TWI457129B

TWI457129B - Use of a Lycogen composition for the manufacture or prevention of hypertrophy or renal function of the prostate

Info

Publication number: TWI457129B
Application number: TW102109063A
Authority: TW
Inventors: Wen Sheng Liu; Fu Hsin Chang; Ya Wen Tsai
Original assignee: Asia Pacific Biotech Developing Inc
Priority date: 2012-03-16
Filing date: 2013-03-14
Publication date: 2014-10-21
Also published as: TW201338784A

Description

一種製造用於治療或預防攝護腺肥大或腎功能的類茄紅素(Lycogen)組合物之用途

本發明係一種於製造治療或預防攝護腺肥大或腎功能的類茄紅素組合物之用途。

番茄紅素(Lycopene)，簡稱茄紅素，是類胡蘿蔔素的一種。作為一種天然色素存在於自然界中，呈紅色，因最早發現於番茄中而得名。在番茄由綠轉紅時其含量增加，番茄愈紅，茄紅素的含量愈多。一般營養素易受熱而破壞，但是茄紅素在食物中相當穩定，不會因烹調而流失，反而是經過加熱加工後，人體吸收率會更好，因為茄紅素屬於脂溶性，在和油脂一起烹調之下成份會溶入脂肪中，較易被人體所吸收而增加利用率。

攝護腺又稱前列腺，影響攝護腺肥大的因素有很多，攝護腺會隨著年齡的增加而增大。前列腺過大會壓迫尿道，影響正常排尿並波及腎臟。腎臟將受壓迫力損害及被尿裡的細菌感染。當腎臟充斥著這些細菌，很可能發生腎臟炎。前列腺炎也可能引起膀胱炎。攝護腺肥大是一種擾人的病變，40歲以上的男性幾乎都有這項困擾，80歲以上飽受攝護腺肥大之苦者，更高達九成以上，其症狀包括有頻尿、排尿困難、尿流減弱和排尿不淨等。傳統治療攝護腺肥大的藥物，多是採用甲型交感神經阻斷劑，不過易出現副作用，約有一至二成的患者，在服用後會出現血壓低、頭暈等症狀，對於上了年紀的老人而言，一不小心還會導致跌倒等意外；因此，沒有副作用的茄紅素，可說是提供一個極佳的治療方式。

有鑒於茄紅素對人體具有上述之效益，而目前由番茄中所取得之茄紅素之量及速度仍屬有限，如台灣發明專利第100125866號申請專利案，其揭示一種突變可產生類茄紅素之菌種，有效的快速萃取出大量之類茄紅素，該類茄紅素產生抗發炎、抗氧化、美白、抑制膠原蛋白分解或促進膠原蛋白增生之多種功效。因此，茄紅素可用於治療攝護腺肥大或腎功能具有相當大的潛力，然而卻未有研究發現利用突變的菌種產生類茄紅素治療或預防攝護腺肥大或腎功能，而市面上對於治療或預防攝護腺肥大或腎功能之類茄紅素產品，亦不多見。因此，本發明將有助於護腺肥大或腎功能相關疾病的治療或預防。

本發明提供一種新穎的類茄紅素組合物，所述組合物中的類茄紅素係由光合菌所萃取而來，所述光合菌係球型紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides)，由野生或培養之原生光合菌經紫外線照射使其變性而來，已寄存於布達佩斯條約的德國微生物與細胞蒐集中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)，寄存編號為DSM 25056，並亦於台灣新竹食品工業發展研究所寄存，寄存標號為BCRC910406，光合菌的CrtC酵素DNA序列如SEQ ID NO.1所示，光合菌CrtC酵素胺基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述類茄紅素係利用有機溶劑萃取，所述有機溶劑可為甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、正己烷、二氯甲烷或乙酸乙酯等。

本發明係利用一種類茄紅素萃取物，其包含活性成分選自ζ-胡蘿蔔素(ζ-carotene)、鏈孢紅素(neurosporene)、球形烯醇(spheroidenone)及/或甲氧基鏈孢紅素(methoxyneurosporene)。在本發明之一具體實施例中，所述活性成分係萃取自突變之光合菌。在另一具體實施例中，所述突變之光合菌係寄存標號為BCRC910406的球形紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides )。在尚有另一具體實施例中，所述突變之光合菌之CrtC酵素(hydroxyneurosporene dehydrogenase)之DNA序列如SEQ ID NO：1所示；而野生型光合菌之CrtC酵素(hydroxyneurosporene dehydrogenase)之DNA序列如SEQ ID NO：3所示。在另一具體實施例中，所述突變之光合菌之CrtC酵素(hydroxyneurosporene dehydrogenase)之胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示；而野生型光合菌之CrtC酵素之胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本發明提供一種用於製造治療或預防攝護腺肥大的類茄紅素組合物之用途，所述的類茄紅素組合物包含有效劑量的類茄紅素萃取物。其中所述的類茄紅素組合物之有效劑量為25~150毫克/公斤。

根據本發明之具體實施例中，所述的類茄紅素組合物包含活性成分選自ζ-胡蘿蔔素(ζ-carotene)、鏈孢紅素(neurosporene)、球形烯醇(spheroidenone)及/或甲氧基鏈孢紅素(methoxyneurosporene)。在本發明之一具體實施例中，所述活性成分係萃取自突變之光合菌。在另一具體實施例中，所述突變之光合菌係寄存標號為BCRC910406的球形紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides )。在尚有另一具體實施例中，所述突變之光合菌之CrtC酵素(hydroxyneurosporene dehydrogenase)之DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

本發明另提供一種用於製造治療或預防腎功能的類茄紅素組合物之用途，所述的類茄紅素組合物包含有效劑量的類茄紅素萃取物。其中所述的類茄紅素組合物之有效劑量為25~150毫克/公斤。

根據本發明之組合物之具體實施例中，所述組合物可用作於食物增補劑、動物飼料、人類食物產品或醫藥品或化妝品組合物。

根據本發明之組合物之另一具體實施例中，其可被製成適合用於非經腸道、局部或口服投藥劑型。較佳地，本發明之組合物可被製成溶液、乳劑、粉末、錠劑、膠囊或供用於口服投藥的其他形式。

本發明之具體實施例中，所述組合物可做為包括，但不限於：膳食補充劑、食品、飲料、乳品或上述形式之組合；其中乳品可為流體乳品(如：牛奶與濃縮牛奶)、發酵乳品(優酪乳、酸乳、冷凍優格、乳酸菌發酵飲料)、奶粉、冰淇淋、乳酪、乾酪、豆奶與發酵豆奶等。飲料可為蔬果汁、果汁及運動飲料等。食品可為甜點、糖果、嬰兒食品、動物飼料等。

茲以下列實施方式予以詳細說明本發明，惟並不意味本發明僅侷限於此等實施方式所揭示之內容。

圖1係根據本發明之一具體實施例，產生茄紅菌之流程圖。

圖2係原生光合菌之代謝途徑。

圖3(A-B)係根據本發明之一具體實施例，本發明之茄紅菌與野生光合菌之CrtC酵素DNA序列比較圖。

圖4係根據本發明之一具體實施例，本發明之茄紅菌與野生光合菌之CrtC酵素胺基酸序列比較圖。

圖5係根據本發明之一具體實施例之高效液相層析法(HPLC)分析圖；(A)至(F)為以不同有機溶劑萃取本發明茄紅菌之萃取物；圖5(G)為茄紅素標準品；圖5(H)為本發明茄紅菌之乙醇丙酮類茄紅素萃取物。

圖6顯示(A)茄紅素；(B)ζ-胡蘿蔔素；(C)鏈孢紅素；(D)球形烯醇及(E)甲氧基鏈孢紅素之分子結構。

圖7顯示(A)ζ-胡蘿蔔素；(B)鏈孢紅素；(C)球形烯醇及(D)甲氧基鏈孢紅素之預測NMR光譜。該些經標記之波峰代表該些可與類茄紅素萃取物之COSY NMR光譜所示之波峰相對應之波峰。

圖8顯示類茄紅素萃取物之COSY NMR光譜；標記為「a」之波峰代表可能的雜質；標記為「b」之波峰代表球形烯醇及甲氧基鏈孢紅素；標記為「c」之波峰代表ζ-胡蘿蔔素及鏈孢紅素；且標記為「d」之波峰代表球形烯醇。

圖9顯示根據本發明之一具體實施例之ζ-胡蘿蔔素純化物(A)及鏈孢紅素純化物(B)¹ H NMR光譜；箭頭所指處表示ζ-胡蘿蔔素純化物及鏈孢紅素純化物皆會在5.1ppm處產生一波峰。

圖10顯示根據本發明之一具體實施例之類茄紅素萃取物¹ H NMR光譜(A)及其部分放大圖(B及C)。

圖11顯示根據本發明之一具體實施例之用於定量分析的類茄紅素萃取物¹ H NMR光譜。

圖12為根據本發明之一具體實施例，進行效用測試實驗之實驗流程圖。

圖13為試驗實驗中經過本發明組合物處理的BPH老鼠的攝護腺指數。A：空白組；B：載體((南瓜子油)；C：類茄紅素。

圖14為BPH老鼠經由不同劑量的組合物處理後整體體重的改變。

圖15為BPH老鼠的攝護腺指數經由注射不同劑量的組合物的改變情形。患有BPH的實驗老鼠經由餵食不同劑量的組合物且持續28天。圖15(A)為攝護腺指數之結果，其計算方式為攝護腺的總重占整體體重的比率。每個數據接取自於來自同一組別的8隻老鼠的結果平均加減標準差，且藉由鄧肯多變域檢定發現有統計上的意義(P <0.05)。1：空白控制組；2：BPH控制組；3：50毫克/公斤(低濃度)；4：50毫克/公斤(中濃度)；5：150毫克/公斤(高濃度)。圖15(B)為攝護腺抑制效果，將空白組的攝護腺指數設定為0%，BPH控制組則為100%，而在觀察餵食不同劑量的組合物的老鼠其抑制攝護腺腫大的情形。A：50毫克/公斤(低濃度)；B：50毫克/公斤(中濃度)；C：150毫克/公斤(高濃度)。

圖16為H&E染色法，其顯示餵食不同濃度Locogen(LyG)的老鼠攝護腺組織情況。

圖17顯示隨著Lycogen的增加(50~150mg/kg)對腹側及背側之攝護腺肥大改善效果有遞增的趨勢。

圖18為利用腹側前列腺與背側前列腺的平均值表示整體攝護腺肥大之改善效果。

圖19為不同劑量的組合物對於血中尿素氮之結果。A：空白控制組；B：25毫克/公斤(低劑量)；C：100毫克/公斤(高劑量)。

圖20為不同劑量的組合物對於血清肌酸酐之結果。A：空白控制組；B：25毫克/公斤(低劑量)；C：100毫克/公斤(高劑量)。

圖21為不同劑量的組合物對於血中尿酸之結果。A：空白控制組；B：25毫克/公斤(低劑量)；C：100毫克/公斤(高劑量)。

首先，請參閱圖1之流程圖所示，本發明提供一種生成類茄紅素之微生物，其主要係將野生或培養之原生光合菌，利用紫外線分別予以照射5、10、20、30、40秒後，使其產生變性，而當光合菌經由紫外線之照射而變成含有豐富茄紅素之突變光合菌(命名為茄紅菌)時，將該突變之光合菌(茄紅菌)篩選取出，並予以培養繁殖，再以有機溶劑予以萃取出茄紅素及類茄紅素。

次請參閱圖2，原生光合菌生成茄紅素的代謝途徑中，由甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate)起始，其經由CrtB酵素作用轉變成八氫番茄紅菌(Phytoene)，接著藉由CrtI酵素作用轉變成六氫番茄紅菌(Phytofluene)，該六氫番茄紅菌則接著經由CrtI酵素變化成ζ-胡蘿蔔素(ζ-carotene)，而ζ-胡蘿蔔素會再經由CrtI酵素作用變化成鏈孢紅素(Neurosporene)；接著，鏈孢紅素經由CrtI酵素作用轉變成茄紅素(Lycopene)。該茄紅素生成後被CrtC酵素轉化成紫菌紅素(Rhodopin)，該紫菌紅素經由CrtD酵素作用轉化成3,4-二脫氫紫菌紅素(3,4-didehydrorhodopin)，該3,4-二脫氫紫菌紅素會經CrtF酵素變化成脫水紫菌紅醇(Anhydro-rhodovibrin)，該脫水紫菌紅醇會經CrtC酵素變化成紫菌紅醇(Rhodovibrin)；接著該紫菌紅醇再經由CrtD酵素變化成單脫甲基螺菌黃素(Monodemethyl-spirilloxanthin)，該單脫甲基螺菌黃素最後由CrtF酵素變化成螺菌黃素(Spirilloxanthin)。

上述之代謝過程中，該鏈孢紅素(Neurosporene)尚有可能會由CrtC酵素變化成羥基鏈孢紅素(hydroxyneurosporene)，該羥基鏈孢紅素再經由CrtF酵素轉變成甲氧基鏈孢紅素(Methoxyneurosporene)，然後該甲氧基鏈孢紅素由CrtD酵素變化成球形烯(Spheroidene)；其中，該球形烯可能由CrtC酵素作用生成羥基球形烯羥(Hydroxyspheroidene)，或由CrtA酵素作用生成球形烯醇(Spheroidenone)。

其中，本發明之原生光合菌經由紫外線之照射後，其顏色會產生變化，當其變化成鮮紅色之突變光合菌(茄紅菌)時，將菌液篩選出至培養皿中進行培養繁殖，經由培養繁殖之茄紅菌的CrtC酵素的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，CrtC酵素的胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示。比較該突變之光合菌(茄紅菌)之CrtC酵素的DNA序列與野生(原生)之光合菌之CrtC酵素的DNA序列時，如圖3所示，茄紅菌於第76、88、147、214、274、282、310、496、694、707、708及715個序列會產生變異；藉此，可確定於CrtC酵素DNA序列的第76、88、147、214、274、282、310、496、694、707、708及715個核苷酸具有變異的突變菌株即為茄紅菌。此外，該茄紅菌之CrtC酵素胺基酸序列則如SEQ ID NO：2所示。該茄紅菌之CrtC酵素胺基酸序列與原生之光合菌比較時，如圖4所示，可於第45、46、47、190及239個胺基酸位置發現變異；藉此，可確定於CrtC酵素胺基酸序列第45、46、47、190及239個胺基酸位置具有變異的突變菌株即為茄紅菌。接著將該等茄紅菌篩選至培養皿中予以培養繁殖，再利用有機溶劑萃取培養所得之茄紅菌，而該有機溶劑於實施時，可利用脂溶性有機溶劑為之。

本發明藉由採用物理性之紫外線照射，將野生或培養之原生光合菌以不同時間照射處理，使該光合菌產生突變菌株，並篩選出顏色呈鮮紅色之茄紅菌，將該茄紅菌篩選至培養皿中予以培養繁殖，再以有機溶劑進行，藉此，無須由番茄中萃取，即可達到快速的產生大量茄紅素與類茄紅素之功效。

類茄紅素之提取與分離

1.甲醇和丙酮萃取物

菌體以甲醇於室溫下震盪後離心8000rpm，10分鐘，取上清液後過濾，重覆此抽取步驟三次，合併三次濾液，並減壓濃縮得到甲醇萃取物(Rs-M)。經甲醇萃取後之菌體殘餘物再以丙酮萃取，重複以上步驟，減壓濃縮後得到丙酮萃取物(Rs-M/A)。

2.乙醇和丙酮萃取物

同上步驟1，分別得乙醇萃取物(Rs-E)和丙酮萃取物(Rs-E/A)。

3.丙酮萃取物

同上步驟1，得丙酮萃取物(Rs-A)

4.萃取物之分離

萃取物加入蒸餾水使之成懸浮液，再以正己烷萃取三次，萃取液合併減壓濃縮至乾，得到正己烷層(Fr,Rs-H)，同上法再將水層依序增加極性以二氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和之正丁醇萃取之，分別得二氯甲烷層(Fr,Rs-C)，乙酸乙酯層(Fr,Rs-E)，正丁醇層(Fr,Rs-B)，餘者為水層(Fr,Rs-W)。

HPLC分析法

菌色素含量分析，取菌體萃取粉末以適量DMSO回溶，全程避光。HPLC條件如下：採用C18管柱，波長470nm，移動相為甲醇/異丙醇(95/5,v/v)，流速1毫升/分鐘，茄紅素標準品滯留時間為50±2分鐘。

甲醇萃取物(Rs-M)顏色為綠色，乙醇萃取物(Rs-E)顏色為茶褐色，丙酮萃取物(Rs-A)顏色為深紅色。以茄紅素標準品為比較，經HPLC分析發現，Rs-A之茄紅素含量最多(RT=50分鐘)，Rs-E微量，而Rs-M則完全沒有茄紅素；推測使用甲醇和乙醇萃取之殘餘菌體仍含有茄紅素，故將甲醇與乙醇處理後的菌體殘餘物分別使用丙酮再進行萃取，結果分別得到甲醇殘餘物的丙酮萃取物(Rs-M/A)和乙醇殘餘物的丙酮萃取物(Rs-E/A)，二者顏色皆為紅色。Rs-E/A和Rs-M/A亦進行HPLC分析，如圖5(A)至(F)所示，箭頭所指處為茄紅素吸收峰。

菌體之乙醇丙酮萃取物溶於二甲亞碸(DMSO)後經HPLC分析，並與茄紅素標準品(L-9879,Sigma)比對其滯留時間(圖5(G))，發現菌體萃取物之HPLC分析圖譜顯示位於標準品相同滯留時間(50分鐘)的波峰極小，最大的波峰出現在滯留時間約21分鐘左右(約21.7~24.19分鐘，稱為未知波峰)(圖5(H))。表示菌體茄紅素在波長470nm下吸光的主要成分以21分鐘出現之物質為主，可能是菌體本身合成茄紅素過程之中間代謝產物，因此稱之為「類茄紅素」。以波峰面積來計算的話，其中的茄紅素面積僅為類茄紅素的3.3%左右。

NMR分析

以下實驗中所使用的樣本係利用乙醇丙酮萃取本發明之光合菌所得的類茄紅素萃取物。

A：樣本製備

秤取約15mg樣本並將其溶解於D-三氯甲烷中。將溶解完成之樣品裝入常規液態NMR tube，裝入的體積大約在500uL左右。裝入後使用parafilm(石臘膜)將管口密封，並置於冰箱中保存(~4℃)，以防止溶劑的揮發與樣品的變質。

B：NMR實驗

將配置好的樣品放入液態500 NMR(Varian公司產品，磁場強度為11.74T)。將樣品進行20rps的轉動(儀器內建功能)，藉以消除磁場不均勻性，提升光譜解析度。呼叫儀器內部脈衝序列資訊，分別進行一維¹ H NMR、¹³ C NMR、DEPT NMR、COSY NMR、NOESY NMR實驗。實驗完成後，調整得到的光譜(基線調整、相位調整、施加窗函數)。上述這些調整主要目的在於利於後續的分析。本發明所屬述領域中具有通常知識者認可，這些調整不會對光譜產生嚴重性失真，因此被廣為應用。

C：光譜分析

將NMR實驗中得到的一維¹³ C譜、DEPT譜、二維COSY譜(圖8)及二維NOESY譜進行分析比較。一維¹³ C譜展示所有¹³ C資訊。DEPT譜可以用來區分甲基、乙基及丙基碳。COSY和NOESY譜則可以用來鑑定分子結構。

將COSY譜與預測所得之光譜(圖7，由NMR預測器(nmrdb.org)產生)進行比較以辨識樣本中所含的各種成分。為了進行NMR光譜預測，自KEGG網站下載各化合物(請參照圖6)之分子表達譜(molecular profiles)，並以NMR預測器進行資料處理及預測。利用上述光譜得到的各項資訊，進行樣品定性以及定量的判斷。接著請參照圖8，標記為「a」之波峰代表可能的雜質；標記為「b」之波峰代表球形烯醇(spheriodenone)及甲氧基鏈孢紅素(methoxyneurosporene)；標記為「c」之波峰代表ζ-胡蘿蔔素(ζ-carotene)及鏈孢紅素(neurosporene)；且標記為「d」之波峰代表球形烯醇(spheriodenone)。根據標記為「c」之波峰的低強度，相較於在3-4ppm之間的兩個波峰(標記為「b」)，可得知球形烯醇(spheriodenone)及甲氧基鏈孢紅素(methoxyneurosporene)係樣本中之主要成分，且其比例約為一比一。所述球形烯醇含量多於樣本的30重量百分比，而甲氧基鏈孢紅素含量亦多於樣本的30重量百分比。

ζ-胡蘿蔔素純化物、鏈孢紅素純化物及類茄紅素萃取物的¹ H NMR光譜如圖9至11所示。以前述資訊為基礎，藉由將圖10(A)中所示之光譜與圖9(A)及(B)中所示之光譜進行比較，以進一步辨識類茄紅素萃取物中的活性成分及其所占比例。圖10(A)光譜中各波峰所代表的化合物被標示於圖10(B)及(C)中。圖10(C)虛線長方型區域內的波峰皆可與ζ-胡蘿蔔素純化物(圖9(A))及鏈孢紅素純化物之¹ H NMR光譜中的波峰相對應(圖9(B))。由圖9(A)及(B)可得知，ζ-胡蘿蔔素純化物及鏈孢紅素純化物在進行¹ H NMR時，皆會產生一個在5.1ppm處的波峰(箭頭標示)。

由一化合物在NMR光譜中波峰的強度及/或波峰下的面積可推知該化合物的含量。圖9(A)及(B)中，箭頭所指波峰的強度比為1：1.273，代表ζ-胡蘿蔔素及鏈孢紅素之比例為1：1.273。圖11中的波峰a代表ζ-胡蘿蔔素及鏈孢紅素；波峰b代表球形烯醇；而波峰c代表甲氧基鏈孢紅素。上述波峰a、b及c的面積比為1：1.553：1.604。根據上述所有實驗資料，可計算得知本發明類茄紅素萃取物中所含的ζ-胡蘿蔔素約為10.58重量百分比，鏈孢紅素約為13.47重量百分比，球形烯醇約為37.37重量百分比，而甲氧基鏈孢紅素約為38.58重量百分比。

惡性攝護腺肥大之動物實驗

本發明購自六隻正常和28隻經歷睪丸摘除手術之公鼠，其年紀皆約為6-7個禮拜，體重介於180-220公克之間，購買後隔離飼養1個禮拜。飼養公鼠之環境設定為為攝氏23±1℃且為12小時日夜循環。該些公鼠皆能自行飲食及喝水；另一方面，亦準備三種濃度的試劑(表一)。本實驗步驟已提交動物保護協會及生技發展中心審查且得到認可。

試驗性實驗：將具有預防效果的類茄紅素組合物以10隻經睪丸切除的老鼠進行前測(pretest)。睪丸切除的老鼠隨機分為兩組，1)載體組，2)加入LyG 50毫克/公斤。在睪丸摘除的老鼠的肌肉內注射每公斤10毫克的睾酮環戊丙酸，每禮拜注射兩次且持續四個禮拜，使其患有攝護腺肥大(BPH)。其分組如表二。

本發明使用巴比妥(體重每一公斤使用60毫克)將老鼠安樂死，且從其股靜脈取血液樣本。在分析樣本前，將血液凝固後使用3000g離心10分鐘，以得到血清後在攝氏-20℃下保存。另外也從老鼠取下攝護腺，且將鄰近的血管及結締組織清除。經過假手術的控制組也是經由上述相同的方式取下其攝護腺。攝護腺指數的計算方式為攝護腺的總重占整體體重的比重，如式一：攝護腺指數=(攝護腺總重/整體體重)x 100% (式一)

實驗結果分析：

數據結果是使用平均±標準差的方式呈現。而統計分析則使用單因子變數分析，其根據鄧肯多變域檢定(SPSS軟體包)。P 值小於0.05是有統計上的意義。

效用測試實驗：

A.誘導階段：做為空白組的實驗生物為睪丸並未被摘除的假手術。而睪丸被摘除的老鼠則隨機分配至四組，分別為(a)BPH控制組；(b)低濃度-注射每公斤50毫克的LyG；(c)中濃度-注射每公斤100毫克的LyG；(d)高濃度-注射每公斤150毫克的LyG，與先前所述的試驗性研究的研究條件相同。

B.測試階段：所有的實驗組及控制組皆使用灌食的方式餵食且持續28天，其實驗細節於圖12及表三。

C.評估老鼠的攝護腺指數及體重：使用巴比妥(體重每一公斤使用60毫克)將老鼠安樂死，且從其股靜脈取血液樣本。在分析樣本前，將血液凝固後使用3000g離心10分鐘，以得到血清後在攝氏-20℃下保存。另外也從老鼠取下攝護腺，且將鄰近的血管及結締組織清除。經過假手術的控制組也是經由上述相同的方式取下其攝護腺。攝護腺指數的計算方式為攝護腺的總重占整體體重的比重，如式一。

切片實驗

利用上述實驗的老鼠，進行切片實驗，為了評估前列腺組織的型態變化，本實驗結果由國家實驗室動物中心(NLAC，台灣)進行評估。

一開始先收集上述實驗中每隻老鼠的前列腺組織，並將前列腺組織浸泡於10%甲醛緩衝液中，並進行組織石蠟包埋、組織切片，切片厚度約3-5μm並利用蘇木精和伊紅(Hematoxylin & Eosin)染色法染色，最後利用顯微鏡觀察組織情況。

實驗結果分析

實驗結果

在試驗性實驗中，圖13顯示有攝取類茄紅素(50毫克/公斤)的老鼠，其攝護腺的指數有下降的趨勢，然而其結果中經由t 測試發現並無統計上的意義(P >0.05)。因此在效用實驗終將類茄紅素的劑量提高。

在效用實驗中，每禮拜兩次監控試驗中老鼠的體重，圖14顯示患有BPH的實驗老鼠經由餵食不同劑量的Lcogen(LyG)且持續28天，且每禮拜兩次的監控其體重變化。另一方面，結果顯示餵食後的體重將高於尚未餵食時的體重，控制組及有食用組合物的老鼠的體重浮動百分比並無明顯的差異。

在評估攝護腺指數上，睪固酮可以成功地誘導BPH控制組的攝護腺腫大，其增加的比例約為0.95%，相較於空白組的0.50%。所有經由Lcogen(LyG)處理的BPH老鼠皆呈現抑制攝護腺腫大的情形，且呈現劑量依賴性(圖15A)。在施打低濃度、中濃度和高濃度的Lcogen(LyG)的BPH老鼠相較於BPH老鼠控制組而言，其抑制攝護腺腫大分別呈現6.8%、12.3%和13.9%(圖15B)。此外，在中濃度和高濃度的Lcogen(LyG)處理的老鼠實驗結果中，有統計上的顯著相關(P <0.05)。上述結果指出Lcogen(LyG)具有抑制攝護腺腫大的效果，且呈現劑量依賴性。

另一方面，圖16為H&E染色法，其顯示餵食不同濃度 Locogen(LyG)的老鼠攝護腺組織情況，圖16(A)為無攝護腺肥大之正常組織。圖16(B)為睪固酮誘發之攝護腺肥大組織。圖16(C)為媒介物處理之對照組；圖16(D)-(F)為不同劑量之Lycogen治療處理組。由圖16(B)顯示睪固酮之處理成功的誘發腺泡腔區之肥厚與上皮細胞增生(箭頭指處)。圖16(C)顯示媒介物(oil)之處理並無明顯改善效果。由圖16(D)-(F)可以發現將老鼠餵食不同濃度(100~150mg/kg)的Lycogen(LyG)時即有明顯改善之效果(箭頭指處)。

圖17顯示隨著Lycogen的增加(50~150mg/kg)對腹側及背側之攝護腺肥大改善效果有遞增的趨勢，顯示出Lycogen確實有改善攝護腺肥大之效果。黑色：腹側前列腺(Ventral Prostate，VP)；灰色：背側前列腺(Dorsolateral Prostate，DP)。

圖18為利用VP與DP的平均值表示整體攝護腺肥大之改善效果，圖18顯示Lycogen在50、100、150mg/kg處理下，分別產生約7%，12%，及25%的改善攝護腺肥大效果，顯示出隨著Lycogen的增加(50~150mg/kg)對攝護腺肥大改善效果有遞增的趨勢。

由上述結果進一步證實本發明的Lycogen(LyG)確實有改善攝護腺肥大之效果。

腎功能之生化數值分析

類茄紅素Lycogen對於腎功能之生化數值分析

A：血中尿素氮(BUN)分析結果

血中尿素氮主要經腎小球濾過，從小便中排出體外，當腎小球受損時濾過率降低，血中BUN升高。因此BUN是反映腎小球濾過功能的重要指標。若BUN升高時，會造成以下腎臟疾病；然而，若是嚴重肝臟疾患，BUN可能亦會降低。

1)如慢性腎炎，腎動脈硬化症，嚴重腎盂腎炎、腎結核和腎腫瘤的晚期，尤其是在腎功能衰竭尿毒症時。

2)腎前性疾病如脫水、水腫、腹水、循環功能不全等。

3)腎後性疾病如尿路結石或前列腺腫大引起的尿路梗阻。

4)體內蛋白質分解過盛時，如上消化道出血、大面積燒傷、甲狀腺功能亢進等

本發明將ICR老鼠分為三組，各組老鼠為6隻，分別為控制組(control；僅為安慰劑)、低劑量組(25mg/kg；Low dose)及高劑量組(100mg/kg；High dose)，以管灌餵食之方式進行，每天於固定時間餵食一次，為期30天，以觀察血中尿素氮(BUN)代謝情況。

圖19之結果顯示控制組、低劑量組到高劑量組隨著劑量的增加血中尿素氮(BUN)的含量遞減，可以說明本發明組合物(Lycogen)似乎可以增加腎臟對血中尿素氮(BUN)的代謝速率，且高劑量組更可達顯著差異(表五；p=0.049)。

B.血清肌酸酐(Creatinine)分析

由圖20之結果顯示隨著劑量的增，加Creatinine的含量遞減，可以說明本發明組合物似乎可以增加腎臟對Creatinine的代謝速率，各組間並未達顯著差異(表五)。

由圖21之結果顯示隨著劑量的增加，血中尿酸(Urin Acid)的含量逐漸遞減，可以說明Lycogen似乎可以增加腎臟對Urin Acid的代謝速率，各組間並未達顯著差異(表五)。

【生物材料寄存】 國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

台灣新竹食品工業發展研究所寄存，2008/11/04、寄存標號為BCRC910406。

國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

Claims

一種類茄紅素組合物用於製造治療或預防攝護腺肥大的藥物之用途，其中該類茄紅素組合物包含有效劑量的類茄紅素之萃取物。
如請求項1所述之用途，其中該類茄紅素之萃取物包含活性成分選自ζ-胡蘿蔔素(ζ-carotene)、鏈孢紅素(neurosporene)、球形烯醇(spheroidenone)及/或甲氧基鏈孢紅素(methoxyneurosporene)。
如請求項1所述之用途，其中該類茄紅素之萃取物係萃取自突變之光合菌。
如請求項3所述之用途，其中該突變之光合菌係寄存標號為BCRC910406的球形紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides )。
如請求項1所述之用途，其中該類茄紅素組合物進一步用作食物增補劑、動物飼料、人類食物產品或醫藥品或化妝品組合物。