KR20070011333A - 세균 검출 기구, 세균 검출 방법 및 세균 검출 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 피검 시료 중에 혼입하고 있는 세균을 간편한 조작으로 신속하면서 정확하게 판정할 수 있는 세균 검출 기구, 세균 검출 방법 및 세균 검출 키트를 제공한다. 본 발명에 관한 세균 검출 기구는, 대상으로 되는 세균이 속하는 종 또는 속에 특이적인 염기 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화된 마이크로어레이형의 기구이다. 피검 시료로부터 조제한 프로브와 상기 기판 표면에 고정화된 올리고뉴클레오티드와의 하이브리다이제이션의 성립의 유무에 의해, 피검 시료 중의 세균을 간편, 신속하면서 정확하게 검출·동정할 수 있다.
세균 검출 기구, 세균 검출 방법, 하이브리다이제이션, 맥아 알코올 음료
Description
본 발명은, 세균 검출 기구, 세균 검출 방법 및 세균 검출 키트에 관한 것으로서, 구체적으로는, 세균에 특이적인 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화된 세균 검출 기구와, 이것을 이용한 매우 정확하면서 조작성이 높은 세균 검출 방법 및 세균 검출 키트에 관한 것이다.
예를 들면, 맥아 알코올 음료 중에 유해한 미생물이 혼입한 경우, 탁함이나 풍미 열화 등이 발생하고, 품질 열화의 원인으로 된다. 더 구체적으로는, 예를 들면 맥주에서는, 락토바실루스속(Lactobacillus), 페디오코커스속(Pediococcus), 펙티네터스속(Pectinatus) 등이 대표적인 유해 세균이다. 그 중에서도 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실루스 린드네리(Lactobacillus lindneri)는 맥주 오염균으로서 유명하다. 이들 유해 세균을 검출하는 방법으로서, 현재 가장 일반적인 것은, 대상으로 되는 맥주를 멤브레인 필터로 여과 후, 적당한 배지 중에서 배양하고, 생육하는 콜로니를 검출하는 방법이다.
또한, 이 콜로니가 상기 유해 세균인지의 여부를 판정하는 방법으로서는, 콜 로니로부터 추출한 DNA를 주형으로 하여, 상기 유해 세균에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 행하고, PCR 산물이 얻어지는지의 여부를 전기 영동으로 판정하는 방법(예를 들면, 일본 공개 특허 공보 평7-289295호 공보(공개일:1995년 11월 7일) 참조)이 이용되고 있다. 그러나, 이 방법에서는, 균종마다 다수의 프라이머를 이용하여 PCR을 복수회 행할 필요가 있기 때문에, 조작이 매우 번잡하고, 신속성에 문제가 있다. 또한, 필요로 하는 시간을 단축하기 위해서 다수의 프라이머를 혼합하여 1개의 튜브로 증폭 반응을 행하는 것은 가능하지만, 사용할 수 있는 프라이머의 수에는 한계가 있고, 미량의 검체에 기초하여 정확한 판정을 행하는 것은 어렵다.
상기 문제점을 해결하기 위해서, 각각의 균종에 보편적으로 존재하고 있는 유전자의 종 특이적인 서열을 포함하는 부분이 증폭되도록 프라이머를 설계하고, 증폭 후에 종 특이적인 서열을 인식하는 제한 효소로 증폭 산물을 절단하고, 전기 영동으로 얻어지는 밴드 사이즈로부터 어느 균종의 유전자인지를 특정하는 방법이 이용되고 있다. 그러나, 반드시 대상으로 되는 모든 균종에 대하여 판별 가능한 제한 효소가 존재한다고는 할 수 없고, 또한, 얻어진 증폭 산물을 수종류의 제한 효소로 각각 절단하고, 전기 영동에 제공한다는 매우 번잡한 조작이 필요하고, 신속성, 간편성이라는 면에서는 문제가 있다.
또한, 상기한 바와 같은 문제점을 해결하기 위해서, 종 특이적인 서열을 프로브로서 이용하고, 피검체 중의 DNA 또는 RNA에 그 서열과 상보적인 서열이 존재하는지의 여부를 하이브리다이제이션에 의해 판정하는 방법도 행해지고 있다.
그러나, 상기 하이브리다이제이션에 의해 판정하는 방법에서도, 매우 근연에서 DNA의 상동성이 높은 균종에서는, 별도의 종과 잘못 하이브리다이즈하는 크로스 하이브리다이제이션이 빈번하게 일어난다고 하는 문제가 있고, 정확하게 균종을 동정하기가 어려워지는 경우도 발생한다.
특히, 전술한 대표적인 맥주 오염균인 락토바실루스속에 속하는 종에는 매우 근연의 것이 많기 때문에, 크로스 하이브리다이제이션이 빈번하게 발생하는 방법을 이용한 것에서는, 유해 세균을 검출·동정한다고 하는 목적을 달성할 수 없다.
본 발명은, 상기한 문제점을 감안하여 이루어진 것으로서, 그 목적은, 특정의 세균의 존재의 유무를 정확하게 판정하기 위해서 이용할 수 있는 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화된 세균 검출 기구와, 해당 세균 검출 기구를 이용하여 간편한 조작으로 신속하면서 정확하게 판정할 수 있는 세균 검출 방법 및 세균 검출 키트를 제공하는 데 있다.
<발명의 개시>
본 발명자들은, 상기한 과제를 해결하기 위해서 예의 검토한 결과, 맥아 알코올 음료의 대표적인 오염 세균인 16S 리보좀 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열에 있어서, 특정의 속 또는 특정의 종에 특이적인 서열을 발견하고, 이 염기 서열에 기초한 올리고뉴클레이오티드를 기판 표면에 고정화한 기구를 이용하여, 피검 시료에서 유래하는 핵산과의 하이브리다이제이션에 의해, 신속하면서 정확하게 목적의 세균을 검출·동정할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉 본 발명에 관한 세균 검출 기구는, 피검 시료 중의 세균을 검출·동정하기 위한 기구로서, 대상으로 되는 세균은 (1) 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis)에 속하는 세균, (2) 락토바실루스 린드네리(Lactobacillus lindneri)에 속하는 세균, (3) 페디오코커스속(Pediococcus)에 속하는 세균, (4) 메가스페라속(Megasphaera)에 속하는 세균, (5) 펙티네터스(Pectinatus)에 속하는 세균으로부터 선택되는 적어도 2종류 이상의 세균이고, 대상으로 되는 세균이 속하는 종 또는 속에 특이적인 염기 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있고, 당해 올리고뉴클레오티드와 피검 시료에서 유래하는 핵산과의 하이브리다이제이션에 의해 피검 시료 중의 세균을 검출·동정하는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명의 (1)∼(5)의 세균은, 예를 들면, 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis)는 서열 번호 7∼9, 및 71에 나타나는 염기 서열의 전부를 16S 리보솜 RNA 유전자 중에 포함하는 세균이다. 락토바실루스 린드네리(Lactobacillus lindneri)는 서열 번호 22∼24에 나타나는 염기 서열의 전부를 16S 리보솜 RNA 유전자 중에 포함하는 세균이다. 페디오코커스속(Pediococcus)에 속하는 세균은 서열 번호 36∼45에 나타나는 염기 서열 중 적어도 2개의 염기 서열을 16S 리보솜 RNA 유전자 중에 포함하는 세균이다. 메가스페라속(Megasphaera)에 속하는 세균은 서열 번호 50∼55에 나타나는 염기 서열 중 적어도 2개의 염기 서열을 16S 리보솜 RNA 유전자 중에 포함하는 세균이다. 펙티네터스(Pectinatus)에 속하는 세균은 서열 번호 56∼58에 나타나는 염기 서열 중 적어도 2개의 염기 서열을 16S 리보솜 RNA 유전자 중에 포함하는 세균이다.
또한, 본 발명에 따른 세균 검출 기구의 검출 대상 세균으로서는, (6) 락토바실루스속(Lactobacillus)에 속하는 세균, (7) 스트렙토코커스속(Streptococcus)에 속하는 세균, (8) 류코노스톡속(Leuconostoc)에 속하는 세균, (9) 자이모모나스속(Zymomonas)에 속하는 세균, (10) 락토바실루스 코리니포미스(Lactobacillus coryniformis)에 속하는 세균, (11) 락토바실루스 쿠바투스(Lactobacillus curvatus)에 속하는 세균, (12) 락토바실루스 델브룩키(Lactobacillus delbrueckii)에 속하는 세균, (13) 락토바실루스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)에 속하는 세균, (14) 락토바실루스 메일퍼멘턴스(Lactobacillus malefermentans)에 속하는 세균, (15) 락토바실루스 카제이(Lactobacillus casei) 그룹 (Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus zeae)에 속하는 세균, (16) 락토바실루스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus)에 속하는 세균, (17) 락토바실루스 부키네리(Lactobacillus buchneri)에 속하는 세균, (18) 엔테로코커스 두란스(Enterococcus durans)에 속하는 세균 및 (19) 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)에 속하는 세균이 포함되는 것이 바람직하다.
기판 표면에 고정화되는 올리고뉴클레오티드로서는, 이하에 나타내는 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하고, 본 발명에 관한 세균 검출 기구는, 이들 올리고뉴클레오티드의 적어도 1개 이상이 기판 표면에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하고 있다.
(A) 락토바실루스속(Lactobacillus)에 속하는 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동속에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 2에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 3에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 4에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 5에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 6에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
(B) 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호 7에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 8에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 9에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 71에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
(C) 락토바실루스 코리니포미스(Lactobacillus coryniformis)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호 10에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 11에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 12에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
(D) 락토바실루스 쿠바투스(Lactobacillus curvatus)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호 13에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 14에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
(E) 락토바실루스 델브룩키(Lactobacillus delbrueckii)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호 16에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 17에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 18에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
(F) 락토바실루스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호 19에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 20에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 21에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
(G) 락토바실루스 린드네리(Lactobacillus lindneri)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호 22에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 23에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 24에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
(H) 락토바실루스 메일퍼멘턴스(Lactobacillus malefermentans)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호 25에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 26에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 27에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
(I) 락토바실루스 카제이(Lactobacillus casei) 그룹 (Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus zeae)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 락토바실루스 카제이(Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei)에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호 28에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 29에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 및 락토바실루스 지에(Lactobacillus zeae, 단, 락토바실루스 카제이의 기준주를 포함함)에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호 30에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 31에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
(J) 락토바실루스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호 32에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 33에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
(K) 락토바실루스 부키네리(Lactobacillus buchneri)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호 34에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 35에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
(L) 페디오코커스속(Pediococcus)에 속하는 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동속에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호 36에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 37에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 38에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 39에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 40에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 41에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 42에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 43에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 44에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 45에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
(M) 스트렙토코커스속(Streptococcus)에 속하는 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동속에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호 46에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 47에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
(N) 류코노스톡속(Leuconostoc)에 속하는 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동속에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호 48에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 49에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
(O) 메가스페라속(Megasphaera)에 속하는 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동속에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호 50에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 51에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 52에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 53에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 54에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 55에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
(P) 펙티네터스속(Pectinatus)에 속하는 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동속에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호 56에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 57에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 58에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
(Q) 자이모모나스속(Zymomonas)에 속하는 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동속에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호 59에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 60에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
(R) 엔테로코커스 두란스(Enterococcus durans)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호 61에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 62에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
(S) 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드로서, 서열 번호 63에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 64에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
(T) 류코노스톡속(Leuconostoc)의 일부에 속하는 세균 및 락토바실루스속(Lactobacillus)의 일부에 속하는 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열에 공통하는 염기 서열 중, 서열 번호 72에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드.
상기 (A)∼(T)에 기재된 올리고뉴클레오티드를 기판 표면에 고정화한 세균 검출 기구를 이용함으로써, 식품 중의 오염균, 특히 맥아 알코올 음료 중의 오염균을 망라적으로 검출·동정하는 것이 가능하게 된다.
또한, 본 발명에 관한 세균 검출 기구는, 상기 기판 표면에 카르보디이미드기 또는 이소시아네이트기를 갖고, 당해 카르보디이미드기 또는 이소시아네이트기와 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 말단에 부가된 링커와의 반응에 의해 공유 결합이 형성되는 것이 바람직하다.
본 발명에 관한 세균 검출 방법은, 피검 시료 중의 세균을 검출·동정하기 위한 방법으로서, 피검 시료 중의 세균의 핵산을 조제하는 핵산 조제 공정과, 당해 핵산을 주형으로 하여 표지 프로브를 조제하는 프로브 조제 공정과, 상기 프로브를, 상기 본 발명에 관한 세포 검출 기구의 기판 표면에 고정화된 올리고뉴클레오티드와 하이브리다이즈시키는 하이브리다이제이션 공정과, 하이브리다이제이션 시그널을 검출하는 시그널 검출 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명에 관한 세균 검출 방법의 피검 시료로서는, 식품이 바람직하고, 그 중에서도 맥아 알코올 음료가 가장 적합하다.
본 발명에 관한 세균 검출 키트는, 상기 본 발명에 관한 세균 검출 방법을 실시하기 위한 키트로서, 상기 본 발명에 관한 세균 검출 기구가 포함된다. 또한, 하이브리다이제이션 공정, 시그널 검출 공정, 프로브 조제 공정, 핵산 조제 공정에서 이용하는 시약을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 목적, 특징, 및 우수한 점을, 이하에 나타내는 기재에 의해 충분히 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 이점은, 첨부 도면을 참조한 다음의 설명에서 명백해질 것이다.
도 1(a)는 실시예에서 사용한, 본 발명에 관한 세균 검출 기구의 기판 상에 고정화되어 있는 올리고뉴클레오티드의 배치를 나타낸 도면이다.
도 1(b)는 도 1(a)에 나타난 배치에 올리고뉴클레오티드가 고정화된 세균 검출 기구를 이용하여 Lactobacillus brevis를 검출한 결과를 나타내는 화상이다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
본 발명의 실시의 일 형태에 대하여 설명하면, 이하와 같다. 또한, 본 발명은, 이것에 한정되는 것은 아니다.
(1) 본 발명에 관한 세균 검출 기구
본 발명에 관한 세균 검출 기구는, 피검 시료 중의 세균을 검출·동정하기 위한 기구로서, 대상으로 되는 세균이 속하는 종 또는 속에 특이적인 염기 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있고, 당해 올리고뉴클레오티드와 피검 시료에서 유래하는 핵산과의 하이브리다이제이션에 의해 피검 시료 중의 세균을 검출·동정하는 것이다.
[기판]
본 발명에 관한 세균 검출 기구에 이용하는 기판의 재질로서는, 올리고뉴클레오티드를 안정되게 고정화할 수 있는 것이면 된다. 예를 들면, 폴리카보네이트나 플라스틱 등의 합성 수지, 유리 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다. 기판의 형태도 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 판상, 필름상 등의 기판을 바람직하게 이용할 수 있다.
[기판 표면에 고정화되는 올리고뉴클레오티드]
본 발명에 관한 세균 검출 기구의 기판 표면에 고정화되는 올리고뉴클레오티드는, 검출 대상 세균이 속하는 종 또는 속에 특이적인 염기 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드이면 된다. 당해 올리고뉴클레오티드와 피검 시료 유래의 핵산과의 사이에 하이브리다이제이션이 성립함으로써, 피검 시료 중에 포함되어 있는 목적의 종 또는 속에 속하는 세균을 검출하는 것이 가능하게 된다. 또한, 상기 검출 대상 세균이 속하는 종 또는 속에 특이적인 염기 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드를, 이하 적절하게 「캡처 올리고」라고 칭한다.
상기 특이적인 염기 서열은, 검출 대상 세균의 게놈의 염기 서열로부터 속 또는 종 특이적인 염기 서열을 발견하면 되는데, 검출 대상 세균의 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열로부터 발견하는 것이 바람직하다. 그 중에서도 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자는 속 또는 종 특이적인 염기 서열을 많이 갖고 있는 것이 알려져 있고, 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 DNA 서열 중으로부터 속 또는 종 특이적인 염기 서열을 발견하는 것이 특히 바람직하다. 리보솜 RNA 유전자의 염기 서열은, GenBank, EMBL, DDBJ 등의 데이터베이스 등으로부터 입수할 수 있다.
캡처 올리고는 상기 속 또는 종 특이적인 염기 서열에 기초하여 설계하면 된다. 따라서, 상기 속 또는 종 특이적인 염기 서열 그 자체이어도 되고, 검출 대상 세균으로부터 조제한 핵산과 특이적인 하이브리다이제이션이 성립하는 한에서, 변이가 포함되어 있어도 된다. 변이의 위치는 특별히 한정되는 것은 아니다.
캡처 올리고의 길이(염기 수)는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 지나치게 짧으면 하이브리다이제이션의 검출이 어려워지고, 지나치게 길면 비특이적 하이브리다이제이션을 허용한다. 발명자들은, 캡처 올리고의 길이의 최적화에 대하여 검토를 거듭하고, 표준적인 길이를 12∼24 염기로 하였다. 더 바람직하게는 13∼22 염기이다. 단, 이에 한정되는 것은 아니다. 염기 길이는 주로 서열 특성(특정의 염기의 함유율, 동일 염기의 리피트)에 의존하는 것으로서, 결합성이 좋은 것은 단쇄이어도 특이적 하이브리다이제이션이 가능한 것이, 발명자들에 의해 확인되었다.
캡처 올리고가, 피검 시료 유래의 핵산과의 하이브리다이제이션을 방해하는 헤어핀 구조, 루프 구조, 또는 그 이외의 입체 구조를 갖는 경우, 캡처 올리고를 구성하는 1 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 이노신 또는 어느 뉴클레오티드와도 접합하지 않는 핵산에 치환함으로써, 그 입체 구조를 해제할 수 있다.
캡처 올리고의 합성법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 공지의 방법(예를 들 면, Maniatis, T. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)에 기재된 방법 등)에 의해 합성하면 된다. 일반적으로는, 시판의 DNA 합성기를 이용하여 화학 합성할 수 있다.
본 발명에 관한 세균 검출 기구에 있어서, 상기 검출 대상 세균이 속하는 종 또는 속에 특이적인 염기 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드뿐만 아니라, 이들에 추가하여, 소위 컨트롤·캡처 올리고를 기판 표면에 고정화하는 것이 바람직하다. 컨트롤·캡처 올리고에는, 양성 컨트롤·캡처 올리고 및 음성 컨트롤·캡처 올리고가 포함된다. 양성 컨트롤·캡처 올리고는, 후술하는 프로브 조제 공정에 있어서 증폭 반응이 잘 이루어지고 있는지의 여부를 판정하기 위해서 이용하는 것이다. 음성 컨트롤·캡처 올리고는, 비특이적 하이브리다이제이션이 발생하고 있지 않은 점, 즉 의양성(疑陽性)의 하이브리다이제이션 시그널이 발생하고 있지 않은 점을 확인하기 위해서 이용하는 것이다. 이들 양성 컨트롤·캡처 올리고 및 음성 컨트롤·캡처 올리고가 기판 표면에 고정화된 세균 검출 기구도 본 발명에 포함된다.
양성 컨트롤·캡처 올리고는 검출 대상 세균으로부터 조제하는 프로브에 포함되는 염기 서열에 기초하여 설계되는 것이면 된다. 또한, 복수의 검출 대상 세균을 동시에 동일한 세균 검출 기구를 이용하여 검출하는 경우에는, 각 검출 대상 세균에 대하여 양성 컨트롤·캡처 올리고를 설계하여도 되지만, 복수의 검출 대상 세균으로부터 조제하는 프로브에 공통하는 염기 서열에 기초하여 설계하여도 된다. 모든 검출 대상 세균으로부터 조제하는 프로브에 공통하는 염기 서열이 없는 경우 에는, 몇 개의 그룹마다 양성 컨트롤·캡처 올리고를 설계하여도 된다. 혹은, 프라이머 서열 부분이 동일하고, 대상으로 되는 세균의 서열과는 서로 다른 인공적인 서열을 설계하고, 이 서열의 일부를 양성 컨트롤·캡처 올리고로 할 수도 있다. 상기 인공적인 서열을 주형으로 하여 프로브를 조제하고(본 명세서에서는, 이와 같은 프로브를 컨트롤 프로브라고 칭함), 피검 시료로부터 조제한 프로브에 첨가함으로써, 하이브리다이제이션의 특이성을 검증하는 것이 가능하게 된다. 또한, 상기 프로브에 대해서는 후술한다.
음성 컨트롤·캡처 올리고는, 양성 컨트롤·캡처 올리고의 염기 서열에 있어서, 1 염기 이상이고, 또한, 당해 서열이 갖는 염기 수의 20% 미만의 범위 내에서 인위적인 염기의 치환을 포함하는 염기 서열을 갖도록 설계하는 것이 바람직하다. 염기 치환을 행하는 염기 수는, 하이브리다이제이션의 조건과의 관계에서 결정되고, 검출 대상 세균 유래의 프로브가 하이브리다이제이션을 일으키지 않도록 하는 염기 수를 선택하면 된다.
검출 대상 세균은 특별히 한정되는 것은 아니며, 목적으로 하는 피검 시료 중으로부터 검출하려고 하는 세균을 적절히 선택하면 된다. 예를 들면, 식품 중에 혼입하여 당해 식품을 오염시킬 가능성이 있는 세균을 들 수 있다. 그 중에서도 맥아 알코올 음료에 혼입·오염시킬 가능성이 있는 세균을 검출 대상 세균으로 하는 것이 바람직하다. 식품 중에 유해한 세균이 혼입하는 것은, 공중 위생상 매우 큰 문제로 된다. 또한, 맥주나 발포주로 대표되는 맥아 알코올 음료에서는, 유해한 세균이 혼입한 경우, 탁함이나 풍미 열화 등의 품질 열화의 원인으로 되기 때문 에, 이들 유해 세균을 신속하면서 정확하게 검출·동정하는 방법의 개발이 특히 강하게 요망되어지고 있다.
맥아 알코올 음료를 오염시키는 세균으로서는, 락토바실루스속(Lactobacillus), 페디오코커스속(Pediococcus), 스트렙토코커스속(Streptococcus), 메가스페라속(Megasphaera) 및 펙티네터스(Pectinatus)에 속하는 세균을 들 수 있다. 또한, 락토바실루스속(Lactobacillus)에 속하는 세균 종으로서는, 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실루스 코리니포미스(Lactobacillus coryniformis), 락토바실루스 쿠바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실루스 델브룩키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실루스 린드네리(Lactobacillus lindneri), 락토바실루스 메일퍼멘턴스(Lactobacillus malefermentans), 락토바실루스 카제이(Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei), 락토바실루스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실루스 부키네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실루스 지에(Lactobacillus zeae, Lactobacillus casei의 기준주를 포함함)를 들 수 있다. 또한, 식품을 오염시키는 세균으로서, 상기 외에 류코노스톡속(Leuconostoc) 및 자이모모나스속(Zymomonas)에 속하는 세균, 및 엔테로코커스 두란스(Enterococcus durans) 및 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)를 들 수 있다. 단, 검출 대상 세균은 이들에 한정되는 것은 아니다.
상기 예시한 세균을 검출·동정하기 위한 캡처 올리고로서는, 락토바실루스속(Lactobacillus), 페디오코커스속(Pediococcus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus), 류코노스톡속(Leuconostoc), 메가스페라속(Megasphaera), 펙티네터스(Pectinatus) 및 자이모모나스속(Zymomonas)에 속하는 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 각 속에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드, 및 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실루스 코리니포미스(Lactobacillus coryniformis), 락토바실루스 쿠바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실루스 델브룩키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실루스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실루스 린드네리(Lactobacillus lindneri), 락토바실루스 메일퍼멘턴스(Lactobacillus malefermentans), 락토바실루스 카제이(Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei), 락토바실루스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실루스 부키네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실루스 지에(Lactobacillus zeae, Lactobacillus casei의 기준주를 포함함), 엔테로코커스 두란스(Enterococcus durans) 및 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 각 세균 종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다. 구체적으로는, 서열 번호 1∼64, 71 및 72에 나타난 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.
락토바실루스속(Lactobacillus)에 특이적인 염기 서열에 기초한 캡처 올리고(서열 번호 1∼6), 및 락토바실루스속(Lactobacillus)의 일부와 류코노스톡속(Leuconostoc)의 일부에 대응하는 염기 서열에 기초한 캡처 올리고(서열 번호 72)에 의해 검출 가능한 락토바실루스속 세균을 표 1에 예시하였다. 단, 서열 번 호 1∼6 및 72에 나타난 어느 하나의 염기 서열을 갖는 캡처 올리고에 의해 검출 가능한 세균은, 이들에 한정되는 것은 아니다.
| Lactobacillus acetotolerans | Lactobacillus kefiranofaciens |
| Lactobacillus acidifarinae | Lactobacillus kefiri |
| Lactobacillus acidipiscis | Lactobacillus kitasatonis |
| Lactobacillus acidophilus | Lactobacillus kunkeei |
| Lactobacillus agilis | Lactobacillus lindneri |
| Lactobacillus amylolyticus | Lactobacillus malefermentans |
| Lactobacillus amylovorus | Lactobacillus murinus |
| Lactobacillus animalis | Lactobacillus nagelii |
| Lactobacillus antri | Lactobacillus oris |
| Lactobacillus arizonensis | Lactobacillus panis |
| Lactobacillus brevis | Lactobacillus pantheris |
| Lactobacillus buchneri | Lactobacillus parabuchneri |
| Lactobacillus casei | Lactobacillus paracasei |
| Lactobacillus collinoides | Lactobacillus parakefiri |
| Lactobacillus coryniformis | Lactobacillus paraplantarum |
| Lactobacillus crispatus | Lactobacillus pentosus |
| Lactobacillus curvatus | Lactobacillus plantarum |
| Lactobacillus delbrueckii | Lactobacillus pontis |
| Lactobacillus diolivorans | Lactobacillus psittaci |
| Lactobacillus durianis | Lactobacillus reuteri |
| Lactobacillus ensenii | Lactobacillus rhamnosus |
| Lactobacillus equi | Lactobacillus ruminis |
| Lactobacillus ferintoshensis | Lactobacillus sakei |
| Lactobacillus fermentum | Lactobacillus salicinius |
| Lactobacillus fructivorans | Lactobacillus salivarius |
| Lactobacillus frumenti | Lactobacillus sanfranciscensis |
| Lactobacillus fuchuensis | Lactobacillus sharpeae |
| Lactobacillus gallinarum | Lactobacillus suebicus |
| Lactobacillus gasseri | Lactobacillus suntoryeus |
| Lactobacillus hamsteri | Lactobacillus tolerans |
| Lactobacillus helveticus | Lactobacillus ultunensis |
| Lactobacillus hilgardii | Lactobacillus vaccinostercus |
| Lactobacillus iners | Lactobacillus vaginalis |
| Lactobacillus intestinalis | Lactobacillus zeae |
| Lactobacillus johnsonii | Lactobacillus zymae |
| Lactobacillus kalixensis |
페디오코커스속(Pediococcus)에 특이적인 염기 서열에 기초한 캡처 올리고(서열 번호 36∼45)에 의해 검출 가능한 세균을 표 2에 예시하였다. 단, 서열 번호 36∼45에 나타난 어느 하나의 염기 서열을 갖는 캡처 올리고에 의해 검출 가능한 세균은, 이들에 한정되는 것은 아니다.
| Pediococcus acidilactici |
| Pediococcus pentosaceus |
| Pediococcus damnosus |
| Pediococcus inopinatus |
| Pediococcus parvulus |
| Pediococcus claussenii |
| Pediococcus dextrinicus |
| Pediococcus urinaeequi |
스트렙토코커스속(Streptococcus)에 특이적인 염기 서열에 기초한 캡처 올리고(서열 번호 46, 47)에 의해 검출 가능한 세균을 표 3에 예시하였다. 단, 서열 번호 46 또는 47에 나타난 염기 서열을 갖는 캡처 올리고에 의해 검출 가능한 세균은, 이들에 한정되는 것은 아니다.
| Streptococcus alactolyticus | Streptococcus anginosus |
| Streptococcus macedonicus | Streptococcus sinensis |
| Streptococcus bovis | Streptococcus downei |
| Streptococcus equinus | Streptococcus ferus |
| Streptococcus infantarius | Streptococcus oralis |
| Streptococcus lutetiensis | Streptococcus parasanguinis |
| Streptococcus gallolyticus | Streptococcus cristatus |
| Streptococcus acidominimus | Streptococcus gordonii |
| Streptococcus canis | Streptococcus infantis |
| Streptococcus dysgalactiae | Streptococcus mitis |
| Streptococcus equisimilis | Streptococcus pneumoniae |
| Streptococcus iniae | Streptococcus ovis |
| Streptococcus parauberis | Streptococcus peroris |
| Streptococcus porcinus | Streptococcus pluranimalium |
| Streptococcus pyogenes | Streptococcus ratti |
| Streptococcus urinalis | Streptococcus mutans |
| Streptococcus agalactiae | Streptococcus thoraltensis |
| Streptococcus criceti | Streptococcus entericus |
| Streptococcus didelphis | Streptococcus salivarius |
| Streptococcus zooepidemicus | Streptococcus thermophilus |
| Streptococcus equi | Streptococcus sobrinus |
| Streptococcus gallinaceus | Streptococcus australis |
| Streptococcus suis | Streptococcus macacae |
| Streptococcus hyointestinalis | Streptococcus orisratti |
| Streptococcus intermedius | Streptococcus phocae |
| Streptococcus constellatus | Streptococcus difficilis |
류코노스톡속(Leuconostoc)에 특이적인 염기 서열에 기초한 캡처 올리고(서열 번호 48, 49), 및 락토바실루스속(Lactobacillus)의 일부와 류코노스톡속(Leuconostoc)의 일부에 대응하는 염기 서열에 기초한 캡처 올리고(서열 번호 72)에 의해 검출 가능한 류코노스톡속 세균을 표 4에 예시하였다. 단, 서열 번호 48, 49 및 72에 나타난 어느 하나의 염기 서열을 갖는 캡처 올리고에 의해 검출 가능한 세균은, 이들에 한정되는 것은 아니다.
| Leuconostoc argentinum |
| Leuconostoc carnosum |
| Leuconostoc citreum |
| Leuconostoc cremoris |
| Leuconostoc dextranicum |
| Leuconostoc fallax |
| Leuconostoc ficulneum |
| Leuconostoc fructosum |
| Leuconostoc garlicum |
| Leuconostoc gasicomitatum |
| Leuconostoc gelidum |
| Leuconostoc inhae |
| Leuconostoc kimchii |
| Leuconostoc lactis |
| Leuconostoc mesenteroides |
| Leuconostoc pseudoficulneum |
| Leuconostoc pseudomesenteroides |
메가스페라속(Megasphaera)에 특이적인 염기 서열에 기초한 캡처 올리고(서열 번호 50∼55)에 의해 검출 가능한 세균으로서는, Megasphaera cerevisiae, Megasphaera elsdenii, Megasphaera micronuciformis를 들 수 있다. 단, 서열 번호 50∼55에 나타난 어느 하나의 염기 서열을 갖는 캡처 올리고에 의해 검출 가능한 세균은, 이들에 한정되는 것은 아니다.
펙티네터스속(Pectinatus)에 특이적인 염기 서열에 기초한 캡처 올리고(서열 번호 56∼58)에 의해 검출 가능한 세균으로서는, Pectinatus cerevisiiphilus, Pectinatus frisingensis를 들 수 있다. 단, 서열 번호 56∼58에 나타난 어느 하나의 염기 서열을 갖는 캡처 올리고에 의해 검출 가능한 세균은, 이들에 한정되는 것은 아니다.
자이모모나스속(Zymomonas)에 특이적인 염기 서열에 기초한 캡처 올리고(서열 번호 59, 60)에 의해 검출 가능한 세균으로서는, Zymomonas mobilis, Zymomonas pomaceae를 들 수 있다. 단, 서열 번호 59 또는 60에 나타난 어느 하나의 염기 서열을 갖는 캡처 올리고에 의해 검출 가능한 세균은, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 관한 세균 검출 기구의 기판 표면에 고정화되는 캡처 올리고는, 대상으로 하는 세균으로부터 조제된 프로브와 하이브리다이제이션이 성립하는 것이라면 특별히 한정되는 것은 아니다. 따라서, 상기 서열 번호 1∼64, 71 및 72에 나타난 어느 하나의 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로서는, 서열 번호 1∼64, 71 및 72에 나타난 어느 하나의 염기 서열만으로 이루어지는 것이어도 되고, 서열 번호 1∼64, 71 및 72에 나타난 어느 하나의 염기 서열 이외의 서열을 포함하는 것이어도 된다. 서열 번호 1∼64, 71 및 72에 나타난 어느 하나의 염기 서열 이외의 서열을 포함하는 캡처 올리고로서는, 서열 번호 1∼64, 71 및 72에 나타난 각 염기 서열의 5'측 혹은 3'측 또는 그 양쪽에 대하여, 각각의 16S 리보솜 RNA 유전자의 염기 서열에 기초하여 신장시킨 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 들 수 있고, 이와 같은 올리고뉴클레오티드를 기판 표면에 고정화된 세균 검출 기구도 본 발명에 포함된다.
1개의 기판 상에 고정화하는 캡처 올리고는, 적어도 1종류 이상이면 되고, 특별히 상한은 없다. 일반적으로, 시료 중에 혼입한 세균을 검출하는 경우에는, 피검 시료 중으로부터 검출 가능한 세균을 1개의 기판으로 망라적으로 검출할 수 있는 것이, 조작의 간편성 및 검사의 신속성의 관점으로부터 바람직하다고 할 수 있다. 따라서, 본 발명에 관한 세균 검출 기구도, 1개의 기판 상에 목적의 세균 종 또는 속에 대응하는 캡처 올리고를 복수개 고정한, 소위 마이크로 어레이형의 기구로 하는 것이 가장 바람직하다. 예를 들면, 맥아 알코올 음료를 피검 시료로 하는 경우에는, 락토바실루스속(Lactobacillus), 페디오코커스속(Pediococcus), 스트렙토코커스속(Streptococcus), 류코노스톡속(Leuconostoc), 메가스페라속(Megasphaera), 펙티네터스속(Pectinatus), 자이모모나스속(Zymomonas) 등에 속하는 세균에 대응한 캡처 올리고를 기판 표면에 고정화하는 것이 바람직하다.
[올리고뉴클레오티드(캡처 올리고)의 고정화]
올리고뉴클레오티드의 기판 표면으로의 고정화법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 공지의 방법을 적절히 선택하여 이용하면 된다. 예를 들면, 물리적 흡착, 전기적 결합 또는 분자 공유 결합 등의 일반적인 하이브리다이제이션법에 이용되는 수법이 이용 가능하다. 본 발명에 관한 세균 검출 기구에 있어서는, 표면에 카르보디이미드기 또는 이소시아네이트기를 갖는 기재를 사용하여(미국 특허:US5,908,746, 일본 공개 특허 공보 평8-23975호) 고정화하는 것이 바람직하다.
올리고뉴클레오티드를 스포팅할 때에, 올리고뉴클레오티드의 스폿량이 지나치게 적으면, 올리고뉴클레오티드와 프로브의 사이의 반응성을 충분하게 확보할 수 없고, 판정이 어려워지는 경우가 있다. 또한, 고집적도의 스포팅은 기술적인 문제와 동시에 비용이 들어가고, 또한 프로브의 형광 표지나 화학 발색 등을 이용한 하이브리다이제이션 시그널의 검출에도 더 정밀하고 고액의 검출 장치(예를 들면, 스캐너)가 필요하게 된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는, 기판의 표면에 직경 10∼1,000㎛의 사이즈로 고정하는 것이 바람직하다. 올리고뉴클레오티드의 기판 상으로의 스포팅 방법은 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 스포팅 머신을 사용하여 기판 상에 올리고뉴클레오티드 용액을 스포팅함으로써 행할 수 있다. 이에 의해 올리고뉴클레오티드 용액은, 통상 거의 원형으로 스포팅된다.
(2) 본 발명에 관한 세균 검출 방법
본 발명에 관한 세균 검출 방법은, 피검 시료 중의 세균의 핵산을 조제하는 핵산 조제 공정과, 해당 핵산을 주형으로 하여 표지 프로브를 조제하는 프로브 조제 공정과, 대상으로 되는 세균이 속하는 종 또는 속에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드와 상기 표지 프로브와의 하이브리다이제이션을 행하는 하이브리다이제이션 공정과, 하이브리다이제이션 시그널을 검출하는 시그널 검출 공정을 포함하는, 피검 시료 중의 세균을 검출·동정하기 위한 방법이다. 본 검출 방법의 하이브리다이제이션 공정에서는, 상기 본 발명에 관한 세균 검출 기구를 이용하는 것이 바람직하다. 당해 세균 검출 기구를 이용함으로써, 간편, 신속하면서 정확하게 망라적인 검출·동정을 행하는 것이 가능하게 된다. 또한, 본 검출 방법의 피검 시료로서는, 식품인 것이 바람직하고, 맥아 알코올 음료인 것이 특히 바람직하다. 이하 각 공정으로 나누어 상세하게 설명한다.
[핵산 조제 공정]
피검 시료 중의 세균의 핵산을 조제하는 공정이다. 피검 시료로부터의 핵산의 조제법은, 공지의 핵산의 조제법을 적절하게 선택하여 이용할 수 있다. 예를 들면, DNA의 조제는, R-F. Wang이 소개하는 방법에 따라서 추출할 수 있다(Molecular and Cellular Probes(2000) 14, 1-5). 이 방법은 표준적인 조제법이지만, 많은 대체법이 있고, 어느 것을 채택하여도 됨은 물론이다. 또한, 시판의 키트를 사용하여도 된다.
[프로브 조제 공정]
상기 핵산 조제 공정에서 조제한 핵산을 주형으로 하여 표지 프로브를 조제하는 공정이다. 프로브는, 예를 들면, 캡처 올리고 및 양성 컨트롤·캡처 올리고의 염기 서열을 포함하도록 설계된 프라이머를 사용하여 핵산 증폭에 의해 제작할 수 있다. 핵산 증폭의 방법으로서는, 예를 들면, PCR에 의해 DNA로서 증폭하는 방법, 혹은 인비트로·트랜스크립션(in vitro transcription)법에 의해 RNA로서 증폭하는 방법을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, PCR에 의해 표지 프로브를 조제하는 경우에는, PCR에 이용하는 프라이머는, 프로브가 캡처 올리고 및 양성 컨트롤·캡처 올리고와 상보적인 염기 서열을 포함하도록 설계된다. 또한, 하이브리다이제이션이 가능한 한에서, 프로브는 캡처 올리고 또는 양성 컨트롤·캡처 올리고보다 길거나 짧아도 된다. 표지 브로브를 얻기 위해서, PCR에 이용하는 프라이머를 미리 표지해 두는 것이 가능하다. 또한, PCR의 기질(디옥시뉴클레오시드삼인산)을 표지해 둠으로써 표지 프로브를 얻을 수도 있다. 혹은 PCR 종료 후에 프로브를 표지하여도 된다. 표지 물질은 특별히 한정되는 것이 아니라, 예를 들면, 형광 물질, 하프텐, 방사성 물질 등, 통상의 하이브리다이제이션에 이용하는 프로브와 마찬가지의 표지 물질을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 형광 물질로서는 플루오레세인(FITC), 로다민(Rodamine), 피코에리트린(PE), 텍사스 레드(Texas Red), 시아닌계 형광 색소 등이, 하프텐으로서는 비오틴(BIOTIN), 디곡시게닌(Dig), 디니트로페닐(DNP), 플루오레세인 등을 들 수 있다.
[하이브리다이제이션 공정]
하이브리다이제이션 공정은, 대상으로 되는 세균이 속하는 종 또는 속에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드와 상기 표지 프로브와의 하이브리다이제이션을 행하는 공정이다. 하이브리다이제이션은 상기 올리고뉴클레오티드를 고정화한 멤브레인 상 등에서 행할 수 있는데, 본 발명에 관한 세균 검출 기구를 이용하는 것이 바람직하다. 당해 세균 검출 기구를 이용함으로써, 간편, 신속하면서 정확하게 망라적인 검출·동정을 행하는 것이 가능하게 된다. 하이브리다이제이션 공정에 이용하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니고, 공지의 핵산 하이브리다이제이션 방법을 적절히 선택하여 이용할 수 있다. 이하에, 구체적인 하이브리다이제이션 방법의 일례를 나타낸다.
SSC(Standard Saline Citrate) 등의 염 용액, 황산도데실나트륨(SDS) 등의 계면 활성제, 소 혈청 알부민(BSA) 등의 블로킹 용액, 및 융합 반응 촉진을 위한 첨가제로 이루어진 융합액에, 표지 프로브를 첨가한다. 프로브가 이중 가닥인 경우에는 열 등에 의한 변성을 행한다. 기판 상에 표지 프로브액을 수 μL 첨가한 후, 수시간 가열 조작(통상 37∼50℃)을 행하고, 기판 상에 고정화되어 있는 올리고뉴클레오티드와 표지 프로브 사이에서 하이브리드를 형성시킨다. 그 후, 기판 상에 5×SSC 또는 3M 테트라메틸암모늄클로라이드를 첨가하여 가열하고(통상 37∼50℃), 특이적인 하이브리드를 형성하고 있지 않은 표지 프로브를 기판으로부터 박리시키고, 특이적인 하이브리드만을 선택적으로 기판 상에 남긴다.
[시그널 검출 공정]
시그널 검출 공정은, 상기 하이브리다이제이션 공정에 있어서 하이브리다이제이션의 성립의 유무를 판정하는 공정으로서, 통상 상기 하이브리다이제이션 공정과 연속적으로 행해진다.
하이브리드 검출 공정에서 이용하는 방법은, 상기 프로브 조제 공정에서 조제한 프로브에 도입된 표지 물질에 의존한다. 즉, 하이브리드의 검출에는, 프로브에 도입되어 있는 형광 물질, 하프텐 등의 표지 물질을 사용한다. 따라서, 이용한 프로브에 도입한 표지 물질을 검출하기 위한 공지의 방법을 적절하게 선택하여 사용하면 된다.
예를 들면, 하프텐을 사용하는 경우에는, 하프텐을 인식하는 단백 또는 이에 결합하는 단백과, 알칼리포스파타아제 또는 호스래디시 퍼옥시다아제 등의 결합체(효소 컨쥬게이트)를 포함하는 용액을 기판 상에 첨가하고, 실온에서 수10분간 반응시킨다. 또한, 이 하프텐과 효소 컨쥬게이트의 결합 반응을 행하기 전에, 올리고뉴클레오티드를 고정한 영역 이외의 기판의 영역을 카제인 등의 단백을 이용하여 완전하게 피복함으로써, 효소 컨쥬게이트와 기판의 비특이적 흡착 반응을 저지할 수 있다. 이는, 올리고뉴클레오티드를 고정한 후에 기판 상에 카제인 등의 단백의 용액을 첨가하고, 실온에서 수10분간 방치함으로써 행할 수 있다. 효소 컨쥬게이트와 프로브 중의 하프텐과의 결합 반응 종료 후, 하프텐과 결합하지 않은 효소 컨쥬게이트를, 계면 활성제를 포함하는 적당한 완충제로 세정하여 배제한다. 이에 의해, 기판 상에는 프로브 중의 하프텐과 결합한 효소 컨쥬게이트만이 남게 된다.
하이브리드의 시각화에는, 하프텐과 효소 컨쥬게이트 결합체만이 존재하는 경우에만 불용 화합물이 형성되도록 하는 화합물을 첨가한다. 그 불용성 화합물의 생성은, 효소 반응에 의해 증폭되어 가시화된다. 첨가되는 화합물로서, 효소 컨쥬게이트 중의 효소가 알칼리포스파타아제인 경우에는, 니트로블루테트라졸륨클로라이드(NBT)와 BCIP(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴인산-p톨루이딘염)가 이용되고, 효소가 호스래디시 퍼옥시다아제인 경우에는, TMB(3, 3', 5, 5'테트라메틸벤티딘) 등이 이용된다.
캡처 올리고를 고정화한 위치에서의 하이브리드의 색소 침착 또는 형광 발색 등의 하이브리다이제이션 시그널을 보는 것에 의해, 피검 시료 중에 포함되는 세균 종의 판정을 행한다. 즉, 하이브리다이제이션 시그널이 검출된 경우에는, 당해 시그널이 있는 위치에 스폿된 올리고뉴클레오티드에 대응하는 세균이, 피검 시료 중에 포함되어 있는 것을 의미한다. 또한, 양성 컨트롤·캡처 올리고의 위치에 시그널이 인정되면, 본 시험이 정상으로 기능하고 있음을 확인할 수 있고, 음성 컨트롤·캡처 올리고의 위치에 시그널이 인정되지 않으면, 하이브리다이제이션이 적당한 조건으로 행해진 것을 확인할 수 있다.
(3) 본 발명에 관한 세균 검출 키트
본 발명에 관한 세균 검출 키트는, 전술한 본 발명에 관한 세균 검출 방법을 실시하기 위한 키트이다. 따라서, 본 발명에 관한 세균 검출 방법을 실시할 수 있는 것이라면, 키트에 포함되는 구성은 특별히 한정되는 것은 아니다.
본 세균 검출 키트는, 본 발명에 관한 세균 검출 기구를 포함하는 것임이 바람직하다. 당해 세균 검출 기구를 포함하는 키트로 함으로써, 간편, 신속하면서 정확하게 망라적인 검출·동적을 행하는 것이 가능하게 된다. 또한, 본 세균 검출 키트에는, 상기 하이브리다이제이션 공정 및 시그널 검출 공정에서 사용하는 시약을 포함하는 것이 바람직하다. 하이브리다이제이션 공정에서 이용하는 시약으로서는, 예를 들면, SSC(Standard Saline Citrate) 등의 염 용액, 황산도데실나트륨(SDS) 등의 계면 활성제, 소 혈청 알부민(BSA) 등의 블로킹 용액, 융합 반응 촉진을 위한 첨가제 등을 들 수 있고, 시그널 검출 공정에서 사용하는 시약으로서는, 예를 들면, 하프텐을 인식하는 단백과 효소의 결합체(효소 컨쥬게이트)나, NBT, BCIP, TMB 등의 발색 기질 등을 들 수 있는데, 이에 한정되는 것은 아니고, 목적에 적합하도록 적의 적절한 시약을 선택하여 키트의 구성으로 하면 된다.
본 세균 검출 키트에는, 상기 프로브 조제 공정에서 사용하는 시약을 포함하는 것이 바람직하고, 또한, 상기 핵산 조제 공정에서 사용하는 시약을 포함하는 것이 바람직하다. 프로브 조제 공정에서 사용하는 시약으로서는, 예를 들면, PCR용 완충액, 내열성 DNA 합성 효소, 데옥시뉴클레오시드삼인산 혼합액 등을 들 수 있고, 핵산 조제 공정에서 사용하는 시약으로서는, 용균용 완충액, DNA 회수용 컬럼, DNA 추출용 완충액 등을 들 수 있다. 단 이에 한정되는 것은 아니고, 목적에 적합하도록 적의 적절한 시약을 선택하여 키트의 구성으로 하면 된다.
본 발명에 관한 키트(본 발명에 관한 세균 검출 기구 및 각 공정에 사용하는 시약을 포함하는 것)를 이용함으로써, 피검 시료 수령 후 약 6시간에서 피검 시료 중에 포함되는 세균의 검출·동정을 실시할 수 있다.
(4) 본 발명의 용도
본 발명에 관한 세균 검출 기구, 세균 검출 방법 및 세균 검출 키트의 용도는 특별히 한정되는 것은 아니고, 세균의 판정이 필요한 용도 모두에 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 세균에 의한 오염이 품질에 큰 영향을 미치는 각종 공업 제품의 제조 공정에서, 동 공업 제품이나 그 제조 환경 등으로부터 분리된 세균을 신속하면서 정확하게 검출·동정할 필요가 있는 경우에 바람직하게 이용된다.
판정의 대상으로 되는 피판정 세균의 유래로 되는 상기 공업 제품으로서는, 대표적인 것으로서, 식품, 음료, 의약품·시약·의약부 외품, 일회용 의료용 기구 등을 들 수 있는데, 특별히 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 상기 예시한 공업 제품 중에서의 식품에 응용하는 것이 바람직하다. 식품으로서는, 더 구체적으로는, 빵, 일본식과 서양식 과자(냉과 등도 포함함), 가공 식품, 유제품, 시리얼 식품, 두부·유부류, 면류, 도시락류, 조미료, 소맥분이나 식육 등의 농산 가공품, 영양 보조 식품(서플리먼트 등), 장기 보존 식품(통조림, 냉동 식품, 레토르트 식품 등) 등을 들 수 있는데, 특별히 한정되는 것은 아니다.
본 발명은, 상기 예시한 식품 중에서도, 특히 맥아 알코올 음료에 바람직하게 응용할 수 있다. 맥아 알코올 음료로서는, 맥주, 발포주 등을 들 수 있는데, 특별히 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
[올리고뉴클레오티드의 합성]
정법에 따라서, 올리고뉴클레오티드 합성기(Perkin-elmer Applied biosystems사 제조)를 이용하여 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 탈보호를 실시한 후 건조시켰다. 이 올리고뉴클레오티드 건조체를, 10mM Tris-HCl(pH 7.5)·1mM EDTA 완충액을 이용하여 용해하고, 100pmol/μL의 올리고뉴클레오티드 용액을 조제하였다. 본 실시예에 사용한 모든 올리고뉴클레오티드는 이 방법으로 합성하였다. 합성한 올리고뉴클레오티드의 염기 서열을 서열 번호 1∼72에 나타냈다. 이들 중, 서열 번호 1∼64, 71 및 72가 캡처 올리고이고, 서열 번호 65가 검출 대상 세균에 대한 양성 컨트롤·캡처 올리고이고, 서열 번호 66이 음성 컨트롤·캡처 올리고이고, 서열 번호 67∼68이 프라이머이고, 서열 번호 69가 컨트롤 프로브이고, 서열 번호 70이 컨트롤 프로브에 대한 양성 컨트롤·캡처 올리고이다. 캡처 올리고 뉴클레오티드에 대해서는 상기 합성기를 이용하여 5' 말단에 아미노기를 결합시키고, 프라이머는 5' 말단에 비오틴을 결합시켰다.
[기판으로의 캡처 올리고 뉴클레오티드의 스포팅]
5' 말단에 아미노기를 갖는 올리고뉴클레오티드 용액 10μL에 대하여 마이크로스포팅 용액(TeleChem International Inc. 제조)을 10μL 혼합하고, 마이크로타이터 플레이트(Greiner Laboratory Inc. 제조) 상에 분주하였다. 스포팅 머신의 소정의 위치에 카르보디이미드 수지 처리 슬라이드 글라스 Carbostation(닛세이보세키(주) 제조)을 배치하고, 스포팅 머신을 작동시켰다. 스포팅 종료 후, 슬라이드 글라스에 열수로부터의 증기를 수초 동안 쬐고, 그 후 자외선을 600mJ 조사하였다. 다시 증기에 수초간 폭로한 후, 핫 플레이트 상에 슬라이드 글라스를 놓고 수분을 제거하였다. 슬라이드 글라스를 3% BSA(소 혈청 알부민)를 포함하는 100mM Tris-HCl(pH 7.5)·100mM NaCl·0.1% Triton X-100에 실온에서 30분간 담그고, 블로킹하였다. 그 후, 10mM Tris-HCl(pH 7.5)·1mM EDTA 완충액으로 세정하였다. 슬라이드 글라스를 실온에서 건조시키고, 사용까지 건조 상태로 냉암소에서 보존하였다. 도 1(a)에, 본 실시예에서 실제로 사용한 세균 검출 기구의 기판 상에 고정화되어 있는 올리고뉴클레오티드의 배치를 나타냈다.
[핵산 조제 공정]
검체로서 이용한 세균은 락토바실루스속 14종, 페디오코커스속 5종, 스트렙토코커스속 1종, 류코노스톡속 1종, 메가스페라속 3종, 펙티네터스속 2종, 자이모모나스속 2종, 엔테로코커스속 1종, 락토코커스속 1종의 합계 30종류의 세균이다. 검체로서 이용한 세균을 표 5에 나타냈다.
| Lactobacillus속 Lactobacillus brevis Lactobacillus buchneri Lactobacillus lindneri Lactobacillus coryniformis Lactobacillus curvatus Lactobacillus plantarum Lactobacillus casei Lactobacillus fermentum Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus malefermentans Lactobacillus psittaci Lactobacillus sakei Lactobacillus zeae Lactobacillus rhamnosus | Streptococcus속 Streptococcus alactolyticus |
| Leuconostoc속 Leuconostoc mesenteroides | |
| Megasphaera속 Megasphaera cerevisiae Megasphaera elsdenii Megasphaera micronuciformis | |
| Pectinatus속 Pectinatus cerevisiiphilus Pectinatus frisingensis | |
| Pediococcus속 Pediococcus damnosus Pediococcus acidilactici Pediococcus claussenii Pediococcus dextrinicus Pediococcus urinaeequi | Zymomonas속 Zymomonas mobilis Zymomonas pomaceae |
| Enterococcus속 Enterococcus durans | |
| Lactococcus속 Lactococcus lactis |
이들 각 세균에 최적의 배양 조건에서 배양한 세균으로부터, Genomic DNA Purif. Kit(EdgeBioSystems 제조, Cat. No. #85171)를 이용하여 각 세균의 게놈 DNA를 각각 조제하였다.
[프로브 조제 공정]
얻어진 각 세균의 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 프로브 핵산을 조제하였다. PCR 반응액의 조성은, Taq 폴리메라아제:1unit, 비오틴화 프라이머(서열 번호 68 및 69):각 10pmol, 반응용 완충액(10×):5μL, dNTP:각 10nmol, 주형 DNA:100㎎에 멸균 증류수를 첨가하여 총량 50μL로 하였다. 서멀 사이클러를 이용하여, 95℃에서 3분간 유지한 후, 95℃:30초간, 55℃:15초간, 72℃:1분간의 반응을 30사이클 행하고, 72℃에서 5분간 유지하여 반응을 종료하였다.
또한, 프라이머 서열 부분이 동일하고 대상으로 되는 세균의 서열과는 서로 다른 인공적인 서열을 설계하고, 이것을 컨트롤 프로브로 하였다. 이것을 주형으로 하여 PCR을 행하고, 비오틴화 컨트롤 프로브를 조제하였다. PCR 반응액의 조성은, 주형 DNA를 Ing로 한 점을 제외하고 상기와 마찬가지이다. 또한, 반응 온도 및 사이클 수는 상기와 동일하다. 프로브의 정제는 행하지 않고, PCR 반응액을 그대로 프로브 용액으로서, 이하의 하이브리다이제이션 공정에서 사용하였다.
[하이브리다이제이션 공정 및 시그널 검출 공정]
상기 프로브 핵산 용액 3μL와, 비오틴화 컨트롤 프로브 용액 1μL와, ArrayIt Unihyb Hybridization Solution(TeleChem International Inc. 제조) 16μL를 첨가하여 혼합하고, 100℃에서 1분간 가열 처리를 행한 후, 얼음 중에 5분간 담갔다. 이 프로브 핵산 용액을 전량 취하여, 캡처 올리고 뉴클레오티드를 고정화한 기판에 얹고, 그 위에 커버 글라스를 얹었다. 이것을 보습 상자에 넣고, 37℃로 설정한 항온기 중에 120분간 정치하였다. 기판을 꺼내고, 빠르게 실온하에서 2×SSC 용액(2×SSC:0.033MNaCl, 0.033M 시트르산나트륨)에 담가서 커버 글라스를 제거하고, 37℃로 보습한 2×SSC 중에 5분간 담갔다.
기판을 2×SSC로부터 꺼내고, 원심기(Beckman사 제조)에 세팅하여, 2,000rmp으로 1분간 원심하였다. 다음으로 VECTASTAIN Elite ABC kit(VECTOR사 제조)를 이용하여 아비딘-비오틴화 퍼옥시다아제 복합체를 제작하여 기판 상에 1.4mL 적하하고, 실온에서 30분간 정치하였다. 그 후, PBS(10mM 인산나트륨(pH 7.5), 0.9% 염화나트륨) 중에서 세정하였다. TMB substrate kit for peroxidase(VECTOR사)를 이용하여 발색 용액을 제작하고, 기판 상에 1.4mL 적하하여 실온에서 30분간 정치하였다. 기반을 증류수로 세정하여 발색 반응을 멈췄다.
[판정]
EPSON사 제조의 스캐너 GT-8700F 및 그 투과형 유닛을 이용하여 하이브리다이제이션을 행한 영역을 600dpi로 스캔하고, 스캔 화상을 육안에 의해 발색의 유무를 확인하였다. 도 1(b)에 스캔 화상의 일례로서, Lactobacillus bervis의 스캔 화상을 나타냈다. 또한, 도 1(a)는 기판 상의 올리고뉴클레오티드의 서열을 나타내고 있다.
[결과]
검체로서 이용한 30종류의 각 세균에 대한 결과를 표 6∼표 36에 나타냈다. 각 표 모두 ○ 표시가 발색이 확인된 스폿을 나타내고, ― 표시가 발색이 확인되지 않은 스폿을 나타낸다. 표 6∼표 35로부터 분명히 알 수 있는 바와 같이 모든 경우, 컨트롤 프로브에서는 그에 대한 양성 컨트롤·캡처 올리고(서열 번호 70)에 발색이 보이고, 또한, 음성 컨트롤·캡처 올리고에서는 발색이 인정되지 않고, 증폭 및 하이브리다이제이션의 공정이 모두 정상으로 기능하고 있는 것이 확인되었다. 또한, 모든 세균에 대하여 양성 컨트롤·캡처 올리고(서열 번호 65)에서 발색이 확인되었다. 이 점으로부터 세균으로부터 정제한 핵산이 증폭되어 있는 것도 확인되었다. 또한, 이하의 결과의 설명에서는 양성 컨트롤·캡처 올리고(서열 번호 65 및 70)의 발색은 포함시키지 않는 것으로 한다.
표 6에는 Lactobacillus brevis의 결과를 나타냈다. Lactobacillus brevis는 1개소의 Lactobacillus속 검출용 캡처 올리고(서열 번호 1)와, 4개소의 Lactobacillus brevis 검출용 캡처 올리고(서열 번호 7, 8, 9, 71)의 합계 5개소에서만 발색이 확인되었다(도 1 참조). Lactobacillus curvatus(표 8)는, 1개소의 Lactobacillus속 검출용 캡처 올리고(서열 번호 5)와, 2개소의 Lactobacillus curvatus 검출용 캡처 올리고(서열 번호 13, 14)의 합계 3개소에서만 발색이 확인되었다. Lactobacillus coryniformis(표 7), Lactobacillus delbrueckii(표 9), Lactobacillus lindneri(표 11) 및 Lactobacillus malefermentans(표 12)는, 6개소의 Lactobacillus속 검출용 캡처 올리고(서열 번호 1∼6) 중 어느 1개소와, 각 세균에 대응하는 3개소의 종 특이적 캡처 올리고와의 합계 4개소에만 발색이 인정되었다.
Lactobacillus fermentum(표 10)은, 1개소의 Lactobacillus속 검출용 캡처 올리고(서열 번호 6)와, 1개소의 Leuconostoc속의 일부 및 Lactobacillus속의 일부 검출용 캡처 올리고(서열 번호 72)와, 3개소의 Lactobacillus fermentum 검출용 캡처 올리고(서열 번호 19∼21)의 합계 5개소에만 발색이 인정되었다. Lactobacillus casei(표 13)는, 2개소의 Lactobacillus속 검출용 캡처 올리고(서열 번호 3, 4)와, 2개소의 Lactobacillus casei 검출용 캡처 올리고(서열 번호 28, 29)의 합계 4개소에만 발색이 인정되었다. Lactobacillus rhamnosus(표 14)는, 2개소의 Lactobacillus속 검출용 캡처 올리고(서열 번호 3, 4)와, 2개소의 Lactobacillus rhamnosus 검출용 캡처 올리고(서열 번호 32, 33)의 합계 4개소에만 발색이 인정되었다. Lactobacillus buchneri(표 15)는, 1개소의 Lactobacillus속 검출용 캡처 올리고(서열 번호 1)와, 2개소의 Lactobacillus buchneri 검출용 캡처 올리고(서열 번호 34, 35)의 합계 3개소에만 발색이 인정되었다. Lactobacillus zeae(표 19)는, 2개소의 Lactobacillus속 검출용 캡처 올리고(서열 번호 3, 4)와, 2개소의 Lactobacillus zeae 검출용 캡처 올리고(서열 번호 30, 31)의 합계 4개소에만 발색이 인정되었다.
또한, 종 특이적 캡처 올리고가 설계되어 있지 않은 Lactobacillus plantarum(표 16) 및 Lactobacillus sakei(표 18)는, 6개소의 Lactobacillus속 검출용 캡처 올리고(서열 번호 1∼6) 중 어느 1개소에만 발색이 인정되었다.
Lactobacillus psittaci(표 17)는, 1개소의 Lactobacillus속 검출용 캡처 올리고(서열 번호 6)와 Leuconostoc속의 일부 및 Lactobacillus속의 일부 검출용 캡처 올리고(서열 번호 72)의 합계 2개소에만 발색이 인정되었다.
Pediococcus damnosus(표 20), Pediococcus acidilactici(표 21), Pediococcus claussenii(표 22), Pediococcus dextrinicus(표 23) 및 Pediococcus urinaeequi(표 24)는 10개소의 Pediococcus속 검출용 캡처 올리고(서열 번호 36∼45) 중 어느 하나의 2개소에만 발색이 인정되었다.
Streptococcus alactolyticus(표 25)는 2개소의 Streptococcus속 검출용 캡처 올리고(서열 번호 46, 47)에만 발색이 인정되었다.
Leuconostoc mesenteroides(표 26)는 2개소의 Leuconostoc속 검출용 캡처 올리고(서열 번호 48, 49)와, 1개소의 Leuconostoc속의 일부 및 Lactobacillus속의 일부 검출용 캡처 올리고(서열 번호 72)의 합계 3개소에만 발색이 인정되었다.
Megasphaera cerecisiae(표 27), Megasphaera elsdenii(도 28), Megasphaera micronuciformis(표 29)는 6개소의 Megasphaera속 검출용 캡처 올리고(서열 번호 50∼55) 중 어느 2개소에만 발색이 인정되었다.
Pectinatus cerevisiiphilus(표 30) 및 Pectinatus frisingensis(표 31)는 3개소의 Pectinatus속 검출용 캡처 올리고(서열 번호 56∼58) 중 어느 2개소에만 발색이 인정되었다.
Zymomonas mobilis(표 32) 및 Zymomonas pomaceae(표 33)는 2개소의 Zymomonas속 검출용 캡처 올리고(서열 번호 59, 60)에만 발색이 인정되었다.
Enterococcus durans(표 34)는 2개소의 Enterococcus durans 검출용 캡처 올리고(서열 번호 61, 62)에만 발색이 인정되었다.
Lactococcus lactis(표 35)는 2개소의 Lactococcus lactis 검출용 캡처 올리고(서열 번호 63, 64)에만 발색이 인정되었다.
이상의 결과는, 검체로서 이용한 각 세균에 있어서, 각 세균에 특이적인 캡처 올리고를 고정화한 스폿에서만 발색이 인정되고, 비특이적인 발색은 전혀 인정되지 않은 것을 나타내는 것이다. 따라서, 본 실시예에서 제작한 세균 검출 기구는, Lactobacillus속, Pediococcus속, Streptococcus속, Leuconostoc속, Megasphaera속, Pectinatus속, Zymomonas속을 특이적으로 검출할 수 있고, 또한, Lactobacillus brevis, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus malefermentans, Lactobacillus casei(Lactobacillus paracasei를 포함함), Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus zeae(Lactobacillus casei의 기준주를 포함함), Enterococcus durans 및 Lactococcus lactis를 종 특이적으로 검출할 수 있는 세균 검출 기구인 것이 확인되었다.
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ○ | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ○ | 8 ○ | 9 ○ | 71 ○ |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ○ | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ○ | 11 ○ | 12 ○ | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ○ | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ○ | 14 ○ | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ○ | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ○ | 17 ○ | 18 ○ | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ○ | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ○ | 20 ○ | 21 ○ | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ○ | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ○ | 23 ○ | 24 ○ | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ○ | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ○ | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ○ | 26 ○ | 27 ○ | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ○ | |
| 4 ○ | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ○ | 29 ○ | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ○ | |
| 4 ○ | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ○ | 33 ○ | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ○ | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ○ | 35 ○ | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ○ | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ○ | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ○ | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ○ | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ○ | |
| 4 ○ | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ○ | 31 ○ |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ○ | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ○ | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ○ | |
| 4 ○ | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ○ | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ○ | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ○ | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ○ | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ○ | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ○ | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ○ | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ○ | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ○ | 47 ○ | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ○ | 49 ○ | 72 ○ | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ○ | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ○ | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ○ | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ○ | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ○ | |
| 53 ― | 54 ○ | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ○ | 57 ○ | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ○ | 57 ― | 58 ○ | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ○ | 60 ○ | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ○ | 60 ○ | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ○ | 62 ○ | ||
| Lactococcus lactis | 63 ― | 64 ― | ||
| 검출 대조 세균명 | 서열번호/○시그널 유, ―시그널 무 | |||
| 양성 컨트롤 | 65 ○ | 70 ○ | ||
| 음성 컨트롤 | 66 ― | |||
| Lactobacillus속 | 1 ― | 2 ― | 3 ― | |
| 4 ― | 5 ― | 6 ― | ||
| Lactobacillus brevis | 7 ― | 8 ― | 9 ― | 71 ― |
| Lactobacillus coryniformis | 10 ― | 11 ― | 12 ― | |
| Lactobacillus curvatus | 13 ― | 14 ― | ||
| Lactobacillus delbrueckii | 16 ― | 17 ― | 18 ― | |
| Lactobacillus fermentum | 19 ― | 20 ― | 21 ― | |
| Lactobacillus lindneri | 22 ― | 23 ― | 24 ― | |
| Lactobacillus malefermentans | 25 ― | 26 ― | 27 ― | |
| Lactobacillus casei, Lactobacillus zeae | 28 ― | 29 ― | 30 ― | 31 ― |
| Lactobacillus rhamnosus | 32 ― | 33 ― | ||
| Lactobacillus buchneri | 34 ― | 35 ― | ||
| Pediococcus속 | 36 ― | 37 ― | 38 ― | |
| 39 ― | 40 ― | 41 ― | ||
| 42 ― | 43 ― | 44 ― | 45 ― | |
| Streptococcus속 | 46 ― | 47 ― | ||
| Leuconostoc속 및 Lactobacillus속의 일부 | 48 ― | 49 ― | 72 ― | |
| Megasphaera속 | 50 ― | 51 ― | 52 ― | |
| 53 ― | 54 ― | 55 ― | ||
| Pectinatus속 | 56 ― | 57 ― | 58 ― | |
| Zymomonas속 | 59 ― | 60 ― | ||
| Enterococcus durans | 61 ― | 62 ― | ||
| Lactococcus lactis | 63 ○ | 64 ○ | ||
또한, 발명을 실시하기 위한 최선의 형태의 항에서 행한 구체적인 실시 양태 또는 실시예는, 어디까지나, 본 발명의 기술 내용을 분명하게 하는 것으로서, 그와 같은 구체예에만 한정하여 협의로 해석되는 것이 아니라, 본 발명의 정신과 다음에 기재하는 청구의 범위 내에서, 다양하게 변경하여 실시할 수 있는 것이다.
본 발명에 관한 세균 검출 기구는, 대상으로 되는 세균이 속하는 종 또는 속에 특이적인 염기 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있고, 해당 올리고뉴클레오티드와 피검 시료에서 유래하는 핵산과의 하이브리다이제 이션에 의해, 피검 시료 중의 세균을 검출·동정하는 것이 가능하게 된다. 그 때문에, 본 발명에 따르면, 정확하면서 간편하게 세균의 검출·동정을 행할 수 있다고 하는 효과를 갖는다.
또한, 기판 표면에 복수의 세균 종 또는 속에 특이적인 염기 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드를 고정화해 두면, 망라적인 검사를 행할 수 있다고 하는 효과를 갖는다.
또한, 본 발명에 관한 세균 검출 키트는, 상기 세균 검사 기구 및 필요한 시약을 포함하는 것이기 때문에, 조작성이 향상하고, 한층 간편하게 세균의 검출·동정을 행할 수 있다고 하는 효과를 갖는다.
본 발명은, 식품 제조업, 음식 산업, 약품 산업 등에서의 위생 관리, 공정 관리, 품질 관리에 이용하는 것이 가능하다.
<110> Suntory Limited
Nisshinbo Industries Inc.
<120> Bacteria detecting instrument, bacteria detecting method, and
bacteria detecting kit
<130> IPA9608-592
<150> JP 2004-050523
<151> 2004-02-25
<160> 72
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 13
<212> DNA
<213> Lactobacillus sp.
<400> 1
gcgaactggt gag 13
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> Lactobacillus sp.
<400> 2
aaggcaatga tgcgta 16
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> Lactobacillus sp.
<400> 3
aactgagagg ttgatc 16
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Lactococcus sp.
<400> 4
ccttaagtgg gggataa 17
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> Lactobacillus sp.
<400> 5
atagtaactg atcagg 16
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> Lactobacillus sp.
<400> 6
aggcgatgat gcat 14
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> Lactobacillus brevis
<400> 7
tgaaaggtgg cttcgg 16
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> Lactobacillus brevis
<400> 8
taactgttca agggtt 16
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Lactobacillus brevis
<400> 9
taaagaagaa cacctttg 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Lactobacillus coryniformis
<400> 10
cgaagctgct tgcagtggac 20
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> Lactobacillus coryniformis
<400> 11
aacggcttac caaga 15
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> Lactobacillus coryniformis
<400> 12
gcactgacgt cgaccga 17
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Lactobacillus curvatus
<400> 13
cactctcgtt agattgaaga a 21
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> Lactobacillus curvatus
<400> 14
ctgattgata acatttg 17
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> Lactobacillus curvatus
<400> 15
gaacgtattt gatagt 16
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> Lactobacillus delbrueckii
<400> 16
atctgcccta aagact 16
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> Lactobacillus delbrueckii
<400> 17
actttaggat gagcccg 17
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> Lactobacillus delbrueckii
<400> 18
cgagctgaat tcaaag 16
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> Lactobacillus fermentum
<400> 19
ttcgcatgaa caacgc 16
<210> 20
<211> 14
<212> DNA
<213> Lactobacillus fermentum
<400> 20
ctcgctatca cttc 14
<210> 21
<211> 15
<212> DNA
<213> Lactobacillus fermentum
<400> 21
ttctggatgg acctg 15
<210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> Lactobacillus lindneri
<400> 22
agagcaactg ctcacgg 17
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> Lactobacillus lindneri
<400> 23
gcttgacgat agatctg 17
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> Lactobacillus lindneri
<400> 24
gcttttatgc tatcgct 17
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> Lactobacillus malefermentans
<400> 25
catcccgttg atttgaagt 19
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Lactobacillus malefermentans
<400> 26
actgataatt aacatcggat 20
<210> 27
<211> 14
<212> DNA
<213> Lactobacillus malefermentans
<400> 27
ttggatagac ccgc 14
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> Lactobacillus casei
<400> 28
cgagattcaa catggaa 17
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> Lactobacillus casei
<400> 29
agttctcgtt gatgatcggt g 21
<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213> Lactobacillus casei
<400> 30
gagattcgac ttaaaa 16
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> Lactobacillus casei
<400> 31
ttttggtcga tgaacgg 17
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> Lactobacillus rhamnosus
<400> 32
gttctgatta ttgaaaggt 19
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Lactobacillus rhamnosus
<400> 33
atcttgattt aattttgaac 20
<210> 34
<211> 17
<212> DNA
<213> Lactobacillus buchneri
<400> 34
cgcgtctccg ttaatga 17
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Lactobacillus buchneri
<400> 35
aaagatttaa cattgagacg 20
<210> 36
<211> 16
<212> DNA
<213> Pediococcus sp.
<400> 36
tttagggtcg taaaac 16
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> Pediococcus sp.
<400> 37
accgtataac agagaaaacc g 21
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> Pediococcus sp.
<400> 38
tatttggtag taactggc 18
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> Pediococcus sp.
<400> 39
gcatggaagg agattgaaag a 21
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Pediococcus sp.
<400> 40
ttccgttaaa agaatcagaa 20
<210> 41
<211> 16
<212> DNA
<213> Pediococcus sp.
<400> 41
ctgctcatgc agtgac 16
<210> 42
<211> 17
<212> DNA
<213> Pediococcus sp.
<400> 42
gagattttaa cacgaag 17
<210> 43
<211> 15
<212> DNA
<213> Pediococcus sp.
<400> 43
ttgcacggaa gatga 15
<210> 44
<211> 17
<212> DNA
<213> Pediococcus sp.
<400> 44
agtcttgacg gtatctt 17
<210> 45
<211> 17
<212> DNA
<213> Pediococcus sp.
<400> 45
gtgcttgcac caactga 17
<210> 46
<211> 16
<212> DNA
<213> Streptococcus sp.
<400> 46
atggacctgc gttgta 16
<210> 47
<211> 15
<212> DNA
<213> Streptococcus sp.
<400> 47
acgcgtaggt aacct 15
<210> 48
<211> 13
<212> DNA
<213> Leuconostoc sp.
<400> 48
gtgtgatgaa ggc 13
<210> 49
<211> 16
<212> DNA
<213> Leuconostoc sp.
<400> 49
cggtaccata ccagaa 16
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> Megasphaera sp.
<400> 50
aaaagatggc cactgaat 18
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> Megasphaera sp.
<400> 51
ggaggctctt cggagctt 18
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> Megasphaera sp.
<400> 52
ccgaaagtcg catgactgg 19
<210> 53
<211> 17
<212> DNA
<213> Megasphaera sp.
<400> 53
tggtcaatac ccatacg 17
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> Megasphaera sp.
<400> 54
tacccataag aagtgacgg 19
<210> 55
<211> 16
<212> DNA
<213> Megasphaera sp.
<400> 55
cctgcccttc agatgg 16
<210> 56
<211> 16
<212> DNA
<213> Pectinatus sp.
<400> 56
tgacggtacc ctgtta 16
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Pectinatus sp.
<400> 57
gtagtgttaa taccactatt 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Pectinatus sp.
<400> 58
ctatagccaa taagtatagt 20
<210> 59
<211> 17
<212> DNA
<213> Zymomonas sp.
<400> 59
gaataactag gggaaac 17
<210> 60
<211> 17
<212> DNA
<213> Zymomonas sp.
<400> 60
gagctaatac cgtatga 17
<210> 61
<211> 18
<212> DNA
<213> Enterococcus durans
<400> 61
aaagaaaagg agtggcga 18
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> Enterococcus durans
<400> 62
acgctttttc tttcaccgg 19
<210> 63
<211> 18
<212> DNA
<213> Lactococcus lactis
<400> 63
aaggttggta cttgtacc 18
<210> 64
<211> 18
<212> DNA
<213> Lactococcus lactis
<400> 64
actggatgag cagcgaac 18
<210> 65
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificially Synthesized Positive Control Captuer Oligonucleotide
<400> 65
actcctacgg gaggc 15
<210> 66
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificially Synthesized Negative Control Captuer Oligonucleotide
<400> 66
ctaatcggct tagcgtag 18
<210> 67
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificially Synthesized Primer Sequence
<400> 67
gagtttgatc ctggctcag 19
<210> 68
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificially Synthesized Primer Sequence
<400> 68
gtattaccgc ggctgctg 18
<210> 69
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificially Synthesized Control Probe Sequence
<400> 69
gagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcatgcc tacctaatcg cgatagcgta 60
ggagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 100
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificially Synthesized Positive Control Captuer
Oligonucleotide
<400> 70
cctaatcgcg atagcgtagg 20
<210> 71
<211> 16
<212> DNA
<213> Lactobacillus brevis
<400> 71
gggttgacgg tattta 16
<210> 72
<211> 15
<212> DNA
<213> Leuconostoc sp.
<400> 72
tgcatagccg agttg 15
Claims (29)
- 피검 시료 중의 세균을 검출·동정하기 위한 기구로서,대상으로 되는 세균은 이하의 (1)∼(5)에 기재된 세균으로부터 선택되는 적어도 2종류 이상의 세균이고,대상으로 되는 세균이 속하는 종 또는 속에 특이적인 염기 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있고,당해 올리고뉴클레오티드와 피검 시료에서 유래하는 핵산과의 하이브리다이제이션에 의해 피검 시료 중의 세균을 검출·동정하는 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.(1) 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis)에 속하는 세균(2) 락토바실루스 린드네리(Lactobacillus lindneri)에 속하는 세균(3) 페디오코커스속(Pediococcus)에 속하는 세균(4) 메가스페라속(Megasphaera)에 속하는 세균(5) 펙티네터스(Pectinatus)에 속하는 세균
- 제1항에 있어서,상기 대상으로 되는 세균에는, 추가로 이하의 (6)∼(19)에 기재된 세균이 포함되는 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.(6) 락토바실루스속(Lactobacillus)에 속하는 세균(7) 스트렙토코커스속(Streptococcus)에 속하는 세균(8) 류코노스톡속(Leuconostoc)에 속하는 세균(9) 자이모모나스속(Zymomonas)에 속하는 세균(10) 락토바실루스 코리니포미스(Lactobacillus coryniformis)에 속하는 세균(11) 락토바실루스 쿠바투스(Lactobacillus curvatus)에 속하는 세균(12) 락토바실루스 델브룩키(Lactobacillus delbrueckii)에 속하는 세균(13) 락토바실루스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)에 속하는 세균(14) 락토바실루스 메일퍼멘턴스(Lactobacillus malefermentans)에 속하는 세균(15) 락토바실루스 카제이(Lactobacillus casei)종군에 속하는 세균(16) 락토바실루스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus)에 속하는 세균(17) 락토바실루스 부키네리(Lactobacillus buchneri)에 속하는 세균(18) 엔테로코커스 두란스(Enterococcus durans)에 속하는 세균(19) 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)에 속하는 세균
- 제2항에 있어서,락토바실루스속(Lactobacillus)에 속하는 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동속에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있는 세균 검출 기구로서,당해 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호 1에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 2에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 3에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 4에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 5에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 6에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있는 세균 검출 기구로서,당해 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호 7에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 8에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 9에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 71에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 제2항에 있어서,락토바실루스 코리니포미스(Lactobacillus coryniformis)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있는 세균 검출 기구로서,당해 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호 10에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 11에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 12에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 제2항에 있어서,락토바실루스 쿠바투스(Lactobacillus curvatus)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있는 세균 검출 기구로서,당해 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호 13에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 14에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 제2항에 있어서,락토바실루스 델브룩키(Lactobacillus delbrueckii)의 16S 리보솜 RNA 유전 자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있는 세균 검출 기구로서당해 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호 16에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 17에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 18에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 제2항에 있어서,락토바실루스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있는 세균 검출 기구로서,당해 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호 19에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 20에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 21에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,락토바실루스 린드네리(Lactobacillus lindneri)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있는 세균 검출 기구로서,당해 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호 22에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 23에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 24에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 제2항에 있어서,락토바실루스 메일퍼멘턴스(Lactobacillus malefermentans)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있는 세균 검출 기구로서,당해 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호 25에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 26에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 27에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 제2항에 있어서,락토바실루스 카제이(Lactobacillus casei) 그룹의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있는 세균 검출 기구로서,당해 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호 28에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 29에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 30에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 31에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 제2항에 있어서,락토바실루스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있는 세균 검출 기구로서,당해 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호 32에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 33에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 제2항에 있어서,락토바실루스 부키네리(Lactobacillus buchneri)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있는 세균 검출 기구로서,당해 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호 34에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 35에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,페디오코커스속(Pediococcus)에 속하는 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동속에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있는 세균 검출 기구로서,당해 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호 36에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 37에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 38에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 39에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 40에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 41에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 42에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 43에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 44에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 45에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지 는 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 제2항에 있어서,스트렙토코커스속(Streptococcus)에 속하는 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동속에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있는 세균 검출 기구로서,당해 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호 46에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 47에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 제2항에 있어서,류코노스톡속(Leuconostoc)에 속하는 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동속에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있는 세균 검출 기구로서,당해 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호 48에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 49에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,메가스페라속(Megasphaera)에 속하는 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동속에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있는 세균 검출 기구로서,당해 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호 50에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 51에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 52에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 53에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 54에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 55에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,펙티네터스속(Pectinatus)에 속하는 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동속에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있는 세균 검출 기구로서,당해 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호 56에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 서열 번호 57에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 58에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 제2항에 있어서,자이모모나스속(Zymomonas)에 속하는 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동속에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있는 세균 검출 기구로서,당해 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호 59에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 60에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 제2항에 있어서,엔테로코커스 두란스(Enterococcus durans)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있는 세균 검출 기구로서,당해 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호 61에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 62에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 제2항에 있어서,락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 동종에 특이적인 서열에 기초한 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있는 세균 검출 기구로서,당해 올리고뉴클레오티드가, 서열 번호 63에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 서열 번호 64에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서,상기 기판 표면에 카르보디이미드기 또는 이소시아네이트기를 갖고, 당해 카르보디이미드기 또는 이소시아네이트기와 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 말단에 부가된 링커와의 반응에 의해 공유 결합이 형성되는 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 피검 시료 중의 세균을 검출·동정하기 위한 기구로서, 류코노스톡속(Leuconostoc)에 속하는 세균 및/또는 락토바실루스속(Lactobacillus)에 속하는 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자에 대응하는 염기 서열 중, 서열 번호 72에 나타나는 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 기판 표면에 고정화되어 있고, 당해 올리고뉴클레이티드와 피검 시료에서 유래하는 핵산과의 하이브리다이제이션에 의해 피검 시료 중의 세균을 검출·동정하는 것을 특징으로 하는 세균 검출 기구.
- 피검 시료 중의 세균을 검출·동정하기 위한 방법으로서,피검 시료 중의 세균의 핵산을 조제하는 핵산 조제 공정과,당해 핵산을 주형으로 하여 표지 프로브를 조제하는 프로브 조제 공정과,상기 표지 프로브를, 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 기재된 세균 검출기구의 기판 표면에 고정화된 올리고뉴클레오티드와 하이브리다이즈시키는 하이브리다이제이션 공정과,하이브리다이제이션 시그널을 검출하는 시그널 검출 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 세균 검출 방법.
- 제24항에 있어서,상기 피검 시료가 식품인 것을 특징으로 하는 세균 검출 방법.
- 제25항에 있어서,상기 식품이 맥아 알코올 음료인 것을 특징으로 하는 세균 검출 방법.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 기재된 세균검출방법을 실시하기 위한 세균 검출 키트.
- 제27항에 있어서, 상기 하이브리다이제이션 공정 및/또는 시그널 검출 공정에서 이용하는 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 세균 검출 키트.
- 제28항에 있어서, 상기 프로브 조제 공정 및/또는 상기 핵산 조제 공정에서 이용하는 시약을 추가로 포함하는 세균 검출 키트.
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