ES2629682T3 - Tratamiento efectivo de tumores y cáncer con fosfato de triciribina - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de la fórmula:**Fórmula** para uso en un método para el tratamiento de un tumor o cáncer en un mamífero, en el que el tumor o cáncer sobreexpresa quinasa Akt.
Description
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DESCRIPCION
Tratamiento efectivo de tumores y cancer con fosfato de triciribina Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional Estadounidense No. 60/557,599, presentada el 29 de marzo de 2004.
Campo tecnico
Esta solicitud proporciona regfmenes terapeuticos particulares de fosfato de triciribina y composiciones con toxicidad reducida para el tratamiento de tumores, y cancer.
Antecedentes
El cancer es un crecimiento anormal de celulas. Las celulas de cancer se reproducen rapidamente a pesar de la restriccion de espacio, nutrientes compartidos por otras celulas, o senales enviadas desde el cuerpo para detener la reproduccion. Las celulas de cancer a menudo tienen una forma diferente a las celulas sanas, no funcionan adecuadamente, y se pueden propagar en muchas areas del cuerpo. Los crecimientos anormales de tejido, llamados tumores, son grupos de celulas que son capaces de crecer y dividirse de manera incontrolable. Los tumores pueden ser benignos (no cancerosos) o malignos (cancerosos). Los tumores benignos tienden a crecer lentamente y no se propagan. Los tumores malignos pueden crecer rapidamente, invadir y destruir los tejidos normales adyacentes, y propagarse por todo el cuerpo.
Los canceres se clasifican de acuerdo con el tipo de fluido o tejido del que se originan, o de acuerdo con la ubicacion en el cuerpo donde se desarrollaron por primera vez. Adicionalmente, algunos tipos de cancer son de tipo mixto. Los canceres se pueden agrupar en cinco grandes categonas, carcinomas, sarcomas, linfomas, leucemias y mielomas, que indican las clasificaciones del cancer en tejidos y sangre. Los carcinomas son canceres que se encuentran en el tejido corporal conocido como el tejido epitelial que cubre o reviste las superficies de los organos, glandulas, o estructuras corporales. Por ejemplo, un cancer del revestimiento del estomago se llama un carcinoma. Muchos carcinomas afectan a los organos o glandulas que estan involucrados con la secrecion, tales como los senos que producen leche. Los carcinomas representan aproximadamente el ochenta a noventa por ciento de todos los casos de cancer. Los sarcomas son tumores malignos que crecen de los tejidos conjuntivos, tales como cartftago, grasa, musculo, diezdones y huesos. El sarcoma mas comun, un tumor en el hueso, usualmente ocurre en adultos jovenes. Ejemplos de sarcoma incluyen osteosarcoma (hueso) y condrosarcoma (cartftago). El linfoma se refiere a un cancer que se origina en los nodos o glandulas del sistema linfatico, cuyo trabajo es producir celulas blancas de la sangre y fluidos corporales limpios, o en organos tales como el cerebro y mama. Los linfomas se clasifican en dos categonas: linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin. La leucemia, tambien conocida como cancer de sangre, es un cancer de la medula osea que retiene la medula osea de producir celulas y plaquetas de sangre roja y blanca normales. Las celulas blancas de sangre son necesarias para resistir la infeccion. Las celulas rojas de sangre son necesarias para prevenir la anemia. Las plaquetas conservan facilmente al cuerpo libre de hematomas y sangrado. Ejemplos de leucemia incluyen leucemia mielogena aguda, leucemia mielogena cronica, leucemia linfocftica aguda, y leucemia linfocftica cronica. Los terminos mieloide y linfocftica indican el tipo de celulas que estan involucradas. Finalmente, los mielomas crecen en las celulas plasmaticas de la medula osea. En algunos casos, las celulas de mieloma se acumulan en un hueso y forman un tumor unico, llamado plasmacitoma. Sin embargo, en otros casos, las celulas de mieloma se acumulan en muchos huesos, formando muchos tumores oseos. Esto se conoce como mieloma multiple.
La induccion y progresion del tumor a menudo son el resultado de cambios acumulados en el genoma de la celula de tumor. Dichos cambios pueden incluir la inactivacion de genes que inhiben el crecimiento celular, o genes supresores de tumor, asf como la activacion de genes u oncogenes que promueven el crecimiento de celulas. Se han identificado cientos de oncogenes celulares activados hasta la fecha en modelos animales, sin embargo, solo una pequena minona de estos genes han demostrado ser importantes para los canceres humanos (Weinberg et al 1989 Oncogenes and the Molecular Origins of Cancer Cold Spring Harbor, NY, Stanbridge and Nowell 1990 Cell 63 867-874, Godwin et al 1992 Oncogenes and antioncogenes in gynecological malignancies. In WJ Hoskins, CA Perez and RC Young (eds), Gynecological oncology: principles and practice, pp 87-116, Lippincott, Filadelfia). La activacion de oncogenes en los canceres humanos puede resultar de factores tales como el aumento del numero de copias del gen o cambios estructurales. Estos factores pueden provocar numerosos efectos celulares, por ejemplo, pueden dar lugar a sobreexpresion de un producto genico. Se pueden activar diversos oncogenes implicados en el cancer humano a traves de sobreexpresion de genes.
Se ha hecho evidente que las aberraciones geneticas sucesivas adquiridas por las celulas de cancer resultan en defectos en los circuitos de transduccion de senales reguladoras que regulan la proliferacion normal de las celulas, diferenciacion y muerte celular programada (Hanahan, D. and R.A. Weinberg, Cell, 2000. 100(1): p. 57-700). Esto a su vez resulta en defectos fundamentales en la fisiologfa celular que dictan malignidad. Estos defectos incluyen: a) autosuficiencia en las senales de crecimiento (es decir, sobreexpresion de tirosina quinasas receptoras del factor de
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crecimiento tales como EGFR y activacion aberrante de las rutas de transduccion de senal en direccion 3' tales como Ras/Raf/Mek/Erk1^ y Ras/PI3K/Akt), b) resistencia a las senales de anti-crecimiento (es decir, inferior expresion de TGFp y su receptor), c) evadir la apoptosis (es decir, la perdida de p53 proapoptotico; sobreexpresion de pro-supervivencia Bc1-2; hiperactivacion de las rutas de supervivencia tales como las mediadas por PI3K/Akt), d) angiogenesis sostenida (es decir, altos niveles de secrecion de VEGF) y f) invasion y metastasis de tejido (es decir, proteasas extracelulares e integrinas prometastasicas) (Hanahan, D. and R.A. Weinberg, Cell, 2000. 100(1): p. 57700).
Las tirosina quinasas receptoras tales como EGFR, ErbB2, VEGFR y factor de crecimiento similar a la insulina I receptor (IGF-1R) estan mtimamente involucradas en el desarrollo de muchos canceres humanos que incluyen canceres pancreatico, colorrectal, de mama y de ovario (Khaleghpour, K., et al. Carcinogenesis, 2004. 25(2): p. 2418.; Sekharam, M., et al., Cancer Res, 2003. 63(22): p. 7708-16). La union de ligandos tales como EGF, vEGf y IGF- 1 a sus receptores promueve la estimulacion de la actividad intrmseca de tirosina quinasa, autofosforilacion de tirosinas espedficas en el dominio citoplasmico de los receptores y reclutamiento de protemas de senalizacion que activan una variedad de rutas de transduccion de senal complejas Olayioye, M.A., et al., Embo J, 2000. 19(13): p. 3159-67, Porter, A.C. and R.R. Vaillancourt, Oncogene, 1998. 17(11 Reviews): p. 1343-52). Estas a su vez conducen a la activacion de muchas rutas de supervivencia de tumor y oncogenicas tales como las rutas Ras/Raf/Mek/Erk1^, JAK/STAT3 y de PI3K/Akt. Aunque se han implicado las tres rutas en la oncogenesis de colon, pancreas, mama y de ovario, aquellas que estan mediadas por Akt han mostrado ser cruciales en muchas etapas de la transformacion maligna, que incluyen proliferacion celular, anti-apoptosis/supervivencia, invasion y metastasis y angiogenesis angiogenesis (Datta, S.R.et al. Genes Dev, 1999. 13(22): p. 2905-27).
La Akt es una protema serina/treonina quinasa (tambien conocida como PKb), que tiene 3 miembros de la familia Akt1, Akt2 y Akt3. La estimulacion de las celulas con factores de crecimiento o supervivencia resulta en el reclutamiento a los receptores de la quinasa quinasa fosfoinositida-3-OH-quinasa de lfpido (PI3K), que fosforila fosfoinositol-4,5-bifosfato (PIP2) a PIP3 que recluta Akt a la membrana plasmatica donde puede ser activada mediante fosforilacion sobre Thr308 y Ser473 (Akt1), Thr308 y Ser474 (Akt2) y Thr308 y Ser472 (Akt3) (Datta, S.R.et al. Genes Dev, 1999. 13(22): p. 2905-27). Por lo tanto, la PI3K activa la Akt al fosforilar PIP2 y convertirla a PIP3. La fosfatasa PTEN desfosforila PIP3 a PIP2 y por lo tanto impide la activacion de Akt.
La mayona de los canceres humanos contienen Akt hiperactivada (Datta, S.R.et al. Genes Dev, 1999. 13(22): p. 2905-27, Bellacosa, A., et al., Int J Cancer, 1995. 64(4): p. 280-5; Sun, M., et al., Am J Pathol, 2001. 159(2): p. 4317). En particular, la Akt se sobreexpresa y/o hiperactiva en 57%, 32%, 27% y 36% de canceres colorrectal, pancreatico, de mama y de ovario humano, respectivamente (Roy, H.K., et al. Carcinogenesis, 2002. 23(1): p. 2015,. Altomare, D.A., et al., J Cell Biochem, 2003. 88(1): p. 470-6., Sun, M., et al., Cancer Res, 2001.61(16): p. 598591., Stal, O., et al. Breast Cancer Res, 2003. 5(2): p. R37-44, Cheng, J.Q., et al., Proc Natl Acad Sci utiliza, 1992. 89(19): p. 9267-71, Yuan, Z.Q., et al., Oncogene, 2000. 19(19): p. 2324-30). La hiperactivacion de Akt se debe a la amplificacion y/o sobreexpresion de Akt en sf mismo, asf como a alteraciones geneticas en direccion 5' de Akt que incluyen la sobreexpresion de tirosina quinasas receptoras y/o sus ligandos (Khaleghpour, K., et al. Carcinogenesis, 2004. 25(2): p. 241-8.; Sekharam, M., et al., Cancer Res, 2003. 63(22): p. 7708-16, Cohen, B.D., et al., Biochem Soc Symp, 1998. 63: p. 199-210., Muller, W.J., et al. Biochem Soc Symp, 1998. 63: p. 149-57, Miller, W.E., et al. J Virol, 1995. 69(7): p. 4390-8, Slamon, D.J., et al., Science, 1987. 235(4785): p. 177-82, Andrulis, I.L., et al., J Clin Oncol, 1998. 16(4): p. 1340-9) y la supresion de la fosfatasa PTEN. Se ha demostrado preclmicamente la prueba del concepto de la implicacion de Akt en la oncogenesis al mostrar que la expresion ectopica de Akt induce la transformacion maligna y promueve la supervivencia celular (Sun, M., et al. Am J Pathol, 2001. 159(2): p. 431-7, Cheng, J.Q., et al., Oncogene, 1997. 14(23): p. 2793-801) y que la interrupcion de las rutas de Akt inhibe el crecimiento celular e induce la apoptosis apoptosis (Jetzt, A., et al. Cancer Res, 2003. 63(20): p. 6697-706).
La triciribina ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de tumor o cancer con nivel elevado de Akt (Cancer Research, 64, 2004, paginas 4394-4399).
Los tratamientos actuales contra el cancer y enfermedades relacionadas tienen efectividad limitada y numerosos efectos secundarios no deseados graves. A pesar de la efectividad clmica demostrada de muchos farmacos contra el cancer, la toxicidad sistemica grave a menudo e detiene el desarrollo clmico de agentes quimioterapeuticos prometedores. Adicionalmente, la sobreexpresion de tirosina quinasas receptoras tales como EGFr y sus ligandos, tales como IGF-1, la sobreexpresion de Akt y/o perdida de PTEN (todos los cuales resultan en hiperactivacion de Akt) se asocian con un mal pronostico, resistencia a quimioterapia y tiempo de supervivencia corto de los pacientes con cancer. Las estrategias de investigacion actuales enfatizan la busqueda de modos terapeuticos eficaces con menos riesgo.
Triciribina
La accion anticancengena de triciribina (TCN, NSC-154202, 3-amino-1,5-dihidro-5-metil-1-p-ribofuranosil-1,4,5,6,8- pentaazaacenaftileno) y su ester de 5'-fosfato, fosfato de triciribina (TCN-P, NSC-280594) se identifico inicialmente en la decada de 1970 (Townsend & Milne (1975) Ann NY Acad Sci, 255: 92-103). La TCN-P era la entidad qrnmica avanzada en ensayos clmicos porque era mas soluble que el farmaco original. A principios de los anos ochenta, la
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TCN-P habfa mostrado actividad preclmica contra leucemias y carcinomas. A principios de los anos ochenta, la TCN-P ha^a sido identificada como un inhibidor de ADN, ARN y smtesis de protemas, lo que demuestra la selectividad hacia las celulas en la fase S del ciclo celular (Roti- Roti et al. 1978 Proc Am Assoc Cancer Res and ASCO 19:40). Tambien se ha propuesto que a diferencia de otros agentes antitumorales de nucleosidos en el momento, la TCN-P no es fosforilada mas alla del nivel del monofosfato y no se incorpora en polinucleotidos (Bennett et al 1978 Biochem Pharmacol 27: 233-241, Plagemann JNCI 1976 57: 1283-1295). Tambien se establecio que in vivo, la TCN-P se desfosforila a TCN mediante una enzima de plasma y mediante ecto-5'-nucleotidasa celular. Dentro de las celulas, la TCN se puede refosforila a TCN-P mediante la adenosina quinasa (Wotring et al 1981 Proc Am Assoc Cancer Res 22: 257, Basseches et al J Chromatogr 1982 233:. 227-234).
En 1982, la TCN-P se introdujo en la Fase I de ensayos clmicos por Mittelman y colegas en veinte pacientes con tumores malignos avanzados resistentes Mittelman et al. 1983 Cancer Treat Rep 67: 159-162). La TCN-P se administro como una infusion intravenosa (iv) durante quince minutos una vez cada tres semanas en dosis de 25 a 350 mg/m2. Los pacientes en el estudio fueron diagnosticados con cancer de mama, de cabeza/cuello, pulmon, pancreas, tiroides, melanoma o cancer indeterminado. Solo se encontraron respuestas terapeuticas limitadas y fue evidente una toxicidad significativa. El grupo de Mittelman concluyo que no se justificaban ensayos clmicos adicionales que empleen su esquema de dosificacion, pero insto a otros grupos para examinar los efectos de TCNP en ciertos tipos especfticos de cancer. Tambien en 1983, Lu et al. (ASCO Abstracts, Farmacologfa Clmica, p 34 C- 133) examinaron la farmacologfa clmica de TCN en los pacientes que recibieron 30-40 mg/m2 por via intravenosa mediante infusion continua durante cinco dfas. Lu et al. reporto que la TCN contribuyo a la toxicidad del hftgado y la anemia y sugirio que los pacientes deben ser monitorizados para detectar estas toxicidades.
Cobb et al (Cancer Treat Reports 1983 67:173) informo de la actividad de TCN-P contra explantes quirurgicos de tumores humanos en el ensayo de capsula subrenal de seis dfas en ratones. Examinaron ochenta tipos de tumores que representaban mama, pulmon, colon, ovario y cuello uterino. Cobb et al informaron de que la TCN produce tasas de respuesta uniforme en los diferentes tumores, que van desde 21% (de mama) hasta 88% (cervical).
Tambien se reporto otra Fase I por Feun et al. en 1984 (Cancer Research 44 (8) 3608-12). Feun et al administraron 10, 20, 30, y/o 40 mg/m2 por via intravenosa mediante infusion continua durante cinco dfas, cada tres a cuatro o seis semanas. Los pacientes en el estudio habfan sido diagnosticados con cancer de colon, sarcoma, melanoma, de pulmon o “otro” cancer. Feun et al. reporto que se observo toxicidad significativa, que incluye hiperglucemia, hepatotoxicidad y trombocitopenia. Los autores recomendaron un esquema para la Fase lI de ensayos clmicos de 20 mg/m2 por dfa durante cinco dfas durante seis semanas y tambien se recomienda debido a la toxicidad que los pacientes deben ser estrechamente monitorizados para funcion hepatica y pancreatica, y que se deben excluir pacientes con diabetes, disfuncion hepatica o metastasis hepatica masiva.
En 1986, Schilcher et al. (Cancer Research 1986 46: 3147-3151) reporto de los resultados de la evaluacion Fase I de TCN-P utilizando un regimen intravenoso semanal. El estudio se realizo en veinticuatro pacientes con canceres solidos avanzados a traves de una inyeccion intravenosa lenta durante cinco minutos en los dfas 1, 8, 15 y 22 de un ciclo de 42 dfas con un descanso de dos semanas. Se estudiaron cinco niveles de dosis de 12 a 96 mg/m2 con 3 a 12 pacientes tratados en cada nivel con un total de 106 dosis administradas. Los pacientes en el estudio se han diagnosticado con cancer de colon, recto, vejiga, suprarrenales, ovarios, pancreas, sarcoma, melanoma, pulmon u “otro” cancer. Schilcher et al. concluyeron.
“Este esquema semanal produce toxicidad clmica inesperada y no se debe perseguir”.
“En este momento nuestro grupo no recomienda llevar a cabo mas estudios con TCN-P dada en esquemas semanales o intermitentes. Un futuro estudio de fase I-II, que utiliza un regimen diferente (por ejemplo, una sola aplicacion una vez al mes) se podna reanudar si la TCN-P demuestra una pronunciada actividad in vitro contra tumores pancreatico primario y hepaticos resistente terapeutico”.
En 1986, Powis et al (Cancer Treatment Reports 70: 359-362) reportaron la disposicion de la TCN-P en la sangre y el plasma de pacientes durante la Fase I y II de los ensayos clmicos. El ensayo de fase I emplea una dosis diaria de 24-55 mg/m2 durante 5 dfas, mientras que el ensayo clmico de fase II emplea una dosis unica de 250 mg/m2. Powis et al no identifico una correlacion entre los parametros farmacocineticos de TCN-P y la toxicidad de TCN-P.
A finales de 1980, principios de 1990, la TCN-P avanzo a la Fase II de los ensayos de metastasis de adenocarcinoma colorrectal, el cancer de pulmon de celulas no microcfticas, carcinoma epidermoide denominado avanzado del cuello uterino y cancer de mama metastasico. En 1987, O'Connell et al. (Cancer Treat Reports 71, No. 3, 333-34) publico los resultados de un ensayo de Fase II en pacientes con adenocarcinoma colorrectal metastasico. A los pacientes se les administro 165 o 250 mg/m2 de TCN-P iv durante 15 minutos una vez a la semana en intervalos de tres semanas. O'Connell et al. concluyeron que los ensayos muestran una falta de utilidad clmica de TCN-P en el tratamiento de pacientes con adenocarcinoma colorrectal metastasico. Adicionalmente, en 1991, Lyss, et al., (Proc Annu Meet Am Soc Clin Oncol, (1996) 15 A1151) reportaron los resultados preliminares de un ensayo de la administracion de 35 mg/m2 por dfa durante cinco dfas una vez cada seis semanas a los pacientes con cancer de pulmon de celulas no microcfticas avanzado.
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Feun et al. (Am J Clin Oncol 1993 16: 506-508) reportaron los resultados de un ensayo de fase II de TCN-P en pacientes con carcinoma de celulas epidermoides del cuello uterino avanzado. Una infusion continua de 5 dfas de por lo menos 35 mg/m2 se repitio cada seis semanas. Entre los veintiun pacientes evaluables, se observaron solo dos respuestas. Fuen et al. concluyeron que “la utilizacion de TCN-p en esta dosis y esquema, parece diezer una actividad limitada en cancer de cuello uterino de celulas epidermoides metastasico o recurrente”.
En 1996, Hoffman et al (Cancer Chemother Pharmacol 37: 254-258) reportaron los resultados de un estudio de fase I-II de TCN-P para el cancer de mama metastasico. En un estudio, catorce pacientes fueron tratados con 20 mg/m2 por dfa a traves de infusion continua durante cinco dfas cada seis semanas. Cuando los autores no observaron una respuesta a esta dosis, la dosis se aumento a por lo menos 35 mg/m2 utilizando el mismo esquema de 5 dfas de infusion continua. Hoffman et al concluyeron que “la TCN es inefectiva en todas las dosis ensayadas y en dosis mayores que o iguales a 35 mg/m2 tiene efectos toxicos inaceptables”.
Por lo tanto, la combinacion de efectividad limitada y toxicidad inaceptable impide el desarrollo clmico adicional de TCN-P y compuestos relacionados.
El documento WO 03/079748 otorgado a los Regentes de la Universidad de California describen ciertos inhibidores de ZNF217, tales como triciribina, en combinacion con agentes quimioterapeuticos adicionales, tales como doxorrubicon.
Es un objeto de la presente invencion proporcionar la administracion de fosfato de triciribina y composiciones con toxicidad reducida para el tratamiento de tumores, cancer y otros trastornos asociados con la proliferacion celular anormal.
Es otro objeto de la presente invencion proporcionar metodos mejorados para tratar tumores o cancer en el sujeto con fosfato de triciribina.
Resumen de la invencion
La presente invencion proporciona regfmenes terapeuticos novedosos de fosfato de triciribina para tratar tumores o cancer en un sujeto mientras que se limita la toxicidad sistemica. La invencion se basa sobre el descubrimiento de que los tumores o canceres que sobrexpresan quinasa Akt son particularmente sensibles a los efectos citotoxicos de TCN y los compuestos relacionados. Los inventores han determinado, contrario a la tecnica anterior y experiencia, como utilizar con exito triciribina para tratar tumores y cancer mediante uno o una combinacion de (i) administracion de triciribina solo a pacientes que de acuerdo con una prueba de diagnostico descrita adelante, exhiben sensibilidad mejorada al farmaco; (ii) uso de un nivel de dosificacion descrito que minimiza la toxicidad de el farmaco pero aun asf exhibe eficacia; o (iii) uso de un regimen de dosificacion descrito que minimiza la toxicidad de el farmaco.
En un aspecto de la presente invencion, se proporcionan los metodos para identificar tumores y canceres que sean particularmente susceptibles a los efectos toxicos del TCN-P. En una realizacion, se proporcionan metodos para tratar un tumor en un marnffero, particularmente un humano, que incluye (i) obtener una muestra biologica del tumor; (ii) determinar si el tumor sobreexpresa una quinasa Akt, y (iii) tratar el tumor que sobreexpresa quinasa Akt con fosfato de triciribina.
En una realizacion, se puede determinar el nivel de expresion de quinasa Akt al ensayar el tumor o cancer para presencia de una quinasa Akt fosforilada, por ejemplo, al utilizar un anticuerpo que puede detectar la forma fosforilada. En otra realizacion, el nivel de expresion Akt se puede determinar al ensayar una celula de tumor o cancer obtenida de un sujeto y comparar los niveles a un tejido de control. En ciertas realizaciones, la Akt se puede sobreexpresar por lo menos 2, 2.5, 3 o 5 veces en la muestra de cancer comparada con el control. En ciertas realizaciones, la quinasa Akt sobreexpresada puede ser una quinasa Akt hiperactivada y fosforilada.
En otro aspecto de la presente invencion, se proporcionan regfmenes de dosificacion que limitan los efectos secundarios toxicos del fosfato de TCN. En una realizacion, dichos regfmenes de dosificacion minimizan o eliminan los efectos secundarios toxicos, que incluyen, hepatoxicidad, trombocitopenia, hiperglicemia, vomito, hipocalcemia, anemia, hipoalbunemia, mielosupresion, hipertrigliceridemia, hiperamilasemia, diarrea, estomatitis y/o fiebre. En otra realizacion, la administracion de TCN-P proporciona por lo menos una respuesta parcial, tal como por lo menos 15, 20 o 30%, o respuesta completa in vivo en por lo menos 15, 20, o 25% de los sujetos.
En una realizacion, se proporciona un tratamiento para un sujeto que se ha diagnosticado con un tumor al administrar al sujeto una cantidad efectiva de TCN-P de acuerdo con un esquema de dosificacion que incluye administrar el farmaco aproximadamente una vez por semana durante aproximadamente tres semanas seguido por un periodo de una semana en el que no se administra el farmaco. En otra realizacion, se proporcionan tratamientos de un tumor o cancer en un sujeto al administrar al sujeto un regimen de dosificacion de 10 mg/m2 o menos de TCN- P una vez por semana. En una realizacion, el compuesto se puede administrar como una dosis de unico bolo durante un corto periodo de tiempo, por ejemplo, aproximadamente 5, 10 o 15 minutos. En realizaciones adicionales, se proporcionan esquemas de dosificacion en los que los compuestos se administran a traves de infusion continua
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durante por lo menos 24, 48, 72, 96, o 120 horas. En ciertas realizaciones, la administracion continua se puede repetir por lo menos una vez una semana, una vez cada dos semanas y/o una vez un mes. En otras realizaciones, los compuestos se pueden administrar por lo menos una vez cada tres semanas. En realizaciones adicionales, los compuestos se pueden administrar por lo menos una vez al dfa durante por lo menos 2, 3, 4 o 5 dfas.
En realizaciones adicionales, se puede administrar TCN-P a pacientes en una cantidad que es efectiva en provocar regresion de tumor. La administracion de TCN-P puede proporcionar por lo menos una respuesta parcial, tal como por lo menos 15, 20 o 30%, o respuesta completa in vivo en por lo menos 15-20% de los sujetos. En ciertas realizaciones, por lo menos 2, 5, 10, 15, 20, 30 o 50 mg/m2 de un compuesto divulgado aqrn se puede administrar a un sujeto. La administracion del compuesto se puede realizar de acuerdo con cualquera de los regfmenes terapeuticos divulgados aqrn. En realizaciones particulares, el regimen de dosificacion puede incluir administrar menos de 20 mg/m2 de TCN-P. En una realizacion, menos de 10 mg/m2 de TCN-P se puede administrar una vez una semana. En realizaciones adicionales, dosificaciones de o menos de 2 mg/m2, 5 mg/m2, 10 mg/m2, y/o 15 mg/m2 de TCN-P se puede administrar a un sujeto. En otra realizacion, menos de 10 mg/m2 se puede administrar a un sujeto a traves de infusion continua durante por lo menos cinco dfas. En realizaciones particulares, se puede utilizar TCN-P para el tratamiento de pancreatico, cancer de prostata, colorrectal y/o de ovario.
En una realizacion, se pueden utilizar los compuestos y/o regfmenes terapeuticos de la presente invencion para evitar y/o tratar un carcinoma, sarcoma, linfoma, leucemia, y/o mieloma. En otras realizaciones de la presente invencion, se pueden utilizar los compuestos divulgados aqrn para tratar tumores solidos. En realizaciones aun adicionales, se pueden utilizar los compuestos y composiciones divulgadas aqrn para el tratamiento de un tumor o cancer, tal como, para cancer de los siguientes organos o tejidos: mama, prostata, hueso, pulmon, colon, que incluyen pero no se limitan a colorrectal, urinario, vejiga, linfoma no Hodgkin, melanoma, rinon, renal, pancreas, faringe, tiroides, estomago, cerebro, y/o ovarios. En realizaciones particulares, se puede utilizar TCN-P para el tratamiento de cancer pancreatico, de mama, colorrectal y/o de ovario. En realizaciones adicionales de la presente invencion, se pueden utilizar los compuestos divulgados aqrn en el tratamiento de enfermedades relacionadas con angiogenesis. En ciertas realizaciones, se proporcionan metodos para tratar leucemia a traves infusion continua de TCN-P mediante infusion continua durante por lo menos 24, 48, 72 o 96 horas. En otras realizaciones, se puede repetir la infusion continua, por ejemplo, por lo menos una vez cada dos, tres o cuatro semanas.
En una realizacion particular, se proporciona un tratamiento de tumores, cancer, y otros trastornos asociados con una proliferacion celular anormal en un anfitrion, el tratamiento comprende administrar al anfitrion una cantidad efectiva de un compuesto divulgado aqrn opcionalmente en combinacion con un portador farmaceuticamente aceptable.
En un aspecto, los compuestos y composiciones se pueden administrar en combinacion o alternacion con por lo menos un agente quimioterapeutico adicional. Los farmacos pueden formar parte de la misma composicion, o se puede proporcionar como una composicion separada para administracion al mismo tiempo o un tiempo diferente. En una realizacion, las composiciones de la invencion se pueden combinar con agentes antiangiogenicos. En otras realizaciones de la presente invencion, se pueden utilizar los compuestos y composiciones divulgadas aqrn en combinacion o alternacion con los siguientes tipos de farmacos, que incluyen, farmacos antiproliferativos, agentes antimitoticos, farmacos antimetabolitos, agentes alquilantes o mostazas de nitrogeno, farmacos que se dirigen a topoisomerasas, farmacos que se dirigen a transduccion de senales en celulas de tumor, terapia genica y agentes antisentido, productos terapeuticos de anticuerpo, esteroides, analogos de esteroides, farmacos antiemeticos y/o agentes no esteroides.
En otras realizaciones, se puede utilizar TCN-P para tratar tumores o canceres resistentes a uno o mas farmacos, que incluyen las realizaciones de tumores o canceres y farmacos divulgados aqrn. En una realizacion, la TCN-P se administra en una cantidad efectiva para el tratamiento de un paciente con un tumor o cancer resistente a farmaco, por ejemplo, tumores o cancer resistentes a multiples farmacos, que incluyen aquellos resistentes a taxol, rapamicina, tamoxifen, cisplatino, y/ o gefitinib (iressa). En una realizacion, la tCN-P se puede administrar con un agente quimioterapeutico adicional que puede ser un inhibidor de P-glicoprotema, tal como verapamilo, ciclosporina (tal como ciclosporina A), tamoxifen, antagonistas de calmodulina, dexverapamilo, dexniguldipina, valspodar (PSC 833), biricodar (VX-710), tariquidar (XR9576), zosuquidar (LY335979), laniquidar (R101933), y/o ONT-093.
En ciertas realizaciones, se proporciona un tratamiento que incluye administrar a un anfitrion en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un compuesto divulgado aqrn, o composicion farmaceutica que comprende el compuesto, en una cantidad efectiva para el tratamiento de tumores cancer.
En una realizacion, se proporciona un tratamiento de un tumor o cancer que incluye una cantidad efectiva de un compuesto divulgado aqrn, o una sal, del mismo, a un individuo en necesidad del mismo, en el que el cancer es por ejemplo, carcinoma, sarcoma, linfoma, leucemia, o mieloma. El compuesto, o sal del mismo, opcionalmente se proporciona en una composicion farmaceuticamente aceptable que incluye los portadores adecuados, tales como agua, que se formula para la ruta deseada de administracion a un individuo en necesidad del mismo. Opcionalmente el compuesto se administra en combinacion o alternacion con por lo menos un agente terapeutico adicional para el tratamiento de tumores o cancer.
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Tambien dentro del alcance de la invencion esta el uso de un compuesto divulgado aqu o una sal del mismo en el tratamiento de un tumor o cancer, opcionalmente en un portador farmaceuticamente aceptable; y el uso de un compuesto divulgado aqu o una sal del mismo en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de cancer o tumor, opcionalmente en un portador farmaceuticamente aceptable.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 demuestra la identificacion de API-2 (triciribina) como un candidato de inhibidor de Akt del Grupo de Diversidad NCI. A ilustra la estructura qmmica de API-2 (triciribina). B demuestra que la API-2 inhibe los niveles de fosforilacion de AKT2 en celulas NIH3T3 transformadas por AKT2. Mientras que las celulas del tipo NIH3T3 transformadas por AKT2 se trataron con API-2 (1 M) durante las veces indicadas y se sometieron a analisis de inmunotransferencia con anticuerpo anti-fosfo-Akt-T308 y -S473 (paneles superior y medio). El panel inferior muestra expresion de AKT2 total. En C, se muestra que API-2 inhibe tres isoformas de Akt. Se transfectan celulas HEK293 con HA-Akt1, -AKT2 y -AKT3 y se tratan con API-2 (1 uM) o wortmanina (15 uM) antes de estimulacion con EGF, las celulas se lisaron e inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-HA. Los inmunoprecipitados se sometieron a ensayo de quinasa in vitro (superior) y analisis de inmunotransferencia con anticuerpo anti-fosfo-Akt-T308 (inferior). El panel de la mitad muestra expresion de Akt, AKT2 y AKT3 transfectada. D ilustra que API-2 no inhibe Akt in vitro. Ensayo de quinasa in vitro de la protema recombinante de AKT2 constitutivamente activa en un regulador de quinasa que contiene 1 uM de API-2 (lane 3).
La Figura 2 demuestra que la API-2 no inhibe PI3K, PDK1 y los elementos cercanamente relacionados de la familia de quinasas AGC. A demuestra un ensayo de quinasa PI3K in vitro. Las celulas HEK293 se privaron de suero y se trataron con API-2 (1 uM) o wortmanina (15 uM) durante 30 minutos antes de estimulacion con EGF. Las celulas se lisaron e inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-p110aa. Se sometieron los inmunoprecipitados a ensayo de quinasa in vitro utilizando PI-4-P como sustrato. B ilustra el efecto de API-2 sobre activacion de PDK1 in vitro (panel superior), los drculos cerrados muestran inhibicion mediante API-2. Los drculos abiertos muestran inhibicion por la estaurosporina de control positivo, que es un inhibidor de PDK1 potente (IC50 = 5 nM). Los paneles inferiores son analisis de inmunotransferencia de celulas HEK293 que se transfectan con Myc-PDK1 y se tratan con wortmanina o API-2 antes de estimulacion con EGF. Se detectan las inmunotransferencias con anticuerpos indicados. C ilustra un analisis de de niveles de fosforilacion de PKCa con anticuerpos anti-fosfo-PKCa-T638 (superior) y PKCa total (inferior) luego de tratamiento con API-2 o un inhibidor PKC no selectivo Ro31-8220. D muestra un ensayo de quinasa SGK in vitro. Las celulas HEK293 se transfectan con HA-SGK y se tratan con API-2 o wortmanina antes de estimulacion con EGF. Se desarrolla quinasa in vitro con inmunoprecipitados HA-SGK utilizando MBP como sustrato (superior). El panel inferior muestra la expresion de HA-SGK transfectado. E ilustra los resultados de un ensayo de quinasa PKA. Se incubo PKA inmunipurificado en regulador ADB (Upstate Biotechnology Inc) que contiene los inhibidores indicados (API-2 o PKAI) y el sustrato Kemptide. La actividad de quinasa se cuantifico. En F, se muestra una inmunotransferencia. Se trataron celulas OVCAR3 con API-2 durante las veces indicadas. Se inmunotrasfirieron los lisatos celulares con los anti-fosfo-anticuerpos indicados (paneles 1-4) y anticuerpo anti-actina (inferior).
La Figura 3 demuestra que API-2 inhibe actividad Akt y crecimiento celular e induce apoptosis en celulas de cancer humanas con Ak-t elevada. A es una inmunotransferencia, luego de tratamiento con API-2, se detectan niveles de fosforilacion de Akt con anticuerpo anti-fosfo-Akt-T308 en las estirpes de celulas de cancer humanas. Las transferencias se volvieron a sondear con anticuerpo Akt anti-total (paneles inferiores). En B, se muestra un ensayo de proliferacion celular. Las estirpes celulares como se indican en la Figura se trataron con diferentes dosis de API-2 durante 24 h y 48 h y luego se analizan con kit de Ensayo de Proliferacion de Celulas CellTiter 96 (Promega). C proporciona un analisis de apoptosis. Se trataron las celulas con API-2 y se tineron con annexina V y PI y se analizaron mediante FACScan.
La Figura 4 muestra que la API-2 inhibe objetivos en direccion 3' de Akt y exhibe actividad antitumoral en estirpes celulares de cancer con Akt elevada en xenoinjerto de raton. En A, se demuestra que la API-2 inhibe fosforilacion Akt de tuberina, Bad, AFX y GSK-3p. Luego de tratamiento con API-2, celulas OVAR3 se lisaron y se inmunotrasfirieron con los anticuerpos indicados. B muestra que la API-2 inhibe el crecimiento de tumor. Se inyectaron celulas de tumor por via subcutanea en ratones sin pelo con bajo nivel de celulas Akt sobre el lado izquierdo y nivel elevado de celulas Akt sobre el lado derecho. Cuando los tumores alcanzan un tamano promedio de aproximadamente 100-150 mm3, se trataron los animales con ya sea vehfculo o 1 mg/kg/dfa de API-2. Cada medicion representa un promedio de 10 tumores. C ilustra una representacion de los ratones con xenoinjerto de OVCAR3 (derecha) y OVCAR5 (izquierda) tratado con API-2 o vehfculo (control). D muestra ejemplos de tamano (inferior) y peso (superior) de tumor al final del experimento. En E, se realiza analisis de inmunotransferencia de lisados de tumor con anticuerpos anti-fosfo-Akt-S473 (superior) y anti-AKT2 (inferior) en tumores derivados de OVCAR-3 que se trataron (T3 y T4) y no trataron (T1 y t2) con API-2.
La Figura 5 muestra que la API-2 (triciribina) inhibe actividad Akt de quinasa in vitro. El ensayo de quinasa in vitro se realizo con recombinante de PDK1 y Akt en un regulador que contiene fosfatidilinositol-3,4,5-P3 (PIP3), API-2 e histona H2B como sustrato. Despues de incubacion de 30 min, las reacciones se separaron mediante SDS-PAGE y se expusieron en una pelfcula.
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La Figura 6 proporciona el mARN y secuencia de aminoacidos de Akt1 humana, tambien se observaron sitios de enzima de restriccion.
La Figura 7 proporciona el mARN y secuencia de aminoacidos de Akt2 humana tambien se observaron sitios de enzima de restriccion.
La Figura 8 proporciona el mARN y secuencia de aminoacidos de Akt3 humana tambien se observaron sitios de enzima de restriccion.
Descripcion detallada
Los inventores han determinado, contrario a la tecnica anterior y experiencia, como utilizar de forma exitosa fosfato de triciribina para tratar tumores y cancer mediante una o una combinacion de (i) administrar fosfato de triciribina solo a pacientes que de acuerdo con una prueba de diagnostico descrita adelante, exhibir sensibilidad mejorada al farmaco; (ii) utilizar un nivel de dosificacion descrito que minimiza la toxicidad de el farmaco pero aun asf exhibe eficacia; o (iii) utilizar un regimen de dosificacion descrito que minimiza la toxicidad de el farmaco.
I. Compuestos
La presente invencion proporciona el uso de compuestos de TCN-P para uso en regfmenes terapeuticos particulares para el tratamiento de trastornos proliferativos, cuya estructura se muestra en la reivindicacion 1.
Se debe entender que el compuesto divulgado aqrn puede contener centros quirales. Dichos centros quirales pueden tener cualquier configuracion (R) o (S), o pueden ser una mezcla de las mismas. Por lo tanto, el compuesto proporcionado aqrn puede ser enantiomericamente puro, o ser mezclas estereoisomericas o diastereomericas. Se entiende que la divulgacion de un compuesto aqrn abarca cualquier forma racemica, opticamente activa, polimorfica, o estereoisomerica, o mezclas de las mismas, que posee preferiblemente las propiedades utiles descritas aqrn, siendo bien conocido en la tecnica como preparar formas opticamente activas y como determinar la actividad utilizando las pruebas estandar descritas aqrn, o utilizando otras pruebas similares que se conocen en la tecnica. Ejemplos de metodos que se pueden utilizar para obtener isomeros opticos de los compuestos incluyen los siguientes:
i) separacion ffsica de cristales - una tecnica mediante la cual los cristales macroscopicos de los enantiomeros individuales se separan manualmente. Esta tecnica se puede utilizar si existen cristales de los enantiomeros separados, es decir, el material es un conglomerado y los cristales son visualmente distintos;
ii) cristalizacion simultanea - una tecnica mediante la cual los enantiomeros individuales se cristalizan separadamente a partir de una solucion del racemato, posible solo si este es un conglomerado en el estado solido;
iii) resoluciones enzimaticas - una tecnica mediante la cual existe separacion parcial o completa de un racemato en virtud de diferentes tasas de reaccion para los enantiomeros con una smtesis enzimatica;
iv) smtesis asimetrica enzimatica - una tecnica sintetica por la cual por lo menos una etapa de la smtesis utiliza una reaccion enzimatica para obtener un precursor sintetico enantiomericamente puro o enriquecido del enantiomero deseado;
v) smtesis asimetrica qmmica - una tecnica sintetica mediante el cual el enantiomero deseado se sintetiza a partir de un precursor aquiral bajo condiciones que producen asimetna (es decir, quiralidad) en el producto, lo que se puede conseguir utilizando catalizadores quirales o auxiliares quirales;
vi) separaciones de un diastereomero - una tecnica mediante la cual se hace reaccionar un compuesto racemico con un reactivo enantiomericamente puro (el auxiliar quiral) que convierte los enantiomeros individuales a diastereomeros. Los diastereomeros resultantes luego mediante cromatograffa o cristalizacion en virtud de sus ahora mas claras diferencias estructurales y el auxiliar quiral se elimina mas tarde para obtener el enantiomero deseado;
vii) transformaciones asimetricas de primer y segundo orden - una tecnica mediante la cual los diastereomeros a partir del racemato se equilibran para producir una preponderancia en solucion del diastereomero a partir del enantiomero deseado o en el que la cristalizacion preferencial del diastereomero desde el enantiomero deseado perturba el equilibrio de tal manera que, eventualmente, en principio todo el material se convierte en el diastereomero cristalino a partir del enantiomero deseado. El enantiomero deseado luego se libera del diastereomero;
viii) resoluciones cineticas - esta tecnica se refiere al logro de resolucion parcial o completa de un racemato (o de una resolucion adicional de un compuesto parcialmente resuelto) en virtud de las velocidades de reaccion desiguales de los enantiomeros con un reactivo quiral, no racemico o un catalizador bajo condiciones cineticas;
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ix) smtesis enantioespedfica de precursores no racemicos - una tecnica sintetica mediante el cual el enantiomero deseado se obtiene a partir de materiales de partida no quirales y donde la integridad estereoqmmica no se compromete, o solo se compromete mmimamente durante el curso de la smtesis;
x) cromatograffa de lfquido quiral - una tecnica mediante la cual los enantiomeros de un racemato se separan en una fase movil lfquida en virtud de sus diferentes interacciones con una fase estacionaria. La fase estacionaria puede estar hecha de material quiral o la fase movil puede contener un material quiral adicional para provocar las diferentes interacciones;
xi) cromatograffa de gas quiral - una tecnica mediante la cual el racemato se volatiliza y los enantiomeros se separan en virtud de sus diferentes interacciones en la fase movil gaseosa con una columna que contiene una fase adsorbente quiral no racemica fija;
xii) extraccion con solventes quirales - una tecnica mediante la cual los enantiomeros se separan en virtud de la disolucion preferencial de un enantiomero en un solvente quiral particular;
xiii) transporte a traves de membranas quirales - una tecnica mediante la cual un racemato se coloca en contacto con una barrera de membrana fina. La barrera normalmente separa dos fluidos miscibles, uno que contiene el racemato y una fuerza de accionamiento tales como concentracion o presion diferencial que provoca transporte preferencial a traves de la barrera de la membrana. La separacion ocurre como resultado de la naturaleza quiral no racemica de la membrana que permite que solo pase a traves un enantiomero del racemato.
En algunas realizaciones, se proporciona fosfato de triciribina (TCN-P). La TCN se puede sintetizar mediante cualquier tecnica conocida por un experto en la tecnica, por ejemplo, como se describe en Tetrahedron Letters, vol. 49, pp. 4757-4760 (1971). La TCN-P se puede preparar mediante cualquier tecnica conocida para un experto en la tecnica, por ejemplo, como se describe en la Patente Estadounidense No. 4,123,524. La smtesis de TCN-DMF se describe, por ejemplo, en INSERM, vol. 81, pp. 37-82 (1978). Otros compuestos relacionados con TCN tal como se describe aqrn se pueden sintetizar, por ejemplo, de acuerdo con los metodos divulgados en Gudmundsson, K.S., et al., “Synthesis of carbocyclic analogs of 2',3'-dideoxysangivamycin, 2',3'-dideoxytoyocamycin, and 2',3'- dideoxytriciribine”, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 20(10-11):1823-1830 (Octubre-Noviembre 2001); Porcari, A.R., et al., “6-N-Acyltriciribine analogues: structure-activity relationship between acyl carbon chain length and activity against HIV-1”, J. Med. Chem., 43(12):2457-2463 (June 15, 2000); Porcari, A.R., et al., “Acyclic sugar analogs of triciribine: lack of antiviral and antiproliferative activity correlate with low intracellular phosphorylation”, Nucleosides Nucleotides, 18(11-12):2475-2497 (November-December 1999), Porcari, A.R., et al., “Deoxy sugar analogues of triciribine: correlation of antiviral and antiproliferative activity with intracellular phosphorylation”, J. Med. Chem., 43(12):2438-2448 (June 15, 2000), Porcari, A.R., et al., “Synthesis and antiviral activity of 2-substituted analogs of triciribine”, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 22(12):2171-2193 (December 2003), Porcari, A.R., et al., “An improved total synthesis of triciribine: a tricyclic nucleoside with antineoplastic and antiviral properties”, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 23(1-2):31-39 (2004), Schweinsberg, P.D., et al. “Identification of the metabolites of an antitumor tricyclic nucleoside (nSc-154020)”, Biochem. Pharmacol., 30(18):2521-2526 (September 15, 1981)., Smith, K.L., et al., “Synthesis of new 2'-beta-C-methyl related triciribine analogues as anti-HCV agents”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 14(13):3517-3520 (July 5, 2004), Townsend, L.B., et al., “The synthesis and biological activity of certain pentaazaacenaphthylenes, hexaazaacenaphthylenes and their corresponding nucleosides”, Nucleic Acids Symp. Ser., 1986(17):41-44 (1986), and/or Wotring, L.L., et al., “Mechanism of activation of triciribine phosphate (TCN-P) as a prodrug form of TcN”, Cancer Treat Rep., 70(4):491-7 (April 1986).
Sales farmaceuticamente aceptables
En los casos en que los compuestos son suficientemente basicos o acidos para formar sales acidas o basicas no toxicas estables, la administracion del compuesto como una sal farmaceuticamente aceptable puede ser apropiado. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las derivadas de bases y acidos inorganicos u organicos farmaceuticamente aceptables. Las sales adecuadas incluyen aquellas derivadas de metales alcalinos tales como potasio y sodio, metales alcalinoterreos tales como calcio y magnesio, entre numerosos otros acidos bien conocidos en la tecnica farmaceutica. En particular, ejemplos de sales farmaceuticamente aceptables son sales de adicion de acidos organicos formadas con acidos, que forman un anion fisiologicamente aceptable, por ejemplo, tosilato, metanosulfonato, acetato, citrato, malonato, tartrato, succinato, benzoato, ascorbato, a-cetoglutarato, y a- glicerofosfato. Tambien se pueden formar sales inorganicas adecuadas, que incluyen, sales de sulfato, nitrato, bicarbonato y carbonato.
Se pueden obtener las sales farmaceuticamente aceptables utilizando procedimientos estandar bien conocidos en la tecnica, por ejemplo al hacer reaccionar un compuesto suficientemente basico tal como una amina con un acido adecuado que proporciona un anion fisiologicamente aceptable. Tambien se pueden elaborar sales de metales alcalinos (por ejemplo, sodio, potasio o litio) o metales alcalinoterreos (por ejemplo calcio) de acidos carboxflicos.
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Definiciones
Como se utiliza aqm, los terminos “cancer” y “canceroso” se refieren o describen la condicion fisiologica en mamnferos que se caracteriza normalmente por un crecimiento celular no regulado, es decir, trastornos proliferativos. Ejemplos de dichos trastornos proliferativos incluyen canceres tales como carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia, asf como otros canceres divulgados aqm. Ejemplos mas particulares de dichos canceres incluyen cancer de mama, cancer de prostata, cancer de colon, cancer de celulas epidermoides, cancer de pulmon de celulas microcfticas, cancer de pulmon de celulas no microcfticas, cancer gastrointestinal, cancer pancreatico, cancer cervical, cancer de ovario, cancer de hugado, por ejemplo, carcinoma hepatico, cancer de vejiga, cancer colorrectal, carcinoma endometrial, cancer de rinon, y cancer de tiroides.
Otros ejemplos de cancer son carcinoma de celulas basales, cancer del tracto biliar; cancer de hueso; cancer del cerebro y SNC; coriocarcinoma; cancer de tejido conjuntivo; cancer de esofago; cancer de ojo; cancer de cabeza y cuello; cancer gastrico; neoplasia intraepitelial; laringe cancer; linfoma que incluye linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin; melanoma; mieloma; neuroblastoma; cancer de cavidad oral (por ejemplo, labio, lengua, boca y faringe); cancer de pancreas; retinoblastoma; rabdomiosarcoma; cancer de recto; cancer del sistema respiratorio; sarcoma; cancer de piel; cancer de estomago; cancer testicular; cancer uterino; cancer del sistema urinario, asf como otros carcinomas y sarcomas.
Como se utiliza aqm, el termino “tumor” se refiere a todo crecimiento y proliferacion celular neoplasica, ya sea celulas y tejidos malignos o benignos, y todos los precancerosos y cancerosos. Por ejemplo, un cancer particular se puede caracterizar por un tumor de masa solida. La masa de tumor solido, si esta presente, puede ser una masa de tumor primario. Una masa del tumor primario se refiere a un crecimiento de celulas de cancer en un tejido resultante de la transformacion de una celula normal de ese tejido. En la mayona de los casos, la masa del tumor primario se identifica por la presencia de un quiste, que se puede encontrar a traves de metodos visuales o palpacion, o por la irregularidad en la forma, la textura o el peso del tejido. Sin embargo, algunos tumores primarios no son palpables y se pueden detectar solo a traves de tecnicas de formacion de imagenes medicas tales como rayos X (por ejemplo, mamograffa), o mediante aspiraciones con aguja. El uso de estas ultimas tecnicas es mas comun en la deteccion temprana. El analisis molecular y fenotfpico de las celulas de cancer dentro de un tejido por lo general confirmar si el cancer es endogeno al tejido o si la lesion se debe a metastasis de otro sitio.
El termino alquilo, como se utiliza aqm, a menos que se especifique lo contrario, incluye un hidrocarburo saturado, recto, ramificado, o dclico, primario, secundario, o terciario de por ejemplo de C1 a C24, e incluye espedficamente metilo, trifluorometilo, etilo, propilo, isopropilo, ciclopropilo, butilo, isobutilo, t-butilo, pentilo, ciclopentilo, isopentilo, neopentilo, hexilo, isohexilo, ciclohexilo, ciclohexilmetilo, 3-metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo, y 2,3-dimetilbutilo. El alquilo esta opcionalmente sustituido, por ejemplo, con uno o mas sustituyentes tales como halo (F, Cl, Br o I), (por ejemplo, CF3, 2-Br-etilo, CH2F, CH2Cl2 CH2CF3 o CF2CF3), hidroxilo (por ejemplo, CH2OH), amino (por ejemplo, CH2NH2, CH2NHCH3 o CH2N (CH3)2), alquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, azido (por ejemplo, CH2N3), ciano (por ejemplo, CH2CN), acido sulfonico, sulfato, acido fosfonico, fosfato, o fosfonato, ya sea sin proteccion, o protegidos segun sea necesario, como es conocido por aquellos expertos en la tecnica, por ejemplo, como se ensena en Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edicion, 1991.
El termino alquilo inferior, como se utiliza aqm, y a menos que se especifique lo contrario, se refiere a un alquilo C1 a C4 saturado lineal, ramificado, o si es apropiado, un grupo dclico alquilo (por ejemplo, ciclopropilo), que incluyen tanto formas sustituidas como no sustituidas.
El termino alquilamino o arilamino incluye un grupo amino que tiene uno o dos sustituyentes alquilo o arilo, respectivamente.
El termino aminoacido incluye aminoacidos de origen natural y aminoacidos a, p, y o 6 sinteticos, e incluye pero no se limita a, aminoacidos encontrados en las protemas, es decir, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano, prolina, serina, treonina, cistema, tirosina, asparagina, glutamina, aspartato, glutamato, lisina, arginina e histidina. En una realizacion preferida, el aminoacido esta en la configuracion L. Alternativamente, el aminoacido puede ser un derivado de alanilo, valinilo, leucinilo, isoleuccinilo, prolinilo, fenilalaninilo, triptofanilo, methioninilo, glicinilo, serinilo, treoninilo, cisteinilo, tirosinilo, asparaginilo, glutaminilo, aspartoilo, glutaroilo, lisinilo, argininilo, histidinilo, p-alanilo, p-valinilo, p-leucinilo, p-isoleuccinilo, p-prolinilo, p- fenilalaninilo, p-triptofanilo, p-methioninilo, p-glicinilo, p-serinilo, p-threoninilo, p-cisteinilo, p-tirosinilo, p-asparaginilo, p-glutaminilo, p-aspartoilo, p-glutaroilo, p-lisinilo, p-argininilo o p-histidinilo. Cuando se utiliza el termino aminoacido, se considera que es una divulgacion espedfica e independiente de cada uno de los esteres de un aminoacido natural o sintetico, que incluyen pero no limitado a a, p, y o 6 glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano, prolina, serina, treonina, cistema, tirosina, asparagina, glutamina, aspartato, glutamato, lisina, arginina e histidina en las configuraciones D y L.
El termino “protegido” como se utiliza aqm y a menos que se defina de otra forma incluye un grupo que se agrega a un atomo de oxfgeno, nitrogeno, azufre o fosforo para prevenir su reaccion adicional o para otros propositos. Una amplia variedad de grupos protectores de oxfgeno y nitrogeno son conocidos por aquellos expertos en la tecnica de
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la smtesis organica (vease Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a Ed., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, 1999).
El termino arilo, como se utiliza aqm, y a menos que se especifique lo contrario, incluye fenilo, bifenilo, o naftilo, y preferiblemente fenilo. El grupo arilo se sustituye opcionalmente con uno o mas grupos funcionales tales como halo, hidroxilo, amino, alquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, acido sulfonico, sulfato, acido fosfonico, fosfato, o fosfonato, ya sea no protegido, o protegido como es necesario, como es conocido por aquellos expertos en la tecnica, por ejemplo, como se ensena en Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley y Sons, 3a Ed., 1999.
El termino alcarilo o alquilarilo incluye un grupo alquilo con un sustituyente arilo. El termino aralquilo o arilalquilo incluye un grupo arilo con un sustituyente alquilo.
El termino halo, como se utiliza aqm, incluye cloro, bromo, yodo, y fluoro. El termino acilo incluye un ester de acido carboxflico en el que el grupo funcional no carbonilo del grupo ester se selecciona de alquilo inferior lineal, ramificado o dclico, alcoxialquilo que incluye metoximetilo, aralquilo que incluye bencilo, ariloxialquilo tal como fenoximetilo, arilo que incluye fenilo opcionalmente sustituido con halogeno, alquilo C1 a C4 o alquilo C1 a C4, esteres de sulfonato alcoxi tales como alquilo o aralquilo sulfonilo que incluye metanosulfonilo, el mono, di o ester de trifosfato, tritilo o monometoxitritilo, bencilo sustituido, trialquilsililo (por ejemplo, dimetil-t-butilsililo) o difenilmetilsililo. Los grupos arilo en los esteres comprenden de manera optima un grupo fenilo. El termino “acilo inferior” se refiere a un grupo acilo en el que el grupo funcional no carbonilo es alquilo inferior.
Como se utiliza aqm, el termino “sustancialmente libre de” o “sustancialmente en ausencia de” con respecto a la pureza enantiomerica, se refiere a una composicion que incluye por lo menos 85% o 90% en peso, preferiblemente 95% a 98% en peso, y aun mas preferiblemente 99% a 100% en peso, del enantiomero designado. En una realizacion preferida, en los metodos y compuestos de esta invencion, los compuestos estan sustancialmente libres de otros enantiomeros.
De manera similar, el termino “aislado” se refiere a una composicion de compuesto que incluye por lo menos 85% o 90% en peso, preferiblemente 95% a 98% en peso, y aun mas preferiblemente 99% a 100% en peso, del compuesto, comprendiendo el resto otras especies qmmicas o enantiomeros.
El termino “independientemente” se utiliza aqm para indicar que la variable, que se aplica de forma independiente, vana independientemente de aplicacion a aplicacion. Por lo tanto, en un compuesto tal como R “XYR”, en el que R“ es 'independientemente carbono o nitrogeno', ambos R” puede ser carbono, ambos R” pueden ser nitrogeno o un R” puede ser carbono y el otro R” nitrogeno.
El termino “sal o profarmaco farmaceuticamente aceptable” se utiliza en toda la especificacion para describir cualquier forma farmaceuticamente aceptable (tal como un ester, ester de fosfato, sal de un ester o un grupo relacionado) de un compuesto, que, luego de administracion a un paciente, proporciona el compuesto. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las derivadas de bases y acidos inorganicos u organicos farmaceuticamente aceptables. Las sales adecuadas incluyen aquellas derivadas de metales alcalinos tales como potasio y sodio, metales alcalinoterreos tales como calcio y magnesio, entre otros numerosos acidos bien conocidos en la tecnica farmaceutica. Los profarmacos farmaceuticamente aceptables se refieren a un compuesto que se metaboliza, por ejemplo hidroliza u oxida, en el anfitrion para formar el compuesto de la presente invencion. Ejemplos tfpicos de profarmacos incluyen compuestos que tienen grupos protectores biologicamente labiles en un grupo funcional del compuesto activo. Los profarmacos incluyen compuestos que pueden ser oxidados, reducidos, aminados, desaminados, hidroxilados, deshidroxilados, hidrolizados, deshidrolizados, alquilados, desalquilados, acilados, desacilados, fosforilados, desfosforilados para producir el compuesto activo.
El termino “esteres farmaceuticamente aceptables” como se utiliza aqm, a menos que se especifique lo contrario, incluye aquellos esteres de uno o mas compuestos, que son, dentro del alcance del juicio medico, adecuados para uso en contacto con los tejidos de los anfitriones sin indebida toxicidad, irritacion, respuesta alergica y similares, son proporcionados con una relacion beneficio/riesgo razonable, y son eficaces para su uso pretendido.
El termino “sujeto” como se utiliza aqm, se refiere a un animal, preferiblemente un mairnfero, mas preferiblemente un humano. Los marnfferos pueden incluir mamfferos no humanos, que incluyen, pero no se limitan a, cerdos, ovejas, cabras, vacas (bovino), ciervos, mulas, caballos, monos y otros primates no humanos, perros, gatos, ratas, ratones, conejos o cualesquier otros conocidos o divulgados aqm.
II. Efectividad in vivo/regfmenes de dosificacion
En otro aspecto de la presente invencion, se proporcionan regfmenes de dosificacion que limitan los efectos secundarios toxicos de TCNP. En una realizacion, dichos regfmenes de dosificacion minimizan los siguientes efectos secundarios toxicos, que incluyen, pero no se limitan a, hepatoxicidad, trombocitopenia, hiperglicemia, vomito,
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hipocalcemia, anemia, hipoalbunemia, mielosupresion, hipertrigliceridemia, hiperamilasemia, diarrea, estomatitis y/ o fiebre.
En otra realizacion, la administracion de TCN-P proporciona por lo menos una respuesta parcial o completa in vivo en por lo menos 15-20% de los sujetos. En realizaciones particulares, una respuesta a parcial puede diezer por lo menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 o 85% de regresion del tumor. En otras realizaciones, esta respuesta puede ser evidente en por lo menos 15, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 o 90% de los sujetos tratados con la terapia. En realizaciones adicionales, dichas tasas de respuesta se pueden obtener mediante cualquier regimen terapeutico divulgado aqrn.
En otras realizaciones, se proporcionan tratamientos para un sujeto que se ha diagnosticado con cancer al administrar al sujeto una cantidad efectiva de TCN-P de acuerdo con un esquema de dosificacion que incluye administrar el farmaco una vez por semana durante tres semanas seguidas por un periodo de una semana en el que no se administra el farmaco (es decir a traves de un ciclo de 28 dfas). En otras realizaciones, dichos ciclos de 28 dfas se pueden repetir por lo menos 2, 3, 4, o 5 veces o hasta que es evidente la regresion del tumor.
En realizaciones adicionales, se proporciona un ciclo de 42 dfas en el que los compuestos divulgados aqrn se pueden administrar una vez una semana durante cuatro semanas seguidas en un periodo de dos semanas en el que no se administra el farmaco. En otras realizaciones, dichos ciclos de 42 dfas se pueden repetir por lo menos 2, 3, 4, o 5 veces o hasta que es evidente la regresion del tumor. En una realizacion particular, menos de 12, menos de 11 o menos de 10 mg/m2 de TCN-P se puede administrar de acuerdo con un ciclo de 42 dfas. En otras realizaciones particulares, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 11 mg/m2 de TCN-P se puede administrar de acuerdo con un ciclo de 42 dfas.
En otra realizacion, se proporcionan tratamientos contra el cancer en un sujeto al administrar al sujeto un regimen de dosificacion de 10 mg/m2 o menos de TCN-P una vez por semana. En realizaciones particulares, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 o 10 mg/m2 de TCN-P se puede administrar una vez por semana
En realizaciones de la presente invencion, el compuesto divulgado aqrn se puede administrar como una dosis de unico bolo durante un corto periodo de tiempo, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 30 o 60 minutos. En realizaciones adicionales, se proporcionan esquemas de dosificacion en los que los compuestos se administran a traves de infusion continua durante por lo menos 24, 48, 72, 96, o 120 horas. En ciertas realizaciones, la administracion del farmaco a traves de inyecciones continuas o de bolo se puede repetir a una cierta frecuencia por lo menos: una vez una semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez un mes, una vez cada cinco semanas, una vez cada seis semanas, una vez cada ocho semanas, una vez cada diez semanas y/o una vez cada doce semanas. El tipo y frecuencia de administraciones se puede combinar de cualquier manera divulgada aqrn para crear un ciclo de dosificacion. Los farmacos se pueden administrar repetidamente a traves de un cierto ciclo de dosificacion, por ejemplo como una inyeccion de bolo una vez cada dos semanas durante tres meses. Los ciclos de dosificacion se pueden administrar durante por lo menos: uno, dos tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, dieciocho o veinticuatro meses. Alternativamente, por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 o 20 ciclos de dosificacion se pueden administrar a un paciente. El farmaco se puede administrar de acuerdo con cualquier combinacion divulgada aqrn, por ejemplo, el farmaco se puede administrar una vez una semana cada tres semanas durante 3 ciclos.
En realizaciones adicionales, los compuestos se pueden administrar por lo menos una vez un dfa durante por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dfas. Dicha administracion puede seguir por periodos correspondiente en los que no se administra el farmaco.
La TCN-P se puede administrar a pacientes en una cantidad que sea efectiva en provocar regresion de tumor. La administracion de TCN-P puede proporcionar por lo menos una respuesta parcial, tal como por lo menos 15, 20 o 30%, o respuesta completa in vivo en por lo menos 15-20% de los sujetos. En ciertas realizaciones, por lo menos 2, 5, 10, 15, 20, 30 o 50 mg/m2 de un compuesto divulgado aqrn se puede administrar a un sujeto. En ciertas realizaciones, por lo menos aproximadamente 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 12, 15, 17, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 165, 175, 200, 250, 300, o 350 mg/m2 de TCN-P se puede administrar a un sujeto.
La administracion del compuesto se puede conducir de acuerdo con cualquiera de los regfmenes terapeuticos divulgados aqrn. En realizaciones particulares, el regimen de dosificacion incluye administrar menos de 20 mg/m2 de TCN-P. En una realizacion, se puede administrar menos de 20 mg/m2 de TCN-P una vez una semana. En realizaciones adicionales, se puede administrar 2 mg/m2, 5 mg/m2, 10 mg/m2, y/o 15 mg/m2 de TCN-P a un sujeto. En otra realizacion, menos de 10 mg/m2 se puede administrar a un sujeto a traves de infusion continua durante por lo menos cinco dfas. La presente invencion proporciona cualquier combinacion de tipo de dosificacion, frecuencia, numero de ciclos y cantidad de dosificacion divulgada aqrn.
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III. Cribado de Poblaciones de Pacientes
En otro aspecto de la presente invencion, se proporcionan metodos para identificar canceres o tumores que sean susceptibles a los efectos toxicos de fosfato de triciribina (TCN).
En una realizacion, los tratamientos contra cancer o tumor se proporcionan en un mairnfero al (i) obtener una muestra biologica del tumor; (ii) determinar si el cancer o tumor sobreexpresa quinasa Akt o quinasa Akt hiperactivada y fosforilada, y (iii) tratar el cancer o tumor con triciribina o un compuesto relacionado como se describe aqrn. En una realizacion, la muestra biologica puede ser una biopsia. En otras realizaciones, la muestra biologica puede ser fluida, celulas y/o aspirados obtenidos del tumor o cancer.
Se puede obtener la muestra biologica de acuerdo con cualquier tecnica conocida para un experto en la tecnica. En una realizacion, se puede conducir una biopsia para obtener la muestra biologica. Una biopsia es un procedimiento realizado para eliminar el tejido o celulas del cuerpo para examen. Algunas biopsias se pueden realizar en el consultorio de un medico, mientras que otras necesitan ser hechas en un entorno hospitalario. Adicionalmente, algunas biopsias requieren el uso de un anestesico para adormecer el area, mientras que otros no requieren ninguna sedacion. En ciertas realizaciones, se puede realizar una biopsia endoscopica. Este tipo de biopsia se lleva a cabo a traves de un endoscopio de fibra optica (un tubo largo y delgado que tiene un telescopio de metodo cercano en el extremo para la vision) a traves de un orificio natural del cuerpo (es decir, recto) o de una pequena incision (es decir, artroscopia). El endoscopio se utiliza para ver el organo en cuestion para areas anormales o sospechosas, con el fin de obtener una pequena cantidad de tejido para estudio. Los procedimientos endoscopicos se nombran para el area de organo o cuerpo que se va a visualizar y/o tratar. El medico puede insertar el endoscopio en el tracto gastrointestinal (endoscopia del tracto alimenticio), vejiga (cistoscopia), cavidad abdominal (laparoscopia), cavidad de articulacion (artroscopia), porcion media del pecho (mediastinoscopia), o traquea y sistema bronquial (laringoscopia y broncoscopia).
En otra realizacion, se puede realizar una biopsia de medula osea. Este tipo de biopsia se puede realizar ya sea desde el esternon (hueso del pecho) o el hueso de la cadera cresta ilfaca (el area de hueso a cada lado de la pelvis en el area de la espalda inferior). La piel se limpia y se aplica anestesia local para adormecer la zona. Una aguja larga y ngida se inserta en la medula osea, y las celulas se aspiro para el estudio; este paso es ocasionalmente incomodo. Una biopsia de nucleo (retirar un pequeno hueso 'chip' de la medula osea) puede seguir a la aspiracion.
En una realizacion adicional, se puede realizar una biopsia excisional o incisional en el marnffero. Este tipo de biopsia se utiliza a menudo cuando se necesita una porcion mas ancha o mas profunda de la piel. Utilizando un escalpelo (cuchillo quirurgico), se retira un espesor de la piel para examen adicional, y la herida se sutura (se cosio y se cerro con hilo quirurgico). Cuando se retira todo el tumor, que se conoce como una tecnica de biopsia por escision. Si se retira solo una porcion del tumor, que se conoce como una tecnica de biopsia incisional. La biopsia escisional es a menudo el metodo normalmente preferido, por ejemplo, cuando se sospecha de melanoma (un tipo de cancer de piel).
En aun realizaciones adicionales, se puede utilizar una biopsia de aspiracion con aguja fina (FNA). Este tipo de biopsia implica el uso de una aguja fina para eliminar trozos muy pequenos de un tumor. La anestesia local se utiliza a veces para adormecer el area, pero la prueba no produce molestias y no deja cicatriz. El FNA, por ejemplo, se utiliza para el diagnostico de un lunar sospechoso, pero se puede utilizar, por ejemplo, para biopsia de ganglios linfaticos grandes cerca de un melanoma para ver si el melanoma ha hecho metastasis (diseminacion). Un escaner de tomograffa computarizada (escaner CT o CAT) se puede utilizar para guiar una aguja en un tumor en un organo interno tal como el pulmon o tugado.
En otras realizaciones, se pueden realizar biopsias de afeitado del punzon y/o piel. Las biopsias del punzon involucran tomar una muestra mas profunda de la piel con un instrumento de biopsia que elimina un cilindro corto, o “nucleo de manzana”, de tejido. Despues de que se administra un anestesico local, el instrumento se gira en la superficie de la piel hasta que corta a traves de todas las capas, incluyendo la dermis, epidermis, y las partes mas superficiales de la subcutis (grasa). Una biopsia de afeitado implica la eliminacion de las capas superiores de la piel mediante raspado. Las biopsias de afeitado tambien se realizan con un anestesico local. Las biopsias de piel implican la eliminacion de una muestra de piel para su examen bajo el microscopio para determinar si, por ejemplo, esta presente el melanoma. La biopsia se realiza bajo anestesia local.
En una realizacion particular, se proporcionan metodos para determinar si el tumor sobreexpresa una quinasa Akt. quinasa Akt sobreexpresion puede referirse al estado de fosforilacion de la quinasa. Hiperfosforilacion de Akt puede ser detectado de acuerdo con los metodos descritos aqrn. En una realizacion, una biopsia de tumor se puede comparar con un tejido de control. El tejido de control puede ser un tejido normal del mamffero del que se obtuvo la biopsia o un tejido normal de un mamffero sano. La sobreexpresion o hiperfosforilacion de la quinasa Akt se puede determinar si la biopsia del tumor contiene mayores cantidades de quinasa Akt y/o fosforilacion de la quinasa Akt que el tejido de control, tales como, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 1.5, 2, 2.25, 2.5, 2.75, 3, 3.25, 3.5, 3.75, 4, 4.25, 4.5, 4.75, 5, 5.5, 6, 7, 8, 9, o l0 veces mayores cantidades de quinasa Akt que figuran en el tejido de control.
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En una realizacion, la presente invencion proporciona un metodo para detectar la expresion de quinasa Akt aberrante en un sujeto o en una muestra biologica del sujeto al poner en contacto celulas, extractos celulares, suero u otra muestra de los sujetos o dicha muestra biologica con una molecula inmunoreactiva espedfica a una quinasa Akt o porcion antigenica de la misma y detectar el nivel de formacion de complejo quinasa-Akt molecula inmunoreactiva, en el que una presencia elevada del complejo en relacion con una celula normal es indicadora de una celula aberrante que expresa o sobreexpresa Akt. En un ejemplo, las celulas o extractos celulares se pueden cribar inmunologicamente para la presencia de niveles elevados de quinasa Akt.
En una realizacion alternativa, se detecta la expresion aberrante de Akt en una celula en el nivel genetico mediante el cribado para el nivel de expresion de un gen que codifica una Akt, quinasa en la que un nivel elevado de un producto de expresion de transcripcion (es decir, mARN) en comparacion con una celula normal es indicadora de una celula aberrante. En ciertas realizaciones, el PCR en tiempo real, asf como otros procedimientos de PCR se pueden utilizar para determinar la actividad transcripcional. En una realizacion, el mARN se puede obtener de celulas de un sujeto o de una muestra biologica de un sujeto y de cADN generado opcionalmente. El mARN o cADN se pueden poner en contacto con una sonda genetica capaz de hibridar con y/o amplificar la totalidad o parte de una secuencia de nucleotidos que codifica quinasa Akt o su secuencia de nucleotidos complementaria y entonces el nivel de mARN o cADN se puede detectar en el que se puede evaluar la presencia de niveles elevados de mARN o cADN en comparacion con los controles normales.
Sin embargo, otra realizacion de la presente invencion contempla el uso de un anticuerpo, monoclonal o policlonal, para la quinasa Akt en un kit de diagnostico cuantitativo o semi-cuantitativo para determinar los niveles relativos de quinasa Akt en celulas de un paciente se sospecha tiene cancer, que puede incluir todos los reactivos necesarios para realizar el ensayo. En una realizacion, se proporciona un kit que utiliza reactivos y materiales necesarios para realizar un ensayo ELISA. Los reactivos pueden incluir, por ejemplo, regulador de lavado, regulador de dilucion de anticuerpos, regulador de bloqueo, solucion de tincion celular, solucion de desarrollo, solucion de deteccion, anticuerpos espedficos de protema anti-fosfo, anticuerpos espedficos de protema anti-Pan, anticuerpos secundarios, y agua destilada. El kit tambien puede incluir instrucciones de uso y, opcionalmente, puede ser automatizado o semi-automatizado o en una forma que sea compatible con la maquina o software automatizado. En una realizacion, un anticuerpo Akt fosforo-Ser-473 que detecta la forma activada de AKT (Akt fosforilada en serina 474) se puede utilizar como el anticuerpo en un kit de diagnostico. Vease, por ejemplo, Yuan et al. (2000) “Frequent Activation of AKT2 and induction of apoptosis by inhibition of fosfinositide-3-OH kinase/Akt pathway in human ovarian cancer”, Oncogene 19:2324-2330.
Quinasas Akt
La Akt, tambien llamada PKB3, representa una subfamilia de la serina/treonina quinasa. Se han identificado tres miembros, AKT1, AKT2, y Akt3, en esta subfamilia. La Akt se activa mediante estfmulos extracelulares de una manera dependiente de PI3K (Datta, S. R., et a1. Genes Dev. 13: 2905-2927, 1999). La activacion completa de Akt requiere la fosforilacion de Thr308 en el bucle de activacion y Ser473 en el dominio de activacion C-terminal. La Akt se regula negativamente por supresor de tumores PTEN. Se han identificado mutaciones en PTEN en diversos tumores, que conducen a la activacion de Akt (Datta, S. R., et al.Genes Dev. 13: 2905-2927, 1999). Adicionalmente, se ha detectado amplificacion, sobreexpresion y/o activacion de Akt en una serie de tumores malignos humanos (Datta, S. R., et al. Genes Dev. 13: 2905-2927, 1999, Cheng, J. Q., and Nicosia, S. V AKT signal transduction pathway in oncogenesis. In Schwab D, editor. Encyclopedic Reference of Cancer. Berlin Heidelberg and New York: Springer; 2001. pp 35-7). La expresion ectopica de Akt, especialmente Akt constitutivamente activa, induce la supervivencia celular y transformacion maligna mientras que la inhibicion de la actividad de Akt estimula la apoptosis en una amplia gama de celulas de marnfferos (Datta, S. R., et al. Genes Dev. 13: 2905-2927, 1999, Cheng, J. Q., and Nicosia, S. V. AKT signal transduction pathway in oncogenesis. In Schwab D, editor. Encyclopedic Reference of Cancer. Berlin Heidelberg and New York: Springer; 2001. pp35-7, Sun, M., et al. Am. J. Path., 159: 431-437, 2001, Cheng, J. Q., et al. Oncogene, 14: 2793-2801, 1997). Adicionalmente, se ha demostrado que la activacion de Akt se asocia con la invasividad tumoral y la quimiorresistencia (West, K. A., et al. Drug Resist. Updat., 5: 234-245, 2002).
La activacion de la ruta de Akt cumple una funcion fundamental en la transformacion maligna y la quimiorresistencia al inducir la supervivencia, crecimiento, migracion, y angiogenesis celular. La presente invencion proporciona metodos para determinar los niveles de Akt sobreexpresion de quinasa y/o quinasa Akt hiperactivada y fosforilada.
La quinasa Akt puede ser cualquier familia de quinasas Akt conocida, o quinasa relacionada con la misma, que incluyen, Akt1, Akt2, Akt3. El mARN y secuencias de aminoacidos de Akt1, Akt2, y Akt 3 humana se ilustran en las figuras 6a-c, 7a-d, y 8a-c, respectivamente.
Ensayos de diagnostico
Ensayos inmunologicos
En una realizacion, se proporciona un metodo para detectar la expresion aberrante de una quinasa Akt en una celula en un mairnfero o en una muestra biologica del mairnfero, al poner contacto celulas, extractos celulares o suero u
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otra muestra del mamftero o muestra biologica con una molecula inmunoreactiva espedfica para una quinasa Akt o porcion antigenica de la misma y detectar el nivel de las formaciones de complejos de quinasa Akt-molecula inmunoreactivos y determinar si esta presente una presencia elevada del complejo en relacion con una celula normal.
La molecula inmunoreactiva puede ser una molecula que tiene especificidad y afinidad de union por una quinasa Akt o sus partes antigenicas o sus homologos o derivados de la misma. En una realizacion, la molecula inmunoreactiva puede ser una molecula de inmunoglobulina. En otras realizaciones, las moleculas inmunoreactivas pueden ser fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena unica, y/o moleculas desinmunizadas que incluyen anticuerpos humanizados y moleculas de union al antigeno asociadas a celulas T (TABMs). En una realizacion particular, el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. En otra realizacion particular, el anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal. La molecula inmunorreactiva puede exhibir especificidad a una quinasa Akt o mas particularmente un determinante antigenico o epftopo en una quinasa Akt. Un determinante antigenico o epftopo en una quinasa Akt incluye la parte de la molecula a la que se dirige una respuesta inmunitaria. El determinante antigenico o epftopo puede ser un epftopo de celulas B o en su caso un epftopo de celulas T. En una realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo Akt fosforo-Ser 473.
Una realizacion de la presente invencion proporciona un metodo para diagnosticar la presencia de cancer o crecimiento similar a cancer en un mai^ero, en el que la actividad de Akt aberrante esta presente, al poner en contacto celulas o extractos de celulas de mai^ero o una muestra biologica del sujeto con una cantidad efectiva de union a quinasa Akt de un anticuerpo que tiene especificidad para la quinasa Akt o un determinante o epftopo antigenico de la misma y luego determinar cuantitativamente o cualitativamente el nivel de un complejo de quinasa Akt-anticuerpo en el que se determina la presencia de niveles elevados de dicho complejo en comparacion con una normal de las celulas.
Los anticuerpos se pueden preparar mediante cualquiera de un numero de medios conocidos para un experto en la tecnica. Por ejemplo, para la deteccion de quinasa Akt humana, los anticuerpos pueden ser generalmente pero no necesariamente derivados de animales no humanos tales como primates, ganado (por ejemplo, ovejas, vacas, cerdos, cabras, caballos), animales de ensayo de laboratorio (por ejemplo ratones, ratas, conejillos de indias, conejos) y/o animales de compaffta (por ejemplo perros, gatos). Los anticuerpos tambien se pueden producir de forma recombinante en celulas anfitrionas procariotas o eucariotas. Generalmente, los ensayos basados en anticuerpos pueden llevarse a cabo in vitro en biopsias de celulas o tejidos. Sin embargo, si un anticuerpo se desinmuniza adecuadamente o, en el caso de uso humano, humaniza, entonces, el anticuerpo se puede marcar con, por ejemplo, una etiqueta nuclear, administrada a un paciente y el sitio de la acumulacion de marca nuclear se determina por tecnicas radiologicas. El anticuerpo quinasa Akt puede ser un agente de cancer de focalizacion. De acuerdo con lo anterior, otra realizacion de la presente invencion proporciona formas desinmunizadas de los anticuerpos para su uso en formacion de imagenes de cancer en pacientes humanos y no humanos.
En general, para la generacion de anticuerpos para una quinasa Akt, se requiere que se extraiga la enzima de una muestra biologica ya sea de animal, incluyendo tejido humano o a partir de cultivo de celulas si se produce por medios recombinantes. La quinasa Akt puede separarse de la muestra biologica mediante cualquier medio adecuado. Por ejemplo, la separacion puede tomar ventaja de uno cualquiera o mas de las propiedades de carga superficial de la quinasa Akt, tamano, densidad, actividad biologica y su afinidad por otra entidad (por ejemplo, otro compuesto de protema o qmmico al que se une o de otro modo asocia). Por lo tanto, por ejemplo, la separacion de la quinasa Akt del fluido biologico puede conseguirse mediante uno cualquiera o mas de ultracentrifugacion, cromatograffa de intercambio ionico (por ejemplo, cromatograffa de intercambio anionico, cromatograffa de intercambio cationico), electroforesis (por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida, metodo isoelectrico), separacion por tamano (por ejemplo, filtracion en gel, ultrafiltracion) y separacion mediada por afinidad (por ejemplo, separacion por inmunoafinidad, que incluye, pero no se limita a, separacion de perlas magneticas tal como separacion Dynabead (marca registrada), inmunocromatograffa, inmuno-precipitacion). La separacion de quinasa Akt del fluido biologico puede preservar los epftopos conformacionales presentes en la quinasa y, por lo tanto, adecuadamente evita tecnicas que provocan la desnaturalizacion de la enzima. En una realizacion adicional, la quinasa se puede separar del fluido biologico utilizando una cualquiera o mas de separacion por afinidad, filtracion en gel y/o ultra-filtracion.
La inmunizacion y posterior produccion de anticuerpos monoclonales se puede llevar a cabo utilizando protocolos estandar conocidos en la tecnica, tales como, por ejemplo, descritos por Kohler y Milstein (Kohler and Milstein, Nature 256: 495-499, 1975; Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6(7): 511-519, 1976), Coligan et al. (“Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 1991-1997) or Toyama et al. (Monoclonal Antibody, Experiment Manual”, published by Kodansha Scientific, 1987). Esencialmente, se inmuniza un animal con un fluido biologico que contiene quinasa Akt o fraccion del mismo o una forma recombinante de la quinasa Akt mediante metodos estandar para producir celulas productoras de anticuerpos, particularmente celulas somaticas productoras de anticuerpos (por ejemplo, linfocitos B). Estas celulas pueden entonces ser retirados del animal inmunizado para la inmortalizacion. En cierta realizacion, un fragmento de una quinasa Akt se puede utilizar para generar anticuerpos. El fragmento puede estar asociado con un portador. El portador puede ser cualquier sustancia de peso molecular normalmente alta en el
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que una sustancia no o poco inmunogenica (por ejemplo, un hapteno) se une natural o artificialmente para mejorar su inmunogenicidad.
La inmortalizacion de celulas productoras de anticuerpos se puede llevar a cabo utilizando metodos que son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la inmortalizacion se puede conseguir mediante el metodo de transformacion utilizando virus Epstein-Barr (EBV) (Kozbor et al., Methods in Enzymology 121: 140, 1986). En otra realizacion, las celulas productoras de anticuerpo se inmortalizan mediante el metodo de fusion celular (descrito en Coligan et al., 1991-1997, supra), que se emplea ampliamente para la produccion de anticuerpos monoclonales. En este metodo, las celulas productoras de anticuerpos somaticas con el potencial para producir anticuerpos, particularmente celulas B, se fusionan con una estirpe celular de mieloma. Estas celulas somaticas se pueden derivar de los ganglios linfaticos, bazos y sangre periferica de animales cebados, preferiblemente animales roedores tales como ratones y ratas. En una realizacion particular, se pueden utilizar celulas de bazo de ratones. En otras realizaciones, tambien se pueden utilizar celulas de rata, conejo, oveja o cabra. Se han desarrollado estirpes celulares de mieloma especializadas a partir de tumores linfocfticos para su uso en procedimientos de fusion productoros de hibridoma (Kohler and Milstein, 1976, supra; Shulman et al., Nature 276: 269-270, 1978; Volk et al., J. Virol. 42(1): 220-227, 1982). Tambien se pueden utilizar muchas estirpes celulares de mieloma para la produccion de hnbridos de celulas fusionadas, que incluyen, por ejemplo P3.times.63-Ag8, P3.times.63-AG8.653, p3/NS1-Ag4-1 (NS1), SP2/0-Agl4 y S194/5.XXO.Bu.1. Las estirpes de celulas P3.times.63-Ag8 y NS-1 se han descrito por Kohler and Milstein (1976, supra). Shulman et al. (1978, supra) desarrollaron la estirpe de mieloma Sp2/0- Ag14. La estirpe 194/5.XXO.Bu.1 se reporto por Trowbridge (J. Exp. Med. 148(1): 313-323, 1978). Los metodos para generar tnbridos de celulas de bazo o de ganglios linfaticos productoras de anticuerpos y celulas de mieloma usualmente implican mezclar celulas somaticas con celulas de mieloma en una proporcion 10:1 (aunque la proporcion puede variar desde aproximadamente 20: 1 a aproximadamente 1: 1), respectivamente, en presencia de un agente o agentes (qrnmico, vmco o electrico) que promueve la fusion de las membranas celulares. Los metodos de fusion se han descrito (Kohler and Milstein, 1975, supra; Kohler and Milstein, 1976, supra; Gefter et al., Somatic Cell Genet. 3: 231-236, 1977; Volk et al., 1982, supra). Los agentes que promueven la fusion utilizados por aquellos investigadores fueron virus de Sendai y polietilenglicol (PEG). En ciertas realizaciones, los medios para seleccionar los hnbridos de celulas fusionadas de las celulas no fusionadas restantes, particularmente, se proporcionan las celulas de mieloma no fusionadas. Generalmente, la seleccion de hnbridos de celulas fusionadas se puede lograr mediante el cultivo de celulas en medios que soportan el crecimiento de hibridomas pero impiden el crecimiento de las celulas de mieloma no fusionadas que normalmente se dividirian indefinidamente. Las celulas somaticas utilizadas en la fusion no mantienen viabilidad a largo plazo en cultivo in vitro y por lo tanto no suponen un problema. Se requieren varias semanas para cultivar selectivamente los hnbridos de celulas fusionadas. A principios de este penodo de tiempo, es necesario identificar aquellos hnbridos que producen el anticuerpo deseado, de modo que posteriormente se pueden clonar y se propagan. En general, alrededor del 10% de los hnbridos obtenidos producen el anticuerpo deseado, aunque un rango de aproximadamente 1 a aproximadamente 30% no es infrecuente. La deteccion de los hnbridos productores de anticuerpos se puede lograr mediante cualquiera de varios metodos estandar de ensayo, que incluyen inmunoensayo ligado a enzimas y tecnicas de radioinmunoensayo como, por ejemplo, descritos en Kennet et al. (Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, pp 376-384, Plenum Press, New York, 1980) and by FACS analysis (O'Reilly et al., Biotechniques 25: 824-830, 1998).
Una vez que se han seleccionado y clonado los hnbridos de celulas fusionadas deseados en estirpes celulares productoras de anticuerpos individuales, cada estirpe celular se puede propagar de cualquiera de dos formas estandar. Una suspension de las celulas de hibridoma se puede inyectar en un animal histocompatible. El animal inyectado luego desarrollara tumores que secretan el anticuerpo monoclonal espedfico producido por el hribrido celular fusionado. Los fluidos corporales del animal, tales como suero o fluido de ascitis, se pueden tomar para proporcionar anticuerpos monoclonales en alta concentracion. Alternativamente, las estirpes celulares individuales pueden ser propagadas in vitro en recipientes de cultivo de laboratorio. El medio de cultivo que contiene altas concentraciones de un solo anticuerpo monoclonal espedfico se puede recoger mediante decantacion, filtracion o centrifugacion, y posteriormente purificada.
Las estirpes celulares pueden ser probadas para su especificidad para detectar la quinasa Akt de interes por cualquier medio de inmunodeteccion adecuados. Por ejemplo, las estirpes celulares pueden estar en alfcuotas en una serie de pozos e incubadas y el sobrenadante de cada pozo se analiza mediante el ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA), la tecnica de inmunofluorescencia indirecta, o similares. La estirpe celular(s) que produce un anticuerpo monoclonal capaz de reconocer la LIM quinasa objetivo pero que no reconoce epttopos no objetivo se identifican y luego directamente se cultivan in vitro o se inyecta en un animal histocompatible para formar tumores y para producir, recolectar y purificar los anticuerpos requeridos.
La presente invencion proporciona, por lo tanto, un metodo para detectar en una muestra una quinasa Akt o fragmento, variante o derivado del mismo que comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo o fragmento o derivado del mismo y detectar el nivel de un complejo que contiene el anticuerpo y quinasa Akt o fragmento, variante o derivado de la misma en comparacion con los controles normales, en los que se determinaron los niveles elevados de quinasa Akt. Se puede utilizar cualquier tecnica adecuada para determinar la formacion del complejo. Por ejemplo, un anticuerpo de acuerdo con la invencion, que tiene una molecula informadora asociada con la misma, se puede utilizar en inmunoensayos. Dichos inmunoensayos incluyen, pero no se limitan a
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radioinmunoensayos (RIAs), ensayos de inmunoabsorcion ligados a enzimas (ELISA) tecnicas de inmunocromatograffa (TIC), y transferencia de Western que son bien conocidos para aquellos expertos en la tecnica. Los inmunoensayos pueden incluir tambien ensayos competitivos. La presente invencion abarca inmunoensayos cualitativos y cuantitativos.
Se describen tecnicas de inmunoensayo adecuadas, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos. 4,016,043, 4,424,279 y 4,018,653. Estas incluyen ensayos de un solo sitio y ensayos de dos sitios de los tipos no competitivos, asf como ensayos de union competitiva tradicionales. Estos ensayos tambien incluyen la union directa de una molecula de union a antigeno marcada a un antfgeno objetivo.
La invencion proporciona adicionalmente metodos para cuantificar la expresion de protema Akt y niveles de activacion en las celulas o muestras de tejidos obtenidas de un animal, tal como un paciente de cancer humano o de un individuo que se sospecha cancer. En una realizacion, la invencion proporciona metodos para cuantificar la expresion de protema Akt o niveles de activacion utilizando un sistema de formacion de imagen cuantitativamente. El sistema de formacion de imagen se puede utilizar para recibir, mejorar, y procesar imagenes de celulas o muestras de tejidos, que han sido manchados con manchas espedficas a la protema AKT, con fin de determinar la cantidad o el nivel de activacion de la protema AKT expresada en las celulas o muestras de tejido de dicho animal. En realizaciones de los metodos de la invencion, una curva de calibracion de expresion de la protema AKT1 y AKT2 puede ser generado para por lo menos dos estirpes celulares que expresan diferentes cantidades de protema AKT. La curva de calibracion luego se puede utilizar para determinar cuantitativamente la cantidad de protema AKT que se expresa en una muestra de celulas o tejido. Las curvas de calibracion analogas se pueden hacer para protemas AKT activadas utilizando reactivos espedficos para las caractensticas de activacion. Tambien se puede utilizar para determinar los cambios en las cantidades y estado de activacion de AKT antes y despues del tratamiento del cancer clmico.
En una realizacion particular de los metodos de la invencion, la expresion de protema AKT en una muestra de celula o tejido se puede cuantificar utilizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para determinar la cantidad de protema AKT en una muestra. Dichos metodos se describen, por ejemplo, en la Publicacion de Patente Estadounidense No. 2002/0015974.
En otras realizaciones se pueden utilizar inmunoensayos enzimaticos para detectar la quinasa Akt. En dichos ensayos, una enzima se conjuga con el segundo anticuerpo, generalmente por medio de glutaraldelddo o peryodato. Los sustratos que se van a utilizar con las enzimas espedficas se eligen generalmente para la produccion de, luego de hidrolisis por la enzima correspondiente, un cambio de color detectable. Tambien es posible emplear sustratos fluorogenicos, que producen un producto fluorescente en lugar de los sustratos cromogenicos. El anticuerpo marcado con enzima se puede agregar al primer complejo anticuerpo-antfgeno, permitir la union, y luego el exceso de reactivo se lava. Una solucion que contiene el sustrato apropiado luego se puede agregar al complejo de anticuerpo-antfgeno-anticuerpo. El sustrato puede reaccionar con la enzima ligada al segundo anticuerpo, dando una senal visual cualitativa, que puede cuantificarse adicionalmente, usualmente espectrofotometricamente, para dar una indicacion de la cantidad de antfgeno que estaba presente en la muestra. Alternativamente, los compuestos fluorescentes, tales como fluorescema, rodamina y lantanido, europio (UE), se pueden acoplar qmmicamente a anticuerpos sin alterar su capacidad de union. Cuando se activa por iluminacion con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo marcado con fluorocromo adsorbe la energfa luminosa, induciendo un estado de excitabilidad en la molecula, seguido por emision de la luz en un color caractenstico visualmente detectable con un microscopio de luz. Se deja que el anticuerpo marcado fluorescente se una al primer complejo anticuerpo-antfgeno. Despues de lavar el reactivo no unido, el complejo terciario restante luego se expone entonces a la luz de una longitud de onda apropiada. La fluorescencia observada indica la presencia del antfgeno de interes. Ensayos inmunofluorometrico (IFMA) estan bien establecidos en la tecnica y son particularmente utiles para el presente metodo. Sin embargo, tambien se pueden emplear otras moleculas informadoras, tales como moleculas de radioisotopos, quimioluminiscentes o bioluminiscentes.
En una realizacion particular, los anticuerpos para quinasa Akt tambien se puede utilizar en la deteccion mediada por ELISA de quinasa Akt, especialmente en el suero u otro fluido circulatorio. Esto se puede lograr al inmovilizar anticuerpos anti-quinasa Akt a un soporte solido y poner en contacto estos con un extracto biologico tal como suero, sangre, linfa u otro fluido corporal, extracto celular o biopsia celular. Se pueden utilizar anticuerpos anti-quinasa Akt marcados para detectar la quinasa Akt inmovilizada. Este ensayo se puede variar en cualquier numero de formas y todas las variaciones estan abarcadas por la presente invencion y son conocidas por un experto en la tecnica. Este metodo puede permitir la rapida deteccion y la cuantificacion de los niveles de quinasa Akt utilizando, por ejemplo, un ensayo basado en suero.
En una realizacion, un kit de ensayo Elisa de Akt se puede utilizar en la presente invencion. Por ejemplo, una activacion celular de kit de senalizacion ELISA para Akt S473 de SuperArray Bioscience se puede utilizar en la presente invencion. En una realizacion, el anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-pan que reconoce Akt S473. El Kit Elisa de ensayo que contiene un anticuerpo anti-Akt y reactivos adicionales, que incluyen, pero no se limitan a, regulador de lavado, regulador de dilucion de anticuerpos, regulador de bloqueo, solucion de tincion celular, solucion de revelado, solucion de parada, anticuerpos secundarios, y agua destilada.
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Deteccion de nucleotidos
En otra realizacion, un metodo para detectar quinasas Akt se proporciona mediante la deteccion del nivel de expresion en una celula de un polinucleotido que codifica una quinasa Akt. La expresion del polinucleotido se puede determinar utilizando cualquier tecnica adecuada conocida por los expertos en la tecnica. En una realizacion, se puede utilizar un polinucleotido marcado que codifica una quinasa Akt como una sonda en una transferencia Northern de un extracto de ARN obtenido a partir de la celula. En otras realizaciones, se puede utilizar un extracto de acido nucleico de un animal en concierto con los cebadores de oligonucleotidos correspondiente para secuencias sentido y antisentido de un polinucleotido que codifica la quinasa, o las secuencias flanqueantes de la misma, en una reaccion de amplificacion de acido nucleico tal como Rt PCR. Una variedad de tecnicas de deteccion en fase solida automatizada tambien esta disponibles para un experto en la tecnica, por ejemplo, como se describe por Fodor et al. (Science 251: 767-777, 1991) y Kazal et al. (Nature Medicine 2: 753-759, 1996).
En otras realizaciones, se proporcionan metodos para detectar transcripciones de ARN que codifican quinasa Akt. El ARN se puede aislar de una muestra celular sospechosa de contener ARN de quinasa Akt, por ejemplo ARN total aislado de tejido de cancer humano. El ARN se puede aislar por metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo utilizando el reactivo TRIZOL (Gibco-BRL/Life Technologies, Gaithersburg, Md.). Los oligonucleotidos de secuencia aleatoria, oligo-dT, o asf como oligonucleotidos espedficos de secuencia se pueden emplear como un cebador en una reaccion de transcriptasa inversa para preparar cADN de primera hebra a partir del ARN aislado. El cADN de primera cadena resultante luego se puede amplificar con los oligonucleotidos espedficos de secuencia en las reacciones de PCR para producir un producto amplificado.
Reaccion en cadena de polimerasa o “PCR” se refiere a un procedimiento o tecnica en la que cantidades de un fragmento preseleccionado de acido nucleico, ARN y/o ADN, se amplifican como se describe, por ejemplo, en la Patente Estadounidense No. 4,683,195. Generalmente, la informacion de secuencia de los extremos de la region de interes o mas alla se emplea para disenar cebadores de oligonucleotidos. Estos cebadores seran identicos o similares en secuencia a cadenas opuestas de la plantilla que se va a amplificar. Se puede utilizar PCR para amplificar secuencias de ARN espedficas y cADN transcrito a partir de ARN celular total. Vease en general Mullis et al. (Quant. Biol. 51: 263, 1987; Erlich, eds., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989). Por lo tanto, la amplificacion de secuencias espedficas de acidos nucleicos por PCR se basa en oligonucleotidos o “cebadores” que tienen secuencias de nucleotidos conservadas en las que las secuencias conservadas se deducen de alineamientos de secuencias de genes o protemas relacionadas, por ejemplo, una comparacion de secuencias de los genes de quinasa de marnfferos Akt. Por ejemplo, se prepara un cebador que se predice se va a hibridar con la hebra antisentido y se prepara otro cebador que se predice se va a hibridar con la cadena sentido de una molecula de cADN que codifica una quinasa Akt. Para detectar el producto amplificado, la mezcla de reaccion se somete normalmente a electroforesis en gel de agarosa o de otra tecnica de separacion conveniente y la presencia relativa de la quinasa Akt detecto ADN amplificado espedfico. Por ejemplo, el ADN amplificado por quinasa Akt se puede detectar utilizando hibridacion de Southern con una sonda de oligonucleotido espedfica o la comparacion de su movilidad electroforetica con estandares de ADN de peso molecular conocido. El aislamiento, purificacion y caracterizacion del ADN de quinasa Akt amplificada se puede llevar a cabo mediante la escision o al eluir el fragmento a partir del gel (por ejemplo, vease las referencias Lawn et al., Nucleic Acids Res. 2: 6103, 1981; Goeddel et al., Nucleic cids Res. 8: 4057-1980), la clonacion del producto amplificado en un sitio de clonacion de un vector adecuado, tal como el vector pCRII (Invitrogen), la secuenciacion del inserto clonado y comparando la secuencia de ADN a la secuencia conocida de la quinasa LIM. Luego se pueden determinar las cantidades relativas de mARN y cADN de quinasa LIM.
En una realizacion, la PCR en tiempo real se puede utilizar para determinar los niveles de transcripcion de nucleotidos de Akt. La determinacion de la actividad transcripcional incluye tambien una medida de la actividad potencial traslacional basada en transcripciones de mARN disponibles. La PCR en tiempo real, asf como otros procedimientos de PCR utilizan una serie de qrnmicas para la deteccion de producto de PCR que incluye la union de ADN fluoroforos, los 5' de la endonucleasa, trazador de estirpes y horquilla adyacentes oligosondas y los amplicones de auto-fluorescente de union. Se discuten Estas qrnmicas y PCR en tiempo real en general, por ejemplo, en Mackay et al, Nucleic Acids Res 30 (6): 1292-1305, 2002; Walker, J. Biochem. Mol. Toxicologfa 15 (3): 121-127, 2001; Lewis et al., J. Pathol. 195: 66-71,2001.
En una realizacion alternativa, se puede identificar la expresion aberrante de Akt al poner en contacto secuencias de nucleotidos aisladas de una muestra biologica con una sonda de oligonucleotido que tiene una secuencia complementaria a una secuencia de Akt seleccionadas de las secuencias de nucleotido de las figuras 6a-c, 7a-d, o 8a-c, o fragmento del mismo y, luego detectar la secuencia mediante hibridacion de la sonda a la secuencia, y comparar los resultados con una muestra normal. La hibridacion de la sonda a la muestra biologica se puede detectar mediante el etiquetado de la sonda utilizando cualquier agente detectable. La sonda se puede marcar por ejemplo, con un radioisotopo, o con biotina, colorante fluorescente, reactivo denso en electrones, una enzima, hapteno o protema para el que los anticuerpos estan disponibles. El marcador detectable se puede ensayar mediante cualquier medio deseado, incluyendo medios espectroscopicos, fotoqmmicos, bioqmmicos, inmunoqmmicos, radioisotopicos, o qrnmicos. La sonda tambien se puede detectar utilizando tecnicas tales como una tecnica de restriccion de oligomeros, un ensayo dot blot, un ensayo de transferencia dot blot, un ensayo de
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sonda de lmea, y un ensayo de 5' nucleasa. Alternativamente, la sonda se puede detectar utilizando cualquiera de las tecnologfas de la matriz de ADN generalmente aplicables, incluidas las tecnologfas macromatriz, micromatriz y microchip de ADN. La sonda de oligonucleotido normalmente incluye aproximadamente por lo menos 14, 15, 16, 18, 20, 25 o 28 nucleotidos que se hibridan con los nucleotidos seleccionados de las figuras 6a-c, 7a-d, y 8a-c, o un fragmento del mismo. Generalmente, no se prefiere utilizar una sonda que es mayor que aproximadamente 25 o 28 nucleotidos de longitud. La sonda de oligonucleotido esta disenada para identificar una secuencia de nucleotidos Akt.
Ensayos de quinasa
La actividad de las quinasas Akt se puede medir utilizando cualquier ensayo de quinasa adecuado conocido en la tecnica. Por ejemplo, y no a modo de limitacion, xe pueden utilizar los metodos descritos en Hogg et al (Oncogene 1994 9:98-96), Mills et al (J. Biol. Chem. 1992 267:16000-006) and Tomizawa et al 2001 (FEBS Lett. 2001 4 2: 2217), Schmandt et al, (J. Immunol. 1994, 152:96-105). Adicionalmente se describen ensayos de serina, quinasa treonina y tirosina en Ausubel Ausubel et al. (Short Protocols in Molecular Biology, 1999, unit 17.6).
Generalmente se pueden utilizar ensayos de quinasa Akt, un polipeptido Akt, un sustrato donante marcado, y un sustrato receptor que es ya sea espedfico o no espedfico para Akt. En dichos ensayos el Akt transfiere un grupo funcional marcado del sustrato donante al sustrato receptor, y la actividad quinasa se mide por la cantidad de grupo funcional marcado transferido desde el sustrato donador al sustrato receptor. El polipeptido Akt se puede producir utilizando diversos sistemas de expresion, se puede purificar a partir de celulas, puede estar en forma de una protema de fusion recombinante dividido o no dividido y/o puede tener secuencias de polipeptido no-Akt, por ejemplo una etiqueta His o beta-galactosidasa en su terminal C o N. La actividad de Akt se puede ensayar en las estirpes de celulas de cancer si se utilizan estirpes de celulas de cancer como fuente de la Akt que se va a ensayar. Los sustratos donantes adecuados para ensayos de Akt incluyen cualquier molecula que es susceptible a la desfosforilacion por Akt., tal como, por ejemplo incluyen analogos de ATP y ATP marcados con gamma, en el que la etiqueta es 33P, 32P, 35S o cualquier otro isotopo radiactivo o un marcador fluorescente adecuado. Los sustratos receptores adecuados para ensayos de Akt incluyen cualquier polipeptido u otra molecula que sea susceptible a la fosforilacion por Akt. Los sustratos receptores se pueden derivar de fragmentos de objetivos de Akt in vivo. Los fragmentos de sustratos receptores pueden ser de 8 a 50 aminoacidos de longitud, por lo general de 10 a 30 aminoacidos y en particular de aproximadamente 10, 12, 15, 18, 20 y 25 aminoacidos de longitud. Otros sustratos receptores se pueden determinar empmcamente utilizando un conjunto de diferentes polipeptidos u otras moleculas. Los objetivos de sustratos receptores para TTK pueden ser capaces de ser purificados a partir de otros componentes de la reaccion una vez que se ha realizado la reaccion. Esta purificacion se realiza generalmente a traves de una interaccion molecular, en donde los sustratos receptores se biotinilan y se purifican a traves de su interaccion con estreptavidina, o un anticuerpo espedfico que este disponible puede reconocer espedficamente los sustratos receptores. La reaccion se puede realizar en una variedad de condiciones, tales como en un soporte solido, en un gel, en solucion o en celulas vivas. La eleccion de los metodos de deteccion depende del tipo de marca utilizada en la molecula donante y puede incluir, por ejemplo, la medicion de la radiacion o fluorescencia incorporada por autorradiograffa, centelleo, escaneo o fluorograffa.
IV. Tratamiento
Los compuestos y composiciones farmaceuticas proporcionadas aqrn se pueden utilizar en el tratamiento de una afeccion que incluye tumores, cancer y otros trastornos asociados con la proliferacion celular anormal. En una realizacion, los compuestos de la presente invencion se pueden utilizar para tratar un carcinoma, sarcoma, linfoma, leucemia, y/o mieloma. En otras realizaciones de la presente invencion, los compuestos divulgados aqrn se pueden utilizar para tratar tumores solidos.
Los compuestos de la presente invencion se pueden utilizar para el tratamiento de cancer, tal como, cancer de los siguientes organos o tejidos: mama, prostata, pulmon, bronquio, colon, urinario vejiga, linfoma no Hodgkin, melanoma , rinon, renal, pancreas, faringe, tiroides, estomago, cerebro, mieloma multiple, esofago, Idgado, los conductos biliares intrahepaticos, cuello del utero, de la laringe, leucemia mieloide aguda, leucemia linfatica cronica, tejidos blandos, tales como el corazon, el linfoma de Hodgkin, testfculo, intestino delgado, leucemia mieloide cronica, leucemia linfatica aguda, ano, canal anal, anorrectal, tiroides, la vulva, la vesfcula biliar, pleura, ojo, cavidad de la nariz nasal, ofdo medio, nasofaringe, ureter, peritoneo, omento, mesenterio, y gastrointestineal, de alto grado, glioblastoma, colon, rectal, glioma de pancreas, cancer gastrico, carcinoma hepatocelular; canceres de cabeza y cuello, carcinomas; carcinoma de celulas renales; adenocarcinoma; sarcomas; hemangioendotelioma; linfomas; leucemias, micosis fungoide.
Las composiciones de esta invencion se pueden utilizar para tratar estos canceres y otros canceres en cualquier etapa desde el descubrimiento del cancer a etapas avanzadas. Adicionalmente, las composiciones de esta invencion se pueden utilizar en el tratamiento del cancer primario y metastasis de los mismos.
En otras realizaciones de la presente invencion, los compuestos descritos aqrn se pueden utilizar para el tratamiento de cancer, que incluye, los canceres enumerados en la Tabla 2 a continuacion.
- □ Tabla 2: Tipos de Cancer
- □ leucemia linfoblastica aguda, Adulto
- □ Leucemia de celulas pilosas
- leucemia linfoblastica aguda, Infantil
- Cancer de cabeza y cuello Cancer hepatocelular (hngado), Adulto (primario)
- Leucemia mieloide aguda, Adulto
- Cancer hepatocelular (tngado), Infantil (Primario)
- leucemia mieloide aguda, infantil,
- Linfoma de Hodgkin adultos
- Carcinoma corticosuprarrenal
- Linfoma de Hodgkin, Infantil
- carcinoma corticosuprarrenal,
- linfoma de Hodgkin durante el embarazo
- Infancia
- Cancer hipofaringeo
- canceres relacionado con SIDA
- hipotalamico y rutas visuales
- linfoma relacionado con SIDA
- glioma, Infantil
- cancer anal
- □ melanoma intraocular
- astrocitoma, cerebeloso infantil
- □ Carcinoma de celula isla (pancreas endocrino)
- astrocitoma, cerebral infantil
- □ sarcoma de Kaposi
- □ Carcinoma de celula basal
- Cancer de rinon(celulas renales)
- cancer de ducto filial, extrahepatico,
- cancer del rinon Infantil
- cancer de vejiga
- h cancer de la laringe
- cancer de vejiga, infantil
- cancer de laringe, infantil
- cancer oseo, osteosarcoma/fibroso maligno
- leucemia aguda Linfoblastica, Adulto Leucemia Linfoblastica Aguda,
- histiocitoma
- infantil
- glioma del tronco encefalico, infantil
- Leucemia aguda mieloide, adultos
- tumor cerebral, adultos,
- leucemia aguda mieloide, infantil,
- tumor encefalico glioma del tronco encefalico, infantil
- leucemia linfocftica Leucemia cronica, mielogena
- tumor cerebral cronico, cerebeloso
- leucemia, de celula B
- astrocitoma infantil
- cancer de labios y cavidad oral
- Tumor del cerebro, cerebral
- cancer de hngado, adulto (primario)
- astrocitoma/glioma maligno, infantil
- cancer de hngado, Infantil (primario)
- tumor cerebral ependimoma, infantil
- cancer de pulmon, de celula no microcftica,
- tumor cerebral, meduloblastoma, infantil
- Cancer de pulmon, de celulas pequenas linfoma, relacionado con el SIDa Linfoma de Burkitt, Linfoma cutaneo de celulas T, vease
- tumor cerebral, supratentoriales
- micosis fungoide y smdrome de Sezary
- neuroectodermicos primitivos
- linfoma, enfermedad de Hodgkin, adultos,
- tumores infantiles
- linfoma, enfermedad de Hodgkin, infancia
- Tumor de cerebro, rutas opticas y
- linfoma de Hodgkin durante el embarazo
- glioma hipotalamico, infantil
- Linfoma, no Hodgkin, adulto
- tumor de cerebro, Infantil
- linfoma, no Hodgkin, infantil
- cancer de mama
- linfoma, no-Hodgkin durante el embarazo,
- Cancer de Mama, Infantil
- linfoma, Sistema nervioso central
- Cancer de Mama Hombre
- □ macroglobulinemia,de Waldenstrom
- adenomas/carcinoides bronquiales, infantil
- histiocitoma fibroso maligno
- linfoma de Burkitt
- hueso/osteosarcoma
- □ tumor carcinoide, Infantil
- meduloblastoma, Infantil
- □ tumor carcinoide, gastrointestinal
- melanoma
- Carcinoma de origen primario desconocido
- melanoma, intraocular (ojo)
- linfoma del sistema nervioso central, primario
- Carcinoma de celulas de Merkel
- astrocitoma cerebeloso, Infantil
- mesotelioma, enfermedad maligna en adultos
- astrocitoma cerebral /maligno,
- mesotelioma Infantil
- glioma, Infantil
- cancer de cuello epidermoide metastasico con primario
- cancer de cuello uterino
- oculto
- canceres infantiles
- Smdrome de neoplasia endocrina multiple, infantil
- leucemia linfocftica cronica
- mieloma multiple/Neoplasia de celulas plasmaticas
- leucemia mielogena cronica
- Fungoides micosis
- trastornos mieloproliferativos cronicos
- smdromes mielodisplasicos
- cancer de colon
- enfermedades mielodisplasicas/mieloproliferativas
- cancer colorrectal, infantil
- leucemia mielogena, cronica
- linfoma cutaneo de celulas T, ver
- leucemia mieloide aguda en adultos
- micosis fungoide y Smdrome de Sezary
- leucemia mieloide, aguda infantil
- □ cancer endometrial
- mieloma multiple,
- ependimoma, Infantil
- trastornos mieloproliferativos, cronicos
- cancer de esofago
- □ cancer de cavidad nasal y senos paranasales
- □ Tabla 2: Tipos de Cancer
- cancer de esofago, infantil Tumores de la familia de Ewing Tumor de celulas germinales, extracraneal infantil tumores de celulas germinales extragonadales cancer de rutas biliares extrahepaticas cancer de ojo, melanoma intraocular cancer ocular, Retinoblastoma □ cancer de vesmula biliar cancer gastrico (de estomago) cancer gastrico (de estomago), infantil Tumor carcinoide gastrointestinal tumor de celulas germinales, extracraneal, infantil tumor de celulas germinales, extragonadales Tumor de celulas germinales, de ovario Tumor trofoblastico de gestacion
- cancer de nasofaringe cancer de nasofaringe, infantil Neuroblastoma Linfoma no Hodgkin, adulto linfoma no hodgkin , infantil linfoma de no Hodgkin durante embarazo, cancer de pulmon no microdtico □ cancer oral, Infantil cancer de la cavidad oral, labios y orofaringeo Osteosarcoma/fibroso maligno histiocitoma de hueso cancer de ovario, infantil cancer epitelial ovarico tumor de celulas germinales de ovario Tumor de bajo potencial maligno de ovario □ cancer pancreatico
- glioma, adulto glioma, del tronco encefalico infantil glioma cerebral infantil astrocitoma glioma de rutas opticas infatil y de hipotalamo □ cancer de piel (melanoma) carcinoma de piel, celula de Merkel cancer de pulmon de celula microdtica
- cancer de pancreas, infantil cancer de pancreas, celulas islotes cancer de seno paranasal y cavidad nasal cancer paratiroideo cancer de pene feocromocitoma pineoblastoma y supratentoriales tumores neuroectodermicos primitivos, Infantiles tumor de pituitaria
- cancer del intestino delgado sarcoma de tejido blando, adulto sarcoma de tejido blando, Cinfantil Carcinoma de celulas epidermoides, ver cancer de pie l(no melanoma) cancer de cuello epidermoide con tumor primario oculto, metastasico Cancer de estomago (gastrico) Cancer de estomago (gastrico), Infantil tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales, infantiles □ Linfoma de celula T, cutaneo, ver micosis fungoide y Smdrome de Sezary cancer testicular timoma, Infantil timoma y carcinoma timico cancer de tiroides cancer de tiroides, Infantil cancer de celulas de transicion de pelvis renal y ureter tumor trofoblastico, gestacional □ Carcinoma de sitio primario desconocido, de adulto Cancer de sitio primario desconocido, infantil Canceres poco comunes infantiles cancer de celulas de transicion de pelvis renal y ureter
- Neoplasia/multiplemieloma de celulas plasmaticas Blastoma pleuropulmonar Cancer de embarazo y mama Embarazo yLinfoma de Hodgkin embarazo y linfoma no Hodgkin linfoma del sistema nervioso central primario Cancer dede Prostata □ cancer rectal Cancer de celula renal (rinon) Cancer de celula renal (rinon) , Infantil cancer de transicion de celulas de pelvis renal y ureter Retinoblastoma rabdomiosarcoma , Infantil □ cancer de glandula salival cancer de glandula salival, Infantil sarcoma, de tumores de familia de Ewing sarcoma de Kaposi,tejido blando, adulto sarcoma, tejido blando, Infantil sarcoma, uterino Smdrome de Sezary cancer de piel (no melanoma) cancer de piel, Infantil
- Cancer de uretra Cancer uterino ,de endometrio sarcoma uterino □ cancer de la vagina glioma de las rutas opticas y del hipotalamo, infantil cancer de vulva □ Macroglobulinemia de Waldenstrom Tumor de Wilms
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Tumores o canceres resistentes a farmacos
La invencion proporciona compuestos que se pueden utilizar para tratar el cancer resistente a farmacos, que incluyen las realizaciones de canceres y farmacos divulgados aqm. En una realizacion, se puede TCN-P coadministrar con un segundo farmaco.
La resistencia a multiples farmacos (MDR) se produce en canceres humanos y puede ser un obstaculo importante para el exito de la quimioterapia. La resistencia a multiples farmacos es un fenomeno por el cual las celulas tumorales in vitro que han sido expuestas a un agente citotoxico desarrollan resistencia cruzada a un rango de compuestos estructural y funcionalmente no relacionados. Adicionalmente, MDR puede ocurrir intrmsecamente en algunos tipos de cancer y sin exposicion previa a los agentes de quimioterapia. Por lo tanto, en una realizacion, la presente invencion proporciona tratamientos a un paciente con un cancer resistente a farmacos, por ejemplo cancer resistente a multiples farmacos, mediante la administracion de TCN-P.
En ciertas realizaciones, TCN-P se puede utilizar para tratar canceres que son resistentes a taxol, rapamicina, tamoxifeno, cisplatino, y/o gefitinib (Iressa).
En una realizacion, TCN-P se puede utilizar para el tratamiento de canceres resistentes a farmacos del colon, hueso, rinon, adrenal, pancreas, tugado y/o cualquier otro tipo de cancer conocido en la tecnica o descritos aqm.
Terapia de combinacion
En un aspecto de la presente invencion, los compuestos y composiciones divulgados aqm se pueden combinar con por lo menos un agente quimioterapeutico adicional. Los agentes adicionales se pueden administrar en combinacion o alternancia con los compuestos divulgados aqm. Los farmacos pueden formar parte de la misma composicion, o proporcionarse como una composicion separada para administracion al mismo tiempo o un tiempo diferente.
En una realizacion, los compuestos divulgados aqm se pueden combinar con agentes antiangiogenicos para aumentar su efectividad, o combinarse con otros agentes antiangiogenicos y administrarse junto con otros agentes citotoxicos. En otra realizacion, los compuestos y composiciones, cuando se utiliza en el tratamiento de tumores solidos, se pueden administrar con los agentes seleccionados de, pero no limitado a IL-12, retinoides, interferones, angiostatina, endostatina, talidomida, trombospondina-1, trombospondina-2, captoprilo, agentes antineoplasicos tales como interferon alfa, COMP (ciclofosfamida, vincristina, metotrexato y prednisona), etoposido, mBACOD (metotrexato, bleomicina, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina y dexametasona), PRO-MACE/MOPP (prednisona, metotrexato (rescate de w/leucovin), doxorrubicina, ciclofosfamida, taxol, etoposido/mecloretamina, vincristina, prednisona y procarbazina), vincristina, vinblastina, angioinhibinas, TNP-470, polisulfato de pentosano, factor plaquetario 4, angiostatina, LM-609, SU-101, CM-101, Techgalan, talidomida, SP-PG y la radiacion. En realizaciones adicionales, los compuestos y composiciones divulgadas aqm se pueden administrar en combinacion o alternancia con, por ejemplo, farmacos con efectos antimitoticos, tales como los que se dirigen a elementos citoesqueleticos, incluyendo moduladores de microtubulos tales como farmacos de taxano (tales como taxol, paclitaxel, taxotere , docetaxel), podofilotoxinas o alcaloides vinca (vincristina, vinblastina); farmacos antimetabolitos (tales como 5-fluorouracilo, citarabina, gemcitabina, analogos de purina tales como pentostatina, metotrexato); agentes de alquilacion o mostazas nitrogenadas (tales como nitrosoureas, ciclofosfamida o ifosfamida); farmacos que se dirigen a ADN tal como farmacos de antraciclina adriamicina, doxorrubicina, farmorrubicina o epirubicina; farmacos que se dirigen a las topoisomerasas tales como el etoposido; hormonas y agonistas o antagonistas de hormonas tales como estrogenos, antiestrogenos (tamoxifeno y compuestos relacionados) y androgenos, flutamida, leuprorelina, goserelina, ciprotrona o octreotide; farmacos que se dirigen a la transduccion de senales en celulas tumorales incluyendo derivados de anticuerpos tales como herceptina; farmacos alquilantes tales como farmacos de platino (cis-platino, carboplatino, oxaliplatino, paraplatino) o nitrosoureas; farmacos que afectan potencialmente la metastasis de tumores tales como inhibidores de metaloproteinasa de la matriz; terapia genica y agentes antisentido; anticuerpos terapeuticos; otros compuestos bioactivos de origen marino, principalmente las didemninas tales como la aplidina; analogos de esteroides, en particular dexametasona; farmacos antiinflamatorios, incluyendo agentes no esteroideos (tales como el acetaminofeno o el ibuprofeno) o esteroides y sus derivados, en particular dexametasona; farmacos anti-emeticos, que incluyen inhibidores 5HT-3 (tales como gramisetron o ondasetron), y esteroides y sus derivados, en particular dexametasona. En todavfa otras realizaciones, los compuestos y composiciones se pueden utilizar en combinacion o alternancia con los agentes quimioterapeuticos se divulgan a continuacion en la Tabla 3.
- Tabla 3: agentes quimioterapeuticos
- -13-cis-retinoico -2-amino-6- mercaptopurina -2-CdA -2-clorodesoxiadenosina -5-fluorouracilo
- -Neosar -Neulasta -Neumega -Neupogen -Nilandron -Nilutamida
- -5-FU -6 -TG -6 -Tioguanina -6-mercaptopurina -6-MP - Accitano - actinomicina-D -Adriamicina - Adrucilo
- -Nitrogeno mostaza -Novaldex -Novantrona - octreotido - acetatooctreotido -Oncospar - Oncovin - Ontak - Onxal
- - Acrilina - Ala-Cort - Aldesleukina - Alemtuzumab - Alitretinoina - Alkaban-AQ - Alkeran - Acido transretinoico -Alpha interferon -Altretamina - Ametopterina - Amifostina -Aminoglutetimida -Anagrelida - Anandron -Anastrozol -Arabinosilcitosina -ara-C -Aranesp -Aredia -Arimidex -Aromasin - trioxido de arsenico -Asparaginase -ATRA -Avastina -BCG -BCNU - Bevacizumab -Bexaroteno -Bicalutamide -BiCNU -Blenoxane -Bleomicina -Bortezomib -Busulfan -Busulfex -C225 - Leucovorina Calcio
- -Oprevelkin -Orapred -Orasona -Oxaliplatino -Paclitaxel -Pamidronato -Panretina - Paraplatino -Pediapred - interferon PEG -Pegaspargasa -Pegfilgrastim -PEG-INTRON -PEG-L-asparaginasa -mostaza de fenilalanina -Platinol -Platinol-AQ -Prednisolona -Prednisona -Prelona -Procarbazina -PROCRIT -Proleukina -Prolifeprospan 20 con implante de carmustina -Purinetol -Raloxifeno -Reumatrex -Rituxan -Rituximab -Roveron-A (interferon alfa-2a) -Rubex - clorhidrato de Rubidomicina -Sandostatina -Sandostatina LAR - sargramostima -Solu-Cortef -Solu-Medrol -STI-571 -Estreptozocina
- -Campath - Camptosar - camptotecina-11 -Capecitabina -Carac -Carboplatino -Carmustina -Carmustina oblea
- -Tamoxifen -Targretin -Taxol -Taxotere -Temodar -Temozolomida -Teniposida -TESPA
- -Casodex -CCNU -CDDP -CeeNU -Cerubidina -cetuximab -Clorambucilo -Cisplatino - Factor de Citrovorum -Cladribina -Cortisona -Cosmegen - CPT-11 -Ciclofosfamida -Citadren -Citarabina -Citarabina liposomal -Citosar-T - Citoxan -Dacarbazina - dactinomicina -Darbepoetina alfa -Daunomicina -Daunorrubicina - clorhidrato de Daunorrubicina
- -talidomida -Talomid -TheraCys -Tioguanina -Tioguanina tabloide -Tiofosfoamida -Tioplex -Tiotepa -TICE -Toposar -Topotecan -Toremifeno -Trastuzumab -Tretinoina -Trexall -Trisenox -TSPA -VCR - Velban -Velcade -VePesid -Vesanoid -Viadur -Vinblastina - Sulfato de Vinblastina -Vincasar Pfs
- -Daunorrubicina liposomal -DaunoXome -Decadron -Delta -Cortef -Deltasona -Denileuquina diftitox -DepoCyt -dexametasona - acetato de dexametasona - fosfato de dexametasona sodio -Dexasona
- -Vincristina -Vinorelbina - tartrato de vinorelbina -VLB -VP-16 -Vumon -Xeloda -Zanosar -Zevalina -Zinecard -Zoladex -acido Zoledronico
- -Dexrazoxana -DHAD
- -Zometa oblea-Gliadel
- -DIC -Diodex -Docetaxel -Doxil - doxorrubicina
- -Glivec -GM-CSF -Goserelina -granulocito - factor estimulante de colonia factor estimulante de colonia de macrofago granulocito
- Doxorrubicina liposomal -Droxia
- -Halotestina
- -DTIC -DTIC-Dome -Duralone -Efudex - Eligard - Ellence -Eloxatin -Elspar -Emcyt -Epirrubicina -Epoetin alfa -Erbitux -Erwinia L-asparaginasa - estramustina
- -Herceptina -Hexadrol - Hexalen -Hexametilmelamina -HMM -Hicamtin -Hidrea - Acetato de Hidrocort -Hidrocortisona - fosfato de hidrocortisona sodio succinato de hidrocortisona sodio - fosfato de Hidrocortona -hidroxiurea -Ibritumomab
- -Etiol
- -Ibritumomab Tiuxetan
- -Etopofos
- -Idamicina
- -Etoposida
- -Idarubicin
- -fosfato de Etoposida
- -Ifex
- -Eulexina
- I-IFN-alfa
- -Evista
- - ifosfamida
- -Exemestane
- -IL -2
- -Fareston
- - IL-11
- -Faslodex
- - mesilato de Imatinib
- -Femara
- -Imidazol carboxamida
- -Filgrastim
- interferon alfa
- -Floxuridina
- interferon alfa-2b (PEG conjugado)
- -Fludara
- -Interleuquina -2
- -Fludarabina
- -Interleuquina-11
- -Fluoroplex
- intron A (interferon alfa-2b)
- fluorouracilo
- -Leucovorin
- fluorouracilo (crema)
- -Leukeran
- -Fluoximesterona
- -Leukine
- -Flutamida
- -Leuprolida
- -acido Folmico
- -Leurocristina
- -FUDR
- -Leustatina
- -Fulvestrant
- -Liposomal Ara-C
- -G-CSF
- lfquido que Pred
- -Gefitinib
- -Lomustina
- -Gemcitabina
- -L-PAM
- -Gemtuzumab ozogamicina
- -L-Sarcolisina
- -Gemzar
- - Meticorten
- -Gleevec
- -Mitomicina
- -Lupron
- -Mitomicina-C
- -Lupron Depot
- -Mitoxantrona
- -Matulano
- -M-Prednisol
- -Maxidex
- -MTC
- -Mecloretamina
- -MTX
- -Clorhidrato de mecloretamina
- -Mustargen -Mustina
- -Medralona
- -Mutamicina
- -Medrol
- -Mileran
- -Megace
- -Iressa
- -Megestrol
- -Irinotecan
- - acetato de Megestrol
- -Isotretinoin
- -Melfalan
- - Kidrolase
- -Mercaptopurina
- -Lanacort
- -Mesna
- -L-asparaginasa
- - Mesnex
- -LCR
- - metotrexato
- -Methtrexato sodio
- -Metilprednisolona
- - Milocel
- -Letrozol
En ciertas realizaciones, se pueden utilizar interferones (IFN) en combinaciones con los compuestos de la presente 5 invencion. Los intereferones adecuados incluyen: interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, interferon alfa pegilado, que incluyen interferon alfa-2a y interferon alfa 2b, interferon beta, interferon gamma, interferon tau, interferon omega, INFERGEN® (interferon alphacon-1) por InterMune, OMNIFERON (interferon natural) por Viragen, ALBUFERON por Human Genome Sciences, REBIF (interferon beta-1a) por Ares-Serono, Omega interferon por biomedicina, Oral interferon Alfa por Amarillo Biosciences, e interferon gamma, interferon tau, y/o gamma interferon-1b por InterMune.
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En una realizacion, la TCN-P se puede utilizar en combinacion o alternancia con agentes quimioterapeuticos adicionales, tales como aquellos descritos aqrn o en la Tabla 3, para el tratamiento de cancer resistente a farmacos, por ejemplo cancer resistente a multiples farmacos. Los canceres resistentes a farmaco pueden incluir los canceres de colon, hueso, rinon, adrenal, pancreas, fngado y/o cualquier otro tipo de cancer conocido en la tecnica o descrito 15 aqrn. En una realizacion, el agente quimioterapeutico adicional puede ser un inhibidor de la P-glicoprotema. En
ciertas realizaciones no limitantes, el inhibidor de glicoprotema P se puede seleccionar de entre los siguientes
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farmacos: verapamilo, ciclosporina (por ejemplo, ciclosporina A), tamoxifeno, antagonistas de calmodulina, dexverapamilo, dexniguldipino, valspodar (PSC 833), biricodar (VX-710), tariquidar (XR9576), zosuquidar (LY335979), laniquidar (R101933), y/o ONT-093.
V. Composiciones farmaceuticas
Los portadores farmaceuticos adecuados para administracion de los compuestos proporcionados aqu incluyen cualquiera de los portadores conocidos por aquellos expertos en la tecnica que son adecuados para el modo particular de administracion. Los compuestos se pueden formular como el unico ingrediente farmaceuticamente activo en la composicion o se pueden combinar con otros ingredientes activos.
Las composiciones que comprenden los compuestos divulgados aqu pueden ser adecuadas para administracion oral, rectal, nasal, topica (que incluyen bucal y sublingual), vaginal, o parenteral (que incluyen subcutanea, intramuscular, subcutanea, intravenosa, intradermica, intraocular, intratraqueal, intracisternal, intraperitoneal, y epidural).
Las composiciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosificacion unitaria y se pueden preparar mediante tecnicas farmaceuticas convencionales. Dichas tecnicas incluyen la etapa de poner en asociacion una o mas composiciones de la presente invencion y uno o mas portadores o excipientes farmaceuticos.
Los compuestos se pueden formular en preparaciones farmaceuticas adecuadas tales como soluciones, suspensiones, comprimidos, comprimidos dispersables, pfldoras, capsulas, polvos, formulaciones de liberacion sostenida o elixires, para administracion oral en soluciones o suspensiones esteriles para administracion parenteral, asf como preparacion de parche transdermico e inhaladores de polvo seco. En una realizacion, los compuestos descritos anteriormente se formulan en composiciones farmaceuticas utilizando tecnicas y procedimientos bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition 1985, 126).
En las composiciones, las concentraciones efectivas de uno o mas compuestos o derivados farmaceuticamente aceptables de los mismos se pueden mezclar con uno o mas portadores farmaceuticos adecuados. Los compuestos se pueden derivatizar como las sales, esteres, eteres o esteres de enol, acetales, cetales, ortoesteres, hemiacetales, hemicetales, acidos, bases, solvatos, hidratos o profarmacos correspondientes antes de formulacion. Las concentraciones de los compuestos en las composiciones son eficaces para el suministro de una cantidad, luego de administracion, que trata, previene, o mejora uno o mas de los smtomas de la enfermedad o trastorno objetivo. En una realizacion, las composiciones se formulan para administracion de dosificacion unica. Para formular una composicion, la fraccion en peso del compuesto se disuelve, suspende, dispersa o mezcla de otro modo en un portador seleccionado a una concentracion eficaz de tal manera que se alivia, previene la afeccion tratada, o se mejoran uno o mas smtomas.
Las composiciones adecuadas para administracion oral se pueden presentar como unidades discretas tales como, comprimidos, comprimidos oblongos, pfldoras o grageas capsulas o cachets, que contiene cada uno una cantidad predeterminada de una o mas de las composiciones; como un polvo o granulos; como una solucion o una suspension en un lfquido acuoso o un lfquido no acuoso; o como una emulsion lfquida de aceite en agua o una emulsion de agua en aceite o como un bolo.
Las composiciones lfquidas farmaceuticamente administrables, por ejemplo, se pueden preparar por disolucion, dispersion, o de otra manera mezclando un compuesto activo como se ha definido anteriormente y adyuvantes farmaceuticos opcionales en un portador, tal como, por ejemplo, agua, solucion salina, dextrosa acuosa, glicerol, glicoles, etanol, y similares, para formar de este modo una solucion o suspension. Si se desea, la composicion farmaceutica a administrar tambien puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no toxicas tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes solubilizantes, agentes reguladores del pH, conservantes, agentes aromatizantes, y similares, por ejemplo, acetato, citrato de sodio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitan, acetato de sodio de trietanolamina, oleato de trietanolamina, y otros de tales agentes. Metodos de preparacion de dichas formas de dosificacion son conocidos, o seran evidentes, para aquellos expertos en esta tecnica; por ejemplo, vease Remington Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 15a edicion, 1975.
Las composiciones de la presente invencion adecuadas para la administracion topica en la boca incluyen, por ejemplo, pastillas, que tiene los ingredientes en una base aromatizada, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas, que tienen una o mas de las composiciones de la presente invencion en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales, que tiene una o mas de las composiciones de la presente invencion se administra en un portador lfquido adecuado.
Los comprimidos, pfldoras, capsulas, trociscos y similares pueden contener uno o mas de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante; un lubricante; un diluyente; un deslizante; un agente disgregante; un agente colorante; un agente edulcorante; un agente saborizante; un agente humectante; un
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recubrimiento emetico; y un recubrimiento de peKcula. Ejemplos de aglutinantes incluyen celulosa microcristalina, goma de tragacanto, solucion de glucosa, mudlago de acacia, solucion de gelatina, melaza, polvinilpirrolidina, povidona, crospovidonas, sacarosa y pasta de almidon. Los lubricantes incluyen talco, almidon, magnesio o estearato de calcio, licopodio y acido estearico. Los diluyentes incluyen, por ejemplo, lactosa, sacarosa, almidon, caolm, sal, manitol y fosfato de calcio. Los deslizantes incluyen, dioxido de silicio coloidal. Los agentes disgregantes incluyen croscarmelosa de sodio, glicolato de sodio de almidon, acido algmico, almidon de mafz, almidon de patata, bentonita, metilcelulosa, agar y carboximetilcelulosa. Los agentes colorantes incluyen, por ejemplo, cualquiera de los colorantes FD y C solubles en agua certificados aprobados, mezclas de los mismos; y los colorantes FD y C insolubles en agua suspendidos en hidrato de alumina. Los agentes edulcorantes incluyen sacarosa, lactosa, manitol y agentes edulcorantes artificiales tales como sacarina, y cualquier numero de sabores secados por pulverizacion. Los agentes aromatizantes incluyen aromas naturales extrafdos de plantas tales como frutas y mezclas sinteticas de compuestos que producen una sensacion agradable, tales como, menta y salicilato de metilo. Los agentes humectantes incluyen monoestearato de propilenglicol, monooleato de sorbitan, monolaurato de dietilenglicol y lauril eter de polioxietileno. Los recubrimientos emeticos incluyen acidos grasos, grasas, ceras, goma laca, goma laca amoniacal y ftalatos de acetato de celulosa. Los recubrimientos de pelfcula incluyen hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, polietilenglicol 4000 y ftalato de acetato de celulosa.
Las composiciones adecuadas para la administracion topica a la piel pueden presentarse como unguentos, cremas, geles, y pastas, que tiene una o mas de las composiciones administradas en un portador farmaceutico aceptable.
Las composiciones para administracion rectal se pueden presentar como un supositorio con una base adecuada que comprende, por ejemplo, manteca de cacao o un salicilato.
Las composiciones adecuadas para administracion nasal, cuando el portador es un solido, incluyen un polvo grueso que tiene un tamano de partfcula, por ejemplo, en el rango de 20 a 500 micras que se administran de la manera en que se toma el tabaco, (es decir, mediante inhalacion rapida a traves del conducto nasal desde un recipiente del polvo que se mantiene cerca de la nariz). Cuando el portador es un lfquido (por ejemplo, un pulverizador nasal o como gotas nasales), una o mas de las composiciones se pueden mezclar en una solucion acuosa o aceitosa, e inhalar o pulverizar en el pasaje nasal.
Las composiciones adecuadas para administracion vaginal se pueden presentar como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de pulverizacion que contienen una o mas de las composiciones y portadores apropiados.
Las composiciones adecuadas para la administracion parenteral incluyen soluciones de inyeccion esteriles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, reguladores, bacteriostaticos, y solutos que hacen formulacion isotonica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones acuosas y no acuosas esteriles que pueden incluir agentes de suspension y agentes espesantes. Las composiciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitaria o de multiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en una condicion secada por congelacion (liofilizado) que requiere solo la adicion del portador lfquido esteril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de uso. Las soluciones y suspensiones para inyeccion extemporaneas se pueden preparar a partir de polvos esteriles, granulos y comprimidos del tipo previamente descrito.
Los medios portadores solidos o lfquidos organicos o inorganicos farmaceuticos adecuados para administracion enteral o parenteral se pueden utilizar para fabricar las composiciones. La gelatina, lactosa, almidon, estearato de magnesio, talco, grasas vegetales y animales y aceites, goma, glicol de polialquileno, agua, u otros portadores conocidos pueden todos ser adecuados como medios portadores.
Las composiciones se pueden utilizar como el ingrediente activo en combinacion con medios portadores uno o mas medios portadores y/o excipientes farmaceuticamente aceptables. Como se utiliza aqrn, “medio portador farmaceuticamente aceptable” incluye cualquiera y todos los portadores, solventes, diluyentes, u otros veldculos lfquidos, de dispersion o suspension SIDA, agentes de superficie activa, agentes isotonicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes solidos, lubricantes, adyuvantes , vedculos, sistemas de administracion, disgregantes, absorbentes, conservantes, surfactantes, colorantes, saborizantes, o edulcorantes y similares, segm sea adecuado para la forma de dosificacion particular deseada.
Adicionalmente, las composiciones se pueden combinar con excipientes farmaceuticamente aceptables, y, opcionalmente, matrices de liberacion sostenida, tales como polfmeros biodegradables, para formar composiciones terapeuticas. Un “excipiente farmaceuticamente aceptable” incluye un relleno solido, semi-solido o lfquido no toxico, diluyente, material de encapsulacion o auxiliar de formulacion de cualquier tipo.
Se entendera, sin embargo, que el uso diario total de las composiciones sera decidido por el medico asistente dentro del alcance del juicio medico. El nivel de dosis terapeuticamente eficaz espedfica para cualquier anfitrion en particular dependera de una variedad de factores, que incluyen por ejemplo, el trastorno que se va a tratar y la gravedad del trastorno; actividad de la composicion espedfica empleada; la composicion espedfica empleada, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administracion; ruta de administracion; la
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velocidad de excrecion del compuesto espedfico empleado; la duracion del tratamiento; farmacos utilizados en combinacion o coincidenca con la composicion espedfica empleada; y como factores bien conocidos en las tecnicas medicas. Por ejemplo, esta bien dentro de la experiencia de la tecnica comenzar con dosis de la composicion a niveles mas bajos que aquellos requeridos para lograr el efecto terapeutico deseado y aumentar gradualmente la dosificacion hasta que se consiga el efecto deseado.
Las composiciones se formulan preferiblemente en forma unitaria de dosificacion para facilidad de administracion y uniformidad de dosificacion. “Forma de dosificacion unitaria”, como se utiliza aqrn, se refiere a una unidad ffsicamente discreta de la composicion adecuada para el anfitrion a ser tratado. Cada dosis debe contener la cantidad de la composicion calculada para producir el efecto terapeutico deseado ya sea como tal, o en asociacion con el medio portador farmaceutico seleccionado.
Las formulaciones de dosificacion unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis o unidad diaria, subdosis diaria, o una fraccion apropiada de la misma, del ingrediente administrado. Por ejemplo, aproximadamente 1-5 mg por dfa de un compuesto descrito aqrn puede reducir el volumen de un tumor solido en ratones.
La dosificacion dependera de factores del anfitrion tales como el peso, la edad, area superficial, metabolismo, distribucion de tejido, la tasa de absorcion y la tasa de excrecion. En una realizacion, de aproximadamente 0.5 a 7 gramos por dfa de un compuesto descrito aqrn se pueden administrar a los humanos. Opcionalmente, aproximadamente de 1 a 4 gramos por dfa del compuesto se pueden administrar a los humanos. En ciertas realizaciones 0.001-5 mg/dfa se administra a un humano. El nivel de dosis terapeuticamente eficaz dependera de muchos factores como se senalo anteriormente. Adicionalmente, esta bien dentro de la experiencia de la tecnica comenzar con dosis de la composicion a niveles relativamente bajos, y aumentar la dosificacion hasta que se consigue el efecto deseado.
Las composiciones que comprenden un compuesto descrito aqrn se pueden utilizar con una matriz de liberacion sostenida, que puede ser hecha de materiales, normalmente polfmeros, que son degradables por hidrolisis enzimatica o a base de acido o por disolucion. Una vez insertado en el cuerpo, la matriz se acciona por enzimas y fluidos corporales. Una matriz de liberacion sostenida, por ejemplo, se elige a partir de materiales biocompatibles tales como liposomas, polilactidas (acido polilactico), poliglicolido (polfmero de acido glicolico), polilactida co-glicolida (copolfmeros de acido lactico y acido glicolico), polianfndridos, poli (orto) esteres, polipeptidos, acido hialuronico, colageno, sulfato de condroitina, acidos carboxcylic, acidos grasos, fosfolfpidos, polisacaridos, acidos nucleicos, poliaminoacidos, aminoacidos tales como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleotidos, propileno polivimlico, polivinilpirrolidona y silicona. Una matriz biodegradable preferida es una matriz de uno de cualquiera de polilactida, poliglicolido, o polilactida co-glicolida (copolfmeros de acido lactico y acido glicolico).
Los compuestos tambien pueden administrarse en forma de liposomas. Como se conoce en la tecnica, los liposomas se derivan generalmente de fosfolfpidos u otras sustancias lipfdicas. Los liposomas estan formados por cristales lfquidos hidratados mono- o multi-laminares que se dispersan en un medio acuoso. Se puede utilizar cualquier lfpido no toxico, fisiologicamente aceptable y metabolizable capaz de formar liposomas. El liposoma puede contener, ademas de una o mas composiciones de la presente invencion, estabilizantes, conservantes, excipientes, y similares. Ejemplos de lfpidos son los fosfolfpidos y las fosfatidil colinas (lecitinas), tanto naturales como sinteticas. Los metodos para formar liposomas son conocidos en la tecnica.
Los compuestos pueden formularse como aerosoles para aplicacion, tales como por inhalacion. Estas formulaciones para administracion al tracto respiratorio pueden estar en la forma de un aerosol o solucion para un nebulizador, o como un polvo microfino para insuflacion, solo o en combinacion con un portador inerte tal como lactosa. En tal caso, las partfculas de la formulacion tendran, en una realizacion, diametros de menos de 50 micras, en una realizacion menos de 10 micras.
Las composiciones que comprenden los compuestos divulgados aqrn se pueden utilizar en combinacion con otras composiciones y/o procedimientos para el tratamiento de las afecciones descritas anteriormente. Por ejemplo, un tumor se puede tratar convencionalmente con cirugfa, radiacion o quimioterapia combinada con una o mas composiciones de la presente invencion y luego una o mas composiciones de la presente invencion se pueden administrar posteriormente al paciente para extender el letargo de micrometastasis y para estabilizar, inhibir o reducir el crecimiento de cualquier tumor primario residual.
Realizaciones adicionales
Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se pueden formular de acuerdo con metodos conocidos para preparar composiciones farmaceuticamente utiles. Las formulaciones se describen en un numero de fuentes que son bien conocidos y facilmente disponibles para aquellos expertos en la tecnica. Por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin EW Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company, 19th ed.) describe formulaciones que se pueden utilizar en relacion con la presente invencion. Las formulaciones adecuadas para administracion incluyen, por ejemplo, soluciones acuosas para inyeccion esteriles, que pueden contener antioxidantes, reguladores, bacteriostaticos, y solutos que hacen la formulacion isotonica con la sangre del receptor
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previsto; y suspensiones esteriles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspension y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o multiples dosis, por ejemplo ampollas selladas y frascos, y se pueden almacenar en una condicion de secado por congelacion (liofilizado) que requiere solo la condicion del portador lfquido esteril, por ejemplo, agua para inyecciones, antes de uso. Las soluciones y suspensiones para inyeccion extemporaneas se pueden preparar a partir de polvo esteril, granulos, comprimidos, etc. Se debe entender que adicionalmente a los ingredientes particularmente mencionados anteriormente, las formulaciones de la presente invencion pueden incluir otros agentes convencionales en la tecnica teniendo en cuenta el tipo de formulacion en cuestion.
El compuesto de la presente invencion, para inhibir el crecimiento de una celula cancerosa, se puede combinar ventajosamente con por lo menos un metodo adicional terapeutico, incluyendo quimioterapia, terapia de radiacion, terapia que inhibe selectivamente la senalizacion de Ras oncogenico, o cualquier otra terapia conocida para aquellos expertos en la tecnica del tratamiento y la gestion de cancer, tales como la administracion de un agente anticancengeno.
Se puede llevar a cabo la administracion de TCN-P como una sal. Ejemplos de sales farmaceuticamente aceptables son sales de adicion de acidos organicos formadas con acidos que forman un anion fisiologicamente aceptable, por ejemplo, tosilato, metanosulfonato, acetato, citrato, malonato, tartrato, succinato, benzoato, ascorbato, alfa- cetoglutarato, y alfa-glicerofosfato. Tambien se pueden formar sales inorganicas adecuadas, que incluyen sales de clorhidrato, sulfato, nitrato, bicarbonato y carbonato.
Las sales farmaceuticamente aceptables se pueden obtener utilizando procedimientos estandar bien conocidos en la tecnica, por ejemplo al hacer reaccionar un compuesto suficientemente basico tal como una amina con un acido adecuado que proporciona un anion fisiologicamente aceptable. Tambien se pueden elaborar sales de metales alcalinos (por ejemplo, sodio, potasio o litio) o metales alcalinoterreos (por ejemplo calcio) de acidos carboxflicos.
Los compuestos de la presente invencion se pueden formular como composiciones farmaceuticas y administrarse a un sujeto, tal como un paciente humano o veterinario, en una variedad de formas adaptadas a la ruta de administracion elegida, es decir, por via oral o parenteral, por rutas intravenosa, intramuscular, topica o subcutanea.
Por lo tanto, los compuestos de la presente invencion se pueden administrar sistemicamente, por ejemplo, por via oral, en combinacion con un vetuculo farmaceuticamente aceptable (es decir, portador) tal como un diluyente inerte o un vetuculo comestible asimilable. Pueden estar encerrados en capsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta del paciente. Para la administracion terapeutica oral, los compuestos pueden combinarse con uno o mas excipientes y utilizarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, capsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Dichas composiciones y preparaciones deben contener por lo menos 0.1% de agente activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones puede, por supuesto, variarse y puede estar convenientemente entre aproximadamente 2 a aproximadamente 60% del peso de una forma de dosificacion unitaria dada. La cantidad de compuesto activo en dichas composiciones terapeuticamente utiles es tal que se obtendra un nivel de dosificacion efectiva.
Los comprimidos, trociscos, pfldoras, capsulas y similares tambien pueden contener lo siguiente: aglutinantes tales como goma tragacanto, acacia, almidon de mafz o gelatina; excipientes tales como fosfato de calcio; un agente desintegrante tal como almidon de mafz, almidon de patata, acido algmico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; y se puede agregar un agente edulcorante tal como sacarosa, fructosa, lactosa o aspartamo o un agente aromatizante tal como menta, aceite de gaulteria, o aroma de cereza. Cuando la forma de dosificacion unitaria es una capsula, esta puede contener, ademas de materiales del tipo anterior, un portador lfquido, tal como un aceite vegetal o un polietilenglicol. Diversos otros materiales pueden estar presentes como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma ffsica de la forma de dosificacion unitaria solida. Por ejemplo, comprimidos, pfldoras, o capsulas pueden recubrirse con gelatina, cera, goma laca o azucar y similares. Un jarabe o elixir puede contener los compuestos de la invencion, sacarosa o fructosa como agente edulcorante, metil y propil parabenos como conservantes, un colorante y aromatizante tal como aroma de cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material utilizado en la preparacion de cualquier forma de dosificacion unitaria debena ser farmaceuticamente aceptable y sustancialmente no toxico en las cantidades empleadas. Adicionalmente, los compuestos de la invencion pueden incorporarse en preparaciones y dispositivos de liberacion sostenida.
El agente activo (es decir, TCN-P o sales farmaceuticamente aceptables de las mismas) se pueden administrar tambien por via intravenosa o intraperitoneal por infusion o inyeccion. Las soluciones del agente activo o sus sales se pueden preparar en agua, opcionalmente mezcladas con un surfactante no toxico. Las dispersiones tambien pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles lfquidos, triacetina, y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.
Las formas de dosificacion farmaceuticas adecuadas para inyeccion o infusion pueden incluir soluciones o dispersiones acuosas esteriles o polvos esteriles que comprenden el ingrediente activo que estan adaptados para la
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preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables o infusibles esteriles, opcionalmente encapsuladas en liposomas. En todos los casos, la forma de dosificacion final debe ser esteril, fluida y estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento. El portador o vefuculo Kquido puede ser un solvente o medio lfquido de dispersion que comprende, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicoles lfquidos, y similares), aceites vegetales, esteres de glicerilo no toxicos, y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por la formacion de liposomas, por el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersiones o por el uso de surfactantes. La prevencion de la accion de microorganismos puede ser provocada por varios agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal, y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, reguladores o cloruro de sodio. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede ser provocada por el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables esteriles se preparan incorporando los compuestos de la invencion en la cantidad requerida en el solvente apropiado con diversos de los otros ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizacion por filtracion. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son secado al vacfo y las tecnicas de liofilizacion, que producen un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente adicional deseado presente en las soluciones previamente esterilizadas por filtracion.
Para la administracion topica, los compuestos de la invencion se pueden aplicar en forma pura, es decir, cuando son lfquidos. Sin embargo, generalmente sera deseable administrarlos a la piel como composiciones o formulaciones, en combinacion con un vehuculo dermatologicamente aceptable, que puede ser un solido o un lfquido.
Los portadores solidos utiles incluyen solidos finamente divididos tales como talco, arcilla, celulosa microcristalina, sflice, alumina y similares. Los vehfculos lfquidos utiles incluyen agua, alcoholes o glicoles o agua-alcohol/mezclas de glicol, en el que los compuestos de la invencion se pueden disolver o dispersar a niveles eficaces, opcionalmente con la ayuda de surfactantes no toxicos. Los adyuvantes tales como fragancias y agentes antimicrobianos adicionales se pueden agregar para optimizar las propiedades para un uso dado. Las composiciones lfquidas resultantes se pueden aplicar a partir de almohadillas absorbentes, utilizarse para impregnar vendajes y otros apositos, o pulverizarse sobre el area afectada utilizando de tipo bomba o de aerosol pulverizadores.
Los espesantes tales como polfmeros sinteticos, acidos grasos, sales de acidos grasos y esteres, alcoholes grasos, celulosas modificadas o materiales minerales modificados pueden emplearse tambien con vehfculos lfquidos para formar pastas extensibles, geles, unguentos, jabones, y similares, para aplicacion directamente a la piel del usuario. Ejemplos de composiciones dermatologicas utiles que pueden ser utilizados para entregar los compuestos de la invencion a la piel se divulgan en Jacquet et al. (Patente Estadounidense No. 4,608,392), Geria (Patente Estadounidense No. 4,992,478), Smith et al. (Patente Estadounidense No. 4,559,157) y Woltzman (Patente Estadounidense No. 4,820,508).
Las dosificaciones utiles de las composiciones farmaceuticas de la presente invencion se pueden determinar al comparar su actividad in vitro, y actividad en modelos animales in vivo. Los metodos para la extrapolacion de las dosificaciones eficaces en ratones, y otros animales, a humanos son conocidas en la tecnica; por ejemplo, vease Patente Estadounidense No. 4,938,949.
En una realizacion, la concentracion del agente activo en una composicion lfquida, tal como una locion, puede ser de aproximadamente 0.1-25% en peso, o de aproximadamente 0.5-10% en peso. En una realizacion, la concentracion en una composicion semisolida o solida tal como un gel o un polvo puede ser de aproximadamente 0.1-5%, Preferiblemente de aproximadamente 0.5-2.5 en % en peso. En una realizacion, las dosificaciones individuales para inyeccion, infusion o ingestion variaran generalmente entre 5 a 1500 mg, y pueden administrarse, es decir, 1-3 veces al dfa, para producir niveles de aproximadamente 0.1-50 mg/kg, para adultos. Una dosificacion de la presente invencion puede estar entre 7.5 a 45 mg por arcilla, administrados por via oral, con un ajuste apropiado para el peso del cuerpo de un individuo.
Por consiguiente, la presente invencion incluye una composicion farmaceutica que comprende TCN-P, como se describe aqrn, o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, en combinacion con un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Las composiciones farmaceuticas adaptadas para la administracion oral, topica o parenteral, que comprenden una cantidad de TCN-P o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, constituyen una forma de realizacion preferida de la invencion. La dosis administrada a un sujeto, particularmente un humano, en el contexto de la presente invencion debe ser suficiente para efectuar una respuesta terapeutica en el paciente durante un marco de tiempo razonable. Un experto en la tecnica reconocera que la dosificacion dependera de una variedad de factores, que incluyen el estado del animal, el peso corporal del animal, asf como la gravedad y etapa del cancer.
Una dosis adecuada es la que resultara en una concentracion del agente activo en el tejido tumoral que se sabe efectua la respuesta deseada. La dosis preferida es la cantidad que resulta en la inhibicion maxima del crecimiento celular del cancer, sin efectos secundarios incontrolables. La administracion de TCN-P (o una sal farmaceuticamente
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aceptable de la misma) puede ser continua o a intervalos distintos, segun se puede determinar por una persona medianamente versada en la tecnica.
Las especies de mairnferos que se benefician de los tratamientos divulgados para la inhibicion del crecimiento de celulas de cancer, incluyen, primates, tales como monos, chimpances, orangutanes, humanos, monos; animales domesticados (por ejemplo, mascotas) tales como perros, gatos, conejillos de indias, hamsters, cerdos barrigones vietnamitas, conejos y hurones; animales de granja domesticados, tales como vacas, bufalos, bisonte, caballos, burro, cerdo, ovejas, y cabras; animales exoticos encontrados normalmente en zoologicos, tales como oso, leones, tigres, panteras, elefantes, hipopotamos, rinocerontes, jirafas, antflopes, perezosos, gacelas, cebras, nus, perros de la pradera, koalas, canguro, zarigueyas, mapaches, pandas, hiena, focas, leones marinos, elefantes marinos, nutrias, marsopas, delfines y ballenas. Los terminos “paciente” y “sujeto” se utilizan aqm de forma intercambiable y se pretende que incluyan dichas especies de mamfferos no humanos y humanos. Del mismo modo, los metodos in vitro de la presente invencion se pueden obtener en celulas de dichas especies de mamfferos.
Los pacientes que necesitan tratamiento utilizando los medicamentos de la presente invencion se pueden identificar utilizando tecnicas estandar conocidas por aquellos de la profesion medica.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustracion.
Ejemplos
Ejemplo 1: Tamizado in vitro Materiales
Estirpes celulares y Grupo de Diversidad de NCI. Todas las estirpes celulares utilizadas en este estudio se adquirieron de ATCC o describieron previamente (Cheng, J. Q., et al. Oncogene, 14: 2793-2801, 1997, West, K. A., et al. Drug Resist. Updat., 5: 234-248, 2002, Satyamoorthy, K., et al. Cancer Res. 61: 7318-7324, 2001). El Grupo de Diversidad Estructural NCI es una coleccion de 1992 compuestos seleccionados de entre aproximadamente 140000 compuestos en el depositario de farmacos NCI. Se pueden encontrar datos en profundidad en la seleccion, estructuras y actividades de estos compuestos de conjunto de diversidad en el sitio web del Programa de Terapeutica del Desarrollo del NCI.
Cribado de inhibicion del crecimiento celular transformado por Akt. Las celulas NIH3T3 transformadas AKT2 transforma AKT2 o celulas control NIH3T3 transfectadas con vector LXSN (Cheng, J. Q., et al. Oncogene, 14: 27932801, 1997) se colocaron sobre placa de cultivo de tejido de 96 pozos. Luego de tratamiento con 5 pM de compuesto del Grupo de Diversidad NCI, el crecimiento celular se detecto con CellTier 96 Un Kit de Proliferacion Celular en Solucion (Promega). Los compuestos que inhiben el crecimiento de AKT2-transformadas pero no se consideraron celulas NIH3T3 transfectadas con LXSN como candidatos del inhibidor de Akt y se sometieron a analisis adicional.
Ensayos de supervivencia y apoptosis celular, de protema quinasa in vivo. Se realizo quinasa in vitro como se describio previamente (vease, por ejemplo, Jiang, K., Coppola, et al. Mol. Cell. Biol., 20:139-148, 2000) La supervivencia celular se ensayo con MTS (Promega). La apoptosis se detecto con anexina V, que se realizo como se describio previamente (Jiang, K., Coppola, et al. Mol. Cell. Biol., 20:139-148, 2000). La Akt y PDK1 recombinante se adquirieron de Upstate Biotechnology Inc.
Resultados
La identificacion de inhibidores de moleculas pequenas de ruta de senalizacion Akt, API-2. Las alteraciones frecuentes de Akt se han detectado en el cancer humano y la interrupcion de la ruta de Akt induce la apoptosis e inhibe el crecimiento tumoral (Jetzt, A., et al. Cancer Res., 63: 697-706, 2003). Por lo tanto, se ha considerado la Akt como un objetivo molecular atractivo para el desarrollo de nuevas terapias contra el cancer. Para identificar inhibidores de molecula de Akt, una coleccion qmmica de 1992 compuestos del NCI (Grupo de Diversidad NCI) se evaluo para agentes capaces de inhibicion del crecimiento en celulas NIH3T3 transformadas con AKT2 pero no transfectadas con vector LXSN no vacfos como se describe en “Materiales y Metodos”. Los experimentos repetidos mostraron que 32 compuestos inhibieron el crecimiento solo en las celulas transformadas de AKT2. El mas potente de estos compuestos, API-2 (identificador NCI: NSC 154020), suprimio el crecimiento celular a una concentracion de 50 nM. La Figura 1A muestra la estructura qmmica de API-2, que tambien se conoce como triciribina (Schweinsberg, P. D., et al. Biochem Pharmacol., 30: 2521-2526, 1981). El hecho de que API-2 inhibe celulas transformadas de AKT2 selectivamente sobre celulas parentales no transformadas nos llevo a determinar si API-2 es un inhibidor de AKT2 quinasa. Con este fin, la AKT2 se inmunoprecipito con anticuerpo anti-AKT2 a partir de celulas NIH3T3 transformadas con AKT2 despues del tratamiento con API-2. Los inmunoprecipitados AKT2 se inmunotransfirieron con anticuerpos anti-fosfo-Akt. Como se muestra en la Figura 1B, la API-2 inhibe significativamente fosforilacion AKT2 tanto en treonina 309 como serina-474, que se requieren para activacion completa de AKT2 (Datta, S. R., et al. Genes Dev. 13: 2905-2927, 1999). Cuando tres isoformas de Akt comparten una alta homologfa y estructura
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similar, se evaluo el efecto de la API-2 sobre sus actividades de quinasa. Se transfectaron celulas HEK293 con HA- Akt1, -AKT2 y -AKT3, privadas de suero durante la noche y se trataron con API-2 durante 60 min antes de estimulacion con EGF (50 ng/ml). Los experimentos triples mostraron que la API-2 suprime la actividad de quinasa inducida por EGF y la fosforilacion de Akt1, AKT2 y Akt3 (Figura 1C). Sin embargo, la actividad quinasa de AKT2 recombinante activada constitutivamente (Myr-AKT2) no fue inhibida por API-2 en una reaccion de quinasa in vitro (Figura 1D), lo que sugiere que el API2 no inhibe directamente la Akt in vitro y que la API-2 no funciona como competidor de aTp ni como competidor de sustrato que se une al sitio activo de Akt.
La API-2 no inhibe activadores en direccion 5' conocidos de Akt. Se ha documentado bien que la Akt se activa por estfmulos extracelulares y moleculas de senalizacion intracelulares, tales como Ras y Src activada, a traves de una manera dependiente de PI3K. Por lo tanto, la inhibicion API-2 de Akt podna resultar de moleculas de en direccion 5' de orientacion de Akt. Debido a que la PI3K y PDK1 son reguladores en direccion 5' directas de Akt (Datta, S. R., et al. Genes Dev. 13: 2905-2927, 1999), se examino si la API-2 inhibe PI3K y/o PDK1. Las celulas HEK293 fueron privadas de suero y luego tratadas con API-2 o un inhibidor de PI3K, wortmanina, durante 30 min antes de estimulacion EGF. Se inmunoprecipito PI3K con anticuerpo anti-p110a. Los inmunoprecipitados se sometieron a ensayo de quinasa in vitro de PI3K utilizando PI-4-P como un sustrato. Como se muestra en la Figura 2A, la actividad PI3K inducida por EGF fue inhibida por wortmanina pero no por API-2. Para evaluar el efecto de API-2 en PDK1, un ensayo en el que la PDK1 recombinante promueve la fosforilacion de treonina-309 de peptidos AKT2 se utilizo en presencia de vesfculas de lfpidos que contienen fosfatidilinositol. Como se muestra en la Figura 2B, el ensayo se potentemente inhibida por el control PDK1 inhibidor estaurosporina (IC50 = 5 nM). En contraste, la API-2 muestra solo 21% de inhibicion del ensayo en la concentracion mas alta probada (5.1 jM). Estos datos demuestran que API-2 no es un potente inhibidor de PDK1. Para evaluar adicionalmente el efecto de la API-2 sobre la activacion de PDK1, se examino el nivel de autofosforilacion de PDK1 en la serina-241, un residuo que se fosforila por sf mismo y es cntico para su actividad (Datta, SR, et al. Genes Dev. 13: 2905-2927, 1999), despues del tratamiento API-2 de las celulas HEK293. Los experimentos por triplicado muestran que los niveles de fosforilacion de PDK1 no fueron inhibidos por API-2 (Figura 2B). Sin embargo, la wortmanina de inhibidor de PI3K, como se esperaba, inhibe PDK1 estimulada por EGF (Figura 2b).
La API-2 es altamente selectiva para Akt sobre rutas de senalizacion PKC, PKA, SGK, STAT, JNK, p38 y ERK. La Akt pertenece a la familia quinasa AGC (PKA/PKG/PKC), que tambien incluyen PKA, PKC, suero y quinasa inducible por glucocorticoides (SGK), quinasa S6 ribosomal p90, p70S6K, mitogenos y protema quinasa activada por estres y quinasa relacionada con PKC. Entre la familia de quinasas AGC, las estructuras de protemas de PKA, PKC y SGK estan mas cerca de la quinasa Akt que otros miembros. Por lo tanto, luego se examinaron los efectos de API-2 sobre las actividades enzimaticas de estas 3 quinasas. Se transfectaron celulas HEK293 con PKA etiquetados con HA, PKC o SGK. El ensayo de quinasa in vitro y el analisis de inmunotransferencia mostraron que las actividades quinasa de PKA y PKCa se inhibieron por PKAi y Ro 31-8220, un inhibidor de PKC, respectivamente, mientras que API-2 no exhibio ningun efecto sobre sus actividades (Figura 2C y 2E). Adicionalmente, la actividad de quinasa SGK inducida por suero fue atenuada por wortmanina pero no por API-2 (Figura 2D). Adicionalmente, se determino si API- 2 tiene efecto sobre otras rutas de supervivencia oncogenicas. El analisis por transferencia Western con anti-fosfo- anticuerpos disponibles comercialmente revelo que los niveles de fosforilacion de STAT3, JNK, p38 y Erk1/2 no fueron afectados por tratamiento API-2 (Figura 2F). Estos datos indican que API-2 inhibe espedficamente la ruta de senalizacion de Akt.
API-2 Suprime el Crecimiento Celular e Induce apoptosis en Estirpes Celulares de Cancer Humano que sobreexpresan/que activan Akt La capacidad de API-2 para inhibir selectivamente la ruta de Akt sugiere que debena inhibir la proliferacion y/o inducir apoptosis preferentemente en esas celulas tumorales con expresion/activacion aberrante de Akt. Como la activacion de Akt en tumores malignos humanos comunmente resulta de la sobreexpresion de Akt o mutaciones PTEN, se utilizo API-2 para el tratamiento de las celulas que expresan Akt constitutivamente activa, provocada por la sobreexpresion de AKT2 (NIH3T3 transformado por OVCAR3, OVCAR8, PANC1 y AKT2) o mutaciones del gen PTEN (PC-3, LNCaP, MDA-MB-468), y las celulas que no (OVCAR5, DU-145, T47D, Colo357 y LXSN-NIH3T3), asf como celulas de melanoma que son activadas por IGF-1 para activar Akt o no responden a la estimulacion del crecimiento por IGF-1 (Satyamoorthy, K., et al. Cancer Res. 61: 7318-7324, 2001). El analisis de inmunotransferencia mostro que los niveles de fosforilacion de Akt fueron inhibidos por API-2 solo en las celulas que expresan Art elevada o responden a simulacion IGF-1 (Figura 3A). De acuerdo con lo anterior, la API-2 inhibio el crecimiento celular en un grado mucho mayor en estirpes celulares que sobreexpresan/que activan Akt en comparacion con aquellos con bajos niveles de Akt. Como se muestra en la Figura 3B, el tratamiento API-2 inhibio la proliferacion celular mediante aproximada 50-60% en estirpes celulares que sobreexpresan/que activan Akt, LNCaP, PC-3, OVCAR3, OVCA8, PANC1, MDA-MB-468, y WM35, mientras que solo alrededor de un 10 -20% en las celulas DU145, OVCAR5, Colo357, T47D y WM852, que exhiben bajos niveles de Akt o no responden a estimulacion del crecimiento por IGF-1. Mas aun, la API-2 induce la apoptosis por 8 veces (OVCAR3), 6 veces (OVCAR8), 6 veces (PANC1) y 3 veces (AKT2-NIH3T3). No se observo ninguna diferencia significativa de la apoptosis entre el tratamiento de API-2 y vehnculo (DMSO) y en celulas OVCAR5, Colo357 y LXSN-NIH3T3. Por lo tanto, API-2 inhibe el crecimiento celular e induce la apoptosis preferentemente en las celulas que expresan Akt aberrante.
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La API-2 inhibe objetivos den direccion 3' de Akt. Se ha demostrado que Akt ejerce sus efectos celulares a traves de la fosforilacion de un numero de protemas (Datta, S. R., et al. Genes Dev. 13: 2905-2927, 1999). Mas de 20 protemas se han identificado como sustratos Akt, que incluye los miembros de la familia de protemas Forkhead (FKHR, AFX y FKHRL1), tuberlina/TSC2, p70S6K, GSK-3p, p2lWAF1/Cip1, p27kip1, MDM2, Bad, ASK1 y IKKaetc. Se examino a continuacion si API-2 inhibe objetivos en direccion 3' de Akt. Como anticuerpos anti-fosfo-tuberlina, Bad, AFX, y GSK-3p estan disponibles comercialmente, por lo tanto, se determino el efecto de la API-2 en su fosforilacion inducida por Akt. Despues del tratamiento API-2 (1 DM), se lisaron celulas OVCAR3 y se sometieron a inmunotransferencia con el anti-fosfo-anticuerpo individual. La Figura 4A muestra que la API-2 inhibio considerablemente los niveles de fosforilacion de tuberlina que conducen a la estabilizacion y regulacion en aumento de tuberina (Dan, H. C., et al. J. Biol. Chem., 277: 35364-35370, 2002). Los niveles de fosforilacion de Bad, GSK-3p, y AFX se atenuaron parcialmente por API-2. Estos datos sugieren que la API-2 induce muerte celular y detencion del crecimiento celular al inhibir la fosforilacion de sus objetivos en direccion 3'. La inhibicion de API-2 de objetivos en direccion 3' de Akt en diferentes grados se podna deber al hecho de que los sitios de fosforilacion de estos objetivos tambien estan regulados por otra quinasa(s), por ejemplo, la serina-136 Bad se fosforila por PAK1 ademas de Akt (Schurmann, A., et al. Mol. Cell. Biol., 20: 453-461, 2000).
Ejemplo 2: Actividad antitumoral en el modelo de xenoinjerto de tumor de raton sin pelo.
Se recogieron celulas tumorales, se resuspendieron en PBS, y se inyectaron s.c. en los flancos derecho e izquierdo (2 x 106 celulas/flanco) de ratones hembra sin piel de 8 semanas de edad como se reporto anteriormente (Sun, J., Blaskovic, et. al., Cancer Res, 59: 4919-4926, 1999). Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 100-150 mm3, los animales fueron asignados al azar y se dosificaron i.p. con 0.2 ml de vehroulo de farmaco al dfa. Los animales de control recibieron vehroulo DMSO (20%), mientras que los animales tratados se inyectaron con API-2 (1 mg/kgMa) en 20% de DMSO.
La API-2 inhibe el crecimiento de tumores en ratones sin pelo que sobreexpresan Akt. Se mostro sobreexpresion/activacion y/o amplificacion de AKT1 y AKT2 frecuente en el cancer de ovario y pancreatico humano (Cheng, J. Q., and Nicosia, S. V. AKT signal transduction pathway in oncogenesis. In Schwab D, Editor, Encyclopedic Reference of Cancer. Berlin Heidelberg and New York: Springer; 2001. pp 35-7). La inhibicion de ruta Akt por los inhibidores de PI3K, HSP70, Src y farnesiltransferasa resultaron en la detencion del crecimiento celular e induccion de apoptosis (Solit, D. B., et al. Cancer Res., 63: 2139-2144, 2003, Xu, W., et al. Cancer Res., 63: 77777784, 2003). Un estudio reciente mostro que el crecimiento de tumores de xenoinjertos con elevada Akt tambien se inhibio significativamente mediante inyeccion intratumoral de adenovirus de Akt dominante negativo (Jetzt, A., et al. Cancer Res., 63: 697-706, 2003). Debido a que la API-2 inhibe la senalizacion Akt e induce la apoptosis y la detencion de crecimiento celular solo en celulas de cancer con niveles elevados de Akt (Figura 3), el crecimiento de tumores con niveles elevados de Akt debe ser mas sensibles a API-2 que el de los tumores con bajos niveles de Akt en ratones sin pelo. Con este fin, las celulas Akt que sobreexpresan s.c. (OVCAR3, OVCAR8 y PANC-1) se implantaron s.c. en el flanco derecho, y aquellas estirpes celulares que expresan niveles bajos de Akt (OVCAR5 y Colo357) en el flanco izquierdo de los ratones. Cuando los tumores alcanzaron un tamano medio de alrededor de 100-150 mm3, los animales se aleatorizaron y se trataron i.p. con vehroulo o API-2 (1 mg/kgMa). Como se ilustra en la Figura 4B, los tumores OVCAR-5 y Colo357 tratados con vehroulo crecieron a aproximadamente 800-1000 mm3 49 dfas despues del implante del tumor. Los tumores OVCAR3, OVCAR8 y PANC1 tratados con vehroulo de control crecieron aproximadamente 700-900 mm3 49 dfas despues de implante del tumor. La API-2 inhibe el crecimiento del tumor OVCAR3, OVCAR8 y PANC1 en un 90%, 88% y 80%, respectivamente. En contraste, la API-2 tuvo poco efecto sobre el crecimiento de celulas OVCAR5 y Colo357 en ratones sin pelo (Figuras 4B-4D y datos no mostrados). En dosis de 1 mg/kgMa, la API-2 no tuvo efectos sobre el nivel de glucosa en sangre, peso corporal, actividad e ingesta de alimentos de ratones. En muestras tumorales tratadas, la actividad de Akt se inhibio por API-2 sin cambio en el contenido total de Akt (Figura 4E). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la API-2 inhibe selectivamente el crecimiento de tumores con niveles elevados de Akt.
Ejemplo 3: TCN inhibe directamente actividad de quinasa Akt tipo silvestre
La API-2 (TCN) puede inhibir directamente la actividad de quinasa Akt tipo silvestre inducida por PDK1 in vitro (Figura 1). Este resultado apoya que la API-2 es un inhibidor de Akt directo y que el mecanismo subyacente puede ser API-2 obligatorio al dominio PH y/o treonina 308 de Akt. Un ensayo de quinasa in vitro se realizo con recombinante de PDK1 y Akt en un regulador de quinasa que contiene fosfatidilinositol-3,4,5-P3 (PIP3), API-2 e histona H2B como sustrato. Despues de incubacion de 30 min, las reacciones se separaron mediante SDS-PAGE y se expusieron en una pelroula.
Ejemplo 4: La TCN es efectiva en celulas resistentes cancer
Los efectos de TCN (API-2) se ensayaron en celulas resistentes a A270CP, C-13, OVCAR433 y MCF7/TAM resistentes a cisplatino, paclitaxel, y tamoxifeno. La API-2 supero la resistencia a cisplatino, paclitaxel, y tamoxifeno en estas celulas.
Claims (16)
- 5101520253035REIVINDICACIONES1. Un compuesto de la formula:para uso en un metodo para el tratamiento de un tumor o cancer en un mamifero, en el que el tumor o cancer sobreexpresa quinasa Akt.
- 2. El compuesto para el uso de la reivindicacion 1, en el que la quinasa sobreexpresada es una quinasa Akt hiperactivada y fosforilada.
- 3. El compuesto para el uso de la reivindicacion 1, en el que el nivel de expresion de quinasa Akt se determina al ensayar el cancer para presencia de quinasa Akt fosforilada, o al ensayar el cancer para presencia de una quinasa Akt fosforilada con un anticuerpo.
- 4. Un compuesto de la formula:
imagen1 imagen2 para uso en un metodo para el tratamiento de un tumor o cancer en un mamifero, en el que el tumor o cancer exhibe niveles elevados de quinasa Akt, en el que el compuesto se administra de acuerdo con un esquema de dosificacion una vez por semana durante tres semanas seguidas por un periodo de una semana en el que no se administra el compuesto. - 5. El compuesto para el uso de la reivindicacion 4, en el que el esquema de dosificacion se repite por lo menos dos veces, o por lo menos 4 veces.
- 6. El compuesto para el uso de la reivindicacion 4, en el que por lo menos 10 mg/m2 del compuesto se administra, o en el que se administra 10 mg/m2 o menos del compuesto.
- 7. Un compuesto de la formula:
imagen3 para uso en un metodo para el tratamiento de un tumor o cancer, en el que el tumor o cancer exhibe niveles elevados de quinasa Akt, en el que el compuesto se administra a un sujeto en un regimen de dosificacion una vez por semana a una dosis de 10 mg/m2 o menos en el que el regimen de dosificacion representa un ciclo de dosificacion.51015202530 - 8. El compuesto para el uso de la reivindicacion 7, en el que el regimen de dosificacion se repite durante por lo menos dos semanas, o en el que el regimen de dosificacion se repite durante tres semanas, y en el que el periodo de tres semanas es seguido por un periodo de una semana en el que no se administra el farmaco.
- 9. El compuesto para el uso de la reivindicacion 7, en el que el ciclo de dosificacion se repite por lo menos dos veces.
- 10. El compuesto para el uso de la reivindicacion 7, en el que el ciclo de dosificacion se repite hasta que se logra la regresion del cancer.
- 11. El compuesto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el tumor o cancer se selecciona del grupo que consiste de mama, pancreatico, de ovario, leucemia y colorrectal.
- 12. El compuesto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el cancer es carcinoma, sarcoma, linfoma, leucemia o mieloma.
- 13. El compuesto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, dicho metodo comprende administrar adicionalmente el compuesto en combinacion o alternacion con un agente quimioterapeutico, agente antiangiogenico, o un agente antiagiogenico y un agente citotoxico.
- 14. El compuesto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, dicho metodo comprende administrar adicionalmente el compuesto en combinacion o alternacion con paclitaxel, citarabina, ciclofosfamida, doxorrubicina, o carbonplatino.
- 15. El compuesto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicho compuesto se administra como sal farmaceuticamente aceptable.
- 16. El compuesto para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en el que el compuesto se administra por via intravenosa.
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