수 있다. 상기 조성물이 주사로 투여되는 경우, 투여전에 상기 성분들을 혼합할 수 있도록 주입용 멸균수 또는 식염수 앰플이 제공될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 화합물 및 이의 약학적 허용 염을 임의의 약학적 허용 성분, 부형제, 담체, 보강제 또는 운반체(vehicle) 등과 함께 포함한다.
달리 정의하지 않으면, 본 발명에서 사용되는 모든 기술적 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자들이 이해하고 있는 의미로 사용한 것이다. 본 발명에서 기술하는 것와 유사하거나 동등한 방법 및 물질 재료들을 본 발명을 실시하거나 테스트하는데 사용할 수 있지만, 이 문서에 적절한 방법 및 물질들이 개시되어 있다. 본 발명에서 언급한 모든 출판물, 특허 출원서, 특허, 및 기타 참조 문헌들은 전체로 본 발명의 참조 문헌으로 포함시킨다. 분쟁이 발생하는 경우, 정의를 비롯하여 본 발명의 명세서를 관리하게 된다. 또한, 본 발명에서 설 명하는 실시예, 방법 및 물질들은 예시적인 것이며 이에 한정하고자 하는 의도가 아니다.
본 발명을 이하의 실시예를 통하여 더욱 구체적으로 설명하지만, 이에 본 발명이 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 의도 및 범주를 벗어나지 않는 범위에서 여러 5당류, 스페이서 및 폴리펩티드를 이용하여 다양한 변형을 가할 수 있음은 자명하다.
도 1은 인슐린-특이적 ELISA를 통하여 5당류-인슐린 접합체 6(인슐린-펜타)을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 5당류(PS)-인슐린 접합체 6의 생분자 상호작용 분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다(고정 항인슐린 항체와 인슐린 접합체를 반응시키고 이어서 인간 인슐린 수용체와 결합시킴).
도 2b는 5당류(PS)-인슐린 접합체 6을 비아코어 분석한 결과를 나타내는 그래프이다(고정 항인슐린 항체와 인슐린 접합체를 반응시키고 이어서 인간 ATIII와 결합시킴)
도 3은 단일치환된 5당류-인슐린 접합체 6를 MALDI-TOF 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 수퍼덱스 30에서, 단일치환된 5당류-인슐린 접합체 6를 HP-SEC 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 참조용 5당류-스페이서 잔기 7, 8, 및 9의 hATIII 결합 결과를 나타 내는 그래프이다(BIA 실험).
도 6은 참조용 5당류-스페이서 잔기 24, 28, 및 29의 hATIII 결합 결과를 나타내는 그래프이다(BIA 실험).
도 7은 인슐린-5당류 접합체 24를 질량 분석(ESI-QTOF)한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7a는 인슐린-5당류 접합체에 대하여 산출한 전형적인 동위원소 분포도와 실험 측정치를 비교한 그래프이다(ESI-QTOF, M5+, 화합물 24)
도 8은 화합물 31, 32, 36, 37의 hATIII 결합을 나타내는 그래프이다(Biacore 실험).
도 9는 화합물 39의 hATIII 결합을 나타내는 그래프이다(BIA로 측정함).
도 10은 화합물 41의 hATIII 결합을 나타내는 그래프이다(BIA로 측정함).
도 11은 화합물 44의 hATIII 결합을 나타내는 그래프이다(BIA로 측정함).
도 12는 화합물 47의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 3.5 nmol/kg recH 인슐린(개방원) 또는 5당류-인슐린 접합체 6(삼각형)을 i.v. 투여한 후 인슐린 농도를 측정하여 확인한 평균 혈장 농도(평균±s.e.m.)를 나타내는 그래프이다.
도 14 125I-표지한 접합체 29(개방 사각형), 24(개방원) 및 28(개방 삼각형) 및 recH 인슐린 자체를 i.v. 투여한 후 T = 1분에서 측정한 농도를 %로 표시한 평 균 혈장 농도(평균±s.e.m.)를 나타내는 그래프이다.
도 15는 125I-표지한 접합체 31(개방 사각형) 및 32(닫힌 삼각형)를 i.v. 투여한 후 T = 1분에서 측정한 농도를 %로 표시한 평균 혈장 농도(평균±s.e.m.)를 나타내는 그래프이다(탈할로겐화에 대해서는 보정하지 않음).
도 16은 125I-표지한 접합체 39(개방 사각형) 및 125I-표지한 ADM(27-52)(닫힌 삼각형)을 i.v. 투여한 후 T = 1분에서 측정한 농도를 %로 표시한 평균 혈장 농도(평균±s.e.m.)를 나타내는 그래프이다(탈할로겐화에 대해서는 보정하지 않음).
도 17은 125I-표지한 접합체 41(닫힌 삼각형) 및 125I-표지한 GLP-1(개방 사각형)을 i.v. 투여한 후 T = 1분에서 측정한 농도를 %로 표시한 평균 혈장 농도(평균±s.e.m.)를 나타내는 그래프이다.
도 18은 항인간 및 항토끼 ATIII 항체로 5당류-인슐린 접합체-ATIII 복합체를 검출한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 19는 7 nmol/kg 5당류-인슐린 접합체 6(개방 삼각형) 또는 3.5 nmol/kg recH-인슐린(개방원)을 i.v. 투여한 후 평균 글루코스 농도(평균±s.e.m.)를 나타내는 그래프이다.
도 20은 9 nmol/kg recH-인슐린으로 처리한 후의 글루코스 농도(개방원)와 비교하여 12 nmol/kg 5당류-인슐린 접합체 26(닫힌 삼각형) 또는 24(닫힌원)를 i.v. 투여한 후의 평균 글루코스 농도(평균±s.e.m.)를 나타내는 그래프이다.
도 21은 9 nmol/kg recH-인슐린(개방원) 또는 48 nmol/kg의 인슐린 데테미 어(Detemir)로 처리한 후 글루코스 농도(개방 삼각형)와 비교하여 24 nmol/kg 5당류-인슐린 접합체 27(닫힌 사각형) 또는 25(닫힌 다이아몬드)를 i.v. 투여한 후의 평균 글루코스 농도(평균±s.e.m.)를 나타내는 그래프이다.
도 22는 9 nmol/kg recH-인슐린(개방원) 또는 24 nmol/kg의 인슐린 데테미어로 처리한 후 글루코스 농도(개방 다이아몬드)와 비교하여 24 nmol/kg 5당류-인슐린 접합체 24(닫힌 삼각형), 28(닫힌원) 또는 29(닫힌 사각형)을 i.v. 투여한 후 평균 글루코스 농도(평균±s.e.m.)를 나타내는 그래프이다.
사용한 약어:
ACN : 아세토니트릴
AcOH : 아세트산
ADM : 아드레노메듈린
(h)ATIII : (인간) 항트롬빈 III
AUC : 그래프하의 면적
BIA : 생분자 상호작용 분석
B℃2O : 디-tert-부틸 디카르보네이트
Cl : 제거율
DCCI : N,N'-디시클로헥실카르보디이미드
DIPEA : 디이소프로필에틸아민
DMF : N,N'-디메틸포름아미드
DMSO : 디메틸 술폭시드
EDTA : 에틸렌디아민 테트라아세테이트
ELISA : 효소-연계 면역흡착성 분석법
Equiv. : 등가
ESI : 전자 분무 이온화
GLP-1 : 글루카곤 유사 펩티드 1
GMB : 감마-말레이미도부티릴
GMBS : 감마-말레이미도부티르산 N-히드록시 숙신이미드 에스테르
HBS-EP : EDTA 및 폴리에틸렌 글리콜을 함유한 헤페스 완충 식염수
HPLC : 고성능 액상 크로마토그래피(high performance liquid chromatography)
HP-SEC : 고성능 크기별 배제 크로마토그래피
HRP : 홀스-래디쉬 퍼옥시다제
i.v. : 정맥내
IL-2 : 인터루킨-2
MALDI-TOF : 분자량 측정법(matrix assisted laser desorption ionization time of flight)
MoAb : 단일클론 항체
MRT : 평균 체류 시간(mean residence time)
MS : 질량 분석법
NMM : N-메틸 모르포린
NMR : 핵자기 공명법
PAGE : 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법
PBS : 인산-완충 식염수
PS : 5당류
Q-TOF : 사중극자 질량 분석법(quadropole time of flight)
recH : 재조합 인간
RT : 실온
Rt : 체류 시간(retention time)
SDS : 나트륨 도데실 설페이트
TBTU : 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄테트라플루오로보레이트
TCA : 트리클로로아세트산
TEA : 트레이텔아민
TFA : 트리플루오로아세트산
THF : 테트라히드로푸란
Vss : 정상 상태에서의 분표 용량
재료 및 방법
1H-NMR 스펙트럼은 Bruker DRX-400(ultra shield)를 사용하여 400 MHz에서 기록하였다. 유기 용매에서의 화학적 변위는 테트라메틸실란에 대하여 ppm(δ)으로 기록하였다. DMF, 1,4-디옥산, NMM, 암모늄 아세테이트, B℃2O, TFA, DMSO, DCCI (Acros), 히드록실아민(50 wt. H2O 중의 %), 아이오도아세트산 무수물, GMBS (Sigma Aldrich), recH 인슐린(Diosynth), TEA, 6-아미노카프로산, N-히드록시숙신이미드(Janssen), THF(Biosolve), 2-머캅토-[S-아세틸]아세트산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(13), TBTU(Fluka), ACN(Merck), AcOH 및 Na2HPO4(J.T. Baker) 등을 언급한 생산 공급자로부터 공급받았다.
컬럼 크로마토그래피는 MP Biomedicals Germany GmbH kieselgel 60(MP silica 32-63, 60Å) 및 Merck LiChroprep RP-18(40∼63 ㎛)에서 수행하였다. TLC 분석은 Merck TLC plates kieselgel 60 F254에서 수행하였다. 화합물들은 UV 흡광법(254 nm)으로 가시화하거나/하고 USUI 시약(EtOH 중의 포스포르 폴리브덴산/ AcOH/ H---2SO4)으로 탄화하였다(charring). MALDI 스펙트럼은 Voyager DE PRO (Applied Biosystems, Fra분gham, MA, USA)를 사용하여, 양이온 및 음이온 모드에서 선형, 지연형 추출 모드로 얻었다. 재결정화한 알파-시아노 히드록시 신남산(CHCA, 3 g/L in 500 mL/L ACN /1 mL/L TFA)을 매트릭스로 사용하였다. 분자량은 2지점 보정법을 사용하여 측정하였다(예를 들어, m/z 16953 및 m/z 8477에서 미오글로빈이나, recH 인슐린 및 이의 단편 사슬 중 하나를 선정하여 측정함). Q-TOF 스펙트럼은 ESI-공급원을 사용하여 양이온 모드에서 PE Sciex API Q-star Pulsar를 통해 얻었다. 샘플들은 H2O에 용해시키고 역상 Zip Tip®을 사용하여 탈염시켰다. 디폴트 분석용 HPLC는 LunaTM C18(2) 컬럼(역상, 150 x 4.6 mm, 5 ㎛)을 사용하여 3종 길슨 펌프(305) 구배 시스템이 구비된 Gilson 234 autosampler에서 수행하였다. Gilson UV 검출기(118)를 사용하여 210 nm에서 검출하였다. 40℃의 컬럼 온도 및 1 mL/분의 유속으로, 5분간 95%의 용리액 A (H2O/ACN 중의 0.1% TFA, 9:1) 및 5% 용리액 B (ACN 중의 0.1% TFA)로 출발하여, 이어서 25분간 15 내지 50% ACN로의 선형 구배를 적용하여, 구배 용리를 수행하였다.
화학식 4의 분석용(analytical) HPLC 분석은 LunaTM C18(2) 컬럼(역상, 150 x 2.0 mm, 5 ㎛)을 사용하여 Shimadzu SCL-10A vp (system controller) 2웨이 구배 시스템에서 수행하였다. Shimadzu diode array UV 검출기(SPD-M10A vp)를 사용하여 214 nm에서 검출하였다. 구배 용리는 컬럼 온도 40℃ 및 유속 0.4 mL/분에서 수행하였다.
분취용(Preparative) HPLC는 LunaTM C18(2) column (역상, 250 x 50 mm, 10 ㎛)를 사용하는 단일 펌프(Waters 600) 구배 시스템이 구비된 Waters 2769 sample manager에서 수행하였다. Gilson UV 검출기(2996, photodiode array)를 사용하여 210 nm에서 검출하였다. 구배 용리는 50 mL/분의 유속으로, 10분간 90% 용리액 A (H2O/ACN 중의 0.1% TFA, 9:1) 및 10% 용리액 B (ACN 중의 0.1% TFA)으로 출발하여, 이어서 50분간 15 내지 50% 용리액 B로 선형 구배를 적용하여서 수행하였다.
분석용 음이온 교환 크로마토그래피는 Pharmacia Biotech MonoQ HR 5/5 컬럼을 사용하여 Pharmacia 펌프(P-900) 구배 시스템이 구비된 Pharmacia Akta Explorer에서 수행하였다. Pharmacia pH 및 전도성 검출기(pH/C 900)와 조합하여 210 nm에서 검출하기 위하여 Pharmacia UV 검출기(UV 900)를 사용하였다. AD 검출기(AD900)를 Chiralyser(IBZ)와 함께 사용하였다. 또한 Pharmacia 분획 수집기(Frac 950) 및 Pharmacia 오토샘플러(A 900)를 사용하였다. 유속 1 mL/분으로, 5분간 74% 용리액 A (ACN/H2O 2:8) 및 26% 용리액 B (ACN/2M NaCl 2:8)로 시작하여, 이어서 15분간 20% 용리액 A 및 80% 용리액 B로 구배를 적용하여서 디폴트 용리를 수행하였다.
분취용 음이온 교환 크로마토그래피는 Pharmacia Biotech XK16 Q-세파로스 패스트-플로우 컬럼을 사용하여 Pharmacia pump (P-50) 및 Pharmacia 구배 혼합기(LKB GP-10) 구배 시스템이 구비된 Pharmacia 시스템에서 수행하였다. Pharmacia UV 검출기(LKB-UV-MII)를 Biotechnics 전도성 검출기와 조합하여 214 nm에서 검출을 위해 사용하였다. 4.6 mL/분의 유속으로, 20분간 80% 용리액 A(H2O) 및 20% 용리액 B (H2O 중의 2M NaCl)로 시작하여, 이어서 210분간 20% 용리액 A 및 80% 용리액 B로 구배를 적용하여서 디폴트 구배 용리를 수행하였다.
Pharmacia Biotech XK26 Sephadex-G25 파인 컬럼을 사용하고 Watson-Marlow 펌프(101V)가 구비된 Pharmacia 시스템을 이용하여 세파덱스 G25(탈염)에서 분취용 겔 여과법을 수행하였다. Biotechnics 전도성 검출기와 함께 조합하여 Pharmacia UV 검출기(LKB-UV-MII)를 사용하여 214 nm에서 검출하였다. 10시간 동안 유속 1 mL/분 H2O으로 H2O를 사용하여 등장성 용리를 수행하였다.
화합물 6에 대한 분석용 HP-SEC를 Pharmacia SuperdexTM 30 HR 10/30 컬럼이 장착된 HP1100 크로마토그래피 시스템에서 수행하였다. 유속 0.4 mL/L에서 pH 7.0인 0.2 mol/L 인산 나트륨 완충액을 사용하여 용리하였다.
기타 접합체에 대한 분석용 HP-SEC를 Pharmacia SuperdexTM 75 HR 10/30 컬럼을 사용하여 분석용 Q-세파로스 크로마토그래피에 대해 기술한 바와 같이 Akta Explorer 시스템에서 수행하였다. 50 mM 암모늄 아세테이트를 사용하여 1 mL/분의 유속에서 등장성 용리를 수행하였다.
Pharmacia SuperdexTM 75 XK26 Hiload 26/60 prep-grade 컬럼을 사용하여, 분석용 Q-세파로스 크로마토그래피에 대하여 기술한 바와 같이 동일한 Akta Explorer 시스템에서 분취용 HPSEC를 수행하였다. 50 mM 암모늄 아세테이트를 사용하여 1.32 mL/분의 유속에서 등장성 용리를 수행하였다.
BIAtechnology를 사용하여 ATIII, 항인슐린 항체 및 인슐린 수용체에 대한 5당류 접합체의 결합 실험을 수행하였다. 센서그램 및 기록 시점은 BIA evaluation 3.2를 사용하여 블랭크 유세포 감산으로 분석하였다. IC50 값은 graphpad Prism 3.0 을 사용하여 산출하였다. A280 측정은 Nano Drop®ND-1000 UV-VIS 분광 측정기로 수행하였다.
반응식 1. 화합물 4의 합성
Figure 112007063778710-PCT00009
실시예 1
6-(2- 아이오도 - 아세틸아미노 )- 헥산산 (2)
1,4-디옥산 (60 mL) 중의 6-아미노-헥산산 (1) (0.37 g, 2.8 mmol)의 현탁액에 아이오도아세트산 무수물(0.50 g, 1.4 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 그리고 대기 온도에서 16 시간 동안 교반하였고 이 후 TLC 분석(CH2Cl2/MeOH/AcOH, 98/10/1, v/v/v)을 통하여 화합물 1이 친유성이 덜한 생성물 로 완전하게 전환되었음을 확인하였다. EtOAc (100 mL)을 첨가하고 상기 반응 혼합물을 0.10 M 수성 HCl 용액 (50 mL)으로 세정하였다. 이어서 유기층을 2회 염수(50 mL)로 세정하고 배합된 수층을 2회 EtOAc(75 mL)로 추출하였다. 상기 배합된 유기층을 건조시키고 (MgSO4), 진공 농축하였다. 이 잔유물을 실리카겔(CH2Cl2/MeOH/AcOH, 98/10/1, v/v/v)에서 크로마토그래피하여 6-(2-아이오도-아세틸아미노)-헥산산 (2) (0.45 g, >100%)을 얻었다. 1H NMR (MeOD): δ 3.67 (s, 2H), 3.17 (t, 2H), 2.29 (t, 2H), 1.66-1.33 (m, 6H).
실시예 2
6-(2- 아이오도 - 아세틸아미노 )- 헥산산2 ,5- 디옥소 - 피롤리딘 -1-일 에스테르 (3)
THF (10 mL) 중의 6-(2-아이오도-아세틸아미노)-헥산산 (2) (0.20 g, 0.67 mmol) 용액에 N-히드록시숙신이미드 (85 mg, 0.74 mmol) 및 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (0.21 g, 1.0 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 암중에서 16시간 동안 교반하였다. TLC 분석시 (EtOAc/Hep/AcOH, 80/20/1, v/v/v) 활성화 에스테르 3으로 완전하게 전환된 것을 확인하였으며, 아세트산 7 방울을 첨가하였다. 상기 혼합물을 이어서 밤새 냉동고에 보관하였다(-20℃). 조혼합물을 여과하고 여과물을 진공 농축하였다. 조생성물을 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/Hep/AcOH, 40/60/5 → 20/80/5, v/v/v)로 정제하고 적절한 분획을 농축하여 N-히드록시숙신이미드 에스테르 유도체 3 (0.18 g, 67%)을 얻었다. 1H NMR (MeOD): δ 3.67 (s, 2H), 3.18 (t, 2H), 2.82 (s, 4H), 2.63 (t, 2H), 2.0-1.0 (m, 6H).
실시예 3
화합물 4
DMF (15 mL) 중의 recH 인슐린 (50 mg, 8.6 umol) 현탁액에 상기 용액이 투명해 질때까지 H2O (9.0 mL)을 첨가하였다. 상기 용액을 실온으로 조정하기 위하여 15분간 교반하였다. H2O 중의 0.1 M NaOH를 점적하면서 상기 용액의 pH를 10으로 조정하였다. 이후, 상기 반응 플라스크를 주석 호일로 감쌌다. DMF (1.0 mL) 중의 A 용액 3 (5.0 mg, 8.6 umol)을 1분간 상기 반응 혼합물에 점적하였다. 상기 반응 혼합물을 마그네틱 교반 바를 사용하여 교반하고 pH는 10으로 유지하였다. 30분 이후H2O 중의 0.1% TFA(5.0 mL)를 가하여 상기 반응을 켄칭하였다. H2O (200 mL)을 첨가하고 상기 반응 혼합물을 동결 건조하여서 화합물 4 (60 mg, >100%, max. 8.6 mmol)를 얻었다. 5분간 80% 용리액 A (H2O 중의 0.1% TFA) 및 20% 용리액 B (ACN)로부터 시작하여, 이어서 30분간 20% 용리액 A 및 80% 용리액 B의 구배를 적용하여, HPLC (Shimadzu, 역상) 분석을 수행한 결과 단일치환된 생성물이 45% 존재하는 것을 확인하였다(recH 인슐린 Rt: 12.84 분; 화합물 4 Rt: 13.54 분; B29/A1 이중치환된 생성물: Rt 14.16 분). 상기 조 생성물은 정제없이 다음 반응에서 사용하였다.
실시예 4
화합물 6
조화합물 4 (60 mg)을 가스를 제거(N2를 통과시킴)한 0.1 M Na2HPO4 완충액 중의 0.05 M NH2OH 용액 (25 mL, pH 7.0)에 용해시켰다. 상기 반응 혼합물을 마그네틱 교반 바를 사용하여 교반하고 30분간 가스를 제거하였다(N2를 통과시킴). 이어서 [Angew. Chem . Intl . Ed . (1996), 35, 331-333]에 기재된 바와 같이 제조한 5당류-스페이서 화합물 5(95 mg, 43 umol)을 고체로 첨가하고 이 반응 혼합물을 질소 분위기하에서 16시간 동안 교반하였다.
반응식 2. 화합물 6의 합성 .
Figure 112007063778710-PCT00010
Figure 112007063778710-PCT00011
5당류 -인슐린 접합체 6의 정제.
상기 문장의 반응 혼합물로부터, 음이온 교환 크로마토그래피(포획 단계) 및 크기별 배제 크로마토그래피(연마 단계)를 통하여 거의 균질하게 단일치환된 5당류-인슐린 접합체 6을 정제하였다.
상기 접합체-함유 용액을 20 mmol/L의 인산나트륨 완충액(pH 8.0)으로 평형화시킨 Q-세파로스 FF 컬럼에서 분석하였다. 단백질이 존재하지 않는 분획은 컬럼을 통과시키고 난 후, 평형 완충액으로 대량 세정을 수행하여 A280가 기본값으로 되 돌아 올 때까지 세정하였다. 수퍼덱스 30을 이용한 분석용 HP-SEC 및 MALDI-TOF-MS을 통하여 측정한 바와 같이, 결합한, 비반응 인슐린을 대략 0.4 mol/L NaCl로 용리하고 단일 치환된 5당류-인슐린 접합체는 0.7 mol/L NaCl에서 용리하였다. 상기 접합체 분획을 울트라여과법으로 농축하거나 또는 용리 단계에서 2 mol/L NaCl 범프를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하고 인산-완충 식염수로 평형화시킨 분취용 수퍼덱스 30 컬럼을 이용하여 농축시켰다. HP-SEC 및 MALDI-MS를 통해 측정한 바에 따라 단일접합체를 함유하는 분획을 모았다. 최종 생성물을 에탄올/드라이아이스 혼합물에서 스냅 냉동시키고 나서 -70℃에서 보관하였다. 상기 접합체 농축물은 1 mg/mL에 대하여 0.8의 흡광 계수를 사용하여 A280 측정으로 평가하였다.
화합물 6의 특징 분석
정제한 5당류-인슐린 접합체 6에 대하여 인슐린에 대한 ELISA 및 분석물로 인간 인슐린 수용체 및 인간 ATIII를 사용하여 생분자 상호작용 분석법(BIA)을 통해 상기 접합체 6을 분석하였다. 순도 및 단량체성(monomericity)은 수퍼덱스 30에서의 HP-SEC 및 MALDI-MS로 평가하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 5당류-인슐린 접합체 6의 2 뱃치는 인슐린-특이적 ELISA를 통해 식별되는데, 이는 면역 반응성 인슐린 부분이 존재함을 의미한다. Biocore에 의한 BIA 실험으로부터, 5당류-접합된 인슐린이 여전히 인간 인슐린 수용체에 결합할 수 있음을 결론 내릴 수 있다(Fig. 2a). 이들 실험에서 인간 인슐린 에 대한 MoAb(클론 M3222213, 10-130, 뱃치 223, Fitzgerald Industries International, MoAb 13로 표시)를 표준 아미노 커플링 방법을 통해 CM5 센서 칩에 고정시켰다. HBS-EP (Biacore, cat. No. 22-0512-44)는 5 uL/분의 유속으로 러닝 완충액으로 사용하였다. 인슐린 접합체를 주입하면 고정된 항체에 접합체가 결합하게 된다. 상기 면역결합된 인슐린 접합체는 인슐린 수용체뿐만 아니라 ATIII과 결합하는데, ATIII은 공유결합된 5당류를 표시하는 것이다 (Fig. 2b).
5당류-인슐린 접합체 6의 MALDI-TOF 스펙트럼은 재료 및 방법에 기술한 바와 같이 얻을 수 있다. 분석하기 전, 샘플을 탈염시키고 uC18-ZipTips (Millipore Corporation, Billerica MA, USA)으로 농축시킨다. 500 ml/L ACN/ 1 ml/L TFA 중의 10 g/L 알파-시아노를 함유하는 용액 1 uL에서 스테일레스 스틸 MALDI 표적에 대하여 직접 용리하였다. 도 3은 대략 m/z 6700 및 7400에서 피크가 나타나는 단일치환된 5당류-인슐린 접합체의 전형적인 MALDI-TOF MS 프로파일을 나타낸다. 명백한 불균질성이 나타나는 것은 일련의 80 kDa의 손실이 발생하는 5당류 부분의 레이저-유도 탈황산에 의해 야기되는 것이다. 이중치환된 인슐린의 특징인 m/z 9400 범위에서의 피크가 확인되지 않았기 때문에 MALDI-TOF MS 분석에서는 이중치환된 5당류-인슐린 접합체는 확인되지 않았다. 주목할 것은 비반응 인슐린에 대한 피크도 역시 없었다는 점이다(m/z 5808). HP-SEC 분석(Fig. 4)은 22분의 체류 시간을 나타내는 주요 피크를 보여주고 있다. 순도는 97%로 측정되었다(비반응 인슐린과 이중치환 접합체가 없는 것으로 나타남).
실시예 5
화합물 11
5당류 7 (46 mg) [이는 국제공개특허 제2001/42262호에 기술된 바와 같이, 유도화한 단당류 5를 문헌 [Bioorg. Med. Chem. (1994), 2, 1267-1280]에 기술된 바와 같이 4당류 30에 대한 합성 경로를 수행하여 얻어진 4당류와 커플링시켜서 얻을 수 있는데, 4당류에 대한 합성 경로에서는 이들 출판물들에서 기술된 바와 유사한 방법으로, 예컨대 탈보호 및 황산화 등을 포함하는 방법을 통하여 환원 말단 단당류 빌딩 블록 12를 메틸 2,3-디-O-벤질-6-O--메틸-a-D-글루코스로 교체시킨다] 및 글리콜 유도체 10 (18 mg, 1.6 equiv.)를 질소 분위기하에서 DMF (5 mL)에 용해시킨다. NMM (61 uL, 5 equiv.)를 첨가하고 상기 반응 혼합물을 밤새 대기 온도에서 교반시켰다. 상기 용매를 진공 증발시키고 남은 잔류물을 분취용 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 적절한 분획을 배합하고 분취용 G25-컬럼에서 탈염시켰다. 상기 배합된 분획을 동결 건조하여서 화합물 11 (29 mg, 57%)을 백색 분말로 얻었다. 순도 >98% (분석용 음이온 교환, UV210nm). 1H-NMR (D2O, 400 MHz, HH-COSY): δ 5.31 (d, 1H), 5.23 (m, 1H), 4.91 (m, 1H), 4.45-4.35 (m, 1H), 4.48-3.93 (m, 11H), 3.87-3.62 (m, 9H), 3.60-3.45 (m, 39H), 3.41-3.34 (m, 15H), 3.33-3.23 (m, 7H), 3.18-3.08 (m, 2H), 2.97 (t, 2H), 2.23 (s, 3H).
실시예 6
화합물 12
국제공개특허 제2001/42262호에 기술된 바와 같이 제조한, 5당류 8 (0.2 g)과, [Angew. Chem. Intl. Ed. (1996), 35, 331-333]에서 기술한 바와 같이 제조한 글리콜 유도체 10 (53 mg, 1.3 equiv.)을 DMF (5.0 mL)에 용해시켰다. NMM (61 uL, 5 equiv.)을 첨가하고 상기 반응 혼합물을 대기 온도에서 밤새 교반하였다. 상기 용매를 진공 증발시키고 분취용 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 상기 적절한 분획을 배합하여서 G25-컬럼에서 탈염시켰다. 배합된 분획을 동결건조하여 화합물 12 (0.13g, 55%)를 백색 분말로 얻었다. 순도 >95% (분석용 음이온 교환, UV210nm). 1H-NMR (D2O, 400 MHz, HH-COSY): δ 5.12 (d, 1H), 5.03 (d, 1H), 4.70 (d, 1H), 4.34-4.18 (m, 2H), 4.09-4.03 (m, 1H), 3.98-3.90 (m, 5H), 3.85-3.74 (m, 6H), 3.66-3.48 (m, 7H), 3.43-3.24 (m, 41H), 3.23-3.15 (m, 13H), 3.12 (m, 2H), 3.10-3.01 (m, 7H), 2.99-2.88 (m, 3H), 2.78 (t, 2H), 2.04 (s, 3H).　
실시예 7
화합물 14
5당류 9 (100 mg) [국제공개특허 제01/42262호에 기술된 유도화된 단당류 5와 US 2004/0024197에 기술된 4당류 48을, 탈보호 및 황산화를 비롯하여, 이들 특허 출원서에 기술된 바와 유사한 방법을 이용하여 커플링시켜서 얻음] 및 화합물 13 (18 mg, 1.5 equiv.)을 DMF에 용해시켰다. NMM (15 uL, 2.5 equiv.)를 첨가하고 상기 반응 혼합물을 대기 온도에서 밤새 교반하였다. 상기 용매를 진공 건조하고 남은 잔류물을 분취용 G25-컬럼으로 정제하였다. 적절한 분획을 배합하고 동결건조하여서 화합물 14 (84 mg, 79%)을 백색 분말로 얻었다. 순도 >95% (분석용 음이온 교환, UV210nm). 1H-NMR (D2O, 400 MHz, HH-COSY): δ 5.12 (d, 1H), 5.09 (d, 1H), 4.82 (d, 1H), 4.40-4.26 (m, 1H), 4.10-3.87 (m, 8H), 3.82-3.73 (m, 4H), 3.67-3.43 (m, 11H), 3.41-3.35 (m, 14H), 3.31-3.26 (m, 13H), 3.24-3.15 (m, 8H), 3.14-3.02 (m, 5H), 3.01-2.87 (m, 3H), 2.08 (s, 3H).
반응식 3. 5당류 스페이서 유도체 11, 12 및 14의 합성 .
Figure 112007063778710-PCT00012
실시예 8
화합물 15
RecH 인슐린 (779 mg)을 무수 DMSO (25 mL) 및 AcOH (465 uL)에 용해시켰다. Boc2O (73 mg, 2.5 equiv)를 상기 용액에 첨가하고 그 결과 생긴 혼합물을 대기 온 도에서 5 시간 동안 교반시켰다. 상기 반응은 H2O/ACN 중의 0.1% TFA(9/1, v/v, 150 mL)를 사용하여 켄칭하였고 용액을 4번 동결건조하였다. 잔류물을 H2O/ACN (9/1)/ACN (3:1) 중의 0.1% TFA에 용해시키고 주요 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다. 적절한 분획을 배합하고 동결건조하여 A1,B1-diBoc 인슐린 15 (200 mg, 26%)를 백색 분말로 얻었다. 순도 98% (분석용 HPLC). C267H399N65O81S6 = 6008에 대하여 MS 산출, MALDI-TOF 6008에서 확인됨 (내부 참조 표준으로 recH 인슐린 사용함).
실시예 9
화합물 16
RecH 인슐린 (752 mg)을 무수 DMSO (20 mL) 및 TEA (0.75 mL)에 용해시켰다. DMSO (5 mL) 중의 Boc2O (66 mg, 2.5 equiv.)를 상기 용액에 첨가하였고, 반응물을 대기 온도에서 1.5 시간 동안 교반시켰다. 반응은 H2O/ACN 중의 0.1% TFA(9/1, v/v, 150 mL)를 넣어 켄칭시키고 상기 혼합물을 3번 동결 건조시켰다. 생성된 잔여물을 H2O/ACN (9/1) 중의 0.1% TFA에 용해시키고 분취용 HPLC를 수행하였다. 적절한 분획을 배합하고 동결 건조하여 A1,B29-diBoc 인슐린 16을 백색 분말로 얻었다 (332 mg, 43%). 순도 >98% (분석용 HPLC). C267H399N65 O81S6 = 6008에 대하여 MS 산출,MALDI-TOF 6008에서 확인됨 (내부 참조 표준으로 recH 인슐린 사용함).
실시예 10
화합물 17
A1,B1-diBoc 인슐린 15 (200 mg)을 무수 디메틸 술폭시드 (5 mL) 및 트리에틸아민 (145 uL)에 용해시켰다. GMBS (45 mg, 5 equiv.)를 첨가하고 상기 반응 혼합물을 대기 온도에서 30 분간 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 H2O/ACN (9/1, v/v, 150 mL)중의 0.1% TFA로 켄칭시키고 얻은 혼합물을 동결 건조하여 A1,B1-diBoc-B29-GMB 인슐린 17 (0.5 g, 조산물)을 얻었으며 이를 후속 정제없이 다음 단계에서 사용하였다.
실시예 11
화합물 18
A1,B29-diBoc 인슐린 16 (330 mg)을 무수 DMSO (5 mL) 및 TEA (332 uL)에 용해시켰다. GMBS (230 mg, 15 equiv.)를 첨가하고 상기 반응 혼합물을 대기 온도에서 30 분간 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 H2O/ACN (9/1, v/v, 150 mL) 중의 0.1% TFA로 켄칭하고 얻어진 용액을 동결 건조하여 A1,B29-diBoc-B1-GMB 인슐린 18 (0.6 g, crude)을 얻었으며, 이를 후속 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
실시예 12
화합물 19
A1,B1-diBoc-B29-GMB 인슐린 17 (0.5 g, 조산물)을 TFA (5 mL)에 용해시키고 대기 온도에서 10 분간 교반하였다. 상기 TFA를 감압하에서 제거하고, 잔류물을 H2O/ACN (2/1, v/v) 중의 0.1% TFA에 용해시키고 그 용액으로 곧바로 분취용 HPLC를 수행하였다. 적절한 분획을 배합하고 동결 건조시켜서 백색 분말로 B29-GMB 인슐린 19 (93 mg, 47%)을 얻었다. 순도 >99% (분석용 HPLC).
실시예 13
화합물 20
A1,B29-diBoc-B1-GMB 인슐린 18 (0.6 g, 조산물)을 TFA (5 mL)에 용해시키고 대기 온도에서 10 분간 교반하였다. TFA를 진공 증발시키고, 조 생성물을 H2O/ACN (9/2, v/v) 중의 0.1% TFA에 용해시키고 얻은 용액으로 분취용 HPLC를 수행하였다. 적절한 분획을 배합하고 동결 건조시켜서 B1-GMB 인슐린 20을 백색 분말로 얻었다 (127 mg, 40%). 순도 >99% (분석용 HPLC). C267H399N65O81S6 = 5973로 MS에서 산출, MALDI-TOF 5973에서 확인 (recH 인슐린을 내부 참조 표준으로 사용함).
실시예 14∼19
GMB-인슐린과 5당류의 접합을 위한 일반적인 과정
GMB-인슐린 19 또는 20 (25 mg)을 0.1 M Na2HPO4 완충액 (12 mL, pH 7.0, 상기 용액을 N2 통과시켜 가스 제거함). 상기 용액을 마그네틱 교반 바를 사용하여 교반하고 추가 30분간 가스를 제거하였다. 그리고 나서 5당류 5, 11, 12 또는 14 (23 mg, 2.5 equiv.)를 고체로 첨가하고, 이어서 NH2OH (50 uL, 0.05M)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 대기 온도에서 질소 분위기하에서 교반하였다. 16 시간 후 상기 반응 혼합물로 분취용 HPSEC (S75)를 수행하였다. 적절한 분획을 배합하고 동결 건조하여 인슐린-펜타 접합체 24, 25, 26, 27, 28, 29를 백색 분말로, 대체로 30% ∼50% 수율로 얻었다. 수율은 recH 인슐린에 대한 것과 동일한 몰 흡광 계수를 사용하여 A280 측정으로 결정하였다.
실시예 14
화합물 24
일반적인 과정에 따라서 B29-GMB 인슐린 19 (25 mg)를 5당류 5 (23 mg)와 접합시켜서 B29-5당류 인슐린 유도체 24 (15 mg, 45%)를 얻었다. ESI-MS에서 C320H487N67O137S14= 7913으로 산출, Q-TOF 2638.7에서 확인, M3+; 1979.2 M4+; 1583.6 M5+, 1319.8 M6+. 순도 >98% (분석용 HPSEC, 분석용 음이온 교환).
실시예 15
화합물 25
일반적인 과정에 따라서 B1-GMB 인슐린 20 (25 mg)을 5당류 5 (23 mg)와 접합시켜서 B1-5당류 인슐린 유도체 25 (16 mg, 47%)를 얻음. ESI-MS에서 C320H487N67O137S14= 7913로 산출됨, Q-TOF 2637에서 확인됨, M3+; 1978 M4+; 1583 M5+. 순도 >95% (분석용 HPSEC), >98% (분석용 음이온 교환).
실시예 16
화합물 26
일반적인 과정에 따라서 B29-GMB 인슐린 19 (13 mg)를 5당류 14 (12 mg)와 접합시켜서 B29-5당류 인슐린 유도체 26 (5 mg, 31%)를 얻었다. ESI-MS에서 C312H471N67O133S14= 7737로 산출됨, Q-TOF 2578에서 확인함. M3+; 1934 M4+. 순도 >98% (분석용 HPSEC).
실시예 17
화합물 27
일반적인 과정을 통하여 B1-GMB 인슐린 20 (15 mg)과 5당류 14 (13 mg)를 접합시켜서 B1-5당류 인슐린 유도체 27 (8 mg, 40%)를 얻었다. ESI-MS에서 C312H471N67O133S14= 7737로 산출됨, Q-TOF 2578에서 확인됨. M3+; 1934 M4+. 순도 >98% (분석용 HPSEC).
실시예 18
화합물 28
일반적인 방법으로 B29-GMB 인슐린 19 (15 mg)와 5당류 12 (13 mg)를 접합시켜서 B29-5당류 인슐린 유도체 28 (6 mg, 30%)를 얻었다. ESI-MS에서 C321H489N67O134S13= 7847로 산출됨, Q-TOF 1962에서 확인됨. M4+; 1570 M5+; 1308 M6+. HPSEC 순도 >98%.
실시예 19
화합물 29
일반적인 과정에 따라서 B29-GMB 인슐린 19 (15 mg)와 5당류 11 (13 mg)을 접합시켜서 B29-5당류 인슐린 유도체 29 (7 mg, 33%)를 얻었다. ESI-MS에서 C322H491N67O131S12= 7782로 산출됨, Q-TOF 2593에서 확인됨, M3+; 1945 M4+; 1556 M5+. 순도 >98% (분석용 HPSEC).
반응식 4. 인슐린-5당류 접합체 24 - 29의 합성
Figure 112007063778710-PCT00013
Figure 112007063778710-PCT00014
특징 분석
분석용 크기별 배제 크로마토그래피
화합물 24∼29을 수퍼덱스 75 26/10 컬럼을 사용하여 분석용 HP-SEC 분석을 수행하였다. 유속 1.0 mL/분으로 50 mM 암모늄 아세테이트를 사용하여 용리를 수행하였다.
인슐린 접합체 24-29의 HPSEC 분석
화합물 HPSEC (수퍼덱스 75)
Rt 순도
24 12.7 분 >98%
25 12.5 분 >95%
26 12.7 분 >98%
27 12.5 분 >98%
28 12.7 분 >98%
29 12.8 분 >98%
recH 인슐린 15.0 분 >98%
모든 접합체들인 단일 피크로 관찰되었으며 (적어도 >95% 순도) 이는 인슐린-5당류의 응집 형태가 없음을 나타낸다.
N-말단 서열 분석
상기 인슐린-5당류 접합체 24∼29를 비롯하여, 이에 상응하는 전구체 15, 16, 19 및 20에 대하여 N-말단 서열 분석(에드만 분해법)을 수행하였다. 각 사이클 수행시, 상기 B29 치환된 인슐린 유도체 15, 19, 24, 26, 28 및 29는 접합체의 초기 양에 필적하는 수준으로 A-사슬 및 B-사슬 아미노산 모두를 등몰량으로 수득하였다. 이는 두개의 N-말단에 대한 완전한 접근성을 의미하며 따라서 B29 위치에 한정되는 접합체 부분이 없음을 의미한다. 반대로, B1-치환된 인슐린 유도체 16, 20, 25 및 27의 N-말단 서열 분석 동안에는 A 사슬 아미노산만이 확인되었는데, 이는 B1 위치에서 접합되어 그 결과 B-사슬의 N-말단에서 에드만 분해가 억제되었음을 의미하는 것이다.
생분자 상호작용 분석을 이용한 경쟁적 hATIII 결합 분석
본 실험의 원리 및 목적: 생분자 상호작용 분석법(BIA)은 센서 칩 표면에 상호작용제 중 하나를 공유적으로 고정시키고, 상기 표면 상에 연속 완충액을 흘려주면서 나머지 다른 상호작용제를 주입하여서 (생)분자간의 상호작용을 연구하는 방법이다. 결합이 되면 상기 표면상의 굴절율이 변화되어 이 굴절율 변화로 결합이 기록되며 결합은 상호작용제의 분자량(Mw)에 비례한다.
hATIII과 5당류 접합체의 상호작용을 실험하기 위하여, 화합물 9를 센서 칩 표면에 공유적으로 커플링시켰다. hATIII와 5당류의 결합으로 결합된 (소) 5당류 리간드와 (큰) hATIII 분석물 사이의 Mw 차이로 인하여 강한 시그날이 생성된다. 일정량의 hATIII와 다양한 농도의 자유 5당류 또는 접합체를 함유하는 미리 항온반응시킨 샘플을 상기 표면에 주입하였다. 사전 항온반응 동안 ATIII와 5당류 또는 접합체가 결합하면 그 결과 고정된 5당류에 결합하는 ATIII이 감소하게 된다. 이러한 경쟁적 결합 분석법으로 각 5당류 접합체에 대한 IC50 값을 결정할 수 있게 된다.
실험 과정: pH 8.5에서 아민 커플링을 통하여 CM5 센서에 화합물 9를 공유적으로 커플링시킨다. 상기 센서를 15 분간 EDC/NHS으로 활성화시키고, 이어서 화합물 9를 100 ㎍/mL의 농도로 주입시킨다. 미반응 히드록시숙신이미드기는 7분간 에탄올아민과 반응한다. 상기 표면에 25 uL/분의 유속으로, 5 uL 5 mol/L NaCl을 3번 단주입하여 표면을 재생시킨다. 5당류의 고정을 검출할 수는 없으나, 상기와 같이 처리한 표면에 대한 hATIII의 결합은 특이적으로 확인할 수 있는데, 이는 표면에 5당류가 존재한다는 것을 의미한다. 일련의 농도로 hATIII를 시험하여 억제에 감응하는 농도를 평가하였다(최대 결합 80%에서 수행). 유속 20 uL/분에서 25℃에서 연속적으로 블랭크 및 고정 표면에서 3분간 주입을 수행하였다. 170 초가 기록 시점이 되어 기록되기 시작했다. 상기 표면은 5 mol/L NaCl을 12 초 주입하여 재생하였다.
일정 농도의 hATIII (즉, 15 nmol/L) 및 0.78 내지 100 nM 농도 범위의 5당류 접합체에 대하여 샘플으 시험하였다. 5당류 접합체가 없는 기록 시점이나 hATIII 주입시를 100% 결합으로 설정하였다. 최대 결합과 비교하여 5당류 및 접합체의 상대 결합 %를 사용하여, Log[농도] 대 결합%를 그래프화하여 에스자형 그래프(다양한 기울기를 가짐)를 얻었으며 이로부터 IC50 값을 유추하였다.
경쟁적 결합 분석(BIA 실험)에서 ATIII 결합 잠재력을 나타내는 IC50 값
화합물 BIA (경쟁적 ATIII 결합)
IC50 95% 신뢰 간격
7 (참조용) 96 nM 53.1 ∼ 173 nM
8 (참조용) 58 nM 33.7 ∼ 99.1 nM
9 (참조용) 5.5 nM 5.1 ∼ 5.8 nM
24 8.5 nM 7.9 ∼ 9.3 nM
25 9.1 nM 8.2 ∼ 10.0 nM
26 4.5 nM 4.2 ∼ 4.7 nM
27 15 nM 13.3 ∼ 17.0 nM
28 96 nM 50.6 ∼ 183 nM
29 68 nM 33.9 ∼ 137 nM
결과 : 참조용 캐리어 5당류 7 내지 9(도 5, 표 2) 간의 IC50 값의 차이를 통하여 ATIII에 대한 결합 친화도 측정값인, ATIII에 대한 경쟁적 결합 잠재력은 이들 분자내에 함유된 설페이트 기의 수를 변화시켜서 조율할 수 있다는 것을 확인하였다. 모든 상응하는 인슐린 5당류-접합체(24 내지 29)의 ATIII에 대한 (경쟁적) 결합 잠재력(IC50)은 참조용 모체 5당류 7 내지 9와 비교하여 동일한 범위에 존재한다(도 6, 표 2). 이러한 결과는 상기 접합체들의 약력학적 특성은 ATIII에 대한 다양한 결합 친화성을 갖는 대체적인 캐리어 5당류를 사용하여 조율할 수 있음을 의미하는 것이다.
질량 분석법
5당류 접합체에 대한 전형적인 질량 분석에 대하여 도 7에 도시하였다. 예컨대 브루토 식이 C320H487N67O137S14 이고 단일 동위원소 질량이 7913인 화합물 24를 ESI-QTOF 시스템으로 분석하였다. ESI-MS 스펙트럼에서, recH 인슐린의 전하 분포도와 일치되게 m/z 비율 1319.8 (6+), 1583.6 (5+), 1979.2 (4+), 2638.7 (3+)에서 다수하전 이온이 충돌하였다. 또한, C320H487N67O137S14 (화합물 24)에 대하여 무작위로 선택한 다수의 하전된 피크(예를 들어, 5+)의 동위원소 분포는 programme Isopro를 이용하여 이론적으로 산출된 동위원소 분포와 일치한다(도 7a의 점선 참조).
5당류와 GnRH 길항성 데카펩티드의 접합을 위한 일반적인 과정(실시예S 20, 21, 24, 25)
가니릴릭스 유도체 30 또는 35 (70 mg)를 질소 분위기하에서 DMF (20 mL)에 용해시켰다. TBTU (14 mg, 1.05 equiv.) 및 NMM (25 uL, 5 equiv.)를 첨가하고 상기 혼합물을 대기 온도에서 1 시간 동안 교반하였다. 5당류 8 또는 9 (88 mg, 1.1 equiv.)를 DMF (10 mL)에 용해시켜 현탁액을 얻었다. 상기 현탁액을 상기 반응 혼합물에 첨가하고 나머지 혼합물을 대기 온도에서 16 시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 물 (200 mL)로 희석하고 동결건조시켰다. 얻어진 잔유물을 0.01 M 암모늄 아세테이트 (pH 7) 및 블록-용리으로 10 내지 50% ACN 구배를 통하여 역상 실리카(C18)에서 정제하였다. 적절한 분획을 배합하고 동결 건조하여 가니릴릭스 5당류 접합체 31, 32, 36 또는 37을 백색 분말로 얻었다. 5분간 90% 용리액 A (0.01M 암모늄 아세테이트) 및 10% 용리액 B (ACN)으로 출발하고, 이어서 30분간 100% 용리액 B까지의 구배를 적용하여 분석용 HPLC를 수행하였다.
실시예 20
화합물 31
[J. Med. Chem. 1992, 35, 3942-3948]에 기술된 바와 같이 고체상 펩티드 합성법으로 제조한 가니릴릭스-유도체 30 (70 mg)를 일반적인 과정에 따른 5당류 8 (88 mg)과 접합시켜서 화합물 31 (16 mg, 40%)을 얻었다. 순도 96% (분석용 HPLC), 97% (분석용 음이온 교환). ESI-MS에 의해 C126H191ClN18O62S6= 3175.0359로 산출됨, 792.7390 [M-4H]4-, 1057.3258 [M-3H]3-, 1062.9883 [M+NH3 ---3H]3-에서 확인됨. 1H-NMR (D2O, 400 MHz, HH-COSY):δ 8.56 (m, 1H), 8.53 (m, 1H),　8.10 (m, 1H), 7.76 (m, 2H), 7.68 (m, 2H), 7.47 (m, 1H), 7.39 (m, 2H), 7.16 (m, 3H), 7.04 (m, 2H), 6.95 (m, 2H), 6.63 (m, 2H), 5.35-5.25 (m, 2H), 4.95 (m, 1H), 4.68-4.61 (m, 1H), 4.61-4.51 (m, 2H), 4.50-4.38 (m, 2H), 4.38-4.25 (m, 3H), 4.24-3.96 (m, 15H), 3.90-3.84 (m, 1H), 3.84-3.67 (m, 8H), 3.67-3.20 (m, 53H), 3.19-3.09 (m, 4H), 3.09-2.98 (m, 12H), 2.98-2.84 (m, 8H), 2.77 (m, 2H), 2.13 (m, 1H), 1.96-1.72 (m, 5H), 1.68-1.42 (m, 5H), 1.42-1.20 (m, 7H), 1.18-0.89 (m, 13H), 0.85-0.71 (m, 5H).
실시예 21
화합물 32
가니릴릭스-유도체 30 (70 mg)를 일반적인 과정에 따른 5당류 9 (88 mg)와 접합시켜서 화합물 32 (52 mg, 35%)를 얻었다. 질량은 C125H189ClN18O65S7= 3240.9770로 산출; ESI-QTOF 809.2219 [M-4H]4-, 1079.2994 [M-3H]3-, 1084.9739 [M+NH3]3-, 1090.6340, [M+2NH3-3H]3-에서 확인됨. 1H-NMR (D2O, 400 MHz, HH-COSY): δ 8.45 (m, 1H), 8.38 (m, 1H), 7.90 (m, 1H), 7.78 (d, 1H), 7.73 (m, 2H), 7.59 (m, 1H), 7.50 (m, 1H), 7.43 (m, 2H), 7.20 (m, 3H), 7.05 (d, 2H), 6.97 (m, 2H), 6.66 (m, 2H), 5.40-5.30 (m, 2H), 5.09 (d, 1H), 4.67-4.48 (m, 2H), 4.40-3.92 (m, 18H), 3.92-3.75 (m, 7H), 3.77-3.17 (m, 56H), 3.12-3.02 (m, 11H), 3.02-2.98 (m, 8H), 2.97-2.83 (m, 4H), 2.81-2.75 (m, 2H), 2.14 (m, 1H), 1.99-1.86 (m, 5H), 1.82-1.23 (m, 12H), 1.22-0.90 (m, 13H), 0.87-0.72 (m, 5H). 순도 95% (분석용 HPLC), 97% (분석용 음이온 교환 순도).
실시예 22
화합물 34
화합물 30 (100 mg)을 DMF에 용해시켰다. TBTU (36 mg, 2 equiv.) 및 NMM (60 uL, 10 equiv.)을 첨가하고 상기 반응 혼합물을 대기 온도에서 1 시간 동안 교반하였다. 이어서 국제공개특허 제2005/090382호에 기재된 바와 같이 제조한, 화합물 33 (34 mg, 2 equiv.)을 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 대기 온도에서 16 시간 동안 교반하였다. 상기 용매를 진공하에서 제거하고 남은 잔여물을 물/CAN에 용해시켰으며, 얻은 용액은 분취용 HPLC (구배: 45분간 80% 용리액 A (H2O 중의 0.1% TFA) 및20% 용리액 B (ACN)에서 20% 용리액 A 및 80% 용리액 B)를 수행하였다. 적절한 분획을 배합하고 동결 건조시켜서 백색 분말로 화합물 34 (60 mg, 60%)를 얻었다. 15 분간 75% 용리액 A (H2O 중의 0.1% TFA) 및 25% 용리액 B (CH3CN)에서 출발하여 20% 용리액 A 및 80% 용리액 B의 구배를 가하여 분석용 HPLC를 수행하였다. 질량은 C94H139ClN18O19 = 1859로 산출, MALDI-TOF 1860 [M+H]+ 및 1882 [M+Na]+에서 확인됨. 순도 >90% (분석용 HPLC).
실시예 23
화합물 35
화합물 34 (60 mg)을 H2O/TFA/ACN (7 mL, 5:1:1)에 용해시키고 대기 온도에서 2 시간 동안 교반하였다. 여분의 TFA (2.5 mL)를 첨가하고 상기 반응 혼합물을 추가 22 시간 동안 교반하였다. TFA를 진공 증발시키고 남은 용액은 동결 건조하여 화합물 35 (45 mg, 77%)를 백색 분말로 얻었다. 질량은 C90H131 ClN18O19= 1803로 산출, MALDI-TOF 1804 [M+H]+ 및 1826 [M+Na]+에서 확인. 순도 >95% (분석용 HPLC).
실시예 24
화합물 36
가니릴릭스-유도체 35 (17 mg)를 일반적인 과정에 따른 5당류 8 (19 mg)과 접합시켰다. 분취용 HPLC (구배: 5분간 90% 용리액 A (0.01 M 암모늄 아세테이트) 및 10% 용리액 B (CH3CN), 이어서 50분간 100% B까지 구배)를 통해 추가 정제를 수행하였다. 적절한 분획을 배합하고 동결건조하여 화합물 36 (2 mg, 6%)을 얻었다. 순도 94% (분석용 HPLC), >98% (분석용 음이온 교환).
실시예 25
화합물 37
가니릴릭스-유도체 35 (17 mg)를 일반적인 과정에 따른 5당류 9 (19 mg)와 접합시켰다. 상기 화학식 36에 기술한 바와 같이 분취용 HPLC로 추가 정제를 수행하였다. 적절한 분획을 배합하고 동결 건조하여 화합물 37 (1.16 mg, 3%)을 얻었다. 순도 88% (분석용 HPLC). 분석용 음이온 교환 순도 >95%.
반응식 5. 화합물 31, 32, 36 및 37의 합성.
Figure 112007063778710-PCT00015
결론 : 접합체 31 및 32, 다른 한편으로는 접합체 36 및 37 사이의 ATIII에 대한 경정적 결합 잠재력의 차이는 연결 잔기 길이에 상관없이, ATIII에 대한 친화성은 이들 분자에 함유된 설페이트 기의 수를 변화시켜서 조율할 수 있다는 것을 보여준다(도 8 참조). 이러한 결과는 또한 이들 접합체의 생체내 약력학적 특성이 5당류 선택에 따라서 조율될 수 있음을 의미하는 것이다(이하 약력학 실험 참조). 또한 ATIII에 대한 접합체의 친화성은 특이적인데, 이는 비접합 모펩티드 가니릴릭스가 ATIII에 대한 경쟁적 결합을 보이지 않기 때문이다.
실시예 24
화합물 39
NeoMPS (Strasbourg, France)에서 공급한 화합물 38 (26.5 mg, 8.4 mmol)을 가스를 제거한 0.1 M Na2HPO4/NaH2PO4 완충액 (16 mL, pH 7.0)에 용해시켰다. 5당류 5 (45.5 mg, 21 mmol, 2.5 equiv.)를 질소 분위기하에서 첨가하고 얻어진 혼합물을 대략 10 분간 교반하였다. 이어서 NH2OH (50 중량%, 69 uL)의 수성 용액을 첨가하고 상기 반응 혼합물을 16 시간 동안 교반하였다. 상기 생성물을 Q-세파로스 컬럼 (2M NaCl(aq)/H2O/ACN, 10/40/1 → 0/10/1, v/v/v)에서 정제하였다. 적절한 분획에 대하여 상기 기술한 바와 같이 G25 세파덱스 크로마토그래피를 사용하여 탈염을 수행하여 화합물 39 (15.7 mg, 35%)를 수득하였다. 상기 수율은 1 mg/mL 용액에 대하여 0.48의 이론 흡광치를 사용하여 A280 측정법으로 결정하였다. 질량은 C196H309N41O101S8 = 5108.8으로 산출됨; ESI-Q-TOF = 1740.6 [M+5Na]3+, 1311.2 [M-1H+6Na]4+, 1053.5 [M-2H+7Na]5+에서 확인됨.
반응식 6. 화합물 39의 합성
Figure 112007063778710-PCT00016
결론: 도 9에 도시한 바와 같이, 접합체 39의 ATIII에 대한 경쟁적 결합 잠재력은 모 6당류-스페이서 잔기와 비교하여 보존된다(도 5 참도, 화합물 9). 이러한 결과는 ATIII 결합 캐리어 5당류와 접합을 통하여 펩티드의 생체내 반감기가 유의하게 증가한다는 것을 의미한다(하기의 약력학적 시험 참조). 또한 ATIII에 대한 접합체의 결합은 특이적인데, 이는 접합하지 않은 모체 펩티드 ADM(27-52)가 ATIII에 대하여 유의한 경쟁적 결합을 보이지 않기 때문이다.
실시예 25
화합물 41
NeoMPS (Strasbourg, France)에서 제조한 화합물 40 (15 mg, 4.2 mmol)을 0.1 M Na2HPO4/NaH2PO4 완충액 (8 mL, pH 7.0)에 용해시켰다. 5당류 5 (22.7 mg, 10.4 mmol, 2.5 equiv.)를 질소 분위기하에서 첨가하고 그 혼합물을 대략 10 분간 교반하였다. NH2OH (50 wt %, 0.14 mL)의 수성 용액을 첨가하고 상기 반응 혼합물 을 16 시간 동안 교반하였다. 상기 생성물을 화합물 39에 대해 기술한 바와 같이 정제하여 화합물 41 (1.38 mg, 6%)을 얻었다. 1 mg/mL 용액에 대하여 1.22의 이론적 흡광치를 사용하여 A280 측정법으로 수율을 결정하였다. 질량은 C218H342N44O106S8 = 5528로 산출; ESI Q-TOF = 1843.7 [M+3H]3+, 1383.0 [M+4H]4+, 1107 M+5H]5+에서 확인됨.
결론: 접합체 41의 ATIII에 대한 경쟁적 결합 잠재력은 모체 5당류-스페이서잔기 화합물 9와 비교하여 보존적이다(도 10 참조). 이러한 결과는 ATIII 결합 담체 5당류와의 접합을 통하여 펩티드의 생체내 반감기가 유의적으로 증가될 수 있음을 의미한다(하기의 약력학 실험 참조).
반응식 7. 화합물 41의 합성
Figure 112007063778710-PCT00017
실시예 26
화합물 44
Bachem (Weil am Rhein, Germany) 등에서 시판중인 옥트레오티드 (화합물 42, 50 mg, 0.04 mmol)를 DMSO (5 mL)에 용해시켰다. AcOH (7 uL)를 첨가하여 약산성 용액을 만들었다. 이후 GMBS (11.2 mg, 0.04 mmol, 1.0 equiv.)를 첨가하고 얻은 용액을 질소하에서 1시간 동안 교반하였다. LC-MS 분석을 통하여, 고도의 위치 선택적 방식으로 N-말단 Phe 잔기로 GMB가 도입되어서 GMB 옥트레오티드 43로 거의 완전하게 전환되었음을 확인하였다. 반응물을 ∼5℃로 냉각시키고 이후 NaH2PO4/ Na2HPO4 (20 mL, pH 7.0) 용액을 첨가하였다. 10 분 후, 상기 혼합물을 실온에 도달시키고 10분간 상기 용액에 N2를 통과시켰다. 이어서 5당류 5 (21.8 mg, 0.01 mmol, 0.25 equiv.)를 질소 분위기하에서 고체로 첨가하고, 이후 NH2OH (0.11 mL, 50 wt %) 수성 용액을 첨가하고 반응 혼합물을 16 시간 동안 교반하였다. 상기 생성물은 상기 기술한 바와 같이 이온 교환 크로마토그래피로 정제하여 화합물 44 (6.3 mg, 19%)을 얻었다. 질량은 C112H170N12O70S10 = 3122.7로 산출;ESI-Q-TOF = 1562.3 [M+2H]2+, 1041.9 [M+3H]3+에서 확인됨. 1H-NMR (D2O, 400 MHz, HH-COSY): δ 7.52-7.29 (m, 10H), 7.26-7.14 (m, 4H), 7.03 (s, 1H), 5.44 (m, 1H), 5.37 (m, 1H), 5.14 (m, 1H), 5.12-4.89 (m, 2H), 4.77-4.60 (m, 3H), 4.45-3.97 (m, 18H), 3.95-3.76 (m, 13H) 3.75-3.35 (m, 57H), 3.33-2.59 (m, 18H), 2.22-1.16 (m, 2H), 1.85-1.76 (m, 3H), 1.71-1.38 (m, 3H), 1.32-1.15 (m, 7H), 0.81-0.61 (M, 2H).
반응식 8. 화합물 44의 합성
Figure 112007063778710-PCT00018
결론 : 접합체 44의 ATIII에 대한 경쟁적 결합 잠재력은 모체 5당류-스페이서 잔기 화합물 9과 비교하여 보존적이다 (도 11 참조). 이 결과를 통해서 ATIII 결합 캐리어 5당류와의 접합으로 펩티드의 생체내 반감기를 유의하게 증가되었음을 확인할 수 있다.
실시예 27
화합물 46
5당류 9 (100 mg) 및 GMBS (22 mg, 1.5 equiv.)를 DMF (10 mL)에 용해시켰다. DiPEA (18 uL, 2 equiv.)를 첨가하고 상기 반응 혼합물을 대기 온도에서 밤새 교반하였다. 용매를 진공 증발시키고 잔유물을 분취용 G25-컬럼으로 정제하였다. 얻어진 분획을 동결 건조하여 화합물 46 (50 mg, 46%)을 백색 분말로 얻었다. ESI-MS에 의해 C53H77N2O55S7Na9 = 2052로 산출됨; ESI-Q-TOF = 1027 M2+에서 확인됨.
실시예 28
화합물 47
5당류 말레이미드 유도체 46을 천연 recH-IL2 (R&D systems, 202-IL/CF)의 자유 Cys125에 접합시켰다. 접합전에 recH-IL-2에 대하여 HPSEC, SDS-PAGE 및 MALDI-TOF MS를 수행하였는데 단량체 조성물이 우세하였다. RecH-IL2 (1 mg, 800 uL, 0.5% SDS 함유하는 PBS 중에 1.26 mg/mL)를 RT에서 밤새 롤러 뱅크에서 과량의 화합물 46 (59 uL의 10 mg/mL 수성 용액, 5 equiv.)으로 처리하여 출발 물질을 완전하게 전환시켰다. 다음으로, 미반응 말레이미드 46를 3 시간 동안 5배 몰의 과량 시스테아민(16 uL, 10 mg/mL)으로 블록킹하였다. 과량의 스테아민과 화합물 46을 을 제거하기 위하여 PBS 중의 0.5% SDS에서 투석하고(컷오프 6 내지 8 kDa), 생성물의 최종 양은 A280로 측정한 바에 따르면 0.69 mg이었다.
최종 접합체 47은 SDS-PAGE (4-12%) 및 웨스턴 블랏으로 특징을 분석하였다(도 12 참조). 3 및 4번 레인으로부터, 결론을 내리면 화합물 47은 recH-IL2 (5당류 부분 존재에 상응)에 비하여 높은 Mw를 가졌다. 웨스턴 블랏은 a) 10 ㎍/mL hATIII (HAT 950A2L - Kordia); b) a-hATIII (MoAb HATIII 200- Kordia); c) GAM-HRP (W402B 20373201 - Promega)를 이어서 항온반응하고 DAB 시약으로 최종 검출하였는데 그 결과 IL2를 함유하는 5당류에 대한 특이적 ATIII 결합이 확인되었다 (레인 7 대 8).
반응식 9. 접합체 47의 합성
Figure 112007063778710-PCT00019
약리학( Pharmacology)
접합시킨 (폴리)펩티드의 약력학 측정
본 발명의 화합물의 대표적인 예의 약력학적 특성을 하기에서 기술하는 바와 같이 측정하였다.
래트 혈장에서 인슐린을 측정하기 위한 인간 인슐린 ELISA
인간 ELISA(Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay)는 인간 및 래트 혈장이나 완충계에서 인간 인슐린을 측정하기 위하여 전개하였다. 이런 식으로 ELISA는 약력학 실험에서 유래한 혈장 샘플에서 인슐린 농도를 측정하기 위하여 사용할 수 있다. 상기 분석법은 2종의 단일클론 항체, 즉 고체상에 결합된, 포획 항체 및 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)로 표지된 검출 항체를 사용하는 면역화학적 "샌드위치" 원리를 기초로 한다.
5당류-인슐린 접합체 6와 재조합 인간 인슐린 (recH 인슐린, batch SIHR017, Diosynth, The Netherlands)의 약력학적 특성을 측정하기 위하여, 래트 혈장 샘플을 10Hz에서 진탕하면서 1 시간 동안 실온에서 항온반응시켰다. 이 항온반응시, 5당류-인슐린 접합체 6 또는 recH 인슐린은 고정된 항-인슐린 항체에 결합하게 된다. 2차 세정 과정이후, 검출 항체인 HRP가 접합된 항-인슐린 항체를 첨가하여 상기 고정 인슐린-복합체에 결합시켰다. 플레이트를 세정하여 결합하지 않은 효소-표지 항체를 제거하고 이어서 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘/H2O2 기질 용액을 첨가하였다. 반응은 0.5 M 황산으로 종결시키고 마이크로타이터 플레이트를 450 nm에서 분광측정법으로 판독하였다. 색상 강도는 인슐린 농도에 정비례한다. 이어서 각 혈장 샘플에 대하여 인슐린의 평균 농도(mol/L)를 측정하였다.
화합물 6의 약력학적 특성 측정
인슐린 접합체 6과 recH 인슐린의 약력학적 양태를 300∼400 gr의 숫컷 위스타 래트에서 실험하였다. 상기 래트를 O2/N2O/이소플루란의 혼합물을 흡입시켜서 마취시키고 이후 우경부 정맥에 캐뉼러를 꽂았다. 다음날 래트를 i.v.로 3.5 nmol/kg 용량의 화합물 6 또는 recH 인슐린을 처리하고, 이후 몇 시간 간격으로 혈액 샘플을 취하였다. 혈액을 원심분리하고 이어서 혈장을 뽑아서 사용하기 전까지 -20℃에 보관하였다. 혈장 샘플 내 시험할 화합물의 농도는 시험할 화합물 자체의 보관 용액으로 만든 보정 그래프를 통하여 인간 ELISA를 사용하여 측정하였다. 샘플 내 농도는 nmol/L 단위로 나타내었으며 동력학적 변수는 WinNonlin의 비구획 모델로 산출하였다.
결론: 도 13 및 표 3에 나타낸 바와 같이 5당류-인슐린 접합체 6의 약력학적 특성은 모체 recH 인슐린에 비하여 상당히 개선되었음을 알 수 있다.
래트에서 화합물 6 또는 recH 인슐린 (3.5 nmol/kg)을 i.v. 투여한 후 약력학적 변수. 실험은 1번 처리시 n=3으로 수행하였다.
5당류-인슐린 접합체 6 recH 인슐린
평균 ±s.e.m. 평균 ±s.e.m.
T1/2 제거 (h) 2.8 ± 0.1 0.033 ± 0.001
AUCinf (h.nmol/L) 72.5 ± 6.4 4.6 ± 0.8
Vss (L/kg) 0.11 ± 0.01 0.012 ± 0.002
Cl (L/h/kg) 0.049 ± 0.004 0.80 ± 0.12
MRT (h) 2.1 ±0.1 0.014 ± 0.1
125 I로 표지화한 후 약력학적 측정
문헌 [Machalonis et al. (Bi℃hem J. 1969, 113: 299-305)]에 따라서 락토퍼옥시다제 방법을 사용하여 5당류 접합체 24, 28, 29, 31, 32, 39 및 41를 125I로 표지화하였다. 표지화한 후, 상기 접합체를 세파덱스 G25 및 이온 교환기 HiTrap Q10로 여과하였다. 동력학적 실험은 화합물 125I-표지된 접합체를 사용한 것을 제외하고는 화합물 6에 대하여 기술한 바와 동일하게 반복하였다. 갑상선에 125I가 축적되는 것을 방지하기 위하여, 화합물 투여전에 래트를 10 mg/kg 요오드화 칼륨으로 경구 처리하였다.
순환계에 자유 125I-를 부여하는 대사성 세포내 내인성 탈할로겐화는 125I--표지된 접합체의 체내동태의 정확한 측정에 역효과를 줄 수 있다. 자유 125I- 자체는 래트에서 3.2 시간의 제거 반감기를 나타낸다(대조구, 데이타는 도시하지 않음), 비교적 짧은 반감기를 갖는 125I-표지 화합물의 측정된 총 반감기는 지속적일 수 있으며 비교적 긴 반감기를 갖는 화합물의 실험적으로 측정한 반감기는 보다 짧을 수 있다. 게다가, 접합체 31, 32 및 39에 대하여 관찰된 제거 반감기는 정성적으로 캐리어 5당류와 펩티드의 접합으로 체류 시간이 길어지는 것으로 증명되었다.
40배 높은 용량의 TCA (최종 10% 농도)로 침전시키고 난 펠렛(0.1 mL)에서 방사선 활성을 측정하여 상기 방법을 조절하여서 경쟁적인 내인성 125I-탈할로겐화에 대하여 보정한 화합물 24, 28, 29 및 41의 약력학 변수를 얻었다.
recH 인슐린과 비교한 인슐린- 5당류 접합체 24, 28 및 29의 약력학
인슐린 접합체 24, 28 및 29를 i.v. 투여한 후의 약력학 변수. 실험은 1회처리 당 n=3으로 수행하였다. 비교를 위하여 recH 인슐린은 n=1로 처리하였다(용량(cpm 단위)은 정규화하였다).
화합물 24 화합물 28 화합물 29 recH 인슐린
평균 ±s.e.m. 평균 ±s.e.m. 평균 ± s.e.m. 값 (n=1)
상관도 -1.00 -1.00 -1.00 -1.00
T1/2 제거 3.0 ± 0.2 3.9 ± 0.1 5.5 ± 0.3 0.74
AUCinf (h.cpm/0.1mL) 30447 ± 4034 13756 ± 590 14397 ± 517 481
Vss (L/kg) 0.192 ± 0.022 0.428 ± 0.028 0.570 ± 0.018 2.225
Cl (L/h/kg) 0.068 ± 0.009 0.146 ± 0.007 0.139 ± 0.05 4.16
MRT (h) 2.8 ± 0.1 2.9 ± 0.1 4.1 ± 0.2 0.5
결론 : 125I-표지법으로 측정한 인슐린-5당류 접합체 24의 약력학적 특성(도 14, 표 40는 ELISA 법(도 13, 표 3)으로 측정한 유사한 인슐린-5당류 접합체(화합물 6)에서와 얻은 것과 일치하였다. 2 분석방법으로 측정한 recH 인슐린에 대한 동력학적 변수의 차이는 처음 15분 동안 순환계에서 표지가 빠르게 제거되는 것에 기인하여 그래프 외삽법(Vss 및 Cl 측정하기 위함)에 차이가 생긴것으로 설명할 수 있다. 또한, 인슐린 5당류 접합체 24, 28, 29의 AUC, Cl 및 Vss에서 관찰되는 차이점(도 14, 표 4)은 ATIII에 대하여 상이한 결합 친화성을 갖는 대체 캐리어를 사용하여 접합체의 약력학적 특성을 조율할 수 있다는 것을 분명하게 증명하는 것이다(이것은 BIA 시험에서의 확인된 것과 일치함, 도 6 및 표 2 참조).
5당류 접합체 31 및 32의 약력학
2종의 접합체 31 및 32를 i.v. 투여한 후의 약력학 변수. 실험은 1회 처리당 n=3으로 수행하였다(결과를 탈할로겐화에 대하여 보정하지 않았다).
화합물 31 화합물 32
평균 ± s.e.m. 평균 ± s.e.m.
상관도 -1.00 -1.00
T1/2 eli (h) 7.1 ± 0.3 9.4 ± 0.6
Vss (ml/rat) 66.7 ± 2.3 52.5 ± 2.6
Cl (ml/h/rat) 7.9 ± 0.1 4.2 ± 0.3
MRT (h) 8.4 ± 0.2 12.6 ± 0.7
결론: 자유 가니릴릭스의 반감기 (래트에서 T1/2 1.4 시간, i.v., Chan et al. Drug. Metab. Dispos 1991, 19, 858)은 캐리어 5당류 (도 15, 표 5)와 접합시켰을 때 유의하게 증가되었다. 화합물 32와 화합물 31의 약력학을 비교하면 ATIII에 대하여 높은 친화성이 있는 5당류를 사용하여 Vss, Cl 및 T1/2 제거율이 개선되는 것을 확인하였다. BIA 시험으로 확인된 결과(도 8 참조)와 이러한 결과를 조합하면 접합체의 약력학적 특성은 ATIII에 대하여 상이한 결합 친화성을 갖는 대체적인 캐리어 5당류를 사용하여서 조율할 수 있다는 것을 의미한다.
5당류 접합체 39 및 ADM(27-52)의 약력학
ADM(27-52) 및 화합물 39를 i.v. 투여한 후 약력학적 변수. 실험은 1회 처리당 n=3으로 수행하였다(결과는 탈할로겐화에 대하여 보정하지 않았다).
ADM(27-52) 화합물 39
평균 ± s.e.m. 평균 ± s.e.m.
상관도 -1.00 -1.00
T1/2 제거 (h) 4.9 ± 0.1 11.1 ± 0.2
Vss (ml/rat) 556 ± 48 80 ± 3.3
Cl (ml/h/) 112 ± 9 5.0 ± 0.1
MRT (h) 5.0 ± 0.1 14.5 ± 0.3
결론: ADM(27-52)의 약력학적 특성은 ATIII 결합 캐리어 5당류 (화합물 39, 도 16, 표 6)에 접합시켜서 개선되었다. ADM(27-52) 자체의 T1/2는 과평가되었는데 결과를 탈할로겐화에 대하여 보정하지 않았기 때문이다. 또한, 자유 아드레노메듈린의 반감기는 인간에서 단지 22분이다(Meeran et al. J. Clin. End℃rin. Met. 1997, 82, 95-100). BIA 실험의 초기 관찰(도 9)은 순환하는 ATIII에 대한 특정 결합 친화성을 갖는 (캐리어) 접합체로 전환시켜서 (폴리)펩티드의 약력학적 특성을 개선시킬 수 있다는 결론을 뒷받침해준다.
[D-Ala 8 ]-GLP-1(7-36)와 비교한 5당류 접합체 41의 약력학
GLP-1 및 화합물 41을 i.v. 투여한 후 약력학 변수. 실험은 1회 처리당 n= 3으로 수행하였다(결과(cpm 단위)는 정규화하였다)
[D-Ala8]-GLP-1(7-36) 화합물 41
평균 ± s.e.m. 평균 ± s.e.m.
상관도 -0.98 -0.99
T1/2 제거 (h) 2.0 ± 0.4 9.8 ± 0.4
AUCinf (h.cpm/0.1mL 1154 ± 59 108658 ± 4858
Vss (ml/kg rat) 2696 ± 456 205 ± 13
Cl (ml/h/kg) 1732 ± 86 18 ± 0.8
MRT (h) 1.6 ± 0.1 11.2 ± 0.3
결론: [D-Ala8]-GLP1(7-36)의 약력학은 ATIII 결합 캐리어 5당류와의 접합으로 개선되었다 (화합물 41, 도 17, 표 7). 화합물 41의 Cl은 ∼100배 감소하였고 Vss는 13배 감소하였는데, 그 결과 비접합 펩티드와 비교하여 AUC(노출)가 ∼100배 증가하였다. BIA 결과(도 10)와 조합하여 보면, 이러한 관찰결과는 ATIII 결합 접합체로 전환시켜서 (폴리)펩티드의 약력학적 특성을 개선시킬 수 있다는 결론을 뒷받침해준다.
래트 혈장에서 (폴리)펩티드-5당류-ATIII 복합체의 측정
생체내에서 항트롬빈 III에 (폴리)펩티드 5당류 접합체가 결합하는 것을 확증하기 위하여, 포획 항체로 항인슐린 Mab를 사용하고 검출 항체로 HRP-접합된 항-ATIII 항체를 사용하는 샌드위치형 ELISA를 화합물 6의 약력학 실험에서 기원하는 혈장 샘플에 대해 수행하였다. 명백하게, 완전한 5당류-인슐린-ATIII 복합체 만이 이러한 유형의 분석법에서 검출되었으며 여기서 recH 인슐린을 음성 대조군으로 사용하였다.
래트에서 3.5 nmol/kg의 화합물 6 또는 recH 인슐린을 i.v. 투여한 후 1 분에 얻은 혈장 샘플로부터, 래트 ATIII에 대한 5당류-인슐린 접합체 6 및 recH 인슐린의 결합 여부를 측정하였다. 그 결과는 도 18에 나타내었다.
결론: 5당류-인슐린 접합체 6은 ATIII에 결합하지만, 이와 반대로 recH-인슐린은 ATIII와 복합체를 형성할 수 없다. 비록 항-토끼 ATIII 항체가 감도가 다소 떨어지지만, 두 ATIII 항체들은 5당류-인슐린 접합체 6-ATIII 복합체를 검출할 수 있다. 이러한 결과는 순환계에서 화합물 6이 ATIII에 결합함을 확인한 것이며 ATIII-결합 5당류의 반감기가 늘어난 것은 이러한 복합체 형성에 의한 것임을 보여준다. 따라서, 본래의 비접합 (폴리)펩티드와 비교하여 (폴리)펩티드-5당류 접합체(예컨대 화합물 6)의 약력학적 특성의 향상은 이 접합체가 ATIII에 특이적으로 결합하기 때문인 것으로 결론 내릴 수 있다.
래트에서 생체내 글루코스 억제 시험
인슐린 및 인슐린 접합체의 생물학적 활성을 래트에서 글루코스 강하 정도를 측정하여 시험하였다. 실험전에 상기 동물을 밤새(16 시간) 금식시켰다. 아침에 모든 래트의 꼬리의 일부를 약간 잘라서 혈액을 채취하고, 이후 혈액을 시험 스트립에 떨어뜨리고 ACCU-체크 센서 혈당 모니터(Roche Diagnostics)를 사용하여 글루코스 농도를 측정하였다. 래트를 10분간 39℃의 가열 박스에서 예열시킨 후 꼬리 정맥에 5당류-인슐린 접합체 6 및 인슐린을 i.v. 투여하였다. 사용 용량은 5당류-인슐린 접합체 6은 7 nmol/kg이고 recH-인슐린은 3.5 nmol/k이다. 다양한 시간 간격으로 겉가죽 혈액으로 부터 혈액 샘플을 채취하고, 이후 글루코스 함량을 상기 기술한 바와 같이 곧바로 측정하였다.
5당류 인슐린 접합체 6의 약동력학
i.v. 투여 후 글루코스 억제 정도의 지속성으로 recH-인슐린에 비하여 5당류-인슐린 접합체 6의 개선된 약력학 특성을 확인하였다(도 19 참조). 실험에서는 화합물 24, 25, 26, 27 및 인슐린 데테미어(대조군)을 사용하였고, 래트는 화합물의 투여직전에 단식시켰다(대조군의 일정한 글루코스 농도를 보장하기 위함).
B29-인슐린 접합체 24를 B29-인슐린 접합체 26와 비교하였고(도 20), B1-인슐린 접합체 25를 B1-인슐린 접합체 27와 비교한 결과(도 21)에 따르면, 스페이서 길이에 상관없이 글루코스 억제 활성이 유사하게 지속되는 것을 확인할 수 있었다. 놀랍게도, 시험한 모든 인슐린-접합체의 작용 개시는 recH 인슐린 또는 인슐린 데테미어 (i.v. 투여)에 비하여 느렸으며 노출은 보다 긴 작용 기간을 통해 증강되었다.
24 nmol/kg 용량으로 하나의 실험에서 B29-인슐린 접합체 24, 28 및 29를 직접 비교한 결과 이들의 혈당 강하 활성의 작용 기간이 상이하다는 것이 입증되었다(도 22 참조). 즉, 화합물 24에 의한 글루코스 농도 강하는 7 시간을 넘어서 지속되는 반면, 접합체 28 및 29의 활성은 i.v. 투여후 5.5 시간 보다 길지 않았다. 약동력학적 차이는 각각 화합물 28 및 29와 비교하여 화합물 24의 제거율 및 분포 용적에 대해서 앞서 언급되었던 약력학 차이와 일치한다. 마지막으로, 인슐린 데테미어는 24 및 48 nmol/kg 용량에서 활성 지속성이 덜하며 명확함이 덜하다는 것을 보여주는 비교예로 시험하였다 (도 21, 22).

Claims (32)

  1. 폴리펩티드와 올리고당의 접합체, 또는 이의 약학적 허용 염으로서,
    상기 폴리펩티드는 하나 이상의 올리고당-스페이서 잔기에 접합되며, 상기 올리고당은 4∼18개의 단당류 단위를 포함하고 그 자체로 항트롬빈 III에 대한 친화성을 갖는 합성 황산화 올리고당이며, 상기 스페이서는 결합이거나 필수적으로 약리학적 불활성인 연성 연결 잔기인 폴리펩티드와 올리고당의 접합체, 또는 이의 약학적 허용 염.
  2. 제1항에 있어서, 상기 올리고당은 4∼6개의 단당류 단위로 이루어지는 것인 접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 올리고당은 5당류인 것인 접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 혈장 순환 농도가 ≤ 50 nM인 접합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 자체의 약리학적 활성과 비교하여 상기 올리고당은 그 자체로 치료적 수준 이하의 항응고 활성을 갖는 것인 접합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 올리고당-스페이서 잔기는 하기 화학식 I의 구조를 갖는 것인 접합체:
    [화학식 I]
    Figure 112007063778710-PCT00020
    상기 식에서 하나의 필수적으로 약리학적 불활성의 연성 연결 잔기가 존재하며, 여기서 R은 독립적으로 OSO3 -, (1-8C)알콕시 또는 필수적으로 약리학적 불활성의 연성 연결 잔기이며, Ra는 독립적으로 OSO3 -, (1-8C)알콕시, 필수적으로 약리학적 불활성의 연성 연결 잔기 또는 1∼13개의 단당류 단위를 포함하는 올리고당 잔기이며, Rb는 독립적으로 (1-8C)알콕시, 필수적으로 약리학적 불활성의 연성 연결 잔기 또는 1∼13개의 단당류 단위를 포함하는 올리고당 잔기이고, 상기 전하는 양으로 하전된 반대 이온으로 상쇄된다.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 올리고당-스페이서 잔기는 하기 화학식 II를 갖는 5당류-스페이서 잔기인 것인 접합체:
    [화학식 II]
    Figure 112007063778710-PCT00021
    상기 식에서 하나의 필수적으로 약리학적 불활성 연성 연결 잔기가 존재하며, 여기서 R은 독립적으로 OSO3 -, (1-8C)알콕시 또는 필수적으로 약리학적 불활성의 연성 연결 잔기이고, 상기 전하는 양으로 하전된 반대 이온으로 상쇄된다.
  8. 제7항에 있어서, 상기 5당류는 하기 화학식 III의 구조를 갖는 것인 접합체:
    [화학식 III]
    Figure 112007063778710-PCT00022
    여기서, R은 독립적으로 OSO3 - 또는 (1-8C)알콕시이고, 상기 전하는 양으로 하전된 반대 이온으로 상쇄된다.
  9. 제8항에 있어서, 상기 5당류는 하기 화학식 IV의 구조를 갖는 것인 접합체:
    [화학식 IV]
    Figure 112007063778710-PCT00023
    여기서, R은 독립적으로 OCH3 또는 OSO3 -이다.
  10. 제9항에 있어서, 상기 화학식 IV 중 두 개의 R기 모두가 OSO3 -인 것인 접합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 분자량이 ~0.3 내지 50 kDa인 것인 접합체.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 분자량이 ~0.3 내지 20 kDa인 것인 접합체.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 분자량이 ~0.3 내지 7.5 kDa인 것인 접합체.
  14. 제11항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인슐린, 칼시토닌, 가니릴릭스, GLP-1, [D-Ala8]-GLP-1(7-36), 아드레노메듈린, ADM(27-52), 키스펩틴-10, 옥트레오티드 또는 인터루킨-2로부터 선택되는 것인 접합체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 인슐린 ADM(27-52), 및 [D-Ala8]-GLP-1(7-36)으로부터 선택되는 것인 접합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 5당류-스페이서 잔기로 단일치환되는 것인 접합체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 스페이서는 필수적으로 약리학적 불활성의 연성 연결 잔기인 것인 접합체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 스페이서는 길이가 10∼50 원자인 것인 접합체.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 스페이서는 하나 이상의 -(CH2CH2-O)-성분을 포함하는 것인 접합체.
  20. 제1항에 있어서, 하기의 구조로부터 선택되는 것인 접합체:
    Figure 112007063778710-PCT00024
    상기 식에서, R1 = R2 = H이고, R3 =
    Figure 112007063778710-PCT00025
    이거나, 또는 R1 = R3 = H이고, R2 =
    Figure 112007063778710-PCT00026
    이며,
    여기서 Y는 하기 화학식 A, B, C, 및 D로부터 선택된다;
    Figure 112007063778710-PCT00027
  21. 제20항에 있어서, Y는 화학식 A 및 B로부터 선택되는 것인 접합체.
  22. 제1항에 있어서, 하기의 구조를 갖는 것인 접합체:
    Figure 112007063778710-PCT00028
  23. 제1항에 있어서, 하기의 구조를 갖는 것인 접합체:
    Figure 112007063778710-PCT00029
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 따른 접합체와 약학적으로 적합한 보조제를 포함하는 약학 조성물.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 치료용으로 사용하기 위한 것인 접합체.
  26. 일정한 치료성 폴리펩티드로 치료가 필요한 환자를 치료하기 위한 약물 제조에서의 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 따른 접합체의 용도로서, 상기 약물은 상기 폴리펩티드보다 개선된 약력학적 특성을 갖는 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 따른 접합체를 포함하는 것인 용도.
  27. (a) 폴리펩티드를 접합시키기에 적합하도록 하는 임의 단계, 및
    (b) 상기 임의로 적합화시킨 폴리펩티드를 올리고당-스페이서 분자와 반응시키는 커플링 단계를 포함하는 폴리펩티드와 올리고당의 접합체, 또는 이의 약학적 허용 염의 제조 방법으로서,
    상기 폴리펩티드는 하나 이상의 올리고당-스페이서 잔기에 접합되며, 상기 올리고당은 4∼18개의 단당류 단위를 포함하고 그 자체로 항트롬빈 III에 대한 친화성을 갖는 합성 황산화 올리고당이며, 상기 스페이서는 결합이거나 필수적으로 약리학적 불활성의 연성 연결 잔기인, 폴리펩티드와 올리고당의 접합체 또는 이의 약학적 허용 염의 제조 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 올리고당은 4∼6개의 단당류 단위로 이루어진 것인 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 올리고당은 5당류인 것인 방법.
  30. 폴리펩티드를 포함하는 치료학적 활성 접합체의 제조 방법으로서, 결합 또는 필수적으로 약리학적 불활성의 연성 연결 잔기를 통하여, 그 자체로 항트로빈 III(ATIII)에 대한 친화성을 가지며 4∼18개의 단당류 단위를 포함하는 합성 황산화 올리고당을 폴리펩티드에 공유 결합시키는 단계를 포함하고, 상기 접합체는 미미한 항응고 활성을 가지며, 생물학적 활성을 필수적으로 유지하면서 본래의 폴리펩티드보다 혈장 반감기가 증가된 것인, 폴리펩티드를 포함하는 치료학적 활성 접합체의 제조 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 올리고당은 4∼6개의 단당류 단위로 이루어진 것인 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 올리고당은 5당류인 것인 방법.
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