KR20070090011A

KR20070090011A - 펩티도글리칸을 함유하는 글리코컨쥬게이트 백신

Info

Publication number: KR20070090011A
Application number: KR1020077016067A
Authority: KR
Inventors: 알리 파톰; 에드 하우스크네흐트; 스콧 윈스턴; 스티브 풀러
Original assignee: 나비 바이오파마슈티컬즈
Priority date: 2004-12-14
Filing date: 2005-12-02
Publication date: 2007-09-04
Also published as: TW200633719A; JP2008523142A; WO2006065553A3; US20060134141A1; AU2005316864A1; WO2006065553A2; MX2007007090A; AR052541A1; EP1846025A2; CN101132810A; CA2591442A1; AU2005316864B2; NZ556533A

Abstract

본 발명은 담체 단백질에 컨쥬게이션된 하나 이상의 협막 다당류를 포함하며, 협막 다당류는 백신의 특성을 개선시키는데 유효한 양의 펩티도글리칸을 함유하는 글리코컨쥬게이트 면역원을 포함하는 박테리아 감염 치료용 백신에 관한 것이다.

글리코컨쥬게이트 면역원, 박테리아 감염, 협막 다당류, 백신

Description

펩티도글리칸을 함유하는 글리코컨쥬게이트 백신 {GLYCOCONJUGATE VACCINES CONTAINING PEPTIDOGLYCAN}

본 발명은 일반적으로는 박테리아 감염을 치료하기 위한 백신에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 담체 단백질에 컨쥬게이션된 협막 다당류의 치료적 유효량을 포함하며, 여기서 협막 다당류는, 예를 들어 담체 단백질에 대한 협막 다당류의 개선된 컨쥬게이션 효율 또는 향상된 백신의 면역원성에 의해 보여지는 바와 같이, 백신의 특성을 향상시키는데 유효한 양의 펩티도글리칸을 포함하는 글리코컨쥬게이트 백신을 제공한다.

펩티도글리칸(PG)은 박테리아 세포벽에 특유한 이종중합체이며, N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 N-아세틸무람산(MurNAc)으로 된 교대 단위들의 글리칸 골격으로 이루어져 있으며, 짧은 펩티드가 MurNAc 잔기들의 락틸 기에 연결되어 있다. 대부분의 박테리아 종들에 있어서, 당들은 β-1,4-글리코시드 결합으로 연결되어 있으며, 펩티드의 일반적인 구조는 L-알라닌-D-글루탐산-이아미노산-D-알라닌-D-알라닌이다. 3 위치에서의 이염기성 아미노산(상기 식 중 "이아미노산")은 전형적으로, 그람 양성 구균에서는 리신이고, 그람 양성 간균 및 그람 음성 박테리아에서는 디아미노피멜산(DAP)이다. 상이한 글리칸 사슬 상에 위치한 아미노산들 사이의 펩 티드 가교 결합은 박테리아 세포벽의 필수적인 부분을 형성하는 복잡한 3차원 마크로분자를 형성시킨다. 이러한 중합체성 글리칸의 견고한 배열 및 펩티드에 대한 추가적인 가교는 함께 박테리아의 물리적 일체성을 유지시키는 박테리아의 세포 모양을 결정하는데 있어 주요한 역할을 수행한다. 상이한 박테리아 종들 사이에는 펩티도글리칸의 구조에 있어 미세한 변이들이 있을 수 있으며, 이들 대부분은 가교 펩티드에 관한 것이다.

수많은 연구들이 동물 모델에서의 펩티도글리칸의 병원성 효과를 설명하였다. 그러므로, 박테리아 세포벽으로부터 만들어진 백신들로부터 펩티도글리칸을 제거시킬 필요가 있었다. 예를 들어, 문헌 [Simelyte et al, Infect. Immun. 68: 3535- 40 (2000)]은 그람 양성 박테리아 세포의 조질 세포벽 수득물을 래트에 복강내 도입시켰을 때, 만성 관절염을 야기한다는 것을 개시하였다. 유사하게, 문헌 [Li et al, Infect. Immun. 69: 5883-91 (2001)]은 펩티도글리칸 제제를 관절내 주사하면 관절염 유사 증상을 유발한다는 것을 보고하였다. 문헌 [Myhre et al, Infect. Immun. 72: 1311-17 (2004)]은 펩티도글리칸을 패혈증 및 기관 손상에 있어서의 주된 병원성 인자로서 특성화하였다. 비슷하게, 문헌 [Mattsson et al., Infect. Immun. 70: 3033- 39 (2002)]은 펩티도글리칸이 박테리아성 패혈증 및 심장내막염을 유도하고, 응혈 시스템을 부수적으로 활성화함에 있어서 주된 병원성 인자라고 서술하였다. 이러한 보고된 펩티도글리칸의 해로운 효과들은 백신 및 다른 제약학적 제제 중에서 펩티도글리칸의 함량을 최소화하기 위한 당업계의 통상적인 지식을 강조하는 것이다.

<발명의 요약>

놀랍게도, 본 발명자들은 유리한 백신 특성이 담체 단백질에 대해 컨쥬게이션된 협막 다당류를 포함하는 글리코컨쥬게이트 백신 중에 최소 유효량 이상의 펩티도글리칸이 존재하는 것과 관련되어 있다는 것을 발견하였다. 이러한 이점들에는, 예를 들어 내성 없는 독성을 야기시키지 않으면서, 컨쥬게이션 효율이 향상되고 면역원성이 향상되는 것이 포함된다.

그러므로, 본 발명의 한 가지 측면에 따르면, (A) 하나 이상의 협막 다당류 및 담체 단백질을 포함하며, 여기서 협막 다당류는 최소 유효량의 펩티도글리칸을 포함하는 치료적 유효량의 글리코컨쥬게이트 면역원, 및 (B) 면역원에 대해 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신이 제공된다. 한 가지 실시태양에서, 협막 다당류는 담체 단백질에 대한 협막 다당류의 컨쥬게이션 효율을, 예를 들어 약 2% 펩티도글리칸을 포함하는 협막 다당류에 대하여 약 20% 이상 증가시키는데 유효한 양의 펩티도글리칸을 포함한다. 다른 실시태양에서, 협막 다당류는 백신의 면역원성을 증가시키는데 유효한 양의 펩티도글리칸을 포함한다. 다른 실시태양에서, 협막 다당류는 약 5% 이상의 펩티도글리칸을 포함한다. 일부 실시태양들에서, 글리코컨쥬게이트 면역원은 스타필로코쿠스(Staphylococcus)에 의해 발현되는 하나 이상의 협막 다당류, 예를 들어 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 의해 발현되는 협막 다당류 및/또는 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)에 의해 발현되는 협막 다당류를 포함한다. 예를 들어, 협막 다당류는 타입 5 협막 다당류, 타입 8 협막 다당류, 336 협막 다당류, PS-1 협막 다당류, 또는 이들의 조합일 수 있다. 또다른 실시태양에서, 담체 단백질은 슈도모나스(Pseudomonas)로부터의 외독소 A, 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 알파 헤몰리신, 또는 판톤-발렌틴(Panton-Valentine) 류코시딘(PVL)이다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 (A) (i) 하나 이상의 협막 다당류 및 담체 단백질을 포함하며, (ii) 여기서 협막 다당류는 최소 유효량의 펩티도글리칸을 포함하는, 치료적 유효량의 글리코컨쥬게이트 면역원, 및 (B) 면역원에 대해 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신을 투여하는 것을 포함하는, 박테리아 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 한 가지 실시태양에서, 협막 다당류는 담체 단백질에 대한 협막 다당류의 컨쥬게이션 효율을, 예를 들어 약 2%의 펩티도글리칸을 포함하는 협막 다당류에 대하여 약 20% 이상 증가시키는데 유효한 양의 펩티도글리칸을 포함한다. 다른 실시태양에서, 협막 다당류는 백신의 면역원성을 증가시키는데 유효한 양의 펩티도글리칸을 포함한다. 한 가지 실시태양에서, 협막 다당류는 약 5% 이상의 펩티도글리칸을 포함한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 (A) 하나 이상의 협막 다당류 및 담체 단백질을 포함하는 글리코컨쥬게이트 면역원을 포함하는 백신을 제조하는 방법을 제공하며, 본 방법은 (A) 하나 이상의 협막 다당류를 담체 단백질에 컨쥬게이션시켜 글리코컨쥬게이트 면역원을 형성하고(여기서, 협막 다당류는 최소 유효량의 펩티도글리칸을 포함함), (B) 치료적 유효량의 글리코컨쥬게이트 면역원을 상기 면역원에 대해 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화시키는 것을 포함하는 백신 제조 방법을 제공한다. 한 가지 실시태양에서, 협막 다당류는 담체 단백질에 대한 협막 다당류의 컨쥬게이션 효율을, 예를 들어 약 2% 펩티도글리칸을 포함하는 협막 다당류에 대하여 약 20% 이상 증가시키는데 유효한 양의 펩티도글리칸을 포함한다. 다른 실시태양에서, 협막 다당류는 백신의 면역원성을 증가시키는데 유효한 양의 펩티도글리칸을 포함한다. 한 가지 실시태양에서, 협막 다당류는 약 5% 이상의 펩티도글리칸을 포함한다.

또다른 측면에 따르면, 본 발명은 (i) 협막 다당류와 담체 단백질의 향상된 컨쥬게이션 효율에 기여하는데 유효한 양의 펩티도글리칸을 포함하는 협막 다당류를 선택하고, (ii) 협막 다당류를 담체 단백질에 컨쥬게이션시키는 것을 포함하는, 담체 단백질에 대한 협막 다당류의 컨쥬게이션 효율을 향상시키는 방법을 제공한다. 한 가지 실시태양에서, 협막 다당류는 담체 단백질에 대한 협막 다당류의 컨쥬게이션 효율을 약 2% 펩티도글리칸을 포함하는 협막 다당류에 대하여 약 20% 이상 증가시키는데 유효한 양의 펩티도글리칸을 포함한다. 다른 실시태양에서, 협막 다당류는 약 5% 이상의 펩티도글리칸을 포함한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 백신의 면역원성을 향상시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 (i) 백신의 향상된 면역원성에 기여하는 양의 펩티도글리칸을 포함하는 협막 다당류를 선택하고, (ii) 협막 다당류를 담체 단백질과 컨쥬게이션시켜 글리코컨쥬게이트 면역원을 형성하고, (iii) 글리코컨쥬게이트 면역원 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신을 제조하는 것을 포함한다. 한 가지 실시태양에서, 협막 다당류는 5% 이상의 펩티도글리칸을 포함한다.

<도면의 간단한 설명>

도 1은 에스. 아우레우스 타입 8 협막 다당류의 펩티도글리칸 함량 및 티올화 사이의 상관관계를 보여준다. 정제된 타입 8 협막 다당류는 담체 단백질에 컨쥬게이션시키기 전에 아미노산 분석을 통해 그 펩티도글리칸의 농도를 분석하였다. 엘만(Ellman) 분석법을 사용하여 환원된 유도체화된 다당류에 대한 티올화 비를 결정하였다.

언급된 바와 같이, 본 발명자들은 최소 유효량 이상의 펩티도글리칸(PG)의 존재가 담체 단백질에 대해 컨쥬게이션된 협막 다당류(CPS)를 포함하는 글리코컨쥬게이트 백신에 대해 이점을 부여한다는 것을 발견하였다. 본원에서 사용되는 "협막 다당류(capsular polysaccharide)"는 세포벽에 결합된 다당류 항원 및 표면 다당류 항원 모두를 포함한다. 한 가지 측면에서, CPS와 결합된 PG의 존재는, 예를 들어 CPS의 티올화를 향상시킴으로써, 담체 단백질에 대한 CPS의 컨쥬게이션 효율을 증가시킨다. 향상된 컨쥬게이션 효율은 컨쥬게이션 반응 효율의 향상(즉, 보다 많은 비율의 반응물들이 컨쥬게이션됨) 및 CPS와 담체 단백질 사이의 가교 증가를 포함하는 이점들을 제공한다. 가교의 증가는 이어서, 보다 크고, 보다 면역원성이며, 보다 안정한 글리코컨쥬게이트 면역원 분자를 포함하는 이점들을 제공한다. 다른 측면에서, CPS에 결합된 PG의 존재는 글리코컨쥬게이트 백신의 면역원성을 향상시킨다. 임의의 이론에 매이는 것을 원치 않으면서, 본 발명자들은 단백질 담체에 대한 박테리아 다당류 항원들의 컨쥬게이션이 항원을 변화시켜, 이들이 T-세포 의존성 면역원이 되게 함으로써, 백신을 강화시킨다고 생각하였다. 따라서, 담체 단백질에 대한 CPS의 컨쥬게이션 효율을 향상시키면, 백신의 면역원성이 향상된다. 따라서, 본 발명의 백신은 보다 낮은 PG 함량을 갖는 선행기술의 제제들보다 더 면역원성이다. 따라서, 본 발명은 PG를 포함하는 신규한 백신 제제 및 그를 제조하는 방법 및 사용하는 방법을 제공한다.

조성

본 발명은 하나 이상의 CPS 및 담체 단백질을 포함하는 치료적 유효량의 글리코컨쥬게이트 면역원을 포함하며, 여기서 CPS는 최소 유효량 이상의 PG, 및 면역원에 대해 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신을 제공한다. 임의의 이론에 매이지 않으면서, 본원에 설명된 바와 같이 얻어지는 CPS는 CPS 분자에 공유 결합된 PG 분자를 포함한다고 여겨진다. 다르게는, CPS 분자는 다른 힘을 통해 PG 분자에 가깝게 결합될 수 있다.

협막 다당류 항원 ( CPS )

상기에서 언급된 바와 같이, 본원에서 사용되는 "협막 다당류"는 세포벽에 결합된 다당류 항원 및 표면 다당류 항원 모두를 포함한다. 한 가지 실시태양에 따르면, CPS는 스타필로코쿠스, 예를 들어 스타필로코쿠스 아우레우스 또는 스타필로코쿠스 에피더미디스에 의해 발현된다. 예시적인 에스. 아우레우스 CPS에는 타입 5 협막 다당류, 타입 8 협막 다당류, 및 336형 협막 다당류가 포함된다. 예시적인 에스. 에피더미디스 항원에는 PS-1 협막 다당류가 포함된다. 본 발명의 백신은 이러한 유형들 중 하나 이상의 CPS를 포함할 수 있다. 다른 CPS, 예를 들어 다른 박테리아 협막 다당류 세포벽 항원들 또한, 단독으로 또는 다른 항원, 예를 들어 상기에서 설명된 스타필로코쿠스 항원과 조합되어 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

약 85-90%의 에스. 아우레우스가 CPS 타입 5 또는 타입 8이라는 것이 연구에 의해 보여졌다. 타입 5와 타입 8 협막 다당류 항원 모두를 함유하는 백신으로 백신화된 정상적인 개체는 85-90%의 에스. 아우레우스 균주에 의한 감염으로부터 보호된다. 따라서, 본 발명의 한 가지 실시태양에 따르면, 본 백신은 타입 5 및 타입 8 CPS 모두의 글리코컨쥬게이트를 포함한다.

에스. 아우레우스 타입 5 및 타입 8 CPS의 화학적 조성은 동일하지만, 그 구조는 상이하다. 양자는 N-아세틸-만누론산(ManNAcAPp) 및 N-아세틸-푸코사민(FucNAcp)이 1:2의 비로 구성된 중합체이지만, 이들은 이들 당들 사이의 글리코시드 결합 및 O-아세틸화 부위 및 그 정도에 있어서 상이하다. 문헌 [Moreau et al., Carbohydr. Res., 201(2):285-97 (1990)]; [Fournier et al., Ann. Inst. Pasteur Microbiol, 138(5):561-7 (1987)]. 양자는 그들의 반복 단위 중에 ManNAcAp 뿐 아니라 FucNAcp를 가지며, 이들은 술프히드릴 기를 도입시키는데 사용될 수 있다. 타입 5 및 타입 8 다당류 항원의 구조는 문헌 [Moreau et al, Carbohydr. Res. 201:285 (1990)]; 및 [Fournier et al, Infect. Imm. 45:87 (1984)]에 의해 규명되었으며, 하기에 나타나 있다:

타입 5:

→4)-β-D-ManpNAcA(3OAc)-(1→4)-α-L-FucpNAc-(1→3)-β-D-FucpNAc-(1→

타입 8:

→3)-β-D-ManpNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucpNAc-(1→3)-β-D-FucpNAc-(l→

구조적 유사성에도 불구하고, 두 유형 사이에는 어떠한 증명될 수 있는 면역학적인 교차반응성도 발견되지 않았다.

본 발명에 따른 백신에 사용될 수 있는 다른 스타필로코쿠스 항원은 미국 특허 No. 5,770,208 및 No. 6,194,161에 설명되어 있는 336 CPS이다. 이러한 음전하를 띤 항원은 GlcNAc 및 1,5-폴리(리비톨 포스페이트) 성분을 포함하며, O-아세틸 기를 함유하지 않는다. 예시적인 336 항원은 ATCC 55804로 기탁된 에스. 아우레우스 336형에 대한 항체에 특이적으로 결합한다. 이 항원을 갖고 있는 스타필로코쿠스 아우레우스 균주는 타입 5 또는 타입 8 균주가 아닌 임상적으로 중요한 에스. 아우레우스 균주의 거의 모두를 설명한다. 따라서, 본 발명은 무엇보다도, 각각 타입 5, 타입 8 및 366 CPS의 글리코컨쥬게이트를 포함하는 백신을 고려하고 있다. 그러한 백신은 거의 100%의 에스. 아우레우스 균주들에 의한 감염으로부터 보호할 수 있다.

많은 임상적으로 중요한 에스. 에피더미디스 균주들이 존재한다. 에스. 에피더미디스 균주에 의한 감염의 치료 또는 예방을 위한 백신은 미국 특허 No. 5,961,975 및 No. 5,866,140에 개시된 1형 항원을 포함하는 컨쥬게이트를 포함할 수 있다. PS-1로도 불리는 이 항원은 ATCC 55254(I형 단리물)에 대해 항혈청을 응집시키는 에스. 에피더미디스의 단리물의 세포들을 성장시키고, 세포들로부터 다당류 항원을 추출하여 다당류 항원의 조질 추출물을 제조하고, 이 조질 추출물을 정제하여 최소 유효량 이상의 펩티도글리칸을 함유하는 정제된 항원을 제조하고(보다 구체적으로는, 하기에 설명되어 있음), 분리 컬럼 상에 정제된 항원을 로딩하고, NaCl 구배를 따라 이를 용리하며, I형 단리물에 특이적인 항체를 사용하여 다당류 항원을 함유하는 분획을 확인하는 것을 포함하는 방법에 의해 얻어질 수 있는 산성 다당류 항원이다.

본 발명에 따른 백신에 유용한 또다른 스타필로코쿠스 항원은 WO 00/56357에 설명되어 있다. 이 항원은 아미노산 및 α 배열의 N-아세틸화된 헥소사민을 포함하고, O-아세틸 기를 함유하지 않으며, 헥소스를 함유하지 않는다. 이 항원은 ATCC 202176으로 기탁된 스타필로코쿠스 균주에 대한 항체에 특이적으로 결합한다. 본 항원의 아미노산 분석은 세린, 알라닌, 아스파르트산/아스파라긴, 발린, 및 트레오닌이 약 39:25:16:10:7의 몰 비로 존재함을 보여준다. 아미노산은 항원 분자의 약 32 중량%를 구성한다.

담체 단백질

박테리아 협막 다당류 항원은 일반적으로 불량한 면역원이다. 따라서, 이들은 흔히 담체 단백질에 컨쥬게이션되어 그의 면역원성을 향상시킨다. 본 발명에 따른 적합한 담체 단백질에는 파상풍 톡소이드 및 디프테리아 톡소이드 및 이들의 재조합으로 제조되고 유전적으로 탈독소화된 변이물, 스타필로코쿠스 내독소 또는 톡소이드, 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A 또는 그의 유도체, 예를 들어 문헌 [Fattom et al., Inf. and lmm. 61: 1023-32 (1993)]에 설명된 바와 같은 슈도모나스 애루기노사의 재조합 제조된 비독성 돌연변이 균주의 외독소 A, 뿐 아니라 면역담체로 사용하기에 적합한 기타 단백질, 펩티드 및 바이러스 유사 입자가 포함된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 다른 담체 단백질에는 스타필로코쿠스 아우레우스 외독소, 예를 들어 알파 헤몰리신(알파톡신) 및 판톤-발렌틴 류코시딘이 포함된다.

외독소 A는 슈도모나스 애루기노사로부터의 주된 유독 인자이며(문헌 [Callahan et al., Infect. Immun. 43: 1019-26 (1984)] 참조), 본 발명의 백신의 부생성물로서 독소-중성화 항체를 생성할 수 있다. 따라서, 외독소 A에 컨쥬게이션된 스타필로코쿠스 CPS를 포함하는, 본원에서 설명된 백신들은 스타필로코쿠스 뿐 아니라 슈도모나스의 감염에 대한 위험이 있는 환자에게 유용할 수 있다. 문헌 [Pollack et al, J. Clin. Invest. 63: 276-86 (1979)] 및 [Cryz et al., Rev. Infect. Dis. 9 (Suppl 5): S644-S649 (1987)] 참조. 이 단백질의 재조합된 비독성 형태(rEPA)는 효소 활성 부위 중 553 위치의 글루탐산을 결실시킴으로써 얻어졌다. 문헌 [Lukac et al., Infect. Immun. 56: 3095-98 (1988)] 참조. 이 결실로 인해 단백질 전체는 효소 활성을 잃게 되는 반면에, 본래 독소의 항원성은 여전히 유지한다. 따라서, 본 발명 내의 백신은 담체 단백질로서 rEPA를 포함하는 글리코컨쥬게이트를 포함할 수 있다.

최소 유효량의 펩티도글리칸

본 발명에 따라, 백신은 담체 단백질에 컨쥬게이션된, CPS를 포함하는 글리코컨쥬게이트 면역원을 함유할 수 있으며, 이는 최소 유효량 이상의 PG를 포함한다. PG의 "최소 유효량"은 백신의 특성을 개선시키는데 효과적인 양이다. 한 가지 실시태양에서, 개선된 특성은 향상된 컨쥬게이션 효율에 의해 반영되며, "최소 유효량"은 담체 단백질에 대한 CPS의 컨쥬게이션을 향상시키는데 충분한 PG의 양을 나타낸다. 다른 실시태양에서, 개선된 특성은 증가된 면역원성에 의해 반영되며, "최소 유효량"의 문구는 백신의 면역원성을 증가시키는데 충분한 PG의 양을 나타낸다.

예를 들어, 글리코컨쥬게이트 면역원은 담체 단백질에 대한 CPS의 컨쥬게이션 효율을, 예를 들어 약 2%의 PG를 포함하는 CPS에 대하여 약 20% 이상 증가시키는데(즉, 비교 CPS보다 1.20배의 컨쥬게이션 효율) 유효한 양의 PG를 포함하는 CPS를 포함할 수 있다. 다르게는, 글리코컨쥬게이트 면역원은 백신의 면역원성을 증가시키는데 유효한 양의 PG를 포함하는 CPS를 포함할 수 있다. 물론, 글리코컨쥬게이트 면역원은 컨쥬게이션 효율 및 백신의 면역원성 모두를 증가시키는데 유효한 양의 PG를 포함하는 CPS를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 문구 "컨쥬게이션 효율"은 담체 단백질에 대한 CPS의 컨쥬게이션에 관한 것이다. 향상된 컨쥬게이션 효율은 컨쥬게이션 과정 동안 담체 단백질에 컨쥬게이션되는 CPS의 백분율이 증가되는 것으로 반영된다. 예를 들어, 본 발명에 따르면, 50% 이상의 CPS 분자가 하기 설명되는 컨쥬게이션 과정에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션된다. 다르게는, 향상된 컨쥬게이션 효율이 CPS와 담체 단백질 사이의 증가된 가교로 반영될 수 있다. 가교의 증가는 일반적으로, 보다 큰 글리코컨쥬게이트 면역원 분자를 야기하고, 이는 일반적으로 보다 큰 면역원성을 보인다. 뿐만 아니라, 가교의 증가는 일반적으로 보다 안정한 글리코컨쥬게이트 면역원 분자를 야기한다.

제공되는 CPS 제제의 컨쥬게이션 효율은 하기에서 설명되고, 실시예에서 예시되는 방법을 포함하는, 당업계에서 공지된 방법들에 의해 측정될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 컨쥬게이션 효율은 하기 및 도 1에서 설명되는 바와 같이, CPS의 티올화 효율을 측정함으로써 결정될 수 있다. 따라서, 본원에서 제공되는 PG의 "최소 유효량"의 정의는 CPS의 티올화를 향상시키는데 충분한 PG 양을 포함한다. 예를 들어, 글리코컨쥬게이트 면역원은 CPS의 티올화 효율을 약 2% PG를 포함하는 CPS에 대하여 약 20% 이상 증가시키는데(즉, 비교 CPS보다 1.20배의 티올화 효율) 유효한 양의 PG를 포함하는 CPS를 포함할 수 있다.

제공되는 백신 제제의 면역원성은 하기에서 설명되고, 실시예에서 예시되는 방법을 포함하는, 당업계에서 공지된 방법들에 의해 측정될 수 있다.

CPS의 PG 함량은 특정 아미노산의 w/w %의 단위로 표현될 수 있으며, 이는 하기와 같이 수행되는 아미노산 분석(AAA)을 통해 결정된다.

물 중 1 mg/ml의 정제된 CPS 샘플을 증기 상 염산으로 가수분해시킨다. 재구축된 제1 아미노산 및 제2 아미노산을 395 nm에서 강하게 형광을 발하는 안정한 형광 유도체로 변환시킨다. 재현탁된 단백질 가수분해물의 분석은 역상 HPLC로 수행한다. 아미노산을 외부 표준 및 내부 표준을 이용하여 정량화한다. 다당류 용액 중에 존재하는 아미노산들은 (1) PG(잔기 Ala, Glx, Gly 및 Lys) 및 (2) 잔류 단백질(잔기 Arg, Asx, Ile, Leu, Met, Phe, Ser, Thr, Thy, Val, His 및 Pro)로부터 유래한다. 2개의 아미노산(Cys 및 Trp)들은 정량화하지 않으며, 따라서 보고하지 않는다. PG 및 잔류 단백질에 결합된 아미노산들의 농도를 하기 식을 이용하여 CPS에 대한 질량 백분율로 보고한다:

(Gln/Glu) + (Gly) + (Ala) + (Lys) = (PG)

[PG] / [cPS] x 100 = %펩티도글리칸

∑(아미노산) = (펩티드)_cps

(펩티드)_cps - (PG) / (cPS) x 100 = %RP

상기 식들 중,

[단백질] = AAA에 의한 샘플의 단백질 농도(mg/ml)

[PG] = 샘플의 계산된 펩티도글리칸 함량(mg/ml)

[CPS] = 샘플의 알려진 다당류 함량(mg/ml)

(펩티드)_cps = 총 펩티드 농도

%RP = 잔류 단백질(%)

한 가지 실시태양에서, CPS는 약 5% 이상의 PG, 예를 들어 5% PG, 예를 들어, 약 7% 이상의 PG, 약 9% 이상의 PG, 및 약 11% 이상의 PG를 포함한다. 유효한 다른 PG 양은 약 13% 이상의 PG, 약 15% 이상의 PG, 약 17% 이상의 PG, 약 19% 이상의 PG, 약 21% 이상의 PG, 약 23% 이상의 PG, 약 25% 이상의 PG, 및 약 27% 이상의 PG이다. 문구 "약 ... 이상"은 구체화된 양보다 1% 많은 양과 1% 적은 양 사이의 양의 PG 백분율을 포함한다. 따라서, "약 5% 이상"은 4-6% PG를 포함한다. 문구 "이상"은 구체화된 양보다 많거나, 그와 같은 양의 PG 백분율을 포함한다. 따라서, "5% 이상"은 5%의 PG 또는 그 이상의 PG를 포함한다.

예를 들어, 본 발명에서는 하나 이상의 협막 다당류 및 담체 단백질을 포함하며, 여기서 협막 다당류는 협막 다당류의 중량을 기준으로 약 5% (w/w)의 펩티도글리칸을 포함하고, 담체 단백질은 알파 헤몰리신, 판톤-발렌틴 류코시딘, 슈도모나스로부터의 외독소 A, 파상풍 톡소이드 또는 디프테리아 톡소이드인 글리코컨쥬게이트 면역원, 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신이 고려된다.

본 발명의 다른 실시태양에서, 백신은 비독성 담체 단백질, 예를 들어 재조합 엑소프로테인 A(rEPA)에 컨쥬게이션된 2 이상의 임상적으로 중요한 CPS 유형, 예를 들어 에스. 아우레우스 타입 5, 타입 8 및/또는 366의 글리코컨쥬게이트를 포함한다. 그러한 한 가지 실시태양에서, 하나 이상의 CPS 항원은 최소 유효량 이상의 PG, 예를 들어 상기에서 설명된 바와 같이 측정된 5% 이상의 PG를 포함한다. 그러한 다른 실시태양에서, 각각의 CPS 항원은 최소 유효량 이상의 PG, 예를 들어 5%의 PG를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 전체 글리코컨쥬게이트는 최소 유효량의 PG, 예를 들어 모든 CPS 항원들의 총 중량을 기준으로 전체적으로 5% 이상의 PG 함량을 포함한다.

최소 유효량의 PG를 선택하는 것은 PG가 제공하는 백신의 개선된 효능(즉, 향상된 컨쥬게이션 효율 및 면역원성)에 대해 PG로 인한 독성을 균형화시키는 것을 필요로 할 수 있다. 백신 분야에 특유한 한 가지 요건은 효능에 대해 독성을 균형화시키는 것이고, 당업자는 통상적인 실험에 의해 소정의 상황에서 이러한 균형에 도달할 수 있다. 독성은, 예를 들어 상기에서 논의된 PG의 보고된 병원성 효과에 대해 초점을 두는 잘 알려진 기법들을 통해 결정될 수 있다. 마찬가지로, 효능은 하기 실시예들에서 예시되는 바와 같은 공지된 방법론에 따라 결정될 수 있다. 따라서, 효능은 면역원성, 즉 항체 생산을 유도하는 능력의 관점, 또는 향상된 컨쥬게이션 효율, 즉 담체 단백질에 대한 CPS의 컨쥬게이션을 향상시키는 능력의 관점에서 측정될 수 있다. 유효량의 PG는 임상학자에 의해 독성학적으로 내성있지만 여전히 효능있는 것으로 간주될 글리코컨쥬게이트 백신을 제공한다. 예를 들어, 임상학자는 약 5% 이상 내지 약 27% 이상, 예를 들어 약 19% 이상 범위의 PG 함량을 갖는 CPS를 포함하는 본 발명에 따른 백신이 허용될 수 없는 독성 효과를 보이지 않으면서 향상된 효능(즉, 향상된 컨쥬게이션 효율 및/또는 면역원성)을 제공한다는 것을 발견할 수 있다.

방법

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 글리코컨쥬게이트 백신을 제조하는 방법 및 그를 사용하는 방법을 제공한다. 담체 단백질에 대한 CPS의 컨쥬게이션 효율을 향상시키는 방법, 글리코컨쥬게이트 백신의 면역원성을 향상시키는 방법, 및 박테리아 감염을 치료 또는 예방하기 위한 방법이 구체적으로 설명된다.

CPS 컨쥬게이트 백신을 제조하는 방법 및 관련 방법

한 가지 측면에서, 본 발명은 최소 유효량 이상의 PG를 갖는 CPS를 포함하는 글리코컨쥬게이트 백신을 제조하는 방법을 제공한다. 본 방법은 하나 이상의 CPS 항원을 담체 단백질에 컨쥬게이션시켜 글리코컨쥬게이트 면역원을 형성하는 것을 포함하며, 여기서 CPS 항원은 최소 유효량 이상의 PG를 포함한다. 치료적 유효량의 글리코컨쥬게이트 면역원은 면역원에 대해 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화되어 백신을 제공한다. 한 가지 실시태양에서, PG의 양은, 예를 들어 2%의 PG를 포함하는 CPS에 대하여 약 20% 이상 컨쥬게이션 효율을 향상시키는데 효과적이다. 다른 실시태양에서, PG의 양은 백신의 면역원성을 증가시키는데 효과적이다. 다른 실시태양에서, CPS는 약 5% 이상의 PG를 포함한다.

예를 들어, 하나 이상의 CPS 및 담체 단백질을 포함하는 글리코컨쥬게이트 면역원을 포함하며, 여기서 협막 다당류는 최소 유효량의 PG를 포함하고, 담체 단백질은 알파 헤몰리신, 판톤-발렌틴 류코시딘, 슈도모나스로부터의 외독소 A, 파상풍 톡소이드 또는 디프테리아 톡소이드인 글리코컨쥬게이트 면역원, 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신을 제조하는 방법이 본원에 설명되어 있다. 한 가지 실시태양에서, 최소 유효량의 PG는 CPS의 중량을 기준으로 약 5% 이상의 PG이다.

다른 측면에서, 본 발명은 백신의 면역원성을 향상시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 백신의 향상된 면역원성에 기여하기 위한 최소 유효량 이상의 PG를 갖는 CPS를 선택하고, CPS를 담체 단백질에 컨쥬게이션시켜 글리코컨쥬게이트 면역원을 형성하는 것을 포함한다. 치료적 유효량의 글리코컨쥬게이트 면역원은 면역원에 대해 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화되어 백신을 제공한다. 한 가지 실시태양에서, CPS는 약 5% 이상의 PG를 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 담체 단백질에 대한 CPS의 컨쥬게이션 효율을 향상시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 향상된 컨쥬게이션 효율에 기여하기 위한 최소 유효량 이상의 PG를 갖는 CPS를 선택하고, CPS를 담체 단백질에 컨쥬게이션시키는 것을 포함한다. 한 가지 실시태양에서, PG의 양은, 예를 들어 2%의 PG를 포함하는 CPS에 대해 약 20% 이상 컨쥬게이션 효율을 향상시키는데 효과적이다. 다른 실시태양에서, CPS는 약 5%의 PG를 포함한다.

이들 방법들에 사용하기에 적합한 정제된 CPS(PG 포함)는, 예를 들어 박테리아를 처리하여 CPS를 방출시키고 나서, CPS를 정제함으로써 얻어질 수 있다. 이러한 과정은 박테리아의 효소 분해(예를 들어, 리소스타핀, RNAse 및/또는 DNAse를 사용) 및 CPS 회수(예를 들어, 에탄올 침전, 원심분리 및 여과를 이용)를 포함할 수 있다. 추가적인 정제 단계들에는 투석(예를 들어, 미량의 에탄올을 제거하기 위함), 2차 효소 분해(예를 들어, RNAse, DNAse 및/또는 프로테아제, 예를 들어 프로나제 E를 사용) 및 투석, 추가적인 CPS 회수(예를 들어, 에탄올 침전, 원심분리, 투석 및 여과를 사용), 및 크로마토그래피 방법, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 크기 배제/겔 여과 크로마토그래피가 포함될 수 있다.

얻어지는 정제된 CPS의 PG 함량은, 예를 들어 효소 분해 단계(들)에서 제어될 수 있다. 예를 들어, 박테리아로부터 CPS를 방출시키기 위해 사용되는 리소스타핀의 양을 조정하는 것은 CPS의 PG 함량에 영향줄 수 있으며, 보다 낮은 리소스타핀의 농도는 일반적으로 보다 높은 PG 함량을 야기한다. 한 가지 실시태양에서, 사용되는 리소스타핀의 농도는 세포 페이스트 1 g 당 약 100 ㎍ 내지 약 1000 ㎍(세포 페이스트 1 g 당 약 7 내지 약 64 유닛에 대략 해당함) 범위이다. 다른 실시태양에서는, 세포 페이스트 1 g 당 약 225 ㎍(세포 페이스트 1 g 당 약 16 유닛에 대략 해당함)의 리소스타핀이 사용된다. 비슷한 양의 리소스타핀이 임의적인 2차 리소스타핀 단계에서 사용될 수 있다.

한 가지 실시태양에서, 박테리아 배양액을 발효시키고, 원심분리시켜 세포 페이스트를 얻는다. 리소스타핀은, 예를 들어 페이스트 1 g 당 약 16 유닛의 리소스타핀의 농도로 첨가되어 상기에서 설명된 과정의 1차 효소 분해 단계를 수행한다. 다른 실시태양에서, 리소스타핀은 정제 과정 중에 두 번째로 첨가된다. 예를 들어, 페이스트 1 g 당 약 16 유닛의 리소스타핀이 1차 회수 단계(에탄올 침전) 후에 첨가될 수 있다.

이러한 양의 리소스타핀들은 단지 예시적인 것이며, 목표 PG 함량에 따라 조정될 수 있다. 상기에서 설명된 바와 같이, 리소스타핀의 농도를 증가시키면 일반적으로 PG 함량을 낮출 것이고, 리소스타핀의 농도를 감소시키면 일반적으로 PG 함량을 증가시킬 것이다. 또한, PG 함량은 리소스타핀 효소 분해의 온도를 조정함으로써 제어될 수 있으며, 37℃가 최적 온도이고, 20-30℃ 범위의 보다 낮은 온도는 효소 분해 시간을 길게 한다. 따라서, 보다 낮은 온도에서 리소스타핀 효소 분해를 수행하는 것은 보다 높은 PG 함량을 갖는 제제를 수득하게 할 수 있다.

얻어진 정제된 CPS의 PG 함량은 또한, (임의적인) 2차 효소 분해 단계에서 사용되는 프로테아제의 양을 조정하거나, 그 단계에서 프로테아제의 사용을 생략함으로써 제어될 수 있다.

예를 들어, CPS는 일반적으로, 미국 특허 No. 6,194,161, 문헌 [Fattom et al., Vaccine 13: 1288-93 (1995)] 및 [Fattom et al., Infect. Immun. 58: 2367-74 (1990)]에 설명된 방법들에 따라 박테리아로부터 단리되고 정제될 수 있다. 하지만, 최소 유효량 이상의 PG를 갖는 CPS를 얻기 위해서는, 이들 문헌들에 설명된 농도, 예를 들어 세포 페이스트 1 g 당 약 7 내지 약 64 유닛보다 낮은 농도의 리소스타핀이 효소 처리 단계 동안에 사용된다. 뿐만 아니라, 이들 문헌들에 개시된 프로나제(프로테아제) 단계는 본 발명에 따라 최소 유효량 이상의 펩티도글리칸을 갖는 CPS를 얻기 위해서 변형되거나 생략될 수 있다.

정제된 CPS, 예를 들어 스타필로코쿠스 아우레우스 타입 5 및 타입 8 혈청형으로부터의 정제된 CPS는 PG 함량을 평가하기 위하여 2차원 NMR을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, NMR 스펙트럼 분석은 PG의 주된 아미노산 성분들인 알라닌, 글루타민/글루탐산 및 리신의 존재를 나타낼 수 있다. 마찬가지로, 탈-O-아세틸화된 타입 5 및 타입 8 CPS의 NMR 스펙트럼은 2개의 비치환된 히드로메틸 기에 대한 증거를 제공할 수 있으며, 이는 PG 중에 β-GlcNAc 및 β-MurNAc 잔기가 존재하는 것과 일치할 것이다.

최소 유효량 이상의 PG를 갖는 CPS가 본 발명의 방법에서 사용되기 위하여 선택된다. 정제된 CPS의 PG 함량은 상기 설명된 바와 같이 AAA를 사용하여 결정될 수 있다.

CPS의 단리 및 정제 후에, 최소 유효량 이상의 PG를 포함하는 CPS는 담체 단백질에 컨쥬게이션된다. 한 가지 실시태양에서, 담체 단백질은 당업계에 공지된 방법들에 의해 유도체화되어 컨쥬게이션을 촉진한다. CPS 항원 또한, 당업계에서 공지된 방법들에 의해 유도체화되어 컨쥬게이션을 촉진할 수 있다. 예를 들어, CPS 항원 상의 활성화된 카르복실레이트 기는 ADH, 시스타민 또는 PDPH로 유도체화될 수 있으며, 그 후 CPS 항원은 담체 단백질 상의 카르복실레이트 기에 대한 부분적으로 아미드화된 항원의 카르보디이미드-매개된 반응 또는 SPDP-유도체화된 담체 단백질을 이용한 티올화된 CPS 항원의 디술피드 상호교환에 의해 담체 단백질에 컨쥬게이션될 수 있다. 항원 상의 히드록실 기는 시아노겐 브로마이드 또는 1-시아노-4-디메틸아미노-피리디늄 테트라플루오로보레이트를 사용하여 활성화될 수 있으며, 그 후 항원은 문헌 [Kohn et al, FEBS Lett. 154: 209:210 (1993)]의 방법에 따라 당업계에 공지된 기법들에 따라, 6 탄소 이관능성 스페이서인 아디프산 디히드라지드(ADH)로 유도체화될 수 있다.

한 가지 실시태양에서, CPS의 유도체화는 티올화를 포함하는 과정에 의해 이루어진다. 그러한 과정은 디아미노디술피드(시스타민)을 이용한 CPS의 아미드화를 통해 수행될 수 있다. 이 반응은 디술피드 결합을 도입시키기 때문에, "티올화"라고 불린다. 담체 단백질의 아미드화는 활성화된 카르복실-말단 링커인 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)와 함께 병행되어 수행될 수 있다. 디티오트레이톨(DTT)를 이용한 티올화된 CPS의 환원을 통해 생성된 유리 티올들이 SPDP-유도체화된 담체 단백질에 첨가되어 피리딘 티온을 대체하고, 링커를 통해 CPS와 담체 단백질 사이에 디술피드 결합을 형성하면, 컨쥬게이션이 이루어진다. 전형적으로, 얻어지는 글리코컨쥬게이트는 여과에 의해 회수된다.

담체 단백질의 SPDP 유도체화와 CPS의 티올화의 비는 담체 단백질 및 CPS 상의 항원 결정원을 보존시키고, 보다 안정하고/하거나 보다 면역원성인 컨쥬게이트를 제조할 수 있도록 최적화될 수 있다. 유리 티올의 양은 또한, 선택된 치환 밀도가 티올화된 CPS의 가교를 최소화하고, CPS-단백질 컨쥬게이션이 우세해질 수 있도록 제어되고 최적화될 수 있다.

예를 들어, 초기 유도체화 반응은 1:1의 비를 갖는 각 반응물로 수행될 수 있다. 얻어지는 생성물의 항원성은 생성물로 동물을 면역화시키고, 통상적인 방법에 의해 면역원성 반응을 결정함으로써 평가될 수 있다. 바람직하다면, 얻어지는 생성물의 특성을 최적화시키기 위해서 상이한 비의 반응물질들을 사용하여 추가적인 유도체화 반응들을 수행할 수 있다.

상기에서 논의된 바와 같이, 유도체화된 CPS 항원은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDAC)에 의해 임의의 적합한 담체 단백질, 예를 들어 디프테리아 톡소이드(DTd), 슈도모나스 애루기노사로부터의 재조합 엑소프로테인 A(rEPA), 파상풍 톡소이드(TTd), 알파 헤몰리신, 판톤-발렌틴 류코시딘(PVL) 또는 다른 적합한 담체 단백질에 연결될 수 있다. 얻어지는 컨쥬게이트는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 컨쥬게이션되지 않은 CPS 항원으로부터 분리될 수 있다.

담체 단백질에 CPS 항원을 컨쥬게이션시키는데 사용된 방법에 무관하게, 담체 단백질에 대한 CPS 항원의 공유 결합은 CPS 항원의 면역원성을 상당히 향상시킨다. 예를 들어, 마우스에서의 1차 백신 부스팅 및 2차 백신 부스팅 모두 후에 항원에 대해 유도된 항체의 수준이 증가되는 것으로 이 사실이 관찰되었다. 그러므로, 본 발명에 따라 최소 유효량 이상의 PG를 갖는 CPS의 사용은 담체 단백질에 대한 CPS의 컨쥬게이션 효율을 향상시키고, 백신의 면역원성을 향상시킨다.

엘만 분석법이 티올화 효율에 의해 측정되는 바와 같은 컨쥬게이션 효율을 평가하는데, 즉 남아있는 유리 술프히드릴 기를 측정함으로써 환원되고 유도체화된 CPS의 티올화 비를 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 유리 술프히드릴 기는 실온에서 5분 동안 환원되고 유도체화된 CPS 샘플 또는 대조군을 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB)과 반응시킴으로써 정량화될 수 있다. 이러한 반응은 혼합된 디술피드 및 2-니트로-5-티오벤조산(TNB)를 만든다. TNB의 농도는 몰 흡광 계수가 13,600인 412 nm에서의 흡광도에 의해 정량화될 수 있다. 결과는 다당류(PS) 삼탄당 반복 단위 당 유리 술프히드릴 기의 몰 비로 보고될 수 있다.

도 1에서 보여지는 바와 같이, 약 5%의 PG를 포함하는 CPS는 약 2%의 PG를 포함하는 CPS보다 약 1.20배 이상의 티올화 효율을 갖는다. 따라서, 약 5%의 PG를 포함하는 CPS는 2%의 PG를 포함하는 CPS보다 25% 증가된 컨쥬게이션 효율을 보인다.

본 발명에 따른 백신은 전형적으로는, 글리코컨쥬게이트 면역원에 대해 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 제약학적으로 허용되는 담체는 불활성이거나, 그렇지 않으면 의약적으로 허용될 뿐 아니라, 백신 투여의 관점에서 활성 성분과 상용성이기 때문에 글리코컨쥬게이트에 대한 비히클로서 사용될 수 있는 물질이다. 적합한 부형제 뿐 아니라, 제약학적으로 허용되는 담체에는 통상적인 백신 첨가제, 예를 들어 희석제, 보조제 및 기타 면역자극제, 항산화제, 방부제 및 가용화제가 함유될 수 있다. 예를 들어, 폴리소르베이트 80이 응집을 최소화하고, 안정화제로서 작용하기 위해 첨가될 수 있으며, 완충액이 pH 조절을 위해 첨가될 수 있다. 본원에서 설명되는 백신 제제는 조성물을 변형시키지 않으면서, 상대적으로 용이하게 보조제의 첨가를 허용한다.

뿐만 아니라, 본 발명의 백신은 "저장층(depot)" 성분을 포함하여 투여 부위에서 항원성 물질의 체류를 증가시키도록 제형화될 수 있다. 예를 들어, 보조제(사용된다면) 뿐 아니라, 덱스트란 술페이트 또는 광유가 이러한 저장층 효과를 제공하기 위해 첨가될 수 있다.

백신 제제의 면역원성은 시험관 내 옵소닌식세포작용 분석법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 타입 5- 및 타입 8-rEPA 컨쥬게이트에 의해 생성된 타입 5 및 타입 8 특이적 항체의 면역원성은 백혈구(HL-60 전골수세포성 백혈구 세포주), 보체, 모노클로날 또는 폴리클로날 CPS-특이적 항체 및 타입 5 또는 타입 8 박테리아를 사용하여, 하기와 같이 평가될 수 있다. 0분 및 60분대에, 박테리아의 옵소닌식세포작용 또는 파괴를 측정하였다. 타입 5 및 타입 8 항원에 결합하는 유도된 항체의 존재를 탐지하는 ELISA(효소결합 면역흡착 분석법)와 타입 5 및 타입 8 모두에 대한 옵소닌 항체 활성 사이의 높은 상관관계는 본 백신에 의해 유도된 항체들이 기능성이며, 이들이 유형-특이적 옵소닌식세포작용을 매개한다는 것을 표시하는 것이다.

부가적으로 또는 별법으로, 면역원성은 하기 실시예에서 설명되는 것과 같은 동물 분석법에 의해 평가될 수 있다. 그러한 분석법에서, 본 백신으로 면역화된 동물에서 유도된 항체의 수준은 백신화되지 않은 동물에서의 항체의 수준과 비교된다.

글리코컨쥬게이트 면역원을 포함하는 본 발명에 따른 백신의 예시적인 제제는 담체 단백질, 예를 들어 슈도모나스로부터의 외독소 A, 파상풍 톡소이드 또는 디프테리아에 컨쥬게이션된 하나 이상의 스타필로코쿠스 CPS 항원(예를 들어, 에스. 아우레우스 타입 5, 에스. 아우레우스 타입 8, 에스. 아우레우스 336, 및 에스. 에피더미디스 PS-1)을 포함한다. CPS 항원은 전형적으로는, 상기 설명된 바와 같이 측정된 약 5% 이상의 PG를 포함하지만, 허용되지 않는 독성을 가지지 않으면서, 티올화 효율 및/또는 면역원성을 향상시키는데 유효한 임의의 양의 PG를 포함할 수 있다. 예를 들어, PG의 양이 임상학자에게 허용되지 않는 독성 한계에 도달하지 않는 한, 10%, 15%, 또는 20% 초과의 PG 백분율이 사용될 수 있다.

박테리아 감염을 치료하고 예방하는 방법

또한, 본 발명의 백신을 사용하여 박테리아 감염을 치료하고/하거나 예방하는 방법이 본 발명에 의해 제공된다. 그러한 방법은 상기 설명된 바와 같이, (i) 하나 이상의 협막 다당류 및 담체 단백질을 포함하며, (ii) 여기서 협막 다당류는 최소 유효량 이상의 PG를 포함하는, 치료적 유효량의 글리코컨쥬게이트 면역원을 포함하는 백신의 투여를 필요로 하는 환자에게 상기 백신을 투여하는 것을 포함한다. 전형적으로는, 본 백신은 상기 설명된 바와 같이, 면역원에 대해 제약학적으로 허용되는 담체를 또한 포함한다.

이러한 방법에 대한 목표가 되는 환자 집단에는 박테리아 병원체, 예를 들어 에스. 아우레우스 또는 에스. 에피더미디스에 의해 감염되거나, 그러한 위험이 있는 포유동물, 예를 들어 인간이 포함된다. 본 백신은 임의의 바람직한 투여 형태, 예를 들어 인간에게 정맥내, 근육내 또는 피하 투여될 수 있는 투여 형태로 제공될 수 있다. 본 백신은 단일 투여량으로, 또는 다중 투여 프로토콜에 따라 투여될 수 있다.

투여는 임의 개수의 경로, 예를 들어 피하, 피하내 및 정맥내 경로에 의해 이루어질 수 있다. 한 가지 실시태양에서는, 근육내 투여가 사용된다. 당업자는 투여 경로가 치료될 박테리아 감염 및 백신의 조성에 따라 달라질 것이라는 것을 인식할 것이다.

본 발명에 따른 백신은 보조제가 있거나 없이 투여될 수 있다. 보조제가 사용된다면, 보조제에 의해 유도되는 독성을 피하도록 선택될 것이다. 본 발명에 따른 백신은 β-글루칸 또는 과립구 콜로니 자극 인자, 특히 1999년 9월 14일에 출원되고, 2002년 3월 12일에 특허결정된 미국 특허 No. 6,355,625에 설명된 바와 같은 β-글루칸을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 백신의 치료적 유효량은 당업계에서 통상적인 방법에 의해 결정될 수 있다. 당업자는 그 양이 백신의 조성, 특정 환자의 특성, 선택된 투여 경로 및 치료할 박테리아 감염의 성질에 따라 달라질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일반적인 지침은 예를 들어, 국제 조화 회의(International Conference on Harmonisation)의 간행물 및 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, chapters 27 and 28, at pages. 484-528 (Mack Publishing Company 1990)]에서 발견될 수 있다. 전형적인 백신 투여량은 1 ㎍ 내지 400㎍ 범위일 수 있다.

본 발명은 예시용으로만 제공되는 하기 실시예를 참고하여 더욱 설명된다. 본 발명은 실시예들에 의해 제한되지 않으며, 오히려 본원에 제공된 교시들로부터 명백한 모든 변형들을 포함한다.

실시예 1. 타입 5 협막 다당류의 단리

1차 효소 분해 및 원심분리

타입 5 CPS는 하기와 같이 박테리아로부터 분리하였다:

타입 5 CPS를 트리스 완충액 중에 타입 5 세포 페이스트를 재현탁시킴으로써 에스. 아우레우스로부터 정제하였다. 리오스타핀을 16 유닛/gm(페이스트)의 최종 농도로 첨가하였다. 리오스타핀 분해 후 3시간째에, RNAse 및 DNAse를 40 ㎍/ml의 혼합물 최종 농도로 첨가하여 핵산을 분해하고, 혼합물을 점도를 감소시켰다. 이 혼합물을 연속적으로 교반하면서, 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 효소 혼합물을 1시간 동안 23,000 G에서 원심분리하고, 상등액을 수집하였다.

1차 에탄올 침전, 원심분리 및 여과

분해된 핵산 및 다른 세포성 성분들을 제거하기 위하여, 탈수 알코올 및 CaCl₂를 상등액에 첨가하였다. 용액을 4℃에서 6-18시간 동안 보관하였다. 25% 에탄올-침전물을 원심분리하고, 펠렛을 버렸다. 이후, 다시 침전시켜 조질 CPS를 수집하였다. 탈수 에탄올 및 CaCl₂를 첨가하고, 용액을 4℃에서 6-18시간 동안 보관하였다. 75% 에탄올 침전물을 원심분리하고, 상등액을 버렸다. 펠렛을 물에서 재용해시키고, 여과하였다.

투석 및 여과

에탄올 정제된 CPS를 투석관에서 투석하여 미량의 에탄올을 제거하였다. CPS를 투석하고, 모세관 침전 시험을 이용한 혈청형 확인 시험에 의해 투석물 및 보유액을 CPS의 존재에 대해 시험하였다.

모세관 침전 시험에서, 박테리아 샘플을 수크로스 용액으로 용균시키고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션시키고, 용균 세포 부분을 물로 희석하고, 15분 동안 더 인큐베이션시켰다. 샘플을 원심분리하고, 상등액의 분주액을 모세관 튜브 내로 수집하고, 동등 부피의 특이적 항혈청을 두 번째 튜브에 수집하였다. 항혈청 튜브의 내용물을 샘플 튜브로 옮기고, 형광빛 아래서 검사하였다. 항혈청/샘플 계면에서의 침전물의 존재를 양성 결과로 기록하고, 침전물의 부재를 음성 결과로 기록하였다. 시험한 보유액을 여과하고, 동결건조시켰다.

2차 효소 분해 및 투석

조질 타입 5 CPS를 더욱 정제하기 위해, 동결건조된 물질을 2 mM MgSO₄를 갖는 pH 7.2의 0.05 M 트리스 중에 용해시켰다. 리오스타핀을 16 유닛/gm(페이스트)의 최종 농도로 첨가하였다. 투석관(MW 10,000)에 있는 동안 RNAse 및 DNAse를 100 ㎍/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 이 혼합물을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 투석한 혼합물을 모세관 침전 시험을 이용한 혈청형 확인 시험에 의해 PS의 존재에 대해 시험하였다.

2차 에탄올 침전, 투석 및 여과

탈수 알코올 및 CaCl₂를 투석관으로부터의 보유액에 첨가하고, 현탁액을 6- 18시간 동안 4℃에서 보관하고, 1시간 동안 원심분리하였다. 상등액을 수집하고, 탈수 알코올 및 CaCl₂와 합쳤다. 이 현탁액을 23,000 G에서 1시간 동안 원심분리하였다. 펠렛을 밤새 투석하여 미량의 에탄올을 제거하였다. 투석물 및 보유액을 모세관 침전 시험을 이용한 혈청형 확인 시험에 의해 CPS의 존재에 대해 시험하였다. 보유액을 0.45 ㎛ 필터로 여과하고, 40℃에서 6-18시간 동안 보관하였다. 샘플을 동결건조시키고, 다음 단계까지 보관하였다.

이온 교환 크로마토그래피

샘플을 분리를 위해 이온 교환 크로마토그래피에 적용시켰다. 샘플을 DEAE 컬럼에 적용하고, 컬럼을 60 ml/시의 유속으로 5회 세척하였다. 유출물 분획을 분광광도 모니터링하였다(OD₂₀₆).

크기 배제/겔 여과 크로마토그래피

동결건조시킨 CPS를 크기 배제/겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 분자 체에 의해 더욱 정제하였다. 동결건조시킨 물질을 컬럼 상으로 적재된 0.2 M NaCl 중에 용해시키고, 동일한 완충액으로 용리시켰다. 분획들을 수집하고, OD₂₀₆에서 모니터링하였다. 피크 분획들을 수집하고, 상기 설명된 바와 같이 혈청형 확인 시험을 수행하고, 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하고, 동결건조시켰다.

S4000 HPLC 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 방법은 바이오셉-SEC-S4000(Biosep-SEC-S4000) 컬럼을 사용하여 에스. 아우레우스 협막 다당류(CPS)의 분자 크기를 결정하기 위한 정성적 절차이다. 각각의 다당류 샘플 및 마커를 206 nm에서 모니터링하고, 면적 보고서를 생성하였다. 다당류 샘플의 분자 크기는 분포 계수(K_d)로 표시되며, 이는 컬럼 마커 부피 및 샘플 용리액 부피, 컬럼 공극 부피(2000 kD 덱스트란) 및 총 컬럼 부피(글리실-L-티로신)으로부터 계산하였다.

실시예 2. CPS PG 함량 및 단백질 및 핵산 오염 평가

본 실시예는 아미노산 분석(AAA)에 의한 펩티도글리칸 아미노산 및 잔류 단백질 아미노산의 정량화 및 핵산 오염의 정량화를 설명한다.

절차

아미노산 분석(AAA)를 사용하여 에스. 아우레우스 다당류 샘플에 존재하는 펩티도글리칸 및 잔류 단백질의 농도를 측정하였다. 다당류 용액의 AAA는 증기상 염산으로 샘플(물 중 1 mg/ml의 정제된 다당류로서 제조됨)을 가수분해시킴으로써 수행하였다. 재구축된 제1 아미노산 및 제2 아미노산을 395 nm에서 강하게 형광을 발하는 안정한 형광 유도체로 변환시켰다. 재현탁된 단백질 가수분해물의 분석은 역상 HPLC로 수행하였다. 아미노산은 외부 표준 및 내부 표준을 사용하여 정량화하였다. 다당류 용액 중에 존재하는 아미노산들은 (1) 펩티도글리칸(잔기 Ala, Glx, Gly 및 Lys) 및 (2) 잔류 단백질(잔기 Arg, Asx, Ile, Leu, Met, Phe, Ser, Thr, Thy, Val, His 및 Pro)로부터 유래하였다. 2개의 아미노산(Cys 및 Trp)들은 정량화하지 않았으며, 따라서 보고하지 않았다. 펩티도글리칸 및 잔류 단백질에 결합된 아미노산들의 농도를 하기 식을 이용하여 다당류에 대한 질량 백분율로 보고하였다:

% 펩티도글리칸 (w/w) 계산

%펩티도글리칸 = [PG] / [CPS] x 100

[PG] mg/ml = Glu/Gln + Gly + Ala + Lys

상기 식들 중,

[단백질] = AAA에 의한 샘플의 단백질 농도(mg/ml)

[PG] = 샘플의 계산된 펩티도글리칸 함량(mg/ml)

[CPS] = 샘플의 알려진 다당류 함량(1 mg/ml)

예를 들어, 하기를 포함하는 백신 제제는

[PG] mg/ml = Glu/Gln + GIy + Ala + Lys

[PG] mg/ml = 0.0119 + 0.0208 + 0.0132 + 0.0122 = 0.0581 mg/ml

[CPS] = 0.96 mg/ml

6.05%의 PG를 함유한다(% PG = [PG] /[CPS] x 100 = 0.0581 / 0.96 x 100 = 6.05%).

% 잔류 단백질(w/w) 계산:

%RP = (펩티드)_cps - (PG) / (cPS) x 100

∑(아미노산) = (펩티드)_cps

상기 식들 중,

(펩티드)_cps = 총 펩티드 농도

[RP] = 샘플의 계산된 잔류 단백질 농도(mg/ml)

[PS] = 샘플의 알려진 다당류 농도 (1 mg/ml)

예를 들어, 하기를 포함하는 백신 제제는

(펩티드)_cps = 0.0647 mg/ml

[PG] = 0.0581 mg/ml

[cPS] = 0.96 mg/ml

0.68%의 RP를 함유한다(% [RP] = 0.0647 - 0.0581 / 0.96 = 0.68%)

UV 분광광도법에 의한 잔류 핵산 정량

정제한 CPS의 잔류 핵산 농도는 분광광도 분석법에 의해 결정될 수 있다. 260 nm에서의 샘플의 흡광도를 50 ㎍/ml에서 1.0 AU의 흡광도를 갖는 청어 정자 DNA 용액의 흡광도와 비교하였다. 샘플 중 DNA의 농도는 전체 타입 5 다당류 농도의 분율(%)로서 보고하였다.

실시예 3. 타입 5 및 타입 8 CPS 백신 효율

상기 실시예 1에 설명된 바와 같이 제조된 타입 5 및 타입 8 CPS는 하기의 특성들을 갖는 것으로 측정되었다:

시험	타입 5 CPS		타입 8 CPS
시험	배치 1	배치 2	배치 1	배치 2
분자 체(Kd)	0.25	0.26	0.43	0.43
아미노산 분석에 의한 잔류 단백질 (%)	0.028	0.21	0.68	0.45
잔류 핵산 (%)	<1	<1	<1	<1
펩티도글리칸 함량 (%)	13.57	14.17	6.05	5.76
ELISA에 의한 CPS 정량 (㎍/ml)	94	103	80	102
ELISA에 의한 마우스에서의 역가 (㎍/ml)	66.5	93.6	82.9	77.8
반응자(responder)에 의한 마우스에서의 역가 (10 마우스/배치)	10/10*	10/10	10/10	10/10

* 70%의 마우스들은 대조군에 비해 항체 타이터(titer)에 있어서 4배 이상 증가하였음을 보였다.

표에 나타난 바와 같이, 타입 5 및 타입 8 CPS를 정제하고, 5% 이상의 PG를 포함하는 것을 측정하고, 마우스에서 면역원성임을 측정하였다. 낮은 수준의 잔류 단백질은 거의 모든 탐지된 아미노산들이 잔류 단백질이 아닌 펩티도글리칸에 의한 것임을 보여주기 때문에, 이는 계산된 펩티도글리칸 함량에 대한 신뢰성을 더해주는 것이다. 마우스에서의 타입 5 및 타입 8 CPS의 역가 평가는 하기에서 보다 상세하게 설명한다.

에스. 아우레우스 타입 5 및 타입 8 CPS 백신의 역가는 마우스 면역원성에 의해 측정될 수 있다. 개개의 마우스 혈청에서 항체 반응을 측정하고, 항체 반응에 있어서 상당한(예를 들어, 4배) 증가를 보이는 마우스의 비율을 확인함으로써 본 백신의 역가를 측정하였다. 예를 들어, 하기 절차가 사용될 수 있다:

6주 내지 8주 된 암컷 마우스를 10마리씩 2 그룹으로 나누어 투여하였다. 각 그룹을 2주 간격으로 2회 백신화하였다. 제1 그룹은 PBS/0.01% 폴리소르베이트 80으로 100 ㎕로 희석된 투여량 당 0.25 ㎍의 백신을 받았다. 제2 그룹의 마우스들은 음성 대조군이고, 100 ㎕의 PBS/0.01% 폴리소르베이트 80을 받았다. 백신화 전 혈액 샘플을 첫 번째 주사의 적어도 48시간 전에 각각의 그룹에서 선택된 마우스들로부터 수집하였다. 백신화 후 혈액 샘플을 마지막 면역화로부터 1주 후에 모든 마우스들로부터 수집하였다. 원심분리에 의해 전체 혈액 샘플로부터 혈청 샘플들을 분리하였다.

에스. 아우레우스 타입 5/타입 8 다당류에 대한 항체를 정량 ELISA에 의해 모든 혈청 샘플들에서 정량화하였다. 샘플들을 타입 5 또는 타입 8 CPS로 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 적용하고, 인큐베이션시키고, 세척액(0.1 M 포스페이트, 0.15 M 염화나트륨, 0.1% v/v 폴리소르베이트 20)으로 세척하여 임의의 비결합 뮤린 항체들을 제거하였다. CPS에 결합되어 남아있는 항체의 양을 호스래디시 퍼옥시다제(HRP)에 컨쥬게이션된 염소 항-뮤린 면역글로불린(IgG) 항체와의 후속 반응에 의해 결정하였다. 결합된 HRP의 양을 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)과의 종말점 비색 반응에 의해 측정하였다. 퍼옥시다제 활성을 종결 용액(1.0 M 인산)으로 켄칭시키고, 450 nm에서의 흡광도로 정량화하였다.

본 분석법으로부터 얻을 수 있는 역가의 한 가지 척도는 대조군의 마우스의 기하 평균 항체 수준에 비해 타입 5 및 타입 8 모두의 혈청 항체 수준이 4배 증가하였다는 것을 보여주는 0.25 ㎍ 투여량 그룹의 마우스의 비율(%)이다. 에스. 아우레우스 백신 그룹의 각 마우스에 있어서, 대조군을 기준으로 한 타이터의 증가 배수는 대조군의 마우스의 기하 평균 항체 수준에 대한 그의 혈청 항체 수준의 비이다.

본 분석법으로부터 얻을 수 있는 역가의 다른 척도는 0.025 ㎍ 투여량 그룹에서 관찰되는 타입 5 및 타입 8 항체 수준(㎍/ml)의 기하 평균이다.

실시예 4. 독성학적 연구

단일 투여 급성 독성 연구를 타입 5 및 타입 8 협막 다당류를 포함하는 본 발명에 따른 백신에 대해 수행하였으며, 여기서 각각의 CPS는 다음과 같이, 5% 이상의 PG를 포함하고, rEPA에 컨쥬게이션되었다:

백신 및 백신 성분에 대해 수행된 독성학적 연구

연구 유형 및 기간	연구 번호	투여 경로	종
단일 투여 독성	1	근육내	래트
단일 투여 독성	2	복강내	마우스

연구 1: 단일 투여 급성 독성 연구 ( IM )

10마리의 래트로 된 3개의 그룹에 완충액 중 낮은 제제용량(2.92 ㎍/kg) 또는 높은 제제 용량(29 ㎍/kg)으로 단일 투여량의 백신을 투여하였다. 각 그룹 중 절반의 동물들을 24시간 후에 희생시키고, 남은 동물들을 시험물 및 대조물을 투여한지 7일 후에 희생시켰다. 시험 동물들을 치사율, 임상 징후, 체중, 임상 병리(혈액학 및 임상 화학), 육안 병리 및 조직병리에 대해 평가하였다. 처치와 관련있는 효과들은 임상 징후, 체중, 임상 병리(혈액학 및 임상 화학), 육안 병리 또는 조직병리에 대해 전혀 관찰되지 않았다. 본 연구는 본 백신이 최대 시험 투여량인 29 ㎍/kg(중량:중량 기준으로 100 ㎍의 인간 투여량의 20배)에서 독성 증상을 유도하지 않았다는 것을 보여준다.

연구 2: 단일 투여 급성 독성 연구 ( IP )

10마리의 ICR 마우스로 된 11개의 그룹에 단일 투여량의 백신(25 ㎍의 타입 5 및 타입 8 CPS), 단가 타입 5- 및 타입 8-rEPA 컨쥬게이트(25 ㎍), rEPA(50 ㎍), 슈도모나스 애루기노사 외독소 A(0.1 - 0.5 ㎍) 또는 소혈청 알부민을 투여하였다. 시험 동물들을 시험 물품 투여 후 48시간 동안 관찰하였다. 혈청 샘플들을 트랜스아미나제 간 효소, SGOT 및 SGPT로 측정하였다. 외독소 A만이 치사를 야기하였고, SGOT 및 SGPT 수준을 상승시켰다. 에스. 아우레우스 CPS-rEPA 백신 또는 rEPA를 투여한 그룹에서는 비정상적인 임상 관찰, 예정 외의 죽음 또는 독성 효과들이 전혀 관찰되지 않았다(각 물질에 대해, 중량:중량 기준으로 100 ㎍의 인간 투여량의 약 900배이었음).

실시예 5. 백신 제형화

에스. 아우레우스 타입 5 및 타입 8 CPS를 포함하는 본 발명에 따른 글리코컨쥬게이트 백신을 제조하였다. 전형적으로는, 본 백신 제제는 하기를 함유한다:

에스. 아우레우스 타입 5 컨쥬게이트 100 ㎍

에스. 아우레우스 타입 8 컨쥬게이트 100 ㎍

폴리소르베이트 80 0.1 mg

염화나트륨 11.7 mg

인산나트륨, 이염기성 2.23 mg

인산나트륨, 일염기성 0.23 mg

주사용수 1.0 ml

정제한 CPS의 시험은 하기를 보여준다:

분자 크기 0.16 - 0.34 Kd

잔류 단백질 < 1%

OD에 의한 핵산 함량 < 1%

O-acetyl 함량 > 55%

펩티도글리칸 함량 약 5% 이상

티올:CPS 몰 비 0.05 - .11

Claims

(A) 하나 이상의 협막 다당류 및 담체 단백질을 포함하며, 상기 협막 다당류는 협막 다당류의 중량을 기준으로 약 5% (w/w) 이상의 펩티도글리칸을 포함하는 치료적 유효량의 글리코컨쥬게이트 면역원, 및

(B) 면역원에 대해 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신.
제1항에 있어서, 글리코컨쥬게이트 면역원이 스타필로코쿠스(Staphylococcus)에 의해 발현되는 협막 다당류를 포함하는 백신.
제2항에 있어서, 글리코컨쥬게이트 면역원은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 의해 발현되는 협막 다당류 및 스타필로코쿠스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis)에 의해 발현되는 협막 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 협막 다당류를 포함하고, 하나 이상의 협막 다당류는 약 5% (w/w) 이상의 펩티도글리칸을 포함하는 백신.
제2항에 있어서, 협막 다당류는 타입 5 협막 다당류, 타입 8 협막 다당류, 336 협막 다당류, PS-1 협막 다당류, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 하나 이상의 협막 다당류는 약 5% (w/w) 이상의 펩티도글리칸을 포함하는 백신.
제1항에 있어서, 담체 단백질이 슈도모나스(Pseudomonas)로부터의 외독소 A, 파상풍 톡소이드, 디프테리아, 알파 헤몰리신, 및 판톤-발렌틴(Panton-Valentine) 류코시딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 백신.
제4항에 있어서, 협막 다당류가 타입 5 협막 다당류 및 타입 8 협막 다당류를 포함하는 백신.
제4항에 있어서, (i) 슈도모나스로부터의 외독소 A 담체 단백질에 컨쥬게이션된 타입 5 협막 다당류 및 (ii) 슈도모나스로부터의 외독소 A 담체 단백질에 컨쥬게이션된 타입 8 협막 다당류를 포함하는 백신.
제4항에 있어서, 336 협막 다당류를 포함하는 백신.
제4항에 있어서, PS-1 협막 다당류를 포함하는 백신.
제4항에 있어서, 협막 다당류가 336 협막 다당류 및 PS-1 협막 다당류를 포함하는 백신.
제1항의 백신을 투여하는 것을 포함하는 박테리아 감염 치료 방법.
(A) 협막 다당류의 중량을 기준으로 약 5% (w/w) 이상의 펩티도글리칸을 포함하는 하나 이상의 협막 다당류를 담체 단백질에 컨쥬게이션시켜 글리코컨쥬게이트 면역원을 형성하고,

(B) 치료적 유효량의 글리코컨쥬게이트 면역원을 상기 면역원에 대해 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화하는 것을 포함하는, 하나 이상의 협막 다당류 및 담체 단백질을 포함하는 글리코컨쥬게이트 면역원을 포함하는 백신을 제조하는 방법.
(i) 협막 다당류와 담체 단백질의 향상된 컨쥬게이션 효율에 기여하는데 유효한 양의 펩티도글리칸을 포함하는 협막 다당류를 선택하고, (ii) 협막 다당류를 담체 단백질에 컨쥬게이션시키는 것을 포함하는, 담체 단백질에 대한 협막 다당류의 컨쥬게이션 효율을 향상시키는 방법.
제13항에 있어서, 협막 다당류가 담체 단백질에 대한 협막 다당류의 컨쥬게이션 효율을 약 2% 펩티도글리칸을 포함하는 협막 다당류에 대하여 약 20% 이상 증가시키는데 유효한 양의 펩티도글리칸을 포함하는 것인 방법.
제13항에 있어서, 협막 다당류가 협막 다당류의 중량을 기준으로 약 5% (w/w) 이상의 펩티도글리칸을 포함하는 것인 방법.
(i) 백신의 향상된 면역원성에 기여하는 양의 펩티도글리칸을 포함하는 협막 다당류를 선택하고, (ii) 협막 다당류를 담체 단백질과 컨쥬게이션시켜 글리코컨쥬게이트 면역원을 형성하고, (iii) 글리코컨쥬게이트 면역원 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신을 제조하는 것을 포함하는, 백신의 면역원성을 향상시키는 방법.
제16항에 있어서, 협막 다당류가 협막 다당류의 중량을 기준으로 약 5% (w/w) 이상의 펩티도글리칸을 포함하는 것인 방법.
(A) 하나 이상의 협막 다당류 및 담체 단백질을 포함하며, 상기 협막 다당류는 담체 단백질에 대한 협막 다당류의 컨쥬게이션 효율을 약 2%의 펩티도글리칸을 포함하는 협막 다당류에 대하여 약 20% 이상 증가시키는데 유효한 양의 펩티도글리칸을 포함하는 치료적 유효량의 글리코컨쥬게이트 면역원, 및

(B) 상기 면역원에 대해 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신.