KR20070078638A

KR20070078638A - 푸코이단을 함유하는 항비만용 고추장

Info

Publication number: KR20070078638A
Application number: KR1020060009097A
Authority: KR
Inventors: 박건영; 한민수; 공창숙; 김수옥; 안인숙; 김문수
Original assignee: 씨제이 주식회사; 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2006-01-27
Filing date: 2006-01-27
Publication date: 2007-08-01
Also published as: WO2007086658A1

Abstract

본 발명은 푸코이단을 첨가한 항암 기능성 증진 고추장의 제조방법에 관한 것으로, 푸코이단을 첨가하여 제조한 고추장은 항비만 효과와 항암 효과를 더욱 증진시켰다.

푸코이단, 고추장, 항비만 효과, 항암 효과

Description

푸코이단을 첨가한 항암 기능성 증진 고추장의 제조방법{A preparation method of Kochujang added fucoidan with increased anti-cancer effect}

도 1은 푸코이단 처리에 따른 글리세롤 함량의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 2는 푸코이단 처리에 따른 지방세포의 렙틴 분비량을 나타낸 그래프이다.

도 3은 푸코이단 첨가 고추장의 메탄올추출물을 처리한 비만세포에서의 렙틴 분비량을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 푸코이단을 첨가한 항암 기능성 증진 고추장의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 푸코이단을 첨가하여 항비만 및 항암 효과가 더욱 증진된 고추장과 그 제조방법을 제공하고자 한다.

고추장은 콩과 전분질, 고춧가루, 소금을 주원료로 함으로 콩의 분해산물인 아미노산의 감칠맛, 찹쌀, 멥쌀, 보리 등의 전분질원의 분해로 인한 당질과 단맛, 소금의 짠맛, 고춧가루의 매운맛과 함께 고춧가루의 붉은 색으로 인한 시각적 효과까지 골고루 갖춘 장류 식품이다. 고추장은 우리 식탁에서는 빠질 수 없는 조미료로 이용되고 있는 우리나라 전통발효식품의 하나로 된장류와는 달리 콩을 주원료로 한 고추장 메주와 쌀 등의 전분질 원료, 엿기름, 그리고 고춧가루를 섞어 발효시킨 것으로 세계에서 그 유래를 찾을 수 없는 고유하고 독특한 전통발효식품이다. 고추장은 크게 전통식 고추장과 상품용 고추장으로 분류할 수 있는데 전통식 고추장은 메주를 띄우는 과정에서 많은 종류의 세균이나 곰팡이가 서식하기 때문에 고추장 숙성과정(6~18개월)에서 이들 미생물이 분비하는 효소작용에 의하여 원료 성분이 분해되어 생성되는 유기산, 핵산, 알코올 등이 맛이나 향에 관여하여 풍미의 조화를 이룬다. 공장식 고추장은 숙성식, 당화식 고추장으로 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)를 순수배양한 코지(koji)를 고추장 메주 대신에 사용한다. 코지(koji) 제조에서 단백질 원료로서는 콩이, 전분질 원료로서는 쌀이나 밀가루가 사용되는데, 콩과 쌀에 각각 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)를 접종시켜 3~4일간 발효한 다음 1:1 비율로 섞어 메주 대신 첨가하기 때문에 주로 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)의 효소작용과 효모의 발효작용에 의해 풍미가 높아지며 숙성기간(15~60일)이 비교적 짧은 특징이 있다.

비만은 전 세계적으로 심각한 건강문제로 떠오르고 있는데 비만이 원인으로 생길 수 있는 만성적이고 치명적인 질환으로는 당뇨병, 고혈압, 심혈관 관련 질환, 무리한 체중에 의한 관절질환, 폐질환 그리고 일부 암 등이 있다. 또한 최근, 비만은 동서양, 성별, 그리고 사회적 지위를 막론하고 급속도로 만성적으로 유행하는 병이라고 볼 수 있다. 그래서 현재 체중감량이나 비만을 억제하는데 직·간접적으로 효과가 있으며 장기적인 안목에서 화학성보다 천연에서 기능성과 안전성을 갖춘 성분을 탐색하려는 연구가 전 세계적으로 활발히 이루어지는 가운데 우리의 고추장 역시 발효저장 식품으로 된장과 함께 기능성 식품으로서 주목받고 있다.

갈조류 중에는 중성다당인 라미나란(laminaran)과 황산기를 함유한 산성다당이 다량 함유되어 있는데 대표적인 함황 산성다당으로 푸코이단(fucoidan)과 알기네이트(alginate)를 들 수 있다. 특히, 푸코이단은 혈액응고 활성, 항암활성 및 항AIDS 등의 활성이 있다고 보고되어 있다. 또한 식이섬유에 대한 관심이 높아지면서 해조류를 이용한 다이어트 식품 개발이 활발히 진행되고 있으나 대부분이 생체내(in vivo) 연구이며 시험관내(in vitro) 에서 식이섬유소가 가지는 생리작용에 대한 연구는 부족한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 해조류에 많이 함유되어 있는 푸코이단을 고추장에 첨가하여 푸코이단 첨가 고추장의 시험관내(in vitro) 항비만 증진 효과를 관찰하였으며, 이는 고추장 자체의 항암효과는 제조방법 및 사용되는 부재료에 따라 항암활성이 달라지므로 푸코이단을 첨가하여 고추장의 항암효과를 증진시키고자 본 발명은 안출하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 푸코이단을 첨가함으로써 항암 및 항비만 기능성이 증진된 고추장과 그 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 상기 목적은 지방세포에서 푸코이단과 푸코이단을 첨가하여 제조한 고추장의 항비만 효과를 조사하고, 암세포에서 시험관내(in vitro) 항암 효과를 조사함으로써 달성하였다.

이하, 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 푸코이단 첨가 고추장을 제조하는 단계; 지방세포에서 푸코이단과 푸코이단 첨가 고추장의 항비만 효과를 조사하는 단계; 및 암세포에서 시험관내(in vitro) 항암 효과를 조사하는 단계로 구성된다.

본 발명은 푸코이단을 첨가하여 항암 기능성이 증진된 고추장을 제공함을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 푸코이단 첨가 고추장의 제조

푸코이단((주)MSC)은 0.5, 1 및 3 중량%의 비율로 첨가하여 통상의 방법에 따라 고추장을 제조하였다. 소금은 한주소금을 사용하였으며 밀쌀은 호주산으로 80% 도정된 것을 사용하였다. 고추장은 상품용 고추장의 제조방법으로 밀쌀과 밀가루를 증자 냉각하여 아스퍼질러스 오리재(A. oryzae)를 접종한 후 밀가루 곡자와 덧밥, 식염, 종수를 첨가하였고, 여기에 효모를 접종하고 혼합(30℃, 일주일 숙성)하여 이송한 후 30~40일간 균질화시킨 사입물에 고춧가루 및 푸코이단을 첨가하여 제조하였다.

푸코이단 첨가 고추장은 동결건조한 후 시료를 마쇄하여 분말로 조제하고 분말시료에 20배(w/v)의 메탄올을 첨가하여 12시간 교반을 2회 반복하여 여과한 후 회전식 진공 농축기로 농축하여 메탄올 추출물(methanol extract)을 얻었다. 이들 추출물들은 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 희석하여 20% 스톡을 만든 후 1mg/㎖의 농도로 희석하여 지방세포로 완전히 분화된 프라이머리 셀(primary cell)에 처리하였다.

푸코이단의 항비만 효과를 실험하기 위해서는 1 중량%를 첨가하여 제조한 고추장의 메탄올 추출물을, 항암 효과를 위해서는 푸코이단 0.5 및 3 중량%를 첨가한 고추장의 메탄올 추출물을 각각 사용하였다.

지방세포의 배양

마우스의 배아에서 유래한 세포주인 3T3-L1세포는 ATCC(ATCC, USA)에서 분양받았으며, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum), 100 unit/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배양액을 사용하여 37℃, 5% CO₂가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 3, 4일 후 세포가 컨플루언트(confluent) 상태가 되면 0.05% 트립신-EDTA로 처리하여 계대 배양하였으며 배지는 2~3일마다 교환하였다. 세포의 분화를 유도하기 위하여 세포밀도가 3.3×10³ cell/cm²되도록 현탁액 용액을 만들어 12-웰 플레이트에 1㎖ 씩 분주하여 2차 배양하였다. 세포가 80% 컨플루언트 상태가 되면, 5㎍/㎖ 인슐린, 0.25μM 덱사메타존(dexamethazone), 0.5mM IBMX가 함유된 10% FBS-DMEM 배양액으로 교환하여 분화를 유도한 후 2일 간격으로 5㎍/㎖ 인슐린을 함유한 배양액으로 교환하였다. 분화배지 처리 후 약 10일이 지나면 90% 이상이 지방세포로 분화된다.

ELISA 방법에 의한 렙틴함량의 측정

지방세포에서 분비된 렙틴(leptin)의 양은 수집한 배지를 이용하여 ELISA (Enzyme Linked Immunosolvent Assay, R&D systems) 방법을 이용하여 측정하였다. 먼저 100㎕의 항-마우스 렙틴 IgG(anti-mouse leptin IgG, 2㎍/㎖)를 Maxisorb ELISA plate(Nunc)에 넣어 오버나이트 동안 배양시킨 후 PBS-T(0.05%의 Tween 20을 포함하는 PBS)로 3차례 세척한 플레이트에 수집한 배지 100㎕을 넣어 1시간 동안 배양하였다. 다시 PBS-T로 3차례 세척한 후 100㎕의 비오틴 처리한 항-마우스 렙틴 IgG(biotinylated anti-mouse leptin IgG, 200ng/㎖)을 넣고 1시간 동안 상온에서 배양한 후 다시 PBS-T로 3번 세척하였다. 엑스트라아비딘-고추냉이 페록시다아제( Extravidin-horse radish peroxidase, 희석율=1:200, R&D Systems)를 상온에서 1 시간 동안 배양시킨 후 3번 세척하였다. 면역반응성(Immunoreactivity)은 각 웰에 100㎕의 TMB(tetramethyl benzidine dihydrochloride substrate, TMB, Amresco) 를 넣고 30분 동안 반응시킨 후 나타났다. 이 반응은 웰 당 50㎕의 2M H₂SO₄를 첨가함으로 반응을 종료시켰다. 반응 종료 후 흡광도(Optical Density)는 플레이트 스펙트로포토미터(plate spectrophotometer)를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.

글리세롤 함량의 측정

글리세롤 농도는 GPO-TRINDER(시그마사)을 사용하여 효소반응법에 따라 측정하였다. 글리세롤 분석 제제(Glycerol assay reagents)는 50㎖의 3차 증류수에 용 해시킨 후 1㎖을 취해 37℃에서 5분간 가열하였다. 미리 가온한 유리 글리세롤 시약 1㎖에 수집된 배양액 10㎕을 첨가하여 37℃에서 5분간 배양하였다. 글리세롤 정량을 위해서는 글리세롤 표준용액(Sigma) 12.5㎍과 25㎍을 시료와 동일한 방법으로 반응시킨 후 96웰 플레이트에 200㎕를 취하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

암세포 배양

AGS 인체 위암세포(AGS human gastric adenocarcinoma cell), HT-29 인체 결장암세포(HT-29 human colon adenocarcinoma cell)는 한국세포주은행(서울의대)으로부터 분양받아 배양하면서 실험에 사용하였다. AGS 및 HT-29 암세포는 100 units/㎖의 페니실린-스트렙토마이신과 10%의 FBS(fetal bovine serum)가 함유된 RPMI 1640을 사용하였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2~3회 새로운 배지로 바꿔주고(refeeding) 6~7일 만에 PBS로 세척한 후 0.05% 트립신-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 6~7일 마다 계대배양하면서 실험에 사용하였다. 계대배양시 각각의 패시지 번호(passage number)를 기록하였고 패시지 번호가 10회 이상일 때는 새로운 암세포를 액체질소 탱크로부터 꺼내어 다시 배양하여 실험하였다.

MTT assay

배양된 암세포를 96-웰 플레이트에 각 웰당 1×10⁴cells/㎖가 되도록 분주(seeding)하고 시료를 농도별로 첨가한 다음, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 72시간 후 MTT(미국 시그마사) 20㎕를 첨가하고 4시간 동안 더 배양한 후 생성된 포마잔 결정을 DMSO에 녹여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

통계분석

대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 결과들의 유의성을 검정하기 위하여 t-테스트를 하였으며, 그 결과는 평균(Mean)±표준편차(Standard deviation, SD)로 표시하였다.

실시예 2: 푸코이단 및 푸코이단 첨가 고추장의 항비만 및 항암 효과

상기 실시예 1의 푸코이단과 푸코이단을 첨가하여 제조한 고추장의 항비만 및 항암 효과를 조사하였다.

실험예 1: 푸코이단의 항비만 효과

3T3-L1지방세포에 대한 푸코이단의 비만 억제효과를 살펴보기 위하여 푸코이단처리에 의한 글리세롤 함량의 차이를 측정함으로써 시료처리에 의한 지방의 분해 정도를 관찰하였다(도 1). 중성지방이 분해되면 지방산과 글리세롤로 분해되므로 배지에 녹아있는 글리세롤 분비량을 측정함으로써 시료처리에 의한 지방의 분해정 도를 알 수 있다. 분화를 유도한 지방세포에 농도를 달리하여 푸코이단을 처리하여 글리세롤의 분비량을 검토하였다. 푸코이단의 처리 농도의 증가에 비례하여 분비되는 글리세롤의 함량은 유의적으로 증가하였으며, 5μM 처리에서는 대조구에 비해 50%의 분해율 증가를 나타내었다.

푸코이단을 3T3-L1지방세포에 처리하여 렙틴의 분비를 살펴본 결과(도 2)에서는, 대조구에 비하여 푸코이단을 처리하였을 때 렙틴의 분비가 감소하는 것으로 나타났다. 렙틴은 지방세포에서만 분비되는 단백질로서 지방세포에서 분비되어 시상하부에 있는 렙틴 수용체에 결합하여 신경계로 자극을 전달한다. 이러한 자극신호는 음식의 섭취를 억제하고, 에너지 소비를 증가시켜 비만 유도를 조절하는 역할을 한다. 지방세포에서의 렙틴 분비량의 증가는 지방세포 내의 지방이 축적되는 것을 의미하므로, 렙틴 분비의 감소는 처리한 푸코이단이 지방세포의 분화를 억제하거나 세포의 수 및 크기를 줄이는 효과가 있다고 생각된다.

실험예 2: 푸코이단 첨가 고추장의 항비만 효과

고추장 제조에 있어서 첨가된 푸코이단의 비만 억제효과를 살펴보기 위하여 푸코이단 첨가 고추장의 3T3-L1지방세포에 대한 렙틴의 분비량을 관찰하였다. 푸코이단을 첨가한 고추장의 메탄올 추출물을 비만세포에 처리하여 렙틴의 분비를 살펴본 결과(도 3), 대조구에 비하여 고추장을 처리하였을 때 렙틴의 분비가 감소되는 것으로 나타났다. 즉, 고추장의 처리는 지방세포 내의 렙틴 분비량을 감소시켰으며, 푸코이단 첨가 고추장을 처리하였을 때 렙틴의 분비량은 유의적으로 가장 큰 감소를 보였다. 렙틴은 지방세포에서만 분비되는 단백질로서 렙틴의 분비가 감소하였다는 결과는 시료의 처리로 지방세포의 분화가 억제되었거나 비만세포의 수 및 크기가 줄어들었기 때문으로 사료된다. 이상의 결과에서 푸코이단은 지방의 축적을 억제하는 효과가 탁월함을 알 수 있었으며 고추장에 푸코이단을 첨가함으로써 고추장의 항비만 활성을 더욱 증진시킬 수 있을 것으로 생각된다.

실험예 3: 푸코이단의 항암효과

푸코이단의 시험관내(in vitro) 항암효과를 살펴보기 위하여 정상세포에 대한 푸코이단의 독성을 검토하였다. 푸코이단은 5mg/㎖의 첨가농도에서도 97%이상의 높은 생존율을 나타내어(미도시됨), 이 농도범위 내에서 암세포 성장억제효과를 관찰하였다. 푸코이단에 의한 AGS 및 HT-29 인체 암세포의 성장 억제효과를 살펴본 결과는 표 1과 같다.

푸코이단은 1mg/㎖의 낮은 첨가농도에서도 AGS 및 HT-29 인체 암세포에 대하여 각각 74% 및 76%의 높은 저해율을 나타내었다.

푸코이단의 암세포 성장 억제 효과

처리	OD₅₄₀ ₍억제율, %)
처리	AGS	HT29
대조군	0.638±0.021	0.492±0.017
1 mg/㎖	0.169±0.007	0.119±0.005(76)
2 mg/㎖	0.137±0.009(79)	0.096±0.002(80)
5 mg/㎖	0.097±0.004(85)	0.092±0.002(81)

실험예 4: 푸코이단 첨가 고추장의 항암효과

항암 기능성 증진 고추장개발을 위하여 높은 항암활성을 가진 푸코이단 0.5% 및 3%의 농도로 첨가하여 고추장을 제조하였다. 푸코이단 첨가 고추장의 시험관내(in vitro) 항암효과는 정상세포에 대하여 독성을 나타내지 않는 농도범위에서 관찰하였다. 푸코이단을 0.5% 첨가 고추장의 암세포성장 억제효과를 관찰한 결과는 표 2와 같다. 시료 처리 농도가 높을수록 암세포 성장 저해율도 높아져, 5mg/㎖의 처리 농도에서는 AGS 및 HT-29 인체 암세포에 대하여 각각 59% 및 66%의 높은 저해율을 나타내었다.

푸코이단 3% 첨가 고추장에 의한 AGS 및 HT-29 인체 암세포의 성장 억제효과를 살펴본 결과(표 3)에서도 비슷한 경향을 나타내었다. 시료 처리 농도에 비례하여 AGS 및 HT-29 인체 암세포에 대한 저해율도 높아졌다. 또한 고추장에 첨가되는 푸코이단의 농도가 높을수록 암세포의 성장을 억제하는 저해율도 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 고추장은 그 자체로도 항암활성을 가지며, 푸코이단을 첨가함으로서 고추장의 항암 기능성을 더욱 증진시킬 수 있었다.

푸코이단 0.5% 첨가 고추장의 암세포 성장 억제 효과

처리	OD₅₄₀(억제율, %)
처리	AGS	HT29
대조군	0.519±0.006	0.467±0.014
1 mg/㎖	0.515±0.014(1)	0.456±0.018(2)
2 mg/㎖	0.469±0.025(10)	0.424±0.028(9)
4 mg/㎖	0.318±0.016(39)	0.241±0.021(54)
5 mg/㎖	0.214±0.011(59)	0.160±0.005(66)

푸코이단 3% 첨가 고추장의 암세포 성장 억제 효과

처리	OD₅₄₀(억제율, %)
처리	AGS	HT29
대조군	0.512±0.011	0.513±0.019
1 mg/㎖	0.496±0.012(3)	0.459±0.035(11)
2 mg/㎖	0.379±0.014(26)	0.291±0.013(43)
4 mg/㎖	0.162±0.007(68)	0.197±0.013(62)
5 mg/㎖	0.124±0.009(76)	0.161±0.006(69)

상기 실시예 및 실험예를 통해 살펴본 바와 같이, 본 발명은 푸코이단을 첨가한 항암 기능성 증진 고추장의 제조방법에 관한 것으로, 푸코이단 첨가 고추장은 항비만 효과와 항암 효과를 더욱 증진시켰다. 따라서, 본 발명에서 푸코이단의 첨가는 고추장의 항비만 및 항암 기능성을 더욱 증진시키므로 기능성식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

고추장 제조시, 푸코이단 분말 0.5~3 중량%를 첨가하여 제조함을 특징으로 하는 항암 기능성 증진 고추장의 제조방법.
제1항의 방법에 따라 제조되는 항암 기능성 증진 고추장.