KR20070062542A - 하이드록시이미노산으로부터 아미노산 유도체의 제조방법 - Google Patents

하이드록시이미노산으로부터 아미노산 유도체의 제조방법 Download PDF

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다다시 다케모토
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Abstract

본 발명은 공업적으로 유리한 아미노산 유도체의 제조방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
즉, 본 발명은 하기 화학식 I의 하이드록시이미노산을, 이로부터 하기 화학식 III의 아미노산 유도체의 생성 반응을 촉매하는 미생물 및/또는 효소와 접촉시켜 상기 화학식 III의 아미노산 유도체를 생성하는 단계를 포함하는 아미노산 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.
화학식 I
Figure 112007026453045-PCT00022
화학식 III
Figure 112007026453045-PCT00023
상기 화학식 I 및 화학식 III에서,
R1는 치환되거나 치환되지 않은 소정의 탄화수소 그룹이고,
R2는 탄소수 1 내지 3의 알킬 그룹 또는 수소원자이고,
n은 0 또는 1이다.
아미노산 유도체, 하이드록시이미노산, 모나틴, 트립토판

Description

하이드록시이미노산으로부터 아미노산 유도체의 제조방법{Process for producing amino acid derivative from hydroxyimino acid}
본 발명은 하이드록시이미노산으로부터 아미노산 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이며, 상세하게는, 하이드록시이미노산으로부터 효소적 환원에 의해 아미노산 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
아미노산은 의약품, 식품, 시약류 및 화학 합성 중간체 등으로서, 산업상 매우 중요한 성분이다. 아미노산의 제조방법으로서는, 추출법, 발효법, 효소법 및 화학 합성법의 4개로 대별된다. 이 중 효소법은, 목적하는 아미노산의 구조와 유사한 전구체를 원료로 하여 1 내지 수단계의 효소 반응으로 한번에 아미노산으로 전환시키는 방법이다. 효소법은 일반적으로 부산물이 적어 고순도의 아미노산을 수득할 수 있다. 또한, 효소법은 기질이 되는 전구체를 염가로 입수할 수 있는 경우에는 매우 효율적인 제조법이다.
아미노산 유도체의 1종인 모나틴(Monatin)은, 남아프리카의 관목의 뿌리로부터 분리·추출된 천연의 감미 아미노산이다. 모나틴은 수크로스의 수십배에서 수 천배에 상당하는 강한 감미를 가져 감미제로서 이용이 기대되고 있다.
모나틴의 제조방법에 관한 화학 합성법으로서는, 예를 들면, 인돌아세트산 유도체와 아스파르트산 할로겐화물을 원료로 하여 케톤 유도체를 합성하고, 또한 시아노하이드린 유도체를 수득하여, 이를 염기성 조건하에서 가수분해하는 방법이 있다[참조: 일본 공개특허공보 2003-171365호]. 또한 효소법으로서는, 예를 들면, 인돌-3-피루브산(IPA)으로부터의 중간체로서 4-(인돌-3-일메틸)-4-하이드록시-2-옥소글루타레이트(IHOG라고도 한다)을 생성하고, 또한 효소 존재하에서 모나틴을 생성하는 방법이 있다[참조: 국제공개공보 제2003/056026호 팜플렛]. 또한, 상기 IHOG를 효소의 존재하에서 생성하는 방법도 알려져 있다[참조: 국제공개공보 제2004/018672호 팜플렛].
IHOG로부터 모나틴을 생성하는 다른 방법으로서, 예를 들면, IHOG로부터 중간체로서 IHOG-옥심(또는 4-하이드록시-4-(3-인돌릴메틸)-2-하이드록시이미노글루타르산)을 생성하며, 또한 로듐 등의 환원 촉매의 존재하에서 모나틴으로 전환하는 방법이 있다[참조: 국제공개 제2003/059865호 팜플렛]. 그러나, 미생물 또는 효소의 존재하에서 IHOG보다 안정성이 높은 IHOG-옥심으로부터 모나틴을 생성하는 방법에 관해서는 알려져 있지 않다.
옥심(하이드록시이민)을 미생물 또는 효소를 사용하여 환원하는 것(효소적 환원)에 관해서는, 일본 공개특허공보 제(평)4-23499 A호; Pharmacology, 13, 234(1975); Clement et al., Arch. der Parmazie, 321, 955(1998); Clement et al., JBC, 272, 19615(1997); Gibbs et al., Tetrahedron Lett., 31, 555(1990) 등 에 기재되어 있다. 예를 들면, 일본 공개특허공보 제(평)4-234993 A호에는, 아세토페논옥심으로부터 α-메틸벤질아민을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 하이드록시이미노산을 미생물 또는 효소의 존재하에서 환원시켜 아미노산을 생성하는 방법에 관해서는 전혀 알려져 있지 않다.
화학 합성에 의한 아미노산 유도체의 제조방법은, 분리·추출이 곤란한 아미노산 유도체를 생산하기 위해 유용하지만, 반면, 고가의 설비비 및 고가의 촉매를 사용하지 않으면 안되는 등, 공업적 생산 규모에서는 비용면에서 불리한 경우도 많다. 이에 대하여, 아미노산 유도체의 제조에 있어서 미생물 또는 효소를 사용한 방법은 공업적으로 유용한 경우가 많다. 상기와 같은 상황하에서, 본 발명은 공업적으로 유리한 아미노산 유도체의 제조방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 모나틴 등의 아미노산 유도체의 새로운 제조법에 관해서 예의 연구를 진행한 결과, 하이드록시이미노산을 미생물 및/또는 효소를 사용하여 환원시켜 아미노산 유도체를 생성하는 방법을 밝혀내고 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명은 하기 아미노산 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.
[1] 화학식 I의 하이드록시이미노산을, 이로부터 화학식 III의 아미노산 유도체의 생성 반응을 촉매하는 미생물 및/또는 효소와 접촉시켜 화학식 III의 아미노산 유도체를 생성하는 단계를 포함하는, 아미노산 유도체의 제조방법.
Figure 112007026453045-PCT00001
Figure 112007026453045-PCT00002
상기 화학식 I 및 화학식 III에서,
R1은 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 2 내지 6의 알킬 그룹, 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 6 내지 14의 아릴 그룹, 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 6 내지 10의 사이클로알킬 그룹, 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 7 내지 19의 아르알킬 그룹, 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 2 내지 10의 알콕시알킬 그룹, 또는 이들의 탄소 골격중에 헤테로원자를 포함하는 치환되거나 치환되지 않은 상기 그룹, 및 하기 화학식 II
Figure 112007026453045-PCT00003
(여기서, R4는 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 2 내지 6의 알킬 그룹, 치 환되거나 치환되지 않은 탄소수 6 내지 14의 아릴 그룹, 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 6 내지 10의 사이클로알킬 그룹, 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 7 내지 19의 아르알킬 그룹, 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 2 내지 10의 알콕시알킬 그룹, 또는 이들의 탄소 골격중에 헤테로원자를 포함하는 치환되거나 치환되지 않은 상기 그룹이고, X1 및 X2는 서로 독립적으로 하이드록실 그룹 또는 카르보닐 그룹이다)의 치환기 R3로부터 선택된 치환기이고,
R2는 탄소수 1 내지 3의 알킬 그룹 또는 수소원자이고,
n은 0 또는 1이다.
[2] 상기 항목 [1]에 있어서, n이 O이고, 생성되는 아미노산 유도체가 α-아미노산 유도체인 제조방법.
[3] 상기 항목 [1] 또는 [2]에 있어서, 생성되는 아미노산 유도체가 α-L-아미노산인 제조방법.
[4] 상기 항목 [1] 또는 [2]에 있어서, 생성되는 아미노산 유도체가 α-D-아미노산인 제조방법.
[5] 상기 항목 [1]에 있어서, n이 1이고, 생성되는 아미노산 유도체가 β-아미노산 유도체인 제조방법.
[6] 상기 항목 [1] 내지 [5] 중의 어느 한 항목에 있어서, 아릴 그룹이 치환되거나 치환되지 않은 페닐 그룹 또는 나프틸 그룹인, 제조방법.
[7] 상기 항목 [1] 내지 [5] 중의 어느 한 항목에 있어서, 아르알킬 그룹이 치환되거나 치환되지 않은 페닐알킬 그룹 또는 나프틸알킬 그룹인, 제조방법.
[8] 상기 항목 [1] 내지 [5] 중의 어느 한 항목에 있어서, 탄소 골격에 헤테로원자를 포함하는 그룹이, 치환되거나 치환되지 않은 피리딜 그룹 또는 인돌릴 그룹인, 제조방법.
[9] 화학식 IV의 IHOG-옥심을, 이로부터 화학식 V의 모나틴의 생성 반응을 촉매하는 미생물 및/또는 효소와 접촉시켜 화학식 V의 모나틴을 생성하는 단계를 포함하는, 모나틴의 제조방법.
Figure 112007026453045-PCT00004
Figure 112007026453045-PCT00005
[10] 화학식 VI의 BAE-옥심을, 이로부터 β-페닐알라닌의 생성 반응을 촉매하는 미생물 및/또는 효소와 접촉시켜 β-페닐알라닌을 생성하는 단계를 포함하는, β-페닐알라닌의 제조방법.
Figure 112007026453045-PCT00006
[11] 화학식 VII의 인돌-3-피루베이트-옥심을, 이로부터 트립토판의 생성 반응을 촉매하는 미생물 및/또는 효소와 접촉시켜 트립토판을 생성하는 단계를 포함하는, 트립토판의 제조방법.
Figure 112007026453045-PCT00007
[12] 상기 항목 [1] 내지 [11] 중의 어느 한 항목에 있어서, 미생물이 시트로박터(Citrobacter)속, 에세리키아(Escherichia)속, 및 로도코커스(Rhodococcus)속으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 한 속에 속하는 1종이상의 미생물인, 제조방법.
[13] 상기 항목 [1] 내지 [12] 중의 어느 한 항목에 있어서, 미생물이 시트로박터 푸룬디(Citrobacter freundii), 에세리키아 인터메디아(Escherichia intermedia), 에세리키아 콜리(Escherichia coli) 및 로도코커스 마리노나신즈(Rhodococcus marinonascens)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제조방법.
[14] 상기 항목 [1] 내지 [13] 중의 어느 한 항목에 있어서, 화학식 I의 화합물로부터 화학식 III의 화합물을 생성하기 위한 반응액 중에 NADH, NADPH, 피리 독살-5'-포스페이트 및 MgCl2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 첨가하는 제조방법.
발명의 효과
본 발명에 따라, 간편하고, 비용적으로도 유리한 아미노산의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 아미노산 유도체의 제조방법은, 소정의 미생물 및/또는 효소의 촉매 작용에 의해 상기 화학식 I의 하이드록시이미노산을 상기 화학식 III의 화합물로 전환시키는 것이다. 본 명세서에 있어서 아미노산 유도체에는, 아미노산 그 자체 및 이의 유도체를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 당해 반응을 촉매하는 능력을 가진 미생물로서는, 바람직하게는, 시트로박터(Citrobacter)속, 에세리키아(Escherichia)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 로도코커스(Rhodococcus)속, 살모네라(Salmonella)속, 및 에르위니아(Erwinia)속으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 한 속에 속하는 세균 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로 바람직한 미생물로서, 시트로박터 푸룬디, 시트로박터 인터메디어스, 에세리키아 인터메디아, 에세리키아 콜리, 코리네박테리움 에퀴(Corynebacterium equi), 로도코커스 마리노나신즈(Rhodococcus marinonascens), 살모넬라(Salmonella) 종, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 및 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) 등을 들 수 있다.
보다 구체적으로, 바람직한 미생물로서 다음의 균주가 예시된다. 균주명 및 이의 기탁 기관은 하기와 같다.
(1) 시트로박터 푸룬디 IFO 13546
(i) 기탁번호: IFO 13546
(ii) 기탁기관(주소): 독립행정법인 제품평가기술기반기구 바이오테크놀로지 본부 생물유전자원부문(우편 292-0818 니혼 치바켄 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8)
(2) 에세리키아 인터메디아 AJ 2607
(i) 기탁번호: FERM BP-10401(FERM P-20215로부터 이관)
(ii) 원기탁일: 2004년 9월 8일
(iii) 기탁기관(주소): 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(우편 305-8566 니혼 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반치 1 츄오 다이6)
(3) 에세리키아 콜리 ATCC 13070
(i) 기탁번호: ATCC 13070
(ii) 기탁기관(주소): 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, P.O.Box 1549 Manassas, VA 20110, USA)
(4) 에세리키아 콜리 ATCC 12814
(i) 기탁번호: ATCC 12814
(ii) 기탁기관(주소): 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, P.O.Box 1549 Manassas, VA 20110, USA)
(5) 로도코커스 마리노나신즈 AJ110354
(i) 기탁번호: FERM BP-10400(FERM P-20213로부터 이관)
(ii) 원기탁일: 2004년 9월 8일
(iii) 기탁기관(주소): 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(우편 305-8566 니혼 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반치 1 츄오 다이6)
본 발명에서 사용되는 효소는, 상기 미생물 등으로부터 분리·정제할 수 있다. 또한, 「미생물 및/또는 효소의 존재하에서」란, 화학식 I의 하이드록시이미노산을 화학식 III의 아미노산 유도체로 전환시키는 반응계에 미생물 및/또는 효소가 존재하도록 하는 조작을 의미한다. 「미생물 및/또는 효소」는, 본 발명의 목적하는 활성을 갖는 한, 이의 유래 및 제조방법 등에 특별히 제한은 없다. 미생물로서는, 전술한 본 발명의 반응을 촉매하는 미생물 이외에, 반응을 촉매하는 효소를 암호화하는 유전자(재조합 유전자를 포함한다)에 의해 형질 전환된 숙주 미생물, 또는 당해 숙주 미생물이 생산하는 효소를 사용할 수도 있다. 즉, 화학식 I의 하이드록시이미노산을 화학식 III의 아미노산 유도체로 전환시키는 한 미생물 및/또는 효소는 반응계에 임의의 형태로 존재할 수 있다. 또한, 미생물 또는 효소, 또는 둘다를 사용할 수 있다.
본 발명의 제조법에서 사용되는 「미생물 및/또는 효소」로서는 다음과 같은 형태를 취할 수 있다. 구체적 형태로서는, 상기 미생물의 배양물, 당해 배양물로부터 분리된 미생물 균체, 균체 처리물 등이 포함된다. 미생물의 배양물이란, 미생물을 배양하여 수득되는 것이고, 보다 구체적으로는, 미생물 균체, 당해 미생물 의 배양에 사용한 배지 및 배양된 미생물에 의해 생성된 물질을 포함하는 혼합물 등을 말한다. 또한, 미생물 균체는 세정하여 세정 균체로서 사용할 수 있다. 또한, 균체 처리물에는, 균체를 파쇄, 용균, 동결 건조시킨 것 등이 포함되고, 또한 균체 등을 처리하여 회수되는 조 효소(crude enzyme)를 포함할 수 있다. 또한, 균체 처리물에는 더욱 정제된 효소 등도 포함된다. 정제 처리된 효소로서는, 각종 정제법에 의해서 수득되는 부분 정제 효소, 및 이들을 공유 결합법, 흡착법, 포괄법 등에 의해서 고정화시킨 고정화 효소를 포함할 수 있다. 또한, 사용하는 미생물에 따라서는, 배양중에 일부 용균되는 것도 있기 때문에, 이 경우에는 배양 상등액도 상술한「미생물 및/또는 효소」로서 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조법에서 사용되는 「미생물 및/또는 효소」로서는, 상기 화학식 I의 하이드록시이미노산을 화학식 III의 아미노산 유도체로 전환시키는 효소를 발현하는 유전자 재조합주, 아세톤 처리 균체, 동결 건조 균체 등의 균체 처리물, 및 이들을 공유 결합법, 흡착법, 포괄법 등에 의해서 고정화된 고정화 균체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법에서는, 화학식 I의 하이드록시이미노산을 출발 물질로 하는 반응을 포함한다. 화학식 I에서의 R1의 특정 예는 하기의 그룹을 포함할 수 있다.
R1으로서 탄소수 2 내지 6의 알킬 그룹의 특정 예는 에틸 그룹, n-프로필 그룹, 이소프로필 그룹, n-부틸 그룹, 이소부틸 그룹, 2급-부틸 그룹, 3급-부틸 그 룹, n-펜틸 그룹, 이소펜틸 그룹, 네오펜틸 그룹, n-헥실 그룹 및 이소헥실 그룹 등을 포함할 수 있다.
또한, R1으로서 탄소수 6 내지 14의 아릴 그룹의 특정 예는 페닐 그룹, 톨릴 그룹, 크실릴 그룹, 비페닐 그룹, 나프틸 그룹, 안트릴 그룹 및 페난트릴 그룹 등을 포함할 수 있고, 적합한 것으로서는 페닐 그룹 및 나프틸 그룹 등을 들 수 있다.
R1으로서 탄소수 6 내지 10의 사이클로알킬 그룹의 특정 예는 사이클로헥실 그룹, 사이클로헵타닐 그룹, 사이클로옥타닐 그룹, 사이클로노나닐 그룹 및 사이클로데카닐 그룹 등을 포함할 수 있다.
R1으로서 탄소수 7 내지 19의 아르알킬 그룹의 특정 예는 벤질 그룹, 벤즈하이드릴 그룹, 펜에틸 그룹, 트리틸 그룹 등의 페닐알킬 그룹, 신나밀 그룹, 스티릴 그룹, 및 나프틸알킬 그룹 등을 포함할 수 있고, 적합한 것으로서는 페닐알킬 그룹, 나프틸알킬 그룹 등을 들 수 있다.
R1으로서 탄소수 2 내지 11의 알콕시알킬 그룹의 특정 예는 탄소수 1 내지 10의 알킬 그룹으로, 메톡시 그룹, 에톡시 그룹, 프로폭시 그룹, 이소프로폭시 그룹, 부톡시 그룹, 펜틸옥시 그룹, 페녹시 그룹, 헵톡시 그룹, 옥톡시 그룹, 노난옥시 그룹, 데칸옥시 그룹, 및 운데콕시 그룹으로부터 선택된 그룹이 치환된 것을 포함한다.
R1으로서 상기 그룹의 탄소 골격중에 헤테로원자를 포함하는 그룹의 한 형태 는 헤테로사이클 함유 탄화수소 그룹일 수 있다. 헤테로사이클 함유 탄화수소 그룹이란, 사이클릭 화합물의 환에 헤테로원자를 포함하는 사이클릭 탄화수소 그룹이다. 헤테로사이클 함유 탄화수소 그룹은 헤테로아릴 그룹일 수 있다. 헤테로사이클 함유 탄화수소 그룹은 방향족성의 유무에 의해 제한되지 않는다. 또한 헤테로사이클 함유 탄화수소 그룹은 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭일 수 있다. 헤테로사이클 함유 탄화수소 그룹의 특정 예는 푸릴 그룹, 티에닐 그룹, 피리딜 그룹, 피페리딜 그룹, 피페리디노 그룹, 모르폴리노 그룹, 인돌릴 그룹, 또는 이러한 헤테로사이클 그룹에 의해 치환된 알킬 그룹 등을 포함하고, 적합한 것으로서는 피리딜 그룹 및 인돌릴 그룹 등을 들 수 있다.
상기 R1는 또한 할로겐원자, 하이드록실 그룹, 탄소수 3개 이하의 알킬 그룹, 탄소수 3개 이하의 알콕시 그룹, 및 아미노 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환기 등에 의해 추가로 치환될 수 있다.
R2는 탄소수 1 내지 3의 알킬 그룹 또는 수소원자를 나타내며, 탄소수 1 내지 3의 알킬 그룹에는 에틸 그룹, 메틸 그룹, n 프로필 그룹, 이소프로필 그룹이 포함된다.
R4의 알킬 그룹, 아릴 그룹, 사이클로알킬 그룹, 아르알킬 그룹, 알콕시알킬 그룹, 이들의 탄소 골격중에 헤테로원자를 포함하는 그룹, 및 또한 이들이 가질 수 있는 치환기는 상기 R1의 경우와 동일하다.
화학식 I의 화합물은, 하이드록시이미노 그룹에 상응하는 CO 그룹을 CNOH 그 룹으로 전환시키는 각종 옥심화 반응 등에 의해서 수득된다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, 국제공개공보 제2003/056026호 팜플렛, 국제공개공보 제2004/018672호 팜플렛, 국제공개공보 제2003/059865호 팜플렛 등에 기재된 방법에 의해서 수득할 수 있다.
옥심화(하이드록시이미노화)의 방법은 중성 또는 알칼리성 조건하에서, 상응하는 케토 화합물과 하기 화학식 VIII의 아민 화합물 또는 이의 염을 반응시킴으로써 수행한다.
Figure 112007026453045-PCT00008
상기 화학식 VIII에서,
R5는 수소원자, 알킬 그룹, 아릴 그룹 또는 아르알킬 그룹이다.
여기에, R5가 알킬 그룹, 아릴 그룹 또는 아르알킬 그룹인 경우, R5는 탄소수 1 내지 3개의 알킬 그룹, 아릴 그룹 또는 아르알킬 그룹인 것이 바람직하고, 결정화의 관점에서 보다 바람직하게는, R5는 메틸 및 벤질 그룹으로부터 선택된다.
보다 간편하게는, 화학식 VIII에 있어서 R5가 수소원자인 하이드록실아민을 사용하여 옥심화 반응을 실시할 수 있다. 일례를 들면, 하이드록실아민 하이드로클로라이드를 중성 또는 약알칼리 조건하에서 케토 화합물 함유 용액에 첨가하고, 실온으로부터 약 10℃의 조건에서 0.5 내지 60시간 동안 교반함으로써, 옥심화할 수 있다. 옥심화 반응의 pH는 바람직하게는 6 내지 10, 보다 바람직하게는 pH 7 내지 9에서 실시할 수 있다. 케토 화합물의 옥심화 반응의 조건에는 특별한 제한은 없으며, 당업자라면 간단한 예비 검토에 의해서, 옥심화 반응 조건을 결정할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 화학식 I의 화합물은 상기 화학식 III의 화합물로 전환된다. 화학식 III에서 R1, 및 n 등의 정의는 상기 화학식 I와 동일하다.
화학식 I에 있어서, n이 O인 경우에는 화학식 III의 화합물로서 α-아미노산 유도체가 수득된다. 또한, n이 1인 경우에는, β-아미노산 유도체가 수득된다. 또한, 화학식 I의 화합물의 L- 또는 D- 화합물을 선택하여 화학식 III의 L- 또는 D-화합물을 생성할 수 있다. 또한 화학식 III의 화합물이 L- 및 D-화합물의 혼합물로서 수득되는 경우에는, 이들중 어느 하나를 혼합물로부터 분리 및 정제할 수 있다.
미생물 및/또는 효소를 사용하는 반응계의 조건은, 사용하는 미생물, 효소 및 출발 물질의 특정 유형 등에 따라 적절하게 조정할 수 있다. 미생물 및/또는 효소의 사용량은, 목적 하는 효과를 발휘하는 양(유효량)이고, 이의 유효량은 당업자라면 간단한 예비 실험에 의해 용이하게 결정할 수 있지만, 예를 들면 효소를 사용하는 경우에는, 약 O.01에서 100유니트(U)일 수 있고, 세정 균체를 사용하는 경우는 약 0.1 내지 500g/L일 수 있다. 반응 온도에 관해서는, 통상적으로 이용되는 효소가 활성인 범위내, 즉 바람직하게는 10 내지 50℃에서 이루어지지만, 보다 바람직하게는 20 내지 40℃, 더욱 바람직하게는 25 내지 37℃의 범위에서 이루어진 다. 효소 반응액의 pH 값에 관해서는, 통상적으로 2 내지 12, 바람직하게는 7 내지 11, 보다 바람직하게는 8 내지 9의 범위에서 조절된다.
또한, 본 발명의 제조방법의 바람직한 양태에서, 반응액 중에 NADH, NADPH, 피리독살-5'-포스페이트(이하, PLP라고도 기재한다), MgCl2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화합물중 하나 이상을 첨가할 수 있다. 이러한 첨가물을 가함으로써, 화학식 III의 아미노산 유도체의 생성량을 증가시킬 수 있다.
상기 4종의 첨가물의 배합은 미생물 등의 유형에 따라 적절하게 선택될 수 있고, 보다 바람직하게는 적어도 NADH, NADPH 및 PLP의 3종을 포함하는 배합일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 4종의 첨가물을 전부 포함하는 배합일 수 있다. 또한, 반응액 중에서의 각 첨가물의 바람직한 배합량은 다음과 같다. NADH에 관해서는, 바람직하게는 0.01 내지 200mM, 보다 바람직하게는 0.1 내지 50mM이다. NADPH에 관해서는, 바람직하게는 0.01 내지 200mM, 보다 바람직하게는 0.1 내지 50mM이다. MgCl2에 관해서는, 바람직하게는 0.01 내지 10mM, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1mM이다. PLP에 관해서는, 바람직하게는 0.01 내지 10mM, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1mM이다.
본 발명의 제조방법은, R1가 방향족환 또는 헤테로사이클 함유 그룹인 아미노산 유도체의 제조에 적합하고, 보다 바람직하게는 모나틴, 트립토판, 페닐알라닌 등의 제조에 적용된다. 모나틴의 제조의 경우, 화학식 I의 화합물은, IHOG-옥심이다. 트립토판의 제조의 경우, 화학식 I의 화합물은, IPA-옥심(인돌-3-피루베이트- 옥심)이다. 또한, 페닐알라닌의 제조의 경우, 화학식 I의 화합물은, BAE-옥심(3-하이드록시이미노-3-페닐-프로피온산 메틸 에스테르이다. 또한, BAE는 벤조일 아세테이트 에틸 에스테르의 약칭이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 참조로 상세하게 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 실시예에 있어서, 모나틴의 정량은 GL 사이언스사에 의해 제조된「Inertsi1 ODS-80A」(5㎛, 6×150mm)을 이용한 고속 액체 크로마토그래피에 의해 실시하였다. 분석 조건은 이하에 나타내는 바와 같다.
이동상: 12%(v/v) 아세토니트릴/0.05%(v/v) 트리플루오로아세트산 수용액;
유속: 1.5ml/분;
칼럼 온도: 30℃; 및
검출: UV 210nm.
본 분석 조건하에서, (2S,4S)-모나틴 및 (2R,4R)-모나틴은 12.1분의 체류 시간에, (2S,4R)-모나틴 및 (2R,4S)-모나틴은 9.7분의 체류 시간에 분별 정량이 가능하다.
또한, 필요에 따라서, 다이셀가가쿠고교에 의해 제조된 광학 분할 칼럼「CROWNPAK CR(+)」(4.6×150mm)을 이용한 고속 액체 크로마토그래피에 의한 분석도 실시하였다. 분석 조건은 이하에 나타내는 바와 같다.
이동상: 과염소산 수용액(pH 1.5)/10%(v/v) 메탄올;
유속: 0.5ml/분;
칼럼 온도: 30℃; 및
검출: UV 210nm.
본 분석 조건하에서, 모나틴 광학 이성체는 (2R,4S), (2R,4R), (2S,4R) 및 (2S,4S)의 순서로 42분, 57분, 64분, 및 125분의 체류 시간에서 분별 정량이 가능하다.
제조예 1
IHOG-옥심 2암모늄염(4-하이드록시-4-(3-인돌릴메틸)-2-하이드록시이미노글루타레이트 2암모늄염)의 제조
1.6중량% 수산화나트륨 수용액 917g에, 인돌-3-피루브산 73.8g(352mmol)을 가하고 용해시켰다. 반응 용액을 35℃로 하고, 30% 수산화나트륨 수용액을 사용하여 pH 값을 11.1로 유지하면서, 50% 피루브산 수용액 310.2g(1761mmol)을 2시간에 걸쳐 적가하였다. 또한 반응 혼합물을 4.5시간 동안 반응시켜, 4-하이드록시-4-(3-인돌릴메틸)-2-케토글루타르산을 함유하는 반응 용액을 수득하였다. 여기에 30% 수산화나트륨 수용액으로 pH 값을 7로 유지하면서, 40% 하이드록실아민염산염 수용액 367.2g(2114mmol)을 가하고, 5℃에서 17.5시간 동안 혼합물을 교반하였다. 농염산을 사용하여 반응액의 pH 값을 2로 하고, 유기물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 포화 식염수로 세척하고 농축시켜 잔사를 수득하였다. 28% 암 모니아수 60ml과 2-프로판올 1350ml로부터 재결정화하여, 4-하이드록시-4-(3-인돌릴메틸)-2-하이드록시이미노글루타레이트 잔사를 2암모늄염 43.4g(142mmol: 인돌-3-피루브산에 대해 수율 40%)을 결정으로서 수득하였다.
제조예 2
IHOG-옥심 2칼륨염(4-하이드록시-4-(3-인돌릴메틸)-2-하이드록시이미노글루타레이트 2칼륨염)의 제조
제조예 1에 따라서 제조한 4-하이드록시-4-(3-인돌릴메틸)-2-하이드록시이미노글루타레이트 2암모늄염 10g을 물 20ml에 용해시키고, 100ml의 양이온 교환 수지 DIAION PK228(칼륨형, 미쓰비시가가쿠 제조)를 충전한 칼럼에 통과시키고 화합물을 목적하는 바 대로 이온과 교환시킨 후, 용리액을 20g까지 농축시키고 4-하이드록시-4-(3-인돌릴메틸)-2-하이드록시이미노글루타레이트 2칼륨염 수용액을 수득하였다.
제조예 3
인돌피루베이트 옥심의 제조
인돌피루브산 4.06g(0.02mol) 및 85% 수산화칼륨 1.32g(0.02mol)을 물 50ml에 용해시키고, 여기에 하이드록실아민 하이드로클로라이드 1.53g(0.022mol)을 가하였다. 또한 85% 수산화칼륨 1.45g(0.022mol)을 추가로 가하고, 화합물을 실온하에서 하룻밤 교반하였다. 반응액에 염산을 가하여 pH 2로 조정하여, 석출된 결정 을 여과 취득하였다. 수득된 습결정을 건조시키고 인돌피루베이트 옥심 3.34g를 수득하였다. 인돌피루브산에 대한 수율은 76.5%이고, ESI-MS:219.1[M+H]+의 시그널이 수득되었다.
제조예 4
벤조일 아세트테이트 에틸 에스테르 옥심의 제조
벤조일 아세테이트 에틸 에스테르 3.84g(0.02mol)을 MeOH 50ml에 용해시키고, 여기에 하이드록실아민 하이드로클로라이드 1.53g(0.022mol)을 가하였다. 트리에틸아민 2.23g(0.022mol)을 가하고, 혼합물을 실온하에서 하룻밤 교반하였다. 반응액을 감압하에서 농축시키고, 잔사에 물을 가하여 석출된 결정을 여과 취득하였다. 건조시켜 벤조일 아세테이트 에틸 에스테르 옥심 3.27g를 수득하였다. 벤조일 아세테이트 에틸 에스테르에 대한 수율은 78.9%이고, ESI-MS:208.2[M+ H]+의 시그널이 수득되었다.
(분석 조건)
가드(Guard) 칼럼: Shodex IC YK-G[참조: 쇼와덴코 제조]
칼럼: Shodex IC YK-421[참조: 쇼와덴코 제조]
검출: 전기전도도 검출기
용리액: 4mM 인산+5mM 18-Crown-6
유속: 0.6ml/분
분석 온도: 40℃
실시예 1
IHOG-옥심 환원 활성균의 채취
4-하이드록시-4-(3-인돌릴메틸)-2-하이드록시이미노글루타르산(IHOG-옥심)을 기질로 하여 모나틴을 생성하는 IHOG-옥심 환원 활성 미생물 균주를 채취하였다.
부용(bouillon) 평판 배지[참조: 에이켄가가쿠 제조]에 공시 미생물(세균 또는 효모)을 접종하여, 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 수득된 배양물을 글리세롤 0.5g/dl,푸마르산 0.5g/dl, 효모 추출물 0.3g/dl, 펩톤 0.2g/dl, 황산암모늄 0.5g/dl, K2HPO4 0.3g/dl, KH2PO4 0.1g/dl, MgSO4·7H2O 0.05g/dl, IHOG-옥심·2암모늄염 0.2g/dl, 한천분말 2g/dl(pH 6.5)을 포함하는 플레이트에 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 수득된 균체를 습균체 중량으로 약 1%(w/v)이 되도록, 이하의 2종류의 반응액에 각각 접종하여, 30℃에서 24시간 동안 반응시켰다.
반응액 1: 100mM Tris-HCl(pH 8.0), 50mM IHOG-옥심·2암모늄염, 1mM MgCl2, 1mM 피리독살-5'-포스페이트(PLP), 20mM NADH, 20mM NADPH 및 1%(v/v) 톨루엔
TLC을 사용하여 생성된 모나틴의 정성 분석을 실시하였다. 반응액 1㎕을 TLC 플레이트 실리카 겔 60F254[참조: 머크사 제조]에 스폿(spot)하고, n-부탄올:아세트산:물=4:1:2로 혼합한 용액을 사용하여 전개한 후, 닌하이드린 발색을 실시하였다. 모나틴은 약 Rf=0.39의 위치에 핑크색의 스폿으로서 검출할 수 있다.
모나틴의 생성이 확인된 반응액을 HPLC 분석하여, 생성된 모나틴을 정량 분석하였다. 그 결과, 표 1에 기재한 균주에 있어서 모나틴의 생성이 확인되었고, 즉 IHOG-옥심으로부터 미생물 전환에 의해 모나틴을 생성시킬 수 있었다.
Figure 112007026453045-PCT00009
실시예 2
IHOG-옥심·2칼륨염을 기질로 한 모나틴의 생성
표 2에 기재한 균주를 사용하여, IHOG-옥심·2칼륨염을 기질로 한 전환 반응을 실시하였다. 균체의 제조방법은 실시예 1에 기재된 방법과 동일하게 실시하고, 반응액은 이하에 나타내는 반응액 2 및 반응액 3을 사용하였다. 30℃에서 24시간 동안 반응시킨 후에 HPLC로 생성 모나틴량을 정량하였다. 그 결과, 표 2에 기재한 바와 같이, IHOG-옥심·2칼륨염으로부터도 모나틴이 생성되는 것으로 확인되었다. 또한, 반응액 3과 4의 비교로부터, 반응액중에 NADH, NADPH, MgCl2, 피리독살-5'-포스페이트(PLP) 등을 첨가함으로써 생성 모나틴량이 증가되는 것으로 확인되었다.
반응액 2: 100mM 글라이신-NaOH(pH 9.0), 50mM IHOG-옥심·2칼륨염, 1mM MgCl2, 1mM 피리독살-5'-포스페이트(PLP), 25mM NADH, 25mM NADPH 및 1%(v/v) 톨루엔
반응액 3: 100mM 글라이신-NaOH(pH 9.0), 50mM IHOG-옥심·2칼륨염 및 1%(v/v) 톨루엔
Figure 112007026453045-PCT00010
실시예 3
PLP, MgCl2, NAD(P)H의 첨가 효과
시트로박터 푸룬디 IFO 13546 또는 에세리키아 인터메디아 AJ2607에 의한 IHOG-옥심 환원 반응에 있어서의 PLP, MgCl2 또는 NAD(P)H의 첨가 효과를 검토하였다.
표 3에 기재한 조성의 반응액(반응액 4 내지 9)을 각각 제조하여, 실시예 1에 나타내는 방법과 동일하게 IHOG-옥심 환원 반응을 실시하여, 생성된 모나틴을 정량하였다.
그 결과(표 4)는 각각의 균주에 있어서, PLP, MgCl2, 또는 NAD(P)H를 첨가함으로써 생성 모나틴량이 증가하였음을 보여준다.
또한, 반응액 4를 사용하여 생성된 모나틴에 관해서, 광학 분리 칼럼「CROWNPAK CR(+)」를 사용하여 광학이성체를 동정한 결과, 생성물이 (2S,4S)-모나틴인 것으로 밝혀졌다.
Figure 112007026453045-PCT00011
Figure 112007026453045-PCT00012
실시예 4
IPA-옥심(인돌-3-피루베이트-옥심)으로부터의 트립토판(Trp)의 생성
부용 평판 배지[참조: 에이켄가가쿠 제조]에 시트로박터 푸룬디 IFO 13546 또는 에세리키아 인터메디아 AJ 2607를 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이를 글리세롤 0.5g/dl, 푸마르산 0.5g/dl, 효모 추출물 0.3g/dl, 펩톤0.2g/dl, 황산암모늄 0.5g/dl, K2HPO4 0.3g/dl, KH2PO4 0.1g/dl, MgSO4·7H2O 0.05g/dl, IHOG-옥심·2암모늄염 0.2g/dl, 한천분말 2g/dl(pH 6.5)을 포함하는 플레이트에 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 수득된 균체를 습균체 중량으로 약 1%(w/v)이 되도록, 이하의 반응액 10에 접종하고, 반응 혼합물을 30℃에서 24시간 동안 반응시켰다.
반응액 10: 100mM 글라이신-NaOH(pH 9.0), 50mM IPA-옥심, 1mM MgCl2, 1mM 피리독살-5'-포스페이트(PLP), 25mM NADH, 25mM NADPH 및 1%(v/v) 톨루엔
TLC을 사용하여 생성된 트립토판의 정성 분석을 실시하였다. 반응액 1㎕을 TLC 플레이트 실리카 겔 60F254[참조: 머크사 제조]에 스폿하고, n-부탄올:아세트산:물=4:1:2로 혼합한 용액을 사용하여 전개한 후, 닌하이드린 발색을 실시하였다. 트립토판은 약 Rf=0.52의 위치에 보라색의 스폿으로서 검출할 수 있다.
트립토판의 생성이 확인된 반응액을 HPLC 분석하여, 생성 트립토판을 정량 분석하였다. 그 결과, 트립토판의 생성이 확인되었고, 즉 IPA-옥심으로부터 미생물 전환에 의해 트립토판을 생성시킬 수 있었다.
(분석 조건)
칼럼: Inertsil ODS-80A[참조: GL 사이언스 제조]
검출: UV 210nm
용리액: 12%(v/v) 아세토니트릴/0.05% 트리플루오로아세트산 수용액
유속: 1.5ml/분
분석 온도: 30℃
Figure 112007026453045-PCT00013
실시예 5
BAE-옥심으로부터 β-페닐알라닌(β-Phe)의 생성
시트로박터 푸룬디 IFO 13546 또는 에세리키아 인터메디아 AJ 2607를 공시 균주로 하여, 실시예 4와 동일하게 배양하여 수득된 균체를 습균체 중량으로 약1%(w/v)이 되도록, 이하의 반응액 11에 접종하여, 30℃에서 24시간 동안 반응시켰다.
반응액 11: 100mM 글라이신-NaOH(pH 9.0), 50mM BAE-옥심, 1mM MgCl2, 1mM 피리독살-5'-포스페이트(PLP), 25mM NADH, 25mM NADPH 및 1%(v/v) 톨루엔
TLC을 사용하여 생성물의 정성 분석을 실시하였다. 반응액 1㎕을 TLC 플레이트 실리카 겔 60F254[참조: 머크사 제조]에 스폿하고, n-부탄올:아세트산:물=4:1:2로 혼합한 용액을 사용하여 전개한 후, 닌하이드린 발색을 실시하였다. β-페닐알라닌에틸에스테르는 약 Rf=0.72의 위치에 황색의 스폿으로서, β-페닐알라닌은 약 Rf=0.51의 위치에 갈색의 스폿으로서, 각각 검출할 수 있다. 그 결과, 이들 반응액에 있어서는 β-페닐알라닌과 동일한 Rf 부근에 스폿의 생성을 확인하였다.
β-페닐알라닌 스폿의 생성이 확인된 반응액을 HPLC 분석으로 분석하였다. 그 결과, β-페닐알라닌의 생성이 확인되었고, 즉 BAE 옥심으로부터 미생물 전환에 의해 β-페닐알라닌을 생성시킬 수 있었다.
(분석 조건)
칼럼: Inertsil ODS-80A[참조: GL 사이언스 제조]
검출: UV 210nm
용리액: 12%(v/v) 아세토니트릴/0.05% 트리플루오로아세트산 수용액
유속: 1.5ml/분
분석 온도: 30℃
Figure 112007026453045-PCT00014
실시예 6
15N 표지된 IPA-옥심(15N 동위원소로 표지된 인돌-3-피루베이트 옥심)으로부터 트립토판(Trp)의 생성
실시예 4와 동일한 방법에 의해 에세리키아 인터메디아 AJ 2607를 배양하여 습균체를 수득하였다. 수득된 균체를 습균체 중량으로 약 1%(w/v)이 되도록, 이하의 반응액 12에 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 반응시켰다.
반응액 12: 100mM 글라이신-NaOH(pH 9.0), 50mM 15N 표지된 IPA-옥심, 1mM MgCl2, 1mM 피리독살-5'-포스페이트(PLP), 25mM NADH, 25mM NADPH 및 1%(v/v) 톨루엔
15N 표지된 IPA-옥심은 이하의 과정에 따라 제조하였다. 아르곤 기류하, 25℃에서 물 60ml에 인돌피루브산 1.413g(6.95mmol) 및 8N NaOH 0.913ml을 가하고 용해시켰다. 당해 용해액에 15NH2OH 하이드로클로라이드 0.5g(7.09mmol) 및 8N NaOH 0.913ml을 첨가하고, 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 1N 염산 4.9ml로 반응액의 pH를 3으로 조정하고 25℃에서 하룻밤 교반하였다. 석출 결정을 여과 분리하여 습결정 2.07g를 40℃에서 감압 건조시킴으로써, 15N 표지된 IPA-옥심 0.81g(3.58mmol 영역 순도 97.5%)을 수득하였다.
반응액을 LC-MS로 분석한 결과, 15N 표지된 부분에서 +206(15N 상당)의 피크가 검출되어, 옥심이 효소적으로 환원된 것으로 나타났다.
본 발명은 각종 아미노산 유도체의 생산에 있어서 유용하다.

Claims (14)

  1. 화학식 I의 하이드록시이미노산을, 이로부터 화학식 III의 아미노산 유도체의 생성 반응을 촉매하는 미생물 및/또는 효소와 접촉시켜 화학식 III의 아미노산 유도체를 생성하는 단계를 포함하는, 아미노산 유도체의 제조방법.
    화학식 I
    Figure 112007026453045-PCT00015
    화학식 III
    Figure 112007026453045-PCT00016
    상기 화학식 I 및 화학식 III에서,
    R1은 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 2 내지 6의 알킬 그룹, 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 6 내지 14의 아릴 그룹, 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 6 내지 10의 사이클로알킬 그룹, 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 7 내지 19의 아르알킬 그룹, 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 2 내지 10의 알콕시알킬 그룹, 또는 이들의 탄소 골격중에 헤테로원자를 포함하는 치환되거나 치환되지 않은 상기 그룹, 및 하기 화학식 II
    화학식 II
    Figure 112007026453045-PCT00017
    (여기서, R4는 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 2 내지 6의 알킬 그룹, 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 6 내지 14의 아릴 그룹, 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 6 내지 10의 사이클로알킬 그룹, 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 7 내지 19의 아르알킬 그룹, 치환되거나 치환되지 않은 탄소수 2 내지 10의 알콕시알킬 그룹, 또는 이들의 탄소 골격중에 헤테로원자를 포함하는 치환되거나 치환되지 않은 상기 그룹이고, X1 및 X2는 서로 독립적으로 하이드록실 그룹 또는 카르보닐 그룹이다)의 치환기 R3로부터 선택된 치환기이고,
    R2는 탄소수 1 내지 3의 알킬 그룹 또는 수소원자이고,
    n은 0 또는 1이다.
  2. 제1항에 있어서, n이 O이고, 생성되는 아미노산 유도체가 α-아미노산 유도체인 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 생성되는 아미노산 유도체가 α-L-아미노산인 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 생성되는 아미노산 유도체가 α-D-아미노산인 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, n이 1이고, 생성되는 아미노산 유도체가 β-아미노산 유도체인 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 아릴 그룹이 치환되거나 치환되지 않은 페닐 그룹 또는 나프틸 그룹인, 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 아르알킬 그룹이 치환되거나 치환되지 않은 페닐알킬 그룹 또는 나프틸알킬 그룹인, 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 탄소 골격에 헤테로원자를 포함하는 그룹이, 치환되거나 치환되지 않은 피리딜 그룹 또는 인돌릴 그룹인, 제조방법.
  9. 화학식 IV의 IHOG-옥심을, 이로부터 화학식 V의 모나틴의 생성 반응을 촉매하는 미생물 및/또는 효소와 접촉시켜 화학식 V의 모나틴을 생성하는 단계를 포함하는, 모나틴의 제조방법.
    화학식 IV
    Figure 112007026453045-PCT00018
    화학식 V
    Figure 112007026453045-PCT00019
  10. 화학식 VI의 BAE-옥심을, 이로부터 β-페닐알라닌의 생성 반응을 촉매하는 미생물 및/또는 효소와 접촉시켜 β-페닐알라닌을 생성하는 단계를 포함하는, β-페닐알라닌의 제조방법.
    화학식 VI
    Figure 112007026453045-PCT00020
  11. 화학식 VII의 인돌-3-피루베이트-옥심을, 이로부터 트립토판의 생성 반응을 촉매하는 미생물 및/또는 효소와 접촉시켜 트립토판을 생성하는 단계를 포함하는, 트립토판의 제조방법.
    화학식 VII
    Figure 112007026453045-PCT00021
  12. 제1항 또는 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 시트로박 터(Citrobacter)속, 에세리키아(Escherichia)속, 및 로도코커스(Rhodococcus)속으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 한 속에 속하는 1종 이상의 미생물인, 제조방법.
  13. 제1항 또는 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 시트로박터 푸룬디(Citrobacter freundii), 에세리키아 인터메디아(Escherichia intermedia), 에세리키아 콜리(Escherichia coli) 및 로도코커스 마리노나신즈(Rhodococcus marinonascens)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 제조방법.
  14. 제1항 또는 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 I의 화합물로부터 화학식 III의 화합물을 생성하기 위한 반응액 중에 NADH, NADPH, 피리독살-5'-포스페이트 및 MgCl2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 첨가하는, 제조방법.
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