JP2008538200A - ポリペプチドと五糖の複合物 - Google Patents
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Abstract
Description
Raは独立にOSO3 −であり、(1−8C)アルコキシであり、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基であり、又は1−13単糖単位を含むオリゴ糖残基であり、
Rbは独立に(1−8C)アルコキシであり、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基であり、又は1−13単糖単位を含むオリゴ糖残基であり、電荷は、プラスに帯電した対イオンによって打ち消されている。
五糖の合成
本発明の化合物の、ATIII結合性のオリゴ糖、特に五糖は、例えば、Angew. Chem. Intl. Ed. Engl. 1994, 32, 1671−1690に記載のように調製することができる。ATIIIに対して異なる親和性を有する異なるオリゴ糖及び五糖は、中間体の単糖、二糖又は四糖構成要素を変えることによって、例えば、(永続的な)アルキル基を導入することによって、又は異なる硫酸化オリゴ糖及び五糖を制御された様式で利用する異なる(一時的な)保護基を適用することによって、得ることができる(例えば、Westerdu in et. al. Bioorg. Med. Chem. 1994, 1267)。スペーサーは、例えば、国際公開第2001/42262号に記載のように導入することができる。オリゴ糖−及び五糖−スペーサー分子は、ガンマ−マレイミドブチリル(GMB)基、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)基、保護されていてもよいチオール基などの連結残基を用いてさらに誘導体化して(例えばAngew. Chem. Intl. Ed. Engl. 1996, 35, 331−333)、修飾されていてもよいポリペプチドと直接カップリングすることができる。
一般に、本発明の複合物は、(a)ポリペプチドが複合化用に改変される、必須でない段階と、(b)改変されていてもよいポリペプチドがオリゴ糖−又は五糖−スペーサー分子と反応する、カップリング段階とを含む方法によって製造される。
タンパク質の生理活性に対する、二官能リンカー及び/又は反応性五糖部分を用いた反応の効果をモニターする幾つかの技術が利用可能である。この点で、可溶な受容体分子を相補的結合剤(インスリン)として用いた生体分子間相互作用解析(BIA)及び酵素活性の測定は貴重なツールである。五糖複合物とATIIIの結合試験も、これらのアッセイに含まれ得る。イオン交換、サイズ排除クロマトグラフィー及びATIIIアフィニティークロマトグラフィーは、五糖複合物の亜分画に利用可能な方法である。一方、電気泳動技術は、直交、定性及び定量キャラクタリゼーション(例えばSDS−PAGE、CZE)に適切である。複合化部位は、複合物のMALDI−TOF MS分析及びN末端配列決定によって同定することができる。
非修飾ポリペプチド及び対応する五糖複合物のインビボでの半減期を求めるPK試験をラットで実施することができる。幾つかの選択肢、例えば血しょう試料におけるIodogen、求電子置換を起こすラクトペルオキシダーゼイオン化、又は標識部分としてのボルトンハンター試薬を用いた125Iによる放射性標識とガンマ線放射の測定が利用可能である。当分野で公知の他の方法は、非標識複合物の注入と、それに続くELISA又はLuminex法による免疫化学的分析に基づく。
本発明のポリペプチドとATIII結合性五糖の複合化の薬理効果は、以下に示すように、インビトロでのアッセイ及びインビボでの動物モデルにおいて試験することができる。インスリンは、2個のジスルフィド架橋によって結合した2個のペプチド鎖からなる5.8kDaのタンパク質である。Lys ε−アミノ基又はN末端α−アミノ基の1つにおける部位特異的化学修飾は詳細に記録されている。五糖とインスリンの複合化の効果は、血清試料のグルコース、インスリン及びC−ペプチド含有量(内因性インスリン分泌を補正するための生物マーカー)を分析することによって試験することができる。血糖計、ヒトインスリン及びC−ペプチド放射性免疫測定法が商用的に利用可能である。血糖値に対するインスリンのインビボでの効果は、ラット又はビーグルで測定することができる。
本発明の複合物は、経腸又は非経口投与することができる。これらの化合物及びその組成物の正確な用量及び投薬計画は、ポリペプチド自体の生物活性、医薬品を投与する個々の対象の要求、苦痛の程度又は開業医の要求及び判断に応じて必然的に決まる。一般に、非経口投与は、吸収により大きく依存する他の投与方法よりも少ない投与量を必要とする。しかし、ヒトに対する1日用量は、好ましくは0.0001−1mg/kg体重、より好ましくは0.001−0.1mg/kg体重である。
実施例
使用略語:
ACN アセトニトリル
AcOH 酢酸
ADM アドレノメデュリン
(h)ATIII (ヒト)抗トロンビンIII
AUC 曲線下面積
BIA 生体分子間相互作用解析
Boc2O ジ−tert−ブチルジカルボナート
Cl クリアランス
DCCI N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
DIPEA ジイソプロピルエチルアミン
DMF N,N’−ジメチルホルムアミド
DMSO ジメチルスルホキシド
EDTA エチレンジアミン四酢酸
ELISA 酵素結合免疫吸着検定法
Equiv. 当量
ESI エレクトロンスプレーイオン化
GLP−1 グルカゴン様ペプチド1
GMB ガンマ−マレイミドブチリル
GMBS ガンマ−マレイミド酪酸N−ヒドロキシコハク酸(succinimic)エステル
HBS−EP EDTAとポリエチレングリコールを含むhepes緩衝食塩水
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
HP−SEC 高速サイズ排除クロマトグラフィー
HRP 西洋わさびペルオキシダーゼ
i.v. 静脈内
IL−2 インターロイキン−2
MALDI−TOF マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型
MoAb モノクローナル抗体
MRT 平均滞留時間
MS 質量分析法
NMM N−メチルモルホリン
NMR 核磁気共鳴
PAGE ポリアクリルアミドゲル電気泳動
PBS リン酸緩衝食塩水
PS 五糖
Q−TOF 四重極飛行時間型
recH 組換えヒト
RT 室温
Rt 保持時間
SDS ドデシル(docecyl)硫酸ナトリウム
TBTU 2−(1H−ベンゾトリアゾル−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート
TCA トリクロロ酢酸
TEA トリエチルアミン
TFA トリフルオロ酢酸
THF テトラヒドロフラン
Vss 定常状態での分布容積
材料及び方法
1H−NMRスペクトルをBruker DRX−400(ultra shield)によって400MHzで記録した。有機溶媒中の化学シフトをテトラメチルシランに対するppm(δ)で報告する。
6−(2−ヨード−アセチルアミノ)−ヘキサン酸(2)
6−アミノ−ヘキサン酸(1)(0.37g、2.8mmol)の1,4−ジオキサン(60mL)懸濁液に無水ヨード酢酸(0.50g、1.4mmol)を添加した。反応混合物を50℃で3時間及び周囲温度で16時間撹拌した。その後、TLC分析(CH2Cl2/MeOH/AcOH、98/10/1、v/v/v)によって、化合物1が親油性(lypophilic)のより低い生成物に完全に転化したことを確認した。EtOAc(100mL)を添加し、反応混合物を0.10M HCl水溶液(50mL)で洗浄した。次いで、有機層を塩水(50mL)で2回洗浄し、混合水層をEtOAc(75mL)で2回抽出した。混合有機層を脱水(MgSO4)し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフ(CH2Cl2/MeOH/AcOH、98/10/1、v/v/v)にかけて、6−(2−ヨード−アセチルアミノ)−ヘキサン酸(2)(0.45g、>100%)を得た。1H NMR(MeOD):δ 3.67(s、2H)、3.17(t、2H)、2.29(t、2H)、1.66−1.33(m、6H)。
6−(2−ヨード−アセチルアミノ)−ヘキサン酸2,5−ジオキソ−ピロリジン−1−イルエステル(3)
6−(2−ヨード−アセチルアミノ)−ヘキサン酸(2)(0.20g、0.67mmol)のTHF(10mL)溶液にN−ヒドロキシスクシンイミド(85mg、0.74mmol)及びN,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(0.21g、1.0mmol)を添加した。反応混合物を暗所で16時間撹拌した。TLC分析(EtOAc/Hep/AcOH、80/20/1、v/v/v)によって活性化エステル3への完全な転化を確認した後、酢酸7滴を添加した。次いで、混合物を冷凍庫に終夜保存した(−20℃)。粗製混合物をろ過し、ろ液を濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー(EtOAc/Hep/AcOH、40/60/5→20/80/5、v/v/v)によって精製し、適切な画分を濃縮して、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体3(0.18g、67%)を得た。1H NMR(MeOD):δ 3.67(s、2H)、3.18(t、2H)、2.82(s、4H)、2.63(t、2H)、2.0−1.0(m、6H)。
化合物4
recHインスリン(50mg、8.6μmol)のDMF(15mL)懸濁液に溶液が透明になるまでH2O(9.0mL)を添加した。溶液を15分間撹拌して、室温に調節した。0.1M NaOH水溶液を滴下して、溶液のpHを10に調節した。その後、反応フラスコをスズ箔で包んだ。3(5.0mg、8.6μmol)のDMF(1.0mL)溶液を反応混合物に1分間滴下した。反応混合物を磁気撹拌子で撹拌し、pHを10に維持した。30分後、過剰の0.1%TFA水溶液(5.0mL)を添加して、反応をクエンチした。H2O(200mL)を添加し、反応混合物を凍結乾燥して、4(60mg、>100%、最高8.6μmol)を得た。溶離剤A(0.1%TFA水溶液)80%と溶離剤B(ACN)20%で5分間開始し、次いで溶離剤A 20%と溶離剤B 80%までの勾配を30分間適用したHPLC(Shimadzu、逆相)分析によって、45%の一置換生成物の存在が明らかになった(recHインスリン Rt:12.84min;化合物4 Rt:13.54min;B29/A1二置換生成物:Rt 14.16min)。粗製生成物を精製せずに次の反応に使用した。
化合物6
粗製化合物4(60mg)を、(N2を通して)脱気した0.1M Na2HPO4緩衝剤(25mL、pH7.0)中の0.05M NH2OH溶液に溶解させた。反応混合物を磁気撹拌子で撹拌し、(N2を通して)30分間脱気した。次いで、Angew. Chem. Intl. Ed.(1996), 35, 331−333に記載のように調製した五糖−スペーサー化合物5(95mg、43μmol)を固体として添加し、反応混合物を窒素雰囲気下で16時間撹拌した。
精製五糖−インスリン複合物6の特性(identity)をインスリンのELISAによって、また、ヒトインスリン受容体とヒトATIIIを分析物として用いた生体分子間相互作用解析(BIA)によって求めた。純度及び単量体性(monomericity)を、Superdex 30を用いたHP−SEC及びMALDI−MSによって評価した。
化合物11
五糖7(46mg)[五糖7は、国際公開第2001/42262号に記載の誘導体化された単糖5と、Bioorg. Med. Chem.(1994), 2, 1267−1280に記載の四糖30を生成する合成経路を実施することによって得られる四糖とのカップリングによって得ることができる。ここで、還元性末端の単糖構成要素12は、脱保護及び硫酸化を含めて、これらの刊行物に記載の方法と類似の方法によって、メチル2,3−ジ−O−ベンジル−6−O−メチル−α−D−グルコースで置換される。]及びグリコール誘導体10(18mg、1.6当量)をDMF(5mL)に窒素雰囲気下で溶解させた。NMM(61μL、5当量)を添加し、反応混合物を周囲温度で終夜撹拌した。溶媒を減圧蒸発させ、残渣を分取陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。適切な画分を混合し、分取G25カラムで脱塩した。混合画分を凍結乾燥させて、11(29mg、57%)を白色粉末として得た。純度>98%(分析陰イオン交換、UV210nm)。1H−NMR(D2O、400MHz、HH−COSY):δ 5.31(d、1H)、5.23(m、1H)、4.91(m、1H)、4.45−4.35(m、1H)、4.48−3.93(m、11H)、3.87−3.62(m、9H)、3.60−3.45(m、39H)、3.41−3.34(m、15H)、3.33−3.23(m、7H)、3.18−3.08(m、2H)、2.97(t、2H)、2.23(s、3H)。
化合物12
国際公開第2001/42262号に記載のように調製した五糖8(0.2g)及びAngew. Chem. Intl. Ed.(1996), 35, 331−333に記載のように調製したグリコール誘導体10(53mg、1.3当量)をDMF(5.0mL)に溶解させた。NMM(61μL、5当量)を添加し、反応混合物を周囲温度で終夜撹拌した。溶媒を減圧蒸発させ、残渣を分取陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。適切な画分を混合し、分取G25カラムで脱塩した。混合画分を凍結乾燥させて、12(0.13g、55%)を白色粉末として得た。純度>95%(分析陰イオン交換、UV210nm)。1H−NMR(D2O、400MHz、HH−COSY):δ 5.12(d、1H)、5.03(d、1H)、4.70(d、1H)、4.34−4.18(m、2H)、4.09−4.03(m、1H)、3.98−3.90(m、5H)、3.85−3.74(m、6H)、3.66−3.48(m、7H)、3.43−3.24(m、41H)、3.23−3.15(m、13H)、3.12(m、2H)、3.10−3.01(m、7H)、2.99−2.88(m、3H)、2.78(t、2H)、2.04(s、3H)。
化合物14
五糖9(100mg)[五糖9は、国際公開第01/42262号に記載の誘導体化された単糖5と、米国特許出願公開第2004/0024197号に記載の四糖48との、脱保護及び硫酸化を含めて、これらの特許出願に記載の方法と類似の方法を用いたカップリングによって得ることができる。]及び化合物13(18mg、1.5当量)をDMFに溶解させた。NMM(15μL、2.5当量)を添加し、反応混合物を周囲温度で終夜撹拌した。溶媒を減圧蒸発させ、残渣を分取G25カラムによって精製した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、14(84mg、79%)を白色粉末として得た。純度>95%(分析陰イオン交換、UV210nm)。1H−NMR(D2O、400MHz、HH−COSY):δ 5.12(d、1H)、5.09(d、1H)、4.82(d、1H)、4.40−4.26(m、1H)、4.10−3.87(m、8H)、3.82−3.73(m、4H)、3.67−3.43(m、11H)、3.41−3.35(m、14H)、3.31−3.26(m、13H)、3.24−3.15(m、8H)、3.14−3.02(m、5H)、3.01−2.87(m、3H)、2.08(s、3H)。
化合物15
RecHインスリン(779mg)を無水DMSO(25mL)及びAcOH(465μL)に溶解させた。Boc2O(73mg、2.5当量)を溶液に添加し、生成した混合物を周囲温度で5時間撹拌した。0.1%TFAのH2O/ACN(9/1、v/v、150mL)溶液を添加して反応をクエンチし、溶液を4回凍結乾燥させた。残渣を0.1%TFAのH2O/ACN(9/l)/ACN(3:1)溶液に溶解させ、主生成物を分取HPLCによって単離した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、A1,B1−ジBocインスリン15(200mg、26%)を白色粉末として得た。純度:98%(分析HPLC)。C267H399N65O81S6のMS計算値=6008、(recHインスリンを内部比較基準として用いた)MALDI−TOFの実測値6008。
化合物16
RecHインスリン(752mg)を無水DMSO(20mL)及びTEA(0.75mL)に溶解させた。Boc2O(66mg、2.5当量)のDMSO(5mL)溶液を溶液に添加し、反応物を周囲温度で1.5時間撹拌した。0.1%TFAのH2O/ACN(9/1、v/v、150mL)溶液を添加して反応をクエンチし、混合物を3回凍結乾燥させた。生成した残渣を0.1%TFAのH2O/ACN(9/1)に溶解させ、分取HPLCに供した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、A1,B29−ジBocインスリン16を白色粉末として得た(332mg、43%)。純度:>98%(分析HPLC)。C267H399N65O81S6のMS計算値=6008、(recHインスリンを内部比較基準として用いた)MALDI−TOFの実測値6008。
化合物17
A1,B1−ジBocインスリン15(200mg)を無水ジメチルスルホキシド(5mL)及びトリエチルアミン(145μL)に溶解させた。GMBS(45mg、5当量)を添加し、反応混合物を周囲温度で30分間撹拌した。0.1%TFAのH2O/ACN(9/1、v/v、150mL)を添加して反応混合物をクエンチし、生成した混合物を凍結乾燥させて、A1,B1−ジBoc−B29−GMBインスリン17(0.5g、粗製)を得た。これをさらに精製せずに次の段階に使用した。
化合物18
A1,B29−ジBocインスリン16(330mg)を無水DMSO(5mL)及びTEA(332μL)に溶解させた。GMBS(230mg、15当量)を添加し、反応混合物を周囲温度で30分間撹拌した。0.1%TFAのH2O/ACN(9/1、v/v、150mL)溶液を添加して反応混合物をクエンチし、生成した溶液を凍結乾燥させて、A1,B29−ジBoc−B1−GMBインスリン18(0.6g、粗製)を得た。これをさらに精製せずに次の段階に使用した。
化合物19
A1,B1−ジBoc−B29−GMBインスリン17(0.5g、粗製)をTFA(5mL)に溶解させ、周囲温度で10分間撹拌した。TFAを減圧除去し、残渣を0.1%TFAのH2O/ACN(2/1、v/v)溶液に溶解させ、溶液をすぐに分取HPLCに供した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、B29−GMBインスリン19を白色粉末として得た(93mg、47%)。純度 >99%(分析HPLC)。
化合物20
A1,B29−ジBoc−B1−GMBインスリン18(0.6g、粗製)をTFA(5mL)に溶解させ、混合物を周囲温度で10分間撹拌した。TFAを減圧蒸発させ、粗生成物を0.1%TFAのH2O/ACN(9/2、v/v)溶液に溶解させ、生成溶液をすぐに分取HPLCに供した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、B1−GMBインスリン20を白色粉末として得た(127mg、40%)。純度 >99% 分析HPLC)。C267H399N65O81S6のMS計算値=5973、(recHインスリンを内部比較基準として用いた)MALDI−TOFの実測値5973。
GMB−インスリンと五糖の複合化の一般的手順
GMB−インスリン19又は20(25mg)を0.1M Na2HPO4緩衝剤(12mL、pH7.0、N2を溶液に通して脱気)に溶解させた。溶液を磁気撹拌子で撹拌し、さらに30分間脱気した。次いで、五糖5、11、12又は14(23mg、2.5当量)を固体として添加し、続いてNH2OH(50μL、0.05M)を添加した。反応混合物を窒素雰囲気下で周囲温度で撹拌した。16時間後、反応混合物を分取HPSEC(S75)に供した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、インスリン−ペンタ複合物24、25、26、27、28、29を白色粉末として、30%−50%の典型的な収率で得た。収率は、A280測定によってrecHインスリンの場合と同じモル吸光係数を用いて求めた。
化合物24
B29−GMBインスリン19(25mg)を五糖5(23mg)と一般的手順に従って複合化して、B29−五糖インスリン誘導体24(15mg、45%)を得た。C320H487N67O137S14のESI−MS計算値=7913、Q−TOFによる実測値2638.7 M3+;1979.2 M4+;1583.6 M5+、1319.8 M6+。純度:>98%(分析HPSEC、分析陰イオン交換)。
化合物25
B1−GMBインスリン20(25mg)を五糖5(23mg)と一般的手順に従って複合化して、B1−五糖インスリン誘導体25(16mg、47%)を得た。C320H487N67O137S14のESI−MS計算値=7913、Q−TOFによる実測値2637 M3+;1978 M4+;1583 M5+。純度:>95%(分析HPSEC)、>98%(分析陰イオン交換)。
化合物26
B29−GMBインスリン19(13mg)を五糖14(12mg)と一般的手順に従って複合化して、B29−五糖インスリン誘導体26(5mg、31%)を得た。C312H471N67O133S14のESI−MS計算値=7737、Q−TOFによる実測値2578 M3+;1934 M4+。純度:>98%(分析HPSEC)。
化合物27
B1−GMBインスリン20(15mg)を五糖14(13mg)と一般的手順に従って複合化して、B1−五糖インスリン誘導体27(8mg、40%)を得た。C312H471N67O133S14のESI−MS計算値=7737、Q−TOFによる実測値2578 M3+;1934 M4+。純度:>98%(分析HPSEC)。
化合物28
B29−GMBインスリン19(15mg)を五糖12(13mg)と一般的手順に従って複合化して、B29−五糖インスリン誘導体28(6mg、30%)を得た。C321H489N67O134S13のESI−MS計算値=7847、Q−TOFによる実測値1962 M4+;1570 M5+;1308 M6+。HPSEC純度:>98%。
化合物29
B29−GMBインスリン19(15mg)を五糖11(13mg)と一般的手順に従って複合化して、B29−五糖インスリン誘導体29(7mg、33%)を得た。C322H491N67O131S12のESI−MS計算値=7782、Q−TOFによる実測値2593 M3+;1945 M4+;1556 M5+。純度:>98%(分析HPSEC)。
分析的サイズ排除クロマトグラフィー
化合物24−29をSuperdex 75 26/10カラムを用いた分析的なHP−SEC分析に供した。50mM酢酸アンモニウムを用いて流量1.0mL/minで溶出させた。
インスリン−五糖複合物24−29並びに対応する前駆体15、16、19及び20をN末端配列解析(エドマン分解)に供した。実施したサイクルの各々において、B29が置換されたインスリン誘導体15、19、24、26、28及び29は、複合物の初期量のレベルに匹敵するレベルでA鎖アミノ酸とB鎖アミノ酸の等モル量を生成した。これは、両方のN末端の利用性(accessibility)が十分であることを示し、したがってB29位に限定される複合部分が存在しないことを示している。これに対し、B1が置換されたインスリン誘導体16、20、25及び27のN末端配列決定中にはA鎖アミノ酸しか見出されなかった。これは、B鎖のN末端におけるエドマン分解が結果として阻害されたB1位における複合化を示している。
試験の原理及び目的:生体分子間相互作用解析(BIA)は、相互作用物の一方をセンサーチップ表面に共有結合によって固定し、もう一方の相互作用物をこの表面を連続して流れる緩衝剤に注入することによって、(生体)分子間の相互作用を試験する。結合は、この表面での屈折率の変化として記録され、相互作用物の分子量(Mw)に比例する。
表2. 競合結合アッセイ(BIA試験)における潜在的ATIII結合能力を表すIC50値
五糖複合物の質量分析法による典型的な分析結果を図7に示す。例えば、総計の式(bruto formula)C320H487N67O137S14及びモノアイソトピック質量計算値7913を有する化合物24をESI−QTOFシステムで分析した。ESI−MSスペクトルでは、recHインスリンの電荷分布と一致するm/z比1319.8(6+)、1583.6(5+)、1979.2(4+)、2638.7(3+)の複数の荷電イオンが出現した。また、C320H487N67O137S14(化合物24)に対して無作為に選択した2価以上の荷電ピーク(例えば5+)の同位体分布は、Isoproプログラムを用いて理論計算した同位体分布(図7Aの点線を参照)と一致する。
ガニレリクス誘導体(dervative)30又は35(70mg)をDMF(20mL)に窒素雰囲気下で溶解させた。TBTU(14mg、1.05当量)及びNMM(25μL、5当量)を添加し、混合物を周囲温度で1時間撹拌した。五糖8又は9(88mg、1.1当量)をDMF(10mL)に溶解させて、懸濁液を得た。この懸濁液を反応混合物に添加し、残りの混合物を周囲温度で16時間撹拌した。反応混合物を水(200mL)で希釈し、凍結乾燥させた。生成した残渣を、0.01M酢酸アンモニウム(pH7)を用いた逆相シリカ(C18)にかけ、10から50%ACNの勾配でブロック溶出(block−elution)させて精製した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、ガニレリクス五糖複合物31、32、36又は37を白色粉末として得た。勾配溶出による分析HPLCを、溶離剤A(0.01M酢酸アンモニウム)90%と溶離剤B(ACN)10%で5分間開始し、次いで溶離剤B 100%までの勾配を30分間適用して実施した。
化合物31
J. Med. Chem. 1992, 35, 3942−3948に記載の固相ペプチド合成によって調製したガニレリクス誘導体30(70mg)を、一般的手順に従って五糖8(88mg)と複合化して、31(16mg、40%)を得た。純度96%(分析HPLC)、97%(分析陰イオン交換)。C126H191ClN18O62S6のESI−MS計算値=3175.0359、実測値792.7390[M−4H]4−、1057.3258[M−3H]3−、1062.9883[M+NH3−3H]3−。1H−NMR(D2O、400MHz、HH−COSY):δ 8.56(m、1H)、8.53(m、1H)、8.10(m、1H)、7.76(m、2H)、7.68(m、2H)、7.47(m、1H)、7.39(m、2H)、7.16(m、3H)、7.04(m、2H)、6.95(m、2H)、6.63(m、2H)、5.35−5.25(m、2H)、4.95(m、1H)、4.68−4.61(m、1H)、4.61−4.51(m、2H)、4.50−4.38(m、2H)、4.38−4.25(m、3H)、4.24−3.96(m、15H)、3.90−3.84(m、1H)、3.84−3.67(m、8H)、3.67−3.20(m、53H)、3.19−3.09(m、4H)、3.09−2.98(m、12H)、2.98−2.84(m、8H)、2.77(m、2H)、2.13(m、1H)、1.96−1.72(m、5H)、1.68−1.42(m、5H)、1.42−1.20(m、7H)、1.18−0.89(m、13H)、0.85−0.71(m、5H)。
化合物32
ガニレリクス誘導体30(70mg)を一般的手順に従って五糖9(88mg)と複合化して32(52mg、35%)を得た。C125H189ClN18O65S7の質量計算値=3240.9770;ESI−QTOFによる実測値809.2219[M−4H]4−、1079.2994[M−3H]3−、1084.9739[M+NH3]3−、1090.6340、[M+2NH3−3H]3−。1H−NMR(D2O、400MHz、HH−COSY):δ 8.45(m、1H)、8.38(m、1H)、7.90(m、1H)、7.78(d、1H)、7.73(m、2H)、7.59(m、1H)、7.50(m、1H)、7.43(m、2H)、7.20(m、3H)、7.05(d、2H)、6.97(m、2H)、6.66(m、2H)、5.40−5.30(m、2H)、5.09(d、1H)、4.67−4.48(m、2H)、4.40−3.92(m、18H)、3.92−3.75(m、7H)、3.77−3.17(m、56H)、3.12−3.02(m、11H)、3.02−2.98(m、8H)、2.97−2.83(m、4H)、2.81−2.75(m、2H)、2.14(m、1H)、1.99−1.86(m、5H)、1.82−1.23(m、12H)、1.22−0.90(m、13H)、0.87−0.72(m、5H)。純度:95%(分析HPLC)、97%(分析陰イオン交換純度)。
化合物34
化合物30(100mg)をDMFに溶解させた。TBTU(36mg、2当量)及びNMM(60μL、10当量)を添加し、反応混合物を周囲温度で1時間撹拌した。次いで、国際公開第2005090382号に記載のように調製した化合物33(34mg、2当量)を添加し、反応混合物を周囲温度で16時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣を水/CANに溶解させ、生成した溶液を分取HPLC(勾配:溶離剤A(0.1%TFA水溶液)80%と溶離剤B(ACN)20%から溶離剤A 20%と溶離剤B 80%まで45分間)に供した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、化合物34(60mg、60%)を白色粉末として得た。分析HPLCを、溶離剤A(0.1%TFA水溶液)75%と溶離剤B(CH3CN)25%から溶離剤A 20%と溶離剤B 80%までの勾配を15分間適用して実施した。C94H139ClN18O19の質量計算値=1859、MALDI−TOFの実測値1860[M+H]+及び1882[M+Na]+。純度:>90%(分析HPLC)。
化合物35
化合物34(60mg)をH2O/TFA/ACN(7mL、5:1:1)に溶解させ、周囲温度で2時間撹拌した。過剰量のTFA(2.5mL)を添加し、反応混合物をさらに22時間撹拌した。TFAを減圧蒸発させ、残りの溶液を凍結乾燥させて、35(45mg、77%)を白色粉末として得た。C90H131ClN18O19の質量計算値=1803、MALDI−TOFの実測値1804[M+H]+及び1826[M+Na]+。純度:>95%(分析HPLC)。
化合物36
ガニレリクス誘導体35(17mg)を五糖8(19mg)と一般的手順に従って複合化した。さらなる精製を分取HPLC(勾配:溶離剤A(0.01M酢酸アンモニウム)90%と溶離剤B(CH3CN)10%を5分間、次いでB 100%まで50分間)によって実施した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、36(2mg、6%)を得た。純度:94%(分析HPLC)、>98%(分析陰イオン交換)。
化合物37
ガニレリクス誘導体35(17mg)を五糖9(19mg)と一般的手順に従って複合化した。さらなる精製を、化合物36の場合と同様に、分取HPLCによって実施した。適切な画分を混合し、凍結乾燥させて、37(1.16mg、3%)を得た。純度:88%(分析HPLC)。分析陰イオン交換純度:>95%。
化合物39
NeoMPS(Strasbourg、France)によって供給される化合物38(26.5mg、8.4μmol)を、脱気した0.1M Na2HPO4/NaH2PO4緩衝剤(16mL、pH7.0)に溶解させた。五糖5(45.5mg、21μmol、2.5当量)を窒素雰囲気下で添加し、生成した混合物を約10分間撹拌した。次いで、NH2OH水溶液(50wt%、69μL)を添加し、反応混合物を16時間撹拌した。生成物をQ−Sepharoseカラム(2M NaCl(aq)/H2O/ACN、10/40/1→40/10/1、v/v/v)によって精製した。適切な画分を、上述したようにG25 sephadexクロマトグラフィーによって脱塩して、化合物39(15.7mg、35%)を得た。収率は、1mg/mL溶液に対する理論吸光度0.48を用いてA280測定によって求めた。C196H309N41O101S8の質量計算値=5108.8;ESI−Q−TOFによる実測値=1740.6[M+5Na]3+、1311.2[M−1H+6Na]4+、1053.5[M−2H+7Na]5+
スキーム6. 化合物39の合成
化合物41
NeoMPS(Strasbourg、France)によって調製された化合物40(15mg、4.2μmol)を、脱気した0.1M Na2HPO4/NaH2PO4緩衝剤(8mL、pH7.0)に溶解させた。五糖5(22.7mg、10.4μmol、2.5当量)を窒素雰囲気下で添加し、混合物を約10分間撹拌した。次いで、NH2OH水溶液(50wt%、0.14mL)を添加し、反応混合物を16時間撹拌した。生成物を、化合物39の場合と同様に精製して、化合物41(1.38mg、6%)を得た。収率は、1mg/mL溶液に対する理論吸光度1.22を用いてA280測定によって求めた。C218H342N44O106S8の質量計算値=5528;ESI Q−TOFの実測値=1843.7[M+3H]3+、1383.0[M+4H]4+、1107 M+5H]5+。
化合物44
Bachem(Weil am Rhein、Germany)などの供給業者から入手することができるオクトレオチド(化合物42、50mg、0.04mmol)をDMSO(5mL)に溶解させた。AcOH(7μL)を添加して、微酸性溶液を作製した。続いて、GMBS(11.2mg、0.04mmol、1.0当量)を添加し、生成溶液を窒素下で1時間撹拌した。LC−MS分析によれば、GMB部分がN末端Phe残基に極めて位置選択的に導入されたGMBオクトレオチド43にほぼ完全に転化された。反応物を約5℃に冷却し、NaH2PO4/Na2HPO4(20mL、pH7.0)溶液を添加した。10分後、混合物を室温にし、N2を10分間通した。次いで、五糖5(21.8mg、0.01mmol、0.25当量)を窒素雰囲気下で固体として添加し、続いてNH2OH水溶液(0.11mL、50wt%)を添加し、反応混合物を16時間撹拌した。生成物を、上述したようにイオン交換クロマトグラフィーによって精製して、化合物44(6.3mg、19%)を得た。C112H170N12O70S10の質量計算値=3122.7;ESI−Q−TOFによる実測値=1562.3[M+2H]2+、1041.9[M+3H]3+。1H−NMR(D2O、400MHz、HH−COSY):δ 7.52−7.29(m、10H)、7.26−7.14(m、4H)、7.03(s、1H)、5.44(m、1H)、5.37(m、1H)、5.14(m、1H)、5.12−4.89(m、2H)、4.77−4.60(m、3H)、4.45−3.97(m、18H)、3.95−3.76(m、13H)3.75−3.35(m、57H)、3.33−2.59(m、18H)、2.22−1.16(m、2H)、1.85−1.76(m、3H)、1.71−1.38(m、3H)、1.32−1.15(m、7H)、0.81−0.61(M、2H)。
化合物46
五糖9(100mg)及びGMBS(22mg、1.5当量)をDMF(10mL)に溶解させた。DiPEA(18μL、2当量)を添加し、反応混合物を周囲温度で終夜撹拌した。溶媒を減圧蒸発させ、残渣を分取G25カラムによって精製した。混合画分を凍結乾燥させて、46(50mg、46%)を白色粉末として得た。C53H77N2O55S7Na9のESI−MS計算値=2052;ESI−Q−TOFによる実測値=1027M2+。
化合物47
五糖マレイミド誘導体46を未変性recH−IL2(R&D systems、202−IL/CF)の遊離Cys125と複合化した。複合化前に、recH−IL−2をHPSEC、SDS−PAGE及びMALDI−TOF MSで分析した。それによれば、recH−IL−2は、圧倒的に単一な組成であった。recH−IL2(1mg、800μL、1.26mg/mL 0.5%SDS含有PBS溶液)をロールバンク上で過剰の化合物46(10mg/mL水溶液59μL、5当量)で終夜室温で処理して、出発材料を完全に転化させた。次に、未反応マレイミド46を5倍モル過剰のシステアミン(16μL、10mg/mL)で3時間ブロックした。反応混合物を、0.5%SDSのPBS溶液で透析して(カットオフ6−8kDa)、過剰のシステアミン及び46を除去した。生成物の最終量はA280で求めて0.69mgであった。
複合(ポリ)ペプチドの薬物動態の測定
本発明の化合物の代表例の薬物動態特性を以下のパラグラフに記載のように求めた。
ヒト及びラットの血しょう又は緩衝系中のヒトインスリンを測定するために、ヒト酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)を開発した。このようにして、ELISAを使用して、薬物動態学的実験由来の血しょう試料中のインスリン濃度を求めることができる。
インスリン複合物6及びrecHインスリンの薬物動態学的挙動を300−400gのオスのウィスターラットで試験した。ラットをO2/N2O/イソフルラン混合物の吸入によって麻酔し、その後、右の頚静脈をカニューレ処置した。翌日、ラットに化合物6又はrecHインスリン3.5nmol/kgをi.v.投与し、その後、血液を幾つかの時間間隔で採取した。血液を遠心分離し、その後、血しょうを吸い上げ、使用するまで−20℃で保存した。血しょう試料中の試験化合物の濃度を、ヒトELISAによって、試験化合物自体の原液でできた検量線に対して求めた。試料中の濃度をnmol/Lで表した。動力学的パラメータをWinNonlinのノンコンパートメントモデルを用いて計算した。
五糖複合物24、28、29、31、32、39及び41を、Machalonis et al.(Biochem J. 1969, 113:299−305)に従って、ラクトペルオキシダーゼ法によって125Iで標識した。標識後、複合物をSephadex G25を用いたゲルろ過及び陰イオン交換体HiTrap Q10によって精製した。動力学的実験を化合物6の場合と同様に、但し125I標識複合物を代わりに用いて繰り返した。甲状腺に125I−が蓄積するのを防止するために、化合物の投与前にラットを10mg/kgヨウ化カリウムで経口的に処理した。
表4. インスリン複合物24、28及び29のi.v.投与後の薬物動態パラメータ。実験をn=3/処理で実施した。比較のために、recHインスリンをn=1で試験した(cpm単位の用量を正規化した。)。
表5. 2種類の複合物31及び32のi.v.投与後の薬物動態パラメータ実験をn=3/処理で実施した。(脱ハロゲン化に対する補正をしていないデータ)。
表6. ADM(27−52)及び化合物39のi.v.投与後の薬物動態パラメータ。実験をn=3/処理で実施した。(脱ハロゲン化に対する補正をしていないデータ)。
表7. GLP−1及び化合物41のi.v.投与後の薬物動態パラメータ。実験をn=3/処理で実施した(cpm単位のデータを正規化した。)。
(ポリ)ペプチド五糖複合物がアンチトロンビンIIIにインビボで確実に結合するように、捕捉抗体として抗インスリンMabと検出抗体としてHRP複合抗ATIII抗体とを使用するサンドイッチ型ELISAを、化合物6の薬物動態学的実験から得られた血しょう試料に対して実施した。完全な五糖−インスリン−ATIII複合体のみが、recHインスリンを負の対照として使用したこのアッセイタイプにおいて検出できることは明らかである)。
インスリン及びインスリン複合物の生物活性を、ラットモデルにおいてグルコース抑制レベルを測定することによって試験した。ラットを実験前に終夜(16時間)絶食させた。朝、尾部を少し切って、全ラットから採血した。その後、血液を試験片に滴下し、ACCU−Check Sensor血糖モニター(Roche Diagnostics)を用いてグルコースレベルを測定した。ラットを加熱箱中で39℃で10分間予熱後、五糖−インスリン複合物6及びインスリンを尾静脈にi.v.投与した。投与量は、五糖−インスリン複合物6 7nmol/kg及びrecH−インスリン3.5nmol/kgであった。種々の時間間隔で、凝固した血液を除去して血液試料を採取し、その後、グルコース含量を上記のようにすぐに測定した。
recH−インスリンよりも五糖−インスリン複合物6の薬物動態特性が改善されたことは、i.v.投与後のグルコース抑制レベルが延長したことによって確認される(図19参照)。
Claims (32)
- ポリペプチドが少なくとも1個のオリゴ糖−スペーサー残基と複合化され、該オリゴ糖が4−18単糖単位を含む合成硫酸化オリゴ糖であり、該オリゴ糖自体がアンチトロンビンIIIに親和性を有し、該スペーサーが結合であり、又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基である、ポリペプチドとオリゴ糖の複合物又は薬剤として許容されるその塩。
- オリゴ糖が4−6単糖単位からなる、請求項1に記載の複合物。
- オリゴ糖が五糖である、請求項1又は2に記載の複合物。
- 50nM以下の循環血しょう中濃度を有する、請求項1から3のいずれか一項に記載の複合物。
- オリゴ糖自体が、ポリペプチド自体の薬理活性と比較したときに、治療レベル以下である抗凝血活性を有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の複合物。
- オリゴ糖−スペーサー残基が構造(I)を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の複合物。
Raは独立にOSO3 −であり、(1−8C)アルコキシであり、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基であり、又は1−13単糖単位を含むオリゴ糖残基であり、
Rbは独立に(1−8C)アルコキシであり、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基であり、又は1−13単糖単位を含むオリゴ糖残基であり、電荷は、プラスに帯電した対イオンによって打ち消されている。) - (IV)中の両方のR基がOSO3 −である、請求項9に記載の複合物。
- ポリペプチドが分子量約0.3−50kDaである、請求項1から10のいずれか一項に記載の複合物。
- ポリペプチドが分子量約0.3−20kDaである、請求項1から10のいずれか一項に記載の複合物。
- ポリペプチドが分子量約0.3−7.5kDaである、請求項1から10のいずれか一項に記載の複合物。
- ポリペプチドが、インスリン、カルシトニン、ガニレリクス、GLP−1、[D−Ala8]−GLP−1(7−36)、アドレノメデュリン、ADM(27−52)、キスペプチン−10、オクトレオチド又はインターロイキン−2から選択される、請求項11に記載の複合物。
- ポリペプチドが、インスリン、ADM(27−52)及び[D−Ala8]−GLP−1(7−36)から選択される、請求項14に記載の複合物。
- ポリペプチドが五糖−スペーサー残基で一置換されている、請求項1から15のいずれか一項に記載の複合物。
- スペーサーが、本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基である、請求項1から16のいずれか一項に記載の複合物。
- スペーサーが10−50原子の長さを有する、請求項17に記載の複合物。
- スペーサーが少なくとも1個の−(CH2CH2O)−要素を含む、請求項17又は18に記載の複合物。
- Yが構造A及びBから選択される、請求項20に記載の複合物。
- 請求項1から23のいずれか一項に記載の複合物と薬剤的に適切な助剤とを含む、薬剤組成物。
- 治療用の、請求項1から23のいずれか一項に記載の複合物。
- 医薬品が、ある種の治療用ポリペプチドよりも改善された薬物動態特性を有する請求項1から23のいずれか一項に記載の複合物を含む、該ポリペプチドによる治療を必要とする患者を治療するための該医薬品の製造に対する、請求項1から23のいずれか一項に記載の複合物の使用。
- (a)ポリペプチドが複合化用に改変される、必須でない段階と、(b)改変されていてもよいポリペプチドがオリゴ糖−スペーサー分子と反応する、カップリング段階とを含み、
ポリペプチドが少なくとも1個のオリゴ糖−スペーサー残基と複合化され、該オリゴ糖が4−18単糖単位を含む合成硫酸化オリゴ糖であり、該オリゴ糖自体がアンチトロンビンIIIに親和性を有し、該スペーサーが結合であり、又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基である、ポリペプチドとオリゴ糖の複合物又は薬剤として許容されるその塩の調製方法。 - オリゴ糖が4−6単糖単位からなる、請求項27に記載の方法。
- オリゴ糖が五糖である、請求項27又は28に記載の方法。
- 4−18単糖単位を含む合成硫酸化オリゴ糖であって、アンチトロンビンIII(ATIII)に対する親和性をそれ自体が有するオリゴ糖が、結合又は本質的に薬理学的に不活性である柔軟な連結残基によって、ポリペプチドに共有結合する段階を含み、該ポリペプチドを含む複合物が、生物活性を本質的に保持しつつ、元のポリペプチドよりも長い血しょう中半減期を有し、無視し得る抗凝血活性を有する、治療に有効な該複合物の調製方法。
- オリゴ糖が4−6単糖単位からなる、請求項30に記載の方法。
- オリゴ糖が五糖である、請求項30又は31に記載の方法。
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