KR20070085094A - 트리시리빈 및 관련 화합물을 사용한 종양 및 암의효과적인 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명자들은 종래 기술 및 실험과 반대로, (i) 본 명세서에 기재된 진단 시험에 따라 약물에 대한 증진된 감수성을 보이는 환자들에게만 트리시리빈 투여, (ii) 약물의 독성을 최소화하되 여전히 효능을 보이는 기재된 용량 수준의 사용, 또는 (iii) 약물의 독성을 최소화하는 기재된 용량 투여계획(dosage regimen)의 사용 중 하나 또는 조합에 의해 종양 및 암을 치료하기 위해 트리시리빈을 성공적으로 사용하는 방법을 결정하였다.

Description

트리시리빈 및 관련 화합물을 사용한 종양 및 암의 효과적인 치료{EFFECTIVE TREATMENT OF TUMORS AND CANCER WITH TRICIRIBINE AND RELATED COMPOUNDS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2004년 3월 29일자로 출원된 미국 가특허 출원 제 60/557,599호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조 병합되어 있다.

본 출원은, 비정상 세포 증식과 관련 있는 종양, 암 및 다른 장애의 치료를 위한 감소된 독성을 갖는 트리시리빈(triciribine) 및 관련 화합물 및 조성물의 특정한 치료 투약 계획(therapeutic regimens)을 제공한다.

암은 세포의 비정상적인 성장이다. 암 세포는, 공간의 제한, 다른 세포들에 의해 공유되는 영양소, 또는 재생산(reproduction)을 멈추도록 신체로부터 보내어지는 신호에도 불구하고 신속하게 재생산된다. 암 세포들은 종종 건강한 세포와 다르게 형성되고, 적절하게 작용하지 못하고, 신체의 많은 영역으로 퍼질 수 있다. 종양이라 불리는, 조직의 비정상적 성장은 조절불가능하게 성장 및 분할될 수 있는 세포 클러스터이다. 종양은 양성(benign)(비암) 또는 악성(암)이 될 수 있다. 양성 종양은 천천히 성장하는 경향이 있고 퍼지지 않는다. 악성 종양은 빠르게 성장하고, 근처의 정상 조직을 침습 및 파괴하고, 신체 전체에 퍼질 수 있다.

암은 이들이 유래하는 유체 또는 조직의 종류에 따라, 또는 이들이 1차적으로 발생하는 신체 내 위치에 따라 분류된다. 또한, 일부 암은 혼합된 형태로 되어 있다. 암은 5개의 넓은 카테고리, 암종, 육종, 림프종, 백혈병 및 골수종으로 그룹지어질 수 있으며, 이는 암의 조직 및 혈액 분류를 나타낸다. 암종은 장기, 선(glands) 또는 신체구조의 표면을 덮거나 라이닝하는(lines) 상피 조직으로 알려진 신체 조직 내에서 발견되는 암이다. 예를 들어 위의 라이닝(lining)의 암은 암종이라 불린다. 많은 암종은 우유를 생산하는 유방과 같은 분비와 관련있는 선 또는 장기에 영향을 준다. 암종은 모든 암 케이스의 약 80 내지 90 %를 차지한다. 육종은 연골, 지방, 근육, 힘줄 및 뼈와 같은 연결 조직으로부터 성장하는 악성 종양이다. 가장 일반적인 육종인 뼈 상의 종양은 일반적으로 젊은이(young adult)에게서 발병한다. 육종의 예에는 골육종(뼈) 및 연골육종(연골)이 포함된다. 림프종은, 백혈구 및 깨끗한 체액을 생산하는 역할을 하는 림프계의 절 또는 선에서, 또는 뇌 및 유방과 같은 장기에서 유래하는 암을 나타낸다. 림프종은 두 카테고리: 호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종으로 분류된다. 혈액암이라고도 하는 백혈병은, 골수가 정상적인 적혈구 및 백혈구 및 혈소판을 생산하는 것을 막는 골수암이다. 백혈구는 감염에 견뎌내기 위해 필요하다. 적혈구는 빈혈을 예방하기 위해 필요하다. 혈소판은 신체가 쉽게 멍들고 피가 나는 것을 막는다. 백혈병의 예로는 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병이 포함된다. 골수성 및 림프구성이라는 용어는, 관련되는 세포의 형태를 나타낸다. 마지막으로, 골수종은 골수의 플라즈마 세포 내에서 성장한다. 일부 경우에, 골수종 세포 는 하나의 뼈에서 수집되고, 형질세포종이라 불리는 단일(single) 종양을 형성한다. 그러나, 다른 경우, 골수종 세포는 많은 세포에서 수집되며, 다수의 뼈 종양들을 형성한다. 이는 다발성 골수종이라 한다.

종양 유도 및 진행(progression)은 종종 종양-세포 게놈의 누적된 변화의 결과이다. 이러한 변화는 세포 성장 저해 유전자, 또는 종양 억제(suppressor) 유전자의 불활성화와, 세포 성장 촉진(promoting) 유전자, 또는 종양 형성 유전자(oncogenes)의 활성화를 포함할 수 있다. 수백의 활성화된 세포 종양 형성 유전자들이 동물 모델 내에서 현재까지 확인되었으나, 이들 유전자들의 소수만이 인간 암과 관련있는 것으로 판명되었다(Weinberg et al 1989 Oncogenes and the Molecular Origins of Cancer Cold Spring Harbor, NY, Stanbridge and Nowell 1990 Cell 63 867-874, Godwin et al 1992 Oncogenes and antioncogenes in gynecological malignancies. In WJ Hoskins, CA Perez and RC Young(eds), Gynecological oncology: principles and practice, pp87-116, Lippincott, Philadelphia). 인간 암 내 종양 형성 유전자의 활성화는, 증가된 유전자 복사 수 또는 구조적 변화와 같은 요인으로부터 기인할 수 있다. 이들 요인들은 다수의 세포 작용을 유발할 수 있다, 예를 들어 이들은 유전자 생성물의 과발현을 초래할 수 있다. 인간 암과 관련있는 몇가지 종양 형성 유전자가 유전자 과발현을 통해 활성화될 수 있다.

암 세포에 의해 얻어진 연속적인 유전자 변형(aberrations)의 결과, 정상 세포 증식, 분화 및 프로그래밍된 세포 사망을 지배하는 규칙적인 신호 전달 회 로(regulatory signal transduction circuits)에 결함이 생긴다는 것은 명백하였다(Hanahan, D. and R.A. Weinberg, Cell, 2000. 100(1): p.57-700). 그 결과, 차례로 악성종양을 지시하는 세포 생리에서의 기본적 결함이 생긴다. 이들 결함에는 a) 성장 신호의 자가 충족(self sufficiency)(즉, EGFR과 같은 성장 인자 수용체 티로신 키나제의 과발현 및 Ras/Raf/Mek/Erk 1/2 및 RAS/PI3K/Akt와 같은 하류 신호 전달 경로(downstream signal transduction pathway)의 비정상(aberrant) 활성화), b) 항-성장 신호에 대한 내성(즉, TGFβ 및 이의 수용체의 저발현), c) 세포 자멸사 회피(evading apoptosis)(즉, 프로세포자멸사(proapoptotic) p53의 손실; 프로-생존(pro-survival) Bcl-2의 과발현; PI3K/Akt에 의해 매개되는 것과 같은 생존 경로의 과활성화), d) 지속된 혈관형성(angiogenesis)(즉 높은 수준의 VEGF의 분비), 및 f) 조직 침습 및 전이(즉 세포외 프로테아제 및 프로전이(prometastatic) 인테그린)이 포함된다(Hanahan, D. and R.A. Weinberg, Cell, 2000. 100(1): p.57-700).

EGFR, ErbB2, VEGFR 및 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체(IGF-1R)과 같은 수용체 티로신 키나제는, 결장직장 췌장, 유방 및 난소 암을 포함하는 많은 인간 암들의 발명과 친밀하게 관련된다(Khaleghpour, K., et al. Carcinogenesis, 2004. 25(2): p. 241-8.; Sekharam, M., et al., Cancer Res, 2003. 63(22): p.7708-16). 이들의 수용체에 대한 EGF, VEGF 및 IGF-1과 같은 리간드의 결합은 고유(intrinsic) 티로신 키나제 활성의 자극, 수용체의 세포질 도메인 내 특정 티로신의 자가인산화(autophosphorylation) 및 다양한 복합 신호 전환 경로(complex signal transduction pathways)를 유발하는 신호 단백질의 보충(recruitment)을 촉진한다(Olayioye, M.A., et al., Embo J, 2000. 19(13): p.3159-67, Porter, A.C. and R.R. Vaillancourt, Oncogene, 1998. 17(11 Reviews): p.1343-52). 이는 차례로 Ras/Raf/Mek/Erk 1/2, JAK/STAT3 및 PI3K/Akt 경로와 같은 많은 종양 생존 및 종양 형성 유전자 경로의 활성화를 유발한다. 세 경로 모두가 결장, 췌장, 유방 및 난소 종양형성(oncogenesis)와 관련 있다고 할지라도, Akt에 의해 매개된 것들은 세포 증식, 항-세포자멸사/생존, 침습 및 전이 및 혈관형성을 포함하는 악성 형질전환의 많은 단계들에서 중요한 것으로 보였다(Datta, S.R. et al. Genes Dev, 1999. 13(22): p.2905-27).

Akt는 세린/트레오닌 단백질 키나제(PK_B라고도 함)이며, 3가지 구성원 Akt1, Akt2 및 Akt3을 갖는다. 성장 또는 생존 인자로 세포를 자극하면, Thr308 및 Ser473(Akt1), Thr308 및 Ser474(Akt2) 및 Thr308 및 Ser472(Akt3) 상의 인산화에 의해 활성화될 수 있는 플라즈마막에 Akt를 보충하는 PIP₃으로 포스포이노시톨-4,5-바이포스페이트(PIP₂)를 인산화하는 지질 키나제 포스포이노시타이드-3-OH-키나제(PI3K)의 수용체에 대한 보충이 이루어진다(Datta, S.R. et al. Genes Dev, 1999. 13(22): p.2905-27). 따라서, PI3K는 PIP2를 인산화하고 PIP3으로 전환시켜 Akt를 활성화환다. 포스파타제 PTEN은 PIP3을 PIP2로 탈인산화하고(dephosphorylates) 이에 따라 Akt의 활성화를 막는다.

대다수의 인간 암은 과활성화된 Akt를 포함한다(Datta, S.R.et al. Gene Dev, 1999. 13(22): p.2905-27, Bellacosa, A., et al., Int J Cancer, 1995. 64(4): p.280-5; Sun, M., et al., Am J Pathol, 2001. 159(2):p.431-7). 특히, Akt는 인간 결장직장, 췌장, 유방 및 난소 암의 57%, 32%, 27% 및 36%에서 각각 과발현 및/또는 과활성화된다(Roy, H.K., et al. Carcinogenesis, 2002. 23(1): p.201-5, Altomare, D.A., et al., J Cell Biochem, 2003. 88(1): p.470-6., Sun, M., et al., Cancer Res, 2001. 61(16): p.5985-91., Stal, O., et al. Breast Cancer Res, 2003. 5(2): p.R37-44, Cheng, J.Q., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1992. 89(19): p.9267-71, Yuan, Z.Q., et al., Oncogene, 2000. 19(19): p.2324-30). Akt의 과활성화는 Akt 자체의 증폭 및/또는 과발현과, 수용체 티로신 키나제 및/또는 이들의 리간드의 과발현을 포함하는 Akt의 상류 유전자 변형(alterations)(Khaleghpour, K., et al. Carcinogenesis, 2004. 25(2): p.241-8.; Sekharam, M., et al., Cancer Res, 2003. 63(22): p.7708-16, Cohen, B.D., et al., Biochem Soc Symp, 1998. 63:p.199-210., Muller, W.J., et al. Biochem Soc Symp, 1998. 63: p.149-57, Miller, W.E., et al. J Virol, 1995. 69(7):p.4390-8, Slamon, D.J., et al., Science, 1987. 235(4785): p.177-82, Andrulis, I.L., et al., J. Clin Oncl, 1998, 16(4):1340-9), 및 포스파타제 PTEN의 결실(deletion)에 기인한다. 종양 형성에서 Akt의 관여의 개념 증명(Proof-of-concept)은, Akt의 정규장소 밖의(ectopic) 발현이 악성 형질전환을 유도하고 세포 생존을 촉진하며(Sun, M., et al. Am J Pathol, 2001. 159(2):p.431-7, Cheng, J.Q., et al., Oncogene, 1997. 14(23): p.2793-801), Akt 경로의 혼 란(disruption)이 세포 성장을 저해하고 세포자멸사를 유도한다(Jetzt, A., et al. Cancer Res, 2003. 63(20): p.6697-706)는 것을 보임으로써, 임상 전에 증명되었다.

암 및 관련 질환의 현재의 치료법은 제한된 효과 및 다수의 심각한 원하지 않는 부작용을 갖는다. 많은 항암 약물의 증명된 임상적 효능에도 불구하고, 심각한 전신 독성은 많은 경우에 유망한 화학요법제의 임상적 발전을 막는다. 또한, EGFR과 같은 수용체 티로신 키나제 및 IGF-1과 같은 이들의 리간드의 과발현, Akt 과발현 및/또는 PTEN의 손실(이들 모두로 인해 Akt의 과활성화가 얻어짐)은, 부족한 예후, 화학치료에 대한 내성 및 암환자의 수명 단축과 관련 있다. 현재 탐구 전략은, 위험이 덜한 효과적인 치료 모드에 대한 연구를 강조한다.

트리시리빈

트리시리빈(TCN, NSC-154202, 3-아미노-1,5-디하이드로-5-메틸-1-β-리보퓨라노실-1,4,5,6,8-펜타아자아세나프틸렌) 및 이의 5'-포스페이트 에스테르, 트리시리빈 포스페이트(TCN-P, NSC-280594)의 항암작용은 1970년대에 처음 확인되었다(Townsend & Milne(1975) Ann NY Acad Sci, 255:92-103). TCN-P는 모(parent) 약물보다 더 가용성이므로 임상 시험으로 발전된 화학적 실체(entity)였다. 80년대 초까지, TCN-P는 백혈병 및 암종에 대해 임상전 활성을 보였다. 80년대 초까지, TCN-P는 DNA, RNA 및 단백질 합성의 저해제로서 확인되었고, 이는 세포 사이클의 S 상(phase)의 세포에 대한 선택성을 증명하였다(Roti-Roti et al. 1978 Proc Am Assoc Cancer Res and ASCO 19:40). 이 때 다른 뉴클레오사이드 항암제과 달리, TCN-P는 모노포스페이트의 수준을 넘어 인산화되지 않으며 폴리뉴클레오타이드 내에 통합되지 않는다는 것도 제안되었다(Bennett et al 1978 Biochem Pharmacol 27:233-241, Plagemann JNCI 1976 57:1283-95). 또한, 생체 내에서 TCN-P는 플라즈마 효소에 의해 및 세포 엑토-5'-뉴클레오타이다제(ecto-5'-nucleotidase)에 의해 TCN으로 탈인산화된다는 것도 확립되었다. 세포 안에서, TCN은 아데노신 키나제에 의해 TCN-P로 재인산화될 수 있다(Wotring et al 1981 Proc Am Assoc Cancer Res 22: 257, Basseches et al. J Chromatogr 1982 233: 227-234).

1982년에, TCN-P는 미틀맨(Mittelman) 및 그 동료들에 의해 심한(advanced) 난치 악성종양을 갖는 20명의 환자에게 상 I 임상 시험에 들어갔다(Mittelman et al. 1983 Cancer Treat Rep 67:159-162). TCN-P는 정맥 내(i.v.) 주입으로 매 3주마다 1번씩 15분에 걸쳐 25 내지 350 mg/㎡의 투여량으로 투여되었다. 시험 중의 환자들은 유방, 두부/경부, 폐, 췌장, 갑상선, 흑색종 또는 미결정된 암으로 진단되었다. 제한된 치료 반응만이 밝혀졌고, 상당한 독성이 명백했다. 미틀맨의 그룹은, 이들의 투여 계획을 사용한 추가적인 임상 시험이 정당화되지 않는다고 결론지었으나, 다른 그룹들이 어떤 특정 암 형태에서의 TCN-P의 작용을 조사하도록 촉구하였다. 1983년에 또한, 루 등(Lu et al., ASCO Abstracts, Clinical Pharmacology, p34 C-133)은 5일동안 정맥내 연속 주입으로 30-40 mg/㎡ 투여된 환자에게 TCN의 임상 약리학(pharmacology)을 조사하였다. 루 등은, TCN이 간 독성 및 빈혈에 기여하였음을 보고하였고, 이들 독성에 대해 환자들을 모니터링해야 한다고 제안하였다.

코브 등(Cobb et al, Cancer Treat Reports 1983 67:173)은, 마우스 내 6일 신장하 피막 어세이(subrenal capsule assay)에서 인간 종양의 외과적 외식편에 대한 TCN-P의 활성을 보고하였다. 이들은, 유방, 폐, 결장, 난소 및 경부인 80가지 종양 형태를 조사하였다. 코브 등은, TCN이 21 %(유방) 내지 88 %(경부) 범위의, 상이한 종양 내에서의 다양한 반응 속도를 나타냈다고 보고하였다.

또다른 상 I가 1984년에 퓬 등(Feun et al.)에 의해 또한 보고되었다(Cancer Research 44(8) 3608-12). 퓬 등은 매 3주 내지 4주 또는 6주마다, 5일동안 10, 20, 30 및/또는 40 mg/㎡ 을 연속 주입으로 정맥 내 투여하였다. 시험 환자들은 결장, 육종, 흑색종, 폐 또는 "다른" 암으로 진단되었다. 퓬 등은, 고혈당증, 간독성(hepatotoxicity) 및 혈소판 감소증을 포함하는 상당한 독성이 나타났다고 보고하였다. 발명자들은, 6주간 5일동안 하루당 20 mg/㎡의 상 II 시험에 대한 계획을 추천하였고, 또한 독성으로 인해 환자는 간 및 췌장 기능에 대해 면밀히 모니터링되어야 하며, 당뇨병, 간 기능장애 또는 광범성 간 전이(massive hepatic metastasis)를 갖는 환자는 제외되어야 한다고 충고하였다.

1986년에 쉴허 등(Schilcher et al., Cancer Research 1986 46:3147-3151)은 주마다의 정맥 내 투약계획을 사용한 TCN-P의 상 I 평가의 결과를 보고하였다. 연구는, 심한 고형 암을 갖는 24명의 환자들에게 2주 휴지(rest)를 포함하는 42일 주기의 1, 8, 15 및 22일에 5분에 걸쳐 느린 정맥내 주입을 통해 수행되었다. 12 내지 96 mg/㎡의 5가지 투여 수준이, 각 수준으로 치료된 3-12명의 환자에게 연구되었으며, 총 106가지 투여량이 투여되었다. 시험 환자들은 결장, 직장, 방광, 부 신, 난소, 췌장, 육종, 흑색종, 폐 또는 "다른" 암으로 진단되었다. 쉴허 등은 다음과 같이 결론지었다.

"이러한 주마다의 계획은 뜻밖의 임상 독성을 생산하였고, 수행되지 말아야 한다."

"이 시점에서 우리 그룹은 주마다 또는 단속적인 계획 상에서 TCN-P가 주어지는 추가 연구를 수행하기는 것을 단념한다. 상이한 투약 계획(예를 들어 1개월에 1번의 단일 적용)을 사용한 장래의 상 I-II 연구는, TCN-P가 치료제 내성 1차 췌장 및 간 종양에 대한 탁월한 시험관 내 활성을 나타내는 경우에 재개될 수 있다."

1986년에, 포위스 등(Powis et al., Cancer Treatment Reports 70:359-362)은, 상 I 및 II 임상 시험동안 환자의 혈액 및 플라즈마 내 TCN-P의 성질(disposition)을 보고하였다. 상 I 시험은 5일동안 24-55 mg/㎡의 일일 투여량을 사용했던 반면, 상 II 임상 시험은 250 mg/㎡의 단일 투여량을 사용하였다. 포위스 등은 TCN-P 약물동역학적 파라미터 및 TCN-P의 독성 간의 상관관계를 확인하지 못했다.

1980년대 후기, 1990년대 초기에, TCN-P는 전이 결장직장 선암, 비-소세포(non-small cell) 폐암, 경부의 심한 편평상피세포 암종, 및 전이 유방암에 대한 상 II 시험까지 진전되었다. 1987년에, 오코넬 등(O'Connell et al., Cancer Treat Reports 71, No.3, 333-34)은 전이 결장직장 선암 환자에서의 상 II 시험의 결과를 공표했다. 환자들은 TCN-P가 3주 간격으로 1주 1회 15분에 걸쳐 165 또는 250 mg/㎡으로 i.v. 투여되었다. 오코넬 등은, 시험을 통해 전이 결장직장 선암 환자의 치 료에 TCN-P의 임상적 유용성이 부족해 보인다고 결론지었다. 또한, 1991년, 리스 등(Lyss, et al., Proc Annu Meet Am Soc Clin Oncol, (1996) 15 A1151)은, 심한 비-소세포 폐암 환자에게 매 6주마다 1회씩 5일동안 날마다 35 mg/㎡을 투여하는 시험의 예비 결과를 보고했다.

퓬 등(Feun et al. Am J Clin Oncol 1993 16:506-508)은, 경부의 심한 편평상피세포 암종을 갖는 환자에서의 TCN-P의 상 II 시험의 결과를 보고했다. 35 mg/㎡ 이상의 5일 연속 주입을 매 6주마다 반복하였다. 21명의 평가가능한 환자들 가운데, 단지 두명의 반응만이 관찰되었다. 퓬 등은 "이 투여량 및 계획을 사용하면, TCN-P는 경부의 전이 또는 재발 편평상피 세포 암에 제한된 활성을 갖는 것으로 보인다"고 결론지었다.

1996년에, 호프만 등(Hoffman et al., Cancer Chemother Pharmacol 37: 254-258)은, 전이 유방암에 대한 TCN-P의 상 I-II 연구의 결과를 보고하였다. 한 연구에서, 14명의 환자들이 매 6주마다 5일동안 연속 주입으로 하루당 20 mg/㎡ 로 치료되었다. 발명자들이 이러한 투여량에서 반응을 보지 못했을 때, 투여량을 동일한 5일 연속 주입 계획을 사용하여 35 mg/㎡ 이상까지 단계적으로 확대하였다. 호프만 등은 "TCN은 시험된 모든 투여량에서 효과적이지 못하고, 35 mg/㎡ 이상의 투여량에서 허용불가능한 독성 효과를 갖는다"고 결론지었다.

따라서, 제한된 효능 및 허용불가능한 독성의 결합은 TCN-P 및 관련 화합물의 추가적인 임상적 발전을 막았다.

캘리포니아 대학의 시약에 대한 WO 03/079748호에는, 트리시리빈과 같은 특 정한 ZNF217 저해제가 독소루비콘과 같은 추가적인 화학요법제와 조합하여 개시되었다.

본 발명의 목적은, 비정상 세포 증식과 관련 있는 종양, 암 및 다른 장애의 치료를 위한 감소된 독성을 갖는 트리시리빈 및 관련 화합물 및 조성물의 투여를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은, 트리시리빈 및 관련 화합물을 사용하여 대상의 종양 또는 암을 치료하는 개선된 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은, 전신 독성을 제한하면서 대상의 종양 또는 암을 치료하기 위한 트리시리빈(triciribine), 트리시리빈 포스페이트 및 관련 화합물의 신규한 치료 투약 계획을 제공한다. 본 발명은, Akt 키나제를 과발현하는 종양 또는 암이 TCN 및 관련 화합물의 세포독성 효과에 특히 감수성(sensitive) 있다는 발견에 기초한다. 본 발명자들은 종래 기술 및 경험과 대조적으로, (i) 하기된 진단 시험에 따라 약물에 증진된 감수성을 보이는 환자에게만 트리시리빈을 투여; (ii) 약물의 독성을 최소화하되 여전히 효능을 보이는 기재된 용량 수준의 사용; 또는 (iii) 약물의 독성을 최소화하는 기재된 용량 투약 계획(dosage regimen)의 사용 중 하나 또는 이의 조합에 의해 종양 및 암을 치료하기 위하여 성공적으로 트리시리빈을 사용하는 방법을 결정하였다.

본 발명의 한 측면에서, TCN, TCN-P 및/또는 관련된 화합물의 독성 효과에 특히 영향받기 쉬운 종양 및 암을 확인하기 위한 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, (i) 종양으로부터 생물학적 시료를 얻는 단계; (ii) 종양이 Akt 키나제를 과발현하는지를 결정하는 단계; 및 (iii) 본 명세서에 기재된 바와 같은 트리시리빈, 트리시리빈 포스페이트 또는 관련 화합물을 사용하여 Akt 키나제를 과발현하는 종양을 치료하는 단계를 포함하는 포유동물, 특히 인간의 종양의 치료 방법이 제공된다. 일실시형태에서, 예를 들어 인산화된 형태를 검출할 수 있는 항체를 사용하여, 인산화된 Akt 키나제의 존재에 대해 종양 또는 암을 어세이함으로써 Akt 키나제 발현의 수준이 결정될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 대상으로부터 얻어진 종양 또는 암을 어세이하고, 상기 수준을 대조구 조직과 비교함으로써 Akt 발현의 수준이 결정될 수 있다. 특정 실시형태에서, Akt는 대조구에 비해 암 시료에서 2, 2.5, 3 또는 5 배 이상 과발현될 수 있다. 특정 실시형태에서, 과발현된 Akt 키나제는 과활성화(hyperactivated) 및 인산화된 Akt 키나제가 될 수 있다.

본 발명의 또다른 측면에서, TCN 및 관련 화합물의 독성 부작용을 제한하는 투여 투약 계획(dosing regimens)이 제공된다. 일실시형태에서, 이러한 투여 투약 계획은 간독성, 혈소판감소증(thrombocytopenia), 고혈당증, 구토, 저칼슘혈증, 빈혈, 히포알부네미아(hypoalbunemia), 골수억제, 고트리글리세라이드혈증, 고아밀라제혈증, 설사, 스토마키티스(stomachitis) 및/또는 열을 포함하되 이에 제한되지 않는 독성 부작용을 최소화하거나 제거한다. 또다른 실시형태에서, TCN, TCN-P 또는 관련된 화합물의 투여는, 예를 들어 15, 20 또는 30 % 이상과 같은 적어도 부분적이거나, 또는 대상의 15, 20 또는 25 % 이상의 완전한 생체 내 반응을 제공한다.

일 실시형태에서, 유효량의 TCN, TCN-P 또는 관련 화합물, 예를 들어 본 명세서에 기재된 화합물을 약 3주동안 주당 약 1회 투여에 이어 약물이 투여되지 않는 1주를 포함하는 투여 계획에 따라 대상에게 투여함으로써 종양으로 진단된 대상을 치료하기 위한 방법이 제공된다. 또다른 실시형태에서, 10 ㎎/㎡ 이하의 TCN, TCN-P 또는 관련 화합물을 주당 1회 투여 투약 계획으로 대상에게 투여함으로써 대상의 종양 또는 암을 치료하기 위한 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 화합물은 단일 볼루스(bolus) 투여량으로서 단기간, 예를 들어 약 5, 10 또는 15분에 걸쳐 투여될 수 있다. 또다른 실시형태에서, 화합물이 24, 48, 72, 96 또는 120 시간 이상동안 연속 주입(infusion)을 통해 투여되는 투여 계획이 제공된다. 특정 실시형태에서, 적어도 1주에 1회, 매 2주마다 1회 및/또는 1개월에 1회로 연속 투여가 반복될 수 있다. 다른 실시형태에서, 화합물은 매 3주마다 1회 이상 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 화합물은 2, 3, 4 또는 5일 이상동안 1일 1회 이상 투여될 수 있다.

추가 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 TCN, TCN-P 및 관련 화합물이 종양 퇴행(regression)을 일으키기에 효과적인 양으로 환자에게 투여될 수 있다. TCN, TCN-P 또는 관련 화합물의 투여는, 예를 들어 15, 20 또는 30 % 이상과 같은 적어도 부분적이거나, 또는 대상의 15 내지 20 % 이상의 완전한 생체 내 반응을 제공할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물의 2, 5, 10, 15, 20, 30 또는 50 ㎎/㎡ 이상이 대상에게 투여될 수 있다. 본명세서에 개시된 임의의 치료 투약 계획에 따라 화합물의 투여가 실시될 수 있다. 특정 실시형태에서, 투여 투약 계획은 20 ㎎/㎡ 이하의 TCN 및 관련 화합물의 투여를 포함할 수 있다. 일실시형태에서, 10 ㎎/㎡ 이하의 TCN 또는 관련 화합물이 1주에 1회 투여될 수 있다. 추가 실시형태에서, 2 ㎎/㎡, 5 ㎎/㎡, 10 ㎎/㎡, 및/또는 15 ㎎/㎡ 이하의 TCN 또는 관련 화합물의 용량이 대상에게 투여될 수 있다. 또다른 실시형태에서, 10 ㎎/㎡ 이하가 5일 이상동안 연속 주입을 통해 대상에게 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 TCN 또는 관련 화합물이 췌장, 전립선, 결장-직장 및/또는 난소 암의 치료에 사용될 수 있다.

일실시형태에서, 본 발명의 화합물 및/또는 치료 투약 계획은 암종, 육종, 림프종, 백혈병 및/또는 골수종의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 고형 종양을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 또다른 추가 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물 및 조성물은, 다음의 장기 또는 조직의 암과 같되 이에 제한되지 않는 종양 또는 암의 치료에 사용될 수 있다: 유방(breast), 전립선, 뼈, 폐, 결장직장을 포함하되 이에 제한되지 않는 결장, 비뇨기, 방광, 비-호지킨 림프종, 흑색종, 신장(kidney), 신장부(renal), 췌장, 인두(pharnx), 갑상선, 위, 뇌 및/또는 난소. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 TCN 또는 관련 화합물이 췌장, 유방, 결장직장 및/또는 난소 암의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 추가 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 화합물은 혈관형성(angiogenesis)-관련 질환의 치료에 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 24, 48, 72 또는 96 시간 이상동안 연속 주입을 통한 TCN, TCN-P 또는 관련 화합물의 연속 주입으로 백혈병을 치료하는 방법이 제공된다. 다른 실시형태에서, 연속 주입이 예를 들어 매 2주, 3주 또는 4주마다 1회 이상 반복될 수 있다.

특정 실시형태에서, 수용자(host) 내 비정상 세포 증식과 관련 있는 종양, 암, 및 다른 장애의 치료 방법이 제공되며, 이 방법은 수용자에게 유효량의 본 명세서에 개시된 화합물을 선택적으로 치료적으로 허용가능한 담체와 조합하여 투여하는 단계를 포함한다.

한 측면에서, 화합물 및 조성물은 하나 이상의 추가적인 화학요법제와 조합하거나 이로 변경하여 투여될 수 있다. 약물은 동일한 조성물의 일부를 형성할 수 있거나, 동일한 시간 또는 상이한 시간에 투여하기 위한 개별 조성물로 제공될 수 있다. 일실시형태에서, 본 발명의 조성물은 항혈관형성제(antiangiogenic)와 결합될 수 있다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물 및 조성물은, 항증식 약물, 세포분열 저지제, 항대사 약물(antimetabolite drugs), 알킬화제 또는 질소 머스타드, 토포아이소머라제(topoisomerases)를 표적화하는 약물, 종양 세포 내 신호 전달을 표적화하는 약물, 유전자 치료 및 항안티센스 제, 항체 치료제, 스테로이드, 스테로이드 유사체, 항-구토 약물 및/또는 비스테로이드성 약제를 포함하되 이에 제한되지 않는 약물의 형태와 조합되거나 이로 변경되어 사용될 수 있다.

다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 TCN, TCN-P 또는 관련 화합물이, 본 명세서에 개시된 종양 또는 암 및 약물의 실시형태를 포함하는 하나 이상의 약물에 내성인 종양 또는 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 TCN, TCN-P 또는 관련 화합물이, 예를 들어 탁솔(taxol), 라파마이신, 타목시펜, 시스플라틴, 및/또는 제피티닙(gefitinib)(iressa)에 내성인 것들을 포함하되 이에 제한되지 않는 다중약물(multidrug) 내성 종양 또는 암과 같은 약물 내성 종양 또는 암에 걸린 환자의 치료에 유효한 양으로 투여된다. 일실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 TCN, TCN-P 또는 관련 화합물이, 베라파밀(verapamil), 사이클로스포린(cyclosporin)(사이클로스포린 A 등), 타목시펜, 칼모듈린 길항제, 덱스베라파밀(dexverapamil), 덱스니굴디핀(dexniguldipine), 발스포다르(valspodar) (PSC 833), 비리코다르(biricodar)(VX-710), 타리퀴다르(tariquidar)(XR9576), 조수퀴다르(zosuquidar)(LY335979), 라니퀴다르(laniquidar)(R101933), 및/또는 ONT-093과 같은 P-당단백질 저해제일 수 있는 부가적인 화학요법제와 함께 투여될 수 있다.

특정 실시형태에서, 유효량의 본 명세서에 개시된 화합물, 또는 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 수용자에게, 수용자 내 비정상 세포 증식과 관련있는 종양, 암, 및 다른 장애의 치료에 치료 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

일실시형태에서, 유효량의 본 명세서에 개시된 화합물, 또는 이의 염, 이성질체, 프로드러그 또는 에스테르를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 종양 또는 암의 치료 방법이 제공되며, 상기 암은 예를 들어 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 또는 골수종이다. 화합물, 또는 이의 염, 이성질체, 프로드러그 또는 에스테르는 선택적으로, 물과 같은 적당한 담체를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 조성물 내에 제공되며, 이는 이를 필요로 하는 개체에 대한 원하는 투여 경로를 위해 조성된다. 선택적으로, 화합물은 종양 또는 암의 치료를 위해 하나 이상의 부가적인 치료제와 조합하거나 이를 변경하여 투여한다.

선택적으로 약제학적으로 허용가능한 담체 내의, 종양 또는 암의 치료에서의, 본 명세서에 개시된 화합물, 또는 이의 염, 프로드러그 또는 에스테르의 용도; 및 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 담체 내의, 암 또는 종양의 치료용 약제의 제조에서의, 본 명세서에 개시된 화합물, 또는 이의 염, 프로드러그 또는 에스테르의 용도는 또한 본 발명의 범위 내에 있다.

본 발명자들은 종래 기술 및 경험과 대조적으로, (i) 하기된 진단 시험에 따라 약물에 증진된 감수성을 보이는 환자에게만 트리시리빈을 투여; (ii) 약물의 독성을 최소화하되 여전히 효능을 보이는 기재된 용량 수준의 사용; 또는 (iii) 약물의 독성을 최소화하는 기재된 투여 투약계획(dosage regimen)의 사용 중 하나 또는 이의 조합에 의해 종양 및 암을 치료하기 위하여 성공적으로 트리시리빈을 사용하는 방법을 결정하였다.

I. 화합물

본 발명은 증식 장애의 치료를 위한 특정한 치료 투약 계획에 사용하기 위한 TCN, TCN-P 및 관련된 화합물의 용도를 제공한다.

일 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 화합물은 다음의 구조를 갖는다:

단, 상기 식에서, R2', R3' 및 R5'은 각각 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 포스페이트 또는 포스포네이트(모노-, 디- 또는 트리포스페이트 또는 안정화된 포스페이트 프로드러그를 포함); 아실(저급(lower) 아실 포함); 알킬(저급 알킬 포함); 알킬 또는 아릴알킬을 포함하는 아미드, 술포네이트 에스테르; 페닐기가 예를 들어 본 명세서에 기재된 아릴의 정의에서 설명되는 바와 같은 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환되는, 메탄술포닐 및 벤질을 포함하는 술포닐; 선택적으로 치환된 아릴술포닐; 인지질을 포함하는 지질; 아미노산; 탄수화물; 펩티드; 또는 콜레스테롤; 또는 R2', R3' 또는 R5'가 독립적으로 H 또는 모노-, 디- 또는 트리-포스페이트인 화합물을 생체 내 제공하는, 다른 약제학적으로 허용가능한 이탈기이고;

R^x 및 R^y는 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 포스페이트; 아실(저급 아실 포함); 아미드, 알킬(저급 알킬 포함); 선택적으로 아릴술포닐로 치환된, 폴리에틸렌글리콜과 같은, 방향족성, 폴리옥시알킬렌; 인지질을 포함하는 지질; 아미노산; 탄수화물; 펩티드; 또는 콜레스테롤; 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 이탈기이다. 일실시형태에서, 화합물은 5'-포스포에테르 지질 또는 5'-에테르 지질로서 투여된다.

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 직쇄, 분지 또는 사이클릭 알킬(저급 알킬 포함), 알케닐, 또는 알키닐, CO-알킬, CO-알케닐, CO-알키닐, CO-아릴 또는 헤테로아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 술포닐, 알킬술포닐, 아릴술포닐, 아르알킬술포닐이다.

일실시형태에서, R2' 및 R3'는 수소이다. 또다른 실시형태에서, R2' 및 R5'는 수소이다. 또다른 실시형태에서, R2', R3' 및 R5'는 수소이다. 또다른 실시형태에서, R2', R3', R5', R1 및 R2는 수소이다.

또다른 실시형태에서, 화합물은 다음 구조를 갖는다:

단,상기 식에서, R₃은 H, 선택적으로 치환된 직쇄, 분지 또는 사이클릭 알킬(저급 알킬 포함), 알케닐, 또는 알키닐, NH₂, NHR⁴, N(R⁴)₂, 아릴, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 또는 치환된 아릴이고; 및

R⁴는 각각 독립적으로 H, 저급 아실을 포함하는 아실, 메틸, 에틸, 프로필 및 사이클로프로필과 같되 이에 제한되지 않는 저급 알킬을 포함하는 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 하이드록시알킬, 또는 아릴이다. 하위실시형태(subembodiment)에서, R₃은 직쇄 C1-11 알킬, 이소-프로필, t-부틸, 또는 페닐이다.

일 실시형태에서, 본 명세서에 제공되는 화합물은 다음의 구조를 갖는다:

다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 화합물은 하기 구조를 갖는다:

또다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 화합물은 하기 구조를 갖는다:

단, 상기 식에서, R₆는 H, 알킬, (저급 알킬 포함) 알케닐, 알키닐, 알콕시알킬, 하이드록시알킬, 아릴알킬, 사이클로알킬, NH₂, NHR⁴, NR⁴R⁴, CF₃, CH₂OH, CH₂F, CH₂Cl, CH₂CF₃, C(Y³)₃, C(Y³)₂C(Y³)₃, C(=O)OH, C(=O)OR⁴, C(=O)-알킬, C(=O)-아릴, C(=O)-알콕시알킬, C(=O)NH₂, C(=O)NHR⁴, C(=O)N(R⁴)₂이고, Y³은 각각 독립적으로 H 또는 할로이고;

R⁴는 각각 독립적으로 H, 저급 아실을 포함하는 아실, 메틸, 에틸, 프로필 및 사이클로프로필과 같되 이에 제한되지 않는 저급 알킬을 포함하는 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 하이드록시알킬, 또는 아릴이다.

하위실시형태(subembodiment)에서, R₆은 에틸, CH₂CH₂OH, 또는 CH₂-페닐이다.

또다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공되는 화합물은 다음의 구조를 갖는다:

단, 상기 식에서, R₇은 H, 할로, 알킬(저급 알킬 포함), 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알콕시알킬, 하이드록시알킬, 사이클로알킬, 니트로, 시아노, OH, OR⁴, NH₂, NHR⁴, NR⁴R⁴, SH, SR⁴, CF₃, CH₂OH, CH₂F, CH₂Cl, CH₂CF₃, C(Y³)₃, C(Y³)₂C(Y³)₃, C(=O)OH, C(=O)OR⁴, C(=O)-알킬, C(=O)-아릴, C(=O)-알콕시알킬, C(=O)NH₂, C(=O)NHR⁴, C(=O)N(R⁴)₂, 또는 N₃이고, Y³은 각각 독립적으로 H 또는 할로이고; 및

R⁴는 각각 독립적으로 H, 저급 아실을 포함하는 아실, 메틸, 에틸, 프로필 및 사이클로프로필과 같되 이에 제한되지 않는 저급 알킬을 포함하는 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 하이드록시알킬이다.

하위실시형태(subembodiment)에서, R₇은 메틸, 에틸, 페닐, 클로로 또는 NH₂이다.

또다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공되는 화합물은 다음의 구조를 갖는다:

또다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공되는 화합물은 다음의 구조를 갖는다:

본 명세서에 개시된 화합물은 키랄 중심(chiral centers)을 가질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 이러한 키랄 중심은 (R) 또는 (S) 구조가 될 수 있거나, 이의 혼합물이 될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 제공된 화합물은 거울상이성질체적으로 순수하거나, 입체이성질체 또는 부분입체이성질체 혼합물이 될 수 있다. 본 명세서에서 화합물의 개시내용은 임의의 라세미체, 광학 활성, 폴리모르픽(polymorphic), 또는 입체이성질체 형태, 또는 이의 혼합물을 포함하고, 이는 바람직하게는 본 명세서에 기재된 유용한 특성을 가지며, 광학 활성 형태를 제조하는 방법 및 본 명세서에 기재된 표준 시험을 사용하거나 이 기술분야에서 주지되는 다른 유사한 시험을 사용하여 활성을 결정하는 방법은 이 기술분야에서 주지되어 있다. 화합물의 광학 이성질체를 얻기 위해 사용될 수 있는 방법들의 예로는 다음의 것들이 포함된다:

i) 결정의 물리적 분리 - 개별 거울상이성질체의 거시적 결정(macroscopic crystals)이 수작업으로 분리된다. 이 기술은, 개별 거울상이성질체들의 결정들이 존재하고, 즉 물질이 집괴(conglomerate)이고, 결정들이 시각적으로 구별되는 경우에 사용가능하다;

ii) 동시 결정화 - 라세미체가 고체 상태에서 집괴이기만 하면 가능한, 개별 거울상이성질체가 라세미체의 용액으로부터 개별적으로 결정화되는 기술;

iii) 효소 분해(enzymatic resolutions) - 효소와 거울상이성질체의 상이한 반응 속도로 인해 라세미체가 일부 또는 완전 분리되는 기술;

iv) 효소 비대칭 합성(enzymatic asymmetric synthesis) - 원하는 거울상이성질체의 거울상이성질체적으로 순수하거나 풍부한 합성 전구체를 얻기 위하여 합성의 1 이상의 단계가 효소 반응을 사용하는 합성 기술;

v) 화학 비대칭 합성- 원하는 거울상이성질체가, 키랄 촉매 또는 키랄 보조제를 사용하여 얻어질 수 있는, 생성물 내 비대칭성(assymetry)(즉 키랄성(chirality))을 생산하는 조건 하에서 아키랄(achiral) 전구체로부터 합성되는 합성 기술;

vi) 부분입체이성질체 분리 - 라세미체 화합물이, 개별 거울상 이성질체를 부분입체이성질체로 전환시키는 거울상이성질체적으로 순수한 시약(키랄 보조제)과 반응되는 기술. 이어서 얻어지는 부분입체이성질체는, 이들의 현재의 더 구별되는 구조적 차이 및 원하는 거울상이성질체를 얻기 위해 이후에 제거되는 키랄 보조제 덕택에 크로마토그래피 또는 결정화에 의해 분리된다;

vii) 1- 및 2-차(order) 비대칭 형질전환 - 라세미체로부터의 부분입체이성질체가 원하는 거울상이성질체로부터의 부분입체이성질체의 용액에서 우세하도록 평형화되거나, 또는 원하는 거울상이성질체로부터의 부분입체이성질체의 차별적인 결정화가, 궁극적으로는 원칙적으로 모든 물질이 원하는 거울상이성질체로부터 결정질 부분입체이성질체로 전환되도록, 평형(equilibrium)을 불안정하게 하는(perturbs) 기술. 이어서 원하는 거울상이성질체가 부분입체이성질체로부터 분리된다;

viii) 동역학 분해(kinetic resolutions) - 이 기술은, 동역학 상태 하의 키랄성, 비-라세믹 시약 또는 촉매와 거울상이성질체의 동등하지 않은 반응 속도로 인해 라세미체의 일부 또는 완전 분해(또는 일부 분해된 화합물이 추가 분해)가 달성되는 것을 나타낸다;

ix) 비-라세믹 전구체로부터의 거울상이성질특이(enantiospecific) 합성 - 비-키랄 출발 물질로부터 원하는 거울상이성질체가 얻어지고, 합성 과정동안 입체화학 완전성(integrity)이 떨어지지(compromised) 않거나 최소로만 떨어지는 합성 기술;

x) 키랄 액체 크로마토그래피 - 라세미체의 거울상이성질체가 정지상과의 상이한 상호작용으로 인해 액체 이동상(mobile phase)에서 분리되는 기술. 상이한 상호작용을 일으키기 위해 정지상이 키랄 물질로 만들어질 수 있거나 이동상이 추가적인 키랄 물질을 포함할 수 있다;

xi) 키랄 가스 크로마토그래피 - 라세미체가 휘발되고, 거울상이성질체가 고정된 비-라세믹 키랄 흡착 상을 포함하는 칼럼과의 가스 이동상 내에서의 상이한 상호작용으로 인해 분리되는 기술;

xii) 키랄 용매를 사용한 추출 - 거울상이성질체가 하나의 거울상이성질체의 특정 키랄 용매 내로의 차별적인 용해로 인해 분리되는 기술;

xiii) 키랄 막(membrane)을 가로지르는(across) 수송 - 라세미체가 박막 배리어와 접촉하여 위치되는 기술. 배리어는 일반적으로 두 혼화성 유체(하나는 라세미체를 포함)를 분리하고, 농도 또는 압력 차와 같은 구동력이 막 베리어를 가로지르는 차별적인 수송을 유발한다. 분리는, 라세미체의 하나의 거울상이성질체만이 통과할 수 있는 막의 비-라세믹 키랄 성질로 인해 일어난다.

일부 실시형태에서, 트리시리빈, 트리시리빈 포스페이트(TCN-P), 트리시리빈 5'-포스페이트(TCN-P), 또는 트리시리빈의 DMF 부가물(TCN-DMF)가 제공된다. TCN은 예를 들어 문헌(Tetrahedron Letters, vol. 49, pp.4757-4760 (1971))에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지된 어떤 기술로 합성될 수 있다. TCN-P는 예를 들어 미국특허 제 4,123,524호에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지된 어떤 기술로 제조될 수 있다. TCN-DMF의 합성은 예를 들어 문헌(INSERM, vol. 81, pp.37-82(1978))에 기재되어 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 TCN과 관련 있는 다른 화합물들은 예를 들어 하기 문헌에 개시된 방법에 따라 합성될 수 있다:

약제학적으로 허용가능한 염 및 프로드러그

화합물이 비독성 산 또는 염기 염을 형성하기에 충분히 염기성 또는 산성인 경우, 약제학적으로 허용가능한 염으로서 화합물을 투여하는 것이 적당할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 약제학적으로 허용가능한 무기 또는 유기 염기 및 산에서 유래하는 것을 포함한다. 적당한 염은, 약제학적 기술에서 주지된 다수의 다른 산들 중에서, 칼륨 및 나트륨과 같은 알칼리 금속, 칼슘 및 마그네슘과 같은 알칼리 토금속으로부터 유래하는 것을 포함한다. 특히, 약제학적으로 허용가능한 염의 예로는, 예를 들어 토실레이트, 메탄술포네이트, 아세테이트, 시트레이트, 말로네이트, 타르타레이트, 숙시네이트, 벤조에이트, 아스코르베이트, α-케토글루타레이트 및 α-글리세로포스페이트와 같은, 생리학적으로 허용가능한 음이온을 형성하는 산과 함께 형성된 유기산 부가염이 있다. 술페이트, 니트레이트, 바이카르보네이트, 및 카르보네이트 염을 포함하는 적합한 무기염이 또한 형성될 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 염은 이 기술에서 주지된 표준 방법을 사용하여, 예를 들어 생리학적으로 허용가능한 음이온을 제공하는 적합한 산과 아민과 같은 충분히 염기성인 화합물을 반응시킴으로써 얻어질 수 있다. 카르복실산의 알칼리 금속(예를 들어, 나트륨, 칼륨 또는 리튬) 또는 알칼리 토금속(예를 들어 칼슘) 염이 또한 만들어질 수 있다.

활성, 생체적합성, 안정성을 증가시키기 위해 또는 이와 달리 뉴클레오사이드의 특성을 변경하기 위해 본 명세서에 기재된 어떤 뉴클레오티드가 뉴클레오티드 프로드러그로서 투여될 수 있다. 다수의 뉴클레오타이드 프로드러그 리간드가 공지되어 있다. 일반적으로, 뉴클레오사이드의 모노, 디 또는 트리포스페이트의 알킬화, 아실화 또는 다른 친지성 변경이 뉴클레오타이드의 안정성을 증가시킬 것이다. 포스페이트 잔기 상의 하나 이상의 수소를 대체할 수 있는 치환기의 예로는 알킬, 아릴, 스테로이드, 당을 포함하는 탄수화물, 1,2-디아실글리세롤 및 알콜이 있다. 문헌(R.Jones and N. B.Schofberbger, Antiviral Research, 27(1995) 1-17)에 많은 것들이 기재되어 있다. 이들 중 어떤 것은 원하는 효과를 얻기 위해 개시된 뉴클레오사이드와 조합하여 사용될 수 있다.

일실시형태에서, 트리시리빈 또는 관련 화합물이 5'-하이드록실 친지성 프로드러그로서 제공된다. 바람직하게는 뉴클레오사이드 또는 친지성 제제의 5'-OH 위치에서, 뉴클레오사이드 내에 공유 결합될 수 있는 적합한 친지성 치환체를 개시하는 미국 특허는 예를 들어 비제한적으로 미국 특허 제 5,149,794호(1992년 9월 22일, Yatvin, et al.); 제 5,194,654호(1993년 3월 16일, Hostetler, et al.); 제 5,223,263호(1993년 6월 29일, Hostetler, et al.); 제 5,256,641호(1993년 10월 26일, Yatvin, et al.); 제 5,411,947호(1995년 5월 2일, Hostetler, et al.); 제 5,463,092호(1995년 10월 31일, Hostetler, et al.); 제 5,543,389호(1996년 8월 6일, Yatvin, et al.); 제 5,543,390호(1996년 8월 6일, Yatvin, et al.); 제 5,543,391호(1996년 8월 6일, Yatvin, et al.); 및 제 5,554,728호(1996년 9월 10일, Basava, et al.)를 포함하며, 이들 모두는 본 명세서에 참조 병합된다.

본 발명의 트리시리빈 또는 관련 화합물에 부착될 수 있는 친지성 치환체 또는 친지성 제제를 개시하는 외국 특허 출원에는 WO 89/02733, WO 90/00555, WO 91/16920, WO 91/18914, WO 93/00910, WO 94/26273, WO/15132, EP 0 350 287, EP 93917054.4, 및 WO 91/19721이 포함된다.

트리시리빈 또는 관련 화합물의 유도체는 추가적으로 비제한적으로 예를 들어 다음 공개문헌에 개시된 바와 같은 치환체를 포함하는 것이다. 이들 유도체화된 트리시리빈 또는 관련 화합물은, 본 명세서에 기재된 지시사항(indications)에 대해 또는 이와 달리 항-HIV 또는 항-HBV 약제와 같은 항바이러스제로서 사용될 수 있다.

항-HIV 약제 AZT의 알킬 수소 포스포네이트 유도체는 모(parent) 뉴클레오사이드 유사체보다 독성이 덜할 수 있다.

바람직한 한 포스페이트 프로드러그 기는, "SATE" 라고도 하는 S-아실-2-티오에틸기이다.

사용가능한 프로드러그의 부가적인 예들은 다음의 특허 및 특허출원에 기재된 것이다: 미국 특허 제 5,614,548호, 제 5,512,671호, 제 5,770,584호, 제 5,962,437호, 제 5,223,263호, 제 5,817,638호, 제 6,252,060호, 제 6,448,392호, 제 5,411,947호, 제 5,744,592호, 제 5,484,809호, 제 5,827,831호, 제 5,696,277호, 제 6,022,029호, 제 5,780,617호, 제 5,194,654호, 제 5,463,092호, 제 5,744,461호, 제 4,444,766호, 제 4,562,179호, 제 4,599,205호, 제 4,493,832호, 제 4,221,732호, 제 5,116,992호, 제 6,429,227호, 제 5,149,794호, 제 5,703,063호, 제 5,888,990호, 제 4,810,697호, 제 5,512,671호, 제 6,030,960호, 제 2004/0259845호, 제 6,670,341호, 제 2004/0161398호, 제 2002/082242호, 제 5,512,671호, 제 2002/0082242호, 및/또는 PCT 공개 WO 90/11079호, WO 96/39197호 및/또는 WO 93/08807호.

정의

본 명세서에 사용된 바와 같이, "암" 및 "암의" 라는 용어는 일반적으로 비조절된 세포 성장, 즉 증식 장애를 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 이상(condition)을 나타내거나 설명한다. 이러한 증식 장애에는 예를 들어 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병과 같은 암과, 본 명세서에 개시된 다른 암이 포함된다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 유방암, 전립선암, 결장암, 편평상피 세포 암, 소-세포(small-cell) 폐암, 비-소세포 폐암, 위장암, 췌장암, 경부암, 난소암, 간암, 예를 들어 간 암종(hepatic carcinoma), 방광암, 결장직장암, 자궁내막 암종, 신장암 및 갑상선암이 포함된다.

암의 다른 비제한적인 예로는 기저 세포 암종, 담도암; 뼈암; 뇌 및 CNS 암; 융모막암종(choriocarcinoma); 연결 조직 암; 식도암; 눈 암; 두부 및 경부의 암; 위암(gastric cancer); 상피-내 신생물; 후두암; 호지킨 및 비-호지킨 림프종을 포함하는 림프종; 흑색종; 골수종; 신경아세포종; 구강암(예를 들어 입술, 혀, 입 및 인두); 췌장암; 망막아세포종; 황문근육종; 직장암; 호흡계의 암; 육종; 피부암, 위암(stomach cancer); 고환암; 자궁암; 비뇨기계의 암과, 다른 암종 및 육종이 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은, "종양"이라는 용어는, 악성이든 양성이든간에 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 및 모든 전-암(pre-cancerous) 및 암 세포 및 조직을 나타낸다. 예를 들어, 특정한 암은 고형 덩어리 종양(solid mass tumor)을 특징으로 할 수 있다. 고형 종양괴(tumor mass)는 존재하는 경우에 1차 종양 덩어리일 수 있다. 1차 종양 덩어리란 조직의 정상 세포의 형질전환으로부터 얻어지는 조직 내 암 세포의 성장을 나타낸다. 대부분의 경우, 1차 종양 덩어리는 포낭(cyst)의 존재로 확인되며, 이는 시각적 방법 또는 촉진(palpation) 방법을 통해, 또는 조직의 형태, 조직(texture) 또는 중량의 불규칙성에 의해 발견될 수 있다. 그러나, 일부 1차 종양은 촉진될 수 없고, X-선(예를 들어 유방 x-선 촬영)과 같은 의료적 이미징 기술을 통해서나 침 흡인(needle aspirations)에 의해서만 검출될 수 있다. 이들 후자 기술들을 사용하는 것은 초기 검출에서 보다 일반적이다. 조직 내 암 세포의 분자 및 표현형 분석으로 일반적으로, 암이 조직에 대해 내생인지 또는 병소(lesion)가 다른 부위로부터의 전이에 기인하는지가 확인될 것이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 알킬이라는 용어는, 달리 구체화되지 않는다면, 예를 들어 C₁ 내지 C₂₄의 포화된 직쇄, 분지, 또는 사이클릭, 일차, 이차 또는 삼차 탄화수소이고, 구체적으로 메틸, 트리플루오로메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 사이클로프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 사이클로펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 이소헥실, 사이클로헥실, 사이클로헥실메틸, 3-메틸펜틸, 2,2-디메틸부틸, 및 2,3-디메틸부틸을 포함한다. 알킬은 선택적으로, 본 명세서에 참조 병합된, 예를 들어 본 명세서에 참조 병합된 문헌(Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Second Edition, 1991)에 교시된 바와 같이, 당업자에게 공지된 바에 따라, 비보호되거나 필요에 따라 보호된, 예를 들어 할로(F, Cl, Br 또는 I), (예를 들어, CF₃, 2-Br-에틸, CH₂F, CH₂Cl, CH₂CF₃ 또는 CF₂CF₃), 하이드록실(예를 들어 CH₂OH), 아미노(CH₂NH₂, CH₂NHCH₃ 또는 CH₂N(CH₃)₂), 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 아지도(예를 들어 CH₂N₃), 시아노(예를 들어 CH₂CN), 술폰산, 술페이트, 인산, 포스페이트, 또는 포스포네이트와 같은 하나 이상의 치환체로 치환된다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 저급 알킬이라는 용어는, 달리 구체화되지 않는 한, 치환 및 비치환 형태를 모두 포함하는 C₁ 내지 C₄의 포화된 직쇄, 분지, 또는 적당하다면, 사이클릭(예를 들어, 사이클로프로필) 알킬기를 나타낸다.

알킬아미노 또는 아릴아미노라는 용어는 하나 또는 두 알킬 또는 아릴 치환체를 갖는 아미노기를 각각 포함한다.

아미노산이라는 용어는 자연 발생 및 합성 α, β, γ 또는 δ 아미노산을 포함하고, 단백질 내에서 발견되는 아미노산, 즉 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르테이트, 글루타메이트, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘을 포함하되 이에 제한되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 아미노산은 L-구조이다. 선택적으로, 아미노산은 알란일, 발린일, 류신일, 이소류신일, 프롤린일, 페닐알라닌일, 트립토판일, 메티오닌일, 글리신일, 세린일, 트레오닌일, 시스테인일, 티로신일, 아스파라긴일, 글루타민일, 아스파르토일, 글루타로일, 라이신일, 아르기닌일, 히스티딘일, β-알란일, β-발린일, β-류신일, β-이소류신일, β-프롤린일, β-페닐알란일, β-트립토판일, β-메티오닌일, β-글리신일, β-세린일, β-트레오닐일, β-시스테인일, β-티로신일, β-아스파라긴일, β-글루타민일, β-아스파르토일, β-글루타로일, β-라이신일, β-아르기닌일 또는 β-히스티딘일의 유도체가 될 수 있다. 아미노산이라는 용어가 사용되는 경우, 이는 D 및 L-구조의 α, β, γ 또는 δ 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르테이트, 글루타메이트, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘을 포함하되 이에 제한되지 않는 자연 또는 합성 아미노산의 에스테르를 각각 구체적이고 개별적으로 개시하는 것으로 간주된다.

달리 정의되지 않는 한 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "보호된" 이라는 용어는, 산소, 질소, 황 또는 인 원자의 추가 반응을 방지하기 위해 또는 다른 목적을 위해 이들 원자에 첨가되는 기를 포함한다. 매우 다양한 산소 및 질소 보호기가 유기 합성의 당업자에게 알려져 있다(문헌(Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd Ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1999)을 참조).

달리 구체화되지 않는 한 본 명세서에 사용되는 바와 같은 아릴이라는 용어는 페닐, 바이페닐, 또는 나프틸, 및 바람직하게는 페닐을 포함한다. 아릴기는, 예를 들어 문헌(Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, 3^rd Ed., 1999)에 교시된 바와 같이 당업자에게 공지된 바와 같은, 비보호되거나 필요시 보호되는, 할로, 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 술폰산, 술페이트, 포스폰산, 포스페이트, 또는 포스포네이트와 같은 하나 이상의 잔기로 선택적으로 치환된다.

알크아릴 또는 알킬아릴이라는 용어는 아릴 치환체를 갖는 알킬기를 포함한다. 아르알킬 또는 아릴알킬이라는 용어는 알킬 치환체를 갖는 아릴기를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 할로라는 용어는 클로로, 브로모, 요오도 및 플루오로를 포함한다.

아실이라는 용어는, 에스테르기의 비-카르보닐 잔기가 직쇄, 분지, 또는 사이클릭 알킬 또는 저급 알킬, 메톡시메틸을 포함하는 알콕시알킬, 벤질을 포함하는 아르알킬, 페녹시메틸과 같은 아릴옥시알킬, 할로겐, C₁ 내지 C₄ 알킬 또는 C₁ 내지 C₄ 알콕시로 선택적으로 치환된 페닐을 포함하는 아릴, 메탄술포닐을 포함하는 알킬 또는 아르알킬 술포닐과 같은 술포네이트 에스테르, 모노, 디 또는 트리포스페이트 에스테르, 트리틸 또는 모노메톡시트리틸, 치환된 벤질, 트리알킬실릴(예를 들어 디메틸-t-부틸실릴) 또는 디페닐메틸실릴로부터 선택되는 카르복실산 에스테르를 포함한다. 에스테르 내 아릴기는 최적으로 페닐기를 포함한다. "저급 아실"이라는 용어는 비-카르보닐 잔기가 저급 알킬인 아실기를 나타낸다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 거울상이성질체 순도와 관련하여 "실질적으로 없는" 또는 "실질적으로 부재하는" 이라는 용어는, 85 중량% 또는 90 중량% 이상, 바람직하게는 95 중량% 내지 98 중량%, 및 훨씬 더 바람직하게는 99 중량% 내지 100 중량%의 지정된 거울상이성질체를 포함하는 조성물을 나타낸다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물에서, 화합물은 실질적으로 다른 거울상이성질체가 없다.

유사하게, "분리된" 이라는 용어는, 85 중량% 또는 90 중량% 이상, 바람직하게는 95 중량% 내지 98 중량%, 및 훨씬 더 바람직하게는 99 중량% 내지 100 중량%의 화합물을 포함하고, 나머지는 다른 화학종 또는 거울상이성질체를 포함하는 화합물 조성물을 나타낸다.

"독립적으로" 라는 용어는, 독립적으로 적용되는 변수가 적용예로부터 적용예가지 독립적으로 변화되는 것을 나타내도록 본 명세서에서 사용된다. 따라서, R"가 "독립적으로 탄소 또는 질소"인 R"XXR"과 같은 화합물 내에서, 모든 R"은 탄소가 될 수 있거나, 모든 R"가 탄소가 될 수 있거나, 한 R"는 탄소가 될 수 있고 다른 R"은 질소가 될 수 있다.

"약제학적으로 허용가능한 염 또는 프로드러그"라는 용어는, 명세서 전체에서, 환자에게 투여시 화합물을 제공하는 화합물의 (에스테르, 포스페이트 에스테르, 에스테르의 염 또는 관련 기와 같은) 임의의 약제학적으로 허용가능한 형태를 나타내기 위해 사용된다. 약제학적으로 허용가능한 염은 약제학적으로 허용가능한 무기 또는 유기 염기 및 산에서 유래하는 것을 포함한다. 적합한 염은, 약제학적 기술에서 주지된 다수의 다른 산 가운데, 칼륨 및 나트륨과 같은 알칼리 금속, 칼슘 및 마그네슘과 같은 알칼리 토금속에서 유래하는 것을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 프로드러그는, 본 발명의 화합물을 형성하기 위해 수용자 내에서 대사되는, 예를 들어 가수분해 또는 산화되는 화합물을 나타낸다. 프로드러그의 전형적인 예에는 활성 화합물의 작용성 잔기 상에 생물학적으로 불안정한(labile) 보호기를 갖는 화합물이 포함된다. 프로드러그는 활성 화합물을 생산하기 위해 산화, 환원, 아미노화, 탈아미노화(deaminated), 하이드록실화, 탈하이드록실화, 가수분해, 탈가수분해(dehydrolyzed), 알킬화, 탈알킬화, 아실화, 탈아실화, 인산화, 탈인산화될 수 있는 화합물을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "약제학적으로 허용가능한 에스테르"라는 용어는, 달리 구체화되지 않는 한, 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 염증(irritation), 알러지 반응 등 없이 수용자의 조직과 접촉시켜 사용하기에 적합하고, 합리적인 이점/위험 비율과 잘 맞고, 이들의 원하는 용도에 효과적인 하나 이상의 화합물의 에스테르를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "대상"이라는 용어는, 동물, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 인간을 나타낸다. 포유동물은 돼지, 양, 염소, 소(cow)(소(bovine)), 사슴, 노새, 말, 원숭이 및 다른 비-인간 영장류, 개, 고양이, 래트, 마우스, 래빗 또는 본 명세서에 공지 또는 개시된 임의의 다른 동물을 포함하되 이에 제한되지 않는 비인간 포유동물을 포함할 수 있다.

II. 생체 내 효능/투여 투약 계획(dosing regimens)

본 발명의 또다른 측면에서, TCN 및 관련 화합물의 독성 부작용을 제한하는 투여 투약 계획이 제공된다. 일실시형태에서, 이러한 투여 투약 계획은 간독성, 혈소판감소증, 고혈당증, 구토, 저칼슘혈증, 빈혈증, 히포알부네미아(hypoalbunemia), 골수억제, 고트리글리세라이드혈증, 고아밀라제혈증, 설사, 스토마키티스(stomachitis) 및/또는 열을 포함하되 이에 제한되지 않는 독성 부작용을 최소화한다.

또다른 실시형태에서, TCN, TCN-P 또는 관련 화합물의 투여는 대상의 적어도 15 내지 20% 에서 적어도 일부 또는 완전 생체 내 반응을 제공한다. 특정 실시형태에서, 일부 반응은 종양의 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 또는 85 % 이상의 퇴행이 될 수 있다. 다른 실시형태에서, 이 반응은 이 치료법으로 치료받은 대상의 15, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 또는 90 % 이상에서 명백할 것이다. 추가 실시형태에서, 이러한 반응 비율은 본 명세서에 개시된 임의의 치료법으로 얻어질 수 있다.

다른 실시형태에서, 3주동안 주당 1회 약물을 투여한 후 약물이 투여되지 않는 1주의 기간이 이어지는 것을 포함하는 투여 계획(dosing schedule)(즉, 28일 주기를 통함)에 따라 유효량의 TCN, TCN-P 또는 관련 화합물을 대상에게 투여함으로써 암으로 진단받은 대상을 치료하는 방법이 제공된다. 다른 실시형태에서, 이러한 28일 주기는 2, 3, 4 또는 5회 이상 또는 종양의 퇴행이 명백할 때까지 반복될 수 있다.

추가 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물이 4주동안 1주에 1회 투여된 후 약물이 투여되지 않는 2주의 기간이 이어질 수 있는 42일 주기가 제공된다. 다른 실시형태에서, 이러한 42일 주기는 2, 3, 4 또는 5회 이상 또는 종양의 퇴행이 명백할 때까지 반복될 수 있다. 특정 실시형태에서, 12 ㎎/㎡ 이하, 11 ㎎/㎡ 이하 또는 10 ㎎/㎡ 이하의 TCN, TCN-P 또는 관련 화합물이 42일 주기에 따라 투여될 수 있다. 다른 특정 실시형태에서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 ㎎/㎡의 TCN, TCN-P 또는 관련 화합물이 42일 주기에 따라 투여될 수 있다.

또다른 실시형태에서, 대상에게 주당 1회 10 ㎎/㎡ 이하의 TCN, TCN-P 또는 관련 화합물의 투여 투약 계획으로 투여함으로써 대상의 암을 치료하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10 ㎎/㎡의 본 명세서에 기재된 바와 같은 TCN, TCN-P 또는 관련 화합물이 주당 1회 투여될 수 있다.

본 발명의 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 단일 볼루스 투여량으로서 단기간에 걸쳐, 예를 들어 약 5, 10, 15, 20, 30 또는 60분에 걸쳐 투여될 수 있다. 추가 실시형태에서, 화합물이 24, 48, 72, 96 또는 120 시간 이상동안 연속 주입을 통해 투여되는 투여 계획이 제공된다. 특정 실시형태에서, 연속 또는 볼루스 주입을 통한 약물 투여는 적어도 1주 1회, 매 2주마다 1회, 매 3주마다 1회, 1개월 1회, 매 5주마다 1회, 매 6주마다 1회, 매 8주마다 1회, 매 10주마다 1회 및/또는 매 12주마다 1회의 특정 주기로 반복될 수 있다. 투여 주기(dosing cycle)를 생성하기 위해 본 명세서에 개시된 임의의 방법으로 투여 형태 및 주기를 결합시킬 수 있다. 약물은 특정 투여 주기를 통해, 예를 들어 3개월동안 매 2주마다 1회씩 볼루스 투여로 반복적으로 투여될 수 있다. 투여 주기는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18 또는 24 개월 이상동안 투여될 수 있다. 선택적으로, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 또는 20 투여 주기로 환자에게 투여될 수 있다. 약물은 본 명세서에 개시된 임의의 조합에 따라 투여될 수 있다, 예를 들어 약물은 매 3주마다 1주 1회로 3 주기동안 투여될 수 있다.

추가 실시형태에서, 화합물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 이상동안 하루에 1회 이상 투여될 수 있다. 이러한 투여는, 약물이 투여되지 않는 대응하는 기간이 이어질 수 있다.

본 명세서에 개시된 바와 같은 TCN, TCN-P 및 관련 화합물은 종양 퇴행을 유발하기에 효과적인 양으로 환자에게 투여될 수 있다. TCN, TCN-P 및 관련 화합물의 투여는 예를 들어 15, 20 또는 30 % 이상과 같은 적어도 부분적이거나, 또는 대상의 15 내지 20% 이상의 완전한 생체 내 반응을 제공할 수 있다. 특정 실시형태에서, 2, 5, 10, 15, 20, 30 또는 50 mg/㎡의 본 명세서에 개시된 화합물이 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 약 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 12, 15, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 165, 175, 200, 250, 300, 350 ㎎/㎡ 이상의 본 명세서에 개시된 TCN, TCN-P 또는 관련 화합물이 대상에게 투여될 수 있다.

화합물의 투여는 본 명세서에 개시된 임의의 치료 투약 계획에 따라 실시될 수 있다. 특정 실시형태에서, 투여 투약 계획은 20 ㎎/㎡ 이하의 TCN 및 관련 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 20 ㎎/㎡ 이하의 TCN 또는 관련 화합물이 1주 1회 투여될 수 있다. 추가 실시형태에서, 2 ㎎/㎡, 5 ㎎/㎡, 10 ㎎/㎡, 및/또는 15 ㎎/㎡ 의 TCN 또는 관련 화합물이 대상에게 투여될 수 있다. 또다른 실시형태에서, 10 ㎎/㎡ 이하가 5일 이상동안 연속 주입을 통해 대상에게 투여될 수 있다. 본 발명은 본 명세서에 개시된 투여 형태, 빈도, 주기의 수 및 용량의 임의의 조합을 제공한다.

III. 환자 집단(populations)의 스크리닝

본 발명의 다른 측면에서, 트리시리빈(TCN) 및 관련 화합물의 독성 효과에 영향받기 쉬운 암 또는 종양을 확인하기 위한 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, (i) 종양으로부터 생물학적 시료를 얻는 단계; (ii) 암 또는 종양이 Akt 키나제 또는 과활성화(hyperactivated) 및 인산화된 Akt 키나제를 과발현하는지를 결정하는 단계; 및 (iii) 본 명세서에 기재된 바와 같은 트리시리빈 또는 관련 화합물을 사용하여 암 또는 종양을 치료하는 단계에 의해 포유동물에서 암 또는 종양을 치료하는 방법이 제공된다. 일실시형태에서, 생물학적 시료는 생검(biopsy)될 수 있다. 다른 실시형태에서, 생물학적 시료는 종양 또는 암으로부터 얻어진 유체, 세포 및/또는 흡인물(aspirates)이 될 수 있다.

생물학적 시료는 당업자에게 공지된 임의의 기술에 따라 얻어질 수 있다. 일실시형태에서, 생물학적 시료를 얻기 위해 생검이 실시될 수 있다. 생검은 검사를 위한 신체로부터 조직 또는 세포를 제거하기 위해 수행되는 절차이다. 일부 생검은 내과의사 사무실(physician's office)에서 수행될 수 있는 반면, 다른 생검은 병원 세팅(setting)에서 실시될 필요가 있다. 또한, 일부 생검은 소정 영역을 마비시키기 위해 마취제의 사용을 요구하지만, 다른 생검은 어떤 진정작용(sedation)을 요구하지 않는다. 특정 실시형태에서, 내시경 생검(endoscopic biopsy)이 수행될 수 있다. 이러한 형태의 생검은 광파이버 내시경(fiberoptic endoscope)(관찰을 위한 말단에 클로즈-포커싱 망원경을 갖는 길고 가는 관)을 통해 원래의 신체 오리피스(즉 직장) 또는 소형 절개부(즉 관절경검사)를 통해 수행된다. 내시경은, 소량의 연구용 조직을 얻기 위해, 비정상 또는 의심스러운 영역의 해당 장기를 관찰하고자 사용된다. 내시경 절차는 시각화되거나(visualized) 및/또는 치료되는 장기 또는 신체 영역에 대해 지정된다(named). 내과의사는 위장관(소화관 내시경), 방광(방광경검사), 복강(복강경검사), 관절강(관절경검사), 가슴의 중간부(종격동경검사), 또는 기관(trachea) 및 기관지계(후두경검사 및 기관지경검사) 내에 내시경을 삽입할 수 있다.

또다른 실시형태에서, 골수 생검이 수행될 수 있다. 이러한 형태의 생검은 휴골(가슴뼈) 또는 장골능 관골(등 하부 영역의 골반의 어느 한 쪽 상의 골 영역)로부터 수행될 수 있다. 피부는 세척되고(cleansed), 소정 영역을 마비시키기 위해 국부 마취제가 주어진다. 길고 단단한 침이 골수 내에 삽입되고, 세포가 연구를 위해 흡인된다; 이 단계는 종종 불편하다. 코어 생검(골수로부터 소골(small bone) '칩(chip)' 제거)은 흡인을 뒤따를 수 있다.

추가 실시형태에서, 포유동물 상에서 절제 또는 절개 생검이 수행될 수 있다. 이러한 형태의 생검은 피부의 더 광범위하고 더 깊은 일부분이 요구되는 경우에 자주 사용된다. 스캘펠(scalpel)(외과용 나이프)을 사용하여, 피부의 전체 두께가 추가 조사를 위해 제거되고, 상처는 봉합된다(외과용 실로 닫아 꿰맴). 전체 종양이 제거되는 경우, 이는 절제 생검 기술이라 한다. 종양의 일부분만이 제거되면, 이는 절개 생검 기술이라 한다. 예를 들어, 흑색종(한 형태의 피부암)이 의심되는 경우, 절제 생검은 대개 일반적으로 바람직한 방법이다.

또다른 실시형태에서, 미세 침 흡인(FNA) 생검이 사용될 수 있다. 이러한 형태의 생검은 종양으로부터 매우 작은 조각을 제거하기 위하여 가는 침을 사용하는 것을 수반한다. 국부 마취는 때때로 영역을 마비시키기 위해 사용되지만, 시험은 드물게는 상당한 불편을 유발하고 반흔(scar)을 남기지 않는다. FNA는 예를 들어 의심스런 검은 점(mole)을 진단하기 위해 사용되지만, 예를 들어 흑색종 주변의 큰 림프절을 생검하여 흑색종이 전이(확산(spread))되었는지를 알아보기 위해 사용될 수 있다. 폐 또는 간과 같은 내부 장기 내 종양 속으로 침을 가이드(guide)하기 위해 컴퓨터계산된 x선 단층촬영(computed tomography)(CT 또는 CAT 스캔)이 사용될 수 있다.

다른 실시형태에서, 펀치 쉐이브(punch shave) 및/또는 피부 생검이 실시될 수 있다. 펀치 생검은, 조직의 짧은 원통 또는 "애플 코어(apple core)" 를 제거하는 생검 기구를 사용하여 피부의 심부 시료(deeper sample)를 취하는 것을 포함한다. 국부 마취제가 투여된 후, 기구는 피부의 표면 상에서 진피, 표피 및 피하조직의 가장 표면 부분(지방)을 포함하는 모든 층을 뚫고 지나갈(cut through) 때까지 회전한다. 쉐이브 생검은 피부의 최상부층을 깎아냄(shaving off)으로써 제거하는 것을 포함한다. 쉐이브 생검은 또한 국부 마취제를 사용하여 수행된다. 피부 생검은 예를 들어 흑색종이 존재하는지를 결정하기 위해 현미경 하에서 조사하기 위한 피부 시료를 제거하는 것을 포함한다. 생검은 국부 마취 하에 수행된다.

특정 실시형태에서, 종양이 Akt 키나제를 과발현하는지를 결정하기 위한 방법이 제공된다. Akt 키나제 과발현은 키나제의 인산화 상태를 나타낼 수 있다. Akt의 과인산화(hyperphosphorylation)는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 검출될 수 있다. 일실시형태에서, 종양 생검은 대조구 조직과 비교할 수 있다. 대조구 조직은 생검이 얻어지는 포유동물로부터의 정상 조직 또는 건강한 포유동물로부터의 정상조직이 될 수 있다. 종양 생검이, 예를 들어 대조구 조직에 포함된 것보다 약 1.5, 2, 2.25, 2.5, 2.75, 3, 3.25, 3.5, 3.75, 4, 4.25, 4.5, 4.75, 5, 5.5, 6, 7, 8, 9 또는 10-배 이상의 다량의 Akt 키나제와 같이, 대조구 조직보다 다량의 Akt 키나제 및/또는 Akt 키나제 인산화를 포함한다면, Akt 키나제 과발현 또는 과인산화가 결정될 수 있다.

일실시형태에서, 본 발명은, 대상으로부터의 세포, 세포 추출물, 혈장 또는 다른 시료 또는 상기 생물학적 시료를 Akt 키나제 또는 이의 항원 일부분에 대해 특이적인 면역상호작용(immunointeractive) 분자와 접촉시키고, 면역상호작용 분자-Akt 키나제 착체 형성 수준에 대해 스크리닝함으로써, 대상 내 또는 대상으로부터의 생물학적 시료 내 비정상(aberrant) Akt 키나제 발현을 검출하는 방법을 제공하며, 정상 세포에 대한 착체의 상승된 존재는 Akt를 발현 또는 과발현하는 비정상 세포를 나타낸다. 일례에서, 세포 또는 세포 추출물은 상승된 수준의 Akt 키나제의 존재에 대해 면역학적으로 스크리닝될 수 있다.

대체 실시형태에서, 정상 세포에 비해 전사 발현 산물(즉 mRNA)의 상승된 수준이 비정상 세포를 나타내는 Akt 키나제를 암호화하는 유전자의 발현 수준에 대해 스크리닝함으로써, 세포 내 Akt의 비정상 발현이 유전자 수준에서 검출된다. 특정 실시형태에서, 전사 활성을 결정하기 위해 실시간(real-time) PCR 및 다른 PCR 절차가 사용될 수 있다. 일실시형태에서, 대상의 세포로부터 또는 대상으로부터의 생물학적 시료로부터 mRNA가 얻어질 수 있고 cDNA가 선택적으로 생성된다. 이어서 mRNA 및 cRNA가, Akt 키나제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부, 또는 이의 상보 뉴클레오티드 서열에 혼성화되거나 및/또는 이를 증폭할 수 있는 유전자 프로브과 접촉될 수 있고, 이어서 정상 대조구에 비해 상승된 수준의 mRNA 또는 cDNA이 존재하는 것으로 평가될 수 있는 mRNA 또는 cDNA의 수준이 검출될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시형태는, 환자로부터 얻은 의심되는 암 세포 내의 Akt 키나제의 상대적 수준을 결정하기 위해 정량 또는 반-정량 진단 키트 내 Akt 키나제에 항체, 모노클로날 또는 폴리클로날을 사용하는 것을 숙고하며, 이는 어세이를 수행하기 위해 필요한 모든 시약을 포함할 수 있다. 일실시형태에서, ELISA 어세이를 수행하기 위해 필요한 시약 및 물질을 사용하는 키트가 제공된다. 시약에는 예를 들어 세척(washing) 완충액, 항체 희석 완충액, 차단(blockng) 완충액, 세포 염색 완충액, 현상 용액, 중단(stop) 용액, 항-포스포-단백질 특이 항체, 항-Pan 단백질 특이 항체, 2차 항체, 및 증류수가 포함될 수 있다. 키트는 또한 사용 설명서를 포함할 수 있고, 선택적으로 자동화 또는 반-자동화되거나, 자동화 기계 또는 소프트웨어에 적합한(compatible) 형태가 될 수 있다. 일실시형태에서, AKT(세린 474에서 인산화된 Akt)의 활성화된 형태를 검출하는 phosphor-ser-473 Akt 항체가 진단 키트 내에 항체로서 사용될 수 있다. 예를 들어 문헌(Yuan et al. (2000) "Frequent Activation of AKT2 and induction of apoptosis by inhibition of phosphinositide-3-OH kinase/Akt pathway in human ovarian cancer", Oncogene 19:2324-2330)을 참조한다.

Akt 키나제

PKB³라고도 하는 Akt는 세린/트레오닌 키나제의 아족(subfamily)이다. 이 아족 내에는 세 구성원, AKT1, AKT2 및 AKT3이 확인되었다. Akt는 PI3K-의존성 방식으로 세포외 자극에 의해 활성화된다(Datta, S.R., et al. Genes Dev. 13:2905-2927, 1999). Akt의 전체 활성화에는 활성화 루프 내 Thr³⁰⁸ 및 C-말단(terminal) 활성화 도메인 내 Ser⁴⁷³ 의 인산화가 요구된다. Akt는 PTEN 종양 억제자(suppressor)에 의해 불리하게(negatively) 조절된다. PTEN의 돌연변이가 다양한 종양에서 확인되었고, 이는 Akt 경로의 활성화를 유발한다(Datta, S.R., et al. Genes Dev. 13:2905-2927, 1999). 또한, Akt의 증폭, 과발현 및/또는 활성화가 다수의 인간 악성종양에서 검출되었다(Datta, S.R., et al. Genes Dev. 13:2905-2927, 1999, Cheng, J.Q., and Nicosia, S.V. AKT signal transduction pathway in oncogenesis. In Schwab D, editor. Encyclopedic Reference of Cancer. Berlin Heidelberg and New York: Springer; 2001. pp35-7). Akt, 특히 구조적 활성 Akt의 정규 장소 밖의 발현(Ectopic expression)은 세포 생존 및 악성 형질전환을 유도하는 반면, Akt 활성화의 저해는 많은 포유동물 세포들에서 세포자멸사를 자극한다(Datta, S.R., et al. Genes Dev. 13:2905-2927, 1999, Cheng, J.Q., and Nicosia, S.V. AKT signal transduction pathway in oncogenesis. In Schwab D, editor. Encyclopedic Reference of Cancer. Berlin Heidelberg and New York: Springer; 2001. pp35-7, Sun, M., et al. Am. J. Path., 159:431-437, 2001, Cheng, J.Q., et al. Oncogene, 14:2793-2801, 1997). 또한, Akt의 활성화는 종양 침습성 및 화학내성과 관련있는 것으로 보였다(West, K. A., et al. Drug Resist. Updat., 5: 234-248, 2002).

Akt 경로의 활성화는, 세포 생존, 성장, 이동 및 혈관형성을 유도함으로써 악성 형질전환 및 화학내성에 중추 역할을 한다. 본 발명은 Akt 키나제 과발현 및/또는 과활성화 및 인산화된 Akt 키나제 수준을 결정하기 위한 방법을 제공한다.

Akt 키나제는, Akt1, Akt2, 및 Akt3을 포함하되 이에 제한되지 않는 임의의 공지된 Akt족 키나제, 또는 이와 관련있는 키나제가 될 수 있다. mRNA 및 인간 Akt1, Akt2, 및 Akt3의 아미노산 서열은 도 6a-c, 7a-d 및 8a-c에 각각 도시된다.

진단 어세이

면역학적 어세이

일실시형태에서, 포유동물 또는 생물학적 시료로부터의 세포, 세포 추출물 또는 혈장 또는 다른 시료를 Akt 키나제 또는 이의 항원 일부분에 특이적인 면역상호작용 분자와 접촉시키고, 면역상호작용 분자-Akt 키나제 착체 형성의 수준에 대해 스크리닝하고, 정상 세포에 비해 착체가 상승 존재하는지를 결정함으로써, 포유동물의 세포 내 또는 포유동물로부터의 생물학적 시료 내 Akt 키나제의 비정상 발현을 검출하기 위한 방법이 제공된다.

면역상호작용 분자는 Akt 키나제 또는 이의 항원 일부 또는 이의 상동체(homologs) 또는 이의 유도체에 대한 특이성 및 결합 친화성을 갖는 분자가 될 수 있다. 일실시형태에서, 면역상호작용 분자는 면역글로불린 분자가 될 수 있다. 다른 실시형태에서, 면역상호작용 분자는 인간화된 항체 및 T-세포 관련 항원-결합 분자(TABMs)를 포함하는 항체 단편, 단일쇄 항체, 및/또는 탈면역화(deimmunized) 분자가 될 수 있다. 한 특정 실시형태에서, 항체는 모노클로날 항체가 될 수 있다. 다른 특정 실시형태에서, 항체는 폴리클로날 항체가 될 수 있다. 면역상호작용 분자는 Akt 키나제 또는 보다 특히 Akt 키나제 상의 항원 결정기(determinant) 또는 에피토프에 대한 특이성을 보일 수 있다. Akt 키나제 상의 항원 결정기 또는 에피토프는, 면역 반응이 지시되는 분자의 일부를 포함한다. 항원 결정기 또는 에피토프는 B-세포 에피토프 또는 적당하다면 T-세포 에피토프가 될 수 있다. 일 실시형태에서, 항체는 phosphor-ser-473 Akt 항체이다.

본 발명의 일실시형태에서, 포유동물 또는 대상으로부터의 생물학적 시료로부터의 세포 또는 세포 추출물을, Akt 키나제 또는 Akt 키나제 상의 항원 결정기 또는 에피토프에 대한 특이성을 갖는 Akt 키나제-결합 유효량의 항체와 접촉시키고, 이어서 정상 세포에 비해 상승된 수준의 상기 착체가 존재하는 것으로 결정되는 Akt 키나제-항체 착체의 수준을 정량적 또는 정성적으로 결정함으로써, 비정상 Akt 활성이 존재하는 포유동물 내 암 또는 암-유사 성장의 존재를 진단하는 방법이 제공된다.

당업자에게 공지된 임의의 다수의 방법으로 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 인간 Akt 키나제의 검출에 대해, 항체는 영장류, 가축(예를 들어 양, 소, 돼지, 염소, 말), 실험실 시험 동물(예를 들어 마우스, 래트, 기니아피그, 래빗) 및/또는 반려동물(예를 들어 개, 고양이)과 같은 비-인간 동물로부터 일반적으로 유래될 수 있으나 반드시는 아니다. 항체는 또한 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 재조합 생산될 수도 있다. 일반적으로, 항체에 근거한 어세이는 세포 또는 조직 생검 상에서 시험관 내 실시될 수 있다. 그러나, 항체가 적합하게 탈면역화되거나 인간 사용예의 경우에 인간화되면, 이어서 항체가 예를 들어 핵 태그(tag)로 표지되어 환자에게 투여되고, 핵 표지 축적 부위가 방사선 기술에 의해 결정될 수 있다. Akt 키나제 항체는 암 표적화 약제(targeting agent)가 될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또다른 실시형태는, 인간 및 비-인간 환자의 암 이미징에 사용하기 위한 항체의 탈면역화된 형태를 제공한다.

일반적으로, Akt 키나제에 대한 항체를 생성하기 위해, 효소가 인간 조직을 포함하는 동물로부터 유래하든지 또는 재조합 방법으로 생산되는 경우 세포 배양액으로부터 유래하든지 간에, 효소는 생물학적 시료로부터 추출되도록 요구된다. Akt 키나제는 임의의 적합한 방법에 의해 생물학적 시료로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 분리는 Akt 키나제 표면 전하 특성, 크기, 밀도, 생물학적 활성 및 또다른 실체(entity)에 대한 이의 친화도(예를 들어, 이것이 결합하거나 이와 달리 관련 있는 다른 단백질 또는 화학적 화합물) 중 임의의 하나 이상의 장점을 가질 수 있다. 따라서, 예를 들어, 초-원심분리(ultra-centrifugation), 이온-교환 크로마토그래피(예를 들어 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피), 전기영동(예를 들어 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전위 포커싱(isoelectric focussing)), 크기 분리(예를 들어 겔 여과, 한외여과) 및 친화도-매개 분리(예를 들어 다이나비드(Dynabead)(상표명) 분리와 같은 자석 비드 분리를 포함하되 이에 제한되지 않는 면역친화도 분리, 면역크로마토그래피, 면역-침전) 중 임의의 하나 이상에 의해, 생물학적 유체로부터의 Akt 키나제의 분리가 성취될 수 있다. 생물학적 유체로부터의 Akt 키나제의 분리는, 키나제 상에 존재하는 구조적(conformational) 에피토프를 보존할 수 있고, 따라서 효소의 변성을 유발하는 기술이 적절히 회피된다. 또다른 실시형태에서, 키나제는 친화도 분리, 겔 분리 및/또는 한외여과 중 임의의 하나 이상을 사용하여 생물학적 유체로부터 분리될 수 있다.

모노클로날 항체의 면역화 및 연이은 생산은 예를 들어 문헌{Kohler and Milstein(Kohler and Milstein, Nature 256:495-499, 1975; Kohler and Milstein, Eur.J. Immunol. 6(7): 511-519, 1976), Coligan et al. ("Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 1991-1997) 또는 Toyama et al. (Monoclonal Antibody, Experiment Manual", published by Kodansha Scientific, 1987)에 기재된 바와 같은 이 기술분야에서 공지된 표준 프로토콜을 사용하여 실시될 수 있다. 본질적으로, 동물은 항체-생산 세포, 특히 항체-생산 체세포(예를 들어 B 림프구)를 생산하기 위한 표준 방법에 의해 Akt 키나제-함유 생물학적 유체 또는 이의 분획 또는 Akt 키나제의 재조합 형태로 면역화된다. 이들 세포는 이어서 불멸화를 위해 면역화된 동물로부터 제거될 수 있다. 특정 실시형태에서, Akt 키나제의 단편이 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 단편은 담체와 관련될 수 있다. 담체는, 비면역원성 또는 열등하게 면역원성인 물질(예를 들어 햅텐(hapten))이 이의 면역원성을 증진시키기 위해 자연적으로 또는 인공적으로 결합되는 일반적으로 고분자량인 임의의 물질이 될 수 있다.

항체-생산 세포의 불멸화는 이 기술에서 주지된 방법을 사용하여 실시될 수 있다. 예를 들어 불멸화는 엡스테인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus)(EBV)를 사용하는 형질전환법(Kozbor et al., Methods in Enzymology 121: 140, 1986)으로 수행될 수 있다. 또다른 실시형태에서, 항체-생산 세포는 모노클로날 항체 생산에 널리 사용되는 세포 융합법(Coligan et al., 1991-1997에 기재)을 사용하여 불멸화된다. 이 방법에서, 항체를 생산하기 위해 잠재력을 갖는 항체-생산 체세포(somatic antibody-producing cells), 특히 B 세포가 골수종 세포주와 융합된다. 이들 체세포는 제 1의(primed) 동물, 바람직하게는 마우스 및 래트와 같은 설치류 동물의 림프절, 비장 및 말초혈액으로부터 유래할 수 있다. 특정 실시형태에서, 마우스 비장 세포가 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 래트, 래빗, 양 또는 염소 세포가 사용될 수도 있다. 하이브리도마-생산 융합 방법에 사용하기 위한 림프구 종양으로부터 특수화된(specialized) 골수종 세포주가 발생되었다(Kohler and Milstein 1976, 상기됨; Shulman et al., Nature 276:269-270, 1978; Volk et al., J. Virol. 42(1): 220-227, 1982). 예를 들어 P3.타임즈.63-Ag8(P3.times.63-Ag8), P3.타임즈.63-Ag8.653, P3/NS1-Ag4-1(NS-1), Sp2/0-Ag14 및 S194/5.XXO.Bu.1를 포함하는 융합된 세포 혼성물(hybrids)의 생산에 많은 골수종 세포주가 또한 사용될 수 있다. P3.타임즈.63-Ag8 및 NS-1 세포주는 문헌(Kohler and Milstein (1976, 상기됨)에 기재되었다. 슐만 등{Shulman et al.(1978, 상기됨)}은 Sp2/0-Ag14 골수종주를 발전시켰다. S194/5.XXO.Bu.1 주는 문헌(J.Exp.Med. 148(1): 313-323, 1978)에 보고되었다. 항체-생산 비장 또는 림프절 세포 및 골수종 세포의 혼성물을 생산하는 방법은 일반적으로, 세포막의 융합을 촉진하는 약제 또는 약제들(화학적, 바이러스적 또는 전기적)의 존재 하에 체세포를 골수종 세포와 10:1 비율(비율은 약 20:1 내지 약 1:1로 다양할 수 있다)로 각각 혼합하는 단계를 포함한다. 융합 방법은 알려져 있다(Kohler and Milstein, 1975, 상기됨; Kohler and Milstein, 1976, 상기됨; Gefter et al., Somatic cell Genet. 3: 231-236, 1977; Volk et al., 1982, 상기됨). 조사자에 의해 사용된 융합-촉진제는 센다이 바이러스(Sendai virus) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이었다. 특정 실시형태에서, 융합된 세포 혼성물을 남아있는 미융합 세포, 특히 미융합 골수종 세포로부터 선택하는 수단이 제공된다. 일반적으로, 하이브리도마의 성장을 유지하되 미융합된 골수종 세포의 성장을 막는 배지 내에 세포를 배양함으로써 융합된 세포 혼성물이 선택될 수 있으며, 이는 일반적으로 무한히 계속 분할될 것이다. 융합에 사용된 체세포는 시험관 내 배양액에서 장기간 생존능력을 유지하지 못하며, 따라서 문제를 일으키기 않는다. 융합된 세포 혼성물을 선택적으로 배양하기 위해 몇주가 요구된다. 원하는 항체를 생산하는 혼성물이 연이어 클로닝 및 증식(propagated)될 수 있도록, 이 기간 초기에 원하는 항체를 생산하는 혼성물을 확인할 필요가 있다. 약 1 내지 약 30 % 범위가 일반적이라고 할지라도, 일반적으로, 얻어진 혼성물의 약 10 %가 원하는 항체를 생산한다. 예를 들어 문헌(Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, pp 376-384, Plenum Press, New York, 1980)에 기재된 바와 같은 효소-결합 면역어세이 및 방사선면역어세이 기술을 포함하는 몇가지 표준 어세이 방법 중 임의의 하나에 의해, 및 FACS 분석(O'Reilly et al., Biotechniques 25: 824-830, 1998)에 의해 항체-생산 혼성물의 검출이 수행될 수 있다.

일단 원하는 융합된 세포 혼성물이 선택되고 개별 항체-생산 세포주 내에 클로닝되면, 각 세포주는 두 표준 방법 중 하나로 증식될 수 있다. 하이브리도마 세포의 현탁액은 조직적합성 동물 내에 주입될 수 있다. 주입된 동물은 이어서 융합된 세포 혼성물에 의해 생산된 특이적 모노클로날 항체를 분비하는 종양을 발달시킬 것이다. 모노클로날 항체를 고농도로 제공하기 위해 혈장 또는 복수 유체와 같은 동물의 체액이 태핑(tapped)될 수 있다. 선택적으로, 개별 세포주가 실험실 배양 용기 내에서 시험관 내 증식될 수 있다. 고농도의 단일 특이적 모노클로날 항체를 포함하는 배양 배지가 경사(decantation), 여과 또는 원심분리로 회수(harvested)된 후 정제될 수 있다.

이어서 세포주를 임의의 적당한 면역검출 수단에 의해 관심있는 Akt 키나제를 검출하기 위해 이의 특이성에 대해 시험할 수 있다. 예를 들어, 세포주는 다수의 웰 내에 분취 및 배양될 수 있으며, 각 웰로부터의 상등액은 효소-결합 면역흡착 어세이(ELISA), 간접 형광 항체 기술 등으로 어세이된다. 표적 LIM 키나제를 인식할 수 있되 비-표적 에피토프를 인식하지 못하는 모노클로날 항체를 생산하는 세포주(들)가 동정된 후, 종양을 형성하고 원하는 항체를 생산, 수집 및 정제하기 위해 시험관 내에서 직접 배양되거나 조직적합성 동물 내에 주입된다.

따라서, 본 발명은, 시료를 항체 또는 이의 단편 또는 유도체와 접촉시키는 단계, 및 상승된 수준의 Akt 키나제가 결정되는, 정상 대조구와 비교되는 항체 및 Akt 키나제 또는 이의 단편, 변형체 또는 유도체를 포함하는 착체의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, Akt 키나제, 또는 이의 단편, 변형체 또는 유도체를 시료 내에서 검출하는 방법을 제공한다. 착체의 형성을 결정하기 위한 임의의 적합한 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 이와 관련되는 리포터 분자를 갖는 본 발명에 따른 항체가 면역어세이에 사용될 수 있다. 이러한 면역어세이는 당업자에게 주지되어 있는 방사선면역어세이(RIAs), 효소-결합 면역흡착 어세이(ELISAs), 면역크로마토그래피 기술(ICTs), 및 웨스턴 블로팅을 포함하되 이에 제한되지 않는다. 면역어세이는 또한 경쟁(competitive) 어세이를 포함할 수도 있다. 본 발명은 정성 및 정량 면역어세이를 포함한다.

적합한 면역어세이 기술은 예를 들어 미국 특허 제 4,016,043호, 제 4,424,279호 및 제 4,018,653호에 기재되어 있다. 이들은 비-경쟁 형태의 단일-부위 및 두-부위 어세이 모두와, 전통적인 경쟁 결합 어세이를 포함한다. 이들 어세이는 또한 표적 항원에 대한 표지된 항원-결합 분자의 직접적인 결합을 포함한다.

본 발명은 또한 인간 암 환자 또는 암을 갖는 것으로 의심되는 개체와 같은 동물로부터 얻어진 세포 또는 조직 시료 내 Akt 단백질 발현 및 활성화 수준을 정량하기 위한 방법을 제공한다. 일실시형태에서, 본 발명은 이미징 시스템을 사용하여 Akt 단백질 발현 또는 활성화 수준을 정량적으로 정량하기 위한 방법을 제공한다. 이미징 시스템은, 이러한 동물로부터 세포 또는 조직 시료 내에서 발현된 AKT 단백질의 양 또는 활성화 수준을 결정하기 위해, AKT 단백질-특이 염색으로 염색된, 세포 또는 조직 시료의 이미지를 수용, 강화 및 처리하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법의 실시형태에서, 상이한 양의 AKT 단백질을 발현하는 둘 이상의 세포주에 대해 AKT1 및 AKT2 단백질 발현의 보정(calibration) 곡선이 만들어질 수 있다. 이어서 세포 또는 조직 시료 내에서 발현되는 AKT 단백질의 양을 정량적으로 결정하기 위해 보정 곡선이 사용될 수 있다. 활성화 피처(features)에 대해 특이적인 시약을 사용하여 활성화된 AKT 단백질에 대해 유사한 보정 곡선이 만들어질 수 있다. 이는 임상적인 암 치료의 전후의 AKT의 양 및 활성화 상태의 변화를 결정하기 위해 또한 사용될 수 있다.

본 발명의 방법의 한 특정 실시형태에서, 세포 또는 조직 시료 내의 AKT 단백질 발현은, 효소-결합 면역흡수 어세이(ELISA)를 사용하여 시료 내 AKT 단백질의 양을 결정하기 위해 정량화될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 미국 특허 공개 제 2002/0015974호에 기재된다.

다른 실시형태에서, Akt 키나제를 검출하기 위해 효소 면역어세이가 사용될 수 있다. 이러한 어세이에서, 일반적으로 글루타르알데하이드 및 페리오데이트(periodate)에 의해 효소가 제 2 항체에 접합된다. 특이 효소와 함께 사용되는 기질은 일반적으로, 대응하는 효소에 의한 가수분해시에, 검출가능한 색상 변화를 생산하기 위해 일반적으로 선택된다. 발색성 기질보다는 형광 산물을 생산하는 형광발생(fluorogenic) 기질을 사용하는 것도 가능하다. 효소-표지된 항체가 제 1 항체-항원 착체에 첨가되고, 결합된 후, 과량의 시약이 세척(washed off)될 수 있다. 이어서 적당한 기질을 포함하는 용액이 항체-항원-항체의 착체에 첨가될 수 있다. 기질은 정성적인 시각(visual) 신호를 생산하면서(이는 일반적으로 분광광도법으로 추가적으로 정량될 수 있다) 제 2 항체에 결합된 효소와 반응하여, 시료 내에 존재한 항원의 양을 나타낼 수 있다. 선택적으로, 플루오레세인(fluorescein), 로다민 및 란타나이드, 유로피움(EU)과 같은 형광 화합물이 항체의 결합 능력을 바꾸지 않으면서 항체에 화학적으로 결합될 수 있다. 특정 파장의 광으로 조명함으로써 활성화되는 경우에, 형광색소-표지된 항체는 빛에너지를 흡수하여, 분자의 여기 상태를 유도한 후, 광현미경으로 시각적으로 검출가능한 특징적인 색의 빛을 방출한다. 형광-표지된 항체는 제 1 항체-항원 착체에 결합될 수 있다. 미결합 시약을 세척해낸 후, 남은 3차 착체(tertiary complex)를 적당한 파장의 빛에 노출시킨다. 관찰된 형광은 관심있는 항원이 존재하는 것을 나타낸다. 면역형광어세이(immunofluorometric assays)(IFMA)도 이 기술분야에서 확립되어 있으며, 본 방법에 특히 유용하다. 그러나, 방사성동위원소, 화학발광 또는 생물발광 분자가 사용될 수도 있다.

특정 실시형태에서, Akt 키나제에 대한 항체가 또한 특히 혈장 또는 다른 순환 유체에서 Akt 키나제의 ELISA-매개 검출에 사용될 수도 있다. 이는, 항-Akt 키나제 항체를 고체 지지체에 고정하고, 이들을 혈장과 같은 생물학적 추출물, 혈액, 림프 또는 다른 체액, 세포 추출물 또는 세포생검과 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 이어서 표지된 항-Akt 키나제 항체는 고정된 Akt 키나제를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이 어세이는 임의의 수의 방법으로 변화시킬 수 있으며, 모든 변형법은 본 발명에 포함되고 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 접근법은 예를 들어 혈장에 근거한 어세이를 사용하여 Akt 키나제 수준의 신속한 검출 및 정량을 가능하게 할 수 있다.

일실시형태에서, Akt Elisa 어세이 키트가 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 슈퍼어레이 바이오사이언스(SuperArray Bioscience) 제 Akt S473에 대한 신호 ELISA 키트의 세포 활성화(Cellular Activation of Signaling ELISA kit)가 본 발명에 이용될 수 있다. 일실시형태에서, 항체는 Akt S473을 인식하는 항-pan 항체가 될 수 있다. Elisa 어세이 키트는 항-Akt 항체, 및 세척 완충액, 항체 희석 완충액, 차단(blocking) 완충액, 세포 염색 용액, 현상 용액, 중단(stop) 용액, 2차 항체 및 증류수를 포함하되 이에 제한되지 않는 추가적인 시약을 포함한다.

뉴클레오티드 검출

또다른 실시형태에서, Akt 키나제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 발현 수준을 검출함으로써 Akt 키나제를 검출하는 방법이 제공된다. 폴리뉴클레오티드의 발현은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 일실시형태에서, Akt 키나제를 암호화하는 표지된 폴리뉴클레오티드는, 세포로부터 얻어진 RNA 추출물의 노던 블롯(Northern blot)의 프로브로서 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 동물로부터의 핵산 추출물이, RT PCR과 같은 핵산 증폭 반응에서, 키나제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 서열, 또는 이의 플랭킹(flanking) 서열에 대응하는 올리고뉴클레오티드 프라이머(primers)와 함께(in concert with) 사용될 수 있다. 문헌(Fodor et al., Science 251:767-777, 1991 및 Kazal et al., Nature Medicine 2: 753-759, 1996)에 기재된 바와 같이, 다양한 자동화된 고체-상 검출 기술이 또한 당업자에게 이용가능하다.

다른 실시형태에서, RNA 전사물을 암호화하는 akt 키나제를 검출하는 방법이 제공된다. Akt 키나제 RNA를 포함하는 것으로 의심되는 세포 시료로부터 RNA가 분리될 수 있다, 예를 들어 전체 RNA가 인간 암 조직으로부터 분리될 수 있다. RNA는 예를 들어 TRIZOL 시약(GIBCO-BRL/Life Technologies, Gaithersburg, Md.)을 사용하여 이 기술에서 공지된 방법으로 분리될 수 있다. 올리고-dT(Oligo-dT), 또는 무작위-서열 올리고뉴클레오티드, 및 서열-특이적 올리고뉴클레오티드가, 분리된 RNA로부터의 제 1-가닥 cDNAs를 제조하기 위한 역 전사효소 반응의 프라이머로서 사용될 수 있다. 이어서, 얻어지는 제 1-가닥 cDNAs는 증폭된 생성물을 얻기 위해 PCR 반응에서 서열-특이적 올리고뉴클레오티드로 증폭될 수 있다.

폴리머라제 연쇄 반응 또는 "PCR"은 핵산, RNA 및/또는 DNA의 미리선택된 단편의 양이 예를 들어 미국 특허 제 4,683,195호에 기재된 바와 같이 증폭되는 절차 또는 기술을 나타낸다. 일반적으로, 관심 있거나 이를 넘어서는 영역의 말단으로부터의 서열 정보가 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계하기 위해 사용된다. 이들 프라이머는 증폭되는 템플릿(template)의 반대 가닥에 동일하거나 유사한 서열이 될 것이다. PCR은 특정 RNA 서열 및 전체 세포 RNA로부터 전사된 cDNA를 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로 문헌(Quant. Biol. 51: 263, 1987; Erlich, eds., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989)을 참조한다. 따라서, PCR에 의한 특정 핵산 서열의 증폭은, 보존된 서열이 관련 유전자 또는 단백질 서열의 정렬, 예를 들어 포유동물 Akt 키나제 유전자의 서열 유사물로부터 유래되는, 보존된 뉴클레오티드 서열을 갖는 "프라이머" 또는 올리고뉴클레오티드에 따라 결정된다. 예를 들어, 안티센스 가닥에 어닐링되도록 예측되는 하나의 프라이머가 제조되고, Akt 키나제를 암호화하는 cDNA의 센스 가닥에 어닐링되도록 예측되는 다른 프라이머가 제조된다. 증폭된 생성물을 검출하기 위해, 반응 혼합물은 일반적으로 아가로즈 겔 전기영동 또는 다른 편리한 분리 기술에 도입되고, Akt 키나제 특이적인 증폭된 DNA의 상대적인 존재가 검출된다. 예를 들어, 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브와의 서던(Southern) 혼성화를 사용하거나 공지된 분자량의 DNA 표준물과 이의 전기영동 이동성을 비교하여 Akt 키나제 증폭된 DNA를 검출할 수 있다. 겔로부터 단편을 절제하거나 용리하고(예를 들어 참조문헌(Lawn et al., Necleic Acids Res. 2:6103, 1981; Goeddel et al., Nucleic acids Res. 8:4057-1980)을 참조), pCRII 벡터(인비트로젠)와 같은 적합한 벡터의 클로닝 부위에 증폭된 생성물을 클로닝하고, 클로닝된 인서트(insert)를 시퀀싱하고, DNA 서열을 LIM 키나제의 공지된 서열과 비교함으로써 증폭된 Akt 키나제 DNA의 분리, 정제 및 특징화가 수행될 수 있다. 이어서 상대량의 LIM 키나제 mRNA 및 cDNA를 결정할 수 있다.

일실시형태에서, 실시간 PCR이 Akt 뉴클레오티드의 전사 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 전사 활성의 결정은 또한 이용가능한 mRNA 전사물에 근거한 잠재적 번역 활성의 측정을 포함한다. 실시간 PCR 및 다른 PCR 절차는, DNA 결합 플루오로포어(fluorophores), 5' 엔도뉴클레아제, 인접한 라이너(liner) 및 헤어핀 올리고프로브 및 자가-형광 암플리콘(amplicons)의 결합을 포함하는 PCR 생성물의 검출을 위해 다수의 화학작용(chemistries)을 이용한다. 이들 화학작용 및 실시간 PCR은 일반적으로 예를 들어 문헌(Mackay et al., Nucleic Acids Res 30(6): 1292-1305, 2002; Walker, J. Biochem. Mol. Toxicology 15(3):121-127, 2001; Lewis et al., J. Pathol. 195: 66-71, 2001)에 논의된다.

대체 실시형태에서, 생물학적 시료로부터 분리된 뉴클레오티드 서열을, 도 6a-c, 7a-c 또는 8a-c, 또는 이의 단편의 뉴클레오티드 서열부터 선택된 Akt 서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉시키고, 이어서 상기 프로브를 상기 서열에 혼성화함으로써 상기 서열을 검출하고, 그 결과를 정상 시료와 비교함으로써 Akt의 비정상 발현이 확인될 수 있다. 생물학적 시료에 대한 프로브의 혼성화는 임의의 검출가능한 약제를 사용하여 프로브를 표지함으로써 검출될 수 있다. 프로브는 예를 들어 방사성동위원소, 또는 항체가 이용할 수 있는 비오틴, 형광 염료, 전자-밀집 시약(electron-dense reagent), 효소, 햅텐 또는 단백질로 표지될 수 있다. 검출가능한 표지는, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 방사성표지, 또는 화학적 수단을 포함하는 임의의 원하는 수단에 의해 어세이될 수 있다. 프로브는 또한 올리고머 제한 기술, 도트 블롯 어세이, 역 도트 블롯 어세이, 라인 프로브 어세이, 및 5' 뉴클레아제 어세이과 같은 기술을 사용하여 검출될 수 있다. 선택적으로, 프로브는 마크로어레이(macroarray), 마이크로어레이 및 DNA 마이크로칩 기술을 포함하는 임의의 일반적으로 이용가능한 DNA 어세이 기술을 사용하여 검출될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 일반적으로, 도 6a-c, 7a-d 및 8a-c로부터 선택된 뉴클레오티드 또는 이의 단편에 혼성화하는 약 14, 15, 16, 18, 20, 25 또는 28 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 약 25 또는 28 뉴클레오티드보다 길이가 긴 프로브를 사용하는 것은 일반적으로 바람직하지 않다. Akt 뉴클레오티드 서열을 확인하기 위해 올리고뉴클레오티드 프로브가 설계된다.

키나제 어세이

이 기술에 공지된 임의의 적합한 키나제 어세이를 사용하여 Akt 키나제의 활성이 측정될 수 있다. 제한하기 위해서가 아니라 예를 들어, 문헌(Hogg et al., Oncogene 1994 9:98-96; Mills et al., J. Biol. Chem. 1992 267: 16000-006; 및 Tomizawa et al 2001, FEBS Lett. 2001 492:221-7; Schmandt et al., J. Immunol. 1994, 152:96-105)에 기재된 방법이 사용될 수 있다. 또한 세린, 트레오닌 및 티로신 키나제 어세이가 문헌(Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 1999, unit 17.6)에 기재되어 있다.

Akt 키나제 어세이는 일반적으로 Akt 폴리펩티드, 표지된 공여체 기질, 및 Akt에 대해 특이적이거나 비-특이적인 수용체 기질을 사용할 수 있다. 이러한 어세이에서, Akt는 공여체 기질로부터 수용체 기질로 표지된 잔기를 이동시키고, 키나제 활성은 공여체 기질로부터 수용체 기질로 이동시킨 표지된 잔기의 양에 의해 측정된다. Akt 폴리펩티드는 다양한 발현 시스템을 사용하여 생산될 수 있고, 세포로부터 정제될 수 있고, 쪼개지거나(cleaved) 쪼개지지 않은 재조합 융합 단백질의 형태가 될 수 있으며, 및/또는 비-Akt 폴리펩티드 서열, 예를 들어 His 태그(tag) 또는 .베타.-갈락토시다제(.beta.-galactosidase)를 이의 N-- 또는 C-말단에 가질 수 있다. 암세포주가 어세이되는 Akt의 공급원으로서 사용되는 경우에 Akt 활성은 암세포주에서 어세이될 수 있다. Akt 어세이에 적합한 공여체 기질은, 예를 들어 .감마.-표지된 ATP 및 ATP 유사체를 포함하는 것과 같은, Akt에 의한 탈인산화에 영향받기 쉬운 임의의 분자를 포함하며, 표지는 ³³P, ³²P, ³⁵S 또는 임의의 방사선활성 동위원소 또는 적합한 형광 마커이다. Akt 어세이에 적합한 수혜(recipient) 기질은, Akt에 의한 인산화에 영향받기 쉬운 임의의 폴리펩티드 또는 다른 분자를 포함한다. 수혜 기질은 Akt의 생체내 표적의 단편으로부터 유래될 수 있다. 수혜 기질 단편은 8 내지 50 아미노산 길이, 일반적으로 10 내지 30 아미노산 및 특히 약 10, 12, 15, 18, 20 및 25 아미노산 길이가 될 수 있다. 추가적인 수혜 기질은 한 세트의 상이한 폴리펩티드 또는 다른 분자를 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 반응이 일단 수행되었으면, TTK에 대한 수혜 기질의 표적은 반응의 다른 성분으로부터 정제될 수 있다. 이러한 정제는 일반적으로 분자 상호작용을 통해 일어나는데, 수혜 기질이 스트렙타비딘과 이의 상호작용을 통해 비오티닐화 및 정제되거나, 수혜 기질을 특이적으로 인식할 수 있는 특이적 항체가 이용가능하다. 반응은 고체 지지체 상, 겔 내, 용액 내 또는 살아있는 세포 내와 같은 다양한 조건에서 수행될 수 있다. 검출 방법의 선택은 공여체 분자에 사용된 표지의 형태에 좌우되며, 예를 들어 방사능사진촬영(autoradiography), 신틸레이션(scintillation), 스캐닝 또는 x선형광촬영(fluorography)의한 통합된(incorporated) 방사선 또는 형광의 측정을 포함할 수 있다.

IV. 치료 방법

본 명세서에 제공된 화합물 및 약제학적 조성물은 비정상 세포 증식과 관련된 종양, 암 및 다른 장애를 포함하는 이상(condition)의 치료에 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 암종, 육종, 림프종, 백혈병 및/또는 골수종을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 고형 종양을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물은, 다음의 장기 또는 조직의 암과 같되 이에 제한되지 않는 암의 치료에 사용될 수 있다: 유방(breast), 전립선, 폐, 기관지, 결장, 비뇨기, 방광, 비-호지킨 림프종, 흑색종, 신장(kidney), 신장부(renal), 췌장, 인두(pharnx), 갑상선, 위, 뇌, 다발성 골수종, 식도, 간, 간내담도(intrahepatic bile duct), 경부, 후두, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 연부조직(soft tissue), 예를 들어 심장, 호지킨 림프종, 정소, 소장, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 항문, 항문관, 항문직장(anorectal), 갑상선, 음문, 담낭, 늑막, 눈, 코 비강, 중이, 비인강(nasopharnx), 수뇨관, 복막, 장막, 장간막, 및 위장, 고급 신경교종, 교아세포종, 결장, 직장, 췌장, 위 암, 간세포 암종; 두부(head) 및 경부(neck) 암, 암종; 신장 세포 암종; 선암; 육종; 혈관내피종; 림프종; 백혈병, 균상식육종. 추가적인 실시형태에서, 본 발명의 화합물은, 악성 질환 혈관육종, 혈관내피종, 기저세포암, 편평상피 세포 암종(squamous cell carcinoma), 악성 흑색종 및 카포지 육종, 및 비-악성 질환 또는 이상, 예를 들어 건선, 림프관형성(lymphangiogenesis), 어린이의 혈관종, 스터지-베버 증후군(Sturge-Weber syndrome), 심상성 사마귀, 신경섬유종증, 결절성 경화증, 화농성 육아종, 열성 영양장애 수포 표피박리증, 정맥 궤양, 좌창(acne), 주사비(rosacea), 습진, 전염성 연속종, 지루성 각화증, 및 광선 각화증을 포함하되 이에 제한되지 않는 피부 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 암의 발견으로부터 심한 단계까지의 어떤 단계에서 이들 암 및 다른 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 1차(primary) 암 및 이의 전이의 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 화합물은 하기 표 2a-2f에 기재된 암을 포함하되 이에 제한되지 않는 암의 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 추가적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 화합물은 혈관형성-관련 질환의 치료에 사용될 수 있다.

혈관성형 소분자(small molecule)는, NFkB를 저해함으로써 부분적으로 작용하는 탈리도마이드, 미세소관(microtubule) 활성화 및 저산소증 유도인자(HIF1a) 활성화에 영향을 주는 2-메톡시에스트라디올, 사이클로-옥시게나제 2(COX2) 저해제, 및 사이클로포스파미드, 탁산(taxanes) 및 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴)을 포함하는 저용량의 통상적인 화학치료제를 포함한다(D'Amato, R.J. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 91, 3964-3968, D'Amato, R.J. et al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 91, 4082-4085). 또한, 특정 티로신 키나제 저해제는, 종양 및 기질(stromal) 세포에 의한 VEGF 및 전혈관형성(proangiogenic) 인자의 생산을 감소시킴으로써 혈관형성을 간접적으로 감소시킨다. 이들 약물은 허셉틴(Herceptin), 이마티닙(imatinib)(Glivec), 및 이레사를 포함한다(Bergers, G. et al. (2003) Journal of Clinical Investigation 111, 1287-1295, Ciardiello, F. et al. (2001) Clinical Cancer Research 7, 1459-1465, Plum, S.M. et al. (2003) Clinical Cancer Research 9, 4619-4626).

최근, 혈관형성 저해제가 동물 모델로부터 인간 환자에게 이동되었다. 혈관형성 저해제는 다양한 암의 유망한 치료를 나타낸다. 최근, 아바스틴, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 대한 고친화도 항체가, 심한 신장 세포 암종에서 단일 약제로서 수명을 연장시키고, 심한 결장 암에서 화학요법과 조합하여 수명을 연장시키는 것으로 나타났다((Yang, J.C. et al. (2003) New England Journal of Medicine, 349, 427-434, Kabbinavar, F. et al. (2003) Journal of Clinical Oncology 21, 60-65)).

혈관형성-관련 질환은 염증성, 자가면역성, 전염성 질환; 예를 들어 고형 종양, 백혈병과 같은 혈액 생성(blood born) 종양, 및 종양 전이를 포함하는 혈관형성-의존성 암; 양성 종양, 예를 들어 혈관종, 청신경종, 신경섬유종, 트라코마 및 화농성 육아종; 류마티즘성 관절염; 건선; 습진; 눈 혈관형성 질환, 예를 들어 당뇨성 망막증, 조숙의 망막증, 황반변성(macular degeneration), 각막 이식 거부, 신생혈관성 녹내장, 후수정체 섬유증식증, 홍색증(rubeosis); 오슬러-베버 증후군(Osler-Webber Syndrome); 심근 혈관형성; 플라크 신생혈관증식(plaque neovascularization); 모세관 혈관확장(telangiectasia); 혈우병 조인트(hemophiliac joints); 혈관섬유종; 및 상처 육아형성(wound granulation)을 포함하되 이에 제한되지 않는다. 추가적으로, 본 발명의 조성물은 장관유착증(intestinal adhesions), 아테롬성동맥경화증, 경피증(scleroderma), 사마귀, 및 비후성 반흔(hypertrophic scars)(즉 켈로이드)과 같되 이에 제한되지 않는 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한, 묘소병(Rochele minalia quintosa), 궤양(헬리코박터 필로리), 결핵 및 나병과 같은 병리학적 예후로서 혈관형성을 갖는 질환의 치료에 사용될 수도 있다.

약물 내성 종양 또는 암

본 발명은, 본 명세서에 개시된 암 및 약물의 실시형태를 포함하는, 약물 내성 암을 치료하기 위해 사용될 수 있는 화합물을 제공한다. 일실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 TCN, TCN-P 또는 관련 화합물과 같은 화합물은 제 2 약물과 공동-투여될 수 있다.

다중약물 내성(MDR)이 인간 암에서 발생하며, 화학요법의 성공에 큰 장애가 될 수 있다. 다중약물 내성은, 한 세포독성제(cytotoxic agent)에 노출된 시험관 내 종양 세포가 구조적으로 및 기능적으로 관련없는 화합물의 범위까지 교차-내성을 발전시키는 현상이다. 또한, MDR은, 화학요법제에 미리 노출되지 않은 일부 종양에서 본질적으로 발생할 수 있다. 따라서, 일실시형태에서, 본 발명은, 본 명세서에 개시된 바와 같은 TCN, TCN-P 또는 관련 화합물을 투여함으로써 약물 내성 암, 예를 들어 다중약물 내성 암을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 탁솔, 라파마이신, 타목시펜, 시스플라틴(cisplatin) 및/또는 제피티닙(gefitinib)(이레사(iressa))에 내성인 암을 치료하기 위해 TCN, TCN-P 및 관련 화합물이 사용될 수 있다.

일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 TCN, TCN-P 또는 관련 화합물은, 본 명세서에 기재되거나 이 기술분야에서 공지된 결장, 뼈, 신장, 부신, 췌장, 간 및/또는 임의의 다른 암의 약물 내성 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

조합 치료

본 발명의 한 측면에서, 본 명세서에 개시된 화합물 및 조성물은 하나 이상의 추가적인 화학요법제와 조합될 수 있다. 추가적인 약제는 본 명세서에 개시된 화합물과 조합하거나 이로 변경되어 투여될 수 있다. 약물은 동일 조성물의 일부를 형성할 수 있거나, 동시 또는 상이한 때에 투여하기 위한 개별 조성물로서 제공될 수 있다.

일실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은, 이들의 효과를 증진시키기 위해 항혈관형성제(antiangiogenic agents)와 조합될 수 있거나, 다른 항혈관형성제와 결합되고 다른 세포독성제와 함께 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 고형 종양의 치료에 사용되는 경우, 화합물 및 조성물은 IL-12, 레티노이드, 인터페론, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 탈리도마이드, 트롬보스폰딘-1(thrombospondin-1), 트롬보스폰딘-2, 캡토프릴(captopryl), 알파 인터페론과 같은 항-종양제, COMP(사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 메토트렉세이트 및 프레드니손), 에토포사이드, mBACOD(메토르트렉세이트(methortrexate), 블레오마이신, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴 및 덱사메타손), PRO-MACE/MOPP(프레드니손, 메토트렉세이트(w/류코빈 구제(rescue)), 독소루비신, 사이클로포스파미드, 탁솔, 에토포사이드/메클로레타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카르바진), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 안지오인히빈스(angioinhibins), TNP-470, 펜토산 폴리술페이트, 혈소판 인자 4, 안지오스타틴, LM-609, SU-101, CM-101, 테크갈란(Techgalan), 탈리도마이드, SP-PG 및 방사선으로부터 선택되고 이에 제한되지 않는 약제와 함께 투여될 수 있다. 추가 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물 및 조성물은 예를 들어, 탁산 약물(탁솔, 파클리탁셀, 탁소텔(taxotere), 도세탁셀), 포도필로톡신 또는 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴)와 같은 미소체 조절인자(microtubule modulators)를 포함하는, 세포골격(cytoskeletal) 요소를 표적화하는 약물과 같은, 세포분열저지(antimitotic) 효과를 갖는 약물; 항대사 약물(예를 들어 5-플루오로우라실, 시타라빈, 젬시타빈(gemcitabine), 펜토스타틴과 같은 퓨린 유사체, 메토트렉세이트); 알킬화제 또는 질소 머스타드(예를 들어 니트로소우레아, 사이클로포스파미드 또는 이포스파미드(ifosphamide)); 안트라사이클린 약물 아드리아마이신, 독소루비신, 파르모루비신(pharmorubicin) 또는 에피루비신과 같은 DNA를 표적화하는 약물; 에토포사이드와 같은 토포아이소머라제를 표적화하는 약물; 호르몬 및 호르몬 작동제 또는 길항제, 예를 들어 에스트로겐, 안티에스트로겐(타목시펜 및 관련 화합물) 및 안드로겐, 플루타미드, 류프로렐린(leuprorelin), 고세렐린, 시프로트론(cyprotrone) 또는 옥트레오티드; 헤르셉틴(herceptin)과 같은 항체 유도체를 포함하는 종양 세포 내 신호 전달(transduction)을 표적화하는 약물; 플라티늄 약물(시스-플라틴, 카본플라틴, 옥살리플라틴, 파라플라틴)또는 니트로소우레아와 같은 알킬화 약물; 매트릭스 메탈로프로테이나제 저해제와 같은 종양의 전이에 잠재적으로 영향을 주는 약물; 유전자 치료 및 안티센스 약제; 항체 치료제; 해양 기원의 다른 생물활성 화합물, 특히 아플리딘과 같은 디뎀닌(didemnins); 스테로이드 유사체, 특히 덱사메타손; 비스테로이드성 약제(예를 들어 아세트아미노펜 또는 이부프로펜) 또는 스테로이드제 및 이들의 유도체, 특히 덱사메타손을 포함하는 항-염증 약물; 5HT-3 저해제(예를 들어 그라미세트론(gramisetron) 또는 온다세트론(ondasetron)), 및 스테로이드 및 이들의 유도체, 특히 덱사메타손을 포함하는 항-구토 약물과 조합하거나 이로 변경하여 투여될 수 있다. 추가 실시형태에서, 화합물 및 조성물은 이하 표 3a-3e에 개시된 화학요법제와 조합하거나 이로 변경하여 사용될 수 있다.

특정 실시형태에서, 인터페론(IFNs)은 본 발명의 화합물과 조합하여 사용될 수 있다. 적합한 인터페론에는: 인터페론 α-2a, 인터페론 α-2b, 인터페론 α-2a 및 인터페론 α-2b를 포함하는 페길레이티드(pegylated) 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, 인터페론 τ, 인터페론 ω, 인터뮨(InterMune) 제 INTERGEN(인터페론 알파콘-1(alphacon-1)), 바이라젠(Viragen) 제 OMNIFERON(천연 인터페론), 휴먼 게놈 사이언스 제 ALBUFERON, 아레스-세로노 제 REBIF(인터페론 베타-1a), 바이오메디신 제 ω 인터페론(Omega Interferon), 아마릴로 바이오사이언스 제 경구 인터페론 α, 및 인터뮨 제 인터페론 γ, 인터페론 τ, 및/또는 인터페론 γ- 1b가 포함된다.

일실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 TCN, TCN-P 또는 관련 화합물이, 약물 내성 암, 예를 들어 다중 약물 내성 암의 치료에, 본 명세서 또는 표 3에 기재된 것과 같은 추가적인 화학요법제와 조합하거나 이로 변경하여 사용될 수 있다. 약물 내성 암은 이 기술분야에서 공지되거나 본 명세서에 기재된 결장, 뼈, 신장, 부신, 췌장, 간의 암 및/또는 임의의 다른 암을 포함할 수 있다. 일실시형태에서, 부가적인 화학요법제는 P-당단백질 저해제가 될 수 있다. 특정한 비-제한적 실시형태에서, P-당단백질 저해제는 다음 약물로부터 선택될 수 있다: 베라파밀(verapamil), 사이클로스포린(예를 들어 사이클로스포린 A), 타목시펜, 칼모듈린(calmodulin) 길항제, 덱스베라파밀(dexverapamil), 덱스니굴디핀(dexniguldipine), 발스포다르(valspodar)(PSC 833), 비리코다르(VX-710), 타리퀴다르(tariquidar)(XR9576), 조수퀴다르(LY335979), 라니퀴다르(R101933) 및/또는 ONT-093.

V. 약제학적 조성물

본 명세서에 제공된 화합물을 투여하기 적합한 약제학적 담체에는 특정 투여 모드에 적합한 당업자에게 공지된 임의의 담체를 포함한다. 화합물은 조성물 내에서 단독의 약제학적으로 활성인 성분으로서 조성될 수 있거나 다른 활성 성분과 함께 조합될 수 있다.

본 명세서에 개시된 화합물을 포함하는 조성물은 경구, 직장, 비강, 국부(구강 및 설하 포함), 질 또는 비경구(피하, 근내, 피하, 정맥내, 피내, 안내, 조내(intracisternal), 복강내, 및 경막외) 투여에 적합할 수 있다.

조성물은 편리하게는 단위 투여 형태로 만들어질 수 있으며, 통상적인 약제학적 기술로 제조될 수 있다. 이러한 기술은 본 발명의 하나 이상의 조성물 및 하나 이상의 약제학적 담체 또는 부형제를 조합(association)하는 단계를 포함한다.

화합물은 경구 투여를 위한 액제, 현탁액제, 정제, 분산성 정제, 환제, 캅셀제, 산제, 지속 방출 조성물 또는 엘릭시르(elixirs), 비경구 투여를 위한 멸균 액제 또는 현탁액제와, 경피 패치 제제 및 건조 분말 흡입제(inhalers)와 같은 적합한 약제학적 제제로 조성될 수 있다. 일실시형태에서, 상기 화합물들은 이 기술분야에서 주지된 기술 및 방법을 사용하여 약제학적 조성물로 조성된다(예를 들어 문헌(Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition 1985, 126)참조).

조성물에서, 유효 농도의 하나 이상의 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 이의 유도체를 하나 이상의 적합한 약제학적 담체와 혼합시킬 수 있다. 화합물은 대응하는 염, 에스테르, 엔올 에테르 또는 에스테르, 아세탈, 케탈, 오르도에스테르, 헤미아세탈, 헤미케탈, 산, 염기, 용매화물, 수화물 또는 프로드러그로서 조성 전에 유도체화될 수 있다. 조성물 내의 화합물의 농도는, 투여 시에, 표적 질환 또는 장애의 증상 중 하나 이상을 치료, 예방 또는 개선시키는 양을 전달하기에 효과적이다. 일실시형태에서, 조성물은 단일 용량(single dosage) 투여를 위해 조성된다. 조성물을 조성하기 위해, 화합물의 중량 분획이, 치료된 이상(condition)이 경감, 방지되거나 하나 이상의 증상이 개선되는 유효 농도로 선택된 담체 내에 용해, 현탁, 분산 또는 이와 달리 혼합된다.

경구 투여에 적합한 조성물은, 각각 미리 정해진 양의 하나 이상의 조성물을 포함하는 정제, 캐플릿, 환제 또는 당의정 캅셀, 또는 카세제와 같되 이에 제한되지 않는 구체적인 단위로서; 분말 또는 과립으로서; 수용액 또는 비-수용액 내 액제 또는 현탁액으로서; 또는 오일-인-워터(oil-in-water) 액체 에멀젼 또는 워터-인-오일 에멀젼으로서 또는 볼루스 등으로서 만들어질 수 있다.

액체 약제학적으로 투여가능한 조성물은, 예를 들어 상기 정의된 바와 같은 활성 화합물 및 선택적인 약제학적 보조제(adjuvants)를 예를 들어 물, 염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 글리콜, 에탄올 등과 같은 담체 내에 용해, 분산 또는 이와 달리 혼합시켜 이를 통해 액제 또는 현탁액을 형성함으로써 제조될 수 있다. 필요시, 투여되는 약제학적 조성물은 또한, 습윤제, 유화제, 가용화제, pH 완충제, 방부제, 향미제 등과 같은 소량의 비독성 보조 물질, 예를 들어 아세테이트, 나트륨 시트레이트, 사이클로덱스트린 유도체, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 나트륨 아세테이트, 트리에탄올아민 올레이트, 및 다른 이러한 약제를 포함할 수 있다. 이러한 용량 형태를 제조하는 방법은 당업자에게 공지되거나 명백할 것이다; 예를 들어 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 15th Edition, 1975) 참조.

입 안에 국부 투여하기에 적합한 본 발명의 조성물에는 예를 들어, 향미가 나는 성분(flavored basis), 일반적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트 내에 구성성분을 갖는 마름모꼴 정제(lozenges); 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아와 같은 불활성 성분 내에 하나 이상의 본 발명의 조성물을 갖는 향정(pastilles); 및 적합한 액체 담체 내에 포함되는(administered) 하나 이상의 본 발명의 조성물을 갖는 구강세척액(mouthwashes)을 포함한다.

정제, 환제, 캅셀제, 트로키제 등은, 결합제; 윤활제(lubricant); 희석제; 글리던트(glidant); 붕괴제(disintegrating agent); 착색제(coloring agent); 향미제; 습윤제; 구토 코팅(emetic coating); 및 필름 코팅인 구성성분, 또는 유사한 성질의 화합물 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 결합제의 예로는 미소결정질 셀룰로스, 트라가칸트 고무, 글루코스 용액, 아카시아 점액, 젤라틴 용액, 당밀, 포리비닐피롤리딘, 포비돈, 크로스포비돈, 수크로스 및 전분 페이스트가 포함된다. 윤활제는 탈크, 전분, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트, 리코포듐(lycopodium) 및 스테아르산을 포함한다. 희석제는 예를 들어 락토스, 수크로스, 전분, 카올린, 염, 만니톨 및 디칼슘 포스페이트를 포함한다. 글리던트는 콜로이드성 실리콘 디옥사이드를 포함하되 이에 제한되지 않는다. 붕괴제는 크로스카르멜로스(crosscarmellose) 나트륨, 나트륨 전분 글리콜레이트, 알긴산, 옥수수 전분, 감자 전분, 벤토나이트, 메틸셀룰로스, 아가 및 카르복시메틸셀룰로스를 포함한다. 착색제는 예를 들어 임의의 승인 보증된 수용성 FD 및 C 염료, 이의 혼합물; 및 알루미나 수화물에 현탁된 수 불용성 FD 및 C 염료를 포함한다. 감미제는 수크로스, 락토스, 만니톨 및 사카린과 같은 인공 감미제, 및 임의의 수의 분무 건조된 향미제를 포함한다. 향미제는 과일과 같은 식물로부터 추출된 천연 향미제 및 페퍼민트 및 메틸 살리실레이트와 같되 이에 제한되지 않는 좋은 느낌을 주는 화합물들의 합성 블렌드를 포함한다. 습윤제는 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올레이트, 디에틸렌 글리콜 모노라우레이트 및 폴리옥시에틸렌 라우랄 에테르(polyoxyethylene laural ether)를 포함한다. 구토-코팅은 지방산, 지방, 왁스, 셀락, 암모니아화 셀락 및 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트를 포함한다. 필름 코팅은 하이드록시에틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜 4000 및 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트를 포함한다.

피부에 대한 국부 투여에 적합한 조성물은, 약제학적 허용가능한 담체 내에 포함된 하나 이상의 조성물을 갖는, 연고, 크림, 겔 및 페이스트로서 만들어질 수 있다.

직장 투여용 조성물은 예를 들어 코코아 버터 또는 살리실레이트를 포함하는 적합한 베이스를 갖는 좌제로서 만들어질 수 있다.

비강(nasal) 투여에 적합한 조성물은, 담체가 고체인 경우, 코로 들이쉬는 방식으로 (즉, 코 가까이에 유지된 분말 용기로부터 코 구멍(nasal passage)을 통해 신속히 흡입하여) 투여되는, 예를 들어 20 내지 500 미크론의 입자 크기를 갖는 굵은 분말을 포함한다. 담체가 액체(예를 들어, 비강 스프레이 또는 비점액(nasal drops))인 경우, 하나 이상의 조성물이 수성 또는 유성 용액 내에 혼합되고, 코구멍을 통해 흡입 또는 스프레이될 수 있다.

질 투여에 적합한 조성물은, 하나 이상의 조성물 및 적합한 담체를 포함하는 페서리(pessaries), 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포옴(foams) 또는 스프레이 조성물로서 만들어질 수 있다.

비경구 투여에 적합한 조성물은, 항-산화제, 완충제(buffers), 세균발육저지제(bacteriostats), 조성물을 원하는 수혜자의 혈액과 등장으로 만드는 용질을 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주입액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 조성물은 단위-투여 또는 다중-투여(multi-dose) 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알 내에 존재할 수 있으며, 사용 직전에 주입을 위해 멸균 액체 담체, 예를 들어 물의 첨가만을 요구하는 동결-건조된(감압하 동결건조된(lyophilized)) 상태로 저장될 수 있다. 앞서 기재된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 즉석 주입 용액 및 현탁액을 제조할 수 있다.

장 또는 비경구 투여에 적합한 약제학적 유기 또는 무기 고체 또는 액체 담체 매질이 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 젤라틴, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 식물 및 동물 지방 및 오일, 검, 폴리알킬렌 글리콜, 물 또는 다른 공지된 담체가 모두 담체 매질로서 적합할 수 있다.

조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 매질 및/또는 부형제와 조합하여 활성 성분으로서 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 담체 매질"에는, 원하는 특정 투여에 적합한 대로, 임의의 및 모든 담체, 용매, 희석제 또는 다른 액체 비히클, 분산 또는 현탁 보조제(aids), 표면 활성제, 등장제, 증점 또는 유화제, 방부제, 고체 결합제, 윤활제, 보조제(adjuvants), 비히클, 전달 시스템, 붕괴제(disintegrants), 흡수제, 방부제, 계면활성제, 착색제, 향미제, 또는 감미제 등이 포함된다.

부가적으로, 조성물은 치료 조성물을 형성하기 위해 약제학적으로 허용가능한 부형제, 및 선택적으로, 생분해성 중합체와 같은 지속-방출 매트릭스와 조합될 수 있다. "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 비-독성 고체, 반-고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화(encapsulating) 물질 또는 임의의 형태의 조성물 보조제를 포함한다.

그러나, 조성물의 총 일일 용량은 주치의에 의해 분별 있는 의료적 판단의 범위에서 결정될 것임을 이해할 것이다. 임의의 특정한 수용자에 대한 특정한 치료적 유효량 수준은, 예를 들어 치료되는 장애 및 장애의 심각도; 사용된 특정 조성물의 활성; 환자의 사용된 특정 조성물, 연령, 체중, 일반적인 건강상태, 성별 및 식이; 투여 시간; 투여 경로; 사용된 특정 화합물의 배출 속도; 치료 기간; 사용된 특정 화합물과 조합하거나 동시에 사용되는 약물; 및 의학 기술분야에서 주지된 유사한 인자들을 포함하는 다양한 인자에 따라 결정될 것이다. 예를 들어, 원하는 치료 효과를 얻기 위해 요구되는 것보다 낮은 수준에서 조성물의 투여량을 시작하고 원하는 효과가 얻어질 때까지 용량을 점진적으로 증가시키는 것이 기술분야에서 주지되어 있다.

조성물은 바람직하게는 투여 용이성 및 용량의 균일성(uniformity)을 위해 용량 단위 형태(dosage unit form)로 조성된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "용량 단위 형태"는 치료받는 수용자에 대해 적합한 조성물의 신체적으로 개별적인 단위를 나타낸다. 각 용량은 원하는 치료 효과를 얻기 위해 계산된 조성물의 양을 그대로, 또는 선택된 약제학적 담체 매질과 함께 포함해야 한다.

바람직한 단위 용량 조성물은, 투여 구성성분의 일일 투여량 또는 단위, 일일 서브-투여량(sub-dose), 또는 이의 적당한 분획을 포함하는 조성물이다. 예를 들어, 1일 당 약 1-5mg의 본 명세서에 개시된 화합물이 마우스의 고형 종양 부피를 감소시킬 수 있다.

용량은 중량, 연령, 표면적, 대사, 조직 분포, 흡수 속도 및 배출 속도와 같은 수용자 인자들에 따라 결정될 것이다. 일 실시형태에서, 1일 당 약 0.5 내지 7g의 본 명세서에 개시된 화합물이 인간에게 투여될 수 있다. 선택적으로, 1일당 약 1 내지 4g의 화합물이 인간에게 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 0.001 내지 5 mg/일이 인간에게 투여된다. 치료적 유효 투여량 수준은 상기된 바와 같은 많은 인자들에 따라 결정될 것이다. 부가적으로, 조성물의 투여량을 비교적 낮은 수준에서 시작하고, 원하는 효과가 얻어질 때까지 증가시키는 것이 이 기술분야에서 주지되어 있다.

본 명세서에 개시된 화합물을 포함하는 조성물은, 효소 또는 산에 기초한 가수분해에 의해 또는 용해에 의해 분해되는, 일반적으로 중합체인 재료로 만들어질 수 있는 지속-방출 매트릭스와 함께 사용될 수 있다. 일단 신체 내에 들어가면, 매트릭스는 효소 또는 체액에 의해 영향받는다. 지속-방출매트릭스는 예를 들어 리포좀, 폴리아락타이드(폴리락트산), 폴리글리콜라이드(글리콜산의 중합체), 폴리락타이드 코-글리콜라이드(락트산 및 글리콜산의 공중합체), 폴리안하이드라이드, 폴리(오르도)에스테르, 폴리펩타이드, 히알루론산, 콜라겐, 콘드로이친 술페이트, 카르복실산, 지방산, 인지질, 폴리사카라이드, 핵산, 폴리아미노산, 페닐알라닌, 티로신, 이소류신과 같은 아미노산, 폴리뉴클레오타이드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘과 같은 생체적합성 물질로부터 선택된다. 바람직한 생분해성 매트릭스는 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 또는 폴리락타이드 코-글리콜라이드(락트산 및 글리콜산의 공중합체) 중 하나의 매트릭스이다.

화합물은 또한 리포좀의 형태로 투여될 수도 있다. 이 기술에서 알려진 바와 같이, 리포좀은 일반적으로 인지질 또는 다른 지질 물질로부터 유래한다. 리포좀은, 수성 매질 내에 분산되어 있는 단층 또는 다층의(mono- or multi-lamellar) 수화된 액정에 의해 형성된다. 리포좀을 형성할 수 있는, 임의의 비-독성의 생리학적으로-허용가능하고 대사가능한(metabolizable) 지질이 사용될 수 있다. 리포좀은 본 발명의 하나 이상의 조성물에 부가적으로, 안정화제, 방부제, 부형제 등을 포함할 수 있다. 지질의 예로는 천연 및 합성 모두의 인지질 및 포스파티딜 콜린(레시틴)이 있다. 리포좀을 형성하는 방법은 이 기술분야에 공지되어 있다.

화합물은 흡입에 의해서와 같은 적용예에 대해 에어로졸로서 조성될 수 있다. 호흡관으로 투여하기 위한 이들 조성물은, 네뷸라이저에 대해 에어로졸 또는 용액의 형태로, 흡입치료(insufflation)에 대해 초미립자 분말로서, 단독으로 또는 락토스와 같은 불활성 담체와 조합하여 조성될 수 있다. 이러한 경우, 조성물의 입자는 일실시형태에서 50 미크론 이하, 일실시형태에서 10 미크론 이하의 직경을 가질 것이다.

본 명세서에 개시된 화합물을 포함하는 조성물은, 상기된 이상의 치료를 위해 다른 조성물 및/또는 방법과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 종양은 통상적으로, 본 발명의 하나 이상의 조성물과 조합한 수술, 방사선 또는 화학요법으로 치료될 수 있고, 이어서 미소전이의 휴지(dormancy)를 연장시키기 위해 및 임의의 잔류 1차 종양의 성장을 안정화, 저해 또는 감소시키기 위해 본 발명의 하나 이상의 조성물이 환자에게 연속하여 투여될 수 있다.

추가적인 실시형태

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위한 공지된 방법에 따라 조성될 수 있다. 조성물은 당업자에게 주지되어 있으며 쉽게 이용가능한 다수의 공급원(sources) 내에 기재되어 있다. 예를 들어 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences)(Martin EW[1995] Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company, 19^th ed.)에는 본 발명과 함께 사용가능한 조성물이 기재되어 있다. 투여하기 적합한 조성물에는 예를 들어, 항산화제, 완충제, 세균발육저지제 및 조성물을 원하는 수혜자의 혈액과 등장으로 만드는 용질을 포함하는 수성 멸균 주입 용액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액이 포함된다. 조성물은 단위-투여 또는 다중-투여 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알 내에 존재할 수 있으며, 사용 전에, 주입을 위한 멸균 액체 담체(예를 들어 물)의 상태만을 요구하는 동결건조된(감압하 동결건조된) 상태로 저장될 수 있다. 즉석 주입 용액 또는 현탁액이 멸균 분말, 과립, 정제 등으로부터 제조될 수 있다. 특히 상기된 구성성분에 추가로, 본 발명의 조성물은 해당 조성물의 형태를 고려하여 이 기술분야에서 통상적인 다른 약제를 포함할 수 있다는 것을 이해해야 한다.

예를 들어 암종 세포의 성장을 저해하기 위해, 본 발명의 방법은, 항암제의 투여와 같은, 암을 치료 및 관리하는 당업자에게 공지된 화학요법, 방사선치료, Ras 종양원성 신호(Ras oncogenic signaling)을 선택적으로 저해하는 치료, 또는 임의의 다른 치료법을 포함하되 이에 제한되지 않는 하나 이상의 부가적인 치료 방법과 유리하게 조합될 수 있다.

염으로서 API-2(트리시리빈)을 투여할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염의 예로는, 생리학적으로 허용가능한 음이온을 형성하는 산과 함께 형성된 유기산 부가염, 예를 들어 토실레이트, 메탄술포네이트, 아세테이트, 시트레이트, 말로네이트, 타르타레이트, 숙시네이트, 벤조에이트, 아스코르베이트, 알파-케토글루타레이트 및 알파-글리세로포스페이트가 있다. 하이드로클로라이드, 술페이트, 나이트레이트, 바이카르보네이트 및 카르보네이트 염을 포함하는 적합한 무기 염이 또한 형성될 수 있다.

예를 들어 아민과 같은 충분히 염기성인 화합물을 생리학적으로 허용가능한 음이온을 제공하는 적합한 산과 반응시킴으로써, 이 기술분야에서 주지된 표준 방법을 사용하여, 약제학적으로 허용가능한 염을 얻을 수 있다. 카르복실산의 알칼리 금속(예를 들어 나트륨, 칼륨 또는 리튬) 또는 알칼리 토금속(예를 들어 칼슘) 염이 또한 만들어질 수 있다.

본 발명의 화합물은 약제학적 조성물로서 조성될 수 있으며, 선택된 투여 경로, 즉 경구 또는 비경구, 정맥내, 근육내, 국부 또는 피하 경로에 적합화된 다양한 형태로, 인간 또는 동물 환자와 같은 대상에게 투여될 수 있다.

따라서, 본 발명의 화합물은, 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 같은 약제학적으로 허용가능한 비히클(즉 담체)과 조합하여, 전신 투여, 예를 들어 경구 투여될 수 있다. 이들은 경질 또는 연질 쉘(shell) 젤라틴 캅셀 내에 넣을 수 있거나, 정제로 압착될 수 있거나, 환자식의 음식과 직접 혼합될 수 있다. 경구 치료 투여를 위해, 화합물은 하나 이상의 부형제와 조합되고 섭취가능한 정제, 구강정, 트로키제, 엘릭시르, 현탁액제, 시럽제, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 0.1 % 이상의 활성제를 포함해야 한다. 조성물 및 제제의 백분율은 물론 변화될 수 있으며, 편리하게는 주어진 단위 투여 형태의 약 2 중량% 내지 약 60 중량%가 될 수 있다. 이러한 치료적으로 유용한 조성물의 양은 효과적인 투여 수준이 얻어지도록 하는 양이다.

정제, 트로키제, 환제, 캅셀제 등은 또한 다음을 포함할 수 있다: 트라가칸트 검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 이칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등과 같은 붕괴제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 및 수크로스, 프럭토스, 락토스 또는 아스파르탐과 같은 감미제 또는 페퍼민트, 살리실산 메틸(oil of wintergreen), 또는 체리 향료와 같은 향미제가 첨가될 수 있다. 단위 투여 형태가 캅셀인 경우, 이는 상기 형태의 물질에 추가하여, 식물성유 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 액체 담체를 포함할 수 있다. 다양한 다른 물질이 코팅으로서 또는 이와 달리 고체 단위 투여 형태의 물리적인 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제 또는 캅셀제는 젤라틴, 왁스, 셀락 또는 당 등으로 코팅될 수 있다. 시럽제 또는 엘릭시르는 본 발명의 화합물, 감미제로서의 수크로스 및 프럭토스, 방부제로서의 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 체리 또는 오렌지 향과 같은 향료를 포함할 수 있다. 물론, 임의의 단위 투여 형태의 제조에 사용된 임의의 물질은, 약제학적으로 허용가능해야 하고, 사용량에서 실질적으로 비독성이 되어야 한다. 또한, 본 발명의 화합물은 지속-방출 제제 및 장치 내에 넣을 수 있다.

활성제(즉 API-2 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)은 또한 주입 또는 주사에 의해 정맥내 또는 복강내 투여될 수 있다. 활성제 또는 이의 염의 용액이, 선택적으로 비독성 계면활성제와 혼합되어, 물 중에서 제조될 수 있다. 분산제가 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 트리아세틴, 및 이의 혼합물 내에서 및 오일 내에서 제조될 수도 있다. 일반적인 저장 및 사용 상태 하에서, 제제는 미생물의 성장을 막기 위한 방부제를 포함한다.

주사 또는 주입에 적합한 약제학적 투여 형태는, 선택적으로 리포좀 내에 캡슐화된, 멸균 주사가능하거나 주입가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조에 적합화된 활성 성분을 포함하는 멸균 수용액 또는 분산액 또는 멸균 분말을 포함할 수 있다. 모든 경우에, 궁극적인 투여 형태는 멸균되고, 유동성이고, 제조 및 저장 상태 하에서 안정해야 한다. 액체 담체 또는 비히클은, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성유, 비독성 글리세롤 에스테르를 포함하는 용매 또는 액체 분산 매질, 및 이의 적합한 혼합물이 될 수 있다. 예를 들어, 리포좀의 형성, 분산액의 경우에 원하는 입자 크기의 유지, 또는 계면활성제의 사용에 의해 적당한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물의 활동은, 다양한 항박테리아 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등으로 막을 수 있다. 많은 경우, 등장제, 예를 들어 당, 완충제 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 조성물 내에 흡수를 지연하는 약제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써 조성물을 연장 흡수시킬 수 있다.

멸균 주입 용액은, 필요시, 상기 열거된 다양한 다른 구성성분과 함께 적당한 용매 중에 원하는 양으로 본 발명의 혼합물을 혼입한 후 여과 멸균하여 제조된다. 멸균 주입 용액 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술이며, 활성 성분 및 기존의 멸균-여과된 용액 내에 존재하는 임의의 부가적인 원하는 성분을 합한 분말이 얻어진다.

국부 투여를 위해, 본 발명의 화합물은, 이들이 액체인 경우에 순수-형태(pure-form)로 적용될 수 있다. 그러나, 이들을, 고체 또는 액체일 수 있는 피부병학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 조성물 또는 제제로서 피부에 투여하는 것이 일반적으로 바람직할 것이다.

유용한 고체 담체는, 탈크, 클레이(clay), 미소결정질 셀룰로스, 실리카, 알루미나 등과 같은 미세하게 분리된 고체를 포함한다. 유용한 액체 담체는, 본 발명의 화합물이 선택적으로 비-독성 계면활성제의 도움으로 유효 수준으로 용해 또는 분산될 수 있는, 물, 알콜 또는 글리콜 또는 물-알콜/글리콜 블렌드를 포함한다. 방향제(fragrances) 및 부가적인 항균제와 같은 보조제가, 주어진 용도에 대해 특성을 최적화하기 위해 첨가될 수 있다. 얻어지는 액체 조성물은, 붕대 및 다른 드레싱을 함침시키기 위해 사용된 흡수 패드로부터 적용될 수 있거나, 펌프-형 또는 에어로졸 스프레이(sprayers)를 사용하여 환부(affected area) 상에 스프레이될 수 있다.

합성 중합체, 지방산, 지방산 염 및 에스테르, 지방 알콜, 변성 셀룰로스 또는 변성 미네랄 물질과 같은 증점제는, 액체 담체와 함께 사용되어, 사용자의 피부에 직접 적용하기 위한 펴 바를 수 있는(spreadable) 페이스트, 겔, 연고, 비누 등을 형성할 수도 있다. 본 발명의 화합물을 전달하기 위해 사용가능한 유용한 피부병학적 조성물의 예는 문헌(Jacquet et al.(미국 특허 제 4,608,392호), Geria(미국 특허 제 4,992,478호), Smith et al.(미국 특허 제 4,559,157호) 및 Woltzman(미국 특허 제 4,820,508호))에 개시된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 유용한 용량은 이들의 시험관 내 활성, 및 동물 모델 내에서의 생체 내 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 마우스 내, 및 다른 동물, 인간까지의 효과적인 용량의 외삽(extrapolation) 방법이 이 기술분야에 공지되어 있다; 예를 들어 미국 특허 제 4,938,949호 참조.

하나의 비-제한적 투여형태에서, 로션과 같은 액체 조성물 내 활성제의 농도는 약 0.1 내지 25 중량% 또는 약 0.5 내지 10 중량%가 될 수 있다. 일 실시형태에서, 겔 또는 분말과 같은 반-고체 또는 고체 조성물 내 농도는 약 0.1 내지 5 중량%, 바람직하게는 약 0.5 내지 2.5 중량%가 될 수 있다. 일실시형태에서, 주사, 주입 또는 섭취를 위한 단일 용량은 5 내지 1500 mg이고, 성인의 경우 약 0.1 내지 50 mg/kg의 수준을 얻기 위해 투여될 수 있다, 즉 일일 1-3회 투여될 수 있다. 본 발명의 비-제한적 용량은, 개체의 체중에 대해 적절히 조정하면서, 클레이 당 7.5 내지 45 mg으로 경구 투여될 수 있다.

따라서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 바와 같은, API-2를 포함하는 약제학적 조성물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 포함한다. 소정량의 API-2, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 경구, 국부 또는 비경구 투여에 적합화된 약제학적 조성물이 본 발명의 바람직한 실시형태를 구성한다. 본 발명에서, 대상, 특히 인간에게 투여되는 투여량은 합리적인 시간 프레임 상에서 환자에게 치료적 반응을 일으키기에 충분해야 한다. 당업자는, 동물의 상태, 동물의 체중과, 암의 심각도 및 단계를 포함하는 다양한 인자에 따라 용량이 결정될 것임을 인식할 것이다.

적합한 투여량은, 원하는 반응을 일으키기 위해 알려진 종양 조직 내 활성제의 농도가 얻어지는 투여량이다. 바람직한 용량은, 다루기 어려운 부작용 없이, 암 세포 성장의 최대 저해가 얻어지는 양이다. API-2는 당업자가 결정할 수 있는 바와 같이, 연속적이거나 다른 간격으로 투여할 수 있다.

암 세포 성장의 개시된 저해 방법으로부터 이익을 얻는 포유동물 종에는, 유인원, 침팬지, 오랑우탄, 인간, 원숭이와 같은 영장류; 개, 고양이, 기니아 피그, 햄스터, 미니돼지, 래빗 및 페럿과 같은 가축화된 동물(예를 들어 애완동물); 소, 버팔로, 들소, 말, 당나귀, 돼지, 양 및 염소와 같은 가축화된 농장 동물; 곰, 사자, 호랑이, 팬더, 코끼리, 하마, 코뿔소, 기린, 영양, 나무늘보, 가젤, 얼룩말, 누, 프레리도그, 코알라, 캥거루, 주머니쥐, 미국너구리, 판다, 하이에나, 바다표범, 바다사자, 바다코끼리, 수달, 돌고래무리(porpoises), 돌고래(dolphins), 및 고래와 같은 일반적으로 동물원에서 볼 수 있는 외래 동물이 포함되며, 이에 제한되지 않는다. "환자" 및 "대상"이라는 용어는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, 이러한 인간 및 비-인간 포유동물을 포함하도록 의도된다. 유사하게, 본 발명의 시험관 내 방법이 이러한 포유동물 종의 세포 상에서 실시(earn out)될 수 있다.

본 발명의 방법을 사용하여 치료할 필요가 있는 환자는, 의료 전문직 종사자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 확인될 수 있다.

이하 실시예는 설명을 위하여 제공되며, 제한을 위한 것이 아니다.

도 1은 NCI 다이버시티 세트(NCI Diversity Set.)로부터의 Akt 저해제의 후보로서 API-2(트리시리빈)의 동정을 설명한다. a는 API-2(트리시리빈)의 화학 구조를 설명한다. b는 API-2가 AKT2-형질전환된 NIH3T3 세포의 AKT2의 인산화 수준을 저해한다는 것을 설명한다. 와일(Wile) 타입 AKT2-형질전환된 NIH3T3 세포를 API-2(1□M)로 지시된 기간동안 처리하고, 항-포스포-Akt-T308 및 -S473 항체(최상부 및 중간 패널들)를 사용하여 면역블로팅 어세이하였다. 최저부(bottom) 패널은 전체 AKT2의 발현을 보인다. c에서, API-2가 Akt의 세 이소형태(isoforms)를 저해하는 것을 알 수 있다. HEK293 세포는 HA-Aktl, -AKT2 및 -AKT3으로 트랜스펙션되었고 EGF 자극 전에 API-2(1μM) 또는 워트만닌(Wortmannin)(15μM)으로 처리되었고, 세포는 용해되었고(lysed) 항-HA 항체로 면역침전되었다. 면역침전물은 시험관 내 키나제 어세이(최상부)되었고, 항-포스포-Akt-T308 (최저부) 항체를 사용하여 면역블로팅 어세이되었다. 중간 패널은 트랜스펙션된 Akt1, AKT2 및 AKT3의 발현을 보여준다. d는 API-2가 시험관 내에서 Akt를 저해하지 않았음을 도시한다. 1 μM API-2(레인 3)을 포함하는 키나제 완충액 내의 본질적으로(constitutively) 활성인 AKT2 재조합 단백질의 시험관 내의 키나제 어세이.

도 2는, API-2가 PI3K, PDK1 및 AGC 키나제 족의 밀접하게 관련된 구성원을 저해하지 않는다는 것을 입증한다. a는 시험관 내 PI3K 키나제 어세이를 설명한다. HEK293 세포는 혈장-결핍되었고(serum-starved) EGF 자극 전에 30분동안 API-2(1 μM) 또는 워트만닌(15 μM)으로 처리되었다. 세포는 용해되었고 항-p110α 항체로 면역침전되었다. 면역침전물은 기질로서 PI-4P를 사용하여 시험관 내 키나제 어세이되었다. b는 시험관 내 PDK1 활성화(최상부 패널) 상의 API-2의 효과를 입증하며, ●는 API-2에 의한 저해를 도시한다. ○는 강력한 PDK1 저해제(IC50 = 5 nM)인 양성 대조구 스타우로스포린(staurosporine)에 의한 저해를 도시한다. 최저부 패널은, Myc-PDK1으로 트랜스펙션되었고 EGF 자극 전에 워트만닌 또는 API-2로 처리된 HEK293 세포의 면역블로팅 어세이다. 면역블롯은 지시된 항체로 검출되었다. c는, API-2 또는 비선택성 PKC 저해제 Ro31-8220로 처리한 후 항-포스포-PKCα-T638(최상부) 및 전체 PKCα(최저부) 항체를 갖는 PKCα의 인산화 수준의 면역블롯 어세이를 도시한다. d는 시험관 내 SGK 키나제 어세이를 도시한다. HEK293 세포는 HA-SGK 로 트랙스펙션되고 EGF 자극 전에 API-2 또는 워트만닌으로 처리되었다. 시험관 내 키나제는 기질(최상부)로서 MBP를 사용하는 HA-SGK 면역침전물과 함께 실시되었다. 최저부 패널은 트랜스펙션된 HA-SGK의 발현을 도시한다. e는 PKA 키나제 어세이의 결과를 도시한다. 면역-정제된 PKA는 지시된 저해제(API-2 또는 PKAI) 및 기질 켐프타이드(Kemptide)를 포함하는 ADB 완충액(upstate Biotechnology Inc) 중에서 배양되었다. 키나제 활성은 정량화되었다. f에서, 웨스턴 블롯이 도시된다. OVCAR3 세포는 API-2로 지시된 시간동안 처리되었다. 세포 용해물은 지시된 항-포스포-항체(패널 1-4) 및 항-액틴 항체(최저부)로 면역블로팅되었다.

도 3은 API-2가 Akt 활성 및 세포 성장을 저해하고, 상승된 Akt에서 인간 암 세포 내 세포자멸사(apoptosis)를 유도한다는 것을 입증한다. a는, API-2를 사용한 처리 후의 웨스턴 블롯이고, Akt의 인산화 수준은 지시된 인간 암 세포주 내 항-포스포-Akt-T308 항체로 검출되었다. 블롯은 항-전체 Akt 항체(최저부 패널)로 재프로브되었다(reprobed). b에서, 세포 증식 어세이가 도시된다. 도면 내에 지시된 바와 같은 세포주는 24시간 및 48 시간동안 상이한 투여량의 API-2로 처리된 후 세포역가 96 세포 증식 어세이 키트(CellTiter 96 Cell Proliferation Assay kit)(Promega)로 어세이되었다. c는 세포자멸사 분석을 제공한다. 세포는 API-2로 처리되었고, 애넥신(annexin) V 및 PI로 염색되었고, FAC스캔(FACScan)으로 어세이 되었다.

도 4는, API-2가 Akt의 하류 표적을 저해하고, 마우스 이종이식편(xenograft) 내 상승된 Akt를 갖는 암 세포주에서 항-종양 활성을 보인다는 것을 도시한다. a에서, API-2가 튜버린, 배드(Bad), AFX 및 GSK-3β의 Akt 인산화를 저해한다는 것이 증명된다. API-2로 처리한 후, OVAR3 세포는 용해되었고, 지시된 항체로 면역블로팅되었다. b는 API-2가 종양 성장을 저해한다는 것을 보여준다. 종양 세포는 누드 마우스에 왼쪽에는 낮은 수준의 Akt 세포 및 오른쪽에는 상승된 수준의 Akt 세포로 피하 주입되었다. 종양이 약 100-150 mm³의 평균 크기에 도달했을 때, 마우스는 비히클 또는 1 mg/kg/일 API-2로 치료되었다. 각 측정은 평균 10개의 종양을 나타낸다. c는 API-2 또는 비히클(대조구)로 치료된 OVCAR3(오른쪽) 및 OVCAR5(왼쪽) 이종이식편을 갖는 마우스의 설명을 도시한다. d는 실험 끝에서의 종양 크기(최저부) 및 중량(최상부)을 예를 들어 도시한다. e에서, API-2로 치료(T3 및 T4) 및 미치료(T1 및 T2)된 OVCAR-3-유도된 종양에 항-포스포-Akt-S473(최상부) 및 항-AKT2 (최저부) 항체를 사용하여 종양 용해물의 면역블롯 분석을 실시하였다.

도 5는, API-2(트리시리빈)가 시험관 내 Akt 키나제 활성을 저해한다는 것을 도시한다. 시험관 내 키나제 어세이는, 기질로서 포스파티딜이노시톨-3,4,5-P3(PIP3), API-2 및 히스톤 H2B를 포함하는 키나제 완충액 내의 PDK1 및 Akt의 재조합체를 사용하여 수행되었다. 30분 배양 후, SDS-PAGE로 반응물(reactions)이 분리되었고, 필름에 노출되었다.

도 6은 인간 Akt1의 mRNA 및 아미노산 서열을 제공하고, 제한 효소 부위도 나타낸다.

도 7은 인간 Akt2의 mRNA 및 아미노산 서열을 제공하고, 제한 효소 부위도 나타낸다.

도 8은 인간 Akt3의 mRNA 및 아미노산 서열을 제공하고, 제한 효소 부위도 나타낸다.

실시예 1: 시험관 내 스크리닝

물질

세포주 및 NCI 다이버시티 세트. 이 연구에 사용된 모든 세포주들은 ATCC로부터 입수하였거나, 앞서 기재되었다(Cheng, J.Q., et al. Oncogene, 14:2793-2801, 1997, West, K. A., et al. Drug Resist. Updat., 5: 234-248, 2002, Satyamoorthy, K., et al. Cancer Res. 61:7318-7324, 2001). NCI 구조적 다이버시티 세트(NCI Structural Diversity Set)는 약 140,000-화합물 NCI 약물 수탁소(depository)로부터 선택된 1,992 화합물의 라이브러리이다. 이들 다이버시티 세트 화합물들의 선택, 구조, 및 활성의 상세한 데이터는 NCI 발전된 치료 프로그램(NCI Developmental Therapeutics Program) 웹 사이트 상에서 알 수 있다.

Akt -형질전환된 세포 성장의 저해에 대한 스크리닝. AKT2 형질전환된 NIH3T3 세포 또는 LXSN 벡터-트랜스펙션된 NIH3T3 대조구 세포(Cheng, J.Q., et al. Oncogene, 14:2793-2801, 1997)를 96-웰 조직 배양 플레이트에 도말하였다. 5 μM 의 NCI 다이버시티 세트 화합물로 치료한 후, CellTier 96 한 용액 세포 증식 키트(Celltier 96 One Solution Cell Proliferation kit)(Promega)로 세포 성장을 검출하였다. AKT2-형질전환되었으나 LXSN-트랜스펙션되지 않은 NIH3T3 세포의 성장을 저해하는 화합물은 Akt 저해제 후보로 간주되었고, 추가 어세이되었다.

시험관 내 단백질 키나제 , 세포 생존 및 세포자멸사 어세이. 시험관 내 키나제가 앞서 기재된 바와 같이 처리되었다(예를 들어, 문헌(Jiang, K., Coppola, et al. Mol. Cell. Biol., 20:139-148, 2000) 참조.). 세포 생존은 MTS로 어세이되었다(Promera). 세포자멸사는 애넥신 V로 검출되었고, 이는 앞서 기재된 대로 수행되었다(Jiang, K., Coppola, et al. Mol. Cell. Biol., 20:139-148, 2000). 재조합 Akt 및 PDK1은 업스테이트 바이오테크날러지 사(Upstate Biotechnology Inc.)로부터 입수하였다.

결과

Akt 시그널링 경로의 저분자 저해제, API-2의 확인. 인간의 암에서 Akt의 빈번한 변화(alterations)이 검출되었고, Akt 경로의 혼란(disruption)은 세포자멸사를 유도하고 종양 성장을 저해한다(Jetzt, A., et al. Cancer Res., 63:697-706, 2003). 따라서, Akt는 신규한 암 치료제의 개발을 위한 매력적인 분자 표적으로서 간주되어왔다. Akt의 저분자 저해제(들)를 확인하기 위해, "물질 및 방법(Materials and Methods)"에 기재된 바와 같이 AKT2-형질전환되었으나 빈(empty) 벡터 LXSN-트랜스펙션되지 않은 NIH3T3 세포의 성장을 저해할 수 있는 약제에 대하여 NCI로부터의 1,992-화합물들의 화학적 라이브러리(NCI 다이버시티 세트)를 평가 하였다. 반복적 실험으로, 32가지 화합물들이 AKT2-형질전환된 세포에서만 성장을 저해한다는 것을 알았다. 이들 화합물들 중 가장 강력한 화합물인, API-2(NCI 식별자: NSC 154020)는 50 nM의 농도에서 세포 성장을 억제하였다. 도 1a는 API-2의 화학적 구조를 보여주며, 이는 트리시리빈으로도 알려져 있다(Schweinsberg, P.D., et al. Biochem Pharmacol., 30:2521-2526, 1981). API-2가 비형질전환된 모세포보다 AKT-2 형질전환된 세포를 선택적으로 저해하였다는 사실로, 본 발명자들은 API-2가 AKT2 키나제의 저해제인지를 결정하도록 격려되었다. 이러한 목적으로, AKT2는API-2 처리 후 AKT-2 형질전환된 NIH3T3 세포로부터 항-AKT2 항체로 면역침전되었다. AKT2 면역침전물은 항-포스포-Akt 항체로 면역블로팅되었다. 도 1b에 도시된 바와 같이, API-2는 AKT2의 완전한 활성화(Datta, S.R., et al. Genes Dev. 13:2905-2927, 1999)를 위해 요구되는 트레오닌-309 및 세린-474 모두에서의 AKT2 인산화를 크게 저해하였다. Akt의 세가지 이소형태(isoforms)는 고도의 상동관계(homology) 및 유사한 구조를 가지므로, 이들의 키나제 활성 상의 API-2의 효과가 평가되었다. HEK293 세포는 HA-Akt1, -AKT2 및 -AKT3으로 트랜스펙션되었고, 밤새 혈장-결핍(serum-starved)되었고, EGF(50 ng/ml) 자극 전에 60분동안 API-2로 처리되었다. 3중(triple) 시험은, API-2가 EGF-유도된 키나제 활성 및 Akt1, AKT2 및 AKT3의 인산화를 억제하였음을 보여주었다(도 1c). 그러나, 재조합형 구조적 활성 AKT2(Myr-AKT2)의 키나제 활성은 시험관 내 키나제 반응에서 API-2에 의해 저해되지 않았으며(도 1d), API-2가 시험관 내에서 Akt를 직접적으로 저해하지 않는다는 것과, API-2가 Akt의 활성 부위에 결합하는 기질 경쟁자로서 작용하지 않고 ATP 경쟁자로서 작용하지도 않는다는 것을 제시하였다.

API-2는 Akt 의 알려진 상류 활성인자(Upstream Activators)를 저해하지 않는다. PI3K-의존성 방식을 통해 세포외 자극 및 활성 Ras 및 Src와 같은 세포 내 신호 분자에 의해 Akt가 활성화된다는 것은 잘 기록되어 있다. 따라서, Akt의 API-2 저해가 Akt의 상류 분자(들)의 표적화에 기인할 수 있다. PI3K 및 PDK1은 Akt의 직접적인 상류 조절인자이므로(Datta, S.R., et al. Genes Dev. 13:2905-2927, 1999), API-2가 PI3K 및/또는 PDK1을 저해하는지가 조사되었다. HEK293은 혈장-결핍되었고, 이어서 EGF 자극 전에 30분간 API-2 또는 PI3K 저해제, 워트만닌으로 처리되었다. PI3K는 항-p110α 항체로 면역침전되었다. 면역침전물은 기질로서 PI-4-P를 사용하여 시험관 내 PI3K 키나제 어세이되었다. 도 2에 도시된 바와 같이, EGF-유도된 PI3K 활성은 API-2에 의해서가 아니라 워트만닌에 의해 저해되었다. PDK2 상의 API-2의 효과를 평가하기 위해, 재조합형 PDK1이 AKT2펩티드의 트레오닌-309 인산화를 촉진하는 어세이가 포스포티딜이노시톨을 포함하는 지질 베지클의 존재 하에 사용되었다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 어세이는 대조구 PDK1 저해제 스타우로스포린에 의해 크게 저해되었다(IC50 = 5 nM). 대조적으로, API-2는 가장 높은 시험 농도(5.1 μM)에서 어세이의 21% 저해만을 나타냈다. 이들 데이터는, API-2가 PDK1의 강력한 저해제가 아니라는 것을 증명한다. PDK1 활성화 상의 API-2의 효과를 더 평가하기 위해, 단독으로 인산화되고 이의 활성을 위해 중요한 잔기인 세린-241에서 PDK1의 자가인산화(autophophorylation) 수준을 조사한 후(Datta, S.R., et al. Genes Dev. 13:2905-2927, 1999), HEK293 세포를 API-2 처리하였다. 삼중 시험은, PDK1의 인산화 수준이 API-2에 의해 저해되지 않았음을 보여준다(도 2b). 그러나, PI3K 저해제 워트만닌은 예상대로 EGF-자극된 PDK1을 저해하였다(도 2b).

API-2는 PKC , PKA , SGK , STAT, JNK , p38 및 ERK 시그널링 경로 상에서 Akt 에 대해 고도로 선택성이다. Akt는 AGC(PKA/PKG/PKC) 키나제 족에 속하며, 이는 또한 PKA, PKC, 혈장- 및 글루코코르티코이드-유도성(glucocorticoid-inducible) 키나제(SGK), p90 리보솜 S6 키나제, p70^S6K, 미토젠- 및 스트레스-활성화된 단백질 키나제 및 PKC-관련 키나제를 포함한다. AGC 키나제 족 가운데, PKA, PKC 및 SGK의 단백질 구조는 다른 구성원들보다 Akt 키나제에 더 가깝다. 따라서, 이들 3가지 키나제의 효소 활성 상의 API-2의 효과가 이어서 조사되었다. HEK293 세포는 HA-태그(HA-tagged) PKA, PKC□ 또는 SGK로 트랜스펙션되었다. 시험관 내 키나제 어세이 및 면역블로팅 어세이는, PKA 및 PKCα의 키나제 활성이 PKAI 및 Ro 31-8220, PKC 저해제에 의해 각각 저해된 반면, API-2는 이들의 활성에 어떠한 효과도 나타내지 않았다는 것을 보여주었다(도 2c 및 2e). 또한, 혈장-유도된 SGK 키나제 활성은 API-2에 의해서가 아니라 워트만닌에 의해 약화되었다(도 2d). 또한, API-2가 다른 종양 형성 유전자(oncogenic) 생존 경로에 영향을 주는지가 결정되었다. 시판되는 항-포스포-항체를 사용한 웨스턴 블로팅 어세이로, Stat3, JNK, p38 및 ErK1/2의 인산화 수준이 API-2 처리에 의해 영향받지 않았던 것으로 밝혀졌다(도 2f). 이들 데이터는, API-2가 Akt 시그널링 경로를 특이적으로 저해한다는 것을 나타낸다.

API-2는 세포 성장을 억제하고 Akt -과발현/활성화 인간 암 세포주의 세포자 멸사를 유도한다. Akt 경로를 선택적으로 저해하는 API-2의 능력은, 이것이 Akt의 비정상 발현/활성화를 갖는 종양 세포 내에서 선택적으로 증식을 저해하고 및/또는 세포자멸사를 유도해야 한다는 것을 제안한다. 인간 악성종양 내 Akt의 활성화는 일반적으로 Akt의 과발현 또는 PTEN 돌연변이에 기인하므로, API-2는, AKT2의 과발현(OVCAR3, OVCAR8, PANC1 및 AKT2-형질전환된 NIH3T3) 또는 PTEN 유전자의 돌연변이(PC-3, LNCaP, MDA-MB-468)로 인한, 구조적 활성 Akt를 발현하는 세포 및, (OVCAK5, DU-145, T47D, COLO357 및 LXSN-NIH3T3)이 아닌 세포와, Akt를 활성화하거나 IGF-1에 의한 성장 자극에 반응하지 않는 IGF-1에 의해 활성화되는 흑색종 세포를 처리하기 위해 사용되었다(Satyamoorthy, K., et al. Cancer Res. 61:7318-7324, 2001). 면역블로팅 어세이는, 상승된 Akt를 발현하거나 IGF-1 자극에 반응하는 세포들에서만 Akt의 인산화 수준이 API-2에 의해 저해되었음을 보였다(도 3a). 따라서, API-2는, 낮은 수준의 Akt를 갖는 세포에 비해 Akt-과발현/활성화 세포 내에서 훨씬 더 높은 정도로 세포 성장을 저해했다. 도 3b에 도시된 바와 같이, API-2 처리는 Akt 과발현/활성화 세포주, LNCaP, PC-3, OVCAR3, OVCA8, PANCI, MDA-MB0468 및 WM35 내에서 세포 증식을 약 50-60% 까지 저해한 반면, 낮은 수준의 Akt를 나타내거나 IGF-1에 의한 성장 자극에 반응하지 않는, DU145, OVCAR5, COLO357, T47D 및 WM852 세포에서 단지 약 10-20% 까지 저해했다. 또한, API-2는 세포자멸사를 8-배(OVCAR3), 6-배(OVCAR8), 6-배(PANC1) 및 3-배(AKT2-NIH3T3) 까지 유도한다. OVCAR5, COLO357 및 LXSN-NIH3T3 세포 내 API-2 및 비히클(DMSO) 처리 간에는 세포자멸사의 유의성 있는 차이가 없었다. 따라서, API-2는 비정상 Akt를 발현하는 세포 내에서 선택적으로 세포 성장을 저해하고 세포자멸사를 유도한다.

API-2는 Akt 의 하류 표적을 저해한다. Akt는 다수의 단백질의 인산화를 통해 이의 세포 작용을 나타낸다(Datta, S.R., et al. Genes Dev. 13:2905-2927, 1999). 포크헤드 단백질 족의 구성원(FKHR, AFX 및 FKHRL1), 튜버린(tuberlin)/TSC2, p70^S6K, GSK-3β, p21^{WAF1 / Cip1}, p27^kip1, MDM2, Bad, ASK1 및 IKKα 등을 포함하는, 20가지 이상의 단백질이 Akt 기질로서 확인되었다. 이어서 API-2가 Akt의 하류 표적을 저해하는지가 조사되었다. 항-포스포-튜버린, -Bad, -AFX, 및-GSK-3β 항체가 시판되므로, 따라서, Akt에 의해 유도된 이들의 인산화 상의 API-2의 효과가 결정되었다. API-2(1□M) 처리 후, OVACR3 세포를 용해시키고 개별 항-포스포-항체로 면역블로팅하였다. 도 4a는, API-2가 튜버린의 인산화 수준을 상당히 저해하여 튜버린의 안정화 및 상향조절(upregulation)을 유도하였음을 보여준다(Dan, H.C., et al. J. Biol. Chem. 277:35364-35370, 2002). Bad, GSK-3β, 및 AFX의 인산화 수준은 API-2에 의해 부분적으로 감소되었다. 이들 데이터는, API-2가, 이의 하류 표적의 인산화를 저해함으로써 세포 사망 및 세포 성장 정지를 유도한다는 것을 제시한다. 상이한 정도의 Akt 하류 표적들의 API-2 저해는, 이들 표적들의 인산화가 또한 다른 키나제(들)에 의해 조절된다, 예를 들어 Bad 세린-136은 Akt에 추가로 PAK 1에 의해 인산화된다는 사실에 기인할 수 있었다(Schurmann, A., et al. Mol. Cell. Biol., 20:453-461, 2000).

실시예 2: 누드 마우스 종양 이종이식편 ( Xenograft ) 모델 내 항종양 활성

종양 세포를 수집하고(harvested), PBS 내에 재현탁하고, 이전에 보고된 대로 8 주령 암놈 누드 마우스의 오른쪽 및 왼쪽 옆구리(2×10⁶ 세포/옆구리)에 s.c. 주입하였다(Sun, J., Blaskovic, et al. Cancer Res., 59;4919-4926, 1999). 종양이 약 100-150 ㎣ 에 도달했을 때, 동물을 무작위화하여 날마다 0.2ml의 비히클과 함께 i.p. 투여하였다. 대조구 동물은 DMSO(20%) 비히클이 투여된 반면, 처리 동물은 20% DMSO 중의 API-2(1mg/kg/일)가 주입되었다.

API-2는 Akt 를 과발현하는 누드 마우스 내 종양의 성장을 저해한다. 인간 난소 및 췌장 암에서 AKT1 및 AKT2의 빈번한 과발현/활성화 및/또는 증식이 나타났다(Cheng, J.Q., and Nicosia, S.V.AKT signal transduction pathway in oncogenesis. In Schwab D, Editor, Encyclopedic Reference of Cancer. Berlin Heidelberg and New York: Springer; 2001. pp 35-7). PI3K, HSP70, Src 및 파네실트렌스퍼라제(farnesyltransferase)의 저해제에 의한 Akt 경로의 저해로 인해 세포 성장 정지 및 세포자멸사의 유도가 얻어졌다(Solit, D.B., et al. Cancer Res., 63:2139-2144, 2003, Xu, W., et al. Cancer Res., 63:7777-7784, 2003). 최근 연구에 따르면, 주요한 음성 Akt(dominant negative Akt)인 아데노바이러스의 종양내 주입에 의해, 상승된 Akt를 갖는 이종이식편의 종양 성장이 또한 크게 저해된 것으로 나타났다(Jetzt, A., et al. Cancer Res., 63:697-706, 2003). API-2는 상승된 수준의 Akt를 갖는 암세포에서만 Akt 시그널링을 저해하고 세포자멸사 및 세포 성 장 정지를 유도하므로(도 3), 상승된 수준의 Akt를 갖는 종양의 성장은, 누드 마우스 내 낮은 수준의 Akt를 갖는 종양의 성장보다 API-2에 더 민감하게 반응해야 한다. 이러한 목적으로, s.c. Akt-과발현 세포들(OVCAR3, OVCAR8 및 PANC-1)은 오른쪽 옆구리에 s.c. 이식되었고, 낮은 수준의 Akt를 발현하는 세포주들(OVCAR5 및 COLO357)은 마우스의 왼쪽 옆구리에 이식되었다. 종양이 약 100-150 ㎣의 평균 크기에 도달했으면, 동물들은 무작위화되었고, 비히클 또는 API-2(1 mg/kg/일)로 i.p. 치료되었다. 도 4b에 도시된 바와 같이, 비히클로 치료된 OVCAR-5 및 COLO357 종양은 종양 이식 49일 후에 약 800-1,000 ㎣ 까지 성장하였다. 대조구 비히클로 치료된 OVCAR-3, OVCAR8 및 PANC1 종양은 종양 이식 49일 후에 약 700-900 ㎣ 까지 성장하였다. API-2는 OVCAR-3, OVCAR8 및 PANC1 종양 성장을 90 %, 88 % 및 80 %까지 각각 저해하였다. 대조적으로, API-2는 누드 마우스 내 OVCAR5 및 COLO357 세포의 성장에 거의 효과를 갖지 않았다(도 4b-4d 및 데이터는 도시 않음). 투여량 1 mg/kg/일에서, API-2는 마우스의 혈당 수준, 체중, 활성 및 먹이 섭취에 어떠한 효과도 갖지 않았다. 치료된 종양 시료에서, Akt 활성은 전체 Akt 함량의 변화 없이 API-2에 의해 저해되었다(도 4e). 함께 취해지는 경우, 이러한 결과는, API-2가 상승된 수준의 Akt를 갖는 종양의 성장을 선택적으로 저해한다는 것을 보여준다.

실시예 3: TCN 은 야생형 Akt 키나제 활성을 직접적으로 저해한다.

API-2(TCN)은 시험관 내 PDK1에 의해 유도된 야생형 Akt 키나제 활성을 직접 저해할 수 있다(도 1). 이러한 결과는, API-2가 직접적인 Akt 저해제이고, 기초(underlying) 메커니즘이 Akt의 트레오닌-308 및/또는 PH 도메인에 대한 API-2 결합이 될 수 있다는 것을 지지한다. 시험관 내 키나제 어세이는 기질로서 포스파티딜이노시톨-3,4,5-P3 (PIP3), API-2 및 히스톤 H2B를 포함하는 키나제 완충액 내에서 PKD1 및 Akt의 재조합체를 사용하여 수행되었다. 30분 배양 후, 반응물(reactions)은 SDS-PAGE로 분리되었고, 필름 내에 노출되었다.

실시예 4: TCN 은 암 내성 세포에 효과적이다.

TCN(API-2)의 효과는 시스플라틴, 파클리탁셀 및 타목시펜 내성 A270CP, C-13, OVCAR433 및 MCF7/TAM 세포에서 시험되었다. API-2는 이들 세포의 시스플라틴, 파클리탁셀 및 타몰시펜 내성을 극복하였다.

본 발명은 이의 바람직한 실시형태를 참조하여 기재되었다. 본 발명의 변화 및 변형은 본 발명의 상기된 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이들 변화 및 변형은 모두 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이 의도된다.

Claims (42)

1. (i) 종양 또는 암으로부터 생물학적 시료를 얻는 단계; (ii) 종양 또는 암이 Akt 키나제를 과발현하는지를 결정하는 단계; 및 (iii) 종양 또는 암이 Akt 키나제를 과발현하는 경우, 유효량의 하기 화학식의 화합물로 종양 또는 암을 치료하는 단계를 포함하는 포유동물 내 종양 또는 암의 치료 방법:

   

   (단, 상기 식에서,

   R2', R3' 및 R5'은 각각 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 포스페이트 또는 포스포네이트(모노-, 디- 또는 트리포스페이트 또는 안정화된 포스페이트 프로드러그를 포함); 아실(저급 아실 포함); 알킬(저급 알킬 포함); 알킬 또는 아릴알킬을 포함하는 아미드, 술포네이트 에스테르; 페닐기가 예를 들어 본 명세서에 기재된 아릴의 정의에서 정의되는 바와 같은 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환되는, 메탄술포닐 및 벤질을 포함하는 술포닐; 선택적으로 치환된 아릴술포닐; 인지질을 포함하는 지질; 아미노산; 탄수화물; 펩티드; 또는 콜레스테롤; 또는 R2', R3' 또는 R5'가 독립적으로 H 또는 모노-, 디- 또는 트리-포스페이트인 화합물을 생체 내 제공하는, 다른 약제학적으로 허용가능한 이탈기이고;

   R^x 및 R^y는 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 포스페이트; 아실(저급 아실 포함); 아미드, 알킬(저급 알킬 포함); 선택적으로 아릴술포닐로 치환된, 폴리에틸렌글리콜과 같은, 방향족성, 폴리옥시알킬렌; 인지질을 포함하는 지질; 아미노산; 탄수화물; 펩티드; 또는 콜레스테롤; 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 이탈기이다. 일실시형태에서, 화합물은 5'-포스포에테르 지질 또는 5'-에테르 지질로서 투여된다.

   R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 직쇄, 분지 또는 사이클릭 알킬(저급 알킬 포함), 알케닐, 또는 알키닐, CO-알킬, CO-알케닐, CO-알키닐, CO-아릴 또는 헤테로아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 술포 닐, 알킬술포닐, 아릴술포닐, 아르알킬술포닐이다)
2. 제 1항에 있어서,

   상기 대상은 유방, 췌장, 난소 및 결장직장으로 구성되는 그룹에서 선택되는 암으로 진단받은 것을 특징으로 하는 포유동물 내 종양 또는 암의 치료 방법.
3. 제 1항에 있어서,

   상기 Akt 키나제 발현 수준은 인산화된 Akt 키나제의 존재에 대해 암을 어세이함으로써 결정되는 것을 특징으로 하는 포유동물 내 종양 또는 암의 치료 방법.
4. 제 1항에 있어서,

   상기 Akt 키나제의 발현 수준은 항체로 암을 인산화된 Akt 키나제의 존재에 대해 어세이함으로써 결정되는 것을 특징으로 하는 포유동물의 종양 또는 암의 치료 방법.
5. 화합물이 3주 동안 주당 1회 투여된 후 화합물이 투여되지 않는 1주 기간이 이어지는 것을 특징으로 하는, 포유동물에게 유효량의 다음 화학식의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 종양 또는 암의 치료 방법.

   

   (단, 상기 식에서,

   R2', R3' 및 R5'은 각각 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 포스페이트 또는 포스포네이트(모노-, 디- 또는 트리포스페이트 또는 안정화된 포스페이트 프로드러그를 포함); 아실(저급 아실 포함); 알킬(저급 알킬 포함); 알킬 또는 아릴알킬을 포함하는 아미드, 술포네이트 에스테르; 페닐기가 예를 들어 본 명세서에 기재된 아릴의 정의에서 정의되는 바와 같은 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환 되는, 메탄술포닐 및 벤질을 포함하는 술포닐; 선택적으로 치환된 아릴술포닐; 인지질을 포함하는 지질; 아미노산; 탄수화물; 펩티드; 또는 콜레스테롤; 또는 R2', R3' 또는 R5'가 독립적으로 H 또는 모노-, 디- 또는 트리-포스페이트인 화합물을 생체 내 제공하는, 다른 약제학적으로 허용가능한 이탈기이고;

   R^x 및 R^y는 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 포스페이트; 아실(저급 아실 포함); 아미드, 알킬(저급 알킬 포함); 선택적으로 아릴술포닐로 치환된, 폴리에틸렌글리콜과 같은, 방향족성, 폴리옥시알킬렌; 인지질을 포함하는 지질; 아미노산; 탄수화물; 펩티드; 또는 콜레스테롤; 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 이탈기이다. 일실시형태에서, 화합물은 5'-포스포에테르 지질 또는 5'-에테르 지질로서 투여된다.

   R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 직쇄, 분지 또는 사이클릭 알킬(저급 알킬 포함), 알케닐, 또는 알키닐, CO-알킬, CO-알케닐, CO-알키닐, CO-아릴 또는 헤테로아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 술포닐, 알킬술포닐, 아릴술포닐, 아르알킬술포닐이다)
6. 제 5항에 있어서,

   상기 투여 계획은 2회 이상 반복되는 것을 특징으로 하는 포유동물의 종양 또는 암의 치료 방법.
7. 제 5항에 있어서,

   상기 투여 계획은 4회 이상 반복되는 것을 특징으로 하는 포유동물의 종양 또는 암의 치료 방법.
8. 제 5항에 있어서,

   상기 종양은 유방, 췌장, 난소 및 결장직장 종양으로 구성되는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 포유동물의 종양 또는 암의 치료 방법.
9. 제 5항에 있어서,

   10 mg/㎡ 이상의 상기 화합물이 투여되는 것을 특징으로 하는 포유동물의 종양 또는 암의 치료 방법.
10. 제 5항에 있어서,

    10 mg/㎡ 이하의 상기 화합물이 투여되는 것을 특징으로 하는 포유동물의 종양 또는 암의 치료 방법.
11. 화합물이 주당 1회 투여되는 것을 특징으로 하는, 포유동물에게 10 mg/㎡ 이하 용량의 다음 화학식의 화합물을 투여하는 단계 포함하는 포유동물의 종양 또는 암의 치료 방법.

    

    (단, 상기 식에서,

    R2', R3' 및 R5'은 각각 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 포스페이트 또는 포스포네이트(모노-, 디- 또는 트리포스페이트 또는 안정화된 포스페이트 프로드러그를 포함); 아실(저급 아실 포함); 알킬(저급 알킬 포함); 알킬 또는 아릴알킬을 포함하는 아미드, 술포네이트 에스테르; 페닐기가 예를 들어 본 명세서에 기재된 아릴의 정의에서 정의되는 바와 같은 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환 되는, 메탄술포닐 및 벤질을 포함하는 술포닐; 선택적으로 치환된 아릴술포닐; 인지질을 포함하는 지질; 아미노산; 탄수화물; 펩티드; 또는 콜레스테롤; 또는 R2', R3' 또는 R5'가 독립적으로 H 또는 모노-, 디- 또는 트리-포스페이트인 화합물을 생체 내 제공하는, 다른 약제학적으로 허용가능한 이탈기이고;

    R^x 및 R^y는 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 포스페이트; 아실(저급 아실 포함); 아미드, 알킬(저급 알킬 포함); 선택적으로 아릴술포닐로 치환된, 폴리에틸렌글리콜과 같은, 방향족성, 폴리옥시알킬렌; 인지질을 포함하는 지질; 아미노산; 탄수화물; 펩티드; 또는 콜레스테롤; 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 이탈기이다. 일실시형태에서, 화합물은 5'-포스포에테르 지질 또는 5'-에테르 지질로서 투여된다.

    R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 직쇄, 분지 또는 사이클릭 알킬(저급 알킬 포함), 알케닐, 또는 알키닐, CO-알킬, CO-알케닐, CO-알키닐, CO-아릴 또는 헤테로아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 술포닐, 알킬술포닐, 아릴술포닐, 아르알킬술포닐이다)
12. 제 11항에 있어서,

    상기 투여 투약 계획(dosing regimen)은 2주 이상 반복되는 것을 특징으로 하는 포유동물의 종양 또는 암의 치료 방법.
13. 제 11항에 있어서,

    상기 투여 투약 계획은 3주 이상 반복되고, 상기 3주 기간 후에 약물이 투여되지 않는 1주 기간이 이어지는 것을 특징으로 하는 포유동물의 종양 또는 암의 치료 방법.
14. 제 13항에 있어서,

    상기 투여 투약 계획은 투여 사이클(dosing cycle)을 나타내는 것을 특징으로 하는 포유동물의 종양 또는 암의 치료 방법.
15. 제 14항에 있어서,

    상기 투여 사이클은 2회 이상 반복되는 것을 특징으로 하는 포유동물의 종양 또는 암의 치료 방법.
16. 제 14항에 있어서,

    상기 투여 사이클은 암의 퇴행이 달성될 때까지 반복되는 것을 특징으로 하는 포유동물의 종양 또는 암의 치료 방법.
17. 제 1항, 제 5항 또는 제 11항에 있어서,

    상기 약물이 정맥 내 투여되는 것을 특징으로 하는 포유동물의 종양 또는 암의 치료 방법.
18. 제 1항, 제 5항 또는 제 11항에 있어서,

    상기 대상은 암종, 육종, 림프종, 백혈병 또는 골수종으로 진단받은 것을 특징으로 하는 포유동물의 종양 또는 암의 치료 방법.
19. 제 1항, 제 5항 또는 제 11항에 있어서,

    상기 포유동물은 인간인 것을 특징으로 하는 포유동물의 종양 또는 암의 치료 방법.
20. 제 1항, 제 5항 또는 제 11항에 있어서,

    상기 화합물은 화학식 IB의 화합물:

    

    인 것을 특징으로 하는 포유동물의 종양 또는 암의 치료 방법.
21. 제 1항, 제 5항 또는 제 11항에 있어서,

    상기 화합물은 화학식 IIA의 화합물:

    

    인 것을 특징으로 하는 포유동물의 종양 또는 암의 치료 방법.
22. 용도가 (i) 종양 또는 암으로부터 생물학적 시료를 얻고; (ii) 종양 또는 암이 Akt 키나제를 과발현하는지를 결정하고; 및 (iii) 종양 또는 암이 Akt 키나제를 과발현하는 경우, 종양 또는 암을 유효량의 다음 화학식의 화합물로 치료하는 것을 또한 포함하는, 종양 또는 암을 치료하기 위한 하기 화학식의 화합물의 용도.

    

    (단, 상기 식에서,

    R2', R3' 및 R5'은 각각 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 포스페이트 또는 포스포네이트(모노-, 디- 또는 트리포스페이트 또는 안정화된 포스페이트 프로드러그를 포함); 아실(저급 아실 포함); 알킬(저급 알킬 포함); 알킬 또는 아릴알킬을 포함하는 아미드, 술포네이트 에스테르; 페닐기가 예를 들어 본 명세서에 기재된 아릴의 정의에서 정의되는 바와 같은 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환 되는, 메탄술포닐 및 벤질을 포함하는 술포닐; 선택적으로 치환된 아릴술포닐; 인지질을 포함하는 지질; 아미노산; 탄수화물; 펩티드; 또는 콜레스테롤; 또는 R2', R3' 또는 R5'가 독립적으로 H 또는 모노-, 디- 또는 트리-포스페이트인 화합물을 생체 내 제공하는, 다른 약제학적으로 허용가능한 이탈기이고;

    R^x 및 R^y는 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 포스페이트; 아실(저급 아실 포함); 아미드, 알킬(저급 알킬 포함); 선택적으로 아릴술포닐로 치환된, 폴리에틸렌글리콜과 같은, 방향족성, 폴리옥시알킬렌; 인지질을 포함하는 지질; 아미노산; 탄수화물; 펩티드; 또는 콜레스테롤; 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 이탈기이다. 일실시형태에서, 화합물은 5'-포스포에테르 지질 또는 5'-에테르 지질로서 투여된다.

    R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 직쇄, 분지 또는 사이클릭 알킬(저급 알킬 포함), 알케닐, 또는 알키닐, CO-알킬, CO-알케닐, CO-알키닐, CO-아릴 또는 헤테로아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 술포닐, 알킬술포닐, 아릴술포닐, 아르알킬술포닐이다)
23. 제 22항에 있어서,

    상기 대상은 유방, 췌장, 난소 및 결장직장으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 암으로 진단된 것을 특징으로 하는, 종양 또는 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 용도.
24. 제 22항에 있어서,

    상기 Akt 키나제 발현 수준은 암을 인산화된 Akt 키나제의 존재에 대해 어세이함으로써 결정되는 것을 특징으로 하는 종양 또는 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 용도.
25. 제 22항에 있어서,

    상기 Akt 키나제의 발현 수준은 항체로 암을 인산화된 Akt 키나제의 존재에 대해 어세이함으로써 결정되는 것을 특징으로 하는 종양 또는 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 용도.
26. 화합물이 3주동안 주당 1회 투여된 후 화합물이 투여되지 않는 1주 기간이 이어지는 것을 특징으로 하는, 종양 또는 암을 치료하기 위한 하기 화학식의 화합물의 용도.

    

    (단, 상기 식에서,

    R2', R3' 및 R5'은 각각 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 포스페이트 또는 포스포네이트(모노-, 디- 또는 트리포스페이트 또는 안정화된 포스페이트 프로드러그를 포함); 아실(저급 아실 포함); 알킬(저급 알킬 포함); 알킬 또는 아릴알킬을 포함하는 아미드, 술포네이트 에스테르; 페닐기가 예를 들어 본 명세서에 기재된 아릴의 정의에서 정의되는 바와 같은 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환 되는, 메탄술포닐 및 벤질을 포함하는 술포닐; 선택적으로 치환된 아릴술포닐; 인지질을 포함하는 지질; 아미노산; 탄수화물; 펩티드; 또는 콜레스테롤; 또는 R2', R3' 또는 R5'가 독립적으로 H 또는 모노-, 디- 또는 트리-포스페이트인 화합물을 생체 내 제공하는, 다른 약제학적으로 허용가능한 이탈기이고;

    R^x 및 R^y는 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 포스페이트; 아실(저급 아실 포함); 아미드, 알킬(저급 알킬 포함); 선택적으로 아릴술포닐로 치환된, 폴리에틸렌글리콜과 같은, 방향족성, 폴리옥시알킬렌; 인지질을 포함하는 지질; 아미노산; 탄수화물; 펩티드; 또는 콜레스테롤; 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 이탈기이다. 일실시형태에서, 화합물은 5'-포스포에테르 지질 또는 5'-에테르 지질로서 투여된다.

    R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 직쇄, 분지 또는 사이클릭 알킬(저급 알킬 포함), 알케닐, 또는 알키닐, CO-알킬, CO-알케닐, CO-알키닐, CO-아릴 또는 헤테로아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 술포닐, 알킬술포닐, 아릴술포닐, 아르알킬술포닐이다)
27. 제 26항에 있어서,

    상기 투여 계획은 2회 이상 반복되는 것을 특징으로 하는 종양 또는 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 용도.
28. 제 26항에 있어서,

    상기 투여 계획은 4회 이상 반복되는 것을 특징으로 하는 종양 또는 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 용도.
29. 제 26항에 있어서,

    상기 종양은 유방, 췌장, 난소 및 결장직장 종양으로 구성되는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 종양 또는 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 용도.
30. 제 26항에 있어서,

    10 mg/㎡ 이상의 상기 화합물이 투여되는 것을 특징으로 하는 종양 또는 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 용도.
31. 제 26항에 있어서,

    10 mg/㎡ 이하의 상기 화합물이 투여되는 것을 특징으로 하는 종양 또는 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 용도.
32. 화합물이 주당 1회 투여되는 것을 특징으로 하는, 10 mg/㎡ 이하 투여량으로 종양 또는 암을 치료하기 위한 하기 화학식의 화합물의 용도.

    (단, 상기 식에서,

    R2', R3' 및 R5'은 각각 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 포스페이트 또는 포스포네이트(모노-, 디- 또는 트리포스페이트 또는 안정화된 포스페이트 프로드러그를 포함); 아실(저급 아실 포함); 알킬(저급 알킬 포함); 알킬 또는 아릴알킬을 포함하는 아미드, 술포네이트 에스테르; 페닐기가 예를 들어 본 명세서에 기재된 아릴의 정의에서 정의되는 바와 같은 하나 이상의 치환체로 선택적으로 치환 되는, 메탄술포닐 및 벤질을 포함하는 술포닐; 선택적으로 치환된 아릴술포닐; 인지질을 포함하는 지질; 아미노산; 탄수화물; 펩티드; 또는 콜레스테롤; 또는 R2', R3' 또는 R5'가 독립적으로 H 또는 모노-, 디- 또는 트리-포스페이트인 화합물을 생체 내 제공하는, 다른 약제학적으로 허용가능한 이탈기이고;

    R^x 및 R^y는 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 포스페이트; 아실(저급 아실 포함); 아미드, 알킬(저급 알킬 포함); 선택적으로 아릴술포닐로 치환된, 폴리에틸렌글리콜과 같은, 방향족성, 폴리옥시알킬렌; 인지질을 포함하는 지질; 아미노산; 탄수화물; 펩티드; 또는 콜레스테롤; 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 이탈기이다. 일실시형태에서, 화합물은 5'-포스포에테르 지질 또는 5'-에테르 지질로서 투여된다.

    R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 직쇄, 분지 또는 사이클릭 알킬(저급 알킬 포함), 알케닐, 또는 알키닐, CO-알킬, CO-알케닐, CO-알키닐, CO-아릴 또는 헤테로아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 술포닐, 알킬술포닐, 아릴술포닐, 아르알킬술포닐이다)
33. 제 32항에 있어서,

    상기 투여 투약 계획은 2주 이상 반복되는 것을 특징으로 하는 종양 또는 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 용도.
34. 제 32항에 있어서,

    상기 투여 투약 계획은 3주 이상 반복되고, 상기 3주 기간 후에 약물이 투여되지 않는 1주 기간이 이어지는 것을 특징으로 하는 종양 또는 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 용도.
35. 제 32항에 있어서,

    상기 투여 투약 계획은 투여 사이클을 나타내는 것을 특징으로 하는 종양 또는 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 용도.
36. 제 32항에 있어서,

    상기 투여 사이클은 2회 이상 반복되는 것을 특징으로 하는 종양 또는 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 용도.
37. 제 36항에 있어서,

    상기 투여 사이클은 암의 퇴행이 달성될 때까지 반복되는 것을 특징으로 하는 종양 또는 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 용도.
38. 제 26항, 제 32항 또는 제 36항에 있어서,

    상기 약물이 정맥 내 투여되는 것을 특징으로 하는 종양 또는 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 용도.
39. 제 26항, 제 32항 또는 제 36항에 있어서,

    상기 대상은 암종, 육종, 림프종, 백혈병 또는 골수종으로 진단된 것을 특징으로 하는 종양 또는 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 용도.
40. 제 26항, 제 32항 또는 제 36항에 있어서,

    상기 포유동물은 인간인 것을 특징으로 하는 종양 또는 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 용도.
41. 제 26항, 제 32항 또는 제 36항에 있어서,

    상기 화합물은 화학식 IB의 화합물:

    [화학식 IB]

    

    인 것을 특징으로 하는 종양 또는 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 용도.
42. 제 26항, 제 32항 또는 제 36항에 있어서,

    상기 화합물은 화학식 IIA의 화합물:

    [화학식 IIA]

    

    인 것을 특징으로 하는 종양 또는 암을 치료하기 위한 상기 화합물의 용도.

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