KR20070085408A - 안지오포이에틴-2 특이 결합제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 안지오포이에틴-2 에 결합하는 완전 인간 항체와 같은 특이 결합제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항체의 중쇄 단편, 경쇄 단편 및 CDRs 뿐만 아니라 이러한 항체를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.

안지오포이에틴-2(Ang-2) 특이 결합제, 맥관형성 관련 질환

Description

안지오포이에틴-2 특이 결합제{ANGIOPOIETIN-2 SPECIFIC BINDING AGENTS}

본 출원은 2001 년 10 월 11 일자로 제출된 미국 가출원 일련 번호 제 60/328,604 호의 권리를 주장하고 있는, 2002 년 10 월 10 일자로 제출된 미국 출원 번호 제 10/269,805 호 및 2002 년 10 월 11 일자로 제출된 PCT 출원 번호 제 PCT/US02/32613 호의 일부 계속 출원이며, 상기 문헌 모두는 본원에 참고문헌으로 인용하였다. 본 출원은 또한 본원에 인용문헌으로 인용되어 있는, 2004 년 10 월 19 일자로 제출된 미국 가출원 일련 번호 제 60/620,161 호 및 2004 년 11 월 4 일자로 제출된 미국 출원 번호 제 10/982,440 호의 권리를 주장하고 있다.

본 발명은 안지오포이에틴-2 (이하 Ang-2 로 표기함)를 인식하고 이 Ang-2 와 결합하는 특이 결합제(specific binding agent)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 Ang-2 와 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체와 폴리클로날 항체 및 이의 단편의 생산, 진단학적 용도 및 치료학적 용도에 관한 것이다.

기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 맥관형성(angiogenesis)은 다수의 생리적 및 병리학적 과정에 필수적이다. 일반적으로 맥관형성은 암, 안구의 혈관신생질환, 관절염 및 건선과 같은 질환의 경우에서만 프로- 및 항-맥관형성 인자에 의해 철저히 조절되며, 그 과정은 실패할 수도 있다. Folkman, J., Nat. Med., 1 : 27-31 (1995) 참조하라.

다수의 질환들이 조절되지 않거나 바람직하지 않은 맥관형성과 관련되어 있음이 공지되었다. 이러한 질환으로 다음을 포함하지만 이것으로 한정되는 것은 아니다 : 망막증(당뇨병성망막증 포함)과 같은 안구의 혈관신생 ; 연령-관련 황반변성 ; 건선 ; 혈관아세포종 ; 혈관종 ; 동맥경화증 ; 류마토이드 또는 류마티스성 염증성질환과 같은 염증성질환(특히 류마토이드 관절염을 포함한 관절염) 또는 만성 천식과 같은 그밖의 다른 만성 염증성장애 ; 동맥경화증 또는 이식 후 죽상동맥경화증 ; 자궁내막증 ; 및 충실성(solid)종양과 액상(liquid, 또는 조혈)종양과 같은 종양성질환(예를 들어, 백혈병 및 림프종). 바람직하지 않은 맥관형성과 관련된 그밖의 다른 질환들도 본 분야의 숙련자에게 명백할 것이다.

다수의 신호전달계가 맥관형성 조절에 연관되어 있지만, 최적의 특성을 나타내며 가장 선택적인 내피세포 시스템 중 하나는 Tie-2 수용체 티로신 키나제("Tie-2" 또는 "Tie-2R" 이라고도 하며, 또한 "ORK" 라고도 함 ; 마우스 Tie-2 는 또한 "tek" 라고 명명함) 및 이의 리간드인 안지오포이에틴을 포함한다[Gale, N. W. 및 Yancopoulos, G. D., Genes Dev. 13 : 1055-1066 (1999) 참조]. 4 가지의 공지된 안지오포이에틴으로는 안지오포이에틴-1("Ang-1") 내지 안지오포이에틴-4("Ang-4")가 있다. 이러한 안지오포이에틴은 또한 "Tie-2 리간드" 라고도 명명한다[Davis, S., 등의 Cell, 87 : 1161-1169 (1996) ; Grosios, K., 등의 Cytogenet Cell Genet, 84 : 118-120 (1999) ; Holash, J., 등의 Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42 : 1617-1625 (1999) ; Koblizek, T. I., 등의 Current Biology, 8 : 529-532 (1998) ; Lin, P., 등의 Proc Natl Acad Sci USA, 95 : 8829-8834 (1998) ; Maisonpierre, P. C., 등의 Science, 277 : 55-60 (1997) ; Papapetropoulos, A., 등의 Lab Invest, 79 : 213-223 (1999) ; Sato, T. N., 등의 Nature, 375 : 70-74 (1998) ; Shyu, K. G., 등의 Circulation, 98 : 2081-2087 (1998) ; Suri, C., 등의 Cell, 87 : 1171-1180 (1996) ; Suri, C., 등의 Science, 282 : 468-471 (1998) ; Valenzuela, D. M., 등의 Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 96 : 1904-1909 (1999) ; Witzenbichler, B., 등의 J Biol Chem, 273 : 18514-18521 (1998) 참조하라]. Tie-2 와 Ang-1 의 결합이 배양된 내피세포에서 수용체 인산화를 자극하는 반면에, Ang-2 는 Tie-2 수용체 인산화를 촉진(agonize)도 시키고 약화(antagonize)도 시키는 것으로 관찰되었다[Davis, S., 등의 (1996), 상기 문헌 ; Maisonpierre, P.C., 등의 (1997), 상기 문헌 ; Kim, I., J.H. Kim, 등의 Oncogene 19(39) : 4549-4552(2000) ; Teichert-Kuliszewska, K., P.C. Maisonpierre, 등의 Cardiovascular Research 49(3) : 659-70(2001) 참조].

마우스 Tie-2 와 Ang-1 넉아웃(knockout)의 표현형은 유사하며 Ang-1-자극 Tie-2 인산화가 내피세포-지지 세포 부착(support cell adhesion)의 유지를 통해 자궁내에서 혈관 생성의 재형성 및 안정화를 중재한다고 제시하고 있다[Dumont, D. J., 등의 Genes & Development, 8 : 1897-1909 (1994) ; Sato, T. N., 등의 Nature, 376 : 70-74 (1995) ; Suri, C., 등의 (1996), 상기 문헌을 참조하라]. 혈관 안정화에서 Ang-1 의 역할은, Ang-1 이 성인에게서 광범위하고 구조적으로 발현되도록 유지시키는데 있는 것으로 여겨진다[Hanahan, D., Science, 277 : 48-50 (1997) ; Zagzag, D., 등의 Experimental Neurology, 159 : 391-400 (1999) 참조]. 대조적으로, Ang-2 발현은 Ang-1 기능을 차단한다고 여겨지는 혈관 재형성 부위로 1 차적으로 제한되며 이로인해 맥관형성을 촉구하는 혈관 가성형(vascular plasticity)의 상태를 유도한다[Hanahan, D.,(1997), 상기 문헌 ; Holash, J., 등의 Science, 284 : 1994-1998 (1999) ; Maisonpierre, P. C., 등의 (1997), 상기 문헌 참조].

수많은 공개된 연구는 맥관형성과 관련된 질환 상태에서 혈관-선택적 Ang-2 발현에 관해 입증하였다. 이러한 병리학적 증상은 예를 들어, 건선, 황반변성 및 암을 포함한다[Bunone, G., 등의 American Journal of Pathology, 155 : 1967-1976 (1999) ; Etoh, T., 등의 Cancer Research, 61 : 2145-2153 (2001) ; Hangai, M., 등의 Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42 : 1617-1625 (2001) ; Holash, J., 등의 (1999) 상기 문헌 ; Kuroda, K., 등의 Journal of Investigative Dermatology, 116 : 713-720 (2001) ; Otani, A., 등의 Investigative Ophthalmology & Visual Science, 40 : 1912-1920 (1999) ; Stratmann, A., 등의 American Journal of Pathology, 153 : 1459-1466 (1998) ; Tanaka, S., 등의 J Clin Invest, 103 : 34-345 (1999) ; Yoshida, Y., 등의 International Journal of Oncology, 15 : 1221-1225 (1999) ; Yuan, K., 등의 Journal of Periodontal Research, 35 : 165-171 (2000) ; Zagzag, D., 등의 (1999) 상기 문헌 참조]. 대부분의 이러한 연구들은 암에 초점을 두고 있으며, 이 중에서 다양한 형태의 종양은 혈관의 Ang-2 발현을 나타낸다. 병리학적 맥관형성에서의 Ang-2 발현과는 대조적으로, 정상 조직에서 Ang-2 발현은 극히 제한되어 있다[Maisonpierre, P. C., 등의 (1997), 상기 문헌 ; Mezquita, J., 등의 Biochemical 및 Biophysical Research Communications, 260 : 492-498 (1999) 참조]. 정상의 성인에게서, 맥관형성의 3 가지 주요 부위로는 난소, 태반 및 자궁이며 ; 이러한 부위는 정상(즉, 비-암성) 조직에서 1 차 조직이며, 여기에서 Ang-2 mRNA 가 검출 된다.

특정한 기능적 연구에서 Ang-2 가 종양의 맥관형성에 관여할 수 있음을 암시하고 있다. Ahmad 등의 [Cancer Res., 61 : 1255-1259 (2001)] 문헌에는 Ang-2 과-발현에 관해 서술하고 있으며 마우스의 이종이식편 모델에서 상기 Ang-2 과-발현이 종양 성장의 증가와 관련되어 있음을 나타낸다. Etoh 등의 상기 문헌과 Tanaka 등의 상기 문헌 또한 참조하며, 이들 문헌에서의 데이타는 Ang-2 과발현과 종양의 혈관과다성이 연관되어 있음을 나타내고 있다. 그러나, 이와는 대조적으로 Yu 등의 [Am. J. Path., 158 : 563-570(2001)] 문헌에는 루이스 폐 암종 및 TA3 유방 암종 세포에서의 Ang-2 과발현으로 해당 형질감염체(transfectant)를 주사한 마우스에게서 생존율이 연장되었음을 나타내는 데이타에 관해 기재되어 있다.

지난 수년 동안, 다양한 공개문헌에는 항암 치료에 가능한 표적으로서 Ang-1, Ang-2 및/또는 Tie-2 를 제시하고 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제 6,166,185 호, 제 5,650,490 호 및 제 5,814,464 호 각각은 항-Tie-2 리간드 항체 및 수용체 바디(receptor body)의 개념을 기술하고 있다. Lin 등의 [Proc. Natl. Acad. Sci USA, 95 : 8829-8834(1998)] 문헌에는 가용성 Tie-2 를 발현시키는 아데노바이러스를 마우스 에게 주사하고 ; 이 가용성의 Tie-2 는 마우스에게 나타난 종양의 수와 크기를 감소시키는 것으로 기재되어 있다. 관련된 연구에서, Lin 등의 [J. Clin. Invest., 100 : 2072-2078 (1997)] 문헌에서는 가용성 형태의 Tie-2 를 랫에게 주사하고 ; 이러한 화합물이 랫에서 종양의 크기를 감소시킨다고 기재되어 있다. Siemeister 등의 [Cancer Res., 59 : 3185-3189 (1999)] 문헌에는 Tie-2 의 세포외 도메인을 발현하는 인체의 흑색종 세포주를 형성하고, 이러한 세포주를 누드 마우스에게 주사하여 가용성 Tie-2 가 종양 성장과 종양 맥관형성의 "현저한 저해" 를 나타낸다고 결론지어져 있다. 이러한 사실의 관점에서, Ang-1 과 Ang-2 둘 다가 Tie-2 에 결합하는 것은 정해진 것이지만, Ang-1, Ang-2 또는 Tie-2 가 항-암 치료에 대한 확실한 표적인지는 이러한 연구로부터는 명백히 알 수 없다.

이러한 분자의 반감기를 향상시키기 위해 Ig 불변영역과 같은 안정한 플라즈마 단백질에 특정 펩티드의 융합은, 예를 들어, 2000 년 5 월 4 일자로 공개된 PCT 공개 번호 제 WO 00/24782 호에 기재되어 있다.

이러한 분자의 반감기를 향상시키기 위해 Ig 불변영역과 같은 안정한 플라즈마 단백질에 단백질 또는 이의 단편의 융합은 다음의 문헌에 다양하게 기재되어 있다 [예를 들어, 미국 특허 번호 제 5,480,981 호 ; Zheng 등의 J. Immunol., 154 : 5590-5600, (1995) ; Fisher 등의 N. Engl. J. Med., 334 : 1697-1702, (1996) ; Van Zee, K. 등의 J. Immunol., 156 : 2221-2230, (1996) ; 1998 년 9 월 15 일자로 공고된 미국 특허 번호 제 5,808,029 호 ; Capon 등의 Nature, 337 : 525-531 (1989) ; Harvill 등의 Immunotech., 1 : 95-105, (1995) ; 1997 년 7 월 3 일자로 공개된 제 WO 97/23614 호 ; 1997 년 12 월 11 일자로 제출된 제 PCT/US97/23183 호 ; Linsley, J. Exp. Med., 174 : 561-569, (1991) ; 1995 년 8 월 10 일자로 공개된 제 WO 95/21258 호를 참조하라].

효과적인 항-Ang-2 치료는 방대한 암환자 집단에 효과적이며, 이는 대부분의 충실성 종양이 지름의 크기가 1-2 밀리미터의 범위를 넘어서 성장하는 신생혈관(neovascularization)을 필요로하기 때문이다. 상기 치료는 예를 들어, 망막증, 관절염 및 건선 뿐만 아니라 그밖의 다른 맥관형성과 관련된 질환에서도 폭넓게 적용된다.

특이적으로 Ang-2 를 인식하고 이와 결합하는 신규한 제제를 입증할 필요가 있다. 상기 제제는 Ang-2 활성도와 관련된 질환 상태에서 진단학적 스크리닝과 치료학적 중재에 유용하다.

따라서, 본 발명의 목적은 Ang-2 활성도를 조절하는 Ang-2 의 특이 결합제를 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체를 제공하며, 상기 중쇄는 다음 중에서 선택한 중쇄의 가변영역을 포함한다 :

상기 경쇄는 다음 중에서 선택한 경쇄의 가변영역을 포함한다 :

본 발명은 또한 다음 중에서 선택한 적어도 하나의 펩티드 및 이의 단편을 포함하는 특이 결합제를 제공한다 :

특이 결합제는, 예를 들어 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체와 같은 항체일 수 있음을 인지할 것이다. 항체는 또한 단쇄의 항체일 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다.

본 발명이 본원에 기재되어 있는 접합체에 관한 것임을 또한 인지할 것이다. 접합체는 예를 들어, 본 발명의 항체와 같은 특이 결합제 일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 특이 결합제 (예를 들어, 항체)를 코드하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 뿐만 아니라 이 벡터를 함유하는 숙주세포에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 특이 결합제를 제조하는 방법을 제공한다 : (a) 청구범위 제 1 항의 특이 결합제를 코드하는 적어도 하나의 핵산 분자로 숙주세포를 형질전환시키는 단계 ; (b) 상기 숙주세포에서 핵산 분자를 발현시키는 단계 ; 및 (c) 상기 특이 결합제를 분리시키는 단계. 본 발명은 또한 다음 단계를 포함하여 항체를 제조하는 방법을 제공한다 : (a) 본 발명의 항체를 코드하는 적어도 하나의 핵산 분자로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계 ; (b) 상기 숙주세포에서 핵산 분자를 발현시키는 단계 ; 및 (c) 상기 특이 결합제를 분리시키는 단계.

또한, 본 발명은 본 발명의 특이 결합제의 치료학적 유효량을 투여함으로써 포유동물에서 바람직하지 않은 맥관형성을 저해하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 특이 결합제의 치료학적 유효량을 투여함으로써 포유동물의 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체의 치료학적 유효량을 투여함으로써 포유동물에서 바람직하지 않은 맥관형성을 저해하는 방법에 관한 것이다. 부가적으로 본 발명은 본 발명의 항체의 치료학적 유효량을 투여하여 포유동물의 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 특이 결합제 및 약학적으로 용인가능한 제형화제(formulation agent)를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 약학적 조성물은 본 발명의 항체와 약학적으로 용인가능한 제제를 포함할 것이다.

본 발명은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 특이 결합제를 투여함으로써 안지오포이에틴-2 활성을 조절하거나 저해하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체를 투여함으로써 안지오포이에틴-2 활성을 조절하거나 저해하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 특이 결합제의 치료학적 유효량을 투여하여 포유동물에서 혈관 투과성(vascular permeability) 및 혈장 누 출(plasma leakage) 중 적어도 하나를 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 특이 결합제의 치료학적 유효량을 투여하여 포유동물의 안구내 신생혈관질환, 비만증, 혈관아세포종, 혈관종, 동맥경화증, 염증성질환, 염증성장애, 죽상동맥경화증, 자궁내막증, 신생물질환, 골-관련 질환 및 건선 중 적어도 하나의 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체의 치료학적 유효량을 투여하여 포유동물에서 적어도 하나의 혈관 투과성 또는 플라즈마 누출을 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체의 치료학적 유효량을 투여하여 포유동물에서 다음과 같은 질환인 안구내 신생혈관질환, 비만증, 혈관아세포종, 혈관종, 동맥경화증, 염증성질환, 염증성장애, 죽상동맥경화증, 자궁내막증, 신생물질환, 골-관련 질환 및 건선 중 적어도 하나의 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

더욱이, 본 발명은 본 발명의 특이 결합제의 치료학적 유효량과 화학요법제를 투여하여 포유동물의 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 특이 결합제와 화학요법제를 동시에 투여할 필요가 없음은 본 분야의 숙련자에게 인지될 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체의 치료학적 유효량과 화학요법제를 투여하여 포유동물의 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 특이 결합제와 화학요법제는 동시에 투여할 필요가 없다.

본 발명은 또한 다음 중 하나의 상보성 결정영역 1(Complementarity determining region 1, CDR 1)을 포함하는 특이 결합제를 제공한다 :

본 발명은 또한 다음 중 하나의 상보성 결정영역 2(CDR 2)를 포함하는 특이 결합제에 관한 것이다 :

본 발명은 또한 다음 중 하나의 상보성 결정영역 3(CDR 3)을 포함하는 특이 결합제에 관한 것이다 :

본 발명은 본 발명의 특이 결합제를 코드하는 핵산 분자를 또한 제공한다.

더욱이, 본 발명은 (a) 본 발명의 특이 결합제와 생물학적 시료를 접촉시키는 단계 및 (b) 상기 시료에 상기 특이 결합제의 결합 정도를 측정하는 단계에 의해 상기 생물학적 시료내에서 안지오포이에틴-2 의 수준을 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 (a) 본 발명의 항체와 생물학적 시료를 접촉시키는 단계 및 (b) 상기 시료에 상기 항체의 결합 정도를 측정하는 단계에 의해 상기 생물학적 시료내에서 안지오포이에틴-2 의 수준을 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에 기재되어 있는 바와 같은 치료학적 유효량의 폴리펩티드 또는 조성물을 투여하여 포유동물의 바람직하지 않은 맥관형성을 저해하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본원에 기재되어 있는 바와 같은 치료학적 유효량의 폴리펩티드 또는 조성물을 투여하여 포유동물의 맥관형성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본원에 기재되어 있는 바와 같은 치료학적 유효량의 폴리펩티드 또는 조성물을 투여하여 포유동물의 바람직하지 않은 맥관형성을 특징으로 하는 종양 성장을 저해하는 방법에 관한 것이다. 부가적으로, 본 발명은 본원에 기재되어 있는 바와 같은 치료학적 유효량의 폴리펩티드나 조성물 및 화학요법제를 투여하여 포유동물의 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시형태에서, 화학요법제는 5-FU, CPT-11 및 탁소테르(Taxotere) 중 적어도 하나이다. 그러나, 다른 적합한 화학요법제 및 다른 암 치료제도 사용할 수 있다.

본 발명의 특이 결합제는 조절되지 않거나 바람직하지 않은 맥관형성에 관련된 수많은 질환을 치료하는 데 사용할 수 있다. 이러한 질환은 망막증(당뇨병성망막증 및 연령-관련 황반변성을 포함)과 같은 안구내 혈관신생, 건선, 혈관아세포종, 혈관종, 동맥경화증, 류마토이드나 류마티스성 염증성질환(특히, 류마티스성 관절염을 포함하는 관절염)과 같은 염증성질환, 또는 만성 천식, 동맥성이거나 이식 후 죽상동맥경화증과 같은 다른 만성 염증성질환, 자궁내막증, 및 예를 들어, 충실성종양 및 액상종양(예를 들어, 백혈병)이라 불리는 신생물질환을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특이 결합제를 투여하여 치료할 수 있는 부가적인 질환들도 본 발명의 숙련자들에게 명백할 것이다. 이러한 부가적인 질환은 비만증, 혈관 투과성, 혈장 누출 및 골다공증을 포함하는 골-관련 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명은 또한 조절되지 않거나 바람직하지 않은 맥관형성과 관련된 이러한 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 실시형태는 본원의 상세한 설명을 통해 명백해질 것이다.

도 1 은 본 발명의 항-Ang-2 항체(클론 533, 537 또는 544), 대조 항체 또는 인산염완충식염수(PBS)로 처리한 종양 발생 마우스에서의 종양 크기(y-축) 대 시간(x-축)의 그래프를 나타낸 것이다. 실시예에 더 상세히 기재되어 있다.

도 2A, 2B 및 2C 는 전장의 인체 Ang-2(hAng-2), hAng-2 의 N-말단 및 C-말단에 결합하는 대조 펩티바디, Tie2-Fc, C2B8 또는 5B12 뿐만 아니라 본 발명의 펩티바디 TN8-Con4-C, L1-7-N 및 12-9-3-C 에 대한 에피토프 맵핑 데이타(O.D. 370)를 나타낸 것이다. 실시예에 더 상세히 기재되어 있다.

단락의 표제는 단지 구조적 목적으로 본원에 사용되는 것이지 기재되어 있는 내용을 한정하려고 하는 것은 아니다.

표준 기술은 조직배양 및 세포 형질전환 뿐만 아니라 재조합 DNA 분자, 단백질 및 항체를 생산하는데 사용할 수 있다. 효소반응 및 정제기술은 전형적으로 제조업자의 설명에 따라 수행하거나 Sambrook 등의 문헌[Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)] 또는 본원에 기재되어 있는 바와 같은 통상적인 방법을 사용하여 본 분야에서 일반적으로 수행할 수 있다. 특별한 정의가 요구되지 않는다면, 분석화학, 합성 유기화학, 의약품 화학 및 약품화학과 관련되어 사용되는 용어 및 실험 방법과 기술들은 본 분야에 널리 공지되어 있으며 일반적으로 사용된다. 표준 기술은 화학적 합성, 화학적 분석, 약학적 제조, 제형화와 수송 및 환자를 치료하는 데 사용할 수 있다.

정의

본 명세서에 사용된 바와 같이, 하기 용어는 다르게 나타내는 경우를 제외하고는 다음과 같은 의미로 이해된다 :

용어 "Ang-2" 는 미국 특허 번호 제 6,166,185 호의 도 6 에 기재되어 있는 폴리펩티드("Tie-2 리간드-2") 또는 이의 단편 뿐만 아니라 대립 변이체, 스플라이스 변이체, 유도체, 치환, 결실 및/또는 삽입 변이체, 융합 펩티드와 폴리펩티드 및 종간 동종체를 포함하는 관련 폴리펩티드를 나타낸다. Ang-2 폴리펩티드는 제조방법에 따라 예를 들어, 선도 서열, 표적 서열, 아미노 말단의 메티오닌, 아미노 말단의 메티오닌과 리신 잔기 및/또는 표식이나 융합 단백질 서열과 같은 부가적인 말단 잔기를 포함하거나 포함하지 않을 수도 있다.

용어 "생물학적으로 활성인" 은 Ang-2 또는 Ang-2 특이 결합제와 관련하여 사용되는 경우에, Ang-2 또는 Ang-2 특이 결합제의 적어도 하나의 활성 특성을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 나타낸다. Ang-2 의 특이 결합제는 Ang-2 의 적어도 하나의 생물학적 활성도에 대하여 활성도를 중화시키거나 차단시킬 수 있으며, 효현제 또는 길항물질일 수도 있다.

용어 "특이 결합제" 는 다른 안지오포이에틴보다 우수한 친화도를 갖는 Ang-2 (및 본원에 기재되어 있는 바와 같은 이의 변이체와 유도체)에 결합하는 분자, 바람직하게 단백질성 분자를 나타낸다. 특이 결합제는 바람직하게 Ang-2 에 결합하는 단백질, 펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 저분자량 화합물이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 특이 결합제는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체(mAb), 키메라 항체, CDR-이식편 항체, 다중-특이적 항체, 양-특이적 항체, 촉매 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항-유전자형(항-Id) 항체 및 수용성이거나 결합된 형태로 표지될 수 있는 항체와 같은 항체 뿐만 아니라 이의 단편, 변이체 또는 유도체이며, 이는 공지되어 있는 기술에 의해 단독 또는 다른 아미노산 서열과 조합하여 제공된다. 이러한 기술은 효소적 절단, 화학적 절단, 펩티드 합성 또는 재조합 기술을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 항-Ang-2 특이 결합제는 Ang-2 의 생물학적 활성도 및/또는 다른 Ang-2-연관 활성도를 조절(예를 들어, 저해 또는 촉진)하는 Ang-2 의 부분에 결합할 수 있다.

용어 "폴리클로날 항체" 는 동일한 항원 표면 상의 서로 다른 에피토프를 인식하고 상기 에피토프와 결합하는 이종의 혼합 항체를 의미한다. 폴리클로날 항체는 조혈청(crude serum) 제제로부터 수득할 수 있거나, 예를 들어, 항원 친화성 크로마토그래피 또는 단백질 A/단백질 G 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있다.

용어 "모노클로날 항체" 는 단일 하이브리도마나 그밖의 다른 세포주, 또는 형질전환 포유동물에 의해 임의로 생산된 동일한 핵산 분자에 의해 코드되는 항체의 집합물을 의미하며, 각각의 모노클로날 항체는 일반적으로 항원 표면 상의 동일한 에피토프를 인식할 것이다. 용어 "모노클로날" 은 항체를 제조하는 어떤 특정한 방법으로 제한되는 것도 아니고 마우스, 랫 등과 같은 특정한 종에서 생산되는 항체로 제한되는 것도 아니다.

용어 "키메라 항체" 는 특정 항체의 클래스 또는 서브클래스에 속하거나 특정 종으로부터 유도된 항체에서 해당 서열과 동일하거나 상동적인 중쇄 및/또는 경쇄의 부분을 갖는 항체를 의미하며, 반면에 상기 중쇄와 경쇄의 나머지 부분은 그밖의 다른 항체의 클래스 또는 서브클래스에 속하거나 다른 종으로부터 유도된 항체에서 해당 서열과 동일하거나 상동적이다. 바람직한 생물학적 활성도(즉, Ang-2 와 특이적으로 결합하는 능력)를 나타내는 상기 항체의 단편 또한 포함된다. 미국 특허 번호 제 4,816,567 호 및 Morrison 등의 Proc Natl Acad Sci(USA), 81 : 6851-6855[1985] 참조하라.

용어 "CDR 이식편 항체" 는 특정한 종 또는 이소타입의 특정 항체로부터의 CDR 이 동일하거나 상이한 종 또는 이소타입의 다른 항체의 외곽구조내로 재조합적으로 삽입된 항체를 의미한다.

용어 "다중-특이적(multi-specific) 항체" 는 하나 또는 그 이상의 항원 표면 상의 하나 이상의 에피토프를 인식하는 가변영역을 갖는 항체를 의미한다. 이러한 유형의 항체의 서브클래스는 "양-특이적(bi-specific) 항체" 를 의미하며, 이 항체는 동일하거나 상이한 항원 표면 상의 2 개의 상이한 에피토프를 인식한다.

"촉매" 항체는 하나 또는 그 이상의 세포독성이나 또는 좀 더 일반적으로 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성을 갖는 성분이 표적화 결합제(the targeting binding agent)에 결합된 항체를 의미한다.

용어 "인간화 항체(humanized antibody)" 는 항체 외곽구조 영역이 인간으로부터 유래되나 각각의 CDR 은 마우스 CDR 과 같은 다른 종으로부터 유래된 CDR 로 치환된 CDR-이식편 항체의 특이 유형임을 나타낸다. 용어 "CDR" 을 하기에 정의하였다.

용어 "완전 인간" 항체는 CDR 및 외곽구조 둘 다가 하나 또는 그 이상의 인간 DNA 분자로부터 유래된 항체를 나타낸다.

용어 "항-유전자형" 항체는 항원을 인지하는 또다른 항체에 특이적으로 결합하는 모든 항체를 나타낸다. 항-유전자형 항체는 예를 들어, Ang-2 폴리펩티드 그 자체나 또는 이의 단편보다는 오히려 Ang-2-특이 항체나 또는 이의 Ang-2 결합 단편으로 동물을 면역화시킴으로써 발생하는 항체를 제외한 Ang-2-특이 항체의 생산을 위해 본원에서 기술하고 있는 방법으로 생산할 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "변이체" 는 아미노산 잔기가 결합제의 자연 발생적인(또는 적어도 공지된) 아미노산 서열로 삽입, 결실 및/또는 치환되는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 변이체는 하기에 기재한 바와 같은 융합 단백질을 포함한다.

"유도체" 는 삽입, 결실 또는 치환 변이체와 다르게 몇몇 방법으로 화학적으로 변형시킨 결합제를 포함한다.

"Ang-2 와 특이적으로 결합하는" 은 성숙한 전장 또는 부분-길이 인체 Ang-2 폴리펩티드 또는 이의 오르토로그(ortholog)를 인지하고 이에 결합하는 본 발명의 특이 결합제(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)의 능력을 나타내며, 이의 친화도(예를 들어, 본원에 기재한 바와 같은 친화도 ELISA 또는 비아코어 검정으로 측정) 또는 중화 능력(예를 들어, 본원에 기재한 바와 같은 중화 ELISA 검정 또는 유사 검정으로 측정)은 이외의 다른 안지오포이에틴 또는 다른 펩티드나 폴리펩티드와 동일한 정도의 친화도 또는 중화 능력의 적어도 최대 10 배, 최대 50 배, 최대 100, 250 또는 500 배, 또는 심지어 적어도 최대 1000 배이다.

용어 "항원 결합 도메인" 또는 "항원 결합 영역" 은 항원과 상호작용하며 항원에 대한 특이성 및 친화도를 갖는 결합제인 특이 결합제 아미노산 잔기(또는 그외 성분)를 함유하는 특이 결합제(예를 들어, 항체 분자)의 부분을 의미한다. 항체에서, 항원-결합 도메인은 일반적으로 "상보성-결정영역 또는 CDR" 로 언급된다.

용어 "에피토프" 는 결합제의 하나 또는 그 이상의 항원 결합 영역에서 항체와 같은 특이 결합제에 의해 인지되고 이에 결합될 수 있는 모든 분자의 부분을 나타낸다. 에피토프는 일반적으로 예를 들어, 아미노산 또는 탄수화물 곁사슬과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 이루어져 있으며 특이적인 3-차 구조 특성 뿐만 아니라 특이적인 전하 특성을 지니고 있다. 본원에 사용되는 에피토프는 인접하거나 인접하지 않을 수 있다. 게다가, 에피토프는 항체를 생성하는데 사용하는 에피토프와 동일한 3 차 구조를 포함하지만, 항체 면역 반응을 자극하는데 사용되는 Ang-2 에서 발견된 아미노산 잔기를 일부만 포함하거나 전혀 포함하지 않는다는 점에서 유사할 것이다.

용어 "저해 및/또는 중화 에피토프" 는 항체와 같은 특이 결합제와 결합되는 경우에, 이와 같은 에피토프를 포함하는 분자, 세포 또는 유기체의 생물학적 활성도를 생체내, 생체외 또는 원위치에서 손실(또는 적어도 감소)시키는 에피토프를 나타낸다. 본 발명의 문헌에서, 중화 에피토프는 Ang-2 의 생물학적 활성 영역 상에 위치하거나 결합되어 있다.선택적으로, 용어 "활성 에피토프" 는 항체와 같은 본 발명의 특이 결합제에 의해 결합되는 경우, Ang-2 의 생물학적 활성 입체구조를 활성화시키거나 적어도 유지시키는 에피토프를 나타낸다.

용어 "항체 단편" 은 보다 완전하지 않은 자연 그대로의 항체를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 완전 항체는 2 개의 기능적으로 독립적인 부분 또는 단편을 포함한다 : "Fab" 로 알려진 항원 결합 단편 및 "Fc" 로 알려진 카르복시 말단 결정화가능 단편. Fab 단편은 특이 항원에 결합하는 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 가변영역과 함께 중쇄 및 경쇄(CH1 및 CL1) 둘 다로부터의 첫 번째 불변영역을 포함한다. 각 중쇄 및 경쇄 가변영역은 3 개의 상보성 결정영역(CDRs) 및 각각의 CDR 과 분리되는 외곽구조 아미노산 잔기를 포함한다. Fc 영역은 두 번째 및 세 번째 중쇄 불변영역(CH2 및 CH3)을 포함하며 보체 활성 및 식세포에 의한 공격과 같은 작용인자 기능을 포함한다. 몇몇 항체에서는, Fc 및 Fab 영역이 항체 "힌지 영역" 에 의해 분리되어 있으며 전장의 항체가 얼마나 단백질분해 절단되었는지에 따라 힌지 영역은 Fab 또는 Fc 단편과 결합할 것이다. 예를 들어, 프로테아제 파파인에 의한 항체의 절단으로 인해 결과적으로 생성된 Fc 단편과 힌지 영역이 결합하지만, 프로테아제 펩신에 의한 절단으로 단편이 제공되는데, 여기에서 힌지 영역은 동시에 Fab 단편 둘 다에도 결합한다. 사실 두 Fab 단편이 펩신 절단 후에 공유 결합되기 때문에, 결과적으로 생성되는 단편은 F(ab')2 단편이라고 명명하였다.

Fab 가 짧은 혈청 반감기를 갖는 반면, Fc 도메인은 상대적으로 긴 혈청 반감기를 가질 것이다. Capon 등의 Nature, 337 : 525-31 (1989)를 참조하라. 융합 단백질의 부분으로서 발현될 때, Fc 도메인은 긴 반감기를 제공할 수 있거나 융합될 단백질에 Fc 수용체 결합, 단백질 A 결합, 보체 결합 및 심지어는 경태반 전달과 같은 기능을 제공할 수 있다. Fc 영역은 자연 발생 Fc 영역일 수 있으며 또는 치료학적 특성 또는 순환 시간과 같은 특정 성질을 향상시키기 위해 변형시킬 수 있다.

용어 "가변영역" 또는 "가변 도메인" 은 중쇄에 아미노-말단의 대략 120 내지 130 개의 아미노산 및 경쇄에 약 100 내지 110 개의 아미노-말단 아미노산을 일반적으로 포함하는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 부분을 의미한다. 가변영역은 일반적으로 같은 종의 항체들 중에서도 아미노산 서열이 모두 다르다. 항체의 가변영역은 일반적으로 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 및 특이성을 결정한다. 서열내의 변이성은 상보성-결정영역(CDRs)으로 언급되는 이러한 영역에 집중되어 있으며, 가변 도메인내의 좀더 고도로 보존되는 영역은 외곽구조 영역(FR)이라고 명명하였다. 경쇄 및 중쇄의 CDRs 는 항원과 항체의 직접적인 상호작용에 대한 반응성이 큰 아미노산을 포함하지만, FRs 의 아미노산은 하기에 기술된 항원 결합/인식에 상당한 영향을 미칠 수 있다.

항체와 관련되어 사용된 용어 "경쇄" 는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하는 카파(κ) 또는 람다(λ)로 명명된 2 개의 상이한 유형으로 총괄하여 언급된다.

항체와 관련되어 사용된 용어 "중쇄" 는 중쇄 불변 도메인의 아미노산을 기초로 하는 알파, 델타, 입실론, 감마 및 뮤로 명명된 5 개의 상이한 유형으로 총괄하여 언급된다. 경쇄 및 중쇄의 조합은 하기 5 개의 공지된 항체 클래스로 주어진다 : IgG₁, IgG₂, IgG₃ 및 IgG₄ 로 명명된 공지된 IgG 의 공지된 4 개의 서브클래스를 포함하는 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM.

용어 "자연 발생적인" 은 핵산 분자, 폴리펩티드, 숙주세포 등과 같은 생물학적 물질과 연합하여 사용되는 경우에, 자연 그대로 발견되거나 인간에 의해 변형되지 않음을 나타낸다.

용어 "분리된" 은 Ang-2 또는 Ang-2 의 특이 결합제와 관련되어 사용되는 경우에, 자연 환경에서 발견되는 적어도 하나의 오염 폴리펩티드 또는 화합물에서 분리된 화합물, 바람직하게 치료학적 용도나 진단 용도를 저해하는 포유동물의 다른 오염 폴리펩티드에서 실질적으로 분리된 화합물을 나타낸다.

용어 "성숙한" 은 Ang-2, 항-Ang-2 항체 또는 Ang-2 의 다른 단백질성 특이 결합제와 관련되어 사용되는 경우에, 선도 서열이나 신호 서열이 결여된 펩티드 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 결합제가 원핵 숙주세포에서 발현되는 경우에, "성숙한" 펩티드 또는 폴리펩티드는 아미노 말단 메티오닌이나 하나 또는 그 이상의 메티오닌 및 리신 잔기와 같은 부가적인 아미노산 잔기(선도 서열이 결여되어 있음)를 포함할 수 있다. 이러한 형태로 제조한 펩티드 또는 폴리펩티드는 부가적인 아미노산 잔기가 제거되거나 제거되지 않은 채로 사용될 수 있다.

용어 "유효량" 및 "치료학적 유효량" 은 Ang-2 의 특이 결합제와 관련되어 사용되는 경우에, Ang-2 의 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성도의 정도를 현저하게 변화시키는 데 유용하거나 필요한 특이 결합제의 양을 나타낸다. Ang-2 활성도 정도는 증가되거나 감소될 수 있다. 바람직하게, Ang-2 활성도는 감소된다.

특이 결합제 및 항체

본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "특이 결합제" 는 본원에 기술된 것 처럼 Ang-2 를 특이적으로 인식하고 결합하는 분자를 나타낸다. 적합한 특이 결합제는 항체 및 이의 유도체, 폴리펩티드 및 소분자를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 본 분야에 공지된 방법으로 적합한 특이 결합제를 제조하였다. 본 발명의 예시적인 Ang-2 폴리펩티드 특이 결합제는 Ang-2 폴리펩티드의 특정 부분에 결합할 수 있으며, 바람직하게는 Ang-2 폴리펩티드의 활성이나 또는 기능을 조절할 수 있다.

Ang-2 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 및 항체 단편과 같은 특이 결합제는 본 발명의 범주 내에 포함된다. 항체는 모노-특이적 폴리클로날을 함유하는 폴리클로날 항체, 모노클로날(mAbs) 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, CDR-이식편과 같은 인간화 항체, 인간 항체, 단쇄 항체, 촉매 항체, 다중 특이적 및/또는 양 특이적 항체 뿐만 아니라 이의 단편, 변이체 및/또는 유도체일 수 있다.

일반적으로 Ang-2 폴리펩티드를 향하는 폴리클로날 항체는 Ang-2 폴리펩티드 또는 이의 단편이 아쥬반트와 함께 또는 아쥬반트 없이 동물(예를 들어, 토끼, 햄스터, 염소, 양, 말, 돼지, 랫, 게르빌, 기니아 피그, 마우스 또는 적합한 포유동물 뿐만 아니라 다른 비-포유동물 종)에게 다중 피하 주사되거나 또는 복강내 주사됨으로써 생산된다. 상기 아쥬반트(보강제)는 다음을 포함하나 이에 한정되지는 않는다 : 프로인트 완전 및 불완전 아쥬반트, 수산화암모늄과 같은 무기질 겔 및 리졸레시틴, 플루로닉 폴리올(pluronic polyol), 다가음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림페트 헤모시아닌 및 디니트로페놀과 같은 표면-활성 기질. BCG(칼메트-구에린 간균 : bacilli Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파리붐(Corynebacterium parvum)은 잠재적으로 유용한 인체 아쥬반트이다. 면역시키려는 종에 면역원성을 부여하는 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청, 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 저해제와 같은 담체 단백질에 항원 폴리펩티드를 접합시키는 것이 유용할 것이다. 또한, 명반과 같은 응집제를 면역반응을 증강시키기 위해 사용하였다. 면역화 후에, 동물의 혈액을 뽑아내고 그 혈청을 본원의 하기 "실시예" 에서 기술하고 있는 검정으로 측정할 수 있는 항-Ang-2 폴리펩티드 항체역가에 대해 검정하였다. 폴리클로날 항체가 검출되는 혈청의 폴리클로날 항체를 활용하거나 또는 예를 들어, 항원 친화성 크로마토그래피 또는 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피를 이용하여 혈청으로부터 폴리클로날 항체를 정제하였다.

Ang-2 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체를 예를 들어, 전통적인 "하이브리도마" 방법이나 또는 좀 더 새로운 "파지 디스플레이" 기술을 이용하여 생산하지만 이것으로 한정하는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 모노클로날 항체를 본원에서 참고문헌으로 인용한 Kohler 등의 Nature 256 : 495(1975) 에 기술된 바와 같은 하이브리도마 방법 ; Kosbor 등의 Immunol Today 4 : 72 (1983), Cote 등의 Proc Natl Acad Sci(미국) 80 : 2026-2030(1983), 미국 뉴욕에 소재하는 마르셀 데커 인코포레이티드로부터 입수한 Brodeur 등의 Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63,(1987) 에 기술된 인체 B-세포 하이브리도마 기술 ; 및 미국 뉴욕에 소재하는 알랜 알 리스 인코포레이티드로부터 입수한 Cole 등의 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 에서 기술한 EBV-하이브리도마 기술을 이용하여 제조하였다. 또한, 본 발명은 Ang-2 폴리펩티드와 반응하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.

하이브리도마 기술을 이용할 경우, 골수종 세포주를 사용할 수 있다. 바람직하게, 하이브리도마-생성 융합 과정에 사용하기에 적합한 상기 세포주는 높은 융합 효율을 갖는 비-항체를 생산하며, 오직 바람직한 융합 세포(하이브리도마)만을 성장시키는 특정 배지에서 상기 세포주를 성장할 수 없도록 하는 효소 결핍을 갖는다. 예를 들어, 마우스 융합에 사용되는 세포주로는 Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG1.7 및 S194/5XXO Bul ; 랫 융합에 사용되는 세포주로는 R210.RCY3, Y3-Ag1.2.3, IR983F 및 4B210 이 있다. 세포 융합에 유용한 다른 세포주로는 U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 및 UC729-6 이 있다. 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 및 다른 세포주는 본 발명의 신규한 조성물일 것으로 기대된다.

파지 디스플레이 기술 또한 특정 종으로부터 모노클로날 항체를 생성하기 위해 사용하였다. 바람직하게, 상기 기술은 파지 입자의 표면에서 발현되는 단일 Fab 또는 Fv 항체 단편을 코드하는 폴리누클레오티드인 완전 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위해 사용하였다. Hoogenboom 등의 J Mol Biol 227 : 381(1991) ; Marks 등의 J Mol Biol 222 : 581(1991) ; 또는 미국 특허 번호 제 5,885,793 호를 참조하라. 각각의 파지는 Ang-2 에 대해 친화도를 갖는 항체 단편을 식별하기 위해 본원에서 기술하고 있는 결합 검정을 사용하여 "스크리닝" 할 수 있다. 그러므로, 상기 과정은 섬유상 박테리오파지의 표면 상에 항체 단편 레퍼터리(repertory)의 디스플레이를 통한 면역 선별과 흡사하다. 이러한 과정은 출원인 Adams 등에 의해 출원된 PCT 출원 번호 제 PCT/US98/17364 호에 기술되어 있으며, 이 문헌에서는 상기 접근법으로 MPL- 및 msk-수용체에 대해 고-친화성이며 기능적인 효현성(agonistic) 항체 단편의 분리를 기술하고 있다. 이러한 접근법에 있어서, 인간 항체 유전자의 완벽한 레퍼터리를 이전에 기술한 바와 같이[본원에서 참고문헌으로 인용한 Mullinax 등의 Proc Natl Acad Sci(미국) 87 : 8095-8099 (1990) 을 참조] 말초혈액림프구로부터 자연적으로 재배열된 인체 유전자를 클로닝함으로써 만들 수 있다.

일단 본 발명의 전장의 모노클로날 항체 또는 Fab 또는 Fv 단편(류)의 각각의 쇄를 코드하는 폴리펩티드 서열을 확인한 다음, 진핵세포 및 원핵세포와 같은 숙주세포를 본 분야에서 일상적으로 실험되고 널리 공지된 재조합 기술을 이용하여 모노클로날 항체 폴리펩티드를 발현시키기 위해 사용하였다. 선택적으로, 동물을 형질전환시키는데 있어서, 모노클로날 항체 또는 다른 특이 결합제를 코드하는 폴리누클레오티드 분자를 발현시키는 방법으로 바람직한 특이 결합제를 코드하는 폴리누클레오티드를 예를 들어, 마우스, 토끼, 염소 또는 소와 같은 수용(recipient) 동물의 게놈 내로 삽입시켰다. 하나의 양상에서, 모노클로날 항체나 또는 다른 특이 결합제를 코드하는 폴리누클레오티드를 유방-특이 조절 서열에 결합시킬 수 있으며, 키메라 폴리누클레오티드를 표적 동물의 생식계열 내로 삽입시킬 수 있다. 그 다음, 결과적으로 생성된 형질전환 동물은 우유 내에 바람직한 항체를 생산해낸다[Pollock 등의 J Immunol Meth 231 : 147-157(1999) ; Little 등의 Immunol Today 8 : 364-370(2000) 을 참조]. 더욱이, 식물은 모노클로날 항체 또는 다른 특이 결합제를 코드하는 폴리누클레오티드를 적절한 식물에 트랜스펙션시킴으로써 모노클로날 항체와 같은 Ang-2 특이 결합제를 발현 및 생산하기 위해 사용된다.

본 발명의 또다른 실시형태에서, 인간이외의 다른 종으로부터 유래된 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 이의 단편을 "인간화(humanized)" 또는 "키메라화(chimerized)" 할 수 있다. 비-인간 항체를 인간화하는 방법은 본 분야에 널리 공지되어 있다(미국 특허 번호 제 5,859,205 호, 제 5,585,089 호 및 제 5,693,762 호를 참조). 예를 들어 본 분야에 기술된 방법[Jones 등의 Nature 321 : 522-525(1986) ; Riechmann 등의 Nature, 332 : 323-327(1988) ; Verhoeyen 등의 Science 239 : 1534-1536(1988) 을 참조]을 이용하여 인간 항체의 상응하는 영역을 예를 들어, 설치류의 상보성-결정영역(CDRs : complementarity-determining region)의 적어도 한 부분으로 치환함으로써 인간화(humanized)를 실행하였다. 또한, 본 발명은 본 분야에서 널리 공지되고 본원에서 기술한 바와 같이 상기 인간 항체의 변이체 및 유도체를 제공한다.

또한, 본 발명은 Ang-2 폴리펩티드에 결합하는 완전 인간 항체 뿐만 아니라 이의 단편, 변이체 및/또는 유도체를 포함한다. 이러한 항체는 상기 기술된 파지 디스플레이 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 선택적으로, 내인성 면역글로불린이 생산되지 않을 경우에는 인간 항체 레퍼터리를 생산할 수 있는 형질전환 동물(예를 들어, 마우스)을 상기 항체를 생성하는데 사용할 수 있다. 이는 Ang-2 단편이 Ang-2 에 대해 유일한 아미노산 서열을 갖는 Ang-2 항체 또는 이의 단편으로 동물을 면역화시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, Jakobovits 등의 Proc Natl Acad Sci(미국), 90 : 2551-2555 (1993) ; Jakobovits 등의 Nature 362 : 255-258 (1993) ; Bruggermann 등의 Year in Immuno, 7 : 33 (1993) 을 참조하라. 하나의 방법에 있어서, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄를 코드하는 내인성 유전자좌들을 무능력하게 만들고 인간 중쇄 및 경쇄 단백질을 코드하는 유전자좌를 이의 게놈 내로 삽입함으로써 상기 형질전환 동물을 생성할 수 있다. 그리고나서, 바람직한 면역계 변형을 모두 갖는 동물을 얻기 위해서 상기 변형의 완전한 보체보다 좀 적게 갖는 부분적으로 변형된 동물과 교잡시켰다. 면역원을 투여할 경우, 상기 형질전환 동물은 바람직한 항원에 대해 면역-특이성이 있는 인간(예를 들어, 마우스보다는) 아미노산 서열을 포함하는 인간 가변영역을 갖는 항체를 생산할 수 있다. PCT 출원 번호 제 PCT/US96/05928 호 및 제 PCT/US93/06926 호를 참조하라. 부가적인 방법은 미국 특허 번호 제 5,545,807 호, PCT 출원 번호 제 PCT/US91/245 호, 제 PCT/GB89/01207 호, 및 EP 제 546073B1 호와 EP 제 546073A1 호에 기재되어 있다. 또한, 본원에 기술된 바와 같이 재조합 DNA 를 하이브리도마 세포에서 발현시키거나 또는 숙주세포에서 발현시킴으로써 인간 항체를 생산할 수 있다.

수많은 상이한 방법들로 형질전환시킬 수 있다. 예를 들어, Bruggeman 등의 Immunol Today 17 : 391-7 (1996) 문헌을 참조하라. 특정 연구에 있어서, 미니유전자좌가 구성됨으로써 생식계열 입체구조의 유전자 절편은 인공적으로 서로 밀집된다. 크기 제한(즉, 일반적으로 30 kb 미만임)으로 인해, 결과적으로 생성된 미니유전자좌는 제한된 수의 상이한 유전자 절편을 포함할 수 있으나, 여전히 항체의 대형 레퍼터리를 생산할 수 있다. 프로모터 및 인핸서를 포함하는 인체 DNA 서열만을 포함하는 미니유전자좌는 형질전환 마우스에서 충분히 기능적이다.

많은 수의 유전자 절편이 형질전환 동물에서 요구될 경우, 효모인공 염색체(YACs : yeast artificial chromosomes)를 사용하였다. YACs 의 범위는 수백 kb 내지 1 Mb 이며, 이를 난자 내로의 직접적인 마이크로인젝션을 통하거나 또는 배성간(ES : embryonic stem)-세포주 내로 YAC 을 이입시킴으로써 마우스(또는 다른 적절한 동물) 게놈 내로 삽입시킬 수 있다. 일반적으로, 정제된 DNA 를 리포펙션시키거나 또는 효모 스페로플라스트(spheroplast) 융합시킴으로써 YACs 을 ES 세포 내로 삽입시킬 수 있으며, 여기서 정제된 DNA 는 미셀로 운반되고, 하이브리도마 융합 프로토콜과 유사한 방법으로 융합된다. DNA 이동 후의 ES 세포의 바람직한 선별은 YAC 상에 본 분야에 공지된 선별가능한 마커를 포함시킴으로써 시행할 수 있다.

또다른 대안으로서, 박테리아성 E.coli 숙주에서 증폭된 박테리오파지 P1 벡터를 사용하였다. 일반적으로, 이러한 벡터는 YAC 보다는 삽입된 DNA 를 보다 적게 운반하지만, 마우스 난자 내로 직접 마이크로인젝션하여 충분히 높은 수득률로 클론을 용이하게 성장시킨다. 상이한 P1 벡터의 반응혼합액의 사용은 높은 수준의 상동성 재조합을 일으키는 것으로 보인다.

일단 적절한 형질전환 마우스(또는 다른 적합한 동물)를 순환 항체의 혈청 수준을 검출하기 위한 본 분야에 공지된 모든 기술(예를 들어, ELISA)을 이용하여 확인한 다음, 형질전환 동물을 내인성 Ig 유전자좌가 파괴된 마우스와 교잡시켰다. 그 결과 본질적으로 모든 B 세포가 인간 항체를 발현하는 후대 개체가 제공된다.

또다른 대안으로서, 전체 동물 Ig 유전자좌를 인체 Ig 유전자좌로 치환하였으며, 결과적으로 생성된 동물은 오직 인간 항체만을 발현하였다. 또다른 접근법으로는, 동물의 유전자좌 중 일부분을 인체 유전자좌에 특이적이고 상응하는 영역으로 치환하였다. 특정 경우에서, 상기 과정으로 인해 결과적으로 생성된 동물은 완전 인간 항체와는 반대로 마우스 Ig 유전자좌의 치환 특성에 따라 키메라 항체를 발현한다.

또한, 생체외에서 항원에 인체 비장림프구(B 세포 또는 T 세포)를 노출시킨 다음, 예를 들어 SCID 또는 nod/SCID 와 같은 면역결손 마우스에서 노출된 세포를 재구성시킴으로써 인간 항체를 생산할 수 있다. Brams 등의 J Immunol, 160 : 2051-2058 (1998) ; Carballido 등의 Nat Med, 6 : 103-106 (2000) 을 참조하라. 하나의 연구에서, SCID 마우스 내로 인체 태아 조직을 생착(engraftment)시킴(SCID-hu)으로써 장기 조혈 및 인체 T-세포를 발생시켰다[McCune 등의 Science 241 : 1532-1639(1988) ; Ifversen 등의 Sem Immunol 8 : 243-248(1996) 을 참조]. 이러한 키메라 마우스에서의 체액성 면역 반응은 동물 T-세포의 공동-발생에 따라 전적으로 달라진다 [Martensson 등의 Immunol 83 : 1271-179 (1994) 을 참조]. 선택적인 대안으로, 인체 말초혈액 림프구를 SCID 마우스의 복강내로(또는 다른 방법으로) 이식하였다[본원에서 참고문헌으로 인용한 Mosier 등의 Nature 335 :256-259(1988) 을 참조]. 이식된 세포를 포도상구균 장독소 A(SEA : Staphylococcal Enterotoxin A)[Martensson 등의 Immunol 84 : 224-230(1995)을 참조]와 같은 초회항원자극제 또는 항-인체 CD40 모노클로날 항체[Murphy 등의 Blood 86 : 1946-1953(1995)을 참조]로 처리할 경우, 높은 수준의 B-세포가 생산되었다.

선택적으로, 완전한 합성 인간 중쇄 레퍼터리는 인간 J 절편과 함께 무작위 누클레오티드의 D 절편을 갖는 각각의 인간 VH 절편을 구축함으로써 재배열되지 않은 V 유전자 절편으로부터 만들 수 있다[Hoogenboom 등의 J Mol Biol 227 : 381-388(1992) 을 참조]. 또한, 경쇄 레퍼터리는 각각의 인간 V 절편과 J 절편을 결합시킴으로써 구성된다[Griffiths 등의 EMBO J 13 : 3245-3260 (1994)를 참조]. 완전한 항체(즉, 중쇄 및 경쇄 둘 다)를 코드하는 누클레오티드를 단쇄 Fv 단편으로 연결하고 이러한 폴리누클레오티드를 섬유상 파지 마이너 외피단백질을 코드하는 누클레오티드에 결합시켰다. 상기 융합 단백질을 파지의 표면 상에서 발현시킬 경우, 특이 항체를 코드하는 폴리누클레오티드를 고정화된 항원을 사용하여 선별함으로써 확인하였다.

또다른 접근법으로는, 항체 단편이 2 개의 Fab 단편으로 구축되는데 이 중 하나의 쇄를 파지 단백질에 융합시키고 나머지를 세균성 주변세포질로 분비시켰다[Hoogenboom 등의 Nucl Acids Res 19 : 4133-4137 (1991) ; Barbas 등의 Proc Natl Acad Sci(미국) 88 : 7978-7982(1991) 을 참조].

키메라 항체, 인간화 항체, CDR-이식편 항체 및 완전 인간 항체 또는 이의 단편의 대규모 생산은 일반적으로 재조합 방법으로 이루어진다. 각각의 항체 또는 이의 단편의 중쇄 및 경쇄를 코드하는 폴리누클레오티드 분자(들)를 본원에서 기술하고 있는 물질 및 과정을 이용하여 숙주세포 내로 삽입하여 발현시켰다. 바람직한 실시형태에서, 항체를 CHO 세포와 같은 포유동물 숙주세포에서 생산하였다. 상기 생산에 대한 세부사항을 하기에 기술하였다.

특이 결합제의 융합 상대 ( Fusion Partner )

본 발명의 추가적인 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역이나 또는 본원에 기술된 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역과 같은 Ang-2 항체의 가변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 N-말단 또는 C-말단에서 인간 IgG 의 Fc 영역의 하나 또는 그 이상의 도메인에 융합시켰다. Fc 도메인이 Ang-2-특이 항체의 Fab 와 같은 치료용 단백질과 함께 구성될 경우, Fc 도메인은 좀 더 긴 반감기를 제공하거나 또는 Fc 수용체 결합, 단백질 A 결합, 보체 결합 및 심지어 경태반 전달과 같은 기능을 제공할 수 있다[Capon 등의 Nature 337 : 525-531 (1989) 를 참조].

실시예에서, 항체 힌지인 CH2 및 CH3 영역을 본 분야에 숙련된 기술자들에게 공지된 방법을 사용하여 항-Ang-2 Fab 또는 Fv 단편(예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 획득함)과 같은 특이 결합제 폴리펩티드의 N-말단이나 또는 C-말단에 융합시켰다. 결과적으로 생성된 융합 단백질을 단백질 A 또는 단백질 G 친화도 컬럼을 이용하여 정제하였다. Fc 영역에 융합된 펩티드 및 단백질은 생체내에서 융합되지 않은 대응물(counterpart) 보다 실질적으로 좀 더 큰 반감기를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 또한, Fc 영역과의 융합으로 융합 폴리펩티드의 이량체화/다량체화가 가능해진다. Fc 영역은 자연적으로 발생하는 Fc 영역일 수 있거나 또는 치료특성, 순환시간, 응집 감소 등과 같은 특정 성질을 향상시키기 위해 변경시킬 수 있다. 본 분야에 공지된 다른 예로는 인간 또는 다른 종의 Fc 영역 또는 합성된 Fc 영역인 것을 포함하며, 호지킨병, 퇴행성림프종 및 T-세포 백혈병을 치료하기 위해 CD30L 의 N-말단에 융합되고(미국 특허 번호 제 5,480,981 호 참조), 상기 Fc 영역은 폐혈증성쇽을 치료하기 위해 TNF 수용체에 융합되며[Fisher 등의 N Engl J Med, 334 : 1697-1702 (1996) 을 참조], 상기 Fc 영역은 AIDS 를 치료하기 위해 Cd4 수용체에 융합된다[Capon 등의 Nature, 337 : 525-31(1989) 를 참조].

촉매 항체는 다른 형태의 융합 분자이며 하나 또는 그 이상의 세포독성이거나 또는 좀 더 일반적으로 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성이 있는 성분이 특이 결합제에 결합되는 항체를 포함한다. 예를 들어, Rader 등의 Chem Eur J 12 : 2091-2095 (2000) 을 참조하라. 이러한 유형의 세포독성제는 항체-매개 세포독성을 개선시키며, 직접 또는 간접적으로 세포사멸을 자극하는 사이토카인과 같은 성분, 방사성동위원소, 화학요법 약물(약물전구체를 포함함), 세균독소(예를 들어, 슈도모나스 외독소, 디프테리아 독소 등), 식물독소(예를 들어, 리신, 겔로닌 등), 화학접합체[예를 들어, 마이탄시노이드 독소, 카레카에미신(Calechaemicin) 등], 방사성접합체 및 효소접합체[RNase 접합체, 항체-유도 효소/약물전구체 요법(ADEPT : antibody-directed enzyme/prodrug therapy)] 등을 포함한다. 하나의 양상에서, 세포독성제는 항체의 선택적인 항원 인식부위 중 한 곳에 상기 제제를 결합시킴으로써 양-특이적 항체 또는 다중-특이적 항체의 성분에 "결합" 될 수 있다. 선택적으로, 세포독소 단백질은 결합제를 코드하는 폴리누클레오티드에 독소를 코드하는 폴리누클레오티드를 결합시킨 다음 특이 결합제와 함께 융합 단백질 형태로 발현될 수 있다. 또다른 대안으로서, 특이 결합제는 바람직한 세포독소를 포함하기 위해서 공유적으로 변형될 수 있다.

이러한 융합 단백질의 예로는 면역원성 폴리펩티드, 긴 순환 반감기를 갖는 단백질 (예를 들어, 면역글로불린 불변영역), 마커 단백질, 바람직한 특이 결합제 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하는 단백질이나 폴리펩티드 및 다량체 단백질(예를 들어, 이량체 형성/안정성에 유용한 루이신 지퍼 모티프)의 형성을 촉진하는 폴리펩티드 서열이 있다.

이러한 유형의 삽입 변이체는 일반적으로 N- 또는 C-말단에서 전체의 2 차 폴리펩티드 또는 이의 일부에 결합하는 전체의 천연 분자 또는 이의 실질적인 부분을 가지고 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 전형적으로 이종 숙주 내에서 단백질을 재조합 발현시키기 위해 다른 종 기원의 선도 서열을 사용한다. 이외의 유용한 융합 단백질은 융합 단백질의 정제를 촉진시키기 위해 항체 에피토프와 같은 면역학적으로 활성인 도메인의 첨가를 포함한다. 융합 접합부 또는 이의 주변에서의 절단 부위의 봉입(inclusion)은 정제 후 외인성 폴리펩티드의 제거를 용이하게 한다. 다른 유용한 융합은 효소의 활성 부위, 글리코실화 도메인, 세포 표적 신호 또는 트랜스멤브레인 영역과 같은 기능적 도메인의 결합을 포함한다.

상업적으로 이용가능한 다양한 융합 단백질 발현 시스템을 본 발명에 사용할 수 있다. 특히 유용한 시스템은 글루타티온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST) 시스템(파마시아에서 입수), 말토스 결합 단백질 시스템(미국 매사추세츠 버버리에 소재하는 엔이비에서 입수), 플라그 시스템(FLAG system, 미국 코네티것 뉴 헤븐에 소재하는 아이비아이에서 입수) 및 6xHis 시스템(미국 캘리포니아 채츠워스에 소재하는 퀴아젠에서 입수)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 시스템으로 재조합 폴리펩티드의 항원능력에 영향을 미치지 않는 소수의 부가적인 아미노산을 제공하는 재조합 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 예를 들어, 플라그 시스템 및 6xHis 시스템은 짧은 서열만을 첨가하며, 이 두 시스템은 불완전한 항원성으로 공지되어 있으며 천연 입체구조의 폴리펩티드의 접힘에 역효과를 미치지 않는다. 유용하다고 여겨지는 다른 N-말단 융합은 단백질 또는 펩티드의 N-말단 영역에서의 Met-Lys 디펩티드의 융합이다. 이러한 융합으로 단백질 발현 또는 활성도를 효과적으로 증가시킬 수 있다.

특히 유용한 융합 구조물은 예를 들어, 본 발명의 항-유전자형 항체 생산에 유용한 특이 결합제 융합 구조물의 면역원성을 증가시키기 위해 합텐에 융합시킨 특이 결합제 펩티드이다. 면역원성을 향상시키기 위한 이러한 융합 구조물은 본 분야의 숙련자들에게 공지되어 있으며, 예를 들어, hsp70 과 같은 보조항원, 디프테리아 독소 사슬에서 유래된 펩티드 서열 또는 IL-2 와 같은 사이토카인과 특이 결합제의 융합은 면역 반응을 일으키는 데 유용하다. 다른 실시형태에서, 융합 구조물은 특정 부위나 세포에 결합하는 항원 결합제 조성물의 표적화가 향상되도록 제조할 수 있다.

표적화에 대하여 바람직한 특성을 지니는 이종 폴리펩티드를 포함하는 다른 융합 구조물(예를 들어, 혈청 반감기를 연장시키기 위한 Ig 불변영역 또는 항체나 이의 단편)도 포함된다. 바람직한 폴리펩티드에서 융합상대를 제거하는 것이 바람직한 경우에 다른 융합 시스템으로 폴리펩티드 하이브리드를 제조할 수 있다. 한 실시형태에서, 융합상대는 프로테아제에 대한 특이적인 인식 서열을 함유하는 펩티드 서열에 의해 재조합 특이 결합제 폴리펩티드에 연결된다. 적합한 서열의 예로는 담배 에치 바이러스 프로테아제(Tabacco Etch Virus protease, 미국 메릴랜드 게티스버그에 소재하는 Life Technologies 에서 입수) 또는 Xa 인자(미국 매사추세츠 버버리에 소재하는 New England Biolabs 에서 입수)에 의해 인지되는 서열이 있다.

본 발명은 종양 혈관 응괴제로 작용하는 절두된 형태의 인체 응고-유도 단백질로 이루어진 혈관 표적제제인 절두된 조직 인자(tTF)와 조합하여, 본원에 기재되어 있는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 또는 본원에 기재되어 있는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역과 같은 Ang-2 항체의 가변 도메인의 전체 또는 일부를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 항-Ang-2 항체 또는 이의 단편과 tTF 와의 융합으로 표적세포로의 항-Ang-2 의 수송을 촉진시킬 수 있다.

특이 결합제의 변이체

본 발명의 특이 결합제의 변이체는 삽입, 결실 및/또는 치환 변이체를 포함한다. 본 발명의 한 양상에서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 특이 결합제 아미노산 서열을 보충하는 삽입 변이체가 제공된다. 삽입물은 단백질 말단 중 하나 또는 둘 다에 위치하거나, 또는 특이 결합제 아미노산 서열의 내부 영역에 위치할 수 있다. 하나 또는 두 말단에 부가적인 잔기를 갖는 삽입 변이체는 예를 들어, 아미노산 표식이나 표지를 포함하는 단백질 및 융합 단백질을 포함할 수 있다. 삽입 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 특이 결합제 아미노산 서열 또는 이의 단편에 첨가된 특이 결합제 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명의 변이 산물은 또한 성숙한 특이 결합제 산물을 포함한다. 이러한 특이 결합제 산물은 선도 서열 또는 신호 서열이 제거된 것이지만, 결과적으로 형성된 단백질은 야생형 Ang-2 폴리펩티드와 비교하여 부가적인 아미노 말단 잔기를 갖는다. 부가적인 아미노 말단 잔기는 다른 단백질로부터 유도되거나, 또는 특정 단백질로부터 유도된 것과 동일하지 않은 하나 또는 그 이상의 잔기를 포함할 수 있다. 위치-1(Met^-1-특이 결합제)에 부가적인 메티오닌 잔기를 갖는 특이 결합제 산물이 포함되며 위치 -2 및 -1(Met^-2-Lys^-1-특이 결합제)에 부가적인 메티오닌 잔기 및 리신 잔기를 갖는 특이 결합제 산물도 포함된다. 부가적인 Met, Met-Lys, Lys 잔기(또는 일반적인 하나 또는 그 이상의 염기성 잔기)를 갖는 특이 결합제의 변이체는 박테리아 숙주세포에서의 재조합 단백질 생산을 향상시키는 데 특히 효과적이다.

본 발명은 또한 특정한 발현 시스템의 사용으로 발생되는 부가적인 아미노산 잔기를 갖는 특이 결합제 변이체도 포함한다. 예를 들어, 글루타티온-S-전이효소(GST) 융합 산물의 일부로서 바람직한 폴리펩티드를 발현하는 상업적으로 이용가능한 벡터를 사용하여 바람직한 폴리펩티드에서 GST 성분을 제거한 후에 아미노산 위치-1 에서 부가적인 글리신 잔기를 갖는 바람직한 폴리펩티드를 생성하였다. 또한 다른 벡터 시스템으로 발현시킨 변이체도 생각할 수 있으며, 이 변이체는 일반적으로 서열의 카르복시 및/또는 아미노 말단에서 아미노산 서열내로 혼입된 폴리-히스티딘 표식을 포함한다.

삽입 변이체는 또한 특이 결합제 폴리펩티드의 아미노 및/또는 카르복시 말단이 다른 폴리펩티드, 이의 단편 또는 일반적으로 모든 특이 단백질 서열의 부분으로 인지되지 않는 아미노산 서열에 융합되는 상기에 기재한 융합 단백질을 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은 특이 결합제 폴리펩티드의 아미노산 잔기 중 하나 또는 그 이상이 제거된 결실 변이체를 제공한다. 결실은 특이 결합제 폴리펩티드의 한 쪽 또는 양 말단에서 시행되거나, 또는 특이 결합제 아미노산 서열 내의 하나 또는 그 이상의 잔기가 제거될 수 있다. 결실 변이체는 필수적으로 특이 결합제 폴리펩티드의 모든 단편을 포함한다.

항체 단편은 항원 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 항체의 부분을 포함한다. 이러한 단편의 예는 예를 들어, 전장의 항체를 효소학적 또는 화학적으로 절단하여 생성한 Fab 및 F(ab')₂ 단편을 포함한다. 다른 결합 단편들은 항체 가변영역을 코드하는 핵산 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현과 같은 재조합 DNA 기술로 생성된 것들을 포함한다. 또한 본 발명은 Ang-2 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 Ang-2 결합제의 폴리펩티드 단편도 포함한다. 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드의 연속적인 아미노산 중 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 나 50 개 또는 그 이상을 포함하는 단편도 본원에 포함된다. 바람직한 폴리펩티드 단편은 본 발명의 항원-결합제에 대해 유일하거나 특이적인 면역학적 특성을 나타낸다. 바람직한 면역학적 특성을 갖는 본 발명의 단편은 공지된 모든 방법에 의해 제조될 수 있으며 본 분야에서 일반적으로 수행될 수 있다.

또다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 특이 결합제의 치환 변이체를 제공한다. 치환 변이체는 일반적으로 원래의 폴리펩티드와 "유사" 하거나 또는 원래의 폴리펩티드에 대해 특정한 "동일성(％)" 을 가진다고 여겨지며, 폴리펩티드의 아미노산 잔기 중 하나 또는 그 이상이 제거되고 대체 잔기로 치환된 폴리펩티드를 포함한다. 한 양상에서, 치환은 자연 보존적이나, 본 발명은 비-보존적 치환도 포함한다.

관련 폴리펩티드의 동일성 및 유사성은 공지된 방법으로 쉽게 계산할 수 있다. 이러한 방법에는 Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York(1988) ; Biocomputing : Informatics 및 Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York(1993) ; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., 및 Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey(1994) ; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press(1987) ; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991) ; 및 Carillo 등의 SIAM J. Applied Math., 48 : 1073(1988) 에 기재되어 있는 방법이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

두 폴리펩티드의 관련성 또는 동일성(％)을 측정하기 위한 바람직한 방법은 시험한 서열 간에 최대로 매치되도록 고안되었다. 동일성을 측정하는 방법은 통상적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 기재되어 있다. 두 서열 간의 동일성을 측정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GAP 를 포함하는 GCG 프로그램 패키지[Devereux 등의 Nucl. Acid. Res., 12 : 387(1984) ; 제네틱스 컴퓨터 그룹, 미국 위스콘신 메디슨에 소재하는 University of Wisconsin 에서 입수], BLASTP, BLASTN 및 FASTA[Altschul 등의 J. Mol. Biol., 215 : 403-410(1990) 참조] 를 포함하나 이에 한정되지 않는다. BLASTX 프로그램은 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(NCBI) 및 다른 정보원[BLAST Manual, Altschul 등의 NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894 ; Altschul 등의 상기 문헌(1990)]으로부터 통상적으로 이용가능하다. 널리 공지된 스미스 워터맨 알고리즘(Smith Waterman algorithm) 또한 동일성을 측정하는 데 사용할 수 있다.

두 아미노산 서열을 정렬시키기 위한 특정한 정렬 계획으로 두 서열의 짧은 영역만을 매칭시키는 것이며, 전장의 두 서열 간에 현저한 관계성이 없음에도 불구하고, 이렇게 정렬된 작은 영역은 매우 높은 서열 동일성을 지닌다. 따라서 특정 실시형태에서, 선택한 정렬 방법(GAP 프로그램)으로 비교한 전장의 표적 폴리펩티드 중 적어도 10 %, 즉 비교한 적어도 400 개의 아미노산 서열 중 적어도 40 개의 연속적인 아미노산, 비교한 적어도 300 내지 약 400 개의 아미노산 서열 중 30 개의 연속적인 아미노산, 비교한 200 내지 약 300 개의 아미노산 서열 중 적어도 20 개의 연속적인 아미노산 및 비교한 약 100 내지 200 개의 아미노산 서열 중 적어도 10 개의 연속적인 아미노산에 이르도록 정렬하였다.

예를 들어, 컴퓨터 알고리즘 GAP(제네틱스 컴퓨터 그룹, 미국 위스콘신 메디슨에 소재하는 University of Wisconsin 에서 입수)를 사용하여, 서열 동일성(％)을 측정할 두 서열을 상대적인 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬하였다[알고리즘에 의해 측정된 바와 같은 "매칭된 길이(matched span)"]. 특정 실시형태에서, PAM 250 또는 BLOSUM 62 와 같은 비교 매트릭스 뿐만 아니라 갭 오프닝 패널티(gap opening penalty ; 일반적으로 3X 평균 대각선으로 계산된 것이고 ; "평균 대각선" 은 사용되는 비교 매트릭스의 대각선의 평균이고 ; "대각선(diagonal)" 은 특정한 비교 매트릭스에 의한 각각의 완전한 아미노산 매치에 대해 정한 점수 또는 숫자이다) 및 갭 신장 패널티(gap extension penalty ; 일반적으로 갭 오프닝 패널티의 1/10 배)를 알고리즘에 사용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 표준 비교 매트릭스[PAM 250 비교 매트릭스에 관한 Dayhoff 등의 Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3)(1978) ; BLOSUM 62 비교 매트릭스에 관한 Henikoff 등의 Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89 : 10915-10919(1992) 참조] 또한 알고리즘에 사용할 수 있다.

특정 실시형태에서, 폴리펩티드 서열 비교에 대한 파라미터는 다음을 포함한다 : 알고리즘(Algorithm): Needleman 등의 J. Mol. Biol., 48:443-453(1970) ; 비교 매트릭스(Comparison matrix): Henikoff 등의 상기 문헌(1992) 의 BLOSUM 62 ; 갭 패널티(Gap Penalty): 12 갭 길이 패널티(Gap Length Penalty): 4 유사성의 역치(Threshold of Similarity): 0.

GAP 프로그램은 상기 파라미터로 수행하는 것이 효과적이다. 특정 실시형태에서, 상기에 언급한 파라미터는 GAP 알고리즘을 사용하여 폴리펩티드 비교(말단 갭에 대한 패널티가 없음)에 대한 디폴트 파라미터(default parameter)이다.

특정 실시형태에서, 폴리누클레오티드 분자 서열 비교에 대한 파라미터는 다음을 포함한다 : 알고리즘 : Needleman 등의 상기 문헌(1970) 참조 ; 비교 매트릭스 : 일치(match) = +10, 미스매치(mismatch) = 0 갭 패널티 : 50 갭 길이 패널티 : 3.

GAP 프로그램은 또한 상기 파라미터로 수행하는 것이 효과적이다. 상기에 언급한 파라미터는 폴리누클레오티드 분자 비교에 대한 디폴트 파라미터이다.

Program Maunal, Wisconsin Package, Version 9, September, 1997 에 기재되어 있는 것들도 포함하여, 다른 전형적인 알고리즘, 갭 오프닝 패널티, 갭 신장 패널티, 비교 매트릭스, 유사성의 역치 등도 사용할 수 있다. 프로그램을 실행하기 위한 특정의 선택은 본 분야의 숙련자들에게 자명할 것이며, 이는 DNA-대-DNA, 단백질-대-단백질, 단백질-대-DNA 와 같이 실행될 특이적 비교에 따라 다를 것이며 ; 부가적으로, 이러한 비교는 주어진 서열의 쌍(GAP 또는 BestFit 이 일반적으로 바람직한 경우) 간의 비교 또는 서열과 서열의 거대한 데이타베이스(FASTA 또는 BLASTA 가 바람직한 경우) 간의 비교일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 통상적인 20 개의 아미노산 및 이의 약어는 일반적인 용도를 따른다. 특정의 목적을 위해 본원에서 참고문헌으로 인용된 Immunology-A Synthesis[2nd Edition, E. S. Golub 및 D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass.(1991)]을 참조하라.

아미노산은 L 또는 D 입체화학을 가지며(예외적으로, Gly 는 L 도 갖지 않으며 D 도 갖지 않음), 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물은 입체화학의 조합을 포함한다. 그러나, L 입체화학이 바람직하다. 또한 본 발명은 아미노산의 카르복시 말단 서열에 대한 아미노 말단이 상반되는 역분자를 제공한다. 예를 들어, 정상적인 서열 X₁-X₂-X₃ 를 갖는 분자의 역은 X₃-X₂-X₁ 이다. 본 발명은 또한 상기와 같이, 아미노산의 카르복시 말단 서열에 대한 아미노 말단은 상반되며 일반적으로 "L" 거울상이성질체인 잔기가 "D" 입체이성질체 형태로 변경되는 레트로-역분자(retro-reverse molecule)를 제공한다.

일반적인 20 개의 아미노산의 입체 이성질체(예를 들어, D-아미노산), α-, α-비치환된 아미노산과 같은 비천연 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산 및 이외의 일반적이지 않은 아미노산도 또한 본 발명의 폴리펩티드에 대해 적합한 성분이다. 일반적이지 않은 아미노산은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다 : 아미노아디프산, 베타-알라닌, 베타-아미노프로피온산, 아미노부티르산, 피페리딘산, 아미노카프리오산, 아미노헵타논산, 아미노이소부티르산, 아미노피멜산, 디아미노부티르산, 데스모신, 디아미노피멜산, 디아미노프로피온산, N-에틸글리신, N-에틸아스파라긴, 히드록시리신, 알로-히드록시리신, 히드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이소루이신, N-메틸글리신, 사르코신, N-메틸이소루이신, N-메틸발린, 노르발린, 노르루이신, 오리틴(orithine), 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루탐산염, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, σ-N-메틸아르기닌 및 이외의 유사 아미노산과 아미노산(예를 들어, 4-히드록시프롤린).

유사하게, 다른 식으로 정의되지 않는다면, 단일-가닥 폴리누클레오티드의 서열의 왼쪽 말단은 5' 말단이고 ; 이중-가닥 폴리누클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5' 방향이라 한다. 초기 RNA 전사물이 5' 에서 3' 으로 첨가되는 방향을 전사 방향이라 하고 ; RNA 전사물의 5' 영역에서 5' 말단까지이며 RNA 와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "상류서열" 이라 하고 ; RNA 전사물의 3' 영역에서 3' 말단까지이며 RNA 와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "하류서열" 이라 한다.

보존적 아미노산 치환기는 생물학적 시스템 내에서 합성하기 보다는 일반적으로 화학적 펩티드 합성으로 합성된 비-자연 발생적인 아미노산 잔기를 포함한다. 이러한 아미노산 잔기는 펩티도유사체 및 아미노산 성분의 역형태를 포함한다.

자연 발생적인 잔기는 일반적인 곁사슬 특성에 따라 다음과 같이 분류할 수 있다 : 1) 소수성 : Met, Ala, Val, Leu, Ile ; 2) 중성의 친수성 : Cys, Ser, Thr, Asn, Gln ; 3) 산성 : Asp, Glu ; 4) 염기성 : His, Lys, Arg ; 5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기 : Gly, Pro ; 및 6) 방향족 : Trp, Tyr, Phe.

예를 들어, 비-보존적 치환은 이러한 클래스 중 하나의 멤버가 다른 클래스의 멤버로 치환되는 것을 포함한다. 이와 같이 치환된 잔기는 비-인간 항체와 상동인 인간 항체의 영역 또는 분자의 비-상동 영역으로 도입시킬 수 있다.

특정 실시형태에서, 치환을 수행하는데 있어서는 아미노산의 수치료법 수치(hydropathic index)가 고려된다. 각각의 아미노산은 이의 소수성 및 전하 특성을 근거로 하여 수치료법 수치가 결정된다. 이 수치는 다음과 같다 : 이소루이신(+4.5) ; 발린(+4.2) ; 루이신(+3.8) ; 페닐알라닌(+2.8) ; 시스테인/시스틴(+2.5) ; 메티오닌(+1.9) ; 알라닌(+1.8) ; 글리신(-0.4) ; 트레오닌(-0.7) ; 세린(-0.8) ; 트립토판(-0.9) ; 티로신(-1.3) ; 프롤린(-1.6) ; 히스티딘(-3.2) ; 글루탐산염(-3.5) ; 글루타민(-3.5) ; 아스파라긴산(-3.5) ; 아스파라긴(-3.5) ; 리신(-3.9) ; 및 아르기닌(-4.5).

단백질에 대한 상호작용성 생물학적 기능을 부여하는 아미노산 수치료법 수치의 중요성은 본 분야에 공지되어 있다. Kyte 등의 J. Mol. Biol., 157 : 105-131(1982) 을 참조하라. 특정 아미노산은 유사한 수치료법 수치를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며 유사한 생물학적 활성도를 가지고 있음이 공지되어 있다. 특정 실시형태에서, 수치료법 수치를 근거로 하여 치환하는 데 있어서는 수치료법 수치가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 포함된다. 특정 실시형태에서, 수치가 ±1 이내인 것들이 포함되며, 특정 실시형태에서, ±0.5 이내인 것들도 포함된다.

유사 아미노산은 친수성을 근거로 효과적으로 치환되며, 특히 이러한 치환으로 생성된 생물학적으로 기능적인 단백질 또는 펩티드는 본 발명의 경우와 같은 면역학적 실시형태에서 사용됨이 본 분야에서 이해된다. 특정 실시형태에서, 인접 아미노산의 친수성에 의해 조절되는 단백질의 매우 국소적인 평균 친수성은 단백질의 면역원성 및 항원성, 즉 단백질의 생물학적 특성에 관련된 것이다.

아미노산 잔기의 친수성 값을 하기에 나타내었다 : 아르기닌(+3.0) ; 리신(+3.0) ; 아스파라긴산(+3.0 ± 1) ; 글루탐산(+3.0 ± 1) ; 세린(+0.3) ; 아스파라긴(+0.2) ; 글루타민(+0.2) ; 글리신(0) ; 트레오닌(-0.4) ; 프롤린(-0.5 ± 1) ; 알라닌(-0.5) ; 히스티딘(-0.5) ; 시스테인(-1.0) ; 메티오닌(-1.3) ; 발린 (-1.5) ; 루이신(-1.8) ; 이소루이신(-1.8) ; 티로신(-2.3) ; 페닐알라닌(-2.5) ; 및 트립토판(-3.4). 특정 실시형태에서, 유사한 친수성 값을 근거로 하여 치환하는 데 있어서는 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 포함되며, 친수성 값이 ±1 이내인 아미노산 및 ±0.5 이내인 아미노산의 치환도 포함된다. 또한 친수성을 근거로 1 차 아미노산 서열로부터 에피토프를 확인할 수 있다. 이러한 영역은 "에피토프 코어 영역" 이라 한다.

일반적인 아미노산 치환을 하기의 표 1 에 나타내었다.

숙련자들은 널리 공지된 기술을 이용하여 본원에 기재되어 있는 바와 같은 폴리펩티드의 적합한 변이체를 결정할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 분야의 숙련자들은 활성도를 손실시키지 않으면서 활성도에 중요한 영향을 미치지 않을 것으로 여겨지는 표적 영역으로 변이시킬 수 있는 분자의 적당한 부분을 확인할 수 있다. 특정 실시형태에서, 숙련자들은 유사 폴리펩티드 중에서 보존된 분자의 잔기 및 부분을 확인할 수 있다. 특정 실시형태에서, 생물학적 활성도나 구조에 중요한 영향을 미치는 영역에서도 생물학적 활성도를 파괴하지 않거나 폴리펩티드 구조에 불리한 영향을 미치지 않으면서 보존적 아미노산 치환을 실시할 수 있다.

부가적으로, 본 분야의 숙련자들은 활성도나 구조에 중요한 유사 폴리펩티드의 잔기를 확인하는 구조-작용 연구를 검토할 수 있다. 이러한 비교를 통해, 숙련자들은 유사 단백질의 활성도나 구조에 중요한 아미노산 잔기에 해당하는 단백질내 아미노산 잔기의 중요성을 예측할 수 있다. 본 분야의 숙련자들은 중요한 아미노산 잔기로 예측된 바와 같은 아미노산 잔기를 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시킬 수 있다.

본 분야의 숙련자들은 또한 유사 폴리펩티드의 구조에 관한 아미노산 서열과 3 차원 구조를 분석할 수 있다. 본 분야의 숙련자들은 이러한 정보를 통해 항체의 3 차원 구조에 관한 항체의 아미노산 잔기의 정렬을 예측할 수 있다. 특정 실시형태에서, 아미노산 잔기는 다른 분자와의 중요한 상호작용에 관계되어 있으므로, 본 분야의 숙련자들은 단백질의 표면에서 예측되는 아미노산 잔기에 대한 라디칼 변화가 일어나지 않도록 선택할 수 있다. 또한, 본 분야의 숙련자들은 각각의 바람직한 아미노산 잔기에서의 단일 아미노산을 치환시킨 실험 변이체를 제조할 수 있다. 그런 다음 본 분야의 숙련자들에게 공지된 활성도 검정을 이용하여 이 변이체를 스크리닝할 수 있다. 이러한 변이체는 적당한 변이체에 관한 정보를 수집하는 데 이용할 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산 잔기의 변화로 활성도가 손실되거나 바람직하지 못하게 감소되거나 부적합하게 된다면, 이러한 변이를 갖는 변이체는 피하는 것이 좋다. 즉, 본 분야의 숙련자들은 일반적인 실험으로부터 수집한 정보를 토대로, 추가 변이가 단독으로 또는 다른 돌연변이와 조합되어 일어나지 않도록 하는 아미노산을 용이하게 결정할 수 있다.

2 차 구조를 예상하는 많은 과학적 발표가 있었다. Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4) : 422-427(1996), Chou 등의 Biochemistry, 13(2) : 222-245(1974) ; Chou 등의 Biochemistry, 113(2) : 211-222(1974) ; Chou 등의 Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47 : 45-148(1978) ; Chou 등의 Ann. Rev. Biochem., 47 : 251-276 및 Chou 등의 Biophys. J., 26 : 367-384(1979) 를 참조하라. 또한, 2 차 구조를 예상하는데 도움이 되는 컴퓨터 프로그램을 일반적으로 이용할 수 있다. 2 차 구조를 예상하는 하나의 방법은 상동성 모델링에 기초하는 방법이다. 예를 들어, 30 % 보다 큰 동일성 또는 40 % 보다 큰 유사성을 갖는 두 폴리펩티드 또는 단백질은 종종 유사 구조 위상학을 갖는다. 최근 단백질 구조 데이타베이스(PDB)의 발달은 폴리펩티드나 단백질 구조내의 가능한 접힘의 수를 포함하는 2 차 구조의 예상가능성을 높여주었다. Holm 등의 Nucl. Acid. Res., 27(1) : 244-247(1999) 를 참조하라. 특정 폴리펩티드 또는 단백질에서의 제한된 접힘의 수가 존재하며 구조의 임계수(critical number)가 일단 정해지면 구조의 예측은 정확해질 것이라고 제시되어 있다[Brenner 등의 Curr. Op. Struct. Biol., 7(3) : 369-376(1997) 참조].

2 차 구조를 예상하는 부가적인 방법은 "트레딩(threading)"[Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3) : 377-87(1997) ; Sippl 등의 Structure, 4(1) : 15-19(1996) 참조], "프로필 분석"[Bowie 등의 Science, 253 : 164-170(1991) ; Gribskov 등의 Meth. Enzym., 183 : 146-159(1990) ; Gribskov 등의 Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13) : 4355-4358(1987) 참조] 및 "친화론적 연관"[Holm 의 상기 문헌(1999) 및 Brenner 의 상기 문헌(1997) 참조]을 포함한다.

특정 실시형태에서, 항체 변이체는 글리코실화 부위의 수 및/또는 유형이 모폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교하여 변이된 글리코실화 변이체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 단백질 변이체는 천연 단백질보다 많거나 적은 N-결합 글리코실화 부위를 포함한다. N-결합 글리코실화 부위는 서열 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr 을 특징으로 하며, 여기에서 X 로 나타낸 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 모든 아미노산 잔기이다. 이러한 서열을 생성하기 위한 아미노산 잔기의 치환은 N-결합 탄수화물 사슬이 부가될 수 있는 잠재적인 신규한 부위를 제공한다. 선택적으로, 이러한 서열을 제거하는 치환으로 존재하는 N-결합 탄수화물 사슬을 제거한다. 또한, 상기 치환은 하나 또는 그 이상의 N-결합 글리코실화 부위(일반적으로 자연 발생적인 부위임)가 제거되고 하나 또는 그 이상의 신규한 N-결합 부위가 생성된 N-결합 탄수화물 사슬의 재배열을 제공한다. 부가적인 바람직한 항체 변이체는 모아미노산 서열과 비교하여 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기가 결실되거나 또는 다른 아미노산(예를 들어, 세린)으로 치환된 시스테인 변이체를 포함한다. 시스테인 변이체는 항체가 불용성 봉입체를 분리한 다음 생물학적으로 활성인 입체구조로 재접힘되어야 하는 경우에 유용하다. 시스테인 변이체는 일반적으로 천연 단백질보다 적은 수의 시스테인 잔기를 가지며, 일반적으로 짝지어지지 않은 시스테인으로 인한 상호작용을 최소화하는 수의 시스테인 잔기를 갖는다.

특정 실시형태에 따라, 아미노산 치환은 (1) 단백질 분해에 대한 감수성을 감소시키고 (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고 (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화도를 변화시키고 (4) 결합 친화도를 변화시키며/변화시키거나 (5) 폴리펩티드에 관한 다른 기능적 특성을 전환 또는 변형시킨다. 특정 실시형태에 따라, 단일 또는 다중 아미노산 치환(특정 실시형태에서, 보존적 아미노산 치환)은 자연 발생적인 서열(특정 실시형태에서, 분자간 접촉을 형성하는 폴리펩티드 외부 도메인의 부분)로 수행할 수 있다. 특정 실시형태에서, 보존적 아미노산 치환은 일반적으로 모서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않는다(예를 들어, 치환 아미노산은 모서열 내에서 발생하는 나선을 파괴하지 않거나 모서열을 특정화하는 2 차 구조의 유형을 붕괴시키지 않아야 한다). 본 분야에서 인지된 폴리펩티드 2 차 및 3 차 구조의 예는 Proteins, Structures and Molecular Principles[Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York(1984)] ; Introduction to Protein Structure[C. Branden 및 J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y.(1991)] ; 및 Thornton 등의 Nature 354 : 105(1991) 에 기재되어 있다.

폴리펩티드 또는 펩티드 치환 변이체인 본 발명의 특이 결합제 분자는 치환된 원래의 아미노산 서열 중 약 10 내지 12 % 를 갖는다. 항체 변이체에 대하여, 경쇄는 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개의 치환된 아미노산을 갖는 반면에 경쇄는 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 개의 치환된 아미노산을 갖는다.

특이 결합제의 유도체

본 발명은 또한 특이 결합제 폴리펩티드의 유도체를 제공한다. 유도체는 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환과는 다른 변형에 의한 특이 결합제 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게, 변이체는 자연적으로 공유결합하며, 예를 들어, 중합체, 지질, 다른 유기 및 무기 성분과의 화학적 결합을 포함한다. 본 발명의 유도체는 특이 결합제 폴리펩티드의 순환 반감기가 증가되도록 제조하거나 또는 바람직한 세포, 조직 또는 기관에 대한 폴리펩티드의 표적 능력이 향상되도록 제조할 수 있다.

본 발명은 또한 미국 특허 번호 제 4,640,835 호, 제 4,496,689 호, 제 4,301,144 호, 제 4,670,417 호, 제 4,791,192 호 및 제 4,179,337 호에 기재되어 있는 바와 같은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜과 같은 하나 또는 그 이상의 수용성 중합체가 부착되도록 공유적으로 변형시킨 결합제 유도체를 포함한다. 본 분야에 공지되어 있는 또다른 유용한 중합체는 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로스나 다른 탄수화물 기저 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 동종중합체, 산화폴리프로필렌/산화에틸렌 공-중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어, 글리세롤) 및 폴리비닐 알콜, 뿐만 아니라 이러한 중합체의 혼합물도 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 서브유닛으로 공유적으로 변형시킨 특이 결합제 산물이 특히 바람직하다. 수용성 중합체는 예를 들어, 특이 결합제 산물의 아미노 말단인 특정 위치에 결합하거나 또는 폴리펩티드의 곁사슬 중 하나 또는 그 이상에 무작위로 결합할 수 있다. 특이 결합제 및 특히 인간화 항체에 대한 치료학적 능력을 향상시키는 데 사용하는 PEG 는 2000 년 10 월 17 일자로 공고된 Gonzales 등의 미국 특허 번호 제 6,133,426 호에 기재되어 있다.

항체 돌연변이유발에 대한 표적 부위

항체 표적에 대한 항체의 친화도와 같은, Ang-2-특이 항체의 고유 특성을 조정하는 데 특정 전략을 사용할 수 있다. 이러한 전략은 항체 변이체를 제조하기 위해 항체를 코드하는 폴리누클레오티드 분자를 부위-특이 또는 무작위 돌연변이유발시킨 다음 바람직한 변화, 예를 들어, 증가되거나 또는 감소된 활성도를 나타내는 항체 변이체가 회복되도록 설계한 스크리닝 단계를 포함한다.

가장 일반적으로 돌연변이 전략의 표적이 되는 아미노산 잔기는 CDRs 내에 존재한다. 상기 문헌에 기재한 바와 같이, 이러한 영역은 잔기의 공간적 배열에 영향을 미치는 다른 아미노산 및 Ang-2 와 실질적으로 상호작용하는 잔기를 포함한다. 그러나, CDR 영역 외부의 가변 도메인의 외곽구조 영역 내의 아미노산은 또한 항체의 항원-결합 특성에 실질적으로 기여한다고 보여지며, 이는 이러한 특성을 조정하기 위해 표적화될 수 있다. Hudson, Curr Opin Biotech, 9 : 395-402(1999) 및 본원의 참고문헌을 참조하라.

덜 효과적으로 및 더 효과적으로 스크리닝된 항체 변이체의 라이브러리는 신체 활성도 발달 과정 중에 "과-돌연변이" 되기 쉬운 부위에 해당하는 CDRs 내의 부위에 대한 제한된 무작위 또는 부위-특이 돌연변이유발로 생성할 수 있다. Chowdhury 및 Pastan, Nature Biotech, 17 : 568-572(1999) 및 본원의 참고문헌을 참조하라. 이러한 방법으로 과-돌연변이 부위를 나타내는 공지된 DNA 요소의 유형은 직접 및 전환 반복체, 특정 칸센서스 서열, 2 차 구조 및 팔린드롬을 포함한다. 칸센서스 DNA 서열은 테트라 염기서열 퓨린-G-피리미딘-A/T(즉, A 또는 G-G-C 또는 T-A 또는 T) 및 세린 코돈 AGY(여기에서, Y 는 C 또는 T)를 포함한다.

따라서, 본 발명의 실시형태는 항체 표적에 대한 항체의 친화도를 향상시키는 것을 목적으로 하는 돌연변이원성 전략을 포함한다. 이러한 전략은 전체적인 가변 중쇄 및 경쇄의 돌연변이유발, CDR 영역만의 돌연변이유발, CDRs 내의 칸센서스 과돌연변이 부위의 돌연변이유발, 외곽구조 영역의 돌연변이유발 또는 이러한 방법을 조합한 돌연변이유발을 포함한다(본원의 "돌연변이유발" 은 무작위이거나 부위-특이적이다). 본 발명의 항체 및 항체-리간드 복합체의 구조가 밝혀졌음에도 불구하고, X-선 결정학과 같은 본 분야의 숙련자들에게 공지되어 있는 기술로 CDR 영역을 결정적으로 묘사하고 항체의 결합 부위를 포함하는 잔기를 확인할 수 있다. 항체 결정 구조의 분석 및 특정화를 기초로 하는 다양한 방법은 본 분야의 숙련자들에게 공지되어 있으며 결정적인 방법은 아니나 CDR 영역을 추측하는 데 사용할 수 있다. 일반적으로 사용되는 방법의 예는 Kabat, Chothia, AbM 및 접촉 정의(contact definitions)를 포함한다.

Kabat 정의는 서열 다양성에 기초를 두며 CDR 영역을 추측하는 데 가장 일반적으로 사용되는 정의이다[Johnson 및 Wu, Nucleic Acids Res, 28 : 214-8(2000) 참조]. Chothia 정의는 구조적 루프 영역의 위치에 기초를 둔다[Chothia 등의 J Mol Biol, 196 : 901-17(1986) ; Chothia 등의 Nature, 342 : 877-83(1989) 참조]. AbM 정의는 Kabat 및 Chothia 정의의 절충안이다. AbM 은 Oxford Molecular Group 에 의해 생성된 항체 구조 모델링에 대한 프로그램에 매우 적합하다[Martin 등의 Proc Natl Acad Sci(USA) 86 : 9268-9272(1989) ; Rees 등의 ABM™, 항체의 가변영역을 모델링하기 위한 컴퓨터 프로그램, 영국 옥스퍼드에 소재하는 Oxford Molecular, Ltd. 에서 입수]. AbM 한벌은 지식 데이타베이스 및 최초의 방법의 조합을 사용하여 1 차 서열결정으로부터 항체의 3 차 구조를 모델링한다. 접촉 정의와 같이 공지된 부가적인 정의는 최근에 도입되어왔다[MacCallum 등의 J Mol Biol, 5 : 732-45(1996) 참조]. 이러한 정의는 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기초를 둔다.

통상적으로, 중쇄 내의 CDR 영역은 일반으로 H1, H2 및 H3 으로 명명되며, 아미노 말단에서 카르복시 말단까지를 순서대로 열거하여 번호를 매겼다. 경쇄 내의 CDR 영역은 일반적으로 L1, L2 및 L3 로 명명되며, 아미노 말단에서 카르복시 말단까지를 순서대로 열거하여 번호를 매겼다.

CDR-H1 의 길이는 대략 10 개 내지 12 개의 잔기로 이루어져 있으며 일반적으로 Chothia 및 AbM 정의에 따라 Cys 다음의 4 개의 잔기로 시작하거나 또는 Kabat 정의에 따라 일반적으로 Cys 다음의 5 개의 잔기로 시작한다. H1 은 일반적으로 Trp 다음에 존재하는데, 일반적으로 Trp-Val 또한 Trp-Ile 또는 Trp-Ala 다음에 존재한다. H1 의 길이는 AbM 정의에 따라 대략 10 개 내지 12 개의 잔기로 이루어져 있으며, 반면에 Chothia 정의에 따라서는 마지막 4 개의 잔기가 제외된다.

CDR-H2 는 일반적으로 Kabat 및 AbM 정의에 따라 H1 말단 다음의 15 개의 잔기로 시작한다. H2 의 앞 잔기는 일반적으로 Leu-Glu-Trp-Ile-Gly 이나 다양한 변이가 존재한다. H2 는 일반적으로 아미노산 서열 Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala 다음에 존재한다. Kabat 정의에 따라, H2 의 길이는 대략 16 개 내지 19 개의 잔기로 이루어져 있으며, AbM 정의에 따라서는 길이는 일반적으로 9 개 내지 12 개의 잔기로 이루어져 있다.

CDR-H3 는 일반적으로 H2 의 말단 다음의 33 개의 잔기로 시작하며, 일반적으로 아미노산 서열(전형적으로 Cys-Ala-Arg) 앞에서 시작한다. H3 는 일반적으로 아미노산 서열-Gly 다음에 존재한다. H3 의 길이는 대략 3 개 내지 25 개의 잔기로 이루어져 있다.

CDR-L1 은 일반적으로 대략 잔기 24 에서 시작하며, 일반적으로 Cys 다음에 시작할 것이다. CDR-L1 다음의 잔기는 항상 Trp 이며, 일반적으로 서열 Trp-Tyr-Gln, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln 또는 Trp-Tyr-Leu 로 시작한다. CDR-L1 의 길이는 대략 10 개 내지 17 개의 잔기로 이루어져 있다. 본 발명의 항체에 대한 징벌적(punitive) CDR-L1 은 정확히 Cys 잔기 다음 15 개의 아미노산이 있으며 그 다음에 Trp-Tyr-Gln 을 갖는 방식을 따른다.

CDR-L2 는 L1 의 말단 후 대략 16 개의 잔기로 시작한다. 일반적으로 잔기 Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys 또는 Ile-Phe 를 따른다. CDR-L2 의 길이는 대략 7 개의 잔기로 이루어져 있다.

CDR-L3 은 일반적으로 L2 의 말단 후 33 개의 잔기로 시작하며 일반적으로 Cys 다음에 존재한다. L3 은 일반적으로 아미노산 서열 Phe-Gly-XXX-Gly 다음에 존재한다. L3 의 길이는 대략 7 개 내지 11 개의 잔기로 이루어져 있다.

항체를 변이시키는 다양한 방법이 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,530,101 호(1996 년 6 월 25 일자 Queen 등의 문헌)에는 인간화 면역글로불린 중쇄 가변영역 외곽구조의 서열이 공여체 면역글로불린 중쇄 가변영역 외곽구조의 서열과 65 % 내지 95 % 가 동일한 인간화 항체를 생산하는 방법이 기재되어 있다. 각각의 인간화 면역글로불린 쇄는 CDRs 에 더하여 분자 모델링으로 예측한 바와 같이 약 3 Å 이내의 아미노산이거나 공여체 면역글로불린 내의 CDR 과 매우 인접한 하나 또는 그 이상의 아미노산과 같은, 결합 친화도에 영향을 미치는 CDR 과 상호작용할 수 있는, 공여체 면역글로불린 외곽구조의 아미노산을 포함한다. 중쇄 및 경쇄는 다양한 위치 기준 중 하나 또는 모두를 사용하여 각각 설계할 수 있다. 가공하지 않은 항체로 혼합되는 경우, 본 발명의 인간화 면역글로불린은 실질적으로 인체에서 비-면역원성이며, 에피토프를 포함하는 단백질 또는 다른 화합물과 같은 항원에 결합하는 공여체 면역글로불린과 실질적으로 동일한 결합력을 지닌다. 또한 1997 년 12 월 2 일자로 공고된 Queen 등의 미국 특허 번호 제 5,693,761 호("Polynucleotides encoding improved humanized immunoglobulins") ; 1997 년 12 월 2 일자로 공고된 Queen 등의 미국 특허 번호 제 5,693,762 호("Humanized Immunoglobulins") ; 1996 년 12 월 17 일자로 공고된 Queen 등의 미국 특허 번호 제 5,585,089 호("Humanized Immunoglobulins")에 관련 방법이 기재되어 있다.

하나의 실시예에서, 1996 년 10 월 15 일자로 공고된 Hoogenboom 등의 미국 특허 번호 제 5,565,332 호("Production of chimeric antibodies-a combinatorial approach")에는 항체, 및 모항체와 유사한 결합 특성을 가지지만 향상된 인체 특성을 지니는 항체 단편을 생산하는 방법이 기재되어 있다. 인간화 항체는 예를 들어, 파지 디스플레이 기술을 사용하는 쇄 셔플링(chain shuffling)으로 수득하며, 목적 항원에 대한 특이적인 비-인간 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 인체 상보적(경쇄 또는 중쇄) 쇄의 가변 도메인 레퍼터리와 혼합한다. 목적 항원에 대한 특이적인 혼성 짝을 확인하고 선택한 짝으로부터 수득한 인체 쇄는 인체 상보적 가변 도메인(중쇄 또는 경쇄)의 레퍼터리와 혼합한다. 다른 실시형태에서, 비-인간 항체의 CDR 성분은 인간 항체의 CDRs 부분의 성분의 레퍼터리와 혼합한다. 결과적으로 생성된 항체 폴리펩티드 이량체의 라이브러리로부터, 하이브리드를 선택한 다음 두 번째 인간화 셔플링 단계에서 사용한다. 선택적으로, 두 번째 단계는 하이브리드가 치료학적 가치를 나타내는 효과적인 인체 특성을 이미 나타낸다면 제외한다. 인체 특성을 향상시키기 위한 변형 방법도 기재되어 있다. Winter, FEBS Leets 430 : 92-92(1998) 를 참조하라.

다른 실시예에서, 2000 년 4 월 25 일자로 공고된 Carter 등의 미국 특허 번호 제 6,054,297 호에는 대응되는 인체 CDR 아미노산 서열을 CDR 아미노산 서열로 치환시키고/치환시키거나 대응되는 인체 FR 아미노산 서열을 FR 아미노산 서열로 치환시켜 인간화 항체를 제조하는 방법이 기재되어 있다.

다른 실시예에서, 1998 년 6 월 16 일자로 공고된 Studnicka 등의 미국 특허 번호 제 5,766,886 호("Modified antibody variable domains")에는 항원 결합 도메인의 원래의 친화도를 감소시키지 않고 이종의 종에 관한 면역원성은 감소되도록 변형시킨 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 확인하는 방법 및 이종의 종에게 투여하기에 유용한 변형된 항체 가변 도메인을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 또한 1999 년 2 월 9 일자로 공고된 Studnicka 의 미국 특허 번호 제 5,869,619 호를 참조하라.

논의된 바와 같이, 본 분야에 공지되어 있는 방법은 일반적으로 항원에 대한 결합 친화도를 향상시키고/향상시키거나 수용체의 항체의 면역원성을 감소시키도록 항체를 변형시키도록 설계되었다. 하나의 연구에 있어서, 인간화 항체는 동원 항원(cognate antigen)에 대한 친화도를 향상시키기 위해 글리코실화 부위를 제거하도록 변형시킬 수 있다[Co 등의 Mol Immunol 30 : 1361-1367(1993) 참조]. "재형성", "과키메라화" 및 "베니어링(veneering)/재표면화(resurfacing)" 와 같은 기술로 뛰어난 치료학적 잠재력을 갖는 인간화 항체를 생산하였다[Vaswami 등의 Annals of Allergy, Asthma, & Immunol 81 : 105(1998) ; Roguska 등의 Prot Engineer 9 : 895-904(1996) 참조]. 또한 항체를 재형성하는 방법이 기재되어 있는 2000 년 6 월 6 일자로 공고된 Hardman 등의 미국 특허 제 6,072,035 호를 참조하라. 이러한 기술이 외부 잔기의 수를 감소시켜 항체 면역원성을 감소시키는 반면에, 항체의 반복적인 투여에 따른 항-유전자형 및 항-동종형 반응은 저해하지 않는다. 면역원성을 감소시키는 대안적인 방법은 Gilliland 등의 J Immunol 62(6) : 3663-71(1999) 에 기재되어 있다.

많은 예에서, 인간화 항체는 항원 결합 능력이 손실된다. 따라서 항체의 결합 친화도를 회복시키도록 원래의(대부분 설치류) 항체에서 수득한 아미노산 중 하나 또는 그 이상을 포함하도록 하기 위해 인간화 항체를 "역 돌연변이" 시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, Saldanha 등의 Mol Immunol 36 : 709-17(1999) 를 참조하라.

비-펩티드 특이 결합제 유사체/단백질 유사체

또한, 안정화된 구조 또는 감소된 생분해를 제공하는 펩티드의 비-펩티드 특이 결합제 유사체도 고려된다. 특이 결합제 펩티드 유사성 유사체는 선택한 저해 펩티드에 기초하여 잔기 중 하나 또는 그 이상을 비펩티드 성분으로 치환시켜 제조할 수 있다. 바람직하게, 비펩티드 성분은 천연 입체구조를 유지하거나 또는 Ang-2 를 인지하고 이에 결합하는 능력을 지니는 바람직한 예를 들어, 생반응성 입체구조를 안정화시키기 위한 펩티드를 제공한다. 하나의 양상에서, 결과적으로 생성된 유사체는 향상된 Ang-2 와의 결합 친화도를 나타낸다. 특이 결합제 펩티드에서 비펩티드 유사성 유사체를 제조하는 방법의 한 예가 Nachman 등의 Regul. Pept. 57 : 359-370(1995) 에 기재되어 있다. 필요에 따라, 본 발명의 특이 결합제 펩티드는 예를 들어, 글리코실화, 아미드화, 카르복실화 또는 인산화하거나, 또는 산 부가염, 아미드, 에스테르(특히, C-말단 에스테르) 및 본 발명의 펩티드의 N-아실 유도체를 생성하여 변형시킬 수 있다. 또한 특이 결합제 펩티드는 또한 다른 성분을 갖는 공유적 또는 비공유적 복합체를 형성하여 펩티드 유도체를 생성하도록 변형시킬 수 있다. 공유-결합된 복합체는 특이 결합제 펩티드를 포함하는 아미노산의 곁사슬 또는 N- 이나 C-말단 상의 작용기에 화학적 성분을 결합시켜 제조할 수 있다.

특히, 특이 결합제 펩티드는 방사성표지, 형광성표지, 효소(예를 들어, 착색반응 또는 형광반응을 촉진시키는 효소), 기질, 고형 매트릭스 또는 담체(예를 들어, 비오틴 또는 아비딘)을 포함하나 이에 한정되지 않는 리포터 그룹과 접합시킬 수 있다. 본 발명은 항체 분자를 포함하는 분자를 제공하며, 상기 분자는 방사성표지, 형광성표지, 효소, 기질, 고형 매트릭스 및 담체 중에서 선택한 리포터를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 표지는 본 분야의 숙련자들에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 비오틴 표지가 특히 고려된다. 이러한 표지의 용도는 본 분야의 숙련자들에게 널리 공지되어 있으며 미국 특허 번호 제 3,817,837 호 ; 미국 특허 번호 제 3,850,752 호 ; 미국 특허 번호 제 3,996,345 호 ; 및 미국 특허 번호 제 4,227,437 호에 기재되어 있다. 이외의 유용한 표지는 방사성반응성표지, 형광성표지 및 화학발광성표지를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 이러한 표지의 용도에 관한 미국 특허 번호 제 3,817,837 호 ; 미국 특허 번호 제 850,752 호 ; 미국 특허 번호 제 3,939,350 호 ; 및 미국 특허 번호 제 3,996,345 호를 참조하라. 본 발명의 모든 펩티드는 상기 표지 중 하나, 둘 또는 그 이상을 포함할 수 있다.

특이 결합제 제조방법

단백질인 본 발명의 특이 결합제는 통상적인 기술에 따라 용액 내 또는 고체 지지 상에서 화학적으로 합성하여 제조할 수 있다. 고체상 합성에 대한 현재 한계는 길이가 약 85-100 개의 아미노산으로 이루어져 있다는 것이다. 그러나, 화학적 합성 기술은 전장의 폴리펩티드를 생성하기 위해 일련의 보다 작은 펩티드를 화학적으로 결합시키는데 사용할 수 있다. 다양한 자동 합성기를 통상적으로 이용할 수 있으며 이는 공지되어 있는 프로토콜에 따라 이용할 수 있다. 예를 들어, 각각을 본원에 참고문헌으로 인용하고 있는 Stewart 및 Young, Solid Phase Epetide Synthesis, 2d. ed., Pierce Chemical Co.(1984) ; Tam 등의 J Am Chem Soc, 105 : 6442(1983) ; Merrifield, Science 232 : 341-347(1986) ; Barany 및 Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1-284 ; Barany 등의 Int. J. Peptide Protein Res., 30, 705-739(1987) ; 및 미국 특허 번호 제 5,424,398 호를 참조하라.

고체상 펩티드 합성 방법은 0.1-1.0 mM 아민/g 중합체를 포함하는 코폴리(스티렌-디비닐벤젠)을 사용한다. 펩티드를 합성하는 이러한 방법은 알파-아미노기의 9-플루오렌일메틸옥시-카르보닐(FMOC) 또는 부틸옥시카르보닐(t-BOC)보호를 사용한다. 두 방법은 단계적인 합성 방법을 포함하며, 이로 인해 펩티드의 C-말단에서 시작하는 각 단계에 아미노산이 첨가된다(Coligan 등의 Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, Unit 9 참조). 화학적 합성으로, 합성 펩티드는 t-BOC 또는 FMOC 아미노산 차단기를 제거하기 위해 탈보호될 수 있으며 감소된 온도에서 산으로 처리(예를 들어, 0 ℃ 에서 약 0.25 내지 약 1 시간 처리한 액체 HF-10% 아니졸로 처리)하여 중합체에서 절단시킬 수 있다. 시약을 증발시킨 후에, 1 % 아세트산 용액으로 중합체에서 특이 결합제 펩티드를 추출한 다음 동결건조시켜 가공하지 않은 물질을 수득하였다. 상기 물질을 일반적으로 용매로서 5 % 아세트산을 사용하는 스판덱스 G-15 상에서 겔 정제와 같은 기술로 정제하였다. 컬럼의 적합한 분획을 동결건조시켜 동종의 특이 결합제 펩티드 또는 펩티드 유도체를 수득하였으며, 이는 아미노산 분석, 박층 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 자외선 흡수분광법, 몰 선광도, 가용성과 같은 표준 기술로 특정화하고 고체상 에드만 분해로 정량하였다.

항-Ang-2 항체, 유도체, 변이체 및 이의 단편 뿐만 아니라 다른 단백질-기저 Ang-2 결합제의 화학적 합성은 비-자연 발생적인 아미노산을 제제로 혼입시킬 수 있도록 한다.

재조합 DNA 기술은 본 발명의 전장의 항체와 본 발명의 거대 단백질 특이 결합제 또는 이의 단편을 제조하는 데 용이한 방법이다. 항체 또는 단편을 코드하는 cDNA 분자는 발현 벡터 내로 삽입할 수 있으며, 그 다음으로는 항체 또는 단편을 생산하기 위해 숙주세포 내로 삽입할 수 있다. 이러한 항체를 코드하는 cDNA 는 코돈 축퇴가 일어나도록 또는 코돈이 다양한 숙주세포에서 바람직하게 사용되도록 "원래의" cDNA(mRNA 에서 번역된 것)를 다양하게 변형시킬 수 있음을 이해하였다.

일반적으로, 항체를 코드하는 DNA 분자는 실시예에 기재되어 있는 방법으로 수득할 수 있다. 원래의 항체 분자에 관한 Fab 분자 또는 CDRs 을 수득하는 것이 요구되는 경우에, 관련 Fabs/CDRs 를 확인하고 클로닝시키기 위해 표준 기술을 사용하여 적합한 라이브러리(파지 디스플레이 라이브러리 ; 림프구 라이브러리 등)를 스크리닝할 수 있다. 스크리닝하기 위해 사용하는 프로브는 원래의 항체의 Fab 부분을 코드하는 전장 또는 절두된 Fab 프로브, 원래의 항체의 Fab 부분 중 하나 또는 그 이상의 CDRs 에 대한 프로브 또는 이외의 적합한 프로브이다. DNA 단편이 프로브로서 사용되는 경우에, 일반적인 혼성화 조건은 Ausubel 등의 문헌[(Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press(1994)] 에 기재되어 있는 바와 같다. 혼성화 후에, 프로브화된 블롯(probed blot)은 프로브 크기, 클로닝시키기 위한 프로브의 예상된 상동성, 스크리닝하고자 하는 라이브러리의 유형 및 스크리닝하고자 하는 클론의 수와 같은 인자에 따라 적합하고 엄격한 조건에서 세척한다. 매우 엄격한 스크리닝 조건의 예는 온도 50-65 ℃ 에서의 0.1 × SSC 및 0.1 % SDS 이다.

다양한 발현 벡터/숙주계는 본 발명의 특이 결합제 폴리펩티드를 코드하는 폴리누클레오티드 분자를 포함하고 발현시키는 데 사용할 수 있다. 이러한 계는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다 : 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환시킨 박테리아와 같은 미생물 ; 효모 발현 벡터로 형질전환시킨 효모 ; 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바쿨로바이러스)로 감염시킨 곤충 세포계 ; 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV ; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 트랜스펙션시키거나 또는 박테리아 발현 벡터(예를 들어, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환시킨 식물 세포계 ; 또는 동물 세포계.

재조합 특이 결합제 단백질 생산에 유용한 포유동물 세포는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다 : VERO 세포, HeLa 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주, COS 세포(예를 들어, COS-7), W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 및 293 세포, 뿐만 아니라 본원에 기재되어 있는 바와 같은 하이브리도마 세포주. 일반적으로 글리코실화되고 활성도를 위해 적절한 재접힘이 요구되는 항체 및 항체 단편과 같은 특이 결합제를 제조하는 데는 포유동물 세포가 바람직하다. 바람직한 포유동물 세포는 CHO 세포, 하이브리도마 세포 및 골수세포를 포함한다.

특이 결합제 단백질을 재조합 발현시키는 몇몇 일반적인 프로토콜은 본원의 하기에 기재되어 있다.

용어 "발현 벡터" 는 DNA(RNA) 서열에서 폴리펩티드를 발현시키는 플라스미드, 파지, 바이러스 또는 벡터를 의미한다. 발현 벡터는 다음의 조합을 포함하는 전사단위를 포함할 수 있다 : (1) 유전자 발현을 조절하는 유전인자, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA 로 전사되어 단백질로 번역되는 결합제를 코드하는 구조 또는 서열 및 (3) 적합한 전사 개시 및 종결 서열. 효모 또는 진핵 발현계에서 사용되는 구조 단위는 바람직하게 숙주세포에서 번역된 단백질이 세포외로 분비될 수 있도록 하는 선도 서열을 포함한다. 선택적으로, 선도 서열 또는 수송 서열이 없는 재조합 특이 결합제 단백질이 발현되는 경우에, 이는 아미노 말단 메티오닌 잔기를 포함한다. 이러한 잔기는 최종 특이 결합제 산물을 수득하기 위해 발현된 재조합 단백질에서 실질적으로 절단되거나 절단되지 않을 수 있다.

예를 들어, 특이 결합제는 제조업자의 지시에 따라 통상적으로 이용가능한 발현계, 예를 들어, Pichia Expression System(미국 캘리포니아 샌 디에고에 소재하는 Invitrogen corporation 에서 입수)을 이용하여 효모에서 재조합 발현시킬 수 있다. 이러한 계는 직접 분비되는 프리-프로-알파 서열을 따르지만, 삽입물의 전사체는 메탄올 유도 알콜 산화효소(AOXI) 프로모터에 의해 유도된다.

예를 들어, 박테리아 및 포유동물 세포 상청액에서 펩티드를 정제하는 데 사용하는 방법으로 효모 성장 배지에서 분비된 특이 결합제 펩티드를 정제하였다.

선택적으로, 특이 결합제 펩티드를 코드하는 cDNA 는 바쿨로바이러스 발현 벡터 pVL1393(미국 캘리포니아 샌 디에고에 소재하는 PharMingen 에서 입수) 내로 클로닝시킬 수 있다. 이러한 벡터는 sF9 단백질-유리 배지를 스포도프테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포로 감염시키고 재조합 단백질을 생산하기 위해 제조업자의 지시(PharMingen 에서 입수)에 따라 사용할 수 있다. 상기 특이 결합제 단백질을 정제하고 헤파린-세파로스 컬럼(Pharmacia 에서 입수)을 이용하여 배지에서 농축시켰다.

선택적으로, 펩티드는 곤충계에서 발현된다. 단백질 발현에 적합한 곤충계는 본 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다. 상기 곤충계 중 하나에서, 오토그라파 캘리포니아 핵 폴리헤드론형성 바이러스(autographa california nuclear polyhedrasis virus, AcNPV)는 스포도프테라 프루지페르다 세포 또는 양배추 유충(trichoplusia larvae)에서 외래 유전자를 발현시키는 벡터로 사용될 수 있다. 특이 결합제 펩티드 코딩 서열은 다각체 유전자(polyhedrin gene)와 같은 바이러스의 중요하지 않은 영역으로 클로닝되고 다각체 프로모터의 조절 하에 위치할 수 있다. 특이 결합제 펩티드의 성공적인 삽입으로 다각체 유전자가 불활성화되며 외피 단백질 코팅이 결여된 재조합 바이러스를 생산하게 될 것이다. 재조합 바이러스는 펩티드를 발현시키는 에스. 프루지페르다(S. frugiperda) 세포 또는 양배추 유충을 감염시키는데 사용될 수 있다[Smith 등의 J Virol 46 : 584(1983) ; Engelhard 등의 Proc Nat Acad Sci(USA) 91 : 3224-7(1994) 참조].

다른 실시예에서, 특이 결합제 펩티드를 코드하는 DNA 서열은 PCR 에 의해 증폭될 수 있고 적절한 벡터, 예를 들어, pGEX-3X(Pharmacia 에서 입수) 내로 클로닝시킬 수 있다. pGEX 벡터는 이 벡터에 의해 코드되는 글루타티온-S-전이효소(GST)를 포함하는 융합 단백질 및 상기 벡터의 클로닝 부위 내로 삽입된 DNA 단편에 의해 코드되는 특이 결합제 단백질을 생산하도록 설계되었다. PCR 에 사용되는 프라이머는 예를 들어, 적절한 절단 부위를 포함하도록 제조할 수 있다. 특이 결합제 융합 성분이 용이하게 발현시키는데에만 사용되거나 목적의 펩티드에 부착시키는 것이 바람직하지 않은 경우에는, 재조합 특이 결합제 융합 단백질을 융합 단백질의 GST 부분으로부터 제거할 수 있다. pGEX-3X/특이 결합제 펩티드 구성물을 E.coli XL-1 블루 세포(미국 캘리포니아 라졸라에 소재하는 Stratagene 에서 입수) 내로 형질전환시키고, 이들 각각의 형질전환체를 분리하고 성장시켰다. 각각의 형질전환체로부터 플라스미드 DNA 는 적합한 정위의 핵산 삽입물을 코드하는 바람직한 특이 결합제의 존재를 확인하기 위해 정제할 수 있으며 자동화된 서열결정기를 사용하여 부분적으로 서열결정할 수 있다.

상기한 재조합 시스템을 이용하여 항-Ang-2 항체 및 이의 단편을 코드하는 폴리누클레오티드를 발현시킴으로써, 생물학적으로 활성화되도록 하기 위해서(다양한 이황화물 결합을 적당하게 형성하기 위해) "되-접힘" 되어야만 하는 항체 또는 이의 단편을 생성하였다. 상기 항체에 대한 일반적인 되접힘 과정을 본 명세서의 실시예 및 하기 부분에서 설명하였다.

박테리아 세포에서 제조된 특이 결합제는 박테리아에서 불용성 봉입체로 생성될 수 있으며, 이를 다음과 같이 정제할 수 있다. 숙주세포를 다음과 같이 원심분리함으로써 희생시킬 수 있다 : 0.15 M NaCl, 10 mM 트리스, pH 8, 1 mM EDTA 에서 세척 : 및 실온에서 15 분 동안 0.1 ㎎/㎖ 의 라이소자임(미국 미주리 세인트 루이스에 소재하는 Sigma 에서 입수)으로 처리. 세포용해물은 고음파 처리함으로써 제거할 수 있으며, 세포 파편은 10 분 동안 12,000 × g 으로 원심분리함으로써 펠렛화할 수 있다. 특이 결합제-함유 펠렛을 pH 8 의 50 mM 트리스 및 10 mM EDTA 에서 재현탁시키고, 50 % 글리세롤 위로 층을 형성시킨 다음 30 분 동안 6000 × g 으로 원심분리하였다. 펠렛을 Mg⁺⁺ 및 Ca⁺⁺ 가 존재하지 않는 표준 인산염완충식염수(PBS)에서 재현탁시킬 수 있다. 특이 결합제는 변성 SDS-폴리아크릴아미드 겔(Sambrook 등의 상기 문헌 참조)에서 재현탁된 펠렛을 분획화함으로써 추가로 정제할 수 있다. 단백질을 명시화하기 위해 0.4 M 의 KCl 에 겔을 담궜으며, 상기 단백질을 잘라내어 SDS 가 결여된 겔-전개 완충용액에서 전기용출시킬 수 있다. 만약 GST/융합 단백질이 박테리아에서 가용성 단백질로 생산된다면, 상기 단백질은 GST 정제 모듈(Pharmacia 에서 입수)을 사용하여 정제할 수 있다.

재조합 단백질을 발현시키기 위한 포유동물 숙주계는 본 분야의 숙련자들에게 널리 공지되어 있다. 숙주세포 균주는 발현된 단백질을 처리하거나 또는 단백질 활성을 공급하는 데 유용한 특정 번역-후 변이를 일으키는 특정한 능력에 따라 선택될 수 있다. 폴리펩티드의 이러한 변이는 다음을 포함하나 이에 한정되지는 않는다 : 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화 및 아실화. CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, 뿐만 아니라 하이브리도마 세포주 등과 같은 상이한 숙주세포들은 후-번역 활성에 따른 특이적인 세포 내 기관 및 특정한 메카니즘을 가지고 있으며, 이는 도입된 외부 단백질의 올바른 변형 및 프로세싱을 확실히 하기 위해 선택될 수 있다.

재조합 단백질을 생성하기 위해 형질전환시킨 세포를 회수하기 위해서 수많은 선별 시스템을 사용할 수 있다. 이러한 선별 시스템은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다 : 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에 있어서, HSV 티미딘 키나제, 히포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자. 또한, 항-대사산물 내성은 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 DHFR ; 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt ; 아미노글리코시드 G418 에 대한 내성을 부여하고 클로르술푸론에 대한 내성을 부여하는 neo ; 및 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro 에 대한 선별을 근거로 하여 사용할 수 있다. 부가적으로, 선택가능한 유전자로는 트립토판을 대신하여 인돌을 사용하는 세포에서는 trpB 를 포함하는 것이 유용하거나 또는 히스티딘을 대신하여 히스티놀을 사용하는 세포에서는 hisD 를 포함하는 것이 유용하다. 형질전환체 식별을 위한 시각 지표를 부여하는 마커로는 안토시아닌, β- 글루쿠로니다제와 이의 기질, GUS 및 루시퍼라제와 이의 기질 및 루시페린을 포함한다.

특이 결합제의 정제 및 되접힘

몇몇 경우에 있어서, 상기한 방법으로 생성된 특이 결합제는 적당한 3 차 구조 내에서 산화되고 "되접힘" 되는 것이 요구되며 생물학적으로 활성화되기 위해서 이황화물 결합을 형성한다. 되접힘은 본 분야에 널리 공지된 수많은 과정을 이용하여 이루어질 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 카오트로픽제가 존재할 경우 일반적으로 7 이상의 pH 에 가용화된 폴리펩티드 제제를 노출시키는 것을 포함한다. 카오트로프(chaotrope)의 선별은 봉입체 가용화를 위해 사용된 선별 방법과 유사하나, 일반적으로 카오트로프는 낮은 농도에서 사용된다. 일반적인 카오트로픽제는 구아니딘이다. 대부분의 경우에 있어서, 되접힙/산화 용액은 또한 시스테인 가교 형성을 위해 발생하는 이황화물 셔플링을 고려한 특정 산화환원 전위를 생성하기 위하여 환원제외에 이의 산화형을 특정 비율로 포함한다. 일반적으로 사용되는 일부 산화환원쌍은 시스테인/시스타민, 글루타티온/디티오비스GSH, 염화구리, 디티오트레이톨 DTT/디티안 DTT 및 2-머캅토에탄올(bME)/디티오-bME 를 포함한다. 많은 사례에 있어서, 되접힘 효율을 증가시키기 위해 공-용매를 사용하였다. 일반적으로 사용된 공용매는 글리세롤, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 및 아르기닌을 포함한다.

본 발명의 특이 결합제 단백질 또는 이의 변이체를 정제하는 것이 바람직하다. 단백질 정제 기술은 본 분야의 숙련자들에게 널리 공지되어 있다. 이러한 기술은 특정 단계에서 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 분획의 초기 분획화를 포함한다. 다른 단백질로부터 분리된 특이 결합제 폴리펩티드를 갖는 목적 폴리펩티드를 부분적으로 정제하거나 또는 완전히 정제하기 위해(또는 균질성을 위해 정제함) 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 순수한 특이 결합제 펩티드 제조에 특히 적합한 분석적 방법으로는 이온-교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피 ; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 ; 등전 집중법이 있다. 펩티드를 정제하는데 특히 효율적인 방법으로는 속성 단백질 액체 크로마토그래피 또는 HPLC 도 있다.

본 발명의 특정 양상은 코드된 특이 결합제 단백질 또는 펩티드의 정제 및 특정 실시형태에서의 실질적인 정제와 관련이 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "정제된 특이 결합제 단백질 또는 펩티드" 는 다른 성분으로부터 분리가능한 조성물을 의미하며, 여기에서 특이 결합제 단백질 또는 펩티드는 자연적으로-수득가능한 상태에 적합한 정도로 정제되었다. 그러므로, 정제된 특이 결합제 단백질 또는 펩티드는 또한 자연적으로 발생할 수 있는 환경에서는 존재하지 않는 특이 결합제 단백질 또는 펩티드를 의미한다.

일반적으로, "정제된" 은 다양한 다른 성분들을 제거하기 위해 분획화시킨 특이 결합제 조성물을 나타내며, 이러한 조성물은 실질적으로 발현된 생물학적 활성을 보유한다. 용어 "실질적으로 정제된" 을 사용할 경우, 상기 용어는 조성물이 약 50 %, 약 60 %, 약 70 %, 약 80 %, 약 90 %, 약 95 % 또는 그 이상의 단백질로 구성되는 것과 같이, 특이 결합제 단백질 또는 펩티드가 조성물의 주요 성분을 형성하는 특이 결합제 조성물을 나타낸다.

특이 결합제의 정제도를 측정하는 다양한 방법들은 본 명세서의 견지에서 본 분야의 숙련자들에게 널리 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 활성 분획의 특이 결합 활성도 측정 또는 SDS/PAGE 분석에 의한 분획 내에서의 특이 결합제 폴리펩티드의 양을 검정하는 것을 포함한다. 특이 결합제 분획의 순도를 검정하는 바람직한 방법은 분획의 결합 활성도를 측정하고 초기 추출물의 결합 활성도와 비교하여 정제 정도를 추정하는 방법이다[본원에서는 "-접힘 정제 수(-fold purification number)" 로 측정됨]. 물론 결합 활성도의 양을 나타내기 위해 사용된 실제 단위는 정제에 따라 선택된 특정 검정 기술 및 발현된 특이 결합제 단백질 또는 펩티드가 검출가능한 결합 활성도를 나타내는지의 여부에 따라 다르다.

특이 결합제 단백질을 정제하는데 적합한 다양한 기술들은 본 분야의 숙련자들에게 널리 공지되어 있다. 상기 정제 방법은 예를 들어 다음을 포함한다 ; 황산암모늄, PEG, 항체(면역침전) 등에 의한 침전 또는 열변성에 의한 침전, 그런 다음 원심분리에 의한 침전 ; 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 단백질-A-세파로스), 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 수산기인회석 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 단계 ; 등전 집중법 ; 겔 전기영동 ; 및 상기 기술 및 다른 기술을 조합한 방법. 본 분야에 일반적으로 공지된 바와 같이, 다양한 정제 단계는 수행하는 순서는 바뀔 수 있거나 또는 특정 단계를 생략할 수 있으며, 이는 여전히 실질적으로 정제된 특이 결합제를 제조하는 적절한 방법이다.

본 발명의 특이 결합제는 이를 정제하는 대부분의 단계에서 항상 제공되는 일반적인 필요 조건은 아니다. 게다가, 실질적으로 좀 더 적은 특이 결합체 산물은 특정 실시형태에 있어 실용성이 있을 것으로 기대된다. 결합시 소수의 정제 단계를 사용하여 부분 정제하거나 또는 일반적으로 동일한 정제 계획을 갖는 다른 정제 단계를 이용하여 부분 정제하였다. 예를 들어, HPLC 장치를 사용하여 수행한 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피는 일반적으로 낮은 압력의 크로마토그래피 시스템을 이용하는 동일한 기술보다 좀 더 큰 "-접힘" 정제를 일으킬 것으로 기대된다. 상대적으로 좀 더 낮은 등급의 정제를 나타내는 방법은 특이 결합제 단백질 산물의 총 회수율 또는 발현된 특이 결합제 단백질의 결합 활성도 유지에 이점이 있다.

폴리펩티드의 이동은 상이한 조건의 SDS/PAGE 에 의해 때때로 상당히 다양할 수 있다고 공지되어 있다[Capaldi 등의 Biochem Biophys＼Res Comm, 76 : 425(1977) 참조]. 그러므로, 상이한 전기영동 조건 하에서, 정제되었거나 또는 부분적으로 정제된 특이 결합제 발현 산물의 명백한 분자량은 다양할 것으로 기대된다.

결합 검정

일반적으로 면역학적 결합 검정은 검체 표적 항원에 특이적으로 결합하고 종종 검체 표적 항원을 고정시키기 위한 포획제를 사용한다. 포획제는 검체에 특이적으로 결합하는 성분이다. 본 발명의 실시형태에서, 포획제는 Ang-2 에 특이적으로 결합하는 항체이거나 또는 이의 단편이다. 이러한 면역학적 결합 검정은 본 분야에 널리 공지되어 있다[미국 뉴욕에 소재하는 Academic Press, Inc. 의 Asai, ed., Methods in Cell Biology, Vol. 37, Antibodies in Cell Biology(1993) 참조].

종종, 면역학적 결합 검정은 포획제 및 항원으로 형성된 결합 복합체의 존재를 신호화하는 표지제를 사용한다. 표지제는 결합 복합체를 포함하는 분자 중 하나일 수 있다 ; 즉, 표지된 특이 결합제이거나 또는 표지된 항-특이 결합제 항체일 수 있다. 선택적으로, 표지제는 결합 복합체에 결합하는 3 차 분자이며, 일반적으로는 또다른 항체일 수 있다. 예를 들어, 표지제는 표지를 함유한 항-특이 결합제 항체일 수 있다. 결합 복합체에 특이적인 2 차 항체는 표지가 결여되어있을 수 있으나 2 차 항체가 구성요소로 속하는 항체류에 특이적인 4 차 분자에 의해 결합될 수 있다. 예를 들어, 2 차 항체를 비오틴과 같은 검출가능한 성분으로 변형시킨 다음 효소-표지된 스트렙타비딘과 같은 4 차 분자로 결합시킬 수 있다. 단백질 A 또는 단백질 G 와 같은 면역글로불린 불변영역에 특이적으로 결합할 수 있는 다른 단백질을 표지제로 사용하였다. 상기 결합 단백질은 스트렙토코커스 박테리아 세포벽의 일반적인 성분이며 이는 다양한 종의 면역글로불린 불변영역과 함께 강한 비-면역원성 반응성을 나타낸다[Akerstrom, J Immunol, 135 : 2589-2542(1985) ; 및 Chaubert, Mod Pathol, 10 : 585-591(1997) 참조].

전체 검정에 걸쳐서, 항온 및/또는 세척 단계는 각각의 시약을 조합한 후에 요구된다. 항온 단계는 약 5 초부터 수 시간까지 다양할 수 있으며, 바람직하게는 약 5 분 내지 약 24 시간이다. 그러나, 항온 시간은 검정형식, 검체, 용액의 부피 및 농도 등에 의해 좌우된다. 비록 검정은 온도의 전 범위에서 실행될 수 있을지라도 일반적으로는 실온에서 실행된다.

A. 비-경쟁적 결합 검정

면역학적 결합 검정은 비-경쟁적인 방식일 수 있다. 상기 검정은 직접 측정된 포획된 검체의 양을 측정하여 수행한다. 예를 들어, 바람직한 "샌드위치" 검정에 있어서, 포획제(항체)를 고정화시킨 고체 기질에 직접 결합시킬 수 있다. 그런 다음, 상기 고정화된 항체를 시험 시료에 존재하는 항원에 포획(결합)시켰다. 그러므로, 그 다음, 고정화된 단백질을 표지를 갖는 2 차 항체와 같은 표지제에 결합시켰다. 다른 바람직한 "샌드위치" 검정에 있어서, 2 차 항체에는 표지가 없으나, 이는 2 차 항체가 유도된 항체 종에 특이적인 표지된 항체에 의해 결합될 수 있다. 또한 2 차 항체를 비오틴과 같은 검출가능한 성분으로 변형시킬 수 있으며, 상기 검출가능한 성분에는 스트렙타비딘과 같은 3 차 표지된 분자가 특이적으로 결합할 수 있다[본원에서 참고문헌으로 인용한, 미국 뉴욕에 소재하는 Clod Spring Harbor Laboratory 의 Harlow 및 Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Ch 14(1988) 참조].

B. 경쟁적 결합 검정

면역학적 결합 검정은 경쟁적인 방식일 수 있다. 시료에 존재하는 검체에 의해 포획제로부터 경쟁적으로 떨어지거나 또는 치환되는 검체의 첨가된 양을 측정함으로써 시료에 존재하는 검체의 양을 간접적으로 측정하였다. 바람직한 경쟁적 결합 검정에 있어서, 일반적으로 표지된 검체의 공지된 양을 시료에 첨가한 다음, 그 시료를 항체(포획제)와 접촉시켰다. 항체에 결합된 표지된 검체의 양은 시료에 존재하는 검체의 농도에 반비례한다(상기 문헌 Harlow 및 Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Ch 14, pp. 579-583 참조).

다른 바람직한 경쟁적 결합 검정에 있어서, 항체를 고체 기질 상에 고정시켰다. 항체에 결합된 단백질 양은 단백질/항체 복합체에 존재하는 단백질 양을 측정하거나 또는 선택적으로 남아있는 비복합된 단백질 양을 측정함으로써 결정할 수 있다. 표지된 단백질을 공급함으로써 단백질의 양을 측정하였다. 상기 문헌 Harlow 및 Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Ch14 를 참조하라.

또다른 바람직한 경쟁적 결합 검정에 있어서, 합텐 저해를 활용하였다. 본원에서는 공지된 검체를 고체 기질 상에 고정시켰다. 공지된 양의 항체를 시료에 첨가하고, 그 시료를 고정시킨 검체와 접촉시켰다. 고정화된 검체에 결합된 항체의 양은 시료에 존재하는 검체의 양에 반비례한다. 용액에 남아있는 분획이나 또는 고정화된 항체 분획을 검출함으로써 고정화된 항체의 양을 측정하였다. 항체를 표지하여 직접 검출하거나 또는 상기한 바와 같이 항체에 특이적으로 결합하는 표지된 성분을 연속적으로 첨가함으로써 간접적으로 검출하였다.

C. 경쟁적 결합 검정의 활용

본 분야의 숙련자들은 본 발명의 특이 결합제에 의해 인지되는 효소 복합체 또는 단백질 복합체가 요구되는 단백질이고 교차-반응하는 분자는 아니라는 것을 결정하거나 또는 항체가 항원에 특이적이지만 관련되지 않은 항원에는 결합하지 않는다는 것을 결정하기 위해 교차-반응성 결정에 대하여 경쟁적 결합 검정을 사용하였다. 상기 유형의 검정에 있어서, 항원을 고체 지지물에 고정화시키고 공지되지 않은 단백질 혼합물을 검정에 첨가하여 고정화시킨 단백질에 특이 결합제의 결합을 완성시켰다. 또한 완성된 분자는 항원에 관련되지 않는 하나 또는 그 이상의 항원을 결합시켰다. 고정화시킨 항원에 대한 특이결합제와 경쟁적으로 결합하는 단백질의 능력과 고체 지지물에 고정시킨 동일한 단백질에 의한 결합력을 비교하여 단백질 혼합물의 교차-반응성을 측정하였다.

D. 다른 결합 검정

본 발명은 또한 시료에 존재하는 Ang-2 를 검출하거나 또는 정량하기 위한 웨스턴 블롯 방법을 제공한다. 일반적으로 상기 기술은 분자량을 근거로 하는 겔 전기영동으로 시료 단백질을 분리하고, 니트로셀룰로스 여과기, 나일론 여과기 또는 나일론 유래 여과기와 같은 적당한 고체 지지물로 운반함을 포함한다. 시료를 Ang-2 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편과 함께 항온시켜 결과적으로 생성된 복합물을 검출하였다. 상기 항체는 직접 표지하거나 또는 항체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 선택적으로 검출하였다.

Ang-2 수용체에 결합하는 Ang-2 를 방해하는 Ang-2 특이 결합제를 검출하기 위한 결합 검정을 본원의 실시예에 기술하였다.

진단학적 검정

본 발명의 항체 또는 이의 단편은 Ang-2 또는 서브유닛이 발현되는 특징이 있는 질환 또는 증상을 진단하거나 또는 Ang-2 유도인자, 이의 단편, 효현제 또는 Ang-2 활성 저해제로 치료되는 환자를 관찰하기 위한 검정에 유용하다. Ang-2 에 대한 진단학적 검정은 인체 체액 또는 세포나 조직의 추출물에서 Ang-2 를 검출하기 위한 표지 및 특이 결합제를 사용하는 방법을 포함한다. 본 발명의 특이 결합제는 변형시키거나 또는 변형시키지 않고 사용할 수 있다. 바람직한 진단학적 검정에 있어서, 특이 결합제는 예를 들어, 표지 또는 리포터 분자를 부착시킴으로써 표지하였다. 다양한 표지 및 리포터 분자가 공지되어 있으며, 이들 중 일부를 이미 본원에서 기술하였다. 특히, 본 발명은 인체 질환을 진단하는데 유용하다.

각각의 단백질에 특이적인 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 사용하는 Ang-2 단백질을 측정하기 위한 다양한 프로토콜들이 본 분야에 공지되어 있다. 예로는 효소면역측정법(ELISA), 방사선면역측정법(RIA) 및 형광세포 분석분리(FACS : fluorescence activated cell sorting) 를 포함한다. Ang-2 상의 2 개의 비-간섭 에피토프에 반응하는 모노클로날 항체를 사용하는 2 개-부위의 모노클로날-기저 면역 검정이 바람직하나, 경쟁적 결합 검정을 이용하였다. 상기 검정은 예를 들어, Maddox 등의 J Exp Med, 158 : 1211(1983) 에 기재되어 있다.

진단에 대한 근거를 제공하기 위해서, 인체 Ang-2 발현에 대한 정상값 및 기준값을 일반적으로 확립시켰다. 이러한 결정은 본 분야에 널리 공지된 복합체 형성에 적합한 조건 하에서, Ang-2 에 대한 특이 결합제, 예를 들어, 항체를 갖는 정상적인 피실험자(바람직하게는 사람)의 세포 추출물 또는 체액을 결합시킴으로써 달성할 수 있다. 복합체 형성물의 기준양은 공지된 양의 Ang-2 단백질에 결합하는 특이 결합제를 질환 및 대조 시료 둘 다와 비교함으로써 정량할 수 있다. 그런 다음, 정상적인 시료로부터 수득한 기준값을 질환에 의해 잠재적으로 영향을 받는 피실험자의 시료로부터 수득한 값과 비교할 수 있다. 기준값 및 피실험자의 값 사이의 편차는 질환 상태에 있어 Ang-2 에 대한 역할을 제시한다.

진단학적으로 응용하기 위해서, 본 발명의 특정 실시형태의 특이 결합제를 일반적으로 검출가능한 성분으로 표지하였다. 검출가능한 성분은 직접 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 발생할 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 성분은 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S 또는 ¹²⁵I 와 같은 방사성동위원소, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린과 같은 형광 또는 화학발광 화합물 ; 또는 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소이다[Bayer 등의 Meth Enz, 184 : 138-163(1990) 참조].

질환

본 발명은 인체 질환 및 병리학적 증상을 치료하는데 유용한 Ang-2 에 결합하는 특이 결합제를 제공한다. Ang-2 결합 활성 또는 다른 세포 내 활성을 조절하는 제제는 이들의 치료학적 효과를 증가시키거나 또는 잠재적 부작용을 감소시키기 위해 다른 치료제와 함께 병용하여 사용할 수 있다.

하나의 양상에서, 본 발명은 세포 내의 Ang-2 의 활성도 수준이 정도를 벗어나거나 또는 바람직하지 않은 수준을 나타내는 증상 및 질환을 치료하는데 유용한 방법 및 시약을 제공한다. 이러한 질환은 암 및 과형성, 건선, 접촉피부염, 면역성 장애 및 불임증과 같은 과증식성 증상을 포함한다.

본 발명은 또한 Ang-2 활성도를 저해하거나 또는 감소시키는 유효량의 특이 결합제를 동물에게 투여하여, 사람을 포함하는 동물의 암을 치료하는 방법을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 생물학적 시스템에 있어서 세포내 증식, 침입성 및 전이 과정을 포함하는 암세포 성장을 저해하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 암 세포 성장의 저해제로서 본 발명의 화합물의 사용을 포함한다. 바람직하게, 포유동물과 같은 살아있는 동물의 암세포 성장, 침입성, 전이 또는 종양 발병을 저해하거나 또는 감소시키기 위해 본 방법을 사용하였다. 본 발명의 방법은 또한 암세포 성장에 영향을 미치는 화합물을 확인할 뿐만 아니라 예를 들어, 암세포의 성장 및 이의 특성을 검정하는 검정 시스템에 사용하기 위해 쉽게 변화시킬 수 있다.

본 발명의 방법으로 치료가능한 암은 바람직하게 포유동물에서 발병한다. 포유동물은 예를 들어 다음을 포함한다 : 개 및 고양이와 같은 애완동물이나 동물 뿐만 아니라 사람 및 다른 영장류, 랫, 마우스 및 토끼와 같은 실험용 동물 및 말, 돼지, 양 및 소와 같은 가축을 포함한다.

종양 및 신생물(neoplasm)은 세포의 증식이 억제되지 않으며 진행성인 조직 세포의 성장을 포함한다. 일부는 이러한 성장이 양성이나, 나머지는 악성종양이라 명명되며 이는 유기체의 사멸을 일으킨다. 악성 신생물 또는 암은 공격적인 세포내 증식을 나타내는 것에 더하여, 이들이 주위 조직에 침입하고 전이된다는 점에서 양성 증식과 구별된다. 더욱이, 악성 신생물은 서로 및 이들의 주위 조직에 관련된 이들의 유기화 및 분화를 현저하게 소실시키는(현저하게 탈분화시키는) 특징이 있다. 상기 특성을 또는 "퇴형성" 으로 명명하였다.

본 발명에 의해 치료가능한 신생물은 또한 암종 및 육종과 같은 충실성종양을 포함한다. 암종은 주위 세포에 침윤(침투)하고 전이를 유발시키는 상피세포로부터 유래된 이들의 악성 신생물을 포함한다. 선암은 선조직으로부터 유래된 암종이거나 또는 인식가능한 선조직을 형성한다. 다른 광범위한 범주 또는 암은 육종을 포함하는데, 이는 배의 결합조직과 같은 원섬유 물질이거나 또는 동질의 물질에 삽입된 이들 세포의 종양이다. 본 발명은 또한 일반적으로 종양 덩어리로는 존재하지 않으나 맥관계 또는 림프세망내피성계에 분포하는 백혈병, 림프종 및 다른 암을 포함하는 골수양 또는 림프계 암 치료에 용이하다.

본 발명으로 치료할 수 있는 암 또는 종양 세포의 유형으로는 예를 들어, 다음을 포함한다 : ACTH-생성종양, 급성림프구성백혈병, 급성비림프구성백혈병, 부신피질암, 방광암, 뇌암, 유방암, 경부암, 만성림프구성백혈병, 만성골수성백혈병, 결장직장암, 피부의 T-세포 백혈병, 자궁내막암, 식도암, 유윙육종, 담낭암, 모양세포성백혈병, 두암, 경부암, 호치킨림프종, 카포시육종, 신장암, 간암, 폐암(소 및 비-소세포), 악성복막삼출액, 악성흉막삼출액, 흑색종, 중피종, 다발성골수종, 신경아세포종, 신경교종, 비-호지킨림프종, 골육종, 난소암, 난소(배아세포)암, 췌장암, 음경암, 전립선암, 망막아종, 피부암, 연조직육종, 편평상피암, 위암, 정소암, 갑상선암, 영양막신생물, 자궁암, 질암, 외음문암 및 빌름스종양.

본 발명은 특히 실험적으로 정의된 특정 유형의 암 치료에 관한 것이다. 이들의 실례가 되는 치료에 있어서, 기준이 되는 상태의 생체내 및 생체외 모델을 사용하였다. 생체내의 치료 양생법으로 효능이 있을 것으로 기대되는 제제를 식별하기 위해 이러한 방법들을 사용하였다. 그러나, 본 발명의 방법은 상기 종양 유형을 치료하는데 한정되지 않으며, 어떤 다른 기관계로부터 유래된 모든 충실성종양을 치료하는데 사용할 수 있을 것으로 이해된다. Ang-2 발현 또는 활성에 관련된 암의 침습력이나 또는 전이는 특히 본 발명에 의해 억제될 수 있거나 또는 역행으로 유도될 수 있다.

본 발명은 또한 항체와 같은 본 발명의 특이 결합제와 모든 통상적인 화학요법제와 같은 또다른 항-암 화학요법제를 병용하여 실행시킬 수 있다. 특이 결합제와 다른 제제를 병용하여 사용하는 것은 화합요법 프로토콜을 향상시킬 수 있다. 수많은 화학요법 프로토콜들은 본 발명의 방법에 통합가능한 바와 같이 숙련된 진료의사의 견지에서 그것 자체로 부여할 수 있다. 알킬화제, 항대사물질, 호르몬 및 길항물질, 방사성동위원소 뿐만 아니라 천연산물을 포함한 화학요법제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 독소루빈 및 다른 안트라사이클린 유사물질과 같은 항생제, 시클로포스파미드와 같은 질소 겨자, 5-플루오로우라실과 같은 피리미딘 유사물질, 시스플라틴, 히드록시우레아, 탁솔 및 이의 천연유도체와 합성유도체 등과 함께 투여할 수 있다. 또다른 예로서, 생식선자극호르몬-의존 세포 및 생식선자극호르몬-독립 세포를 포함하는 유방의 선암과 같은 혼합된 종양의 경우에 있어서, 상기 화합물은 류프롤라이드 또는 고세레린(LH-RH 의 합성 펩티드 유사체)과 함께 투여할 수 있다. 다른 항신생물 프로토콜은 예를 들어, 외과 수술, 방사선 등과 같은 또다른 치료 양식과 함께 테트라시클린 화합물의 사용을 포함하며, 이를 또한 본원에서는 "보조적 항신생물성 양식(adjunct antineoplastic modalities)" 으로서 언급하였다. 그러므로, 본 발명의 방법은 부작용을 감소시키고 효능을 증가시키는 이점이 있는 이러한 보통의 양생법과 함께 이용할 수 있다.

그러므로, 본 발명은 충실성종양 및 백혈병을 포함한 다양한 암 치료에 유용한 조성물 및 방법을 제공한다. 치료되는 암의 유형으로는 다음을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다 : 유방, 전립선 및 결장의 선암 ; 모든 형태의 폐의 기관지암 ; 골수양 ; 흑색종 ; 간암 ; 신경아세포종 ; 유두종 ; 아푸도마 ; 분리종 ; 새종 ; 악성카르시노이드증후군 ; 카르시노이드 심장질환 ; 암종[예를 들어, 왈커트(Walker), 기저세포, 기저편평성, 브라운-피얼스(Brown-Pearce), 관, 에리히(Ehrlich)종양, 크렙스 2, 메르켈세포, 점소양, 폐의 비-소 세포, 연맥귀리형세포(oat cell), 유두상, 경성암, 세기관지, 기관지원성, 편평상피 및 천이성(transitional)세포] ; 조직구성장애(histiocytic disorders) ; 백혈병 ; 악성조직구증 ; 호지킨병 ; 면역증식성소세포폐암(immunoproliferative small lung cell carcinoma) ; 비-호지킨림프종 ; 형질세포종 ; 세망내피증 ; 흑색종 ; 연골아세포증 ; 연골종 ; 연골육종 ; 섬유종 ; 섬유육종 ; 거대세포종양 ; 조직구종 ; 지방종 ; 지방육증 ; 중피종 ; 점액종 ; 점액육종 ; 골종 ; 골육종 ; 척삭종 ; 두개인두종 ; 미분화배세포종 ; 과오종(hamartoma) ; 간엽종 ; 중신종(mesonephroma) ; 근육종 ; 법랑질아세포종 ; 백악질종 ; 치아종 ; 기형종 ; 흉선종 ; 및 통풍아세포종양. 더욱이, 또한 다음 유형의 암도 치료될 수 있다 : 선종 ; 담관종 ; 콜레스테린종 ; 시클린드로마(cyclindroma) ; 낭종암 ; 낭선종 ; 과립막세포종 ; 남녀아세포종 ; 간암 ; 한선종 ; 도세포종 ; 라이디히세포종 ; 유두종 ; 세르톨리세포종 ; 난포막세포종 ; 평활근종 ; 평활근육종 ; 근아세포종 ; 근종 ; 근육종 ; 횡문근종 ; 횡문근육종 ; 상의종 ; 신경절신경종 ; 신경교종 ; 수아종 ; 수막종 ; 신경섬유초종 ; 신경모세포종 ; 신경상피종 ; 신경섬유종 ; 신경종 ; 부신경절종 ; 비크롬친화성부신경절종 ; 혈관각화종 ; 호산구증가를 수반하는 혈관림프관양증식 ; 맥관종경화증(angioma sclerosing) ; 혈관종 ; 사구맥관종 ; 혈관내피종 ; 혈관종 ; 혈관외피세포종 ; 혈관육종 ; 림프관종 ; 림프관근종 ; 림프관육종 ; 송과체종 ; 암육종 ; 연골육종 ; 엽상낭상육종 ; 섬유육종 ; 혈관육종 ; 평활근육종 ; 백혈육종 ; 지방육종 ; 림프관육종 ; 근육종 ; 점액육종 ; 난소암 ; 횡문근육종 ; 육종 ; 신생물 ; 신경섬유종증 ; 및 경부형성장애증.

본 발명의 또다른 양상은 건선 및 접촉피부염 또는 다른 과잉증식질환을 포함하는 피부의 과잉증식증상을 예방 및/또는 치료하기 위해 본 발명의 물질 및 방법을 사용하는 것에 관한 것이다. 건선 및 접촉피부염을 앓고 있는 환자의 이러한 병변 내에서 Ang-2 활성이 증가됨을 증명하였다[Ogoshi 등의 J. Inv. Dermatol, 110 : 818-23(1998) 참조]. 바람직하게, Ang-2 에 대해 특이적인 특이 결합제는 이러한 임상증후를 발현하는 사람을 치료하기 위해 다른 약학적 제제와 함께 사용하였다. 결합제는 특히 본원에 기술된 투여 경로 및 본 분야의 숙련자들에게 널리 공지된 다른 투여 경로를 통해 다양한 담체를 이용하여 운반할 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 여성 생식주기 동안의 기능부전성 맥관증식(자궁내막의 미소혈관계 증식을 포함함)과 관련된 자궁내막증, 자궁섬유종 및 다른 증상과 같은 여성 생식도의 장애/질환 뿐만 아니라 혈관형성과 관련된 다양한 망막증(당뇨병성망막증 및 연령-관련 황반변성) 치료를 포함한다.

본 발명의 또다른 양상은 대뇌동정맥기형(AVMs), 위장점막의 손상 및 치유, 소화궤양을 앓은 경력이 있는 환자의 위십이지장점막의 궤양화를 포함하고, 발작으로 인한 허혈, 간질환에서의 와이드(wide) 스펙트럼의 폐맥관장애 및 비간성 문맥압항진증을 앓고 있는 환자의 문맥압항진증을 포함한 비정상적인 맥관 성장 치료를 포함한다.

본 발명의 또다른 양상은 본 발명에 의해 제공된 조성물 및 방법을 사용하여 암을 예방하는 것에 관한 것이다. 이러한 시약은 Ang-2 에 대한 특이 결합제를 포함한다.

약학적 조성물

Ang-2 특이 결합제의 약학적 조성물은 본 발명의 범주 내에 있다. 항체를 포함하는 약학적 조성물은 예를 들어, 2001 년 1 월 9 일자로 공고된 Lam 등의 미국 특허 번호 제 6,171,586 호에 상세히 기술되어 있다. 이러한 조성물은 약학적으로 용인가능한 제제를 갖는 혼합제로, 본원에서 기술하고 있는 바와 같은 치료학적 및 예방학적 유효량의 항체 또는 단편, 변이체, 이의 유도체 또는 이의 융합물과 같은 특이 결합제를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 약학적 조성물은 약학적으로 용인가능한 제제를 갖는 혼합제로 Ang-2 의 적어도 하나의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 조절하는 특이 결합제 길항물질을 포함한다. 일반적으로, 특이 결합제는 동물에게 투여하기 위해 충분히 정제하였다.

약학적 조성물은 예를 들어, 조성물의 pH, 삼투 몰농도, 점도, 정화도, 색, 등장, 향, 살균, 안정성, 용해 속도 또는 방출 속도, 흡착 또는 투과를 변형, 유지 또는 보존하기 위한 제형화 물질을 포함한다. 적합한 제형화 물질로는 다음을 포함하나 이에 한정되지는 않는다 : 아미노산 (예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신) ; 항균제 ; 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 황산나트륨 또는 황화수소나트륨) ; 완충용액(예를 들어, 붕산염, 중탄산염, 트리스-HCl, 시트르산염, 인산염 및 다른 유기산) ; 증량제(예를 들어, 만니톨 또는 글리신) ; 킬레이트제[예를 들어, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA : ethylenediamine tetraacetic acid)] ; 착화제(카페인, 폴리비닐피롤리돈, β-시클로덱스트린 또는 히드록시프로필-β-시클로덱스트린) ; 충전제 ; 단당류 ; 이당류 및 다른 탄수화물(예를 들어, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린) ; 단백질(예를 들어, 혈청 알부민, 겔라틴 또는 면역글로불린) ; 색소 ; 향미료 및 희석제 ; 유화제 ; 친수성 중합체(예를 들어, 폴리비닐피롤리돈) ; 저분자량 폴리펩티드 ; 염-형성 반대이온(예를 들어, 나트륨) ; 방부제(예를 들어, 염화벤잘코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소) ; 용매(예를 들어, 글리세린, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜) ; 당알콜(예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨) ; 현탁화제 ; 계면활성제 또는 습윤제(예를 들어, 플루로닉, PEG, 소르비탄에스테르, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80 과 같은 폴리소르베이트, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤 및 틸옥사팔) ; 안정성 증강제(수크로스 또는 소르비톨) ; 긴장도 증강제[알칼리 금속 할로겐 화합물(바람직하게, 나트륨, 염화칼륨, 만니톨 소르비톨)] ; 수송 부형제 ; 희석제 ; 보형약 ; 및/또는 약학적 아쥬반트(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990 참조).

최적의 약학적 조성물은 예를 들어, 의도된 투여 경로, 수송 형식 및 요구되는 투여량에 따라 본 분야의 숙련자들에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences 를 참조하라. 상기 조성물은 물리적 상태, 안정성, 특이 결합제의 생체내 방출 속도 및 생체내 청소율에 영향을 미친다.

약학적 조성물에 있어서, 1 차 부형제 또는 담체는 사실상 수성이거나 또는 비-수성이다. 예를 들어, 적합한 부형제 또는 담체는 비경구적으로 투여하기 위한 조성물에 보충가능한 보통의 다른 물질인 주사용 증류수, 생리식염수 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 중성인 완충생리식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 생리식염수는 부형제의 부가적인 예이다. 다른 일반적인 약학적 조성물은 약 pH 7.0-8.5 의 트리스 완충용액 또는 약 pH 4.0-5.5 의 아세트산염 완충용액을 포함하며, 이는 추가로 소르비톨 또는 적합한 이의 치환체를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 결합제 조성물을 바람직한 순도를 갖는 선택 조성물과 최적의 제형화제를 혼합함으로써(상기 문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences 참조) 동결건조된 케이크나 또는 수용액 형태로 저장하기 위해 제조하였다. 더욱이, 결합제 산물을 수크로스와 같은 적합한 보형약을 사용하여 동결건조물로서 제형화하였다.

약학적 조성물은 비경구적 투여를 위해 선택할 수 있다. 선택적으로, 조성물은 경구, 이(耳), 안, 직장 또는 질과 같은 소장 투여나 또는 흡입을 위해 선택하였다. 이러한 약학적으로 용인가능한 조성물의 제조는 본 분야의 기술 내에 있다.

제형화 성분은 투여 부위에 용인가능한 농도로 존재한다. 예를 들어, 생리학적 pH 또는 약간 낮은 pH, 일반적으로 약 pH 5 내지 약 pH 8 의 범위로 조성물을 유지하기 위해서 완충용액을 사용하였다.

비경구적 투여를 의도할 경우, 본 발명에서 사용하는 치료학적 조성물은 약학적으로 용인가능한 부형제 내에 요구되는 특이 결합제를 포함하는 비경구적으로 용인가능한 수용액인 피로겐-유리 형태이다. 비경구적 주사에 특히 적합한 부형제는 결합제를 멸균시킨 등장액으로서 제형화하는 멸균증류수이며, 이는 적당하게 보존된다. 또다른 제제는 데포제 주사(depot injection)를 통해 수송된 다음 산물의 조절방출(controlled release) 및 서방성(sustained)을 제공하는 주사가능한 미소립자, 생-부식(bio-erodible) 입자, 고분자화합물(폴리락틱산 및 폴리글리코릭산), 비드 또는 리포솜과 같은 제제와 함께 요구되는 분자의 제형을 포함할 수 있다. 히알루론산 또한 사용할 수 있으며, 이는 순환시 지속시간을 증가시키는 효과가 있다. 바람직한 분자량을 투여하기 위한 다른 적합한 수단으로는 이식가능한 약물 수송장치를 포함한다.

또다른 양상에서, 비경구 투여에 적합한 약학적 제형은 수용액, 바람직하게는 행크스 용액, 링거액 또는 생리완충식염수와 같은 생리적합성완충용액 내에 제형화하였다. 수성의 주사 현탁제는 카르복시메틸나트륨 셀룰로스, 소르비톨 또는 텍스트란과 같은 현탁액의 점도를 증가시키는 기질을 포함한다. 게다가, 활성 화합물의 현탁액을 적합한 유성의 주사 현탁제로서 제조하였다. 적당한 친유성 용매 또는 부형제는 참기름과 같은 지방유, 또는 올레산에틸, 트리글리세리드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 비-지질 다양이온성 아미노 중합체 또한 수송을 위해 사용하였다. 선택적으로, 현탁제는 또한 화합물의 용해도를 증가시키고 고도로 농축된 용액의 제조를 고려한 적당한 안정제 또는 제제를 포함한다.

또다른 실시형태에서, 흡입용 약학적 조성물을 제조하였다. 예를 들어, 흡입을 위해 결합제를 건조 분말로 제형화하였다. 또한, 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 흡입 용제를 에어로졸 수송을 위해 추진제와 함께 제형화하였다. 또다른 실시형태에서, 용액을 분무하였다. 더욱이, 폐투여는 화학적으로 변형된 단백질의 폐수송을 기재한 PCT 출원 번호 제 PCT/US94/001875 호에 기재되어 있다.

또한, 특정 제형은 경구 투여될 수 있음을 예상할 수 있다. 본 발명의 실시형태에서, 상기 방식으로 투여되는 결합제 분자는 정제 및 캡슐과 같은 고형의 약제학적 제형과의 혼합시에 일반적으로 사용되는 담체와 함께 제형화되거나 또는 담체 없이 제형화될 수 있다. 예를 들어, 생체내이용효율이 최대화되고 예비-전신적(pre-systemic) 분해가 최소화될 경우에 위장관에 이르러 제형의 활성 부분을 방출하도록 캡슐을 제조할 수 있다. 결합제(binding agent) 분자의 흡수를 촉진시키기 위한 부가적인 제제를 포함할 수 있다. 희석제, 향미제, 저융점 왁스, 식물유, 윤활제, 현탁화제, 붕해제 정제 및 결합제(binder)를 또한 사용할 수 있다.

또한, 경구 투여용 약학적 조성물을 본 분야에 널리 공지된 약학적으로 용인가능한 담체를 사용하여 경구 투여하기에 적합한 투여량으로 제형화할 수 있다. 환자가 섭취할 수 있도록 하기 위해 이러한 담체는 약학적 조성물이 정제, 환제, 당의정(dragee), 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액 등으로 제형화되는 것을 가능하게 한다.

정제 또는 당의정 코어(cores)를 수득하기 위해, 유효 화합물과 고형의 보형약을 혼합시키고 결과적으로 생성된 과립의 혼합물을 처리(선택적으로, 분쇄 후)하여 경구용 약학적 제제를 수득할 수 있다. 바람직하다면, 적당한 좌제를 첨가할 수 있다. 적당한 보형약으로는 다음을 포함한다 : 락토스, 수크로스, 만니톨 및 소르비톨을 포함한 당과 같은 탄수화물 또는 단백질 충전물 ; 옥수수, 밀, 쌀, 감자 또는 다른 식물으로부터의 녹말 ; 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스 또는 카르복시메틸셀룰로스 나트륨과 같은 셀룰로스 ; 아라비아검 및 트래거캔스 검을 포함하는 검 ; 및 겔라틴 및 콜라겐과 같은 단백질. 바람직하다면, 교차결합된 폴리비닐피롤리돈, 한천 및 알긴산이나 또는 알긴산나트륨과 같은 알긴산의 염과 같은 분해제 또는 가용화제를 첨가할 수 있다.

당의정 코어는 농축된 당액(sugar solution)과 같은 적당한 코팅물과 함께 사용될 수 있으며, 이는 또한 아라비아검, 활석, 폴리비닐피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌글리콜, 및/또는 이산화티타늄, 래커 용액, 및 적당한 유기용매나 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있다. 산물을 식별하기 위해 또는 투여량과 같은 유효 화합물의 양을 나타내기 위해 염료 및 색소를 정제 또는 당의정의 코팅물에 첨가할 수 있다.

경구적으로 사용될 수 있는 약학적 제제는 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 코팅물 및 겔라틴으로 만들어진 연질의 밀봉된 캡슐 뿐만 아니라 겔라틴으로 만들어진 푸시-핏(push-fit) 캡슐을 또한 포함한다. 푸시-핏 캡슐은 락토스 또는 녹말과 같은 접합제, 또는 충전제, 활석 또는 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제 및 선택적으로 안정화제와 혼합된 유효성분을 포함할 수 있다. 연질의 캡슐에 있어서, 유효 화합물을 안정화제와 함께 또는 안정화제 없이 지방유, 액제 또는 액체 폴리에틸렌글리콜과 같은 적당한 액제에 용해시키거나 또는 현탁시킬 수 있다.

또다른 약학적 조성물은 정제로 제조하기에 적합한 비-독성 보형약을 갖는 혼합물에 유효량의 결합제를 포함할 수 있다. 멸균수, 또는 다른 적합한 부형제에 정제를 용해시킴으로써, 용제를 단위 약제학적 제형으로 제조할 수 있다. 적합한 보형약으로는 다음을 포함하나 이로 한정되지는 않는다 : 탄산칼슘, 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 락토스 또는 인산칼슘과 같은 비활성 희석제 ; 녹말, 겔라틴 또는 아카시아와 같은 결합제 ; 또는 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 활석과 같은 윤활제.

부가적인 약학적 조성물이 서방성 제형 또는 조절방출 제형 내에 결합제 분자를 함유한 제형을 포함함은 본 분야의 숙련자들에게 명백할 것이다. 리포솜 담체, 생-부식 미세입자 또는 다공성 비드 및 데포제(depot) 주사와 같은 다양한 다른 서방성 또는 조절방출 수단을 제형화하는 기술은 또한 본 분야의 숙련자들에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 약학적 조성물을 수송하기 위한 다공성인 중합체성 미세입자의 조절방출을 기재하고 있는 특허 번호 제 PCT/US93/00829 호를 참조하라. 서방성 제형의 부가적인 예로는 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐과 같은 구체화된 약품 형태(form of shaped articles)의 반투과성 중합체 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스로는 폴리에스테르, 히드로겔, 폴리락티드(미국 특허 번호 제 3,773,919 호 및 유럽 특허 번호 제 EP 58,481 호를 참조), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루탐산염의 공중합체[Sidman 등의 Biopolymers 22 : 547-556 (1983)을 참조], 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴산염)[Langer 등의 J Biomed Master Res, 15 167-277(1981) 참조] 및 [Langer 등의 Chem Tech, 12 : 98-105(1982) 참조], 에틸렌비닐아세트산염(Langer 등의 상기 문헌 참조) 또는 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산(유럽 특허 번호 제 EP 133,988 호를 참조)을 포함한다. 또한 서방성 조성물은 본 분야에 공지된 몇몇의 모든 방법으로 제조할 수 있는 리포솜을 포함한다. 예를 들어, Eppstein 등의 Proc Natl Acad Sci(미국), 82 : 3688-3692 (1985) ; 유럽 특허 번호 제 EP 36,676 호 ; 유럽 특허 번호 제 EP 88,046 호 ; 유럽 특허 번호 제 EP 143,949 호를 참조하라.

일반적으로 생체내로 투여하기 위해 사용되는 약학적 조성물은 반드시 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통하여 여과시킴으로써 달성될 수 있다. 조성물을 동결건조시킬 경우에는 동결건조 및 재구성 전에 또는 후에 상기 방법을 이용하여 멸균 처리할 수 있다. 비경구 투여를 위한 조성물은 동결건조된 형태 또는 용액으로 저장될 수 있다. 게다가, 일반적으로 비경구적 조성물을 멸균 접근 포트(sterile access port)를 구비한 용기, 예를 들어 피하 주사바늘로 찔러넣을 수 있는 스토퍼(stopper)를 구비한 바이알 또는 정맥내 용액 백(bag) 내에 보관하였다.

일단 약학적 조성물이 제형화되면, 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체, 또는 탈수소화되었거나 또는 동결건조된 분말로 멸균 바이알에 저장될 수 있다. 이러한 제형을 사용하기 쉬운 형태로 저장하거나 또는 투여하기에 앞서 재구성이 요구되는 형태(예를 들어, 동결건조된 형태)로 저장할 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 단일-투여량 투여 단위를 제공하기 위한 키트에 관한 것이다. 본 키트는 각각 건조된 단백질을 함유하는 1 차 용기 및 수성의 제형을 함유하는 2 차 용기 둘 다를 포함한다. 단실 및 다실 프리필드(pre-filled) 주사기[예를 들어, 액체 주사기 및 라이오주사기(lyosyringes)]를 함유하는 키트 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.

치료학적으로 이용되는 약학적 조성물의 유효량은 예를 들어, 치료 상황 및 대상에 좌우될 수 있다. 그러므로, 치료하는데 적절한 투여량 수준은 수송된 분자, 결합제 분자가 사용된 징후, 투여 경로 및 환자의 크기(체중, 체표면 또는 기관 크기)와 조건(연령 및 전반적인 건강 상태)에 따라 부분적으로 다양하다는 것을 본 분야에 숙련자들은 인지할 수 있다. 따라서, 임상의는 최적의 치료 효과를 얻기 위해 투여량을 적정하고 투여 경로를 변경할 수 있다. 일반적인 투여량의 범위는 상기 언급한 인자에 따라 약 0.1 ㎎/kg 내지 최대 약 100 ㎎/kg 또는 그 이상일 수 있다. 다른 실시형태에서, 투여량 범위는 0.1 ㎎/kg 내지 최대 약 100 ㎎/kg ; 또는 1 ㎎/kg 내지 최대 약 100 ㎎/kg ; 또는 5 ㎎/kg 내지 최대 약 100 ㎎/kg 일 수 있다.

모든 화합물에 있어서, 치료학적 유효량은 마우스, 랫, 토끼, 개 또는 돼지와 같은 동물 모델, 또는 세포 배양 검정에서 최초로 평가될 수 있다. 또한 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 평가하기 위해 동물 모델을 사용할 수 있다. 그 다음에, 인체에 투여하기에 유용한 투여량 및 경로를 결정하기 위해 이러한 정보를 이용할 수 있다.

치료를 필요로 하는 피실험자에 관련된 요소에 비추어서 정확한 투여량을 결정할 수 있다. 충분한 농도의 유효 화합물을 제공하거나 또는 바람직한 효과를 유지하기 위해 투여량 및 투여를 조절하였다. 고려될 수 있는 요소로는 질병 상태의 위중성, 피실험자의 전반적인 건강 상태, 연령, 몸무게 및 성별, 투여의 시간 및 횟수, 약물 조합, 반응 민감도 및 치료에 대한 반응을 포함한다. 장기간 작동하는 약학적 조성물을 특정 제형의 반감기 및 제거 속도에 따라 3 내지 4 일마다, 매 주마다, 또는 2 주마다 투여할 수 있다.

투여 횟수는 사용된 제형에서의 결합제 분자의 약물동력학 파라미터에 따라 좌우될 수 있다. 일반적으로, 바람직한 효과를 달성하는 투여량에 이를 때까지 조성물을 투여하였다. 그러므로, 조성물을 단일 투여하거나 또는 시간에 걸쳐 다중 투여하거나(동일한 또는 상이한 농도/투여량), 또는 지속적으로 주입하여 투여할 수 있다. 더욱이, 적절한 투여량의 개선은 통상적으로 이루어진다. 적절한 투여량을 적절한 투여-반응 데이터를 사용하여 확인할 수 있다.

약학적 조성물의 투여 경로는 예를 들어 다음을 포함하는 공지된 방법과 일치한다 : 경구 ; 정맥내, 복강내, 뇌내(뇌실질내 : intra-parenchymal), 뇌실내, 근육내, 안내, 동맥내, 문맥내, 병변내 경로, 골수내, 경막내, 심실내, 경피내, 피하내, 복강내, 비강내, 소화관내, 국소, 설하, 요도, 질 또는 직장 기관으로 주사 ; 서방성 시스템 ; 또는 이식 장치를 이용한 주사. 요구될 경우, 조성물을 농축괴 주사 또는 연속적으로 주입하여 투여하거나, 또는 이식 장치로 투여할 수 있다.

선택적으로 또는 부가적으로, 바람직한 분자가 흡수되거나 또는 캡슐화된 막, 스폰지 또는 다른 적절한 물질의 이식을 통하여 국소적으로 조성물을 투여할 수 있다. 이식 장치를 사용할 경우, 장치를 모든 적절한 조직 또는 기관에 이식할 수 있으며, 요구되는 분자를 확산, 지효성(timed-release) 농축괴로 수송시키거나 또는 연속적으로 투여하여 수송시킬 수 있다.

몇몇 경우에 있어서, 탈체(ex vivo) 방식으로 약학적 조성물을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 예에 있어서, 환자로부터 수득한 세포, 조직 또는 기관을 약학적 조성물에 노출시킨 후에 상기 세포, 조직 및/또는 기관을 환자에게 다시 이식하였다.

다른 경우에 있어서, 폴리펩티드를 발현시키고 분비시키기 위하여, 폴리펩티드인 본 발명의 결합제는 본원에 기재된 방법을 이용하여 유전적으로 설계된(engineered) 특정 세포에 이식하여 수송될 수 있다. 이러한 세포는 동물 또는 인체 세포일 수 있으며, 자가유래(autologous), 이종유래(heterologous) 또는 이종발생성(xenogeneic)일 수 있다. 선택적으로, 세포는 불사화될 수 있다. 면역반응의 기회를 감소시키고 주위 조직의 침윤을 피하기 위해 세포를 캡슐화할 수 있다. 캡슐화 물질은 일반적으로 생적합성, 반투과성 중합체의 봉입물 또는 막이며, 이는 단백질 산물의 방출을 가능하게 하나 환자의 면역계 또는 주위 조직으로부터의 다른 유해 인자에 의한 세포의 파괴를 예방한다.

병용 치료요법

본 발명의 특이 결합제는 Ang-2 이상을 치료하는데 있어서 다른 치료제와 함께 병용하여 사용할 수 있다. 이러한 다른 치료제는 예를 들어, 방사선 치료제, 화학요법제 및 하기한 바와 같은 표적 치료제를 포함한다. 부가적인 병용 치료제는 하기에 구체적으로 기재하였으며, 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.

따라서, 본 발명은 각각 의약용으로 적합한 섭생에 따라 투여되는, 하나 또는 그 이상의 부가적으로 적합한 제제와 병용하여 동일한 환자에게 투여되는 하나 또는 그 이상의 특이 결합제를 투여하는 것을 포함한다. 이는 본 발명의 특이 결합제 및 하나 또는 그 이상의 적합한 제제를 동시 투여하는 것을 포함한다. 본원에 사용한 바와 같이, 용어 "동시에 투여하는" 및 "동시 투여"는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 특이 결합제 및 하나 또는 그 이상의 부가적으로 적합한 제제를 실질적으로 동시에 투여하는 것을 포함한다.

본원에 사용한 바와 같이, 용어 "비-동시" 투여는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 선택적인 특이 결합제 및 하나 또는 그 이상의 부가적으로 적합한 제제를 어떠한 순서로든 투여 시간이 겹치거나 또는 겹쳐지지 않는 다른 시간 대에 투여하는 것을 포함한다. 이는 복합된 성분으로 순차적으로 치료(예를 들어, 전치료, 후-치료 또는 중복 치료)하는 것, 뿐만 아니라 약물을 교체하거나 또는 하나의 성분은 장-기간 투여하고 다른 성분들은 간헐적으로 투여하는 섭생을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 성분들은 동일한 조성물 또는 개별적인 조성물로 투여할 수 있으며, 동일하거나 상이한 경로로 투여할 수 있다.

특정 실시형태에서, 병용 치료요법은 적어도 하나의 부가적인 항-맥관형성제와 병용되는, Ang-2 와 결합할 수 있는 특이 결합제를 포함한다. 제제는 생체외에서 합성적으로 제조된 화학적 조성물, 항체, 항원 결합 영역, 방사선 핵종, 및 이의 복합물 및 결합물을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 제제는 효현제, 길항물질, 알로스테릭 조절인자 또는 독소로서 작용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 제제는 이의 표적을 저해하거나 자극(예를 들어, 수용체 또는 효소의 활성화 또는 저해)하여, 세포 사멸을 촉진시키거나 세포 성장을 억제하도록 작용할 수 있다.

화학요법 치료는 예를 들어 다음의 알킬화제를 포함하는 항-종양제를 사용할 수 있다 : 메클로르에타민, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란 및 클로람부실과 같은 머스터드 질소 ; 카르무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU) 및 세무스틴(메틸-CCNU)과 같은 니트로소요소(nitrosoureas) ; 트리에틸렌멜라민(TEM), 트리에틸렌, 티오포스포르아미드(티오테파), 헥사메틸멜라민(HMM, 알트레타민)과 같은 에틸렌이민/메틸멜라민 ; 부설판과 같은 술폰산알킬 ; 다카르바진(DTIC)과 같은 트리아진 ; 메토트렉세이트 및 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체, 5-플루오로우라실, 플루오로데옥시우리딘, 젬시타빈, 사이토신 아라비노사이드(AraC, 사이타라빈), 5-아자사이티딘 및 2,2'-디플루오로데옥시사이티딘과 같은 피리미딘 유사체 및 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 아자타이오프린, 2'-데옥시코포르마이신(펜토스타틴), 에리트로히드록시노닐아데닌(EHNA), 인산플루다리빈 및 2-클로로데옥시아데노신(클라드리빈, 2-CdA)과 같은 퓨린 유사체 ; 파클리탁셀, 빈블라스틴(VLB), 빈크리스틴 및 비노렐빈을 포함하는 빈카 알칼로이드, 탁소테르(taxotere), 에스트라무스틴 및 인산 에스트라무스틴과 같은 항유사분열 약물을 포함하는 천연 산물 ; 에토포사이드 및 테니포사이드와 같은 피포도필로톡신(ppipodophylotoxins) ; 악티모마이신 D, 다우노마이신(루비도마이신), 독소루비신, 마이토잔트론, 이다루비신, 블레오마이신, 플리카마이신(미스라마이신), 마이토마이신 C 및 악티노마이신과 같은 항생제 ; L-아스파라기나제와 같은 효소 ; 인터페론-알파, IL-2, G-CSF 및 GM-CSF 와 같은 생체반응조절물질 ; 시스플라틴 및 카보플라틴과 같은 백금 배위결합 복합체, 마이토잔트론과 같은 안드라세네디온(anthracenedione), 수산화요소와 같은 치환된 요소, N-메틸히드라진(MIH) 및 프로카르바진을 포함하는 메틸히드라진 유도체, 마이토테인(o,p'-DDD) 및 아미노글루테티미드와 같은 부신피질 억제제를 포함하는 이종 혼합제(miscellaneous agent) ; 프레드니손 및 등가물과 같은 부신피질스테로이드 길항물질, 덱사메타손 및 아미노글루테티미드를 포함하는 호르몬 및 길항물질 ; 히드록시프로제스테론 카프로에이트, 메드록시프로제스테론 아세테이트 및 메제스트롤 아세테이트와 같은 프로게스틴 ; 디에틸스틸베스트롤 및 에티닐 에스트라디올 등가물과 같은 에스트로겐 ; 타목시펜과 같은 항에스트로겐 ; 프로피온산테스토스테론 및 플루옥시메스테론/등가물을 포함하는 안드로겐 ; 플루타미드, 생식선 자극 호르몬-방출 호르몬 유사체 및 류프롤리드와 같은 항안드로겐 ; 및 플루타미드와 같은 비-스테로이드성 항안드로겐.

Ang-2 에 대한 특이 결합제와 함께 투여될 수 있는 암 치료는 본원에 기재된 바와 같은 표적 치료를 또한 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표적 치료의 예는 치료학적 항체를 사용하는 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일반적인 치료학적 항체는 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : 마우스 항체, 마우스-인체 키메라 항체, CDR-이식 항체, 인간화 항체, 완전 인간 항체 및 항체 라이브러리를 스크리닝하여 선별된 항체를 포함하지만 이로 제한되지 않는 합성 항체. 일반적인 항체는 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : 세포 표면 단백질 Her2, CDC20, CDC33, 점액-유사 당단백질 및 종양 세포에 존재하는 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 결합하는 항체, 및 이러한 단백질이 나타난 종양 세포에서 세포증식 억제 효과 및/또는 세포독성 효과를 임의로 유도하는 항체. 일반적인 항체는 유방암 및 다른 형태의 암을 치료하기 위해 사용할 수 있는 HERCEPTIN^™(트라스투주맵), 및 비-호지킨 림프종 및 다른 형태의 암을 치료하기 위해 사용할 수 있는 RITUXAN^™(리툭시맵), ZEVALIN^™(이브리투모맵 티우세탄), GLEEVEC^™ 및 LYMPHOCIDE^™(에프라투주맵)을 또한 포함한다. 특정한 항체의 예는 또한 다음을 포함한다 : ERBITUX^™(IMC-C225) ; IRESSA^™[에르티놀립(ertinolib)] ; BEXXAR^™(요드 131 토시투모맵) ; KDR(키나제 도메인 수용체) 저해제 ; 항-VEGF 항체 및 길항제(예를 들어, AVASTIN^™ 및 VEGAF-TRAP) ; 항-VEGF 수용체 항체 및 항원 결합 영역 ; 항-Ang-1 항체 및 항원 결합 영역 ; Tie-2, 다른 Ang-1 및 Ang-2 수용체에 대한 항체 ; Tie-2 리간드 ; Tie-2 키나제 저해제에 대한 항체 ; 및 Campath^®(알렘투주맵). 특정 실시형태에서, 암 치료제는 TRAIL(TNF 수용체 세포사멸-유도 리간드)과 같은 TNF-관련 폴리펩티드를 포함하지만 이로 제한되지 않는, 종양 세포에서 선택적으로 세포사멸을 유도하는 폴리펩티드이다.

특정 실시형태에서, 적절한 암 치료제는 항-맥관형성으로 공지된 제제이다. 특정 이러한 제제는 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : IL-8 ; Campath^™, B-FGF ; FGF 길항제 ; Tek 길항제(모든 목적에 대해 각각이 본원의 참고문헌으로 인용된 Cerretti 등의., 미국 공개 번호 제 2003/0162712 호 ; Cerretti 등의 미국 특허 번호 제 6,413,932 호 및 Cerretti 등의 미국 특허 번호 제 6,521,424 호) ; 항-TWEAK 제제(항체 및 항원 결합 영역을 포함하지만 이로 제한되지 않음) ; 가용성 TWEAK 수용체 길항제(Wiley, 미국 특허 번호 제 6,727,225 호) ; 인테그린의 리간드에 대한 인테그린의 결합을 중화시키기 위한 ADAM 디스인테그린(distintegrin)(또는 이의 도메인)(Fanslow 등의 미국 공개 번호 제 2002/0042368 호) ; 항-eph 수용체 및 항-에프린(ephrin) 항체 ; 항원 결합 영역 또는 길항물질(미국 특허 번호 제 5,981,245 호 ; 제 5,728,813 호 ; 제 5,969,110 호 ; 제 6,596,852 호 ; 제 6,232,447 호 ; 제 6,057,124 호 및 이의 대응 특허) ; AVASTIN^™ 또는 VEGF-TRAP^™ 와 같은, 본원에 기재되어 있는 바와 같은 항-VEGF 제제(예를 들어, VEGF 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 영역, 또는 가용성 VEGF 수용체 또는 이의 리간드 결합 영역) 및 항-VEGF 수용체 제제(예를 들어, 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 영역), 패니투무맵(panitumumab), IRESSA^™[게피티니브(gefitinib)], TARCEVA^™[에르로티니브(erlotinib)], 항-Ang-1 및 항-Ang-2 제제(예를 들어, 이에 또는 이의 수용체, 예를 들어 Tie-2/TEK 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 영역)와 같은 EGFR 저해성 제제(예를 들어, 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 영역) 및 간세포 성장 인자의 길항제(HGF, 분산 인자로 또한 널리 공지됨)와 같은 항-Tie-2-키나제 저해성 제제(예를 들어, 성장 인자에 특이적으로 결합하고 성장 인자의 활성을 저해하는 항체 또는 항원 결합 영역), 및 이의 수용체 “c-met”에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 영역 ; 항-PDGF-BB 길항제 ; PDGF-BB 리간드에 대한 항체 및 항원 결합 영역 ; 및 PDGFR 키나제 저해제.

특정 실시형태에서, 암 치료제는 맥관형성 저해제이다. 특정한 이러한 저해제는 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : SD-7784(미국에 소재하는 Pfizer 에서 입수) ; 실렌지티드(독일에 소재하는 Merck KGaA 에서 입수, 제 EPO 770622 호) ; 페캡타니브 옥타소듐(미국에 소재하는 Gilead Sciences 에서 입수) ; 알파스타틴(영국에 소재하는 BioActa 에서 입수) ; M-PGA(미국에 소재하는 Celgene 에서 입수, 미국 제 5712291 호) ; 일로마스타트(ilomastate)(미국에 소재하는 Arriva 에서 입수, 미국 제 5892112 호) ; 세마사니브(semaxanib)(미국에 소재하는 Pfiza 에서 입수, 미국 제 5792783 호) ; 바타라니브(스위스에 소재하는 Novartis 에서 입수) ; 2-메톡시에스트라디올(미국에 소재하는 EntreMed 에서 입수) ; TLC ELL-12(아일랜드에 소재하는 Elan 에서 입수) ; 아네코르타브 아세테이트(미국에 소재하는 Alcon 에서 입수) ; 알파-D148 Mab(미국에 소재하는 Amgen 에서 입수) ; CEP-7055(미국에 소재하는 Cephalon 에서 입수) ; 항-Vn Mab(네덜란드에 소재하는 Crucell 에서 입수), DAC:항맥관형성(캐나다에 소재하는 ConjuChem 에서 입수) ; 안지오시딘(Angiocidin)(미국에 소재하는 InKine Pharmaceutical 에서 입수) ; KM-2550(일본에 소재하는 Kyowa Hakko 에서 입수) ; SU-0879(미국에 소재하는 Pfizer 에서 입수) ; CGP-79787(스위스에 소재하는 Novartis 에서 입수, 유럽 제 970070 호) ; ARGENT 테크놀로지(미국에 소재하는 Ariad 에서 입수) ; YIGSR-스텔스(Stealth)(미국에 소재하는 Johnson & Johnson 에서 입수) ; 피브리노겐-E 단편(영국에 소재하는 BioActa 에서 입수) ; 맥관형성 저해제(영국에 소재하는 Trigen 에서 입수) ; TBC-1635(미국에 소재하는 Encysive Pharmaceuticals 에서 입수) ; SC-236(미국에 소재하는 Pfizer 에서 입수) ; ABT-567(미국에 소재하는 Abbott 에서 입수) ; 메타스타틴(Metastatin)(미국에 소재하는 EntreMed 에서 입수) ; 맥관형성 저해제(스웨덴에 소재하는 Tripep 에서 입수) ; 마스핀(일본에 소재하는 Sosei 에서 입수) ; 2-메톡시에스트라디올(미국에 소재하는 Oncology Sciences Corporations 에서 입수) ; ER-68203-00(미국에 소재하는 IVAX 에서 입수) ; 베네핀(미국에 소재하는 Lane Labs 에서 입수) ; Tz-93(일본에 소재하는 Tsumura 에서 입수) ; TAN-1120(일본에 소재하는 Takeda 에서 입수) ; FR-111142(일본에 소재하는 Fujisawa 에서 입수, 일본 제 02233610 호) ; 혈소판 인자 4(미국에 소재하는 RepliGen 에서 입수, 유럽 제 407122 호) ; 혈관 내피 성장 인자 길항제(덴마크에 소재하는 Borean 에서 입수) ; 암 치료(미국에 소재하는 University of South Carolina 에서 입수) ; 베바시주맵(pINN)(미국에 소재하는 Genentech 에서 입수) ; 맥관형성 저해제(미국에 소재하는 SUGEN 에서 입수) ; XL 784(미국에 소재하는 Exelixis 에서 입수) ; XL 647(미국에 소재하는 Exelixis 에서 입수) ; MAb, 알파5베타3 인테그린, 제 2 의 발생(미국에 소재하는 Applied Molecular Evolution 에서 입수 및 미국에 소재하는 Medlmmune 에서 입수) ; 유전자 치료 망막병증(영국에 소재하는 Oxford BioMedica 에서 입수) ; 엔자스타우린 히드로클로라이드(USAN)(미국에 소재하는 Lilly 에서 입수) ; CEP 7055(미국에 소재하는 Cephalon 에서 입수 및 프랑스에 소재하는 Sanofi-Synthelabo 에서 입수) ; BC 1(이탈리아에 소재하는 Genoa Institute of Cancer Research 에서 입수) ; 맥관형성 저해제(오스트레일리아에 소재하는 Alchemia 에서 입수) ; VEGF 길항물질(미국에 소재하는 Regeneron 에서 입수) ; rBPI 21 및 BPI-유도 항맥관형성(미국에 소재하는 XOMA 에서 입수) ; PI 88(오스트레일리아에 소재하는 Progen 에서 입수) ; 실렌지타이드(pINN)(독일에 소재하는 Merck KGaA 에서 입수, 독일에 소재하는 Munich Technical University 에서 입수, 미국에 소재하는 Scripps Clinic and Research Foundation 에서 입수) ; 세툭시맵(INN)(프랑스에 소재하는 Aventis 에서 입수) ; AVE 8062(일본에 소재하는 Ajinomoto 에서 입수) ; AS 1404(뉴질랜드에 소재하는 Cancer Research Laboratory 에서 입수) ; SG 292(미국에 소재하는 Telios 에서 입수) ; 엔도스타딘(미국에 소재하는 Boston Childrens Hospital 에서 입수) ; ATN 161(미국에 소재하는 Attenuon 에서 입수) ; 안지오스타틴(미국에 소재하는 Boston Childrens Hospital 에서 입수) ; 2-메톡시에스트라디올(미국에 소재하는 Boston Childrens Hospital 에서 입수) ; ZD 6474(영국에 소재하는 AstraZeneca 에서 입수) ; ZD 6126(영국에 소재하는 Angiogene Pharmaceuticals 에서 입수) ; PPI 2458(미국에 소재하는 Praecis 에 입수) ; AZD 9935(영국에 소재하는 AstraZeneca 에서 입수) ; AZD 2171(영국에 소재하는 AstraZeneca 에서 입수) ; 바타라니브(pINN)(뉴질랜드에 소재하는 Novartis 에서 입수 및 독일에 소재하는 Schering AG 에서 입수) ; 조직 인자 경로 저해제(미국에 소재하는 EntreMed 에서 입수) ; 페캡타니브(Pinn)(미국에 소재하는 Gilead Sciences 에서 입수) ; 잔토리졸(한국에 소재하는 Yonsei University 에서 입수) ; 백신, 유전자-기저, VEGF-2(미국에 소재하는 Scripps Clinic and Research Foundation 에서 입수) ; SPV5.2(캐나다에 소재하는 Supratek 에서 입수) ; SDX 103(미국 산디에이고에 소재하는 University of California 에서 입수) ; PX 478(미국에 소재하는 ProlX 에서 입수) ; 메타스타틴(미국에 소재하는 EntreMed 에서 입수) ; 트로포닌 I(미국에 소재하는 Harvard University 에서 입수) ; SU 6668(미국에 소재하는 SUGEN 에서 입수) ; OXI 4503(미국에 소재하는 OXiGENE 에서 입수) ; o-구아니딘(미국에 소재하는 Dimensional Pharmaceuticals 에서 입수) ; 모투포라민 C(motuporamine C)(캐나다에 소재하는 British Columbia University 에서 입수) ; CDP 791(영국에 소재하는 Celltech Group 에서 입수) ; 아티프리모드(atiprimod)(pINN)(영국에 소재하는 GlaxoSmithKline 에서 입수) ; E 7820(일본에 소재하는 Eisai 에서 입수) ; CYC 381(미국에 소재하는 Harvard University 에서 입수) ; AE 941(캐나다에 소재하는 Aeterna 에서 입수) ; 백신, 맥관형성(미국에 소재하는 EntreMed 에서 입수) ; 유로키나제 플라스미노겐 활성화 저해제(미국에 소재하는 Dendreon 에서 입수) ; 오글루파니드(oglufanide)(pINN)(미국에 소재하는 Melmotte 에서 입수) ; HIF-1 알파(alfa) 저해제(영국에 소재하는 Xenova 에서 입수) ; CEP 5214(미국에 소재하는 Cephalon 에서 입수) ; BAY RES 2622(독일에 소재하는 Bayer 에서 입수) ; 안지오시딘(미국에 소재하는 InKine 에서 입수) ; A6(미국에 소재하는 Angstrom 에서 입수) ; KR 31372(한국에 소재하는 Korea Research Institute of Chemical Technology 에서 입수) ; GW 2286(영국에 소재하는 GlaxoSmithKline 에서 입수) ; EHT 0101(프랑스에 소재하는 ExonHit 에서 입수) ; CP 868596(미국에 소재하는 Pfizer 에서 입수) ; CP 564959(미국에 OSI 에서 입수) ; CP 547632(미국에 소재하는 Pfizer 에서 입수) ; 786034(영국에 소재하는 GlaxoSmithKline 에서 입수) ; KRN 633(일본에 소재하는 Kirin Brewery 에서 입수) ; 안내(intraocular)의 약물 전달 시스템, 2-메톡시에스트라디올(미국에 소재하는 EntreMed 에서 입수) ; 안지네스(anginex)(네덜란드에 소재하는 Maastricht University 에서 입수 및 미국에 소재하는 Minnesota University 에서 입수) ; ABT 510(미국에 소재하는 Abbott 에서 입수) ; AAL 993(스위스에 소재하는 Novartis 에서 입수) ; VEGI(미국에 소재하는 ProteomTech 에서 입수) ; 종양 괴사 인자-알파 저해제(미국에 소재하는 National Institute on Aging 에서 입수) ; SU 11248(미국에 소재하는 Pfizer 에서 입수 및 미국에 소재하는 SUGEN 에서 입수) ; ABT 518(미국에 소재하는 Abbott 에서 입수) ; YH16(중국에 소재하는 Yantai Rongchang 에서 입수) ; S-3APG(미국에 소재하는 Boston Childrens Hospital 에서 입수 및 미국에 소재하는 EntreMed 에서 입수) ; MAb, KDR(미국에 소재하는 ImClone Systems 에서 입수) ; MAb, 알파5 베타1(미국에 소재하는 Protein Design 에서 입수) ; KDR 키나제 저해제(영국에 소재하는 Celltech Group 에서 입수 및 미국에 소재하는 Johnson & Johnson 에서 입수) ; GFB 116(미국에 소재하는 South Florida University 및 Yale University 에서 입수) ; CS 706(일본에 소재하는 Sankyo 에서 입수) ; 컴브레타스타틴 A4 약물전구체(미국에 소재하는 Arizona State University 에서 입수) ; 콘드로이티나제 AC(캐나다에 소재하는 IBEX 에서 입수) ; BAY RES 2690(독일에 소재하는 Bayer 에서 입수) ; AGM 1470(미국에 소재하는 Harvard University 에서 입수, 일본에 소재하는 Takeda 에서 입수 및 미국에 소재하는 TAP 에서 입수) ; AG 13925(미국에 소재하는 Agouron 에서 입수) ; 테트라티오몰리브데이트(미국에 소재하는 University of Michigan 에서 입수) ; GCS 100(미국에 소재하는 Wayne State University 에서 입수), CV 247(영국에 소재하는 Ivy Medical 에서 입수) ; CKD 732(한국에 소재하는 Chong Kun Dang 에서 입수) ; MAb, 혈관 내피 성장 인자(영국에 소재하는 Xenova 에서 입수) ; 이소글라딘(irsogladine)(INN)(일본에 소재하는 Nippon Shinyaku 에서 입수) ; RG 13577(프랑스에 소재하는 Aventis 에서 입수) ; WX 360(독일에 소재하는 Wilex 에서 입수) ; 스쿠알라민(pINN)(미국에 소재하는 Genaera 에서 입수) ; RPI 4610(미국에 소재하는 Sirna 에서 입수) ; 암 치료(오스트레일리아에 소재하는 Marinova 에서 입수) ; 헤파라나제 저해제(이스라엘에 소재하는 InSight 에서 입수) ; KL 3106(한국에 소재하는 Kolon 에서 입수) ; 호노키올(미국에 소재하는 Emory University 에서 입수) ; ZK CDK(독일에 소재하는 Schering AG 에서 입수) ; ZK 안지오(독일에 소재하는 Schering AG 에서 입수) ; ZK 229561(스위스에 소재하는 Novartis 에서 입수 및 독일에 소재하는 Schering AG 에서 입수) ; XMP 300(미국에 소재하는 XOMA 에서 입수) ; VGA 1102(일본에 소재하는 Taisho 에서 입수) ; VEGF 수용체 조절인자(미국에 소재하는 Pharmacopeia 에서 입수) ; VE-카드헤린-2 길항제(미국에 소재하는 ImClone Systems 에서 입수) ; 바소스타틴(Vasostatin)(미국에 소재하는 National Institutes of Health 에서 입수) ; 백신, Flk-1(미국에 소재하는 ImClone Systems 에서 입수) ; TZ 93(일본에 소재하는 Tsumura 에서 입수) ; 툼스타틴(미국에 소재하는 Beth Israel Hospital 에서 입수) ; 절두된 가용성 FLT 1(혈관 내피 성장 인자 수용체 1)(미국에 소재하는 Merck & Co 에서 입수) ; Tie-2 리간드(미국에 소재하는 Regeneron 에서 입수) ; 트롬보스폰딘 1 저해제(미국에 소재하는 Allegheny Health, Education and Research Foundation 에서 입수) ; 2-벤젠술폰아미드, 4-(5-(4-클로로페닐)-3-(트리플루오로메틸)-1H-피라졸-1-일) ; 아라바 ; 및 C-Met. AVE 8062 ((2S)-2-아미노-3-히드록시-N-[2-메톡시-5-[(1Z)-2-(3,4,5-트리메톡시페닐)에테닐]페닐]프로판아미드 모노히드로클로라이드) ; 메텔리무맵(metelimumab)(pINN)(면역글로불린 G4, 항-(인체 형질전환 성장 인자 베타-1(인체 모노클로날 CAT 192. 감마.4-쇄)), 인체모노클로날 CAT 192 카파-쇄 이량체를 갖는 이황화물) ; Flt3 리간드 ; CD40 리간드 ; 인터루킨-2 ; 인터루킨-12 ; 4-1BB 리간드 ; 항-4-1BB 항체 ; TNF 길항물질 및 TNFR/FC 를 포함하는 TNF 수용체 길항물질, TWEAK 길항물질 및 TWEAK-R/Fc 를 포함하는 TWEAK-R 길항물질 ; TRAIL ; 항-VEGF 항체를 포함하는 VEGF 길항물질 ; VEGF 수용체(VEGF-R1 및 VEGF-R2, 또한 공지된 Flt1 및 Flk 1 또는 KDR 를 포함) 길항물질 ; CD148(DEP-1, ECRTP, 및 PTPRJ 로서 또한 언급됨, 본원의 참고문헌으로 인용된 Takahashi 등의 J. Am, Soc. Nephrol. 10:2135-45(1999) 참조) 작용물질 ; 트롬보스폰딘 1 저해제 및 하나 또는 둘 다의 Tie-2 또는 Tie-2 리간드의 저해제(예를 들어, Ang-2). 특정한 항-Ang-2 항체를 포함하는 본 분야에서 널리 공지된 수많은 Ang-2 의 저해제는 전체가 본원의 참고문헌으로 인용된 공개된 미국 특허 출원 번호 제 20030124129 호(PCT 출원 번호 제 WO 03/030833 호에 해당함) 및 미국 특허 번호 제 6,166,185 호에 기재되어 있다. 부가적으로, Ang-2 펩티바디(peptibodies)는 본 분야에 또한 널리 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 전체가 본원의 참고문헌으로 인용된 공개된 미국 특허 출원 번호 제 20030229023 호(PCT 출원 번호 제 WO 03/057134 호에 해당함) 및 공개된 미국 특허 출원 번호 제 20030236193 호에 기재되어 있다.

특정 암 치료제는 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : 탈리도미드 및 탈리도미드 유사체 (N-(2,6-디옥소-3-피페리딜)프탈이미드) ; 테코갈란 소듐(tecogalan sodium)(황산화한 다당류 펩티도글리칸) ; TAN 1120 (8-아세틸-7,8,9,10-테트라히드로-6,8,11-트리히드록시-1-메톡시-10-[[옥타히드로-5-히드록시-2-(2-히드록시프로필)-4,10-디메틸피라노[3,4-d]-1,3,6-디옥사조신-8-일]옥시]-5,12-나프타세네디온) ; 수라디스타(suradista) (7,7'-[카르보닐비스[이미노(1-메틸-1H-피롤-4,2-디일)카르보닐이미노(1-메틸-1H-피롤-4,2-디일)카르보닐이미노]]비스-1,3-나프탈렌디술폰산 테트라소듐 염) ; SU 302 ; SU 301 ; SU 1498 ((E)-2-시아노-3-[4-히드록시-3,5-비스(1-메틸에틸)페닐]-N-(3-페닐프로필)-2-프로펜아미드) ; SU 1433 (4-(6,7-디메틸-2-퀴녹살리닐)-1,2-벤젠디올) ; ST 1514 ; SR 25989 ; 가용성 Tie-2 ; SERM 유사체, 팜모스(Pharmos) ; 세마사니브(pINN)(3-[(3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌]-1,3-디히드로-2H-인돌-2-온) ; S 836 ; RG 8803 ; RESTIN ; R 440 (3-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-4-(1-메틸-6-니트로-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온) ; R 123942 (1-[6-(1,2,4-티아디아졸-5-일)-3-피리다지닐]-N-[3-(트리플루오로메틸)페닐]-4-피페리딘아민) ; 프롤릴 히드록시라아제 저해제 ; 진행 증진된 유전자(progression elevated gene) ; 프리노마스타트(prinomastat)(INN)((S)-2,2-디메틸-4-[[p-(4-피리딜옥시)페닐]술포닐]-3-티오모르폴린카르보히드록삼산 ; NV 1030 ; NM 3 (8-히드록시-6-메톡시-알파-메틸-1-옥소-1H-2-벤조피란-3-아세트산) ; NF 681 ; NF 050 ; MIG ; METH 2 ; METH 1 ; 마나스산틴(manassantin) B (알파-[1-[4-[5-[4-[2-(3,4-디메톡시페닐)-2-히드록시-1-메틸에톡시]-3-메톡시페닐]테트라히드로-3,4-디메틸-2-푸란일]-2-메톡시페녹시]에틸]-1,3-벤조디옥솔-5-메탄올) ; KDR 모노클로날 항체 ; 알파5베타3 인테그린 모노클로날 항체 ; LY 290293 (2-아미노-4-(3-피리디닐)-4H-나프토[1,2-b]피란-3-카르보니트릴) ; KP 0201448 ; KM 2550 ; 인테그린-특이 펩티드 ; INGN 401 ; GYKI 66475 ; GYKI 66462 ; 그린스타틴(101-354-플라스미노겐(인체)) ; 류마티스성 관절염, 전립선암, 난소암, 신경교종, 엔도스타틴, 결장직장암, ATF BTPI, 항맥관형성 유전자, 맥관형성 저해제 또는 맥관형성에 대한 유전자 치료 ; 겔라티나제 저해제, FR 111142 (4,5-디히드록시-2-헥산산 5-메톡시-4-[2-메틸-3-(3-메틸-2-부텐일)옥시란일]-1-옥사스피로[2.5]옥트-6-일 에스테르) ; 포르페니멕스(forfenimex)(pINN) (S)-알파-아미노-3-히드록시-4-(히드록시메틸)벤젠아세트산) ; 섬유결합소 길항제 (1-아세틸-L-프롤릴-L-히스티딜-L-세릴-L-시스테이닐-L-아스파르트아미드) ; 섬유아세포 성장 인자 수용체 저해제 ; 섬유아세포 성장 인자 길항제 ; FCE 27164 (7,7'-[카르보닐비스[이미노(1-메틸-1H-피롤-4,2-디일)카르보닐이미노(1-메틸-1H-피롤-4,2-디일)카르보닐이미노]]비스-1,3,5-나프탈렌트리술폰산 헥사소듐 염) ; FCE 26752 (8,8'-[카르보닐비스[이미노(1-메틸-1H-피롤-4,2-디일)카르보닐이미노(1-메틸-1H-피롤-4,2-디일)카르보닐이미노]]비스-1,3,6-나프탈렌트리술폰산) ; 내피성 단핵백혈구 활성화 폴리펩티드 Ⅱ ; VEGFR 안티센스 올리고누클레오티드 ; 항-맥관형성 및 영양(trophic) 인자 ; ANCHOR 맥관생성억제제(angiostatic agent) ; 엔도스타틴 ; Del-1 맥관형성 단백질 ; CT 3577 ; 콘토르트로스타틴(contortrostatin) ; CM 101 ; 콘드로이티나제 AC ; CDP 845 ; 칸스타틴 ; BST 2002 ; BST 2001 ; BLS 0597 ; BIBF 1000 ; ARRESTIN ; 아포미그렌(apomigren)(1304-1388-유형 XV 콜라겐(인체 유전자 COL15A1 알파1-쇄 전구물질) ; 안지오인히빈(angioinhibin) ; aaATⅢ ; A 36 ; 9알파-플루오로메드록시프로게스테론 아세테이트 ((6-알파)-17-(아세틸옥시)-9-플루오로-6-메틸-프레근-4-엔-3,20-디온) ; 2-메틸-2-프탈리미디노-글루타르산 (2-(1,3-디히드로-1-옥소-2H-이소인돌-2-일)-2-메틸펜탄디오익산) ; 이트륨 90 표지된 모노클로날 항체 BC-1 ; 세막사니브(Semaxanib) (3-(4,5-디메틸피롤-2-일메틸렌)인돌린-2-온)(C15 H14 N2 O) ; PI 88 [포스포만노펜타오스(phosphomannopentaose) 설페이트] ; 알보시디브(Alvocidib) (4H-1-벤조피란-4-온, 2-(2-클로로페닐)-5,7-디히드록시-8-(3-히드록시-1-메틸-4-피페리디닐)-시스-(-)-)(C21 H20 Cl N 05) ; E 7820 ; SU 11248 (5-[3-플루오로-2-옥소-1,2-디히드로인돌-(3Z)-일이덴메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복시산(2-디에틸아미노에틸)아미드) (C22 H27 F N4 O2) ; 스쿠알라민 (콜레스테인-7,24-디올, 3-[[3-[(4-아미노부틸)아미노프로필]아미노]-, 24-(황산), (3.베타., 5.알파., 7.알파.)-) (C34 H65 N3 O5 S) ; 에리오크롬 블랙 T ; AGM 1470 (카르밤산, (클로로아세틸)-, 5-메톡시-4-[2-메틸-3-(3-메틸-2-부텐일)옥시란일]-1-옥사스피로[2,5] 옥트-6-일 에스테르, [3R-[3알파, 4알파(2R, 3R), 5베타, 6베타]]) (C19 H28 Cl N O6) ; AZD 9935 ; BIBF 1000 ; AZD 2171 ; ABT 828 ; KS-인터루킨-2 ; 유테로글로빈 ; A 6 ; NSC 639366 (1-[3-(디에틸아미노)-2-히드록시프로필아미노]-4-(옥시란-2-일메틸아미노)안트라퀴논 퓨메레이트)(C24 H29 N3 O4. C4 H4 O4) ; ISV 616 ; 항-ED-B 융합 단백질 ; HUI 77 ; 트로포닌 I ; BC-1 모노클로날 항체 ; SPV 5.2 ; ER 68203 ; CKD 731 (3-(3,4,5-트리메톡시페닐)-2(E)-프로페녹산 (3R,4S,5S,6R)-4-[2(R)-메틸-3(R)-3(R)-(3-메틸-2-부텐일)옥시란-2-일]-5-메톡시-1-옥사스피로[2.5]옥트-6-일 에스테르) (C28 H38 O8) ; IMC-1C11 ; aaATⅢ ; SC 7 ; CM 101 ; 안지오콜(Angiocol) ; 크링글 5 ; CKD 732 (3-[4-[2-(디메틸아미노)에톡시]페닐]-2(E)-프로페녹산)(C29 H41 N O6) ; U 995 ; 칸스타틴 ; SQ 885 ; CT 2584 (1-[11-(도데실아미노)-10-히드록시운데실]-3,7-디메틸크산틴)(C30 H55 N5 O3) ; 살모신 ; EMAP Ⅱ ; TX 1920 (1-(4-메틸피페라지노)-2-(2-니트로-1H-1-이미다조일)-1-에탄온)(C10 H15 N5 O3) ; 알파-v 베타-x 저해제 ; CHIR 11509 (N-(1-프로피닐)글리실-[N-(2-나프틸)]글리실-[N-(카르바모일메틸)]글리신 비스(4-메톡시페닐)메틸아미드)(C36 H37 N5 O6) ; BST 2002 ; BST 2001 ; B 0829 ; FR 111142 ; 4,5-디히드록시-2(E)-헥센산 (3R, 4S, 5S, 6R)-4-[1(R),2(R)-에폭시-1,5-디메틸-4-헥센일]-5-메톡시-1-옥사스피로[2.5]옥탄-6-일 에스테르 (C22 H34 O7) ; 및 키나제 저해제. 상기 키나제 저해제는 다음을 포함하나 이로 제한되지 않는다 : N-(4-클로로페닐)-4-(4-피리디닐메틸)-1-프탈라진아민 ; 4-[4-[[[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]아미노]카르보닐]아미노]페녹시]-N-메틸-2-피리딘카르복사미드 ; N-[2-(디에틸아미노)에틸]-5-[(5-플루오로-1,2-디히드로-2-옥소-3H-인돌-3-일이덴)메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복사미드 ; 3-[(4-브로모-2,6-디플루오로페닐)메톡시]-5-[[[[4-(1-피롤리디닐)부틸]아미노]카르보닐]아미노]-4-이소티아졸카르복사미드 ; N-(4-브로모-2-플루오로페닐)-6-메톡시-7-[(1-메틸-4-피페리디닐)메톡시]-4-퀴나졸린아민 ; 3-[5,6,7,13-테트라히드로-9-[(1-메틸에톡시)메틸]-5-옥소-12H-인데노[2,1-a]피롤로[3,4-c]카르바졸-12-일]프로필 에스테르 N,N-디메틸-글리신 ; N-[5-[[[5-(1,1-디메틸에틸)-2-옥사졸일]메틸]티오]-2-티아졸일]-4-피페리딘카르복사미드 ; N-[3-클로로-4-[(3-플루오로페닐)메톡시]페닐]-6-[5-[[[2-(메틸술포닐)에틸]아미노]메틸]-2-푸란일]-4-퀴나졸린아민 ; 4-[(4-메틸-1-피페라진일)메틸]-N-[4-메틸-3-[[4-(3-피리디닐)-2-피리미디닐]아미노]-페닐]벤즈아미드 ; N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-[3-(4-모르폴린일)프로폭시]-4-퀴나졸린아민 ; N-(3-에틴일페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민 ; N-(3-((((2R)-1-메틸-2-피롤리디닐)메틸)옥시)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-2-((3-(1,3-옥사졸-5-일)페닐)아미노)-3-피리딘카르복사미드 ; 2-(((4-플루오로페닐)메틸)아미노)-N-(3-((((2R)-1-메틸-2-피롤리디닐)메틸)옥시)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-3-피리딘카르복사미드 ; N-[3-(아제티딘-3-일메톡시)-5-트리플루오로메틸-페닐]-2-(4-플루오로-벤질아미노)-니코틴아미드 ; 6-플루오로-N-(4-(1-메틸에틸)페닐)-2-((4-피리디닐메틸)아미노)-3-피리딘카르복사미드 ; 2-((4-피리디닐메틸)아미노)-N-(3-(((2S)-2-피롤리디닐메틸)옥시)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-3-피리딘카르복사미드 ; N-(3-(1,1-디메틸에틸)-1H-피라졸-5-일)-2-((4-피리디닐메틸)아미노)-3-피리딘카르복사미드 ; N-(3,3-디메틸-2,3-디히드로-1-벤조푸란-6-일)-2-((4-피리디닐메틸)아미노)-3-피리딘카르복사미드 ; N-(3-((((2S)-1-메틸-2-피롤리디닐)메틸)옥시)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-2-((4-피리디닐메틸)아미노)-3-피리딘카르복사미드 ; 2-((4-피리디닐메틸)아미노)-N-(3-((2-(1-피롤리디닐)에틸)옥시)-4-(트리플루오로메틸)페닐)-3-피리딘카르복사미드 ; N-(3,3-디메틸-2,3-디히드로-1H-인돌-6-일)-2-((4-피리디닐메틸)아미노)-3-피리딘카르복사미드 ; N-(4-(펜타플루오로에틸)-3-(((2S)-2-피롤리디닐메틸)옥시)페닐)-2-((4-피리디닐메틸)아미노)-3-피리딘카르복사미드 ; N-(3-((3-아제티디닐메틸)옥시)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-2-((4-피리디닐메틸)아미노)-3-피리딘카르복사미드 ; N-(3-(4-피페리디닐옥시)-5-(트리플루오로메틸)페닐)-2-((2-(3-피리디닐)에틸)아미노)-3-피리딘카르복사미드 ; N-(4,4-디메틸-1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-7-일)-2-(1H-인다졸-6-일아미노)-니코틴아미드 ; 2-(1H-인다졸-6-일아미노)-N-[3-(1-메틸피롤리딘-2-일메톡시)-5-트리플루오로메틸-페닐]-니코틴아미드 ; N-[1-(2-디메틸아미노-아세틸)-3,3-디메틸-2,3-디히드로-1H-인돌-6-일]-2-(1H-인다졸-6-일아미노)-니코틴아미드 ; 2-(1H-인다졸-6-일아미노)-N-[3-(피롤리딘-2-일메톡시)-5-트리플루오로메틸-페닐]-니코틴아미드 ; N-(1-아세틸-3,3-디메틸-2,3-디히드로-1H-인돌-6-일)-2-(1H-인다졸-6-일아미노)-니코틴아미드 ; N-(4,4-디메틸-1-옥소-1,2,3,4-테트라히드로-이소퀴놀린-7-일)-2-(1H-인디졸-6-일아미노)-니코틴아미드 ; N-(4-(3차-부틸)-3-(3-피페리딜프로필)페닐][2-(1H-인다졸-6-일아미노)(3-피리딜)]카르복사미드 ; N-[5-(3차-부틸)이속사졸-3-일][2-(1H-인다졸-6-일아미노)(3-피리딜)]카르복사미드 ; 및 N-[4-(3차-부틸)페닐][2-(1H-인다졸-6-일아미노)(3-피리딜)]카르복사미드 및 각각 본원에 참고문헌 인용된 미국 특허 번호 제 6,258,812 호 ; 제 6,235,764 호 ; 제 6,630,500 호 ; 제 6,515,004 호 ; 제 6,713,485 호 ; 제 5,521,184 호 ; 제 5,770,599 호 ; 제 5,747,498 호 ; 제 5,990,141 호 ; 미국 공개 번호 제 US20030105091 호 ; 및 특허 협력 조약 공개 번호 제 WO01/37820 호 ; 제 WO01/32651 호 ; 제 WO02/68406 호 ; 제 WO02/66470 호 ; 제 WO02/55501 호 ; 제 WO04/05279 호 ; 제 WO04/07481 호 ; 제 WO04/07458 호 ; 제 WO04/09784 호 ; 제 WO02/59110 호 ; 제 WO99/45009 호 ; 제 WO98/35958 호 ; 제 WO00/59509 호 ; 제 WO99/61422 호 ; 제 WO00/12089 호 ; 및 제 WO00/02871 호에 나타낸 키나제 저해제.

성장 인자에 의한 병용 치료제는 다음을 포함한다 : 사이토카인, 림포카인, 성장 인자, 또는 M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNF0, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, 트롬보포이에틴, 줄기세포 인자 및 적혈구 생성 인자와 같은 다른 조혈 인자. 다른 조성물로는 공지된 안지오포이에틴, 예를 들어, Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, 및/또는 인체 Ang-유사 폴리펩티드 및/또는 맥관내피성장 인자(VEGF : vascular endothelial growth factor)를 포함할 수 있다. 성장 인자로는 다음을 포함한다 : 안지오제닌, 골형성 단백질-1, 골형성 단백질-2, 골형성 단백질-3, 골형성 단백질-4, 골형성 단백질-5, 골형성 단백질-6, 골형성 단백질-7, 골형성 단백질-8, 골형성 단백질-9, 골형성 단백질-10, 골형성 단백질-11, 골형성 단백질-12, 골형성 단백질-13, 골형성 단백질-14, 골형성 단백질-15, 골형성 단백질 수용체 IA, 골형성 단백질 수용체 IB, 뇌 유래 신경영양 인자, 섬모 신경영양 인자, 섬모 신경영양 인자 수용체, 사이토카인-유도 호중구 화학주성 인자-1, 사이토카인-유도 호중구, 화학주성 인자-2, 사이토카인-유도 호중구 화학주성 인자-2, 내피세포 성장 인자, 엔도텔린-1, 표피 성장 인자, 상피-유래 호중구 유인물질, 섬유모세포 성장 인자-4, 섬유모세포 성장 인자-5, 섬유모세포 성장 인자-6, 섬유모세포 성장 인자-7, 섬유모세포 성장 인자-8, 섬유모세포 성장 인자-8b, 섬유모세포 성장 인자-8c, 섬유모세포 성장 인자-9, 섬유모세포 성장 인자-10, 산성 섬유모세포 성장 인자, 염기성 섬유모세포 성장 인자, 아교세포주-유래 신경영양 인자 수용체-1, 아교세포주-유래 신경영양 인자 수용체-2, 성장 관련 단백질, 성장 관련 단백질-2, 성장 관련 단백질-2, 성장 관련 단백질-3, 헤파린 결합 표피 성장 인자, 간세포 성장 인자, 간세포 성장 인자 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 I, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 Ⅱ, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, 케라틴세포 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 백혈병 억제 인자 수용체-1, 신경 성장 인자, 신경 성장 인자 수용체, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 태반 성장 인자, 태반 성장 인자-2, 혈소판-유래 내피세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 A 쇄, 혈소판 유래 성장 인자 AA, 혈소판 유래 성장 인자 AB, 혈소판 유래 성장 인자 B 쇄, 혈소판 유래 성장 인자 BB, 혈소판 유래 성장 인자 수용체-1, 혈소판 유래 성장 인자 수용체-2, 전(pre)-B 세포 성장 자극인자, 줄기세포 인자, 줄기세포 인자 수용체, 형질전환 성장 인자-1, 형질전환 성장 인자-2, 형질전환 성장 인자-3, 형질전환 성장 인자-1.2, 형질전환 성장 인자-4, 형질전환 성장 인자-5, 잠재 형질전환 성장 인자-1, 형질전환 성장 인자-1 결합 단백질 I, 형질전환 성장 인자-1 결합 단백질 Ⅱ, 형질전환 성장 인자-1 결합 단백질 Ⅲ, 제 I 형 종양 괴사 인자 수용체(TNF-R1), 제 Ⅱ 형 종양 괴사 인자 수용체(TNF-R2), 우로키나아제-유형 플라스미노겐 활성화 수용체, 맥관내피 성장 인자, 및 키메라 단백질 및 생물학적 또는 면역학적으로 유효한 이의 단편.

본 발명의 특이 결합제를 하나 또는 그 이상의 항-염증성 제제와 함께 투여할 수 있다는 것은 명백할 것이다. 본원에 사용한 바와 같이, 용어 "항-염증성 제제"는 일반적으로 환자에게서 염증 또는 종창을 감소시키는 모든 제제를 의미한다. 다수의 항-염증성 제제의 예는 본원에 기재되어 있으며, 본 발명에는 포함되지만 본원에는 구체적으로 기재되어 있지 않은 부가적인 적합한 항-염증성 제제도 포함된다는 것은 명백할 것이다.

예를 들어, 항-염증성 제제는 염증성 사이토카인과 이의 수용체와의 상호작용을 저해하는 화합물이다. 본 발명의 특이 결합제와 복합시키기에 적합한 사이토카인 저해제의 예는 예를 들어, 염증과 관련된 인터루킨에 직접적으로 대응되는 길항물질(예를 들어, 항체)뿐만 아니라 TGF-β 의 길항물질(예를 들어, 항체)을 포함한다. 이러한 인터루킨은 본원에 기재하였으며, 바람직하게 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17 및 IL-18 을 포함하나 이에 한정되지 않는다. Feghali 등의 Frontiers in Biosci., 2 : 12-26(1997)을 참조하라.

본 발명의 특이 결합제는 또한 항-레트로바이러스 치료를 받고 있는 HIV-감염 환자에게서 T 세포 증식을 향상시키기 위해 제 1 형의 단백질 키나제 A 의 저해제를 병용하여 투여할 수 있다.

신경 성장 인자(NGFs)는 또한 특정 증상을 치료하기 위해 본 발명의 특이 결합제와 복합시킬 수 있다. 이러한 증상은 신경변성 질환, 척수손상 및 다발성 경화증을 포함한다. 이러한 복합물로 치료가능한 다른 증상은 녹내장 및 당뇨병이 있다.

바람직한 병용 치료요법은 본 발명의 특이 결합제를 하나 또는 그 이상의 적합한 IL-1 저해제와 병용하여 환자에게 투여하는 것에 관한 것이다. IL-1 의 저해제는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다 : IL-1 의 수용체-결합 펩티드 단편, IL-1 또는 IL-1 베타 또는 제 I 형의 IL-1 수용체에 직접적으로 결합하는 항체, 및 IL-1 에 대한 수용체의 전체 또는 일부, 또는 유전적으로 변형된 뮤테인, 다중결합 형태 및 서방성 제형을 포함하는 이의 변형된 변이체를 포함하는 재조합 단백질. 특이적인 길항물질은 다음을 포함한다 : IL-1 ra 폴리펩티드, IL-1 베타 전환효소(ICE) 저해제, 길항적인 제 I 형 IL-1 수용체 길항물질, 제 I 형 IL-1 수용체 및 제 II 형 IL-1 수용체의 IL-1 결합 형태, IL-1 알파, IL-1 베타 및 IL-1 군의 다른 구성요소를 포함하는 IL-1 에 대한 항체, 및 IL-1 Trap(Regeneron 에서 입수)으로 공지되어 있는 치료제. IL-1 ra 폴리펩티드는 미국 특허 번호 제 5,075,222 호에 기재되어 있는 IL-1 ra 형태 및 미국 특허 번호 제 5,922,573 호, 제 WO 91/17184 호, 제 WO 92/16221 호 및 제 WO 93/09323 호에 기재되어 있는 것들을 포함하는 변형된 형태 및 변이체를 포함한다. IL-1 베타 전환효소(ICE) 저해제는 PCT 특허 출원 제 WO 91/15577 호 ; 제 WO 93/05071 호 ; 제 WO 93/09135 호 ; 제 WO 93/144777 및 제 WO 93/16710 호 ; 및 유럽 특허 출원 제 0 547 699 호에 기재되어 있는 것들을 포함하는 펩티딜(peptidyl) 및 소형 분자 ICE 저해제를 포함한다. 비-펩티딜 화합물은 PCT 특허 출원 제 WO 95/26958 호, 미국 특허 번호 제 5,552,400 호, 미국 특허 번호 제 6,121,266 호 및 Dolle 등의 J. Med. Chem., 39, pp. 2438-2440(1996) 에 기재되어 있는 것들을 포함한다. 부가적인 ICE 저해제는 미국 특허 번호 제 6,162,790 호, 제 6,204,261 호, 6,136,787 호, 제 6,103,711 호, 제 6,025,147 호, 제 6,008,217 호, 제 5,973,111 호, 제 5,874,424 호, 제 5,847,135 호, 제 5,843,904 호, 제 5,756,466 호, 제 5,656,627 호 및 제 5,716,929 호에 기재되어 있다. 제 I 형의 IL-1 수용체 및 제 II 형의 IL-1 수용체의 IL-1 결합 형태는 미국 특허 번호 제 4,968,607 호, 제 5,081,228 호, 제 Re 35,450 호, 제 5,319,071 호 및 제 5,350,683 호에 기재되어 있다. 다른 적합한 IL-1 길항물질은 IL-1 신호전달 수용체인 제 I 형의 IL-1 R 에 경쟁적으로 결합할 수 있는 IL-1 로부터 유도된 펩티드를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 IL-1(및 다른 사이토카인) 길항물질에 관한 부가적인 내용은 미국 특허 번호 제 6,472,179 호에 기재되어 있다.

부가적으로, TNF 저해제가 적합하며, 이는 TNFα 의 수용체-결합 펩티드 단편, TNFα 생성을 저해하는 안티센스 올리고누클레오티드 또는 리보솜, TNFα 에 직접적으로 결합하는 항체, 및 TNFα 의 수용체의 전체 또는 일부 또는 유전적으로-변형된 뮤테인, 다중결합 형태 및 서방성 제형을 포함하는 이의 변형된 변이체를 포함하는 재조합 단백질을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한 TAPI(Immunex Corp. 에서 입수) 및 GW-3333X(Glaxo Wellcome Inc. 에서 입수)와 같은 TACE(종양 괴사 인자-α 전환효소) 저해제가 적합하다. 또한 제 EP 0 614 464 B 호에 기재되어 있는 펩티드와 같은 IgA-α₁AT 복합체 형성을 저해하는 분자 또는 이러한 복합체에 대한 항체가 적합하다. 부가적으로 적합한 분자는 TNFα-저해 이당류, 글루코사민의 황산화된 유도체 또는 미국 특허 번호 제 6,020,323 호에 기재되어 있는 다른 유사 탄수화물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 추가적으로 적합한 분자는 미국 특허 번호 제 5,641,751 호 및 제 5,519,000 호에 기재되어 있는 펩티드 TNFα 저해제 및 미국 특허 번호 제 5,753,628 호에 기재되어 있는 D-아미노산-함유 펩티드를 포함한다. 부가적으로, TNFα 전환효소의 저해제도 적합하다. 본 발명에 따라 병용하여 사용할 수 있는 부가적인 제제는 제 WO 01/03719 호에 추가적으로 기재되어 있다.

좀 더 추가적으로 적합한 화합물은 탈리도미드 또는 탈리도미드 유사체와 같은 소형 분자, 펜톡시필린 또는 매트릭스 메탈로프로테나제(MMP) 저해제 또는 다른 소형 분자를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 적합한 MMP 저해제는 예를 들어, 미국 특허 번호 제 5,883,131 호, 제 5,863,949 호 및 제 5,861,510 호에 기재되어 있는 것들을 포함하며, 뿐만 아니라 미국 특허 번호 제 5,872,146 호에 기재되어 있는 머캅토 알킬 펩티딜 화합물을 포함한다. TNFα 생성을 감소시킬수 있는 다른 소형 분자는 예를 들어, 미국 특허 번호 제 5,508,300 호, 제 5,596,013 호 및 제 5,563,143 호에 기재되어 있는 분자를 포함한다. 부가적인 적합한 소형 분자는 미국 특허 번호 제 5,747,514 호 및 제 5,691,382 호에 기재되어 있는 바와 같은 MMP 저해제, 뿐만 아니라 미국 특허 번호 제 5,821,262 호에 기재되어 있는 바와 같은 히드록삼산 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 추가적인 적합한 분자는 예를 들어, 치환된 옥심 유도체(제 WO 96/00215 호 참조), 퀴놀린 술폰아미드(미국 특허 번호 제 5,834,485 호 참조), 아릴 푸란 유도체(제 WO 99/18095 호 참조) 및 헤테로비시클로 유도체(제 WO 96/01825 호 ; 제 GB 2 291 422 A 호 참조)와 같은 포스포디에스테라제 IV 및 TNFα 생성을 저해하는 소형 분자를 포함한다. 또한 TNFα 및 IFNγ(제 WO 99/15524 호 참조)를 억제시키는 티아졸 유도체, 뿐만 아니라 TNFα 및 다른 전염증성 사이토카인(예를 들어, 미국 특허 번호 제 5,118,500 호, 제 5,096,906 호 및 제 5,196,430 호를 참조하라)을 억제시키는 크산틴 유도체가 유용하다. 본원에 기재되어 있는 증상을 치료하는데 유용한 부가적인 소형 분자는 미국 특허 번호 제 5,547,979 호에 기재되어 있는 것들을 포함한다.

병용 치료요법에 의해 투여될 수 있는 약물 및 약물 유형의 추가적인 예는 항바이러스제, 항생제, 진통제(예를 들어, 아세트아미노펜, 코데인, 프로폭시펜 납실레이트, 염산옥시코돈, 히드로코돈 비타르트레이트, 트라마돌), 코르티코스테로이드, 염증성 사이토카인의 길항물질, 질환-조절 항-류마티스 약물(DMARDs), 비-스테로이드성 항-염증성 약물(NSAIDs) 및 완효성 항-류마티스 약물(Slow-Acting Anti-Rheumatic Drugs ; SAARDs)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

질환-조절 항-류마티스 약물(DMARDs)의 예는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다 : Rheumatrex^TM(메토트렉세이트) ; Enbrel®(에탄에르셉트) ; Remicade®(인플릭시맵) ; Humira^TM(아달리무맵) ; Segard®(아펠리모맙) ; Arava^TM(레플루노미드) ; Kineret^TM(아나킨라) ; Arava^TM(레플루노미드) ; D-페니실라민 ; 미오크리신 ; 플라켄일 ; Ridaura^TM(아우라노핀) ; 솔가날(Solganal) ; 레네센트(Hoffman-La Roche 에서 입수) ; CDP870(Celltech 에서 입수) ; CDP571(Celltech 에서 입수), 뿐만 아니라 제 EP 0 516 785 B1 호, 미국 특허 번호 제 5,656,272 호, 제 EP 0 492 448 A1 호에 기재되어 있는 항체 ; 오너셉트[Serono 에서 입수 ; CAS 등록 번호 제 199685-57-9 호] ; MRA(Chugai 에서 입수) ; Imuran^TM(아자티오프린) ; NFKB 저해제 ; Cytoxan^TM(시클로포스파미드) ; 시클로스포린 ; 황산히드록시클로로퀸 ; 미노시클린 ; 술파살라진 ; 및 경구투여용 금, 금티오말산 나트륨 및 아우로티오글루코스와 같은 금 화합물.

추가적인 적합한 분자는 예를 들어, 제 WO 99/04001 호에 기재되어 있는 TNFR 과 같으며 이러한 TNFR 로부터 유도된 TNFR-Ig's 를 포함하는, p55 및 p75 TNFRs 와는 다른 TNFα 수용체 분자의 세포외 영역으로부터 유도된 가용성 TNFRs 를 포함한다. 부가적인 적합한 TNFα 저해제는 본원에 기재되어 있는 바와 같이 사용하는데 적합하다. 상기 저해제는 본원에 기재되어 있는 바와 같은 TNFα 또는 TNFR 에 대한 항체뿐만 아니라 TNFα의 경쟁적 저해제(미국 특허 번호 제 5,795,859 호 또는 미국 특허 번호 제 6,107,273 호에 기재되어 있는 바와 같음)로서 작용할 수 있는 TNFα-유도 펩티드, p55 TNFα 수용체의 세포외 부분을 포함하는 단백질과 같은 TNFR-IgG 융합 단백질, IgG 융합 단백질과는 다른 가용성 TNFR 또는 TNFα 전환효소(예를 들어, 미국 특허 번호 제 5,594,106 호 참조)의 저해제와 같은, 내인성 TNFα 농도를 감소시키는 다른 분자, 또는 본원에 기재되어 있는 바와 같은 다수의 소형 분자 또는 TNFα 저해제를 포함한다.

TNF 에 대한 항체와 관련하여, 투여량은 환자의 필요에 따라 경험이 많은 건강 관리 요원에 의해 최적으로 결정될 것임에도 불구하고, TNFα 에 대한 항체의 바람직한 투여량 범위의 한 예는 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg 이고, 더 바람직하게는 1-10 mg/kg 이다. 항-TNFα 항체에 대한 또다른 바람직한 투여량 범위는 0.75 mg/kg 내지 7.5 mg/kg(체중)이다.

본 발명은 또한 특이 결합제 및 하나 또는 그 이상의 비-스테로이드성 항-염증성 약물(NSAIDs)을 사용할 수 있다. NSAIDs 는 적어도 부분적으로 프로스타글란딘 합성을 저해하는 항-염증성 작용을 가지고 있다. Goodman 및 Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan 7th Edition(1985)을 참조하라. NSAIDs 는 다음의 9 개의 군으로 나누어질 수 있다 : (1) 살리실산 유도체 ; (2) 프로피온산 유도체 ; (3) 아세트산 유도체 ; (4) 페남산 유도체 ; (5) 카르복시산 유도체 ; (6) 부티르산 유도체 ; (7) 옥시캄 ; (8) 피라졸 및 (9) 피라졸론. NSAIDs 의 예는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다 : Anaprox^TM, Anaprox DS^TM(나프록센 나트륨) ; Ansaid^TM(플루비프로펜) ; Arthrotec^TM(디클로페낙 나트륨 + 미소프로스틸) ; Cataflam^TM/Voltaren^TM(디클로페낙 칼륨) ; Clinoril^TM(술린닥) ; Daypro^TM(옥사프로진) ; Disalcid^TM(살사레이트) ; Dolobid^TM(디플루니살) ; EC Naprosyn^TM(나프록센 나트륨) ; Feldene^TM(피록시캄) ; Indocin^TM, Indocin SR^TM(인도메타신) ; Lodine^TM, Lodine XL^TM(에토돌락) ; Motrin^TM(이부프로펜) ; Naprelan^TM(나프록센) ; Naprosyn^TM(나프록센) ; Orudis^TM(케토프로펜) ; Oruvail^TM(케토프로펜) ; Relafen^TM(나부메톤) ; Tolectin^TM(톨메틴 나트륨) ; Trilisate^TM(콜린 마그네슘 살리실레이트) ; Cox-1 저해제 ; Vioxx^TM(로페콕시브)와 같은 Cox-2 저해제 ; Arcoxia^TM(에토리콕시브) ; Celebrex^TM(셀레콕시브) ; Mobic^TM(멜록시캄) ; Bextra^TM(발데콕시브) ; Dynastat^TM(파라콕시브 나트륨) ; Prexige^TM(루미라콕시브) ; 및 남부메톤. 부가적인 적합한 NSAIDs 는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다 : ε-아세트아미도카프로산, S-아데노실메티오닌, 3-아미노-4-히드록시부티르산, 아믹세트린, 아니트라자펜, 안트라페닌, 벤다작, 벤다작 리신에이트, 벤지다민, 베프로진, 브로페라몰, 부콜롬, 부페졸락, 시프로퀴아존, 클록시메이트, 다지다민, 데복사메트, 데토미딘, 디펜피라미드(difenpiramide), 디펜피라미드(difenpyramide), 디피살라민(difisalamine), 디타졸, 에모르파존, 파네티졸 메실레이트, 펜플루미졸, 플록타페닌, 플루미졸, 플루닉신, 플루프로퀴아존, 포피르톨린(fopirtoline), 포스포살(fosfosal), 과이메살(guaimesal), 과이아졸렌(guaiazolene), 이소닉시른(isonixirn), 레페타민 HCl, 레플루노미드, 로페미졸, 로티파졸, 리신 클로닉시네이트, 메세클라존(meseclazone), 나부메톤, 니크틴돌(nictindole), 니메술리드, 오르고테인, 오르파녹신(orpanoxin), 옥사세프롤름(oxaceprolm), 옥사파돌(oxapadol), 파라닐린(paranyline), 페리속살(perisoxal), 페리속살 시트레이트, 피폭심(pifoxime), 피프록센(piproxen), 피라졸락(pirazolac), 피르페니돈, 프로퀴아존, 프록사졸(proxazole), 티엘라빈 B(thielavin B), 티플라미졸(tiflamizole), 티메가딘(timegadine), 톨렉틴, 톨파돌(tolpadol), 트리프타미드(tryptamid) 및 제 480156S 호, 제 AA861 호, 제 AD1590 호, 제 AFP802 호, 제 AFP860 호, 제 AI77B 호, 제 AP504 호, 제 AU8001 호, 제 BPPC 호, 제 BW540C 호, 제 CHINOIN 127 호, 제 CN100 호, 제 EB382 호, 제 EL508 호, 제 F1044 호, 제 FK-506 호, 제 GV3658 호, 제 ITF182 호, 제 KCNTEI6090 호, 제 KME4 호, 제 LA2851 호, 제 MR714 호, 제 MR897 호, 제 MY309 호, 제 ONO3144 호, 제 PR823 호, 제 PV102 호, 제 PV108 호, 제 R830 호, 제 RS2131 호, 제 SCR152 호, 제 SH440 호, 제 SIR133 호, 제 SPAS510 호, 제 SQ27239 호, 제 ST281 호, SY6001 호, 제 TA60 호, 제 TAI-901 호(4-벤조일-1-인단카르복시산), 제 TVX2706 호, 제 U60257 호, 제 UR2301 호 및 제 WY41770 호와 같은 회사 코드 번호로 지정된 바와 같은 화합물. NSAIDs 에 대하여 유사한 진통제 및 항-염증성 특성을 가지는 구조적으로 관련된 NSAIDs 도 또한 이러한 그룹에 포함된다.

적절한 SAARDs 또는 DMARDS 는 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : 알로쿠프레이드 쇼듐(allocupreide sodium), 오라노핀, 오로티오글루코스, 오로티오글리카니드(aurothioglycanide), 아자티오프린, 브레퀴나 소듐(brequinar sodium), 부실라민, 칼슘 3-오로티오-2-프로판올-1-술포네이트, 클로람부실, 클로로퀸, 클로부자리트(clobuzarit), 쿠프록솔린(cuproxoline), 시클로포스파미드, 사이클로스포린, 답손, 15-데옥시스페르구알린, 디아세레인, 글루코사민, 금염(gold salt)[예를 들어, 시클로쿠인(cycloquine) 금염, 골드 소듐 티오말레이트, 골드 소듐 티오술페이트], 히드록시클로로퀸, 히드록시요소, 케부존, 레바미솔, 로벤자리트(lobenzarit), 멜리틴, 6-메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미조리빈(mizoribine), 마이코페놀레이트 모페틸, 마이오랄(myoral), 니트로겐 머스터드, D-페니실라민, SKNF86002 및 SB203580 과 같은 피리딘올 이미다졸, 라파마이신, 티올, 타이모포이에틴 및 빈크리스틴. 유사한 진통제 및 항-염증성 특성을 갖는 구조적으로 관련된 SAARDs 또는 DMARDs 는 또한 이러한 그룹에 포함됨을 의도한다.

신호전달 캐스케이드에서 키나제의 저해제는 또한 본 발명의 특이 결합제와 혼합시키기에 적절한 제제이다. 이들은 P-38[a.k.a., "RK" or "SAPK-2", Lee 등의 Nature, 372:739(1994)]을 저해하는 제제를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. P-38 은 세린/트레오닌 키나제로서 기재되어 있다[Han 등의 Biochimica Biophysica Acta, 1265:224-227(1995)]. P-38 의 저해제는 IL-1 의 세포외 자극과 방출 사이를 방해함을 나타내었으며 세포로부터의 TNFα 는 신호 경로에 놓여있는 키나제의 저해를 통하여 신호 전달을 방해함을 포함한다.

MK2 저해제 및 tpl-2 저해제가 부가적으로 적절하다. 부가적으로, T-세포 저해제는 또한 예를 들어, ctla-4, CsA, Fk-506, OX40, OX40R-Fc, OX40 항체, OX40 리간드, OX40 리간드 항체, lck 및 ZAP70 을 적절히 포함한다. TGF-β 의 길항물질 뿐만 아니라 경구용 레티노이드를 포함하는 레티노이드도 또한 적절하다.

본 발명의 특이 결합제와 혼합시키는데 적합한 부가적인 제제는 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 살리실산 유도체, 이의 약물전구체 에스테르 또는 약학적으로 용인가능한 염을 포함한다. 이러한 살리실산 유도체, 이의 약물전구체 에스테르 및 약학적으로 용인가능한 염은 다음을 포함한다 : 아세트아미노살롤, 알록시프린, 아스피린, 베노릴레이트, 브로모살리제닌, 칼슘 아세틸살리실레이트, 콜린 마그네슘 트리살리실레이트 디플루시날, 에테르살레이트, 펜도살, 젠다스산, 글리콜 살리실레이트, 이미다졸 살리실레이트, 리신 아세틸살리실레이트, 메살라민, 모르폴린 살리실레이트, 1-나프틸 살리실레이트, 올살라진, 파르살미드(parsalmide), 페닐 아세틸살리실레이트, 페닐 살리실레이트, 살라세타미드, 살리실아미드 O-아세트산, 살살레이트 및 술파살라진. 유사한 진통제 및 항-염증성 특성을 갖는 구조적으로 관련된 살리실산 유도체는 또한 이러한 그룹에 포함됨을 의도한다. 부가적으로 적절한 제제는 예를 들어, 프로피온산 유도체, 이의 약물전구체 에스테르 또는 약학적으로 용인가능한 염을 포함한다. 프로피온산 유도체, 이의 약물전구체 에스테르 및 약학적으로 용인가능한 염은 다음을 포함한다 : 알미노프로펜, 베녹사프로펜, 부클로실산, 카프로펜, 데신도프로펜(dexindoprofen), 페노프로펜, 플루녹사프로펜, 플루프로펜(fluprofen), 플루비프로펜, 푸르클로프로펜(furcloprofen), 이부프로펜, 이부프로펜 알루미늄, 이부프록삼, 인도프로펜, 이소프로펜(isoprofen), 케토프로펜, 록소프로펜, 미로프로펜(miroprofen), 나프록센(naproxen), 옥사프로진, 피케토프로펜, 피메프로펜(pimeprofen), 피르프로펜, 프라노프로펜, 프로티진산, 피리독시프로펜(pyridoxiprofen), 수프로펜, 티아프로펜산 및 티옥사프로펜(tioxaprofen). 유사한 진통제 및 항-염증성 특성을 갖는 구조적으로 관련된 프로피온산 유도체는 또한 이러한 그룹에 포함됨을 의도한다. 또한 아세트산 유도체, 이의 약물전구체 에스테르 또는 약학적으로 용인가능한 염은 사용하기에 적절하다. 아세트산 유도체, 이의 약물전구체 에스테르 및 약학적으로 용인가능한 염은 다음을 포함한다 : 아세메타신, 알클로페낙, 암페낙, 부페사막, 신메타신, 클로피락, 델메타신(delmetacin), 디클로페낙 소듐, 에토돌락, 펠비낙, 펜클로페낙, 펜클로락(fenclorac), 펜클로진산, 펜티아작, 푸로페낙(furofenac), 글루카메타신, 이부페낙, 인도메타신, 이소페졸락, 이속제팍, 로나졸락, 메티아진산, 옥사메타신(oxametacin), 옥스피낙(oxpinac), 피메타신(pimetacin), 프로글루메타신, 술린닥, 탈메타신(talmetacin), 티아라미드, 티오피낙(tiopinac), 톨메틴, 지도메타신(zidometacin) 및 조메피락. 유사한 진통제 및 항-염증성 특성을 갖는 구조적으로 관련된 아세트산 유도체는 또한 이러한 그룹에 포함됨을 의도한다. 부가적으로 페남산 유도체, 이의 약물전구체 에스테르 또는 약학적으로 용인가능한 염은 본원에 기재된 바와 같이 사용하기에 적절하다. 페남산 유도체, 이의 약물전구체 에스테르 또는 약학적으로 용인가능한 염은 다음을 포함한다 : 엔페남산, 에토페나메이트, 플루페남산, 이소닉신, 메클로페남산, 메클로페나메이트 소듐, 메도페남산(medofenamic acid), 메파남산(mefanamic acid), 니플룸산, 탈니플루메이트, 테로페나메이트, 톨페남산 및 우페나메이트(ufenamate). 유사한 진통제 및 항-염증성 특성을 갖는 구조적으로 관련된 페남산 유도체는 또한 이러한 그룹에 포함됨을 의도한다.

또한, 사용될 수 있는 적절한 카르복시산 유도체, 이의 약물전구체 에스테르 및 약학적으로 용인가능한 염은 다음을 포함한다 : 클라다낙, 디플루니살, 플루페니살, 이노리딘(inoridine), 케토롤락(ketorolac) 및 티노리딘. 유사한 진통제 및 항-염증성 특성을 갖는 구조적으로 관련된 카르복시산 유도체는 또한 이러한 그룹에 포함됨을 의도한다. 부티르산 유도체, 이의 약물전구체 에스테르 또는 약학적으로 용인가능한 염은 부가적으로 적절하다. 부티르산 유도체, 이의 약물전구체 에스테르 또는 약학적으로 용인가능한 염은 다음을 포함한다 : 부마디존, 부티부펜, 펜부펜 및 젠부신. 유사한 진통제 및 항-염증성 특성을 갖는 구조적으로 관련된 부티르산 유도체는 또한 이러한 그룹에 포함됨을 의도한다. 옥시캄, 이의 약물전구체 에스테르 또는 약학적으로 용인가능한 염은 또한 적절하다. 옥시캄, 이의 약물전구체 에스테르 및 약학적으로 용인가능한 염은 다음을 포함한다 : 드록시캄, 에놀리캄(enolicam), 이속시캄, 피록시캄, 수독시캄, 테녹시캄 및 4-히드록시-1,2-벤조티아진 1,1-디옥시드 4-(N-페닐)-카르복사미드. 유사한 진통제 및 항-염증성 특성을 갖는 구조적으로 관련된 옥시캄은 또한 이러한 그룹에 포함됨을 의도한다. 피라졸, 이의 약물전구체 에스테르 또는 약학적으로 용인가능한 염은 또한 적절하다. 사용될 수 있는 피라졸, 이의 약물전구체 에스테르 또는 약학적으로 용인가능한 염은 다음을 포함한다 : 다이페나미졸 및 에피리졸. 유사한 진통제 및 항-염증성 특성을 갖는 구조적으로 관련된 피라졸은 또한 이러한 그룹에 포함됨을 의도한다. 게다가, 피라졸론, 이의 약물전구체 에스테르 또는 약학적으로 용인가능한 염은 또한 적절하다. 사용될 수 있는 피라졸론, 이의 약물전구체 에스테르 및 약학적으로 용인가능한 염은 다음을 포함한다 : 아파존, 아자프로파존, 벤즈피페릴론, 페프라존, 모페부타존, 모라존, 옥시펜부타존, 페닐부타존, 피페부존, 프로필페나존(propylphenazone), 라미페나존, 석시부존 및 티아졸리노부타존. 유사한 진통제 및 항-염증성 특성을 갖는 구조적으로 관련된 피라졸론은 또한 이러한 그룹에 포함됨을 의도한다.

TNF-매개 질환을 치료하기 위한 약물전구체 에스테르 또는 이의 약학적으로 용인가능한 염은 또한 적절하다. 코르티코스테로이드, 이의 약물전구체 에스테르 및 약학적으로 용인가능한 염은 히드로코르티손 및 다음과 같은 히드로코르티손으로부터 유도된 화합물을 포함한다 : 21-아세톡시-프레그니놀론, 알클로메라손(alclomerasone), 알게스톤, 암시노나이드, 베클로메타손, 베타메타손, 베타메타손 발레레이트, 부데소나이드, 클로로프레드니손, 클로베타솔, 클로베타솔 프로피오네이트, 클로베타손(clobetasone), 클로베타손 부티레이트, 클로코톨론, 클로프레드놀, 코르티코스테론, 코르티손, 코르티바졸, 데플라자콘(deflazacone), 데소나이드, 데속시메라손(desoximerasone), 덱사메타손, 디플로라손, 디플루코톨론, 디플루프레드네이트, 에녹솔론, 플루아자코르트, 플루클로로나이드, 플루메타손, 플루메타손 피발레이트, 플루니솔라이드, 플루시놀론 아세토나이드, 플루오시노나이드, 플루오시놀론 아세토나이드, 플루오코틴 부틸, 플루오코톨론, 플루오로코톨론 헥사노에이트, 디플루코톨론 발레레이트, 플루오로메톨론, 플루페롤론 아세테이트, 플루프레드니덴 아세테이트, 플루프레드니솔론, 플루란데놀리드(flurandenolide), 포르모코르탈, 할시노나이드, 할로메타손, 할로프레돈 아세테이트, 히드로코르타메이트, 히드로코르티손, 히드로코르티손 아세테이트, 히드로코르티손 부틸레이트, 히드로코르티손 포스페이트, 히드로코르티손 21-소듐 숙시네이트, 히드로코르티손 테부테이트, 마지프레돈, 메드리손, 메프레드니손, 메틸프레드니콜론(methylprednicolone), 모메타손 푸로에이트, 파라메타손, 프레드니카르베이트, 프레드니솔론, 프레드니솔론 21-디에드리아미노아세테이드(diedryaminoacetate), 프레드니솔론 소듐 포스페이트, 프레드니솔론 소듐 숙시네이트, 프레드니솔론 소듐 21-m-술포벤조에이트, 프레드니솔론 소듐 21-스테아로글리콜레이트(stearoglycolate), 프레드니솔론 테부테이트, 프레드니솔론 21-트리메틸아세테이트, 프레드니손, 프레드니발, 프레드닐리덴, 프레드닐리덴 21-디에틸아미노아세테이트, 틱소코톨, 트리암시놀론, 트리암시놀론 아세토나이드, 트리암시놀론 베네토나이드 및 트리암시놀론 헥사아세토나이드. 유사한 진통제 및 항-염증성 특성을 갖는 구조적으로 관련된 코르티코스테로이드는 또한 이러한 그룹에 포함됨을 의도한다.

항균제(및 이의 약물전구체 에스테르 또는 약학적으로 용인가능한 염)는 또한 본원에 기재된 바와 같이 배합 용도로 적절하다. 적절한 항균제는 다음을 포함한다 : 예를 들어, 암피실린, 아목시실린, 아우레오마이신(aureomicin), 바시트라신, 세프타지딤, 세프트리악손, 세포탁심, 세파클로르(cephachlor), 세팔렉신(cephalexin), 세프라딘, 시프로플록사신, 클라불란산, 클로사실린, 디클록사실란(dicloxacillan), 에리트로마이신, 플루클록사실란(flucloxacillan), 겐타마이신, 그라미시딘, 메티실란(methicillan), 네오마이신, 옥사실란(oxacillan), 페니실린 및 반코마이신. 유사한 진통제 및 항-염증성 특성을 갖는 구조적으로 관련된 항균제는 또한 이러한 그룹에 포함됨을 의도한다.

부가적인 적절한 화합물은 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : BN 50730 ; 테니댑 ; E 5531 ; 티아파판트(tiapafant) PCA 4248 ; 파나비르(panavir) ; 롤리프람 ; PR 73401 ; 펩티드 T ; MDL 201,449A ; (1R,3S)-시스-1-[9-(2,6-디아미노퓨리닐)]-3-히드록시-4-시클로펜텐 히드로클로라이드 ; (1R,3R)-트랜스-1-[9-(2,6-디아미노)퓨린]-3-아세톡시시클로펜탄 ; (1R,3R)-트랜스-1-[9-아덴일)-3-아지도시클로펜탄 히드로클로라이드 및 (1R,3R)-트랜스-1-[6-히드록시-퓨린-9-일)-3-아지도시클로펜탄.

IL-4 는 천식과 같은 몇몇 경우에서 염증성 효과를 유도할 수 있으며, 폐에서의 IL-4 의 과발현(over-expression)이 상피세포의 비대증, 및 림프구, 호산구 및 호중구의 축적을 초래함을 발견하였다. 이러한 반응은 다른 Th2 사이토카인에 의해 유도되는 전염증 반응(proinflammatory response)의 주요한 특징으로 대표적이다. 따라서, 상기에 나타낸 바와 같이 IL-4 의 저해제는 본 발명에 있어서 또한 유용하다. 부가적으로, 특정 면역억제 약물이 iNOS 저해제 및 5-리폭시게나제 저해제를 포함하지만 이로 제한되지 않는 관절염 치료에 사용될 수 있음을 인지할 수 있다.

생강이 특정 항-염증 특성을 가짐을 나타내었으므로 콘드로이틴과 같은 본 발명에 따른 항-염증제로서 사용하기에 적절하다.

특정 실시형태에서, 암 치료제와 함께 치료하기 전에, 동시에 또는 후에 Ang-2 에 대한 특이 결합제를 투여할 수 있다. 일반적인 암은 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : 유방암, 결장직장암, 위 암종, 신경교종, 머리 및 목 편평상피암, 유전성 및 산발성 유두상의 신장 암종, 백혈병, 림프종, 리-프라우메니 증후군, 악성 흉막 중피종, 흑색종, 다발성 골수종, 비-소세포 폐 암종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 소세포폐암, 활액막 육종, 갑상성 암종 및 방광의 이행상피암.

특정 실시형태에서, 암 치료를 위해 Ang-2 에 대한 특이 결합제를 단독으로 사용하거나 또는 적어도 하나의 부가적인 치료학적 제제와 함께 사용할 수 있다. 특정 실시형태에서, Ang-2 에 대한 특이 결합제를 치료학적 유효량의 부가적인 치료학적 제제와 함께 사용할 수 있다. Ang-2 에 대한 특이 결합제와 함께 투여될 수 있는 일반적인 치료학적 제제는 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : 아니사마이신(anisamycin) 항생제의 겔다나마이신과(geldanamycin family)의 물질 ; Pro-HGF ; NK2 ; c-Met 펩티드 저해제 ; Grb2 Src 상동성 2 의 길항물질 ; Gab1 조절인자 ; 우성-음성 Src ; 위트만닌(wortmannin)을 포함하지만 이로 제한되지 않는 본-히펠-란다우(von-Hippel-Landau) 저해제 ; P13 키나제 저해제, 다른 항-수용체 치료, 항 EGFR, COX-2 저해제, Celebrex^™ ; Vioxx^™ ; 맥관 내피 성장 인자(VEGF), VEGF 조절인자, 섬유아세포 성장 인자(FGF), FGF 조절인자, 표피 성장 인자(EGF) ; EGF 조절인자 ; 케라틴세포 성장 인자(KGF), KGF-관련 분자, KGF 조절인자 ; 매트릭스 금속단백질분해효소(MMP) 조절인자.

특정 실시형태에서, 본 발명은 Ang-2 에 대한 특이 결합제 및 적어도 하나의 세린 프로테아제 저해제를 포함하는 직접적인 치료 및 이러한 치료를 사용하는 치료 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 치료는 Ang-2 에 대한 특이 결합제, 세린 프로테아제 저해제 및 본원에 기재된 적어도 하나의 부가적인 분자를 포함한다.

특정 예에서, 프로테아제/프로테아제 저해제 균형의 교란은 전이를 유도하는 정상 조직의 종양 침입을 포함하지만 이로 제한되지 않는 프로테아제-매개 조직 파괴를 유도할 수 있다.

특정 실시형태에서, Ang-2 에 대한 특이 결합제는 염증에 대한 적어도 하나의 치료학적 제제와 함께 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, Ang-2 에 대한 특이 결합제는 면역 질환에 대한 적어도 하나의 치료학적 제제와 함께 사용될 수 있다. 염증 및 면역 질환에 대한 일반적인 치료학적 제제는 다음을 포함하지만 이로 제한되지 않는다 : 38 kDa 미토겐-활성 단백질 키나제(p38-MAPK)의 사이클로옥시게나제 제 1 형(COX-1) 및 사이클로옥시게나제 제 2 형(COX-2) 저해제 소형 분자 조절인자 ; 염증 경로에서 포함되는 세포내 분자의 소형 분자 조절인자, 여기에서 이러한 세포내 분자는 jnk, IKK, NF-kB, ZAP 70 및 lck 를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 염증에 대한 특정한 일반적인 치료학적 제제는 예를 들어, 미국 캘리포니아 사우전드 오크스에 소재하는 Amgen Inc. 의 문헌 C.A. Dinarello 및 L.L. Moldawer Proinflammatory and Anti-Inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis : A Primer for Clinicians Third Edition(2001)에 기재되어 있다.

특정 실시형태에서, 약학적 조성물은 Ang-2 에 대한 하나 이상의 상이한 특이 결합제를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 약학적 조성물은 하나 이상의 에피토프에 결합하는 Ang-2 에 대한 하나 이상의 특이 결합제를 포함할 수 있다.

면역치료법

일반적으로 면역치료법은 암세포를 표적으로 하고 이를 파괴하기 위한 면역 작용인자(effector) 및 분자의 사용에 의존한다. 면역 작용인자는 예를 들어, 표적 세포의 표면 상의 몇몇 마커를 인지하는 본 발명의 항체일 수 있다. 항체는 단독으로 치료 작용인자로 제공되거나 또는 실제로 세포 사멸에 영향을 미치는 다른 세포를 보충할 것이다. 또한 항체를 약물 또는 독소(화학요법, 방사선핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 결합시킴으로써 항체는 단지 표적화제(targeting agent)로서 제공될 수 있다.

본 발명에 따라, 본 발명의 항체 또는 항체 접합물 둘 중 하나의 면역치료제에 의해 돌연변이 형태의 Ang-2 가 표적화될 수 있다. 특히, 본 발명의 항체 조성물은 Ang-2 표적 치료요법과 함께 병용된 치료요법에 사용될 수 있을 것으로 예상된다.

수동 면역치료법은 특히 수많은 암에 대하여 효과적임이 증명되었다. 예를 들어, 국제 특허 번호 제 WO 98/39027 호를 참조하라.

다음의 실시예는 오직 설명하기 위한 목적으로 기재하였으나 이로 인하여 본 발명의 범주를 제한하지는 않는다.

실시예 1 병리학적 조직 및 정상 조직에서의 Ang -2 발현

정상 조직 및 병리학적 조직에서 원위치 혼성화를 사용하여 Ang-2 의 발현을 시험하였다. 인체 Ang-2 서열 단편(Genbank 기탁번호 제 AF004327 호, 누클레오티드 1274-1726) 및 마우스의 Ang-2 서열 단편(Genbank 기탁번호 제 AF004326 호, 누클레오티드 1135-1588)을 인체 또는 마우스 태아 폐 cDNA 로부터 역전사효소-PCR 을 이용하여 증폭시키고 pGEM-T 플라스미드(ATCC 기탁번호 제 #200123 호) 내에 클로닝시킨 다음에 서열결정하여 확인하였다. ³³P-UTP 및 RNA 중합효소를 이용하여 선형 플라스미드 주형으로부터 ³³P-표지 안티센스 RNA 프로브를 전사시켰다. 포름알데히드-고정화를 차단한, 파라핀이 내장된 조직을 5 ㎛ 로 절단하여 하전된(charged) 슬라이드 위에 놓았다. 원위치 혼성화 전에, 0.2 M HCl 에 조직을 통과시킨 다음, 단백질 분해효소 K 로 분해하고 트리에탄올아민 및 무수아세트산으로 아세틸화시켰다. 절편을 방사성 표지된 프로브로 55 ℃ 에서 밤새도록 혼성화시킨 다음, RNase 로 분해하고 55 ℃ 의 약 0.1 × SSC 에서 매우 엄격하게 세척하였다. 슬라이드를 Kodak NTB2 에멀젼에 담근 다음, 4 ℃ 에서 2-3 주 동안 노출시키고 현상 한 다음에 대조염색시켰다. 조직 형태학 및 혼성화 신호를 동시에 평가하기 위해 암시야 조명법 및 표준 조명법으로 절편을 시험하였다.

정상적인 생후 인체에 있어서, Ang-2 가 난소, 태반 및 자궁과 같은 맥관형성성 맥관구조를 포함한 극히 소수의 조직에서 제한적으로 발현됨을 결과로써 나타내었다. Ang-2 는 정상적인 성인 인체의 심장, 뇌, 신장, 간, 폐, 췌장, 비장, 근육, 편도, 흉선, 충수, 림프절, 담낭, 전립선 또는 고환에서는 발현되지 않았다. 5 주된 마우스(성인 원숭이 또는 인체를 포함하지 않음)에서, 신장은 직혈관에서 현저한 Ang-2 의 발현을 나타내었다. 이러한 발현이 배발생의 잔유물인지 아닌지를 결정하기 위해서, 상기한 조건 및 마우스 Ang-2 프로브를 사용하여 최대 생후 1 년된 마우스로부터 유래된 신장에서 본 실험을 반복하였다. Ang-2 의 발현은 생후 발달 동안에는 감소하였으나 생후 1 년된 마우스의 신장에서는 분명하게 발현되었다.

또한 Ang-2 발현은 실질적으로 다음을 포함한 시험된 모든 종양 유형에서 검출되었다 : 대장 암종(5 건), 유방 암종(10 건), 폐 암종(8 건), 신경교아세포종(1 건)과 같은 원발성 인체 종양 ; 뇌로 전이되는 유방 암종(2 건), 폐 암종(2 건) 및 난소 암종(2 건)과 같은 전이성 인체 종양 ; 및 C6(랫 신경교종), HT29(인체 대장 암종), Colo-205(인체 대장 암종), HCT116(인체 대장 암종), A431(인체 유표피종 암종), A673(인체 횡문근육종), HT1080(인체 섬유 육종), PC-3(인체 전립선 암종), B16F10(마우스 흑색종), MethA(마우스 육종) 및 루이스(Lewis) 폐 암종 메트(mets)와 같은 설치류 종양 모델. 게다가, Ang-2 의 발현은 VEGF 에 반응하여 Matrigel 플러그 내에서 성장하는 신생혈관 및 미숙아의 망막증의 저산소증 마우스 모델에서 검출되었다.

실시예 2 재조합 mAng -2 단백질 및 토끼 폴리클로날 항- Ang -2 항혈청의 생산

전장의 인체 Ang-2 에 대한 PCR 프라이머를 사용하여 마우스 15-일 배아의 cDNA 라이브러리(Marathon-Ready-cDNA, 카탈로그 번호 제 #7459-1 호, Clonetech, Inc. 에서 입수)로부터 PCR(Clontech Advantage PCR 키트, 카탈로그 번호 제 #K1905-01 호)하여 전장의 His-표식 마우스 Ang-2 의 cDNA 를 수득하였다. PCR 산물을 CMV 프로모터 발현 벡터(Invitrogen corporation 에서 입수)에 결합시키고 결과적으로 생성된 플라스미드를 FuGENE6 트랜스펙션 시약(Roche 에서 입수, 카탈로그 번호 제 #1814443 호)을 사용하여 HT1080 인체 섬유육종 세포(ATCC 기탁번호 제 CCL-121 호) 내로 트랜스펙션시켰다. 안정한 클론을 G418 선별로 분리하였다. 항-His 표식 ELISAs 및 웨스턴 블롯팅으로 mAng-2-his 발현 클론을 스크 리닝하였다.

재조합 mAng-2 폴리펩티드를 이러한 세포의 조정배지로부터 정제하였다. mAng-2-His 를 포함하는 조정배지를 두 단계의 크로마토그래피 프로토콜로 정제하였다. 간단히 말해서, 조정배지는 약 20 mM 의 최종 농도에서 pH 9.5 의 트리스 완충용액을 첨가하여 pH 8.9 가 되도록 적정하였다. 부가적으로, 최종 농도가 5 mM 이 되도록 세정제 CHAPS 를 첨가하였다. 그런 다음에 조정배지를 음이온 교환 컬럼 Q-세파로스 ff(Pharmacia 에서 입수)에 직접 가하였다. 컬럼을 약 50 mM 의 NaCl 을 함유하는 약 10 mM 의 pH 8.0 트리스로 세척하였다. 약 350 mM 의 NaCl 및 약 5 mM 의 CHAPS 를 함유하는 10 mM 의 pH 8.0 트리스를 사용하여 재조합 mAng-2-His 를 단일 단계로 용출시켰다.

Q-세파로스 컬럼으로부터의 용출물을 약 4 mM 의 이미다졸로 조정한 다음, 고정된 금속 친화도 컬럼[Ni-NTA 슈퍼플로우(superflow)(Qiagen 에서 입수)]에 가하였다. 약 5 mM 의 CHAPS 및 약 100 mM 의 이미다졸을 함유하는 PBS 로 결합된 단백질을 용출시켰다. 용출물이 약 1.0 ㎎/ml 가 되도록 농축시킨 다음에 PBS 에 대하여 투석하였다. mAng-2-His 의 순도는 SDS-PAGE 쿠마시 염색으로 측정시 90 % 보다 높았다.

항체를 생산하기 위해 약 0.2 ㎎ 의 mAng-2/주사로 토끼를 면역화시켰다. 1 : 1 비율로 약 1 mL 의 Hunter's TiterMax^®(Sigma 에서 입수) 및 mAng-2 를 토끼에게 주사하였다. 4 주 후에, 각각의 토끼를 반복적으로 주사하거나 또는 추가면역시켰고 ; 2 주 후에 다시 추가면역시킨 다음, 7 주 후에는 혈청을 채취하여 mAng-2 에 대한 적정농도를 측정하였다. 혈청의 적정농도가 높은 경우에, 50 mL 의 새로이 생성된 혈액(production bleed)을 연속적으로 6 주 동안 매주 채취하였다. 그러나 혈청의 적정농도가 낮은 경우에는, 토끼에게 부가적으로 추가면역시킨 다음, 50 mL 의 새로이 생성된 혈액을 9 주에 시작하여 연속적으로 6 주 동안 매주 채취하였다. 혈액이 새로이 생성된 지 6 주 후에, 토끼를 6 주 동안 쉬게 하였다. 만약 혈청이 더 필요한 경우에는, 마지막 혈액을 생성한지 1 개월 후에 다시 추가면역시켰다.

중화 ELISA(하기에 기재하였음)를 사용하여, 두 마리 토끼 5254 및 5255 의 항-mAng-2 토끼 폴리클로날 항혈청이 mAng-2 : Tie2 상호작용을 중화시키는지를 관찰하였다.

실시예 3 Ang-2 항체를 측정하기 위한 분자 검정

Ang-2 및 관련된 과(family)의 멤버(member)에 결합하는 직접적인 항체, 및 Ang-2 : Tie-2 의 상호 작용에서 항체의 효과를 평가하기 위해 분자 검정(친화도 ELISA, 중화 ELISA 및 BIAcore)이 개발되었다. 이러한 생체외 및 세포-기저 검정을 하기에 기재하였다.

A. 친화도 ELISA 후보물질인 항-Ang-2 항체를 초기에 스크리닝하기 위하여, 정제된 인체 Ang-2 폴리펩티드[R and D Systems, Inc. 에서 입수 ; 카탈로그 번호 제 623-AN 호 ; Ang-2 는 2 개의 절두된 이형물(version)의 혼합물로서 공급됨] 또는 마우스 Ang-2 폴리펩티드(상기한 바와 같이 제조함)를 사용하였다. 결합 검정을 확인하기 위해서, 전장의 인체 Ang-2 DNA 를 트랜스펙션시킨 인체 293T 세포(ATCC 기탁번호 제 #CRL-1573 호)의 조정배지로부터 인체 Ang-2 를 수득한 다음 약 50 ㎍/㎖ 의 우혈청 알부민(BSA : bovine serum albumin)을 함유하는 무혈청 DMEM 에서 배양하였다.

마이크로플레이트를 사용하여, 약 100 ㎕/웰의 Ang-2 를 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 약 2 시간 동안 항온시킨 다음 약 0.1 % 의 트윈-20 을 함유하는 인산염완충식염수(PBS : phosphate buffered saline)로 4 회 세척하였다. 그 다음, 약 5 % 의 BSA 를 포함하는 약 250 ㎕/웰의 PBS 를 사용하여 웰을 차단한 다음 플레이트를 약 2 시간 동안 실온에서 항온시켰다. 항온시킨 후에, 과량의 차단용액을 제거하고 약 100 ㎕ 의 후보물질인 항-Ang-2 항체를 약 40 nM 의 농도에서 시작하여 계열 희석한 다음 약 1 % 의 BSA 를 함유하는 PBS 로 4 배 계열 희석한 희석물을 각각의 웰에 첨가하였다. 그 다음, 플레이트를 실온에서 밤새도록 항온시켰다. 항온시킨 후에, 플레이트를 약 0.1 % 의 트윈-20 을 함유하는 PBS 로 세척하였다. 추가로 4 회 반복해서 세척한 다음 1 % 의 BSA(우혈청 알부민)를 함유하는 PBS 로 1 : 5000 으로 이미 희석된 100 ㎕/웰의 염소 항-인체 IgG(Fc)-HRP(Pierce Chemical Co. 에서 입수, 카탈로그 번호 제 #31416 호)를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 약 1 시간 동안 항온시켰다. 플레이트를 약 0.1 % 의 트윈-20 을 함유하는 PBS 로 5 회 세척한 다음 약 100 ㎕/웰의 TMB 기질(3,3＇,5,5'-테트라메틸벤지딘 액상 기질계 ; 미국 미주리 세인트 루이스에 소재하는 Sigma chemical Company 에서 입수, 카탈로그 번호 제 T8665 호)을 첨가하고 파란색이 나타낼 때까지 약 5-15 분간 플레이트를 항온시켰다. 그 다음, 분광광도계로 약 370 ㎜ 에서 흡광도를 측정하였다.

B. 중화 ELISA 인체 Ang-2 폴리펩티드가 결합된 마이크로플레이트를 친화도 ELISA 에 대하여 상기한 바와 같이 제조하였다. 약 1 % 의 BSA 및 약 1 nM 의 Tie2(Tie2 부분이 분자의 가용성인 세포외 부분만을 함유하는 Tie-2-Fc 분자로서 제공됨 ; R and D Systems, Inc. 에서 입수, 카탈로그 번호 제 313-TI 호)를 함유하는 PBS 용액으로 상기 친화도 ELISA 에 대해 기재한 바와 같이 계열 희석하여 후보물질인 항-Ang-2-항체를 제조하였다. 약 100 ㎖ 의 항체/Tie-2 용액을 각각의 웰에 첨가한 다음, 플레이트를 실온에서 밤새 항온시킨 다음에 약 0.1 % 의 트윈-20 을 함유하는 PBS 로 5 회 세척하였다. 세척한 후에, 최종 농도가 약 1 ㎍/㎖ 가 되도록 약 100 ㎕/웰의 항-Tie2 항체(Pharmingen Inc. 에서 입수, 카탈로그 번호 제 #557039 호)를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 약 1 시간 동안 항온시켰다. 그 다음, 약 100 ㎕/웰의 염소 항-마우스-IgG-HRP(Pierce Chemical Co. 에서 입수, 카탈로그 번호 제 #31432 호)를 약 1 % 의 BSA 를 함유하는 PBS 의 1 : 10,000 의 희석물에 첨가하였다. 플레이트를 약 1 시간 동안 실온에서 항온시킨 다음 약 0.1 % 의 트윈-20 을 함유하는 PBS 로 5 회 세척하였다. 약 100 ㎕/웰의 TMB 기질(상기하였음)을 첨가한 다음에 색이 나타나게 하였다. 그 다음, 분광광도계로 370 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

C. 친화도 BIAcore 전개 완충용액인 0.005 % 의 P20 계면활성제(BIAcore, Inc. 에서 입수) 및 PBS 를 포함하는 BIAcore^®2000(미국 뉴저지 피스카타웨이에 소재하는 BIAcore, Inc. 에서 입수) 상에서 각각의 후보물질인 Ang-2 항체의 친화도 검정을 실행하였다. 제조업자가 제안한 프로토콜에 따라 아민 결합 키트(BIAcore, Inc. 에서 입수)를 사용하여 1 차 아민기를 통해 연구 단계의 CM5 센서 칩(CM5 Sensor chip, BIAcore, Inc. 에서 입수)에 재조합 단백질 G(미국 매사추세츠 니덤에 소재하는 Repligen 에서 입수)를 고정시켰다.

고정된 단백질 G 에 약 100 Ru 의 각각의 후보물질인 항-Ang-2 항체를 첫 번째로 부착시킨 다음 다양한 농도(0-100 nM)의 huAng-2 또는 mAng-2 를 약 3 분 동안 약 50 ul/분의 유속으로 결합된 항체 표면 상에 주사함으로써 결합 검정을 실행하였다. BIA 평가 3.1 컴퓨터 프로그램(BIAcore, Inc. 에서 입수)을 사용하여 k_a(회합 속도상수), k_d(해리 속도상수) 및 K_D(해리 평형상수)를 포함한 항체 결합 반응속도를 측정하였다. 보다 낮은 해리 평형상수는 Ang-2 에 대한 항체의 보다 높은 친화도를 나타낸다.

실시예 4 파지 디스플레이에 의한 완전 인간 Ang -2 항체의 생산

다음의 프로토콜에 따라 인체 Ang-2 폴리펩티드(R and D Systems, Inc. 에서 입수, 카탈로그 번호 제 623-AN 호)에 대하여 Target Quest 파지 디스플레이 Fab 라이브러리(Target Quest, Inc. 에서 입수)를 사용하여 완전 인간 Ang-2 항체를 생성하였다.

인체 Ang-2 를 다음의 2 가지 방법에 따라 폴리스티렌 마그네틱(magnetic) 비드의 표면에 고정시켰다 : (1) 4 ℃ 에서 밤새 50 ug/㎖ 의 Ang-2 의 직접적인 코팅 ; 및 (2) 4 ℃ 에서 밤새 50 ug/㎖ 의 염소 항-Ang-2 항체에 의한 Ang-2 의 간접적인 포획. 비드 표면을 PBS 에 용해된 2 % 우유(MPBS)로 차단시켰다. 코팅되지 않은 마그네틱 비드 또는 염소 항-Ang-2 항체에 반응하는 파지 클론을 제거하기 위해 인체 Fab 파지 라이브러리(Target Quest, Inc. 에서 입수)를 예비-선별하였다. 그런 다음 Ang-2-코팅 마그네틱 비드를 실온에서 1.5 시간 동안 라이브러리 파지와 함께 항온시켰다. 파지 결합 단계 후에, 표면을 약 0.1 % 의 트윈 20 을 함유하는 MPBS 로 6 회 세척한 후 약 0.1 % 의 트윈 20 을 함유하는 PBS 로 6 회 세척하고 PBS 로 2 회 세척하였다. 결합 파지를 약 100 ug/㎖ 의 인체 Tie2-Fc(미국 미네소타 미네아폴리스 소재하는 R and D Systems, Inc. 에서 입수)와 함께 첫 번째로 용출시킨 다음에 약 100 mM 의 트리에탄올아민과 함께 용출시켰다. 용출된 파지를 E.coli TG1 세포(Amersham Pharmacia Biotech 에서 입수) 내로 감염시키고 증 폭시킨 다음에 다음 단계의 스크리닝을 위해 수득하였다. 좀더 엄격한 세척을 적용하고 투입된 파지의 수를 감소시켜 연속적인 단계에서 선별 압력을 증가시켰다. 3 차 선별 후에, 상기한 바와 같이 ELISA 친화도 검정을 사용하여 측정한 인체 Ang-2, 마우스 Ang-2 및 랫 Ang-2 를 인식하는 사실상 모든 18 개의 특정한 Ang-2-결합 Fab 클론을 확인하였다. 약 10 % 의 이러한 파지는 또한 인체 Ang-1 에 결합하였다. 이러한 클론을 하기한 바와 같이 IgG1 항체 내로 변환시켰다.

부가적인 특정 파지를 수득하기 위해, 2 차 스크리닝을 동일한 라이브러리를 사용하여 약간 상이한 프로토콜로 실시하였다. 이러한 프로토콜에서, 약 4 ℃ 에서 밤새 Nunc Maxisorp 이뮤노튜브(immunotube) 내의 pH 9.6 인 NaHCO₃ 완충용액에 인체 Ang-2 를 평판하였다. Ang-2 를 1, 2 및 3 차 실시에 대하여 각각 약 1.5, 0.74 및 0.3 ug/㎖ 로 평판하였다. 약 4 ㎖ 의 2 % MPBS 내에 상기한 동일한 파지 디스플레이 라이브러리(Target Quest, Inc. 에서 입수)로부터의 약 2×10¹² 파지 입자(라이브러리 내의 각 특정 파지의 약 50 개의 복제)와 함께 항온시키기 전에, PBS 에 용해된 약 2 % 의 우유(MPBS)를 사용하여 이뮤노튜브의 표면을 차단시켰다. 파지 항온 단계 후에, 표면을 PBS 와 약 0.1 % 트윈 20 으로 20 회 세척한 후 PBS 로 20 회 세척하였다. 1 uM 의 hAng-2 또는 1 uM 의 인체 Tie2(R and D Systems, Inc. 에서 입수, 상기에 기재함)를 사용하여 결합된 파지를 용출시켰다. 용출된 파지를 E.coli TG1 세포(파지 라이브러리와 함께 제공됨) 내로 감염시키고 증폭시킨 다음에 다음 단계의 스크리닝을 위해 수득하였다. hAng-2 또는 Tie2 가 결합하는 모든 파지를 PCR 증폭시켜 16 개의 특정한 Ang-2-결합 Fab 클론을 확인하였으며, 이러한 클론을 제한 절단하여 분석하였다. 각 클론의 DNA 를 서열결정하였다.

각각의 파지로부터의 각각의 중쇄 가변영역을 코드하는 서열을 상보적 프라이머와 함께 증폭시켰다. HindⅢ 부위, XbaI 부위, 코작(Kozak) 서열 및 신호 서열(번역된 펩티드는 MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC ; SEQ ID NO : 202 이다)을 가변영역의 5' 말단에 결합시키기 위해 프라이머를 제조하였으며 BsmBI 부위를 PCR 산물의 3' 말단에 첨가하였다. 중쇄를 어떻게 클로닝시키는지에 대한 예로서, 신호 서열의 끝부분의 7 개 아미노산이 첨가된 프라이머 2248-21(GTG GTT GAG AGG TGC CAG ATG TCA GGT CCA GCT GGT GCA G ; SEQ ID NO : 203) 및 가변영역의 말단에 BsmBI 부위가 첨가된 프라이머 2502-31(ATT ACG TCT CAC AGT TCG TTT GAT CTC CAC ; SEQ ID NO : 204)을 사용하여 클론 544(SEQ ID NO : 19)에 대한 주형 파지 DNA 를 증폭시켰다. 신호 펩티드(AQLLGLLLL ; SEQ ID NO : 206)에 9 개의 아미노 산이 첨가된 프라이머 2148-98(CCG CTC AGC TCC TGG GGC TCC TGC TAT TGT GGT TGA GAG GTG CCA GAT ; SEQ ID NO : 205) 및 프라이머 2502-31 을 사용하여 결과적으로 생성된 산물을 증폭시킨 후에, 프라이머 2489-36(CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA CAT GAG GGT CCC CGC TCA GCT CCT GGG ; SEQ ID NO : 207) 및 프라이머 2502-31 을 사용하여 증폭시켰다. 프라이머 2489-36 에 5' 에서 3' 까지의 HindⅢ 부위, XbaI 부위, 코작 서열, 및 신호 서열의 첫번째 6 개 아미노산을 첨가하였다. PCR 산물을 XbaI 및 BsmBI 로 절단한 후 인체 IgG1 불변영역을 함유하는 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝시켰다. 이러한 벡터는 SV40 프로모터 및 DHFR 선별을 포함한다.

각 파지로부터의 경쇄는 카파 또는 람다 클래스 둘 중 하나이다. 각각의 경쇄에서, 5' 에서 3' 까지 HindⅢ 부위, XbaI 부위, 코작 서열 및 신호 서열을 첨가하여 상보적인 프라이머를 제조하였다(상기를 참조하라). 오류 없는 코딩 영역을 갖는 이러한 쇄를 전장의 산물로서 클로닝시켰다. 예를 들어, 신호 서열의 끝부분의 7 개 아미노산이 첨가된 프라이머 2627-69(GTG GTT GAG AGG TGC CAG ATG TGA CAT TGT GAT GAC TCA GTC TCC ; SEQ ID NO : 208) 및 종결 코돈 뒤에 SalI 부위가 첨가된 프라이머 2458-54(CTT GTC GAC TTA TTA ACA CTC TCC CCT GTT G ; SEQ ID NO : 209)를 사용하여 전장의 코딩 영역으로서 파지 클론 536(SEQ ID NO : 11 및 SEQ ID NO : 210)의 경쇄를 증폭시켰다. 신호 서열 및 클로닝 부위의 첨가를 마무리하기 위해, 이러한 PCR 산물을 부가적인 5' 프라이머인 2148-98 및 2489-36 으로 각각 상기에 기재한 바와 같이 증폭시키고 프라이머 2458-54 와 쌍을 이루게 하였다. 전장의 경쇄를 XbaI-SalI 단편으로서 상기한 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝시켰다.

천연의 인체 불변영역 서열과 비교했을 때 특정 람다 클론은 이들의 불변영역에 오류를 갖는다. 이러한 모순을 정정하기 위해, 완전한 람다 불변영역 및 가변영역 유래 파지를 코드하는 DNA 를 사용하여 중복 PCR 을 실시하였다. 또한 상기한 바와 같이 이러한 클론을 XbaI-SalI 단편으로서 클로닝시켰다.

카파 가변영역을 이들의 불변영역과 개별적으로 클로닝시킨 경우에 BsmBI 부위를 PCR 산물의 3' 말단에 첨가하였다. PCR 산물을 XbaI 및 BsmBI 로 절단한 후, 카파쇄 가변영역을 인체 카파 불변영역을 함유하는 발현 벡터 내로 클로닝시켰다.

일반적으로 제조업자의 제안 프로토콜에 따라 인산칼슘 트랜스펙션 키트(Invitrogen corporation 에서 입수)를 사용하여 각각의 변환된 파지로부터 쌍을 이룬 경쇄 및 중쇄 구성물을 CHO 세포(ATCC 기탁번호 제 CRL 9096 호) 내로 공동-트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션시킨 후 14-16 시간에 배지를 교체해주고, 제조업자의 권고에 따라 약 48 시간 후에 선별하기 위해 세포를 조직 배양 접시 내로 통과시켰다. 트랜스펙션된 CHO 세포 콜로니를 트립신 처리하고 트랜스펙션된 세포의 "풀(pool)" 내로 결합시키기 위한 시간인 약 3 주 동안 트랜스펙션된 세포를 HT 선별로 분리하였다.

소규모 조정배지를 48 시간 후에 수집하고 항-인간 Fc 항체, 항-인간 카파 항체 또는 항-인간 람다 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅 분석하여 생성된 항체를 검정하였다. 4 개의 850 ㎠ 회전병에 2×10⁷ 의 생존가능한 세포로 각각 접종하고 DMSO 를 사용하여 냉동 보존 세포주를 제조하기에 충분한 세포를 수득할 때까지, 선택 압력 하에 표준 조직 배양 멸균 기술을 사용하여 선별된 세포 집단을 통과시켰다. 접종 후에, 글루타민 및 비-필수 아미노산이 보충된 DMEM 배지(Gibco/BRL, Inc. 에서 입수)를 함유하는 약 10 % 의 혈청과 함께 회전병 내에 세포를 유지시켰다. 약 80 % 의 세포 군집(confluency)에 도달할 때까지 2 내지 3 일 동안 세포를 유지시켰다. 이러한 시점에서, 회전병 내의 배지를 글루타민 및 비-필수 아미노산이 보충된 무혈청 배지 혼합물(50 % DMEM 및 50 % F12, Gibco 에서 입수)로 교환하였다. 1 회 또는 2 회의 부가적인 수득을 위해 첨가된 신선한 무혈청 배지로 7 일 후에 조정배지를 수득하였다.

표준 절차에 따라 조정배지로부터 직접적으로 단백질 G 친화성 크로마토그래피를 사용하여 항체를 정제하였다. 단백질 G 컬럼으로부터의 용출은 낮은 pH(약 pH 3)의 완충용액을 사용하여 이루어졌으며, 용출된 항체 단백질을 pH 8.5 의 1 M 트리스를 사용하여 중화시킨 다음에 10 kD 분획 분자량 원심분리 농축기를 사용하여 농축시켰다. 농축된 항체 원액(antibody stock)에서 완충용액을 PBS 로 교체하였다.

31 개의 항체가 생성되었으며 표 2A 및 표 2B 에 기재된 바와 같이 이들 각각은 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄(카파 또는 람다)로 구성되어 있다.

다음의 표는 파지에서 전장의 IgG1 항체로 변환된 31 개의 항-Ang-2 항체의 중쇄 및 경쇄(카파 및 람다)의 서열 및 SEQ ID NO 를 나타낸 것이다. Kabat 등의 Sequences of Proteins of Immunological Interest(NIH Publication No. 91-3242 ; U.S. Dept. Health and Human Services, 5^th ed.)에 기재된 기술을 사용하는 VBASE 데이타베이스를 사용하여 모노클로날 항체의 상보성 결정영역(CDRs)을 예상하였다. 영국 케임브리지에 소재하는 Protein Engineering 에서 입수한 MRC Centre 로부터 이용할 수 있는 도구를 사용하여 가장 유사한(the closest) 생식계통 서열을 갖는 데이타베이스의 서열에서 Fab 영역을 서열로 정렬시킨 다음에 이러한 서열과 시각적으로 비교하였다. 각각의 가변영역(중쇄 또는 경쇄)에 대한 CDRs 를 표 7A, 표 7B, 표 7C, 표 7D, 표 7E, 표 7F 및 표 7G 에 나타내었다.

17 개의 항체 및 음성 대조 IgG1(RDB1 으로 명명됨)을 그들의 친화도, 중화 및 특이성 능력을 측정하기 위한 BIAcore 중화 검정 뿐만 아니라 친화도 및 중화 ELISA(상기 실시예 3 에 기재됨)를 사용하여 시험하였다. 결과를 다음의 표 8 에 나타내었으며 이는 표준 방법을 사용하여 계산하였다.

2 개의 항체인 클론 536 및 클론 545 를 상기한 BIAcore 검정을 사용하여 평가하였다. BIAcore 검정에 대해 상기한 바와 같이 보다 큰 친화도를 나타내는 보다 낮은 K_D 를 갖는 항체 결합을 측정하였으며, 결과를 다음의 표 9 에 나타내었다.

상기에 분석한 클론 536 은 SEQ ID NO : 12(536 카파 THW) 및 SEQ ID NO : 210(536 카파 LQT)으로서 표 4A 에 나타낸 두 개의 항체 변이체의 혼합물을 포함한다. 이러한 두 개의 536 변이체를 분리하였고 ELISA 및 HTRF 검정을 사용하여 효능에 대해 개별적으로 분석하였다.

ELISA 검정에서, 96 웰 마이크로플레이트를 293T 세포 조정배지(DMEM/50 ug/ml BSA)에서의 재조합 안지오포이에틴으로 1 시간 동안 37 ℃에서 코팅하였다. 1 nM hTie2-Fc(R and D Systems, Inc. 에서 입수, 카탈로그 번호 제 #313-TI 호)에 80 % 로 최대한으로 결합할 수 있는 안지오포이에틴 농도에서 조정배지를 사용하였다. 플레이트를 PBS/0.1 % 트윈-20 으로 세척한 다음에 PBS/5 % BSA 로 실온에서 2 시간 동안 차단하였다. 실온에서 밤새 항온시킨 다음에 PBS/0.1 % 트윈-20 으로 세척한 안지오포이에틴-코팅된 플레이트에 PBS/1 % BSA/1 nM Tie2 의 용액에서 100 nM 내지 0.4 pM 으로 적정한 안지오포이에틴-중화제를 첨가하였다. 마우스-유도 항-Tie2 항체(BD Pharmingen Inc.에서 입수, 카탈로그 번호 제 #557039 호)를 1 ug/ml 의 최종 농도(실온에서 1 시간 동안 항온)로 각각의 플레이트에 첨가한 다음 플레이트를 PBS/0.1 % 트윈-20 으로 세척하였다. 염소 항-마우스-IgG-HRP(Pierce 에서 입수, 카탈로그 번호 제 #31432 호)를 PBS/1 % BSA(1 시간 동안 실온에서 항온시켰음)에서 1 : 10,000 으로 희석하여 플레이트에 첨가한 다음 이 플레이트를 PBS/0.1 % 트윈-20 으로 몇 회 세척하였다. TMB 기질(Sigma 에서 입수, 카탈로그 번호 제 #T8665 호)을 첨가하고 O.D. 370 nm 에서 흡광도를 측정하였으며, Tie2 표준곡선과 대조하여 비교하여 안지오포이에틴 : Tie2 중화의 정도를 측정하였다.

HTRF 검정에서, 0.8 nM Europium-결합 스트렙타비딘(PERKIN ELMER LIFE SCIENCES INC. 에서 입수, 카탈로그 번호 제 #AD0062 호), 및 4.0 nM 의 비오틴화된(biotinylated) 인체 안지오포이에틴 1(R and D Systems, Inc. 에서 입수) 또는 안지오포이에틴 2(Amgen Inc. 에서 입수)를 함유하는 50 ul 의 HTRF 완충용액(50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.05 % 트윈 20, 0.1 % BSA)을 각각의 웰에 첨가하여 96 웰 마이크로 "혼합 플레이트" 를 제조하였다. 독립된 마이크로플레이트에서, 안지오포이에틴-중화제를 HTRF 완충용액에서 400 nM 내지 20 pM 으로 적정하고, 50 ul 의 각각의 계열 희석된 안지오포이에틴-중화제를 옮긴 다음에 스트렙타비딘-Europium/안지오포이에틴을 함유하는 "혼합 플레이트" 와 혼합하였다. 그 다음에 1 시간 동안 실온으로 진탕기에서 플레이트를 항온시켰다. 다음에, "혼합 플레이트" 의 각각의 웰의 20 ul 을 각각의 96 웰에 HTRF 완충용액에 20 ul 의 10 nM 인체 알로피코시아닌-결합 인체 Tie2-Fc 를 함유하는 "검정 플레이트" 에 옮겼다. 최종의 "검정 플레이트" 를 2 시간 동안 진탕하면서 실온에서 항온시켰다. "검정 플레이트" 의 최종 농도는 다음과 같다 : 1.0 nM 의 안지오포이에틴, 5.0 nM 의 인체 Tie2-Fc 및 100 nM 내지 5.0 pM 의 계열 희석된 안지오포이에틴-중화제. Rubystar 플레이트 판독기(reader)(독일 오펜버그에 소재하는 BMG Labtechnologies 에서 입수)를 사용하여 검정 플레이트를 분석하였다. "안지오포이에틴-중화제가 없는" 대조군(저해가 0 으로 나타남) 및 "안지오포이에틴이 없는" 대조군(완전한 저해를 나타냄)을 사용하여 각각의 안지오포이에틴-중화제 희석물의 저해 백분율을 계산하여 안지오포이에틴 : Tie2 중화의 정도를 측정하였다. GRAFIT 5.0 프로그램(Erithacus Software Ltd. 에서 입수)을 사용하여 저해 백분율을 분석하여 IC50 수치를 계산하였다.

다음의 공식을 사용하여 복제물(duplicate)에서 시험한 시료로부터 계산된 IC50 곡선으로서 모든 결과를 나타내었다. IC50 은 2 개의 매개변수 방정식에 대한 적절한 저해 데이터를 결과로서 나타내었으며, 여기에서 데이터의 하한은 0 이고[즉, 데이터는 정정된 백그라운드(background)임], 데이터의 상한은 100 이다(즉, 데이터는 정정된 범위임).

상기 방정식에서, s 는 기울기 인수(slope factor)이다. 방정식은 x 가 증가하면 y 가 감소하게 됨을 나타낸다. 본 방정식을 소프트웨어 프로그램 GRAFIT 5.0(Erithacus Software Ltd. 에서 입수)에서 이용하였다.

결과를 표 10 및 11 에 나타내었다.

실시예 5 항- Ang -2 항체를 사용한 치료학적 효능 연구

단백질-G 정제된 토끼 항-Ang-2 폴리클로날 항체의 약력학을 마우스에서 실험하였다. 24 마리의 마우스에게 폴리클로날 항-Ang-2 토끼 항체(1 ㎎/마우스)를 처리하였다. 항체를 주사한 후 1 시간, 6 시간, 1 일, 3 일, 7 일 및 14 일에 처리한 4 마리의 동물을 희생시켰다.

토끼의 총 IgG 는 혈청에서 약 19 일의 순환 반감기를 가지며 총 IgG 의 항-Ang-2 IgG 성분은 약 8 일의 반감기를 가짐을 결과를 통해 알 수 있었다.

치료학적 효능을 평가하기 위해, A431 종양 이종이식편을 갖는 마우스(10 마리 동물/군)에게 이종이식한지 1 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일 및 18 일 후에 단백질 G 정제된 항-mAng-2 폴리클로날 항체를 복강내 10 회 투여(약 10 ㎎ IgG/마우스/투여량)하였다. 7 일, 12 일, 15 일, 19 일 및 21 일에 종양 크기를 측정하였다. 0 일, 7 일, 15 일 및 21 일에 체중을 측정하였으며 체중은 치료에 의해 영향을 받지 않았다. 항-Ang-2 폴리클로날 항체가 비-면역 정제된 폴리클로날 항혈청(10 ㎎ IgG/마우스/투여량) 및 부형제(PBS)의 대조군에 대해 p=0.008 로(반복된 측정 ANOVA 사용) A431 종양 이종이식편의 성장을 약 50 % 저해시킴을 결과를 통해 알 수 있었다.

완전 인간 모노클로날 항-Ang-2 항체의 생체내 효능을 시험하기 위해, A431 종양 이종이식편을 갖는 마우스(10 마리 동물/군)에게 항-Ang-2 항체 클론 533, 537 이나 544, 또는 PBS 나 인체 IgG1-카파의 음성 대조군을 복강내 투여하였다. 투여량은 첫 번째 투여시 약 420 ug 단백질/마우스이고 그 다음 3 회 투여시에는 약 140 ug 단백질/마우스이며 그 다음 4 회 투여시에는 약 55 ug 단백질/마우스로 마우스 당 총 8 회 투여하였다. 2 주마다 종양 용적(tumor volume) 및 체중을 기록하였다. 연구의 마지막에 동물을 희생시키고 ELISA 로 항체 농도를 측정하기 위해 이들의 혈청을 수득하였다. 종양 및 정상 조직을 모든 군에서 수집하였다.

항-Ang-2-처리군 및 대조군 사이의 종양 성장에서의 두드러진 차이를 도 1 에 나타내었다. 총 3 개의 항-Ang-2 처리는 대조군에 비해 종양 성장을 저해시켰다(모든 처리에서 hIgG1 대조군에 대하여 p<0.005, 총 3 개의 항체에 대해 반복된 측정 ANOVA 를 사용함). 대조적으로, 대조군에서의 종양은 훨씬 더 높은 비율로 성장을 지속하였다.

실시예 6 에 피토프 맵핑

전장(아미노산 1-495), N-말단(아미노산 1-254) 및 C-말단(아미노산 255-495)의 인체 Ang-2(hAng-2) 단백질을 C-말단에 6xHis 표식을 갖는 CMV-도입 포유동물 발현 벡터(CMV-driven mammalian expression vector) 내로 클로닝시켰다. 결과적으로 생성된 3 개의 구성물 및 벡터 대조군이 293T 세포 내에서 일시적으로 발현되었다. 그런 다음 트랜스펙션된 세포로부터 조정배지를 수집하고 배지 내의 Ang-2 발현 수준을 항-6xhis ELISA 및 웨스턴 블롯팅으로 평가하였다.

항-Ang-2 항체 및 펩티바디의 결합 에피토프를 다음의 프로토콜에 따른 ELISA 로 인체 hAng-2 의 세 개의 이형물에 결합하는 이들의 능력으로 측정하였다 : 고-결합 96-웰 검정 플레이트를 웰 당 100 ㎕ 의 조정배지로 코팅한 후 37 ℃ 에서 1 시간 동안 항온시켰다. 조정배지를 제거하고, 플레이트를 웰 당 200 ㎕ 의 PBS 에 용해된 5 % BSA 로 실온에서 1 시간 동안 차단시켰다. 그런 다음에 차단 용액을 제거하였다. PBS 에 용해된 1 % BSA 내에 1 ㎍/㎖ 로 웰 당 100 ㎕ 의 항체, 펩티바디 또는 Tie2-Fc 를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 항온시켰다. PBS 에 용해된 200 ㎕ 의 0.1 % 트윈으로 웰을 4 회 세척하였다. 웰 당 100 ㎕ 의 HRP-접합 염소 항-인간 IgG 또는 HRP-접합 염소 항-마우스 IgG 를 첨가하고, 실온에서 45 분간 항온시켰다. 그런 다음 웰을 PBS 에 용해된 200 ㎕ 의 0.1 % 트윈으로 4 회 세척하였다. 웰 당 100 ㎕ 의 TMB 기질을 첨가하였다. O.D. 를 370 nm 에서 판독하였다.

결과를 도 2A, 2B 및 2C 에 나타내었다.

SEQUENCE LISTING <110> Oliner, John Graham, Kevin <120> Angiopoietin-2 Specific Binding Agents <130> 04-881-T <140> TBD <141> 2005-10-19 <150> 10/982,440 <151> 2004-11-04 <150> 60/620,161 <151> 2004-10-19 <160> 215 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Leu Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Pro Tyr Ala Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 3 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Val Val Gly Asp Phe Asp Trp Leu Ser Phe Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Tyr Thr Tyr Thr 20 25 30 Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Phe 35 40 45 Gln Asp Phe Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Thr Thr Ala Val 85 90 95 Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 <210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Glu Asp Thr Ala Met Val Phe Asn Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Val Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Phe Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Leu Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Gly Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Ile Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Phe Ser Pro Phe Thr Glu Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Val Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Ala Glu Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 11 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Leu Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Gly Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 13 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Gly Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Ser Asp Ala Ala Val Ala Gly Met Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Asp Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Asn Asn Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Val Tyr Asp Asn His Lys Arg Pro Ser Gly Ile Ser Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Thr Leu Asp Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Pro Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Thr Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Asn Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Phe Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Val Pro Gly Thr Glu Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asn Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Ser Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 17 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Pro Gly Gly Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 19 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Glu Ser Gly Tyr Trp Gly Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser His Val Val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 21 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Pro Val Asp Phe Asp Tyr Gly Asp Tyr Ala Ile Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gln Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Arg Ala 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Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Glu Ala Pro Arg Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ala Ser Asn Ile Gly Ala Asn 20 25 30 Gly Val Ser Trp Tyr His Gln Val Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Leu Ser His Asp Gly Leu Val Thr Ser Gly Val Pro Asp Arg Leu Ser 50 55 60 Val Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu His 65 70 75 80 Ser Asp Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Ala Val Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 25 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Ser Leu Asp Ala Phe Asp 100 105 110 Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 26 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 27 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp 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Asp Ile 1 5 10 <210> 158 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 158 Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Ser Trp Val 1 5 10 <210> 159 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 159 Pro Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Pro Gly Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 160 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 160 Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 161 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 161 Phe Glu Ser Gly Tyr Trp Gly Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 162 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 162 Gln Ser Ala Asp Ser Ser His Val Val 1 5 <210> 163 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 163 Gly Pro Val Asp Phe Asp Tyr Gly Asp Tyr Ala Ile Asp Tyr 1 5 10 <210> 164 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 164 Gln Ser Tyr Asp Ser Arg Leu Ser Gly Ser Val 1 5 10 <210> 165 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 165 Glu Thr Ile Ser Phe Ser Thr Phe Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 166 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 166 Ala Val Trp Asp Asp Ser Leu Asn Ala Val Val 1 5 10 <210> 167 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 167 Gly Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Ser Leu Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 15 <210> 168 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 168 Gly Val Asp Asp Tyr Gly Gly Asn Ser Trp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 169 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 169 Ser Ala Ser Asp His Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Ser Asp Ala 1 5 10 15 Phe Asp Ile <210> 170 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 170 Met Gln Thr Leu Gln Ile Pro Ile Thr 1 5 <210> 171 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 171 Gly His Asp Trp Gly Met Gly Ile Gly Gly Ala Ala Tyr Asp Ile 1 5 10 15 <210> 172 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 172 Gln His Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Thr 1 5 <210> 173 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 173 Gly Val Gln Val Thr Ser Gly Tyr His Tyr Phe Asp His 1 5 10 <210> 174 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 174 Ser Ser Phe Thr Met Asn Ser Phe Val Ile 1 5 10 <210> 175 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 175 Ser Pro Ile Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Ile Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 15 <210> 176 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 176 Met Gln Ala Leu Asp Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 177 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 177 Asp Pro Ile Pro Ser Gly Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 178 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 178 Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Trp Val 1 5 10 <210> 179 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 179 Glu Val Gly Asn Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Gly Tyr 1 5 10 <210> 180 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 180 Gln Ser Ser His Ser Thr Ala Val Val 1 5 <210> 181 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 181 Asp Arg Gly Gly Tyr Ile Asp Ser 1 5 <210> 182 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 182 Gln Ser Tyr Gly Asp Asn Asn Trp Val 1 5 <210> 183 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 183 Gly Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Leu Asn Thr Ser Asp Ile 1 5 10 <210> 184 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 184 Asp Arg Gly Ile Ala Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 185 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 185 Met Gln Ala Thr Gln Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 186 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 186 Asp Pro Pro Ser Gly Gly Trp Glu Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 187 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 187 Met Gln Ser Thr Arg Phe Pro Arg Thr 1 5 <210> 188 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 188 Ser Arg Leu Glu Trp Leu Leu Tyr Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 189 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 189 Gln Ser Tyr Asn Ser Arg Gly Val Met 1 5 <210> 190 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 190 Gly Gly Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Ala Tyr Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 191 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 191 Gln Ser Tyr Asp Ser Asn Ile Trp Val 1 5 <210> 192 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 192 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Leu Val 1 5 10 <210> 193 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 193 Gln Gln Tyr Asp Phe Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 194 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 194 Asp Tyr Tyr 1 <210> 195 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 195 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Thr Trp Val 1 5 <210> 196 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 196 Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Leu Gly 1 5 10 <210> 197 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 197 Glu Ile Ala Val Ala Gly Thr Arg Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 198 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 198 Gln His Arg Ile Asn Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 199 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR1 Region <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is R, S, T, G, E, or D. <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is S, G, A, R, N, T, Y, or H. <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is S, D, N, Q, T, Y, A, G, or E. <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is Q, K, S, N, A, G, I, M, W, or L. <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is S, L, G, A, M, H, or N. <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is L, G, N, P, V, D, W, S, T, I, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is L, Y, I, K, S, N, V, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is H, T, G, Q, S, A, D, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is S, Y, N, A, T, E, G, F, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is N, T, A, G, S, Y, K, D, F, L, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is G, S, Y, F, L, P, A, F, D, N, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is Y, V, D, A, F, G, N, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is N, S, V, H, Q, K, T, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is Y, H, S, T, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is L, Y, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is D, N, L, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa is D or absent. <400> 199 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 200 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR2 Region <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is L, Q, D, N, K, G, H, A, Y, E, T, R, V, or W. <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is G, D, N, A, V, T, I, F, or M. <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is S, F, N, H, G, D, K, T, I, W, Y, or R. <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is N, K, E, L, S, Q, H, T, G, P, Y, or A. <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is R, V, L, S, I, D, G, E, Y, T, or N. <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is A, P, T, F, G, L, N, H, or S. <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is S, T, G, or K. <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is S, T, I, N, E, W, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is T, A, I, K, N, Y, D, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is Y, N, K, F, I, S, G, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is Y, N, D, A, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is A, S, P, Y, D, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is D, Q, S, A, F, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is S, K, L, V, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is V, F, K, S, L, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is K, Q, S, L, F, G, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa is G, R, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is G or absent. <400> 200 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 201 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR3 Region <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is D, M, G, Q, G, A, P, E, or S. <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is L, Q, V, A, R, T, S, Y, E, P, H, G, or I. <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is L, A, V, W, E, P, G, S, Y, I, D, T, Q, F, or R. <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is D, L, G, F, T, S, W, V, Y, P, N, H, I, or E. <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is Y, Q, D, S, T, H, A, F, W, G, M, R, or N. <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa is D, T, F, A, S, E, W, R, G, Y, I, M, N, or L. <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is I, P, D, T, M, L, S, V, G, H, Y, W, A, N, or R. <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa is any naturally occurring amino acid. <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa is any naturally occurring amino acid. <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is any naturally occurring amino acid. <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is any naturally occurring amino acid. <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is any naturally occurring amino acid. <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is any naturally occurring amino acid. <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is any naturally occurring amino acid. <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> Xaa is I, D, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is A, I, V, or absent. <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa is F or absent. <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa is D or absent. <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Xaa is I or absent. <400> 201 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa <210> 202 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 202 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys 20 <210> 203 <211> 40 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 203 gtggttgaga ggtgccagat gtcaggtcca gctggtgcag 40 <210> 204 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 204 attacgtctc acagttcgtt tgatctccac 30 <210> 205 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 205 ccgctcagct cctggggctc ctgctattgt ggttgagagg tgccagat 48 <210> 206 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 206 Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu 1 5 <210> 207 <211> 54 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 207 cagcagaagc ttctagacca ccatggacat gagggtcccc gctcagctcc tggg 54 <210> 208 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 208 gtggttgaga ggtgccagat gtgacattgt gatgactcag tctcc 45 <210> 209 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 209 cttgtcgact tattaacact ctcccctgtt g 31 <210> 210 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 210 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 211 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 211 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Phe Leu Gly Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Lys Val Glu Ala Asp Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Asp Thr Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 212 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 212 Met Gln Gly Leu Gln Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 213 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 213 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Ser Leu Ala 1 5 10 <210> 214 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 214 Ala Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 215 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 215 Gln His Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Thr 1 5

Claims (47)

1. 다음의 적어도 하나의 상보성 결정영역 (complementarity determining region, CDR) 을 포함하는, 안지오포이에틴-2 와 특이적으로 결합하는 분리된 폴리펩티드

   여기에서, 상기 상보성 결정영역 (CDR)은 다음의 (a) CDR1, (b) CDR2 또는 (c) CDR3 이다 :

   (a) 상기 CDR1 영역은 다음 식의 아미노산 서열을 포함하고 :

   X¹X²X³X⁴X⁵X⁶X⁷X⁸X⁹X¹⁰X¹¹X¹²X¹³X¹⁴X¹⁵X¹⁶X¹⁷ (SEQ ID NO : 199)

   이 식에서,

   X¹ 은 R, S, T, G, E, D 이고 ;

   X² 는 S, G, A, R, N, T, Y, H 이고 ;

   X³ 은 S, D, N, Q, T, Y, A, G, E 이고 ;

   X⁴ 는 Q, K, S, N, A, G, I, M, W, L 이고 ;

   X⁵ 는 S, L, G, A, M, H, N 이고 ;

   X⁶ 은 L, G, N, P, V, D, W, S, T, I, 또는 존재하지 않거나 ;

   X⁷ 은 L, Y, I, K, S, N, V, 또는 존재하지 않거나 ;

   X⁸ 은 H, T, G, Q, S, A, D, 또는 존재하지 않거나 ;

   X⁹ 는 S, Y, N, A, T, E, G, F, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹⁰ 은 N, T, A, G, S, Y, K, D, F, L, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹¹ 은 G, S, Y, F, L, P, A, F, D, N, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹² 는 Y, V, D, A, F, G, N, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹³ 은 N, S, V, H, Q, K, T, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹⁴ 는 Y, H, S, T, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹⁵ 는 L, Y, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹⁶ 은 D, N, L, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹⁷ 은 D 또는 존재하지 않는다 ;

   (b) 상기 CDR2 영역은 다음 식의 아미노산 서열을 포함하고 :

   X¹X²X³X⁴X⁵X⁶X⁷X⁸X⁹X¹⁰X¹¹X¹²X¹³X¹⁴X¹⁵X¹⁶X¹⁷X¹⁸ (SEQ ID NO : 200)

   이 식에서,

   X¹ 은 L, Q, D, N, K, G, H, A, Y, E, T, R, V, W 이고 ;

   X² 는 G, D, N, A, V, T, I, F, M 이고 ;

   X³ 은 S, F, N, H, G, D, K, T, I, W, Y, R 이고 ;

   X⁴ 는 N, K, E, L, S, Q, H, T, G, P, Y, A 이고 ;

   X⁵ 는 R, V, L, S, I, D, G, E, Y, T, N 이고 ;

   X⁶ 은 A, P, T, F, G, L, N, H, S 이고 ;

   X⁷ 은 S, T, G, K 이고 ;

   X⁸ 은 S, T, I, N, E, W, 또는 존재하지 않거나 ;

   X⁹ 는 T, A, I, K, N, Y, D, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹⁰ 은 Y, N, K, F, I, S, G, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹¹ 은 Y, N, D, A, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹² 는 A, S, P, Y, D, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹³ 은 D, Q, S, A, F, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹⁴ 는 S, K, L, V, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹⁵ 는 V, F, K, S, L, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹⁶ 은 K, Q, S, L, F, G, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹⁷ 은 G, R, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹⁸ 은 G 또는 존재하지 않는다;

   (c) 상기 CDR3 영역은 다음 식의 아미노산 서열을 포함하고 :

   X¹X²X³X⁴X⁵X⁶X⁷X⁸X⁹X¹⁰X¹¹X¹²X¹³X¹⁴X¹⁵X¹⁶X¹⁷X¹⁸X¹⁹ (SEQ ID NO : 201)

   이 식에서,

   X¹ 은 D, M, G, Q, F, A, P, E, S 이고 ;

   X² 는 L, Q, V, A, R, T, S, Y, E, P, H, G, I 이고 ;

   X³ 은 L, A, V, W, E, P, G, S, Y, I, D, T, Q, F, R 이고 ;

   X⁴ 는 D, L, G, F, T, S, W, V, Y, P, N, H, I, E 이고 ;

   X⁵ 는 Y, Q, D, S, T, H, A, F, W, G, M, R, N 이고 ;

   X⁶ 은 D, T, F, A, S, E, W, R, G, Y, I, M, N, L 이고 ;

   X⁷ 은 I, P, D, T, M, L, S, V, G, H, Y, W, A, N, R 이고 ;

   X⁸ 은 L, P, W, A, V, S, D, G, F, N, Y, I, R, E, T 이고 ;

   X⁹ 는 T, L, V, F, A, G, P, D, S, H, N, M, Y, 또는 존재하지

   않거나 ;

   X¹⁰ 은 G, S, V, N, F, A, M, D, Y, L, W, I, T, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹¹ 은 P, F, Y, W, D, E, I, G, A, V, L, S, M, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹² 는 Y, F, V, G, I, V, M, A, D, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹³ 은 A, D, Y, V, F, H, I, G, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹⁴ 는 Y, V, D, I, S, F, M, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹⁵ 는 I, D, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹⁶ 은 A, I, V, 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹⁷ 은 F 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹⁸ 은 D 또는 존재하지 않거나 ;

   X¹⁹ 는 I 또는 존재하지 않는다.
2. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO : 69-104 및 SEQ ID NO : 213 중에서 선택한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
3. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO : 105-143 및 SEQ ID NO : 214 중에서 선택한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
4. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO : 144-198, SEQ ID NO : 212 및 SEQ ID NO : 215 중에서 선택한 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
5. 제 1 항에 있어서, 분리된 폴리펩티드는 항체임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
6. 제 5 항에 있어서, 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
7. 제 6 항에 있어서, 항체는 단쇄 항체임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
8. 제 6 항의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
9. 제 1 항의 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자.
10. 제 9 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
11. 제 10 항의 벡터를 함유하는 숙주세포.
12. 제 5 항, 제 6 항 또는 제 7 항의 항체를 코드하는 핵산 분자.
13. 제 12 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
14. 제 13 항의 벡터를 함유하는 숙주세포.
15. 다음의 단계를 포함하는 항체의 제조방법

    (a) 제 5 항, 제 6 항 또는 제 7 항의 항체를 코드하는 적어도 하나의 핵산 분자로 숙주세포를 형질전환시키는 단계 ;

    (b) 상기 숙주세포에서 핵산 분자를 발현시키는 단계 ; 및

    (c) 특이 결합제를 분리시키는 단계.
16. 제 1 항의 분리된 폴리펩티드의 치료학적 유효량을 투여하여 포유동물의 바람직하지 않은 맥관형성을 저해하는 방법.
17. 제 1 항의 분리된 폴리펩티드의 치료학적 유효량을 투여하여 포유동물의 암을 치료하는 방법.
18. 제 5 항, 제 6 항 또는 제 7 항의 항체의 치료학적 유효량을 투여하여 포유동물의 바람직하지 않은 맥관형성을 저해하는 방법.
19. 제 5 항, 제 6 항 또는 제 7 항의 항체의 치료학적 유효량을 투여하여 포유동물의 암을 치료하는 방법.
20. 제 1 항의 분리된 폴리펩티드 및 약학적으로 용인가능한 제형화제(formulation agent) 를 포함하는 약학적 조성물.
21. 제 5 항, 제 6 항 또는 제 7 항의 항체 및 약학적으로 용인가능한 제형화제(formulation agent) 를 포함하는 약학적 조성물.
22. 제 1 항의 분리된 폴리펩티드를 환자에게 투여하여 안지오포이에틴-2 의 활성을 조절하거나 또는 저해하는 방법.
23. 제 5 항, 제 6 항 또는 제 7 항의 항체를 환자에게 투여하여 안지오포이에틴-2 의 활성을 조절하거나 또는 저해하는 방법.
24. 제 1 항의 분리된 폴리펩티드의 치료학적 유효량을 포유동물에게 투여하여 상기 포유동물에서 혈관 투과성(vascular permeability) 및 혈장 누출(plasma leakage) 중 적어도 하나를 조절하는 방법.
25. 제 1 항의 분리된 폴리펩티드의 치료학적 유효량을 투여하여 포유동물의 안구내 신생혈관질환, 비만증, 혈관아세포종, 혈관종, 동맥경화증, 염증성질환, 염증성장애, 죽상동맥경화증, 자궁내막증, 신생물질환, 골-관련 질환 및 건선 중 적어도 하나의 질환을 치료하는 방법.
26. 제 5 항, 제 6 항 또는 제 7 항의 항체의 치료학적 유효량을 투여하여 포유동물에서 혈관 투과성(vascular permeability) 및 혈장 누출(plasma leakage) 중 적어도 하나를 조절하는 방법.
27. 제 5 항, 제 6 항 또는 제 7 항의 항체의 치료학적 유효량을 투여하여 포유동물의 안구내 신생혈관질환, 비만증, 혈관아세포종, 혈관종, 동맥경화증, 염증성질환, 염증성장애, 죽상동맥경화증, 자궁내막증, 신생물질환, 골-관련 질환 및 건선 중 적어도 하나의 질환을 치료하는 방법.
28. 제 1 항의 분리된 폴리펩티드의 치료학적 유효량과 화학요법제를 투여하여 포유동물의 암을 치료하는 방법.
29. 제 28 항에 있어서, 분리된 폴리펩티드와 화학요법제를 동시에 투여함을 특징으로 하는 방법.
30. 제 28 항에 있어서, 분리된 폴리펩티드와 화학요법제를 동시에 투여하지 않음을 특징으로 하는 방법.
31. 제 5 항, 제 6 항 또는 제 7 항의 항체의 치료학적 유효량과 화학요법제를 투여하여 포유동물의 암을 치료하는 방법.
32. SEQ ID NO : 69-104 및 SEQ ID NO : 213 중 어느 하나에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 을 포함하는, 안지오포이에틴-2 와 결합하는 분리된 항체.
33. SEQ ID NO : 105-143 및 SEQ ID NO : 214 중 어느 하나에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 를 포함하는, 안지오포이에틴-2 와 결합하는 분리된 항체.
34. SEQ ID NO : 144-198, SEQ ID NO : 212 및 SEQ ID NO : 215 중 어느 하나에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 을 포함하는, 안지오포이에틴-2 와 결합하는 분리된 항체.
35. 제 32 항, 제 33 항 또는 제 34 항의 항체를 코드하는 핵산 분자.
36. 제 35 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
37. 제 36 항의 벡터를 함유하는 숙주세포.
38. 다음의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는, 생물학적 시료에서 안지오포이에틴-2 의 수준을 검출하는 방법

    (a) 제 1 항의 분리된 폴리펩티드와 상기 생물학적 시료를 접촉시키는 단계 ;

    (b) 상기 생물학적 시료에 특이 결합제가 결합하는 정도를 측정하는 단계.
39. 다음의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는, 생물학적 시료에서 안지오포이에틴-2 의 수준을 검출하는 방법

    (a) 제 32 항, 제 33 항 또는 제 34 항의 항체와 상기 생물학적 시료를 접촉시키는 단계 ;

    (b) 상기 생물학적 시료에 항체가 결합하는 정도를 측정하는 단계.
40. 다음의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체이되,

    상기 중쇄는 SEQ ID NO : 1 ; SEQ ID NO : 3 ; SEQ ID NO : 5 ; SEQ ID NO : 7 ; SEQ ID NO : 9 ; SEQ ID NO : 11 ; SEQ ID NO : 13 ; SEQ ID NO : 15 ; SEQ ID NO : 17 ; SEQ ID NO : 19 ; SEQ ID NO : 21 ; SEQ ID NO : 23 ; SEQ ID NO : 25 ; SEQ ID NO : 27 ; SEQ ID NO : 29 ; SEQ ID NO : 31 ; SEQ ID NO : 33 ; SEQ ID NO : 35 ; SEQ ID NO : 37 ; SEQ ID NO : 39 ; SEQ ID NO : 41 ; SEQ ID NO : 43 ; SEQ ID NO : 45 ; SEQ ID NO : 47 ; SEQ ID NO : 49 ; SEQ ID NO : 51 ; SEQ ID NO : 53 ; SEQ ID NO : 55 ; SEQ ID NO : 57 ; SEQ ID NO : 59 ; SEQ ID NO : 61 ; 및 이의 항원 결합 단편 중에서 선택한 중쇄 가변영역을 포함하며 ;

    상기 경쇄는 SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 210 또는 SEQ ID NO : 211 의 아미노산 서열, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함함을 특징으로 하는 항체.
41. 제 40 항의 항체를 코드하는 핵산 분자.
42. 제 41 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
43. 제 42 항의 벡터를 함유하는 숙주세포.
44. SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 210 또는 SEQ ID NO : 211 의 아미노산 서열 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 경쇄, 및 중쇄를 포함하는, 안지오포이에틴-2 와 특이적으로 결합하는 항체.
45. 제 44 항의 항체를 코드하는 핵산 분자.
46. 제 45 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
47. 제 46 항의 벡터를 함유하는 숙주세포.

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