KR20060130624A - 사이클린 의존적 키나제 저해제, 그 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

사이클린 의존적 키나제 저해제, 그 조성물 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20060130624A
KR20060130624A KR1020067014820A KR20067014820A KR20060130624A KR 20060130624 A KR20060130624 A KR 20060130624A KR 1020067014820 A KR1020067014820 A KR 1020067014820A KR 20067014820 A KR20067014820 A KR 20067014820A KR 20060130624 A KR20060130624 A KR 20060130624A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
compound
substituted
compounds
unsubstituted
cells
Prior art date
Application number
KR1020067014820A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101155883B1 (ko
Inventor
니콜라스 보크코비츠
아서 에프. 클루지
크리스 오알만
크리쉬나 케이. 무르티
시야 람
종구오 왕
지엔싱 후앙
Original Assignee
지피씨 바이오테크 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 지피씨 바이오테크 인코포레이티드 filed Critical 지피씨 바이오테크 인코포레이티드
Publication of KR20060130624A publication Critical patent/KR20060130624A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101155883B1 publication Critical patent/KR101155883B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D231/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings
    • C07D231/54—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 cdk/사이클린 복합체 저해제로서, 식 I로 표시되는 신규한 사이클린 의존적 키나제(cdk) 저해제에 관한 것으로, 치환기는 청구범위에 비제한적으로 상세하게 기재되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 저해제는 세포주기 메카니즘을 저해할 수 있으며, 따라서 세포 주기 진행을 조절하여 궁극적으로 세포의 증식 및 분화를 조절할 수 있다. 본 발명의 화합물은 세포의 과다증식과 관련된 장애가 있는 환자의 치료에 유용하다.
사이클린 의존적 키나제 저해제, 세포 주기 조절

Description

사이클린 의존적 키나제 저해제, 그 조성물 및 그의 용도{INHIBITORS OF CYCLIN-DEPENDENT KINASES, COMPOSITIONS AND USES RELATED THERETO}
본 발명은 일반적으로 사이클린 의존적 키나제(cdk) 저해제로서 유용한 화합물, 상기 화합물을 포함하는 약학적 조성물, 상기 화합물의 제형화 방법 또는 상기 화합물을 암, 증식성 질환 또는 그외 질환의 치료에 이용하는 방법, 상기 화합물을 제조하기 위한 중간산물 및 상기 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
생물학에서 가장 중요하고 기본적인 과정중 하나는 세포 주기에 의해 매개되는 세포 분열이다. 이러한 과정은 정의된 생물학적 기능을 가진 세포의 후대 생산에 조절성을 부여한다. 이는 고도로 조절되는 현상으로, 세포 내부의 세포 시그널과 외부 기원의 세포 시그널의 다양한 세트에 반응한다. 암 촉진 및 억제 유전자 산물로 이루어진 복잡한 네트워크는 이러한 세포 시그널 과정에 중요한 구성이다. 암 촉진 인자의 과다 발현이나 이후의 암 억제성 산물의 감소는, 규제되지 않은 세포성 증식과 종양 형성을 유도하게 될 것이다(Pardee, Science 246: 603-608, 1989). 사이클린-의존적 키나제는 세포 주기 메카니즘의 규제에 있어 중요한 역할을 수행한다. 이러한 복합체는 2가지의 구성으로 이루어져 있다: 촉매성 서브유닛(키나제)과 조절성 서브유닛(사이클린). 지금까지, 9종의 키나제 서브유닛(사이 클린-의존적 키나제 1-9)과 7종의 조절성 서브유닛(사이클린 A-H, K, N 및 T)이 동정되었다. 각 키나제는 특이적인 조절성 파트너와 연관되어 있으며, 함께 활성형의 촉매성 모이어티를 형성한다. 각 세포 주기의 이행은 특정 사이클린 의존적 키나제 복합체에 의해 조절된다: 사이클린 의존적 키나제1/사이클린 E, 사이클린 의존적 키나제4/사이클린 D1 및 사이클린 의존적 키나제6/사이클린 D2에 의한 G1/S 이행, 사이클린 의존적 키나제2/사이클린 A 및 사이클린 의존적 키나제1/사이클린 A에 의한 S/G2 이행, 사이클린 의존적 키나제1/사이클린 D에 의한 G2/M 이행. 이러한 키나제의 공동 작용에 의한 활성은 각 세포가 복제 과정을 거치도록 인도하여, 차세대를 존속시킨다(Sherr, Cell 73: 1059-1065, 1993 ; Draetta, Trends Biochem. Sci. 15: 378-382, 1990).
다수 증거들이 종양 발생과 사이클린 의존적 키나제 관련 장애 사이의 연관성을 입증하고 있다. 사이클린 조절성 단백질의 과다발현과 이후 수반되는 키나제의 과다활성은 여러가지 타입의 암과 연계되어 있다(Jiang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9026-9030, 1993; Wang, Nature 343: 555-557, 1990). 요 근래에, 내인성의 매우 특이적인 사이클린 의존적 키나제에 대한 단백질 저해제가 세포 증식에 중요한 작용을 하는 것으로 밝혀졌다(Kamb et al., Science 264: 436-440, 1994; Beach, Nature 336: 701-704, 1993). 이러한 저해제로는 p16INK4(사이클린 의존적 키나제4/D1의 제해제), p21CIP1(일반적인 사이클린 의존적 키나제 저해제) 및 p27KIP(특이적 사이클린 의존적 키나제2/E 저해제)가 있다. 최근 사이클린 의존적 키나제2/A에 결합한 p27의 결정 구조를 통해, 이들 단백질들이 어떠한 방식으 로 사이클린 의존적 키나제 복합체와의 다중 상호작용을 통해 키나제 활성을 효과적으로 저해하는지 밝혀졌다(Pavletich, Nature 382: 325-331, 1996). 이들 단백질은 이의 해당 사이클린 의존적 키나제 복합체와의 특이적인 상호 작용을 통해 세포 주기 조절을 보조한다. 이러한 저해제가 결손된 세포에서는 무통제성 증식과 종양 형성이 이루어지기 쉽다. 이런 증거들은 치료제로서의 cdk 패밀리에 대한 소분자 저해제를 집중적으로 검색하게 한다.
발명의 개요
본 발명은 사이클린 의존적 키나제로 알려진 효소 클래스의 유효한 저해제인 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명에 따른 화합물들 중 적어도 한가지 이상 또는 그것의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 암, 그외 증식성 질환 또는 다른 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 화합물들중 적어도 하나 이상과 다른 항암 또는 항증식제의 조합을, 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 암, 그외 증식성 질환 또는 다른 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 예에서, 본 발명은 식I의 구조로 표시되는, 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 포함하는, 화합물을 제공한다:
(식I)
Figure 112006052222957-PCT00001
상기 식I에서,
R8은 치환 또는 비치환된 헤테로사이클, 치환 또는 비치환된 모르폴리노, 치환 또는 비치환된 피페라지닐, 또는 치환 또는 비치환된 사이클로헥실이고;
F는 n이 1 내지 6의 정수인 (CH2)n이다.
특정 예에서, n은 1이고, Q는 치환 또는 비치환된 2급 아미노 치환기, 치환 또는 비치환된 3급 아미노 치환기, 또는 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로사이클이다.
특정 예에서, n은 1이다.
특정 예에서, 식I의 Q는 3급 아미노 치환기, 예컨대 디알킬 아민이다. 특정 예에서, 식I의 Q는 모르폴린, 피페리딘, 피페라진 또는 피롤리딘과 같은 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로사이클이다. 특정 예에서, Q는 질소 함유성 헤테로아릴 고리, 3급 아미노 치환기, 또는 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로사이클이다.
특정 예에서, R8은
Figure 112006052222957-PCT00002
으로 표시되며, Z는 O 또는 NR''이고, R''는 H 또는 저급 알킬이다.
특정 예에서, 식I의 구조를 가지는 화합물은 하기 화합물들중 하나 이상이 제외된다.
Figure 112006052222957-PCT00003
Figure 112006052222957-PCT00004
Figure 112006052222957-PCT00005
Figure 112006052222957-PCT00006
특정 예에서, 식I의 화합물은 표에 기재된 화합물들중 하나 이상을 포함한다. 예를 들면, 상기 화합물은 화합물 B1 내지 B20 및 C2중 어느 하나를 포함할 수 있다.
언급한 바와 같이, 특정 예에서, 적합한 치환기로 각 경우에 독립적으로 알킬, 옥소, 아실 아미노, 하이드록실, 카르보닐, 설포닐, 에스테르, 아미드, NR'', 하이드록시 알킬, 알콕시 알킬, 아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬 또는 올리고(에틸렌 글리콜)을 포함할 수 있다. 특정 예에서, Q는 2급 아미노 치환기이고, 적합한 치환기로 알킬, 알콕시알킬, 하이드록실알킬 및 하이드록시알콕시알킬을 포함한다. 당업자라면 나열한 치환기 리스트가 모든 것을 망라하는 것이 아니며, 그외 다수의 절합한 치환기를 사용할 수 있음을 쉽게 인지할 것이다.
특정 예에서, 본 발명은 식II의 구조를 가지는, 화합물 또는 그것의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체에 관한 것이다.
Figure 112006052222957-PCT00007
상기에서,
B는 MnR8이고;
Ar은 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고;
V는 O, S 또는 N-CN이고;
W는 O, S 또는 NR''이고;
R'은 독립적으로 H, 저급 알킬 또는 금속 반대이온이고;
R''는 독립적으로 H 또는 저급 알킬이고;
R5는 H, P(=O)(OR')2 또는 MnQ이고;
R6는 H, OH 또는 MnQ이고, 단 R5 및 R6중 어느 하나만 H이고;
R7은 H, 할로겐, 하이드록실, 저급 알킬 또는 저급 알콕실이고;
R8은 치환된 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 또는 아민이고;
M은 독립적으로 치환 또는 비치환된 메틸렌기(C(=O) 및 C(=S) 포함), NR'', O, S, S(O) 또는 S(O2)이고;
n은 B에 존재하는 경우에는 1 내지 4의 정수이고, R5에 존재하는 경우에는 0 내지 6의 정수이고, R6에 존재하는 경우에는 1 내지 3의 정수이고; 및
Q는 치환 또는 비치환된 3급 아미노 치환기 또는 질소 함유성 헤테로사이클이다.
특정 예에서, R8은 치환 또는 비치환된 모르폴리노, 피페라지닐 또는 사이클로헥실이다.
특정 예에서, R''는 H이다.
특정 예에서, R5는 MnQ이다.
특정 예에서, Q에 부착된 M은 CH2, S(O2), C(=S) 또는 C(=O)이다.
특정 예에서, Q에 부착된 M은 CH2이다.
특정 예에서, Q에 부착된 M은 C(=O)이다.
특정 예에서, Q에 부착된 M은 치환된 NR''이다.
특정 예에서, Q는 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로사이클이다.
특정 예에서, Q는 치환 또는 비치환된 3급 아미노기이다.
특정 예에서, R8은 치환 또는 비치환된 모르폴리노, 피페라지닐 또는 사이클로헥실이다. 특정 예에서, R''는 H이고, M의 적어도 하나가 CH2인 경우에는 치환된 NR''이고, 또는 Q에 부착된 경우에는 CH2, S(O2), C(=S) 또는 C(=O)이다.
특정 예에서, Q는 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로아릴 고리이다. 다른 특정 예에서, Q는 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로사이클이다. 특정 예에서, Q는 치환 또는 비치환된 3급 아미노기이다. 특정 예에서, Q는 치환 또는 비치환된 2급 아미노기이다.
특정 예에서, 본 발명은 하기 식의 구조를 가지는 화합물 또는 그것의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체에 관한 것이다:
Figure 112006052222957-PCT00008
특정 예에서, 본 발명은 하기 식의 구조를 가지는 화합물 또는 그것의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체에 관한 것이다:
Figure 112006052222957-PCT00009
특정 예에서, 본 발명은 본원에 기재된 화합물 1종 이상을 정제형 또는 합성형으로 제공하는 것에 관한 것이다.
특정 예에서, 본 발명은 식II의 구조를 가지는 화합물 또는 그것의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체에 관한 것이다:
Figure 112006052222957-PCT00010
상기에서,
B는 MnR8이고;
Ar은 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고;
V는 O, S 또는 N-CN이고;
W는 O, S, S(O2), C(=O), C(=S), CH2 또는 NR''이고;
R'은 독립적으로 H, 저급 알킬 또는 금속 반대이온이고;
R''는 독립적으로 H 또는 저급 알킬이고;
R'''는 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 저급 알킬이고;
R5는 MnJK이고;
R6는 H, OH 또는 MnQ이고;
R7은 H, 할로겐, 하이드록실, 저급 알킬 또는 저급 알콕실이고;
R8은 치환된 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로-알킬, 헤테로사이클릴 또는 아민이고;
J는 C(=O), C(=S) 또는 SO2이고;
K는 OR', N(R'')2 또는 N(R')SO2R''이고;
M은 독립적으로 치환 또는 비치환된 메틸렌기(C(=O) 및 C(=S) 포함), NR'', O, S, S(O) 또는 S(O2)이고;
n은 B에 존재하는 경우에는 1 내지 7의 정수이고, R5에 존재하는 경우에는 0 내지 6의 정수이고, R6에 존재하는 경우에는 1 내지 3의 정수이고; 및
Q는 치환 또는 비치환된: 질소 함유성 헤테로아릴 고리, 2급 아미노 치환기, 3급 아미노 치환기 또는 질소 함유성 헤테로사이클이다.
특정 예에서, R8은 치환 또는 비치환된 모르폴리노, 피페라지닐 또는 사이클로헥실이다.
특정 예에서, R''는 H이다.
특정 예에서, Q에 부착된 M은 CH2, 치환된 NR'', S(O2), C(=S) 또는 C(=O)이다.
특정 예에서, R8은 치환 또는 비치환된 모르폴리노, 피페라지닐 또는 사이클로헥실이다.
특정 예에서, R''는 H이다.
특정 예에서, R5는 MnQ이다.
특정 예에서, Q에 부착된 M은 CH2, S(O2), C(=S) 또는 C(=O)이다.
특정 예에서, Q에 부착된 M은 C(=O)이다.
특정 예에서, Q에 부착된 M은 CH2이다.
특정 예에서, Q에 부착된 M은 치환된 NR''이다.
특정 예에서, Q는 치환 또는 비치환된 3급 아미노 치환기이다.
특정 예에서, Q는 치환 또는 비치환된 3급 질소 함유성 헤테로사이클이다.
특정 예에서, 치환기는 독립적으로, 알킬, 옥소, 아실 아미노, 하이드록실, 카르보닐, 설포닐, 에스테르, 아미드, NR'', 하이드록시 알킬, 알콕시 알킬, 아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬 또는 올리고(에틸렌 글리콜)을 포함한다.
특정 예는 식II의 구조를 가지는 화합물 또는 그것의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 포함한다:
Figure 112006052222957-PCT00011
상기에서,
B는 MnR8이고;
Ar은 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고;
V는 O, S 또는 N-CN이고;
W는 O, S, S(O2), C(=O), C(=S), CH2 또는 NR''이고;
R'은 독립적으로 H, 저급 알킬 또는 금속 반대이온이고;
R''는 독립적으로 H 또는 저급 알킬이고;
R'''는 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 저급 알킬이고;
R5는 H, P(=O)(OR')2, MnJK 또는 MnQ이고;
R6는 H, OH 또는 MnQ이나, 단 R5 및 R6 중 하나 및 어느 하나만 H이고;
R7은 독립적으로 H, 할로겐, 하이드록실, 저급 알킬 또는 저급 알콕실이고;
R8은 치환된 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로-알킬, 헤테로사이클릴 또는 아민이고;
J는 C(=O), C(=S) 또는 SO2이고;
K는 OR', N(R'')2 또는 N(R')SO2R''이고;
M은 독립적으로 치환 또는 비치환된 메틸렌기(C(=O) 및 C(=S) 포함), NR'', O, S, S(O), S(O2) 또는 CH2이고;
n은 B에 존재하는 경우에는 1 내지 7의 정수이고, R5에 존재하는 경우에는 0 내지 6의 정수이고, R6에 존재하는 경우에는 1 내지 3의 정수이고; 및
Q는 치환 또는 비치환된: 질소 함유성 헤테로아릴 고리, 2급 아미노 치환기, 3급 아미노 치환기 또는 질소 함유성 헤테로사이클이며,
단, 하기 식IIa의 구조를 가지는 화합물은 제외된다.
(식IIa)
Figure 112006052222957-PCT00012
상기에서,
W 및 Z는 독립적으로 O 또는 NR''이고;
R'은 독립적으로 H, 저급 알킬 또는 금속 반대이온이고;
R''는 독립적으로 H 또는 저급 알킬이고;
R5는 H, P(=O)(OR')2, 또는 MnQ이고;
R6는 H, OH 또는 MnQ이나, 단 R5 및 R6 중 하나 및 어느 하나만 H이고;
R7은 독립적으로 H, 할로겐, 하이드록실, 저급 알킬 또는 저급 알콕실이고;
M은 독립적으로 치환 또는 비치환된 메틸렌기(C(=S) 및 C(=O) 포함), NR'', O, S, S(O) 또는 S(O2)이고;
n은 1 내지 5의 정수이고; 및
Q는 질소 함유성 헤테로아릴 고리, 3급 아미노 치환기, 또는 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로사이클이다.
특정 예에서, 식IIa의 Q는 3급 아미노 치환기, 예컨대 디알킬 아민이다. 특정 예에서, 식IIa의 Q는 모르폴린, 피페리딘, 피페라진 또는 피롤리딘과 같은 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로사이클이다. 특정 예에서, Q는 질소 함유성 헤테로아릴 고리, 3급 아미노 치환기, 또는, 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로 사이클이다.
특정 예에서, 식II의,
B는 MnR8이고;
Ar은 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고;
V는 O, S 또는 N-CN이고;
W는 C(=O), C(=S), SO2 또는 CH2이고;
R'은 독립적으로 H, 저급 알킬, 금속 반대이온, 또는 알카리 토금속 반대이온이고;
R''는 독립적으로 H 또는 저급 알킬이고;
R'''는 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 저급 알킬이고;
R5는 H, P(=O)(OR')2, MnJK, 또는 MnQ이고;
R6는 H, OH 또는 MnQ이나, 단 R5 및 R6 중 어느 하나만 H이고;
R7은 H, 할로겐, 하이드록실, 저급 알킬 또는 저급 알콕실이고;
R8은 치환된 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로-알킬, 헤테로사이클릴 또는 아민이고;
J는 C(=O), C(=S) 또는O2이고;
K는 OR', N(R'')2 또는 N(R')SO2R''이고;
M은 독립적으로 치환 또는 비치환된 메틸렌기(C(=S) 및 C(=O) 포함), NR'', O, S, S(O) 또는 S(O2)이고;
n은 B에 존재하는 경우에는 1 내지 4의 정수이고, R5에 존재하는 경우에는 0 내지 6의 정수이고, R6에 존재하는 경우에는 1 내지 3의 정수이고; 및
Q는 치환 또는 비치환된: 질소 함유성 헤테로아릴 고리, 2급 아미노 치환기, 3급 아미노 치환기 또는 질소 함유성 헤테로사이클이다.
특정 예에서, Q는 3급 아미노 치환기, 예컨대 디알킬 아민, 또는, 모르폴린, 피페리딘, 피페라진 또는 피롤리딘과 같은 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로사이클이다.
특정 예에서, 식II의,
B는 MnR8이고;
Ar은 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고;
V는 O, S 또는 N-CN이고;
W는 O, S, S(O2), C(=O), C(=S), CH2 또는 NR''이고;
R'은 독립적으로 H, 저급 알킬, 금속 반대이온, 또는 알카리 토금속 반대이온이고;
R''는 독립적으로 H 또는 저급 알킬이고;
R'''는 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 저급 알킬이고;
R5는 H, P(=O)(OR')2, MnJK, 또는 MnQ이고;
R6는 H, OH 또는 MnQ이나, 단 R5 및 R6 중 어느 하나만 H이고;
R7은 H, 할로겐, 하이드록실, 저급 알킬 또는 저급 알콕실이고;
R8은 치환된 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로-알킬, 헤테로사이클릴 또는 아민이고;
J는 C(=O), C(=S) 또는 SO2이고;
K는 OR', N(R'')2 또는 N(R')SO2R''이고;
M은 독립적으로 치환 또는 비치환된 메틸렌기(C(=S) 및 C(=O) 포함), NR'', O, S, S(O) 또는 S(O2)이고;
n은 B에 존재하는 경우에는 1 내지 4의 정수이고, R5에 존재하는 경우에는 0 내지 6의 정수이고, R6에 존재하는 경우에는 1 내지 3의 정수이고; 및
Q는 치환 또는 비치환된 2급 아미노 치환기이다.
다른 예에서, 식II의,
B는 MnR8이고;
Ar은 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고;
V는 O, S 또는 N-CN이고;
W는 O, S, S(O2), C(=O), C(=S), CH2 또는 NR''이고;
R'은 독립적으로 H, 저급 알킬, 금속 반대이온, 또는 알카리 토금속 반대이온이고;
R''는 독립적으로 H 또는 저급 알킬이고;
R'''는 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 저급 알킬이고;
R5는 MnJK이지만, R5는 CH2COOH는 아니고;
R6는 H, OH 또는 MnQ이고;
R7은 H, 할로겐, 하이드록실, 저급 알킬 또는 저급 알콕실이고;
R8은 치환된 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로-알킬, 헤테로사이클릴 또는 아민이고;
J는 C(=O), C(=S) 또는 SO2이고;
K는 OR', N(R'')2 또는 N(R')SO2R''이고;
M은 독립적으로 치환 또는 비치환된 메틸렌기(C(=S) 및 C(=O) 포함), NR'', O, S, S(O) 또는 S(O2)이고;
n은 B에 존재하는 경우에는 1 내지 4의 정수이고, R5에 존재하는 경우에는 0 내지 6의 정수이고, R6에 존재하는 경우에는 1 내지 3의 정수이고; 및
Q는 치환 또는 비치환된: 질소 함유성 헤테로아릴 고리, 2급 아미노 치환기, 3급 아미노 치환기 또는 질소 함유성 헤테로사이클이다.
특정 예에서, 식II의 Q는 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로아릴 고리이고, R8은 치환 또는 비치환된 모르폴리노, 피페라지닐 또는 하이클로헥실일 수 있다. 식 II에서, R''는 H일 수 있다.
또한, M은 CH2일 수 있다. 특정 예에서, 식II의 W는 CH2이고, 하나 이상의 M은 치환된 NR''이다.
특정 예에서, 식II의 Q는 치환 또는 비치환된 2급 아미노기이다. 특정 예에서, 식II의 Q는 치환 또는 비치환된 3급 아미노기이다. 특정 예에서, 식II의 Q는 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로사이클이다.
특정 예에서, 식II의 Q는 치환 또는 비치환된: 질소 함유성 헤테로아릴 고리, 3급 아미노 치환기 또는 질소 함유성 헤테로사이클이다.
식II의 특정 예에서, R5는 MnQ이고, Q는 치환 또는 비치환된: 질소 함유성 헤테로아릴 고리, 3급 아미노 치환기 또는 질소 함유성 헤테로사이클이다.
식II의 특정 예에서, Q는 치환 또는 비치환된 3급 아미노기이다.
식II의 특정 예에서, Q는 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로사이클이다.
식II의 특정 예에서, R5는 MnQ이고, Q는 치환 또는 비치환된 2급 아미노기이다.
식II의 특정 예에서, R5는 MnQ이고, Q는 질소 함유성 헤테로아릴 고리이다.
식II의 특정 예에서, R8은 치환 또는 비치환된 모르폴리노, 피페라지닐 또는 사이클로헥실이다.
식II의 특정 예에서, R''는 H이다.
식II의 특정 예에서, W는 CH2이다.
식II의 특정 예에서, Q에 부착된 M은 CH2, S(O2), C(=S) 또는 C(=O)이다.
식II의 특정 예에서, Q에 부착된 M은 CH2이다.
식II의 특정 예에서, Q에 부착된 M은 CH2, S(O2), C(=S) 또는 C(=O)이다.
식II의 특정 예에서, V는 O이고, M은 NH이고, R8은 Z가 O 또는 NR''인
Figure 112006052222957-PCT00013
이다.
특정 예에서, AR은 페닐 고리이고, R6 및 R7은 모든 경우에서 H이다.
특정 예는 식V의 구조를 가지는 화합물 또는 그것의 프로드럭, 이성질체, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 포함한다
(식V)
Figure 112006052222957-PCT00014
상기 식V에서,
R8은 치환 또는 비치환된 헤테로사이클이고;
Q는 치환 또는 비치환된: 2급 아미노 치환기, 3급 아미노 치환기 또는 비환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로사이클이다.
전술한 바와 같이, R8은 특정 예에서 모르폴리노 또는 피페라지닐 고리일 수 있다.
특정 예에서, 전술한 바와 같이, Q는 피페라진, 모르폴린, 피페리딘, 피리딘, 피롤, 옥사졸, 이속사졸, 이미다졸 또는 피라졸일 수 있다.
특정 예는 A34, A36, A37, A44, A46 및 A76 내지 A82로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물, 또는, 그것의 프로드럭, 이성질체, 호변이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 포함한다.
특정 예는 A47, A49, A51 및 A82로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물, 또는, 그것의 프로드럭, 이성질체, 호변이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 포함한다.
특정 예들에서, W는 O, S(O2), C(=O), C(=S), S, CH2 또는 NR''이다.
전술한 바와 같이, 특정 예들에서, Q는 치환 또는 비치환된: 질소 함유성 헤테로아릴 고리, 3급 아미노 치환기, 또는 질소 함유성 헤테로사이클이다.
특정 예들에서, 적합한 치환기로는, 각 경우에 따라 독립적으로, 알킬, 옥소, 아실 아미노, 하이드록실, 카르보닐, 설포닐, 에스테르, 아미드, NR'', 하이드록시 알킬, 알콕시 알킬, 아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬 또는 올리고(에틸렌 글리콜)을 포함할 수 있다. Q가 2급 아미노 치환기인 특정 예들에서는, 적합한 치환기는 알킬, 알콕시알킬, 하이드록실알킬 및 하이드록시알콕시알킬을 포함한다. 당업자라면 기재된 치환기 리스트가 모든 것을 망라하지 않으며, 그외 다수의 적합한 치환기를 사용할 수 있음을 쉽게 인지할 수 있을 것이다.
특정 예들은 약학적으로 허용가능한 부형제 및 본원에 기재된 모든 타입의 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 포함할 수 있으며, 특정 예는 본원에 기재된 모든 타입의 화합물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 과다증식성 장애의 치료 방법을 포함한다.
특정 예들에서, 본원의 화합물은 세포를 본원에 기재된 타입의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포의 증식을 저해하는 방법에, 또는 포유류에 본원에 기재된 타입의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 (인간 면역결핍성 바이러스(HIV)에 의한 감염과 같은) 바이러스 감염의 치료 방법에 의해 적용될 수 있다. 특정 예는, 한가지 이상의 화학치료제 또는 방사능 치료법과 병행하여 포유류에 본원에 기재된 타입의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 화학요법 또는 방사능 치료법에 의해 유발된 탈모증의 예방 또는 치료 방법을 포함한다. 본원에 따른 화합물은 또한 의약제 제조에 사용될 수 있다.
또한, 화합물은 과다증식성 장애와 같은 장애의 치료에 사용할 수 있다. 화합물은 인간 또는 동물에게 투여할 수 있다. 화합물은 예컨대 증식성 세포를 화합물과 접촉시킴으로써, 세포 증식을 저해하기 위해 사용할 수 있다. 또한, 화합물은 화합물을 포유류에 투여함으로써 바이러스 감염을 치료하기 위해 사용할 수 있다.
화합물을 이용하여 제조한 의약제는 질병(예, 과다증식성 장애, 바이러스 감염, 화학요법에 의한 탈모증, 사이클린 의존적 키나제 활성과 관련된 질병 등)의 치료 또는 예방용 약제로서 사용할 수 있다. 의약제는 본원에 기재된 임의의 질병들의 치료에 사용할 수 있다.
또한, 여러가지 방법들은 화합물의 이용에 이용가능하다. 예컨대, 방법은 치료가 필요한 숙주에게 임의의 화합물을 치료학적 유효량으로 투여함으로써, 사이클린 의존적 키나제를 저해하기 위해 적용할 수 있다. 또한, 상기 방법은 치료가 필요한 숙주에게 화합물을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 사이클린 의존적 키나제 관련 장애를 치료하기 위해 적용할 수 있다. 또한, 인간 또는 그외 동물을 치료하는 방법이 본 발명에 포함된다. 특정 예에서, 인간 또는 그외 동물은 본 발명에 따른 1종 이상의 화합물을 치료학적 유효량으로 포함하는 조성물을 이용하여 치료할 수 있다.
특정 예에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체와, 식(I)의 화합물, (II)의 화합물, 본원에 기재된 그외 임의의 화합물, 또는 그것의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체의 치료학적 유효량을 포함하는 신규한 약학적 조성물을 제공한다.
다른 예에서, 본 발명은 치료가 필요한 숙주에게 식(I)의 화합물, (II)의 화합물, 본원에 기재된 그외 임의의 화합물, 또는 그것의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 신규한 암, 그외 증식성 질환, 또는 다른 질환의 치료 방법을 제공한다.
다른 예에서, 본 발명은 치료가 필요한 숙주에게 (a) 식(I)의 화합물, (II)의 화합물, 본원에 기재된 그외 임의의 화합물, 또는 그것의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체와, 및 (b) 항암제 및 항증식제로부터 선택된 1종 이상의 화합물을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 신규한 암, 그외 증식성 질환, 또는 다른 질환의 치료 방법을 제공한다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 저해제는 세포 주기 장치를 저해할 수 있어, 따라서 세포 주기 진행 조절에 유용하며, 궁극적으로 세포 증식과 분화를 조절할 수 있다. 이러한 화합물은 암, 건선, 원하지 않는 백혈구 증식을 수반하는 면역 질환, 재협착증 및 그외 평활근 세포 장애 등과 같은 과다한 세포 증식과 관련된 질환이 있는 개체의 치료에 유용하다. 또한, 이러한 화합물은 인간 면역결핍성 바이러스 타입I(HIV-I) 전사 저해에 유용하다(Wang et al., J. Virology 75: 7266-7279 (2001)).
또한, 본원에 기재된 본 발명에 따른 화합물은 본원에 기재된 바와 같은 질병 치료에 사용할 수 있는 의약제 제조에 사용할 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 명확하고 비제한적으로 CDK/사이클린 복합체로서 신규한 사이클린 의존적 키나제(cdk) 저해제에 관한 것이다. 본 발명에 기재된 바와 같이, 본 발명의 저해제는 세포 주기 장치를 저해하여, 따라서 세포 주기 진행 조절과 궁극적으로는 세포 증식 및 분화 조절에 유용할 수 있다. 이러한 화합물은 이하 보다 상세히 기재된 바와 같이, 암, 건선, 원하지 않는 백혈구 증식이 수반되는 면역 질환, 재협착증 및 그외 평활근 세포 장애 등의 치료와 같은, 과다 세포 증식과 관련된 질병을 가진 개체의 치료에 유용하다.
일예에서, 본 발명은 식1의 구조로 표시되는, 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 포함하는, 화합물을 제공한다
(식I)
Figure 112006052222957-PCT00015
상기에서,
R8은 치환 또는 비치환된 헤테로사이클, 치환 또는 비치환된 모르폴리노, 치환 또는 비치환된 피페라지닐, 또는 치환 또는 비치환된 사이클로헥실이고;
F는 n이 1 내지 6의 정수인 (CH2)n이다.
특정 예에서, n은 1이고,
Q는 치환 또는 비치환된 2급 아미노 치환기, 치환 또는 비치환된 3급 아미노 치환기, 또는, 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로사이클이다.
특정 예에서, 식I의 Q는 3급 아미노 치환기, 예컨대 디알킬 아민이다. 특정 예에서, 식I의 Q는 모르폴린, 피페리딘, 피페라진 또는 피롤리딘과 같은 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로사이클이다. 특정 예에서, Q는 질소 함유성 헤테로아릴 고리, 3급 아미노 치환기, 또는 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로사이클이다.
특정 예에서, R8은
Figure 112006052222957-PCT00016
으로 표시되며, Z는 O 또는 NR''이고, R''는 H 또는 저급 알킬이다.
특정 예에서, 식I의 구조를 가지는 화합물은 하기 화합물들중 하나 이상을 제외한다.
Figure 112006052222957-PCT00017
Figure 112006052222957-PCT00018
Figure 112006052222957-PCT00019
Figure 112006052222957-PCT00020
특정 예에서, 식I의 화합물은 표에 기재된 화합물들중 하나 이상을 포함한다. 예를 들면, 상기 화합물은 화합물 B1 내지 B20 및 C2중 어느 하나를 포함할 수 있다.
언급한 바와 같이, 특정 예에서, 적합한 치환기로 각 경우에 독립적으로, 알킬, 옥소, 아실 아미노, 하이드록실, 카르보닐, 설포닐, 에스테르, 아미드, NR'', 하이드록시 알킬, 알콕시 알킬, 아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬 또는 올리고(에틸렌 글리콜)을 포함할 수 있다. 특정 예에서, Q는 2급 아미노 치환기이며, 적합한 치환기로 알킬, 알콕시알킬, 하이드록실알킬 및 하이드록시알콕시알킬을 포함한다. 당업자라면 나열한 치환기 리스트가 모든 것을 망라하는 것이 아니며, 그외 다수의 절합한 치환기를 사용할 수 있음을 쉽게 인지할 것이다.
특정 예에서, 본 발명은 식II의 구조를 가지는, 화합물 또는 그것의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체에 관한 것이다.
Figure 112006052222957-PCT00021
상기에서,
B는 MnR8이고;
Ar은 페닐 고리와 같은 아릴 또는 헤테로아릴 고리이고;
V는 O, S 또는 N-CN이고, 바람직하기로는 O 또는 S이고;
W는 O, S, S(O2), C(=O), C(=S), CH2 또는 NR''이고;
R'은 독립적으로 H, 저급 알킬 또는 알카리 또는 알카리 토금속 반대이온과 같은 금속 반대이온이고;
R''는 독립적으로 H 또는 저급 알킬, 바람직하기로는 H이고;
R'''는 H 또는 바람직하기로는 에스테르, 아미드, 아실아미노 또는 아실록시로부터 선택된 치환기로 선택적으로 치환된 저급 알킬이고;
R5는 H, P(=O)(OR')2, MnJK 또는 MnQ이고;
R6는 H, OH 또는 MnQ이나, 바람직하기로는 단 R5 및 R6 중 하나 및 어느 하나만 H이고;
R7은 독립적으로 H, 할로겐, 하이드록실, 메틸과 같은 저급 알킬 또는 메톡시와 같은 저급 알콕실이고;
R8은 치환된 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 또는 아민이고;
J는 C(=O), C(=S) 또는 SO2이고;
K는 OR', N(R'')2 또는 N(R')SO2R''이고;
M은 독립적으로 치환 또는 비치환된 메틸렌기(예, 저급 알킬, 옥소, 하이드록실 등으로 치환된), NR'', O, S, S(O), 또는 SO2이고, 바람직하기로는 NR'' 또는 CH2이거나, W나 Q에 부착된 경우에는 CH2, S(O2), C(=S) 또는 C(=O)이고;
n은 0 내지 10의 정수이고, 바람직하기로는 1-7의 정수이고, 또는 B에 존재하는 경우에는 1 내지 4의 정수이고, R5에 존재하는 경우에는 0 내지 6의 정수이고, R6에 존재하는 경우에는 1 내지 3의 정수이고; 및
Q는 치환 또는 비치환된: 질소 함유성 헤테로아릴 고리, 예컨대 피롤, 테트라졸, 옥사졸, 옥사디아졸, 이속사졸, 이미다졸, 또는 피라졸; 2급 아미노 치환기, 예컨대 모노알킬 아민, 아릴알킬 아민, 헤테로아릴알킬 아민; 3급 아미노 치환기, 예컨대 디알킬 아민; 또는 질소 함유성 헤테로사이클, 예컨대 모르폴린, 피페리딘, 피페라진, 피리딘 또는 피롤리딘이다.
특정 예에서, K는 N(R')SO2R''일때, R''은 저급 알킬이다.
특정 예에서, R5는 MnJK이지만, R5는 CH2COOH는 아니다.
특정 예에서, 적절한 치환기로는 각각 독립적으로 알킬, 옥소, 하이드록실, 알콕시, 하이드록시-알콕시, 카르보닐, 설포닐, 에스테르, 아미드, NR'', 알킬 할라이드, 아실 아미노 또는 치환 또는 비치환된 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬, 올리고(에틸렌 글리콜) 등이 있다. 당업자라면 아릴 및 헤테로아릴이 전술한 모든 것을 포함한 적합한 모든 치환기를 사용할 수 있음을 이해할 것이다.
특정 예에서, R8은 다음 치환기 중 어느 것이다: 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 하이드록실-알콕시, 아릴, 아민 또는 헤테로아릴. 특정 예에서, 전술한 임의의 치환기는 언급한 임의의 치환기 또는 할로, -CN, N3, NO2 또는 할로알킬로 선택적으로 치환될 수 있다. 또한, 그외 적합한 치환기로 예컨대 사이클로헥실, =O, 카르보닐, 설포닐, 카르복실, 설폭실, 아미드, 헤테로사이클, 에스테르 또는 에테르를 포함할 수 있다.
특정 예에서, R8에 부착되고 R5에 존재하는 경우에 적어도 하나 이상의 M은 치환된 NR''이다.
상기 임의의 예를 포함한 특정 예에서, R8은 Z가 O 또는 NR''인
Figure 112006052222957-PCT00022
이다. 특정 예에서, R8은 모르폴리노 또는 사이클로헥실이다. 이러한 특정 예에서, Mn은 NR''이고, 바람직하기로는 NH이다. 특정 예에서, V는 O이다.
특정 예에서, W는 CH2이다. 이러한 특정 예에서, 적어도 하나 이상의 M은 치환된 NR''이다.
R'''이 존재하고 저급 알킬인 특정 예에서, 저급 알킬은 저급 알킬, 저급 할로알킬, NR8R8a, NR''C(O)R8, =O, COR8, CO2R8, NR''CO2R8, C(O)NR8R8a, NR''C(O)NR8R8a, NR''C(S)NR8R8a, C(S)NR8R8a, NR''SO2NR8R8a, SO2NR8R8a, NR''SO2R8a, SO2R8a, NR''SO2R8a, 0-5개의 R'''로 치환된 C3-10 카르보사이클, 및 O, N 및 S로부터 선택된 1-4개의 이종원자를 포함하며 0-3개의 R8로 치환된 5-10원 헤테로사이클로부터 선택된 1 내지 3개(바람직하게는 1개) 치환기로 치환되며, 상기 R8은 H, C1-4 할로알킬, NR8aR8a, NR''C(O)OR8a, NR''C(O)R8a, COR8a, CO2R8a, CONR8a, R8a, NHC(O)NR8aR8a, NHC(S)NR8aR8a, SO2NR8aR8a, SO2R8a, C1-4의 알킬, 페닐, 벤질, 선택적으로 0-3개의 R'''로 치환된 C2-10의 알케닐로 치환된 C5-10의 알킬, 0-3개의 R'''로 치환된 C2-10의 알키닐, -(CF2)mCF3, 0-5개의 R'''로 치환된 C3-10의 카르보사이클, 및 O, N 및 S로부터 선택된 1-4개의 이종원자를 포함하며 0-3개의 R'''로 치환된 5-10원 헤테로사이클이고, R8a는 각각 독립적으로 H, 저급 알킬, 페닐 및 벤질로부터 선택된 기이다.
특정 예에서, R'''은 발린 또는 글리신 잔기와 같은 아미노산 잔기를 포함하며, 예컨대, R'''은 아미드 또는 에스테르 결합을 통해 아미노산 잔기로 치환된 저급 알킬 잔기이다.
바람직한 예에서, R5W 및 R6은 Ar 상에서 서로 인접(ortho)하며, 바람직하기로는 트리사이클릭 코어 결합에 인접하지(ortho) 않는다.
특정 예에서, V는 S 또는 N-CN이다. 일부 예들에서, Ar은 헤테로아릴 고리이다.
식II의 특정 예에서, W는 O, S 또는 NR''이다. 특정 예에서, R5는 H, P(=O)(OR')2, 또는 MnQ이다. 특정 예에서, R7은 독립적으로 할로겐, 하이드록실, 메틸과 같은 저급 알킬 또는 메톡시와 같은 저급 알콕실이다. 특정 예에서, n은 0 내지 5의 정수이고, 바람직하기로는 1 내지 5의 정수이고, 더 바람직하기로는 R5에 존재시 2 내지 4의 정수이다.
식II의 특정 예에서, W는 O, CH2, C(=O), C(=S) 또는 SO2이다. 특정 예에서, R5는 MnJK 또는 MnQ이다. 특정 예에서, R6 및 R7은 H이다. 특정 예에서, M은 C(=)O 또는 CH2이다. 특정 예에서, n은 바람직하기로는 1이지만, 다른 예에서는 n은 0일 수 있다. 특정 예에서, J는 바람직하기로는 C(=O)이고, K는 OR' 또는 N(R')SO2R''이다. 특정 예에서, N(R')SO2R''은 NHSO2R''이다.
특정 예에서, Q는 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로아릴 고리이다. 특정 예에서, Q는 적어도 2개 이상의 질소 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴 고리, 예컨대 5원 또는 6원 고리이다. 특정 예에서, Q는 테트라졸 또는 옥사디아졸의 치환 또는 비치환된 경우일 수 있다. 특정 예에서, Q는 피리딘, 피페리딘 또는 피페라진의 치환 또는 비치환된 경우일 수 있다.
특정 예에서, Q는 2급 아미노 치환기이다. 상기 예의 특정 예에서, 상기 2급 아미노 치환기상의 치환기는 알킬, 알콕시알킬, 하이드록시알킬 및 하이드록시알콕시알킬로부터 선택된다.
식II의 특정 예에서, W는 C(=O), SO2 또는 C(=S)이다. n인 0인 경우에, R6 및 R7은 H이고, R5는 MnQ이며, Q는 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로아릴 고리이다. 특정 예에서, W는 CH2이고, R6 및 R7은 H이고, R5는 MnQ이며, 이때, n은 0이고, Q는 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로아릴 고리이다.
특정 예에서, W는 O, S 또는 NR'', R6 및 R7은 H, R5는 MnJK이며, 이때, n은 1 내지 3의 정수이고, J는 C(=O)이고, K는 OR' 또는 N(R')SO2R''이다.
특정 예에서, W는 O, S 또는 NR'', R6 및 R7은 H, R5는 MnQ이고, 이때 n은 1 내지 3의 정수이고, Q는 치환 또는 비치환된 5원 질소 함유성 헤테로사이클이다. 이러한 예에서, n은 바람직하기로는 1이다. 특정 예에서, Q는 2개 이상의 질소 원자를 포함한다.
특정 예에서, W는 O, S 또는 NR'', R6 및 R7은 H, R5는 MnQ이고, 이때, n은 1 내지 3의 정수이고, Q는 치환 또는 비치환된 6원 질소 함유성 헤테로사이클이다. 이러한 특정 예에서, n은 2이고, Mn은 CH2C(=O)이다.
특정 예에서, W는 O, S 또는 NR'', R6 및 R7은 H, R5는 MnQ이고, 이때, M은 CH2이고 n은 1 내지 3의 정수이고, Q가 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로사이클이다.
특정 예에서, Q는 치환된 질소 함유성 헤테로사이클, 예컨대 피페라진, 모르폴린, 피페리딘, 피리딘, 티아졸, 옥사디아졸, 테트라졸, 피롤 등이고, 적합한 치환기로는, 알킬, 아미노알킬, 알콕실, 아르알킬(예, 벤질), 아릴(예, 페닐) 및 헤테로아릴, 예컨대, 옥사질, 피페라질, 피리딜, 피롤릴의 치환 또는 비치환된 경우를 포함한다. 이러한 특정 예에서, Q는 M에 부착되지 않은 질소를 포함하며, 상기 질소는 이러한 치환기로 치환된다.
특정 예에서, 본 발명은 하기 구조를 가지는 화합물, 또는 그것의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체에 관한 것이다:
Figure 112006052222957-PCT00023
특정 예에서, 본 발명은 하기 구조를 가지는 화합물, 또는 그것의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체에 관한 것이다:
Figure 112006052222957-PCT00024
식II의 특정 예에서, 본 발명은 하기 식IIa의 구조를 가지는, 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 포함한 화합물을 제공한다:
(식IIa)
Figure 112006052222957-PCT00025
상기 식IIa에서,
W와 Z는 독립적으로 O 또는 NR''이고;
R'는 각 경우에 독립적으로, H, 저급 알킬 또는 알카리 또는 알카리 토금속 반대이온과 같은 금속 반대이온이고;
R''는 각 경우에 독립적으로 H 또는 저급알킬, 바람직하게는 H이고;
R5는 H, P(=O)(OR')2 또는 MnQ이고;
R6는 H, OH 또는 MnQ이고, 바람직하기로는 R5 및 R6 중 하나 또는 단지 하나만 H이고;
R7은 각 경우에 독립적으로 H, 할로겐, 메틸과 같은 저급 알킬 또는 메톡시와 같은 저급 알콕실이고;
M은 각 경우에 독립적으로 치환 또는 비치환된 메틸렌기(예, 저급 알킬, 옥소, 하이드록실 등으로 치환됨), NR'', O, S, S(O) 또는 S(O2)이고, 바람직하기로는 CH2이거나 W나 Q에 부착된 경우에는 CH2, S(O2), C(=S) 또는 C(=O)이고;
n은 1 내지 5의 정수이고, R5에 존재하는 경우에는 2 내지 4의 정수이고, R6에 존재하는 경우에는 1 내지 3의 정수이고; 및
Q는 질소 함유성 헤테로아릴 고리, 예컨대 피롤, 옥사졸, 이속사졸, 이미다졸 또는 피라졸; 3급 아미노 치환기, 예컨대 디알킬아민; 또는 모르폴린, 피페리딘, 피페라진 또는 피롤리딘과 같은 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로사이클이다.
특정 예에서, Q는 3급 아미노 치환기, 예컨대 디알킬 아민이다. 특정 예에서, Q는 모르폴린, 피페리딘, 피페라진 또는 피롤리딘과 같은 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로사이클이다. 특정 예에서, Q는 질소 함유성 헤테로아릴 고리, 3급 아미노 치환기, 또는 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로사이클이다.
특정 예에서, 식II의 구조를 가진 화합물은 식IIa의 구조를 가진 화합물을 포함하지 않는다.
식II 및 IIa로 표시되는 화합물의 예는 표 B에 기재된 화합물을 포함한다.
또한, 본 발명은 A3, A7 내지 A29, A31, A33 내지 A37, A40, A41, A44 내지 A47, A49, A51, A56, A57, A65, A69 내지 A82, C1, C2 및 C5로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 가진 화합물을 제공하며, 그것의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 포함한다. 특정 예에서, 본 발명은 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 포함한, A37 구조를 가지는 화합물을 제공한다.
대안적인 예에서, 본 발명은 화합물 A37의 대사산물의 분리된 프로드럭 또는 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다. 상기 예에서, 바람직하기로는 화합물 A68 또는 C5의 프로드럭 또는 약학적으로 허용가능한 염이다.
다른 예로, 본 발명은 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 포함한, B1 내지 B20, C1, C2 및 C5로부터 선택된 구조를 가지는 화합물을 제공한다. 바람직한 예에서, 본 발명은 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 포함한, B16 또는 C5의 구조를 가지는 화합물을 제공한다. 다른 예로, 본 발명은 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 포함한, B3의 구조를 가지는 화합물을 제공한다.
대안적인 예에서, 본 발명은 화합물 B16 대사산물의 분리된 프로드럭 또는 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다. 상기 예에서, 바람직하기로는 화합물 B3의 프로드럭 또는 약학적으로 허용가능한 염이다.
특정 예로, 본 발명은 식V의 구조를 가지는, 화합물, 또는 그것의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 제공한다.
(식V)
Figure 112006052222957-PCT00026
식V에서,
R8은 치환 또는 비치환된 헤테로사이클이고; 및
Q는 치환 또는 비치환된: 3급 아미노 치환기 또는 질소 함유성 헤테로사이클이다.
본 발명의 다른 예로, 표 C, D 및 E에 나타낸 화합물은 예시적인 것이며, 본 발명은 상기 표에 개시된 화합물의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 포함한다.
다른 예로, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 및 치료학적 유효량의 식I, II 또는 IIa의 화합물이나 C5와 같이 본 발명에 개시된 임의의 화합물이나 그것의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 포함하는, 신규한 약학적 조성물을 제공한다. 바람직한 예에서, 상기 약학적 조성물은 A1 내지 A82, B1 내지 B20 및 C1 내지 C5로부터 선택되는 화합물, 또는 그의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 치료학적 유효량으로 포함한다. 대안적인 예에서, 상기 약학적 조성물은 화합물 A37 또는 B16 대사산물의 프로드럭 또는 약학적으로 허용가능한 염을 치료학적 유효량으로 포함하며, 바람직하기로는 A68 또는 C5 구조를 가지는 대사산물의 프로드럭 또는 약학적으로 허용가능한 염을 치료학적 유효량으로 포함한다.
특정 예로, 본 발명은 본원에 기재된 1종 이상의 화합물을 정제형 또는 합성형으로 제공하는 것을 포함한다.
다른 예로, 본 발명은 식I, II 또는 IIa로 표시되는 화합물, 본원에 기재된 임으의 화합물 또는 그의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 치료학적 유효량으로 치료가 필요한 술주에게 투여하는 단계를 포함하는, 암, 그외 증식성 질환, 또는 하기 임의의 질병 또는 증상을 포함한 다른 질병의 신규한 치료 방법을 제공한다. 특정 예에서, 항암제 및 항증식제로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 식I, II 또는 IIa로 표시되는 화합물, 본원에 기재된 임으의 화합물 또는 그의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체와 공동(conjointly)으로 투여할 수 있다. 바람직한 예로, 상기 치료 방법은 A1 내지 A82, B1 내지 B20 및 C1 내지 C5로부터 선택된 화합물, 또는 그의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 치료학적 유효량으로 적정 투여하는 단계를 포함한다. 공동 투여는, 두가지 치료제를 하나의 조제물로 조합하여, 동시에 투여하거나, 또는 각각의 조제물 형태로 다른 시간대에 투여하거나, 또는 치료요법의 일부로서 환자에게 투여하는 치료법을 의미한다.
다른 예예에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 식I, II 또는 IIa로 표시되는 화합물, 본원에 기재된 임으의 화합물 또는 그의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체, 및 선택적으로 약학적 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법을 제공한다. 바람직한 예에서, 상기 약학적 조성물은 치료학적 유효량의 A1 내지 A82, B1 내지 B20 및 C1 내지 C5로부터 선택된 화합물, 또는 그의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체를 포함한다. 다른 예로, 상기 약학적 조성물은 치료학적 유효량의 화합물 A37 또는 B16 대사산물의 프로드럭 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함하며, 바람직하기로는 A68 또는 C5의 구조를 가지는 대사산물의 프로드럭 또는 약학적으로 허용가능한 염을 치료학적 유효량으로 포함한다.
다른 예로, 본 발명의 약학적 조성물은 암과 같은 질병, 및 그외 증식성 또는 하기 임의의 질병 또는 증상을 포함한 질병 치료에 유용하다.
본 발명의 특정 예로, 치환된 기를 사용하는 경우, 적합한 치환기로는, 예컨대 할로겐, 하이드록실, 카르보닐(예, 케톤, 알데하이드, 카르복실, 에스테르, 아실), 티오카르보닐(예, 티오에스테르, 티오아세테이트, 티오포르메이트), 알콕실, 포스포릴(예, 포스포네이트, 포스피네이트), 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 아미노, 아미노-알킬, 아미도, 아미딘, 이민, 시아노, 니트로, 아지도, 설프하이드릴, 알킬티오, 에테르, -CF3, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 알콕실, 실릴, 설포닐(예, 설페이트, 설폰아미도, 설파모일, 설포네이트), 헤테로사이클릴, 아르알킬(예, 벤질), 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티(예, 페닐, 옥사질, 피페라질, 피리딜, 피릴)을 포함할 수 잇다. 이들 치환기들은 치환되거나 치환되지 않을 수 있다.
ii. 정의
본원에서, 하기 용어 및 표현은 지정된 의미를 가진다. 본 발명의 화합물은 비대칭적으로 치환된 탄소 원자를 포함할 수 있으며, 선택적으로 활성인 또는 라세믹 형태로 분리될 수 있다. 라세믹 형태의 분리에 의한 또는 선택적으로 활성인 출발 물질로부터의 합성에 의한, 선택적 활성형의 제조 방법이 당업계에 공지되어있다. 구체적인 입체화학 또는 이성질체 형태가 명확하게 기재되어있지 않다면, 구조의 모든 키랄형, 부분입체 이성질체형, 라세믹형 및 모든 기하 이성질체형을 의미한다. 본 발명의 화합물 및 본 발명에서 제조되는 중간산물를 제조하기 위해 사용되는 모든 과정은, 본 발명의 일부인 것으로 간주된다.
본 발명은 본 발명의 화합물상에 나타나는 모든 동위원소 화합물을 포함한다. 동위원소는 원자 번호는 동일하지만 질량이 상이한 원자이다. 일반적이고 비제한적인 예로서, 수소의 동위원소는 삼중수소 및 중수소가 있으며, 탄소의 동원원소는 12C 및 14C가 있다.
용어 "알킬"은 명시된 갯수의 탄소 원자를 가지는, 분지형 및 직쇄형의 포화 지방족 탄화수소기를 포함한다. 알킬의 예로는, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, t-부틸, n-펜틸 및 s-펜틸이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 용어는 비치환 및 치환된 알킬기를 모두 포함하며, 치환된 알킬기는 비제한적으로 할로겐, 하이드록실, 카르보닐, 알콕시, 에스테르, 에테르, 시아노, 포스포릴, 아미노, 이미노, 아미도, 설프하이드릴, 알키티오, 티오에스테르, 설포닐, 니트로, 헤테로사이클로, 아릴 또는 헤테로아릴로 치환된 하나 이상의 하이드로겐 치환기를 가지고 있는 알킬 모이어티이다. 또한, 당업자는 치환된 모이어티를 그 자체로 적절하게 치환할 수 있음을 이해할 것이다. 용어 "저급 알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 가지고 있는 알킬기로, 바람직하기로는 1 내지 4개의 탄소 원자를 가지고 있는 알킬기이며, 용어 "저급 알콕시"은 산소 원자가 결합된 상기 저급 알킬기를 의미한다. 특정 예에서, 알킬 치환기는 바람직하기로는 저급 알킬 치환기이다.
용어 "할로" 또는 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 의미한다.
용어 "아릴"은 페닐, 인다닐 또는 나프틸로 한정되지 않는 방향족 모이어티이다.
용어 "사이클로알킬" 및 "바이사이클로알킬"은 포화 또는 일부 포화될 수 있는, 모든 안정한 고리 시스템을 의미한다. 그 예로는, 사이클로프로필, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 노르보르닐, 바이스리클로[2 2]노난, 아다만틸 또는 테트라하이드로나프틸(테트랄린)가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본원에서, "카르보사이클" 또는 "카르보사이클릭 잔기"는 모든 안정한 3원 내지 7원 모노사이클 또는 바이사이클, 또는 7원 내지 13원 바이사이클 또는 트리사이클을 의미하며, 이들은 포화, 일부 불포화된 것이거나 또는 방향족일 수 있다. 상기 카르보사이클의 예로는, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 아다만틸, 사이클로옥틸, [3.0]바이사이클로옥탄, [4.0]바이사이클로노난, [4.0]바이사이클로데탄(데칼린), [2.2]바이사이클로옥탄, 플루오레닐, 페닐, 나프틸, 인다닐, 아다만틸 또는 테트라하이드로나프틸(테트라린)이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본원에서, 용어 "헤테로사이클" 또는 "헤테로사이클 시스템"은 안정한 포화, 일부 불포화 또는 불포화(방향족/헤테로아릴)된 5 내지 7원 모노사이클 또는 바이사이클이거나, 또는 7원 내지 10원 바이사이클 헤테로사이클 고리를 의미하며, 이는 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자와 탄소 원자로 이루어지며, 상기에서 정의된 헤테로사이클 고리가 벤젠 고리에 융합된 임의의 바이사이클기를 포함한다. 질소 및 황 헤테로원자는 선택적으로 산화될 수 있다. 헤테로사이클 고리는 안정한 구조를 형성하는 임의의 이종원자나 탄소 원자에서 그것의 측쇄기(pendant group)에 결합될 수 있다. 헤테로사이클 고리는 제조되는 화합물인 안정적인 경우에 탄소 또는 질소 원자상에서 치환될 수 있다. 특별히 언급된 경우에, 헤테로사이클의 질소는 선택적으로 4급화(quaternized)될 수 있다. 특정 예에서, 헤테로사이클내 S와 O 원자의 총 갯수가 1을 초과하는 경우에, 이러한 이종원자들은 서로 인접할 필요가 없다. 헤테로사이클내 S 원자의 총 갯수는 바람직하기로는 1 이하이다. 본원에서, 용어 "방향족 헤테로사이클 시스템"은 탄소 원자와 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 이종원자로 구성된, 안정한 5원 내지 7원의 모노사이클 또는 바이사이클, 또는 7원 내지 10원의 바이사이클 헤테로사이클 방향족 고리를 의미한다. 방향족 헤테로사이클내 S와 O 원자의 총 수는 바람직하기로는 1 이하이다. 헤테로사이클의 예로는, 1H-인다졸, 2-피롤리도닐, 2H16H 디티아지닐, 2H-피롤릴, 3H-인돌릴, 4-피페리도닐, 4aH-카르바졸, 4H-퀴놀리지닐, 6H-1,2,5-티아디아지닐, 아크리디닐, 아조시닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조퓨라닐, 벤조티오퓨라닐, 벤조티오페닐, 벤조옥사졸릴, 벤즈티아졸릴, 벤즈트리아졸릴, 벤즈테트라졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤즈이소티아졸릴, 벤즈이미다잘로닐, 카르바졸릴, 4aH-카르바졸릴, P-카르보리닐, 크로마닐, 크로메닐, 시놀리닐, 데카하이드로퀴놀리닐, 2H,6H 디티아지닐, 디하이드로퓨로[2,3-b]테트라하이드로퓨란, 퓨라닐, 퓨라자닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸릴, 1H-인다졸릴, 인돌레닐, 인돌리닐, 인돌리지닐, 인돌릴, 이소벤조퓨라닐, 이소크로마닐, 이소인다졸릴, 이소인도리닐, 이소인돌릴, 이소퀴놀리닐, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 모르폴리닐, 나프티리디닐, 옥타하이드로이소퀴놀리닐, 옥사디아졸릴, 1,2,3-옥사디아졸릴, 1,2,4-옥사디아졸릴, 1,2,5-옥사디아졸릴, 1,3,4-옥사디아졸릴, 옥사졸리디닐, 옥사졸릴, 옥사졸리디닐페리미디닐, 페난트리디닐, 페난트롤리닐, 페나르사지닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사티닐, 페녹사지닐, 프탈라지닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 프테리디닐, 피페리도닐, 4-피페리도닐, 프테리디닐, 퓨리닐, 피라닐, 피라지닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리도옥사졸, 피리도이미다졸, 피리도티아졸, 피리디닐, 피리딜, 피리이미디닐, 피롤리디닐, 피롤리닐, 피롤릴, 퀸나돌리닐, 퀴놀리닐, 4H-퀴놀리지닐, 퀴녹살리닐, 퀴뉴클리디닐, 카르볼리닐, 테트라하이드로퓨라닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 테트라하이드로퀴놀린닐, 6H-1,2,5-티아디아지닐, 1,2,3-티아디아졸릴, 1,2,4-티아디아졸릴, 1,2,5-티아디아졸릴, 1,3,4-티아디아졸릴, 티안트레닐, 티아졸릴, 티에닐, 티에노티아졸릴, 티에노옥사졸릴, 티에노이미다졸릴, 티오페닐, 트리아지닐, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 1,2,5-트리아졸릴, 1,3,4-트리아졸릴, 잔테닐이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 바람직한 헤테로사이클로는, 피리디닐, 퓨라닐, 티에닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 1H-임다졸릴, 옥사졸리디닐, 벤조트리아졸릴, 벤즈이속사졸릴, 옥신돌릴, 벤즈옥사졸리닐, 또는 이사티노일이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 또한, 융합된 고리 및 예컨대 상기 헤테로사이클을 포함하고 있는 스피로 화합물(spiro compound)이 포함된다.
본원에서, "약학적으로 허용가능한 염"은 모체 화합물이 산 또는 염기성 염의 제조에 의해 변형된 개시된 화합물의 유도체이다. 약학적으로 허용가능한 염의 예로는, 아민과 같은 염기 잔기의 미네랄 또는 유기산 염; 카르복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염 등가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 약학적으로 허용가능한 염은 무독성 무기 또는 유기산으로부터 형성된 모체 화합물의 일반적인 무독성 염 또는 4급 암모늄 염을 포함한다.
예컨대, 이러한 일반적인 무독성 염으로는, 염산, 브롬산, 황산, 설팜산, 인산, 질산 등과 같은 무기산으로부터 유래된 것; 및 아세트산, 프로피오닌산, 숙신산, 글리콜산, 스테아린산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 파모익산, 말레산, 하이드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 설파닐산, 2-아세톡시벤조산, 퓨마르산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 에탄 디설폰산, 옥살산, 이세티온산 등과 같은 유기산으로부터 제조된 염이 있다.
본 발명의 약학적으로 허용가능한 염은 일반적인 화학적인 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모체 화합물로부터 합성할 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이들 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물, 유기 용매 또는 이 둘의 혼합물 중에서 화학론량의 적정 염기 또는 산을 반응시켜, 제조할 수 있으며, 일반적으로 비수성 매질계 에테르, EtOAc, 에탄올, 이소프로판올, 또는 아세토니트릴이 바람직하다. 적합한 염의 목록은 Remington's Pharmaceutical Science, 18th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990, P.1445에서 볼 수 있으며, 이는 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
표현 "약학적으로 허용가능한"은 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 그외 문제점, 또는 효과/위험도의 비가 적당한 그외 문제점 또는 합병증이 없는 인간과 동물의 조직과 접촉 상태로 사용하기에 적합한, 의학적인 판단 범위내에 속하는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 언급할때 사용된다.
"프로드럭"은 프로드럭이 포유류 개체에 투여되었을때 생체내에서 본 발명의 활성형의 모체 약물을 방출시키는 공유 결합된 임의의 담체를 포함하는 것으로 의도된다. 프로드럭은 약제의 여러가지 바람직한 특성(즉, 용해성, 생체이용성, 제조성 등)을 증강시키는 것으로 공지되어 있어, 본 발명의 화합물은 프로드럭 형태로 전달될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 청구된 화합물의 프로드럭, 이의 전달 방법 및 이를 포함하는 조성물을 포괄하는 것으로 의도된다. 본 발명의 프로드럭은 화합물의 관능기를 변형시킴으로써 제조되며, 변형은 모체 화합물에서 일반적인 조작으로 또는 생체내에서 절단되어진다. 프로드럭은 하이드록시, 아미노 또는 설프하이드릴 기가 본 발명의 프로드럭이 포유류 개체에 투여되었을때, 절단되어 각각 자유 하이드록실, 자유 아미노 또는 자유 설프하이드릴 기를 형성하는 임의의 기에 결합된, 본 발명의 화합물을 포함한다. 프로드럭의 예로는, 아세테이트, 포르메이트 및 본 발명의 화합물의 알코올과 아민 관능기의 벤조에이트 유도체들을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다.
용어 "순수한" 또는 "정제된"은 지칭된 분자가 다른 유기 분자, 특히 분해 경로의 부산물 또는 산물과 같은 불순물이 실질적으로 없는 상태로 존재하는 것을 의미한다. 특정 예에서, "순수한" 또는 "정제된" 화합물의 건조 중량은 조성물(화합물의 약학적 조제물내에 존재할 수 있는 물, 완충액, 부형제 및 분자 등을 제외함)에 대하여 80% 이상, 더 바람직하기로는 95-99%, 가장 바람직하기로는 99.8%이다.
"치환된"은 "치환된"으로 표현된 지칭된 원자상에 존재하는 하나 이상의 수소가 지정된 원자의 정상 원자가를 초과하지 않으며 치환으로 안정한 화합물을 형성시키는 지정된 기(들)로부터 선택된 것으로 대체되는 것을 나타낸다. 치환기가 케토 또는 옥소(즉, =O)기이면 원자상의 2개의 수소가 치환된다. 케토/옥소 치환기는 방향족 모이어티상에 존재하지 않는다. 치환기의 예로는, 알킬, 퍼플루오로알킬(트리플루오로메틸), 할로겐, 하이드록실, 카르보닐(예, 카르복실, 알콕시카르보닐, 포르밀 또는 아실), 티오카르보닐(예, 티오에스테르, 이오아세테이트 또는 티오포르메이트), 알콕실, 포르소릴, 포스페이트, 포스포네이트, 포스피네이트, 아미노, 아미도, 아미딘, 이민, 시아노, 니트로, 아지도, 설프하이드릴, 알킬티오, 설페이트, 설포네이트, 설파모일, 설폰아미도, 설포닐, 카르보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아르알킬, 헤테로아르알킬 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 헤테로사이클릴, 아릴, 알킬 등과 같은 치환기가 적절한 경우에 치환될 수 있음을 당업자는 숙지할 것이다
본 발명에 따른 화합물의 "치료학적 유효량"은 사이클린 의존적 키나제로서 알려진 효소 클래스를 저해시키거나 또는 암, 그외 증식성 질환이나 다른 질병의 증상을 치료하는데 효과적인 함량을 의미한다.
본원에서, 용어 "항암" 또는 "항증식"제는 알트레타민, 부술판, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 메클로레타민, 멜팔란, 티오테파, 클라드리빈, 플루오로우라실, 플록스우리딘, 겜시타빈, 티오구아닌, 펜토스타틴, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 시타라빈, 카르무스틴, 로무스틴, 스트렙토조토신, 카르보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 이프로플라틴, 테트라플라틴, 로바플라틴, JM216, JM335, 플루다라빈, 아미노글루테티미드, 플루타미드, 고세렐린, 루프롤리드, 메게스트롤 아세테이트, 시프로테론 아세테이트, 타목시펜, 아나스트로졸, 바이칼루타미드, 덱사메타손, 디에틸스틸베스트롤, 프레드니손, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독시루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 로속산트론, 미토마이신-c, 플리카미신, 파틀리탁셀, 독세탁셀, 토포테칸, 이리노테칸, 9-아미노 캄프토테칸, 9-니트로 캄프토테칸, GS-211, JM 118, 에토포시드, 테니포시드, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 프로카르바진, 아스파라기나제, 페가스파라가제, 옥트레오티드, 에스트라무스틴 및 하이드록시유레아를 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다.
iii. 투여량 및 제형
본 발명의 사이클린 의존적 키나제는 포유류의 체내에서 활성 물질을 물질이 작용하는 부위와 접촉시키는 모든 수단에 의해 암, 증식성 질환 또는 그외 질환의 치료제로서 투여할 수 있다. 이는 개별적인 치료제로서 또는 치료제의 조합 형태로, 약제와 병행하여 이용가능한 모든 일반적인 수단에 의해 투여할 수 있다. 본 발명에 기재된 저해제의 화학적 특징은 화합물에 이로운 용해 특징을 부여하여 정맥 제형, 국소 제형, 경구 제형 및 그외 하기 제형으로서 투여하기에 적합하다. 이는 단독으로 투여할 수 있지만, 바람직하기로는 선택된 투여 경로와 표준적인 약학 실무를 근간으로 선택한 약학적 담체와 함께 부여할 수 있다. 적합한 비히클과 그 제형은 예컨대 Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, Easton, Pa. , USA 1985에 개시되어 있다.
본 발명의 다른 측면은, 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체(첨가제) 및/또는 희석제와 함계 제형화된, 전술한 본 발명의 대상 화합물 1종 이상을 유효량으로 포함하는 약학적으로 허용가능한 조성물을 제공한다.
하기에서 구체적으로 설명한 바와 같이, 본 발명의 약학적 조성물은 (1) 경구 투여, 예컨대 물약(drenches)(수계 또는 비수계 용액 또는 현탁액), 정제, 볼루스, 분말, 과립, 혀에 적용하는 페이스트); (2) 비경구 투여, 예컨대 멸균 용액이나 현탁액으로서 피하, 정맥내, 또는 근육내 주사에 의한 투여); (3) 국소 적용, 예컨대 피부에 적용되는 크림, 연고 또는 스프레이로서; 또는 (4) 예컨대 페서리, 크림 또는 폼으로서의 질내 또는 직장내용으로 고안한 것을 포함한, 고형 또는 액체 형태로 투여하기 위해 특히 제형화될 수 있다. 특정 예에서, 상기 약학적 조제물은 비발열성, 즉 환자의 체온을 증가시킬지 않는 것일 수 있다.
습윤제, 유화제 및 소듐 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제 뿐만 아니라 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 향미제, 보존제 및 항산화제를 상기 조성물내에 존재시킬 수 있다.
약학적으로 허용가능한 항산화제의 예로는: (1) 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 바이설페이트, 소듐 메타바이설피트, 소듐 설피트 등과 같은 수용성 항산화제; (2) 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시아니졸(BHA), 부틸화된 하이드록시톨로엔(BHT), 렉시틴, 프로필 갈레이트, 알프-토코페롤 등과 같은 지용성 항산화제; 및 (3) 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 포스포르산 등과 같은 금속 킬레이트제를 포함한다.
투여되는 용량은 특정 물질의 약 역학적 특징, 그것의 모드 및 투여 경로; 수여체의 나이, 건강 상태 및 체중; 증상의 특징과 정도; 병용 치료의 유형; 치료 횟수; 및 원하는 효과와 같이 공지된 인자에 따라 변경될 수 있음은 자명하다. 활성 성분의 1일 투여량은 체중 1 kg당 약 0.001 내지 약 1000 mg일 것으로 예상할 수 잇으며, 바람직하기로는 약 0.1 내지 약 30 mg/kg이다.
투여하기에 적합한 조성물의 투여 형태는, 활성 성분을 1 단위당 1 mg 내지 약 100 mg 포함한다. 이러한 약학적 조성물에서, 활성 성분은 조성물의 총 함량에 대하여 약 0.95 중량%으로 존재할 수 있다. 활성 성분은 캡슐, 정제 및 분말과 같은 고형 투여 형태로 또는 엘리시르, 시럽 및 현탁액과 같은 액체 투여 형채로 경구 투여될 수 있다. 또한, 이는 멸균액 투여 형태로 비경구 투여될 수 있다.
본 발명의 제형은 경구, 코, 국부(볼 및 설하 포함), 직장, 질 및/또는 비경구 투여에 적합한 제형을 포함한다. 제형은 단위 투여 형태로 일반적으로 존재할 수 있으며, 약학 분야에 공지된 모든 방법으로 제조할 수 있다. 담체 물질과 조합하여 단일 투여 형태를 이루는 활성 성분의 함량은, 처리되는 숙주와 특정 투여 모드에 따라 변경될 것이다. 담체 물질과 조합하여 단일 투여 형태를 이루는 활성 성분의 함량은, 일반적으로 치료 효과를 발생시키는 저해제의 함량일 것이다. 일반적으로, 활성 성분의 함량은 100%중에서 약 1% 내지 약 99%, 약 5% 내지 약 70%, 가장 바람직하기로는 약 10% 내지 30%일 것이다.
이러한 제형이나 조성물을 제조하는 방법은 본 발명의 화합물을 담체와, 선택적으로는 하나 이상의 보조 성분과 조합(association)시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 본 발명의 저해제와 액체 담체, 또는 미분된 고형 담체, 또는 둘다와 균일하고 친밀하게 조합시키고, 필요한 경우 산물을 형성함으로써 제조된다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 제형은 캡슐, 사케트(cachet), 환, 정제, 로젠제(향 베이스를 이용, 일반적으로 슈크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트), 분말, 과립 또는 용액으로서, 또는 수계 또는 비수계 액체 중의 현탁액, 또는 유중수형이나 수중유형의 액체 에멀젼으로서, 또는 엘리시르나 시럽, 또는 파스틸제(pastille)(젤라진 및 글리세린, 또는 슈크로스 및 아카시아와 같은 불활성 기제를 이용), 및/또는 구강 세척제 등의 형태일 수 있으며, 각각은 활성 성분으로서 본 발명의 화합물의 미리 결정된 함량으로 포함한다. 또한, 본 발명의 저해제는 볼루스, 연약(electuary) 또는 페이스트(paste)로서 제공될 수 있다.
경구 투여를 위한 본 발명의 고형 투여 형태(캡슐제, 정제, 환제, 드래그제, 분말, 과립제 등)에 있어서, 활성 성분은 소듐 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트와 같은 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 및/또는 (1) 전분, 락토스, 슈크로스, 글루코스, 만니톨 및/또는 실릭산과 같은 중진제 또는 확장제; (2) 예컨대 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 슈크로스 및/또는 아카시아와 같은 결합제; (3) 글리세롤과 같은 휴멕턴트(humectant); (4) 아가-아가, 칼슘 카르보네이트, 감자 전분, 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트, 및 소듐 카르보네이트와 같은 붕괴제; (5) 파라핀과 같은 해리 지연제(solution retarding agent); (6) 4급 암모늄 화합물과 같은 흡수 가속화제; (7) 예컨대 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 습윤제; (8) 카올린 및 벤토나이트 클레이와 같은 흡착제; (9) 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고상 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트 및 이의 혼합과 같은 윤활제; 및 (10) 착색제 등 중 임의의 것과 혼합한다. 캡슐제, 정제 및 환제의 경우, 약학적 조성물은 또한 완충화제를 포함할 수 있다. 또한, 유사한 유형의 고형 조성물을, 락토스 또는 우유당과 같은 부형제 뿐만 아니라 고분자량의 폴리에틸렌 글리콜 등을 이용한 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐내에 충진제로서 사용할 수 있다.
정제는 선택적으로 하나 이상의 보조 성분과 함께 압착 또는 성형에 의해 제조할 수 있다. 압착된 정제는 결합제(예, 젤라틴 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로스), 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 붕괴제(예, 소듐 전분 글리콜레이트 또는 가교 결합된 소듐 카르복시메틸 셀룰로스), 표면 활성 또는 분산제를 이용하여 제조할 수 있다. 성형된 정제는 불활성 액체 희석제로 가습화된 저해제 분말 혼합물을 적정 장치내에서 성형함으로써 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 정제 또는 그외 고형 투여 형태, 예컨대 드래그제, 캡슐제, 환제 또는 과립제는, 선택적으로 표시되거나, 또는 약-제형화 분야에서 공지된 장 코팅제 또는 그외 코팅제와 같은 코딩제 및 셀(shell)을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 이는 활성 성분의 서방성 또는 조절성 방출을 제공하기 위하여 예컨대, 원하는 방출 양상을 제공하기 위한 여러가지 비율의 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 다른 폴리머 기질, 리포좀 및/또는 미세구를 이용하여 제조할 수 있다. 이는 예컨대 박테리아 제거 필터(bacteria- retaining filter)를 통한 여과, 멸균수에 용해될 수 있는 멸균 고형 조성물 형태에 멸균화제의 병합에 의해, 또는 사용하기 바로 전에 다른 멸균성 주사용 매질에 의해 멸균화될 수 있다. 또한, 이들 조성물은 선택적으로 불투명화제를 포함할 수 있으며, 활성 성분을 선택적으로 지연된 양상으로 위장관의 특정 부위에서만 또는 상기 부위에서 선호적으로 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 함침성 조성물의 예로는, 폴리머성 기질과 왁스가 있다. 또한, 활성 성분은 적절한 경우에는 전술한 하나 이상의 부형제와 함께 미세-캡슐화된 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 경구 투여용 액체 투여 형태는, 약학적으로 허용가능한 에멀젼, 미세에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘리시르를 포함한다. 활성 성분 뿐만 아니라, 상기 액체 투여 형태는 예컨대 물 또는 용매와 같이 당업계에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일(특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배유, 올리브유, 카스토르유 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로퓨릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄의 지방산 에스테르 및 이들의 혼합과 같은 가용화제 및 에멀젼화제를 포함할 수 있다.
불활성 희석제 외에도, 또한, 경구 조성물은 습윤제, 유화 및 현탁제, 감미제, 향미료, 착색제, 향료 및 보존제와 같은 보강제를 포함할 수 있다.
본 발명의 활성 저해제 이외에도 현탁액은 현탁화제, 예컨대 에톡시화된 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정 셀룰로스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸트 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 직장 또는 질 투여용 제형은, 좌제로서 존재될 수 있으며, 이는 본 발명에 따른 1종 이상의 화합물과 예컨대 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 좌제 왁스 또는 살리실레이트를 포함하는 1종이성의 적합한 무자극성 부형제나 담체를 혼합하여 제조할 수 있으며, 이는 실온에서는 고형이지만 체온에서는 액체로 존재하여, 직장이나 질강에서 녹아 활성 저해제를 방출할 수 있을 것이다.
또한, 본 발명의 질 투여용 제형은 당업계에서 적절한 것으로 공지된 담체를 포함하는 페서리, 탐폰, 크림, 젤, 페이스트, 폼(form) 또는 스프레이 제형이다.
본 발명의 국소 또는 진피 투여용 투여 형태는, 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 용액, 패티 및 흡입제이다. 활성 화합물은 약학적으로 허용가능한 담체와, 그리고 보존제, 완충제 또는 필요할 수 있는 추진제(propellant)를 멸균 조건하에서 혼합할 수 있다.
연고, 페이스트, 크림 및 젤은 활성 프레닐트랜스퍼라제(prenyltransferase) 저해제 뿐만 아니라, 동식물성 지방, 오일, 옥스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실릭산, 탈크 및 아연 산화물 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
분말 또는 스프레이는, 본 발명의 화합물 이외에도, 락토스, 탈크, ㅅ실릭산, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 분말 또는 이들의 혼합물과 같은 부형제를 포함할 수 있다. 스프레이는 또한 클로로플루오로하이드로카본와 같은 통상적인 추진제와 부탄 및 프로판과 같은 휘발성 비치환된 탄화수소를 더 포함할 수 있다.
경피 패치는 신체에 대한 본 발명의 화합물의 조절성 전달을 제공하는 장점을 가지고 있다. 이러한 투여 형태는 적절한 매질중에 본 발명이 저해제를 용해 또는 분산시켜 제조할 수 있다. 또한, 흡착 증강제를 사용하여 약물의 피부를 통한 유입을 증가시킬 수 있다. 유입 속도는 속도 조절성 막을 제공하거나 또는 폴리머 기질이나 젤내에 본 발명의 화합물을 분산시켜, 조절할 수 있다.
눈 제형, 눈 연고, 분말, 용액 등도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 비경구 투여에 적합한 약학적 조성물은, 1종 이상의 본 발명에 다른 저해제를 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 멸균 등장성 수계 또는 비수계 용액, 분산액, 현탁액, 에멀젼, 또는 사용하기 바로 전에 멸균된 주사용 용액이나 분산액으로 재구성할 수 있는 멸균 분말과 조합하여 포함하며, 이는 항산화제, 완충제, 세균발육억제제(bacteriostat), 수여체의 혈액과 등장성을 형성하는 용질, 현탁제 또는 증점제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 사용할 수 있는 적합한 수계 및 비수계 담체의 예로는, 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적절한 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 오일 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르가 있다. 예컨대, 렉시틴과 같은 코딩 물질을 이용함으로써, 분산액의 경우에 필수적인 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성을 유지시킬 수 있다.
또한, 이들 조성물은 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보강제를 포함할 수 있다. 미생물의 방지 작용은 다양한 항균제 및 항진균제, 예컨대 파라빈, 클로로부타놀, 페놀 소르브산 등을 포함함으로써 이룰 수 있다. 또한, 당, 소듐 클로라이드 등과 같은 등장제를 상기 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 물질을 포함시킴으로써, 주사용 약학적 조성물의 흡수를 연장시킬 수 있다.
일부의 경우들에서, 치료제의 치료학적 효과를 연장시키기 위해, 피하 또는 근육내 주사로부터 저해제의 흡수를 지연시키는 것이 바람직하다. 이는, 수용성이 불량한 결정형 또는 비결정형 물질의 액체 현탁액을 이용하여 이룰 수 있다. 이후의 저해제의 흡수 속도는 결정의 크기 및 결정 형태에 의존적일 수 있는 용해 속도에 따라 결정된다. 대안적으로, 비경구 투여되는 저해제의 흡수 지연 형태는 오일 비히클에 상기 저해제를 용해 또는 현탁시킴으로써 이룰 수 있다.
주사용 디포트 형태는 폴리락티드-폴리글리콜리드와 같은 생분해성 폴리머 중에 대상 저해제의 미세캡슐화된 기질을 제조합으로써, 만든다. 약물대 폴리머의 비율과 사용하는 폴리머의 특성에 따라, 약물 방출 속도를 조절할 수 있다. 다른 생분해성 폴리머의 예로는, 폴리(오르소에스테르) 및 폴리(무수화물)이 있다. 또한, 주사용 디포트 형태는 신체 조직에 친화적인 리포좀이나 미세에멸젼내에 약물을 포획시킴으로써 제조된다.
본 발명의 화합물을 약제로서 인간과 동물에게 투여하는 경우, 그 자체로, 또는 약학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 0.1 내지 99.5%(더 바람직하기로는 0.5 내지 90%)의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물로서 제공할 수 있다.
본 발명의 조제물은 경구로, 비경구로, 국소로 또는 직장으로 제공될 수 있다. 이는 각 투여 경로에 적합한 형태로 제공된다. 예컨대, 이는 정제 또는 캡슐 형태로, 주사에 의해, 주사, 주입 또는 흡입에 의한 흡입, 눈 로션, 연고, 좌제 투여; 로션 또는 연고에 의한 국소 및 좌제에 의한 직장 투여로 투여된다. 경구 투여가 바람직하다.
표면 "비경구 투여(parenteral administration)" 및 "비경구로 투여된(administered parenterally)"은 장 및 국소 투여 이외의 일반적인 주사에 의한 투여 방식을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내(intrathecal), 관절낭내(intracapsular), 안와내(intraorbital), 심장내, 진피내, 복막내, 경기관내(transtracheal), 피하, 각피하(subcuticular), 관절내(intraarticular), 피막하(subcapsular), 지주막하(subarachnoid), 척수내(intraspinal) 및 흉골내(intrasternal) 주사 및 주입이 있다.
표현 "전신 투여", "전신으로 투여된", "말초 투여" 및 "말초로 투여된"은 화에 물, 약물 또는 그외 물질이 환자의 시스템에 들어가 대사과정 및 그외 유사 과정을 거치는, 예컨대 중추 신경계로 직접 인가되는 방식 이외의 투여, 예컨대 피하 투여를 의미한다.
선택한 투여 경로와는 무관하게, 본 발명의 대상으로 사용가능한 CDK 저해제는 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있으며/있거나, 본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 공지된 일반적인 방법으로 약학적으로 허용가능한 투여 형태로 제형화된다.
젤라틴 캡슐은 활성 성분과 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등의 분말 담체를 함유한다. 유사한 희석제는 압착 정제 제조에 사용할 수 있다. 정제와 캡슐제는 수시간에 걸쳐 의약제의 연속적인 방출을 제공하기 위해, 서방형 제품으로서 제조될 수 있다. 압착 정제는 불괘한 기호를 숨기고 대기나 위장관에서 선별적으로 붕괴되기 위한 장 코팅된 정제를 보호하기 위해, 당-코딩되거나 또는 필름-코딩될 수 있다. 또한, 유사한 유형의 고형 조성물을 연질 및 경질 충진성 젤라틴 캡슐제의 충질제로서 사용할 수 있으며, 바람직한 물질로는 락토스, 우유당 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜이 있다. 바람직한 제형은 연질 젤라틴 캡슐내의 오일, 예컨대 올리브 오일, 미글올(Miglyol) 또는 캅물(capmul) 중의 용액 또는 형탁액이다. 항산화제를 첨가하여 장기간 분해를 적절히 방지할 수 있다.
경구 투여용 액체 투여 형태는 환자 수용성을 증가시키기 위해 착색제 및 향미제를 포함할 수 있다. 애개, 무, 적합한 오일, 염수, 에탄올, 수성 엑스트로스(포도당) 및 관련 당 용액, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜 또는 이들의 혼합물은, 비경구용 용액제에 적합한 담체이다.
정맥내 투여에 있어서, 전술한 화합물은 염 형태 또는 자유 형태로, 생리학적 완충액 또는 멸균수내의 활성 성분의 멸균 용액으로서 제형화될 수 있다. 당을 함유하고 있는 단체 액체(예, 링거 락테이트 또는 그외 포도당이나 덱스트로스 용액)을 바람직한 경우에 사용할 수 있으나, 총 당 함량 당이 유산증(lactic acidosis)을 유발하지 않는 수준이여야 한다. 정맥내 투여는 볼로스 주사(바람직하기로는 1일 수차례), 또는 지속된 시간동안의 연속적인 주입에 의해 이루어질 수 있다. 볼러스 주사 또는 주입을 위한 바람직한 총 투여량은 환자의 신체 상태에 따라 실질적으로 변경될 수 있으며, 일반적으로 약 25 mg/kg 내지 약 250 mg/kg일 것이다.
비경구 투여용 용액은 바람직하기로는 활성 성분의 수용성 염, 적정 안정화제와 필요에 따라 완충제를 함유한다. 적합한 안정화제는 소듐 바이설피트, 소듐 설피트 또는 아스코르브산과 같은 항산화제의 단독 형태 또는 조합 형태이다. 또한, 시트르산 및 그것의 염과, 소듐 EDTA가 사용된다. 또한, 비경구 용액은 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-파라빈 또는 프로필-파라빈 및 클로로부탄올과 같은 보존제를 함유할 수 있다. 적합한 약학적 담체는 본 분야에서 표준적인 참고문헌인 Remington's Pharmaceutical Science, 18th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990에 기술되어 있으며, 이는 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
표 A, B 및/C의 화합물을 이용한 제형, 용액 및 그외 조제물은 PCT 출원 WO 03/033499 및/또는 WO 04/092139에 개시된 바에 따라 제조할 수 있으며, 이는 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
iv. 치료학적 활용
일반적으로 CDK의 세포 증식 조절에 있어서의 중요한 기능으로 인해, 본 발명의 화합물은 암, 양성 전립선 비대증, 가족성 용종증( familial adenomatosis polyposis), 신경 섬유종, 건선, 진균 감염, 내독성 쇼크, 비후성 반흔 형성(hypertrophic scar formation), 염증성 대장 질환, 이식 거부 반응, 죽상동맥경화, 건선, 폐 섬유종, 관절염, 사구체 신염, 혈관 형성술(angioplasty) 또는 혈관 수술이후의 재협착증 및 다른 수술후 협착증과 관련된 혈관 평활근 세포 증식 및 재협착증을 포함한, 과다증식성 질환과 같은 비정상적인 세포 증식을 특징으로 하는 모든 질병 진행을 치료하는데 유용할 수 있는 가역적 세포증식 억제제로서 사용할 수 있다. 그 예로 미국 특허 6,114,365 및 6,107,305를 참조한다.
본 발명에 개시된 화합물들은 암, 자가면역 질환, 바이러스 질환, 진균성 질환, 신경퇴행성 질환 및 심혈관 질환과 같은 증식성 또는 과다증식성 질환의 치료용으로서 유용할 것으로 예상된다.
보다 구체적으로, 본 발명에 개시된 화합물은 이하 질환을 (비제한적으로) 포함한, 다양한 암 치료에 이용가능하다: 방광암, 유방암, 직장암, 신장암, 간암, 소세포 폐 암을 포함한 폐의 암, 식도암, 담낭 암, 난소 암, 췌장 암, 위 암, 목 암, 갑상선 암, 전립선 암 및 편형상피세포암을 포함한 피부 암과 같은 암종; 백혈구, 급성 림프성 백혈병, 급성 림프성모구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨스 림프종, 비호지킨스 림프종, 모발상세포 림프종( hairy cell lymphoma) 및 버켓트 림프종을 포함한 림프계 조혈성 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 및 전골수구성 백혈병(promyelocytic leukemia)을 포함한 골수계 조혈 종양; 섬유육종 및 횡문근육종을 포함한 간엽조직 기원(mesenchymal origin)의 종양; 성상세포종(astrocytoma), 신경모세포종, 신경교종 및 신경초종을 포함한 중추 및 말초 신경계의 종양; 및 흑색종, 정상피종(seminoma), 기형암종(teratocarcinoma), 골육종, 색소성 피부건조증(xenoderoma pigmentosum), 케라토옥탄토마(keratoctanthoma), 갑상선 여포암(thyroid follicular cancer) 및 카포시 육종과 같은 그외 종양.
또한, 본 발명의 화합물은 tau 단백질의 인산화에 cdk5가 관여한다는 최근 보고에 의해, 알츠하이머 질환의 치료에 이용가능할 수 있다 (J. Biochem, 117, 741-749 (1995)).
본 발명에 개시된 화합물은 세포자살을 유발 또는 저해한다. 세포자살 반응은 여러가지 인간 질환에서 비정상적이다. 본원의 화합물은 세포자살 조절자로서 암(전술한 타입을 비제한적으로 포함), 바이러스 감염증(헤르페스 바이러스, 폭스바이러스, 엡스테인-바르 바이러스, 신드비스 바이러스 및 아데노 바이러스를 비제한적으로 포함)의 치료와, HIV 감염된 개체에서의 AIDS의 발병 예방, 자가면역질환(전신성 루푸스, 낭창(erythematosus), 자가면역 매개성 사구체신염, 류마티스 관절염, 건선, 염증성 대장 질환 및 자가면역 당뇨병을 비제한적으로 포함), 신경퇴행성 장애(알츠하이머 질환, AIDS 관련 치매, 파킨슨 질병, 신경 위축성 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 망막색소상피 변성증(retinitis pigmentosa), 척추성 근위축증(spinal muscular atrophy) 및 소뇌 변성(cerebellar degeneration)을 비제한적으로 포함함), 골수이형성 증후군, 재생불량성 빈혈, 심근경색, 발작 및 재관류 관련 허혈성 상해, 부정맥, 죽상동맥경화증, 독소 유발성 또는 알콜 관련 간 질환, 혈액성 질환(만성 빈혈 및 재생불량성 빈혈을 비제한적으로 포함함), 근골격계의 퇴행성 질환(골다공증 및 관절염을 비제한적으로 포함함), 아스피린-민감성 부비동염, 낭성 섬유증, 다발성 경화증, 신장병 및 암 통증의 치료에 이용가능하다.
본 발명에 개시된 화합물은 cdk 저해제로서 세포의 RNA 및 DNA 합성 수준을 조절할 수 있다. 상기 물질은 따라서 (HIV, 인간 파필로마 바이러스, 헤르페스 바이러스, 폭스바이러스, 엡스테인-바르 바이러스, 신드비스 바이러스 및 아데노 바이러스를 비제한적으로 포함하는) 바이러스 감염증 치료에 유용하다
본 발명에 개시된 화합물은 또한 암의 화학예방법에 이용할 수 있다. 화학예방법은 초기 돌연변이 발생을 차단하거나 또는 이미 손상이 있는 전암성 종양(pre-malignant) 세포의 진행을 차단하거나 또는 종양 재발을 저해함으로써, 침투성 암 발병을 저해하는 것으로 정의된다.
본 발명에 개시된 화합물은 또한 종양 혈관신생 및 전이를 저해하는데 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 개시된 화합물은 일반적으로 다수의 전통적인 화학치료법에서 수반되는 탈모의 예방에 사용할 수도 있다. 예컨대, 본 발명의 CDK 저해제를 사용하여, 모낭내 세포의 증식을 저해하고, 그로 인해 증식성 세포를 표적으로 하는 세포독성제로부터의 공격으로부터 보호할 수 있다.
또한, 본 발명에 개시된 화합물은 다른 단백질 키나제, 예컨대 단백질 키나제 C, her2, raf1, MEK1, MAP 키나제, EGF 수용체, PDGF 수용체, IGF 수용체, PI3 키나제, wee1 키나제, Src, Ab1의 저해제로서 작용할 수 있으며, 따라서, 다른 단백질 키나제와 관련된 질병의 치료에 효과적이다.
본 발명에 개시된 화합물은 방사능 치료와 같은 공지된 항암 치료법이나, 예컨대 시스플라틴 또는 독소루비신과 같은 DNA 상호작용제(interactive agent), 에토포시드와 같은 토포아이소머라제 II 저해제, CPT-11 또는 토포테칸과 같은 토포아이소머라제 I 저해제, 파클리탁셀, 도세탁셀 또는 에포틸론과 같은 튜블린 상호작용제, 타목시펜과 같은 호르몬제, 5-플루오로우라실과 같은 티미딜레이트 합성효소 저해제, 및 메토트렉세이트와 같은 항-대사산물 등의 세포 증식 억제제 또는 세포독성제와 조합하여 (함께 또는 연속적으로) 사용할 수 있다. 상기 조합에서, 본 발명의 화합물 및 제형은 종종 방사선 치료나 화학치료에 의해 발생되는 탈모 발생을 예방 또는 감소시키는데 유용할 수 있다.
고정된 조제물으로서 제형화하는 경우, 조합 산물은 하기 함량 범위내의 본 발명의 화합물과 승인된 함량 범위내의 약학적으로 활성인 물질이나 치료제를 사용한다. 예컨대 cdc2 저해제인 올로무신은 공지된 세포독성 물질과 함께 세포자살을 유발하는데 상승적으로 작용하는 것으로 밝혀졌다(J. Cell Sci. 108, 2897 (1995)). 또한, 본 발명에 개시된 화합물은 조합 제형이 부적절한 경우에, 공지된 항암제나 세포독성 물질과 순차적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 투여 순서를 제한하진 않으며, 본 발명의 화합물은 공지의 항암제나 세포독성 물질의 투여 이전이나, 또는 이후에 투여될 수 있다. 예컨대, 사이클린 의존적 키나제 저해제인 플라보피리돌의 세포독성 활성은 항암제 투여 순서에 의해 영향을 받는다(Cancer Research, 57, 3375 (1997)).
본 발명에 기재된 모든 예들은 본 발명은 여러 측면으로 적용할 수 있는 것으로 여겨진다. 또한, 기재된 예들은 모두 적절한 하나 이상의 예와 자유롭게 조합될 수 있는 것으로 간주된다. 특히, 본 발명에 따른 화합물들의 여러가지 예, 상기 화합물을 이용한 치료 가능한 질병들의 여러가지 예, 및 본 발명을 이용한 여러가지 치료법의 예 또는 화합물의 용도는, 서로 자유롭게 조합될 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 예를 보다 상세히 기술한다. 그러나, 이는 예시적인 것일 뿐 어떠한 방식으로도 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
등가물
당업자라면 일반적인 실험 수준으로 본 발명에 기술된 구체적인 예에 대한 다수의 등가물을 확인할 수 있는 것으로 인식되거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다. 또한, 당업자는 본원에 첨부된 청구범위의 예 또는 구성들의 모든 조합이 본 발명의 범위내에 속하는 것으로 인지할 것이다.
도 1은 (a) PI FACS 분석에 의한 HCT-116 세포의 세포 주기 분석과 (b) PARP 절단 유발에 있어서의 화합물 A37의 노출 효과를 나타낸다.
도 2는 (a) 용량 반응 및 (b) 경시적으로 나타낸, HCT-116 종양 세포의 집락형성 생존(clongeneic survival)에 있어서의 화합물 A37의 비가역적 효과를 나타낸다.
도 3은 경시적으로 나타낸, HCT-116 종양 세포의 집락형성 생존에 있어서의 화합물 B16의 비가역적 효과를 나타낸다.
도 4는 화합물 A37에 노출된 정지된 종양 세포에서 동일한 화합물에 노출시킨 정ㅈ지된 정상(IMR90) 세포에 비해 생활도((viability))가 감소됨을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 여러가지 화합물들을 이용한 HCT-116 이종이식 종양 분석 결과이다.
도 6은 (a) 다양한 용량에서의 경시적인 종양 크기 및 (b) 분석 수치로 나타낸, 화합물 A37을 이용한 A2789 이종이식 종양 분석 결과이다.
도 7은 (a) 다양한 용량에서의 경시적인 종양 크기 및 (b) 분석 수치로 나타낸, 화합물 A37을 이용한 PC3 이종이식 종양 분석 결과이다.
도 8은 (a) 다양한 용량에서의 경시적인 종양 크기 및 (b) 분석 수치로 나타낸, 화합물 B16을 이용한 A2780 이종이식 종양 분석 결과이다.
도 9는 일예로서 CDK2/사이클린E의 CM5-저해제-주입된 칩에 대한 결합 결과이다. 실험 결과치로부터 계산된 KD는 8.0+/-2.8 nM이다.
v. 합성
본 발명의 화합물은 하기 방법 및 합성 유기 화합 분야에서 공지된 합성법 또는 당업자들에 의해 숙지된 변형 방법을 이용하여 합성할 수 있다. 바람직한 방법은 하기 방법이지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 하기 인용된 각각의 문헌들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
본 발명에 개시된 화합물을 제조하는 주된 중간산물은, 피라졸 아미노니트릴, 아미노카르복사미드 및 아미노에스테르이다. 이들 중간산물의 제조는 화학 문헌에 기재되어 있으며, 여러가지 방법이 반응식A(A. O. Abdelhamid, et al., J. Heterocycl. Chem., 1984, 1049), B (C. C. Cheng and R. K. Robins, J. Org. Chem. 1956, 21, 1240), C (P. Schmidt and J. Druey, Helv. Chem. Acta 1956, 39, 986)으로 요약되어 있다. 또한, Tominaga et al., J. Heterocycl. Chem. 1990, 27, 775 및 PCT 출원 WO 00/21926와 WO 99/54308를 참조한다. 매우 다양한 출발물질인 하이드라진계 화합물 및 알데하이드계 화합물을 구입하거나 또는 표준 유기 변환법으로 제조할 수 있다. 치환기 Ar은 아릴 고리로서, 본 발명의 화합물의 해당 알릴 치환기에 맞게 또는 변환되도록 치환된다. 또한, 화합물은 염기 존재하에 PrCOCI와 CH2(CN)2를 처리하고, 제조되는 화합물을 PCl5로 처리한 다음 이를 ArNHNH2와 반응시켜 제조할 수 있다.
반응식 A
Figure 112006052222957-PCT00027
반응식 B
Figure 112006052222957-PCT00028
반응식 C
Figure 112006052222957-PCT00029
아미노니트릴II는 반응식 D에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 피라졸로[3,4-d]피리미딘으로 변환될 수 있다. 즉, 아미노카르복사미드는 선택적으로 디클로로메탄과 같은 적정 용매의 존재하에서, 트리에틸아민과 같은 적정 염기로, 이후 식 ArCH2COX의 산 할라이드, 바람직하기로는 산 클로라이드로 처리함으로써 아실화되어, 카르복스아미도니트릴 V가 제조된다. 대안적으로, 카르복스아미도니트릴 V는 아미노니트릴 II를 일반식 ArCH2CO2의 카르복실산을 적합한 용매중의 적정 염기 및 커플링 시약의 존재하에 커플링시켜 제조될 수 있다. 아민과 카르복실산의 커플링이 총괄적으로 기재되어 있으며(Klausnew and Bodansky, 1972, 453-463), 당업자는 이에 작용하는 여러가지 반응시약들을 인지할 수 있을 것이다.
반응식 D
Figure 112006052222957-PCT00030
카르복스아미도니트릴 V의 본 발명의 화합물로의 변환은 용매, 바람직하기로는 물, 알콜 또는 수-알콜 혼합물내의 적정 염기, 바람직하기로는 금속 하이드록사이드 또는 알콕사이드 염기의 존재하에 과잉의 하이드로젠 페록사이드를 약 0 내지 100 ℃에서 처리하여, 수행할 수 있다.
대안적으로, 카르복스아미도니트릴 V는 농축시킨 강산, 바람직하기로는 85%의 H3PO4내에서 약 1시간 가온시켜, 본 발명의 화합물로 변형시킬 수 있다. 반응식 E는 본 발명의 화합물을 제조하기 위한 다른 방법을 나타낸다. 적합한 용매, 바람직하기로는 저급 알카놀내의 아미노 카르복스이미드 III에 식 ArCH2CO2R(R은 예컨대 저급 알킬임)의 과잉의 에스테르와 과잉의 염기, 바람직하기로는 금속 저급 알콕사이드를, 바람직하기로는 용매의 끓는 점에서 처리하여, 본 발명의 화합물을 제조한 다. 다수의 아릴아세트 에스테르는 구입가능하며, 또는 바람직하기로는 용매로서 사용한 에틸 또는 메틸 알콜의 환류하, H2SO4 또는 p-TsOH와 같은 산 촉매의 존재하에 과잉의 알콜, ROH를 이용한 에스테르화에 의해 상업적으로 이용가능한 아릴아세트산으로부터 한 단계 공정으로 제조할 수 있다. 대안적으로, DCC와 같은 커플링제를 바람직하기로는 CH2Cl2와 같은 용매내에서 DMAP와 같은 촉매와 함께 사용할 수 있다.
반응식 E
Figure 112006052222957-PCT00031
페닐아세트산은 아릴아세토니크릴의 산 또는 염기 가수분해에 의해 제조할 수 있으며, 이후 아릴 할라이드를 바람직하기로는 DMF, MeOH, EtOH, 물, DMSO 또는 이들의 혼합물과 같은 용매내에서 CN-으로 처리함으로써 제조할 수 있다. 아릴아세트 에스테르의 다른 예는 Arndt-EistertMeier and Zeller, Chem. Int. Ed. Engl. 1975, 14, 32) 또는 관련 상동한 조건하에서 아릴카르복실산으로부터 제조할 수 있다.
식IV의 아미노에스테르는 식 ArCH2CN의 과잉의 니트릴 및 소듐과 반응시켜, 본 발명의 화합물로 변화시킬 수 있다.
반응식 F
Figure 112006052222957-PCT00032
상기 반응은 가온하면서 수행한다.
피라졸로[3,4-d]피리미딘온은 하기와 같이 추가적으로 제조하여, 본 발명의 부가적인 화합물을 제조할 수 있다. 치환기를 도입하기 위해 Ar 기상에 친전자성 방향족 치환 반응을 수행할 수 있다. 이러한 반응은, 니트로화, 아실화(Friedel-Crafts), 할로겐화, 알킬화(Friedel-Crafts), 클로로메틸화, 설폰화 및 아미노메틸화(만니치 반응, Mannich reaction)가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 이들 반응 수행을 위한 조건은 촉매 존재하에서의 친전자기와 아릴 또는 헤테로아릴 기질 반응이 일반적으로 참여하는, 유기 합성 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 니트로화 또는 만니치 반응에서, 촉매는 바람직하기로는 용매로서 제공할 수 있는 프로틱산이며, 상기 친전자기는 초석(saltpeter) 또는 아민 및 카르보닐 성분 각각으로부터 인 시츄(in situ) 제조된다. 다른 친전가성 방향족 치환 반응의 경우, 바람직한 촉매는 X가 할로겐인 FeX3, AlX3 및 ZnX2를 비제한적으로 포함하는 루이스 산이다.
아미노기를 가지는 상기에서 제조된 화합물은, 아실 할라이드, 무수화물, 이소시아네티으, 클로로포르메이트, 설포닐 할라이드, 알킬 할라이드, 락톤 또는 에스테르를 비제한적으로 포함하는 친전자기와 반응시켜, 유도체화할 수 있다. 이러한 부가 반응을 수행하기 위한 조건은, 바람직하기로는 용매중 0 ℃ 내지 실온의 온도에서 친전자기를 친핵기에 첨가하는 단계가 일반적으로 참여하는 유기 합성 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 염기 추가가 필수적일 수 있다. 이러한 반응들의 산물은 피리미디논 니트로겐(N5)에서 일부 친전자기와 함께 더욱 반응할 수 있음을 유념하여야 한다. 제조되는 관능기(아미드, 카르바메이트 등)는 아킬리노기나 지방족 기보다 염기성 가수분해에 덜 안정적이며, N5상에 H를 가지는 피리미디논으로 ㄷ다시 절단될 수 있다.
아민기를 가지는 화합물과 할로아실 할라이드, α,β-불포화 산 할라이드 또는 할로설포닐 할라이드와 같은 물질의 반응으로, 1급 또는 2급 아민, 디아민, 알콕사이드, 아미노 알콜 또는 티올과 같은 친핵기와 반응할 수 있는 중간산물이 제조된다.
상기에서 제조한 화합물은 카르복실기를 가지는 것으로서, 활성화 및 아민 및 알콜을 비제한적으로 포함하는 친핵기와의 반응에 의해 유도체화되어, 각각 아미드 및 에스테르로 제조될 수 있다. 아민 및 카르복실산과 카르보디이미드와의 커플링은 총괄적으로 기재되어 있으며(Klausnew and Bodansky, Synthesis 1972, 453-463), 이에 작용하는데 이용가능한 다양한 부가적인 반응 시약과 반응 기능성을 숨기기 위한 보호기(Green and Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis" Second Edition, John Wiley & Sons, 1991)의 잠재적인 필요성은 당업자라면 인지할 수 있을 것이다. 산에서 에스테르 제조는 상기에 기재되어 있다. 이러한 아미드 및 에스테르의 아민 및 알콜로의 환원은 적합한 하이드라이드 환원제를 이용하여 수행할 수 있다.
아미노기를 가지는 상기에서 제조한 화합물은 포스겐(phosgene) 또는 포스겐 등가물(Tetrahedron: Asymmetry 1995, 61, 745; J. Org. Chem. 1994, 59, 1937)로, 바람직하기로는 염기의 존재하에 활성화시키고, 비제한적으로 각각 유레아, 카르바메이트 및 설포닐유레아를 제공하기 위하여 아민, 알콜 및 설폰아민을 포함하는 친핵기와 반응에 의한 친전자성 종으로 변환시킬 수 있다. 상기 반응 조건과 포스겐 및 포스겐 등가물의 취급에 있어서의 위험성은 유기 합성 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 모든 적합한 사전 조치를 취하여야 한다.
본 발명의 화합물 제조에 필요할 수 있는 추가적인 변환으로는, 알루미노- 및 보로하이드라이드 반응 시약에 의한 케톤, 알데하이드, 에스테르, 산, 아미드 또는 환원성 아민화의 환원 반응과(J. Seyden-Penne, "Reductions by the Alumino and Borohydrides in Organic Synthesis" VCH Publishers, Inc. , 1991), 알콜, 알데하이드, 올레핀, 티오에테르, 설폭사이드 및 헤테로아릴 기를 포함한 기들이 산화 반응(Milos Hudlicky, "Oxidations in Organic Chemistry" American Chemical Society, 1990)이 있다.
알켄, 알킨, 질소, 니트로 또는 시아노기와 같은 관능기의 환원은, 촉매성 수소첨가나 또는 금속 환원 용해에 의해 수행될 수 있다. 나아가, 본 발명의 화합 물에 친전자성 부위를 포함하고 있는 중산산물의 제조는, 비제한적으로 CN-, 아민, 알콕사이드, 머캅탄 또는 카르반온을 포함한 친핵기로 치환함으로써 이룰 수 있다. 본 발명의 또다른 화합물은 아릴 할라이드 또는 트리플레이트와 적절한 보론산 또는 스타난(stannan)과의 커플링에 의해 제조될 수 있다(Stille, J. K., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1986, 25, 508; Suzuki, A. Pure Appl. Chem. 1985, 57, 1749). 카보닐 기를 가지고 있는 상기에서 제조된 화합물은 친핵기와의 반응에 의해 더욱 유도체화하여, 2급 알콜로 제조될 수 있다. 이러한 친핵기로는, 그리그나드 시약(Grignard reagent), 알킬-알켄닐- 및 알키닐-리튬 시약 및 알릴 스타탄, 싱란 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 전술한 바와 같이 제조한 화합물에 벡크만(Gawley in Org. React. 1988, 35, 1) 또는 그외 재배열(rearrangement)과 같은 재배열에 의해 더욱 작업이 행해질 수 있다.
상기에서 제조한 화합물의 추가적인 작업은, 금속화에 의한 유기마그네슘 또는 유기리튬 종의 제조에 의하여(Beak and Meyers, Acc. Chem. Res. 1986, 19, 356-363; Beak and Snieckus, Acc. Chem. Res. 1982, 15, 306-312; Katritzky, Lam, and Sengupta, Prog. Heterocycl. Chem. 1989, 11, 1-29), 또는 리튬-할로겐 교환에 의한 아릴 할라이드로부터(Parham and Bradsher, Acc. Chem. Res. 1982, 15, 300-305) 수행될 수 있다.
식 II, IIa의 화합물 및 본원에 개시된 다른 화합물을 제조하기 위한 접근법은 반응식 1에 나타나 있으며, 이를 사용하여 본 발명의 화합물을 제조할 수 있다. 치환기 Z, R5, R6 및 R7은 식II에서 나타낸 바와 같은 치환기이거나, 또는 표준적인 유기 변환 법으로 그러한 치환기로 변환될 수 있는 치환기이다. P는 적합한 보호기이다. 보호기의 예로는, 카르복실산의 에스테르, 알콜의 실릴 에테르 및 알데하이드 및 케통의 아세탈 및 케탈이 있다. 보호기 화학 분야가 총괄적으로 기재되어 있다(Greene, T. W.; Wuts, P. G. M. Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd ed.; Wiley: New York, 1991). 디메틸 니트로프탈레이트의 니트로기는 촉매성 수소 첨가로 아민으로 환원된다. 아닐은 염기로서 아세트 무수화물과 피리딘을 이용하여 아실화된다. 제조되는 아세트아미드2 및 아세토페논의 혼합물에 적합한 용매중에서 승온시키는 조건하에 강 염기를 처리하여, 원하는 트리케톤 3을 수득한다. 트리케톤을 제조하는 다른 방법은 Kilgore et al., Industrial and Engineering Chemistry 34: 494-497, 1946에 개시된 바와 같이 당업자에게 공지되어 있다. 트리케톤에 승온하 적합한 용매중에서 하이드라진을 처리하여 인데노[1,2-c]피라졸론 고리 시스템을 수득한다.
인데노[1,2-c]피라졸론의 다른 제조 방법은 Lemke et al., J. Heterocyclic Chem. 19: 1335-1340, 1982 ; Mosher and Soeder, J. Heterocyclic Chem. 8: 855-59, 1971; Hrnciar and Svanygova, Collect. Czech. Chem. Commun. 59: 2734-40, 1994에 개시된 바와 같이 당업자에게 공지되어 있다. 아민은 적당한 용매중에서 강산과 함께 열처리하여 디아실화되어, 아닐4로 제공된다. 상기 아닐은 표준 조건하에 산 클로라이드를 이용하여 적당한 용매중에서 아실화되어, 원하는 산물 5가 제조된다.
반응식 1
Figure 112006052222957-PCT00033
본 발명의 화합물을 제조하기 위한 다른 방법은 반응식 2에 개시되어 있다. 중간산물인 트리케톤 3은 강산으로 디아실화하고, 당업자들에게 공지된 방법으로 적절한 산 클로라이드로 다시 아실화시킬 수 있다. 이후, 케톤6은 반응식 1에서 이미 개시된 동일한 조건을 이용하여 인데노[1,2-c]피라졸론 고리 시스템으로 변환시킬 수 있다.
반응식 2
Figure 112006052222957-PCT00034
반응식 2의 트리케톤6을 제조하기 위한 다른 방법은, Rotberg and Oshkaya, Zh. Organ. Khim. 8: 84-87, 1972; Zh. Organ. Khim. 9: 2548 2550, 1973에 개시된 바와 같이 1,3-디케톤6a와 3-니트로프탈 무수화물과의 축합반응을 사용한다. 1,3-디케톤이 상업적으로 사용가능하지 않으면 필수 메틸 케톤의 아실화 또는 트리플루오로아실화에 의해, 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 제조된 니트로 유도체의 아닐 6b로의 환원은 촉매성 수소첨가, 산성하에 아연 또는 철 처리 또는 소듐 디티오나이트 또는 염화 아주석(stannous chloride)과 같은 다른 환원제 처리를 포함한 여러가지 방ㅇ법으로 수행될 수 있다. 이후, 아닐 6c는 반응식 2에 이미 개시된 바와 같이, 아실화 및 이후의 하이드라진의 처리에 의해 본 발명의 인데노[1,2-c]피라졸론으로 변환시킬 수 있다.
인데노[1,2-c]피라졸론 고리 시스템을 제조하기 위한 다음 방법은 반응식 3에 나타나 있다. 디메틸 하이드라진은 용매 무첨가 조건에서 3-아세틸피리딘ㄴ과 반응시켜 하이드라존7을 제조한다. 이는 반응식 1과 유사한 방법으로 처리하여 원하는 중간산물 8을 제조한다.
반응식 3
Figure 112006052222957-PCT00035
대안적으로, 6b를 활성화된 아실화된 N-아미노 포르몰린 또는 니트로페닐 카르바메이트와 같은 피페라진으로 처리할 수 있다. 유사한 중간산물의 다른 제조 방법이 Rappoport, J. Org. Chem. 49: 2948-2953, 1984에서와 같이 당업자들에게 공지되어 있다. 상기 중간산물은 반응식 1과 유사한 과정으로 수행된다.
상기한 반응식들은 W가 산소인 일반적인 합성 경로를 나타내고, 하기에 일반 적인 설명이 기재되어 있지만, 당업자는 W가 산소가 아닌 본 발명의 다른 화합물의 합성을 계획하고 실시할 수 있을 것이다. 예컨대, W는 S, S(O2), C(=O), C(=S), CH2 및 NR''로부터 선택된다.
본 발명의 다른 특징들은 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명을 한정하기 위한 것이 아닌, 하기 예시적인 실시예의 설명으로부터 명백해질 것이다.
v. 실례
표 A, B 및 C의 화합물을 PCT 출원 WO 03/033499 및/또는 WO 04/092139에 개시된 바에 따라 합성할 수 있으며, 상기 문헌들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
분석 프로토콜 및 결과
본 발명의 화합물의 생물학적 활성과 활용은 이하에거 보다 구체적으로 개시 방법을 포함한 한가지 이상의 분석으로 입증된다.
분석 1. 프로피듐 요오드화물(propidium iodide) 및 BrdU 분석을 이용한 본 발명의 화합물에 의한 세포 주기의 진행 저해(결과는 도 1 및 표 2에 개시됨)
분석 2. NCI 패널에 따른 여러가지 인간 종양으로부터 유래된 60가지 세포주의 본 발명의 화합물에 노출시의 생존성 감소(결과는 표 3에 개시)
분석 3. 집락형성(clonogenic) 생존 분석에서 세포에 대한 본 발명의 화합물의 비가역적 효과(결과는 표 3, 도2 및 도 3에 개시)
분석 4. 칼세인 AM 분석을 이용하여 추산한, 본 발명의 화합물에 노출된 HCT-116 및 IMR90 세포의 생존성 감소(결과는 표 3 및 6에 개시)
분석 5. 본 발명의 화합물에 노출된 정상 세포가 아닌 종양 세포에서의 생존성 저해(결과는 표 4 및 도 4에 개시)
분석 6. 키나제 생화학 분석에서 본 발명의 화합물의 저해 활성(결과는 표 5 및 6에 개시)
분석 7. 이종이식 종양 모델에서 화합물의 활성(결과는 도 5, 6, 7 및 8에 개시)
분석 8. 특정 표적 단백질에 대한 화합물의 친화력(결과는 도 9에 개시)
분석 9. 본 발명의 화합물의 항바이러스 활성(결과는 표 7에 개시)
분석 1: 프로피듐 요오드화물 및 BrdU를 이용한 세포 주기 분석
프로피듐 요오드화물로 DNA를 염색하고 유세포 측정기로 2N 또는 4N DNA 상보체를 이용한 세포 수 정량에 의해, 세포 주기 G1, S 및 G2/M 단계에 있는 세포 비율을 구하였다. Cdk 저해제 노출에 대한 반응으로 세포 주기에서의 세포 분포 변이를 이러한 방법으로 평가하였다.
프로피듐 요오드화물을 이용한 세포 염색 방법
HCT-116 세포(100,000 cells/set) 3세트를 T-25 플라스크에서 표 1의 테스트 화합물 존재하에 배양하였다. 24, 48 및 72시간째에 분석을 수행하였다. 트립신을 처리하여 부착된 세포를 모아, 팔콘 12 x 75 유세포 측정용 튜브에 부유성 세포를 넣고, 원심 분리로 회수하였다. 배지를 버려 세포 펠렛을 수득하고, 여기에 PI 염료 100 ㎕를 첨가하여 37℃에서 20-25분간 배양하였다. 세포 수는 2 x 106 - 4 x 106/ml 이하인 것이 바람직하다. 동일 부피(100 ㎕)의 PI 염을 세포에 첨가하고 4℃에서 1-2시간 배양하였다. 염색된 세포는 Becton Dickinson FACScan 유세포 측정기에서 분석하였다. 샘플은 광 보호되었다. 도 1은 화합물 A37에 노출되었을때, G1 및 G2로 세포가 정지되었음을 나타낸 것으로, 세포자살 및 내재복제(endo- reduplication)의 증거를 나타낸다. 유사한 결과는 화합물 B16을 포함한 본 발명의 다른 화합물들에서도 확인된다.
BrdU의 DNA로의 혼입 확인
이 방법은 세포가 세포 주기의 S 단계를 거쳐 진행되면서, 뉴클레오티드 유사체인 BrdU가 새로 합성되는 DNA로 혼입되어진 세포의 비율을 측정하는 것이다. BrdU 혼입 저해는 S 단계 진행 및 DNA 복제에 대한 Cdk 저해제의 효과로서 사용하였다.
BrdU 표지 방법
HCT-116 세포(100,000 cells/set) 3세트를 T-25 플라스크에 접종하고, 전술한 바와 같이 테스트 화합물과 배양하였다. 24, 48 및 72시간째에 분석을 행하였다. 각 T-25 플라스크에 10 mg/ml의 원액 BrdU를 최종 농도 10 μM로 첨가하여, 37℃에서 16-18시간 배양하였다. 이후, 세포는 제조사의 프로토콜에 따라 유세포 분석을 위해 하기와 같이준비하였다(BrdU Flow kit, BD-Pharmingen catalogue #2354KK).
세포는 T25 플라스크에서 직접 팔콘 12 x 75 유세포 측정용 튜브로 회수하고, 고정화하고 100 ㎕의 Cytofix/Cytoperm 완충액(30분, 실온) 첨가로 투과화하였다. 이후 세포는 1 ml의 Perm 세척 완충액으로 세척하고, 세포 펠렛은 100 ㎕의 Cytoperm이 플러스 완충액에 재현탁한 다음 10분간 얼음위에 두었다. 이후 세포를 다시 Perm 세척 완충액으로 세척하고, 10분간 100 ㎕의 Cytofix/Cyto Perm 완충액에서 고정을 반복하였다. 다시 세포를 100 ㎕의 Perm 세척 완충액으로 세척하였다. 세포는 100 ㎕의 DNase로 37℃에서 1시간동안 처리하여 BrdU 혼입에 노출시킨 다음 1 ml의 Perm 세척 완충액으로 세척하였다. 혼입된 BrdU의 존재는, 알파-BrdU-FITC 항체(Perm 세척 완충액내에 1:50으로 희석한 항체 50 ㎕)로 확인하였다. 세포는 광보호되었으며, 20-30분간 실온에 두었다. 이후 세포는 1 ml의 Perm 세척 완충액으로 세척하고, PBS중이 2% FBS 300 ㎕에 재현탁한 다음 유세포 측정기로 분석하였다. 결과는 BrdU 혼입을 50% 저해하는 화합물의 농도(μM)로서, 표 2에 나타낸다.
분석 2: NCI 패널의 인간 종양 세포주에 대한 Cdk 저해제 평가
국립 암 센터에서 수행한 60종의 세포주에 대한 화합물 평가 결과는, 광범위의 종양 타입 및 유전학적 배경에 있어서, 효능에 대한 많은 정보를 제공한다. 이러한 내용에는, 백혈병, 흑색종 및, 폐, 직장, 뇌, 잔소, 유방, 전립선 및 신장의 암으로부터 유래된 세포 주가 포함되어 있다. 이러한 것을 이용하여, p53 및 Her2/Neu를 포함한 종양 형질전환(neoplastic transformation)과 관련있으며, 대사에 참여하고 다수 약물 내성을 부여하는 다수 유전자가 변이된 세포에 대한 화합물 의 효과를 평가한다. 하기 프로토콜을 이용한 이들 세포주에서 산출한 데이타를 이용하여 화합물의 활성을 평가할 수 있다.
NCI 패널 분석의 결과는 두가지 변수(informative metric)로 나타낸 표 3(NCI 패널)에 나타낸다: (a) 평균-그래프 중앙-치-10 nM 미만의 IC50(μM)를 가지는 것을 제외한 전체 세포 패널의 평균 IC50은 10 nM과 동일한 것으로 계산하고, 및 (b) 아드리아마이신 내성 세포주(ADR-res)에 대한 화합물이 저해 활성 IC50(μM).
본 발명의 부가적인 화합물은 NCI 분석에서 하기 활성을 보였다: (i) 화합물 A37: 평균-그래프 중앙-치 < 50nM 및 ADR-res 세포의 증식 저해 IC50 < 100 μM; (ii) 화합물 B16: 평균-그래프 중앙-치 < 50 nM 및 ADR-res 세포의 증식 저해 IC50 < 100 μM.
시험관내 암 스크리닝 방법
세포를 10% FCS가 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하고, 5000 내지 40000 세포/웰의 밀도로 96웰 마이크로-타이터 플레이트에 접종하였다. 이 플레이트는 24시간동안 37℃, 5% 이산화탄소 하에 두었다. 원하는 최종 농도의 2배 농도의 화합물(5 doses spanning 4 logs) 을 포함하는 배지를 준비하여, 100 ㎕의 배지 및 세포를 함유하고 있는 각 웰에 100 ㎕을 첨가하여 원하는 최종 농도로 맞추었다. 이후, 플레이트는 48시간 더 배양하였다.
화합물의 세포 생활도에 대한 효과는, 총 단백질을 측정하는 설포르호다민 B(SRB)로 결정하였다. 세포는 차가운 TCA로 최종 농도 10%로 고정하여 60분간 4℃에서 배양하였다. 상층액은 버리고, 물로 5회 플레이트를 세척한 다음 공기중에서 건조시켰다. 1% 아세트산내의 4%(w/v) SRB를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 10분간 배양하였다. 플레이트는 1% 아세트산으로 5회 세척한 다음, 공기중에 건조하였다. 결합된 염료는 10 mM 트리즈마 베이스로 용해화하여, 515 nM에서 플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다.
분석 3: HCT-116 세포를 이용한 집락형성 생존율 분석 프로토콜
분석을 통해, 일정한 노출 기간 이후의 생활도의 비가역적인 감소를 나타내는 화합물의 농도를 결정하였다. 필수적으로, 세포를 1, 2 또는 5일간 화합물에 노출시킨 다음 화합물이 없는 증식 배지로 이동시켰다. 화합물 무첨가 배지에서 몇 일간 연속 배양한 다음, 콜로니 수를 추정 생존성 세포의 갯수로 계수하였다.
본 발명의 여러가지 화합물에 대한 생존 분석 결과는 집락 재생을 50%(IC50)로 저해하는 화합물의 농도(μM)로서 표 3(집락 형성)에 나타내었다. 도 2는 HCT-116 세포에서의 세포 활성의 비가역적 저해와, 24시간 화합물 노출시 IC50가 <50 nM인 화합물 A37에 의한 시간 경과에 따른 저해를 나타낸다. 화합물 B16은 동일한 분석에서 IC50이 < 100nM이며, 100 nM에서 IC50은 30 내지 60분이내에 도달한다(도 3).
화합물에 노출된 후 세포 생존율의 측정 방법
배지(RPMI-1640, 10% FCS, pen/strp)를 수조에서 37℃고 따뜻하게 하였다. 세포는 37℃, 5% 이산화탄소 조건하에서 배양 및 증식시켰다. 트립신 처리로 섭-컨플루언트 플레이트로부터 세포를 회수하고, 혈구 계산기로 수를 측정하였다. 15 cm의 조직 배양판에 1 x 104 세포를 배지 25 ml 중에 접종하였다. 각 테스트 화합물에 대해 14개의 플레이트를 준비하여, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 화합물은 7가지 농도로 배지에 희석시키고, 세포상의 배지는 테스트 화합물을 함유하고 있는 배지로 교환하였다. 테스트 화합물의 각 농도에 대하여 2개의 플레이트를 준비하였고, 또한 화합물이 무첨가된 두개의 대조군 플레이트를 준비하였다. 플레이트는 전술한 바와 같이 24, 48 또는 74시간 배양하고, 배지를 제거한 다음 신선한 배지로 교체하였고, 다시 7일간 세포를 배양한 다음 PBS로 세척하였다. 집락은 5분간 크리스탈 바이올렛 용액(0.4% crystal violet, 20 % ethanol)으로 염색한 다음 증류수로 2회 세척하여 갯수를 측정하였다.
분석 4: 혈청 단백질의 존재하 및 부재하에 Cdk 저해제를 평가하기 위한 칼세인 AM 생활도 분석의 이용
세포 생활도 감소로 측정한, Cdk 저해제의 효과를 칼세인 AM 분석(Molecular Probes)으로 확인하였다. 칼세인 AM은 세포내의 에스테라제 기질로서, 살아있는 세포만을 절단하여 형광 플레이트 리더로 정량가능한 형광성 산물을 행성한다. 형광 시그널은 살아있는 세포의 수의 비례하며, 따라서, 세포의 Cdk 저해제 노출에 대한 반응에서의 시그널 감소는 생활도 감소와 관련있다. 본 분석은 세포 주기 정지에서 여전히 살아있을 수 있는 세포를 생활도가 감소된 세포와 식별할 수 있으므 로, 따라서, Cdk 저해제 평가에 매우 적합하다. 잠재적으로 세포독성인 화합물은 상기 분석에서 세포의 생활도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
세포의 IC50을 인간 직장결장 암종 세포주인 HCT-116과 정상적인 인간 섬유아세포 IMR90에서 결정하였다. 단백질 보정된 IC50을 HCT-116에서 측정하였다.
생활도 분석 결과는 표 3에 나타낸다(HCT-116(생활도/단백질 보정) 및 IMR-90). 생활도 분석에서의 HCT-116 세포에 대한 IC50(μM, 단백질 비보정)은 표 6에서 본 발명의 다른 화합물에 대해 나타내었다.
다른 세포주에 대한 유사 세포 생활도 분석을 전술한 바와 같이 수행하였다. 본 발명의 다른 화합물에 대한 IC50(μM)은, (i) 화합물 A37: HCT-116 (<50 nM), HCT-단백질 보정(< 500 nM), A2780(<10 nM), IMR90(<50 nM); (ii) 화합물 B16: HCT-116(<10 nM), HCT-116 단백질 보정(< 500 nM), A2780(<10 nM), IMR90(< 100 nM)이다.
칼세인 AM 생활도 분석 프로토콜
HCT 또는 IMR90 세포를 트립신 처리에 의해 섭-컬플루언트 플레이트에서 회수하고, 각각 1000 또는 4000개의 세포를 24웰 플레이트에 접종하여 37℃ 및 5% 이산화탄소 조건하에서 하룻밤동안 배양하였다. HCT-116 세포는 10% FCS가 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하였고, IMR90 세포는 10% FCS가 보충된 최소 필수 배지-알파(Minimum Essential Medium-alpha) 배지에서 배양하였다. 하룻밤 배양하여 부착되도록 한 다음, 배지를 각 웰에서 흡입 제거한 다음 총 7가지의 0 내지 250 nM 농도로 테스트 화합물을 함유하고 있는 배지로 교체하였다. 플레이트를 배양기에 다시 넣고 72시간(3일) 더 배양하였다. 단백질 보정된 IC50을 결정하기 위해 사용한 배지는 10% FCS, 1 mg/ml 알파 산성 당단백질(Sigma G-9885) 및 45 mg/ml의 인간 혈청 알부민(Sigma A3782)이 첨가된 RPMI-1640이다. 테스트 화합물과 함께 72시간 배양한 다음, 세포는 1 X PBS로 2회 세척하고, 매우 조심스럽게 나머지 잔여 완충액을 모두 제거하였다.
5 μM의 칼세인 AM 용액은, 50 ㎕의 DMSO에 50 ㎍의 칼세인(Molecular Probes catalog # C3100)을 용해시켜 제조하였다. 칼세인을 완전히 용해시킨 다음(실온에서 10분), 10 ml PBS로 희석하였다. 칼세인/PBS(0.5 ml)을 각 웰에 첨가하였다. 이 플레이트는 37℃ (광보호된) 조건에서 75분간 둔 다음 형광 플레이트 리더상에서 형광 신호를 읽었다(여기 485/20 및 방사 530/25).
분석 5: 정지된 세포 분석
사이클린 의존적 키나제(Cdk) 활성은 세포가 세포 분열 주기에서 각 단계를 통과하도록 촉진하는데 필요하다. 배양시 정상적인 비전이 세포의 증식에는 성장 인자가 필요하며, 혈청 부족으로 인간 성장 인자 제거는 Cdk 활성을 감소시키고, 그 결과 세포가 세포 주기에서 벗어나 휴지 상태, G0로 들어서게 된다. 따라서, 이론과 결부되지 않은 기계론적 견지에서, Cdk 저해제는 이의 전이된 세포에 비해 정지된 정상 세포에 대해 현저하게 감소된 효능을 가져야 한다.
본 발명의 특정 화합물을 사용하여, 정지된 정상 세포 (IMR90) 및 정지된 종 양세포(HT-116)에 대하여 수행한 생활도 분석 결과를 하기 표 4에 기재하였다. 도 4는 정지된 정상 세포 (IMR90) 및 정지된 종양세포(HT-116)의 생활도 억제에 대한 화합물 A37의 향상된 활성을 보여준다. 화합물 A37의 IC50은 정지된 HCT-116 세포에 대하여는 < 50nM 이며, 정지된 IMR90 세포에 대하여는 >10μM인 것으로 나타났다. 화합물 B16의 경우 IC50은 정지된 HCT-116 세포에 대하여는 < 50nM 이며, 정지된 IMR90 세포에 대하여는 >10μM인 것으로 나타났다.
화합물의 효능 평가를 위한 혈청 결핍에 의한 HCT-116 및 IMR90 세포의 정지
10% 소태아 혈청을 포함하는 RPMI 1640 배지 중에서 웰당 200 또는 2,000개의 HCT-116 세포를, 테스트할 각 화합물의 농도에 대하여 세 쌍씩, 24웰 플레이트에 접종한 후, 5% CO2, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 웰당 2,000개의 세포를 포함하는 플레이트로부터 배지를 제거한 후, 세포를 무혈청 배지로 1회 세척한 후, 세포에 1ml의 무혈청 배지를 첨가하였다. 혈청의 존재 및 부재 중의 모든 세포를 포함하는 상기 플레이트를 추가로 6일 동안 배양하였다.
10% 소태아 혈청을 포함하는 MEM-α 배지 중에서 웰당 2,000 또는 20,000개의 IMR90 세포를, 테스트할 각 화합물의 농도에 대하여 세 쌍씩 24웰 플레이트에 접종한 후, 5% CO2, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 웰당 20,000개의 세포를 포함하는 플레이트로부터 배지를 제거한 후, 세포를 무혈청 배지로 1회 세척한 후, 세포에 무혈청 배지를 첨가하였다. 혈청의 존재 및 부재 중의 모든 세포를 포함하는 상기 플레이트를 추가로 3일 동안 배양하였다.
혈청 결핍에 의해 정지된 HCT-116 및 IMR90 세포의 평가
혈청의 제거로 인하여 세포가 세포주기로부터 완전히 빠져나왔는지를 확인하기 위하여, 각 실험군에 대하여 S 기로 진입하는 세포를 나타내는 BrdU 양성 세포의 백분율을 결정하였다. 본 실험의 목적을 위하여, 이와 동시에, 세포 생활도를, 살아있는 세포에서만 활성이 있는 세포내 에스터라제의 형광성 기질인 SNARF-1을 사용하여 평가하였다. 이와 함께, 유세포 측정기에 의한 BrdU 혼입 및 SNARF-1 절단의 평가는 단 세포 수준에서, 정지된 세포의 생활도에 대한 평가를 제공한다. 상기 분석을 위하여, 세포를 하기와 같이 SNARF-1으로 염색한 후, 상술한 바대로 BrdU 혼입의 측정에 맞게 준비하였다.
HCT-116 및 IMR90 세포를 혈청을 포함하는 배지 (각각 10% 소태아혈청을 포함하는 RPMI-1640 또는 MEM-α)에서 T25 플라스크에 하기의 밀도로 접종하였다. 24시간 성장시킨 후에 배지를 제거하고, 세포를 세척한 후, 무혈청 배지로 바꾸어 주었다.
HCT-116 + FCS 5,000 세포
HCT-116 - FCS 100,000 세포
IMR90 + FCS 100,000 세포
IMR90 - FCS 200,000 세포
IMR90 세포를 추가로 3일간 배양하고, HCT-116 세포는 추가로 6일간 배양한 후 BrdU로 펄스하였다. SNARF-1 (Molecular Probes catalog #C1272) 분취물 50 ㎍을 실온에서 10분간 50 ㎕의 DMSO 중에 용해한 후 10mL의 PBS로 희석하였다. SNARF-1을 추가로 1:64,000로 희석 한 후, 200 ㎕를 혈청의 존재 또는 부재 중에서 배양된 각 세포에 첨가하고, 20시간 동안 BrdU로 펄스하였다. 상기 세포를 37℃에서 30분간 배양한 후, 3 ml의 PBS로 세척하였다.
이어서, 상기 세포를 고정하여 상술한 바대로 BrdU 혼입 측정에 적합하게 준비하였다. 살아있으며 (FL-2), BrdU 양성 (FL-1)인 세포의 퍼센트를 FACScan 유세포 측정기로 측정하였다.
본 발명의 화합물에 노출된 후의 정지된 HCT-116 및 IMR90 세포의 생활도 평가
세포주기가 정지된 세포 및 정지되지 않은 세포에 대한 화합물 효능을 측정하기 위하여 본 발명의 화합물의 존재 중에서 세포를 하기와 같이 5% CO2, 37℃에서 72시간(3일) 동안 배양하였다. 세포주기가 정지된 HCT-116 세포 및 세포주기 정지되지 않은 IMR90 세포를 5 내지 250 nM 범위의 6가지 농도의 화합물 패널에 노출시켰다. 정지된 정상 세포의 경우, 예측되는 활성 감소를 보충하기 위하여, 투여량 범위를 50 nM 내지 25 μM로 증가시켰다.
세포 생활도에 대한 72시간 동안의 화합물 노출의 영향을 Calcein AM 분석으로 평가하였다. 칼세인 AM은 살아있는 세포에서만 활성이 있는 세포내 에스터라제의 형광성 기질이다. 따라서, 기질의 절단은 살아있는 세포의 척도로서, 세포수에 비례한다.
칼세인 AM (Molecular Probes C3100) 50 ㎍을 50 ㎕의 DMSO에 용해하여 칼세 인 AM 원액을 제조하였다. 상기 용액 튜브를 대략 10분 동안 실온에 두어 칼세인이 완전히 용해하도록 하였다. 이어서 상기 칼세인을 10 mL의 PBS에 희석하여 최종 용액을 준비하고 빛으로부터 차단하여 보관하였다.
세포에서 배지를 흡입하여 제거하고, 1 mL의 PBS로 2회 세척하고, PBS를 흡입하여 완전히 제거하였다. 칼세인/PBS 용액 0.5 ml을 파이펫을 사용하여 각 웰에 전달하였다. 이어서, 상기 플레이트를 37℃에서 빛으로부터 차단된 상태에서 75분 동안 둔한 후, 형광 플레이트 판독기에서 결과를 분석하였다 (여기 파장 485/20 및 방출 파장 530/25).
분석 6: 생화학적 키나제 분석의 억제
효소: Cdc2/cyclin B는 시중에서 구입하였다. Cdk2/ his-cyclin Eshort 는 Sf9 세포에서 발현하였다. Cdk2/cyclin A, cdk4/cyclin D1 및 cdk6/cyclin D2는 Sf9 세포에서 발현하였다. 단백질 키나제 A (소심장 유래의 촉매 서브유니트) 및 단백질 키나제 C (래트 뇌 유래의 혼합된 아이소자임)은 시중에서 구입하였다.
기질: 히스톤 H1은 시중에서 구입하였다. GST-Rb는 Rb 단백질의 N-말단 379-928 잔기와 융합된 글루타씨온-S-트랜스퍼라제이다.
분석: Cdc2/cyclin B 활성은 TCA 침전 분석을 사용하여 아데노신[γ-32P] 트리포스페이트로부터 히스톤 H1으로의 방사능 혼입을 측정하여 결정하였다. Cdc2/cyclin B 키나제 및 히스톤 H1은 시중에서 구입하였다. 분석용 최종 용액은 50 ㎕ 부피 중에, 50 mM Tris. HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM 디씨오쓰레이톨, 50 μM 아 데노신 트리포스페이트, 2 μCi32P, 10% 디메틸설폭사이드(화합물로부터 유래됨),pH 7.5, 20 ㎍ 히스톤 H1, 6U 효소를 포함하였다. 화합물을 1 nM 내지 10 μM 사이에서 다양한 농도로 첨가하였다. 반응은 효소의 첨가로 개시되어, 30℃에서 20분간 반응시킨 후, 20 ㎕의 반응 종결용액(237 mM 디소디움에틸렌디아민 테트라아세테이트, 105 mM 아데노신 트리포스페이트, pH 8.0)을 첨가하여 반응을 중단하였다. 단백질은 35 ㎕의 70%(w/v) 트리클로로아세트산을 첨가하여 침전시키고, 상기 침전물을 25% (w/v) 트리클로로아세트산으로 미리 습윤된 96웰 유리섬유 플레이트(Millipore, Inc.)에 취합하였다. 상기 필터를 25% (w/v) 트리클로로아세트산으로 10회 세척한 후, 혼입된 32P의 양은 100 ㎕의 섬광액을 첨가하여 섬광계측기 (Microscint 20,Packard Instruments)로 결정하였다. 상대적 활성은 화합물의 존재 중에서 혼입된 방사능의 양을 화합물은 포함하지 않고 단지 DMSO 만을 포함하는 대조 실험군에 혼입된 방사능의 양으로 나누어 결정하였다. 화합물 대신에 50 mM EDTA을 포함하는 실험으로 결정된 배경 방사능값을 계산 전에 모든 결과에서 제외하였다. 50% 억제(IC50)에 필요한 화합물의 농도를 하기 표준 공식에 데이터를 대입하여 결정하였다:
P = min + (max-min) + (1/(1 + IC50/[I]s)) (1)
식 중에서, P = 1 - 상대적 활성은 상대적 억제이다. [I]은 화합물의 농도이며, max 및 min는 최대 및 최소 상대적 억제(각각 1 및 0)이며, s는 소위 말하는 힐(Hill) 경사이다.
Cdk2/cyclin E, Cdk2/cyclin A, Cdk4/cyclin D1, 및 Cdk6/cyclin D2의 활성은 글루타씨온-세파로즈 캡쳐 분석법을 사용하여 결정하였다. 상기 효소를 Sf9 세포에서 이질이합체로서 발현시키고, 기질(GST-Rb)은 Rb 레티노블라스토마 단백질의 잔기 379-928과 융합된 글루타씨온-S-트랜스퍼라제를 사용하였다. 분석 용액은 100 ㎕ 중에 50 mM Tris. HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM 디씨오쓰레이톨, 50 μM 아데노신 트리포스페이트, 2 μCi [γ-33P]아데노신 포스페이트, 10% 디메틸설폭사이드(화합물로부터 유래됨), pH 7.5, 40 ㎍ GST-Rb 및 효소를 포함하였다. 화합물을 1 nM 내지 10 μM 사이의 다양한 농도로 첨가하였다. 이어서, 30℃에서 15분간 반응시킨 후, 70 ㎕의 반응 종결용액(237 mM 디소디움에틸렌디아민 테트라아세테이트, 105 mM 아데노신 트리포스페이트, pH 8.0)을 첨가하여 반응을 중단하였다. GST-Rb를 110분동안 글루타씨온-세파로스 비드(Amersham)에 결합시켜 취합한 후, 상기 현탁액을 유리섬유 필터에 통과시켜 여과하였다. 취합된 비드를 0.3 % (w/v) Tween-20을 포함하는 인산완충식염수으로 5회 세척한 후, 혼입된 33P의 양을 100 ㎕의 섬광액을 첨가하여 섬광계측기로 측정하였다. 상대적 활성은 화합물의 존재 중에서 혼입된 방사능의 양을 화합물은 포함하지 않고 단지 DMSO 만을 포함하는 대조 실험군에 혼입된 방사능의 양으로 나누어 결정하였다. 화합물 대신에 50 mM 디소디움 에틸렌디아민 테트라아세테이트를 포함하는 실험으로 결정된 배경 방사능값을 계산 전에 모든 결과에서 제외하였다. 50% 억제(IC50)에 필요한 화합물는 상기 표준 공식(1)에 데이터를 대입하여 결정하였다.
단백질 키나제 C 및 단백질 키나제 A를 히스톤 H1을 기질로하여 TCA 침전법으로 분석하였다. 단백질 키나제 A의 경우, 최종 분석용액은 100 ㎕ 부피 중에, 50 mM Tris. HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM 디씨오쓰레이톨, pH 7.5, 12μM 아데노신 트리포스페이트, 10%(v/v) 디메틸설폭사이드(화합물로부터 유래됨), 20 ㎍ 히스톤 H1, 2 μCi[γ-32P]아데노신 트리포스페이트, 0.2U 단백질 키나제 A를 포함하였다. 단백질 키나제 C의 경우, 최종 분석용액은 50 ㎕ 부피 중에, 50 mM Tris. 10 mM MgCl2, 1 mM 디씨오쓰레이톨, 0.8 mM CaCl2, pH 7.5, 5 μM 아데노신 트리포스페이트, 10%(v/v) 디메틸설폭사이드(화합물로부터 유래됨), 20 ㎍ 히스톤 H1, 2 μCi[γ-32P]아데노신 트리포스페이트, 0.01U 단백질 키나제 C를 포함하였다. 반응은 효소의 첨가로 개시되어 30℃에서 10분간 반응시킨 후, 0.4 부피의 237 mM 디소디움에틸렌디아민 테트라아세테이트, 105 mM 아데노신 트리포스페이트, pH 8.0을 첨가하여 반응을 중단하였다. 0.5부피의 70%(w/v) 트리클로로아세트산을 첨가하여 중단된 반응물로부터 단백질을 침전시키고, 상기 침전물을 96웰 유리섬유 플레이트(Millipore)에 여과하여 취합하였다. 상기 필터를 25% (w/v) 트리클로로아세트산으로 10회 세척한 후, 혼입된 [32P]포스페이트의 양은 100㎕의 섬광액 Microscint을 첨가하여 섬광계측으로 결정하였다. 50% 억제(IC50)에 필요한 화합물의 농도를 표준 공식(1)에 데이터를 대입하여 결정하였다.
상기 분석의 결과는 표 5 및 6에 제시하였다.
분석 7: 이종이식 종양 모델
약물. 본 발명의 화합물을 합성한 후 생체사용에 적합한 매체 중에 i.v. 투여용으로 준비하였다. CPT-11(Camptosar
Figure 112006052222957-PCT00036
, Pharmacia)를 약물로서 수득하여 5% 덱스트로스-물(D5W) 중에 준비하였다. 모든 제제는 매주 신선하게 만들어서 사용하였으며, 주사부피는 체중에 맞추어 조절하였다 (0.2ml/20g 마우스).
마우스/사육. 암컷 nu/nu 마우스는 Charles River에서 구입하였으며, 정적인 마이크로아이솔레이터(static microisolator)안에서, 물 및 방사선 조사된 표준 설치류 먹이(Purina Pico-Lab Rodent Diet 20)에 원하는 대로 접근할 수 있도록 하면서 사육하였다.
최대내약량(maximum tolerated dose, MTD)의 결정. 8주령의 마우스를 그룹당 5-8 마리로 하여 짝을 지워 나눈 후, 알려지지 않은 테스트 화합물을 사용하여 예비 독성 연구를 수행하였다. 동물에게 10일 연속으로 매일 테스트 화합물을 i.v.로 투여하고, 주당 2회씩 체중을 측정하였다. 마우스를 임의의 약물 관련 부작용에 의한 임상적 증상여부에 대하여 자주 관찰하였다. 마우스에서 항암제에 대하여 허용가능한 독성은 NCI에 의하면 평균 20%를 초과하는 그룹체중감량이 없으며, 처리된 동물에서 10% 이하의 독성관련 죽음이 초래되는 경우로 정의된다.
표준 방법. 무흉선 누드 마우스(수컷 또는 암컷, 6-7주령)에게 하나의 1 mm3 크기의 종양 단편 (종양 브리(brie)) 또는 대안적으로, 5-10 x 106 개의 조직 배양으로 수득한 세포를 s.c로 옆구리에 이식하였다. 초기에는 동물을 매주 2회씩 모니터하였으며, 그 후 이식물이 대략 100mm3 의 목적하는 크기에 달하면 매일 모니터하였다. 계산치로 종양의 무게가 62-221 mg으로 자란 경우, 동물을 짝을 맞추어 적절한 실험 처리군(8-10 개체/그룹)으로 나누고, 테스트 화합물로의 처리를 개시하였다. 양성 대조군을 종래에 사용된 대조군을 사용하여 투여하였다. 종양 무게를 계산하고 체중은 주당 2회 측정하였으며, 부작용 여부에 대하여 동물을 자주 관찰하였다. 상기 방법에 의하면 종양의 무게가 1000mg에 달하는 임의의 동물은 안락사 시키는 것으로 되어 있다.
종양은 그 길이 및 폭을 디지털 칼리퍼를 사용하여 측정하였다. 종양 무게는 하기와 같이 추정되었다:
종양 중량 (mg) = (w 2 x l)/2
식 중에서, w 및 l은 각각 종양의 폭 및 길이이다. 상기 값은 부피단위(mm3)로 표시될 수 있다.
실험적 처리는 종양의 부분적 퇴행(PR) 또는 완전 퇴행(CR)을 유발할 수 있다. PR은 종양의 크기가 개시일(day 1)의 50% 이하이며, 연구기간 중 3일 연속에 걸쳐 종양의 크기가 0.0 mg 보다 큰 경우인 반면, CR은 3일 연속 측정가능한 종양이 없는 것이다. 치유는 종양의 크기가 0mg으로 줄어들어 실험 종료시까지 그 상 태를 유지하는 것으로 정의된다.
로그 세포 사멸 (Log cell kill, LCK)는 치료의 개시 후에 죽어나간 종양세포의 퍼센트를 결정하는 계산법으로, 효능의 양적인 척도로서 사용될 수 있다:
Log Cell Kill (LCK) = (T-C)/(3.32)(Td)
식 중에서, T는 치료 마우스 그룹의 종양의 크기가 1000mg에 도달하는데 필요한 평균시간이다. C는 대조군의 종양의 크기가 1000mg에 도달하는데 필요한 평균시간이다. Td는 기하급수적 성장기간 동안의 대조군 종양의 세미 로그 성장 플롯으로부터 선형회귀분석으로 측정된, 종양이 두 배가 되는데 걸리는 시간이며, 3.32는 집단이 1-log10 단위으로 증가하는데 필요한 세포분열(doubling) 회수이다. 각각의 LCK 단위는 1-log10 단위의 세포 사멸을 나타낸다 (예를 들면, 1 LCK = 90% kill, 2 LCK = 99% kill, etc. ). 본 발명자들은 LCK의 값이, >90%의 종양세포가 죽은 경우에 해당하는, >1 경우를 화합물이 유의적으로 활성인 경우로 평가한다.
종양 성장 억제 (TGI)는 정해진 시간에 걸쳐, 화합물로의 처리에 의해 성장이 억제된 종양의 양을 나타내는 계산법이다. 이는 다음과 같이 표현된다:
% TGI = 100 (1-T/C)
식 중에서, T는 특정한 날에 화합물로 처리된 그룹의 평균 종양크기이며, C는 동일한 날에 매체 대조그룹의 평균 종양 크기이다.
독성으로 인한 죽음은 질환의 진행으로 인한 것이 아니라 화합물 투여로 야기된 죽음으로 정의된다. 최종 화합물 처리 후 1 주내에 동물이 죽으며, 종양의 크기가 1000 mg에 달하지 않은 경우를 독성으로 인한 죽음으로 분류한다.
종양 퇴행은 하기와 같이 정의된다: 종양의 무게가 개시 무게(<50 mg)의 <50%으로 감소한 경우를 부분적 퇴행(PR)으로 정의한다. 실험기간 동안에 종양의 무게가 측정가능하지 않게 줄어든 경우를 완전 퇴행(CR)로 정의한다. 치유는 관찰 기간의 종료시 동물이 무종양인 경우로 정의된다.
결과. 도 6은 이종이식 동물 모델에서 수개의 본 발명의 화합물을 테스트한 결과를 보여준다. 도 6은 화합물 A37을 사용하여 수득한 A2780 이종이식 동물모델의 결과이다. 도 7은 화합물 A37을 사용하여 수득한 PC3 이종이식 동물모델의 결과이다. 도 8은 화합물 B16을 사용하여 수득한 A2780 이종이식 동물모델의 결과이다.
분석 8: 표적 분자와 화합물 사이의 친화도 측정
본 발명에서 제안된, 특정 화합물의 용도의 적합성을 확인하기 위하여, 있을수도 있는, 이러한 화합물의 공지된 결합 파트너에 대한 결합 특성을 규명하는 것이 도움이 될 것이다. 그러나, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석하여서는 안된다.
화학적 화합물의 이의 상응하는 결합 파트너에 대한 친화도를, 예를 들면 BIACORETM 분석 시스템 (Biacore AB, Uppsala, SE)를 사용하여 결정할 수 있다. 당업자라면 정량적으로 유사한 결과를 나타내는 다른 시스템, 예컨대, 예를 들면 Affinity Sensors (Cambridge, UK)에서 개발된 시스템을 사용할 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다.
대표적 방법에 있어서, 화합물 R의 이의 공지된 결합 파트너인 CDK2/cyclinE에의 결합을 분석하였다. 상기 분석은 BIACORE 2000 SPR-Biosensor를 사용하여 22℃에서 20 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM DTT 및 0.005% Tween 20 (단백질용 등급, Calbiochem)을 포함하는 시험수행용 완충액 중에서 수행되었다. 화합물 R 10μM 용액을 pH 8.0에서, 아마이드 커플링 방법을 통하여 CM5 센서-칩(연구용 등급)의 덱스트란-표면에 커플링하였다. 화합물 R의 단백질에의 결합 특성을 규명하기 위하여, 예를 들면 CDK2/cyclinE의 정제된 단백질 분획을 완충액 중에 9 개의 상이한 농도로 희석한 후, 이들 각각을 5분 동안 상기 센서 표면위를 흘러가도록 하였으며, 그 후, 동일한 속도로 5분 동안 시험수행용 완충액을 흘려보냈다. CDK2/cyclinE 복합체의 CM5-화합물 R 로딩된 칩 표면상에의 회합 및 해리는 30 ㎕/분의 유속에서 측정하였다. 각 실험 후에, 상기 칩에 3 M 구아니디니움-하이드로클로리드 (20초, 30 ㎕/분)을 주입하여 칩을 재생한 후, 다음 시료를 로딩하였다.
테이터는 Bioevaluation software version 3.1 (Biacore AB, Uppsala, SE)을 사용하여 분석하였다. 곡선은 주입 개시시 및 대조군 표면을 사용하여 수득한 배경값에 대하여 정상화(normalization)하였다. 회합 및 해리 속도는 별개로 또는 통합적으로 Langmuir 1: 1 결합 모델을 사용하여 결정하였다. 친화도 (KD)는 다음의 식을 사용하여 계산되었다:
KD = kdiss/kass
상기 방법은 다른 표적 단백질 예를 들면, Cdk9, Cdk4 등을 사용하여 유사한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들면 Cdk9의 억제제는 HIV 및/또는 AIDS의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
도 9는 예로서 CDK2/cyclinE의 CM5-화합물 R-로딩된 칩에의 결합에서 수득한 결과를 보여준다. 이러한 결과로부터 수득한 KD는 8.0 +/- 2.0 nM에 달한다.
분석 9: 항바이러스 활성
본 발명의 화합물의 급성 감염된 세포에서의 효능의 척도를 마련하기 위하여, 본 발명의 특정 화합물의 활성을 낮은 계대 수의, 임상에서 분리된 HIV-1ROJO로 감염된 말초혈액 단핵세포(PBMC)에서 평가하였다. 이들 정상적인 인간 세포의 사용은 이들 화합물의 추정적인 치료 인덱스의 생산을 가능하게 한다. 두 명의 제공자 유래의 각각의 PBMC를 합하여, 48-72시간 동안 PHA-P로 자극하였다. 상기 세포를 이어서 IL-2의 존재중에서 배양하여 분열촉진 신호에 의해 개시되는 세포 분열을 유지하도록 하였다. 바이러스를 감염다중도 0.1로 첨가하였다. 상기 세포를 이어서, 효능 평가전, 감염 후 7일간 배양하였다. 바이러스 복제를 상층액 중의 역전사효소 활성의 정도로 측정하였으며, 세포독성은 MTS 분석으로 측정하였다. 항-HIV 효능 및 이들 화합물의 세포독성을 이중으로 결정한 결과를 표 7에 제시하였다.
본원에 언급된 모든 문헌, 특허, 및 참조내용은 그 전체가 본 명세서의 일부를 구성한다.
표 1. 분석 1에서 사용한 화합물의 농도 범위
Figure 112006052222957-PCT00037
표 2. 전술한 BrdU 혼입 분석에서의 본 발명의 화합물들의 결과
Figure 112006052222957-PCT00038
표 3. 전술한 시험관내 세포 활성 분석에 따른 본 발명의 화합물의 결과: HCT-116 세포를 이용한 생활도 및 집락형성 생존율 분석, IMR90 세포를 이용한 생활도 분석 및 NCI 세포 패널에 대한 2가지 활성 측정치("평균-그래프 중앙-치 및 아드리아마이신 내성 세포주에 대한 IC50)
Figure 112006052222957-PCT00039
표 4. 정지된 세포 분석에 있어서의 본 발명의 화합물의 결과(IC50, nM)
Figure 112006052222957-PCT00040
표 5. 생화학적 저해 분석에 있어서의 본 발명의 화합물의 결과(IC50, μM)
Figure 112006052222957-PCT00041
표 6. 생화학적 저해 분석 및 HCT-116 생활도 분석(단백질 비보정)에 있어서의 다른 화합물의 결과
Figure 112006052222957-PCT00042
Figure 112006052222957-PCT00043
Figure 112006052222957-PCT00044
Figure 112006052222957-PCT00045
표 7
Figure 112006052222957-PCT00046
표 A
Figure 112006052222957-PCT00047
Figure 112006052222957-PCT00048
Figure 112006052222957-PCT00049
Figure 112006052222957-PCT00050
Figure 112006052222957-PCT00051
Figure 112006052222957-PCT00052
Figure 112006052222957-PCT00053
표 B
Figure 112006052222957-PCT00054
Figure 112006052222957-PCT00055
Figure 112006052222957-PCT00056
Figure 112006052222957-PCT00057
Figure 112006052222957-PCT00058
Figure 112006052222957-PCT00059
Figure 112006052222957-PCT00060
Figure 112006052222957-PCT00061
Figure 112006052222957-PCT00062
Figure 112006052222957-PCT00063
Figure 112006052222957-PCT00064
Figure 112006052222957-PCT00065
Figure 112006052222957-PCT00066
Figure 112006052222957-PCT00067
Figure 112006052222957-PCT00068
Figure 112006052222957-PCT00069
Figure 112006052222957-PCT00070
Figure 112006052222957-PCT00071
Figure 112006052222957-PCT00072
표 C
Figure 112006052222957-PCT00073
Figure 112006052222957-PCT00074
표 D
본 발명의 다른 화합물은 하기 가능한 구성들을 나타낸 표에서, 적합한 구성들을 선택하여, 만든다. 예컨대, 화합물 A77은 없음(none)-모르폴리노-아릴-OCH2(CO)-피페라진-CH3으로부터 만든다.
Figure 112006052222957-PCT00075
표 E
본 발명의 다른 화합물은 하기 가능한 구성들을 나타낸 표에서, 적합한 구성들을 선택하여, 만든다. 예컨대, 화합물 B3은 없음(none)-모르폴리노-아릴-CH2-피페라진-CH2CH2OH으로부터 만든다.
Figure 112006052222957-PCT00076

Claims (27)

  1. 식I의 구조를 가지는 화합물 또는 그것의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체:
    (식I)
    Figure 112006052222957-PCT00077
    상기 식I에서,
    R8은 치환 또는 비치환된 헤테로사이클이고;
    F는 n이 1 내지 6의 정수인 (CH2)n이고;
    Q는 치환 또는 비치환된 2급 아미노 치환기, 치환 또는 비치환된 3급 아미노 치환기, 또는, 치환 또는 비치환된 질소 함유성 헤테로사이클이며;
    단, 하기 화합물은 제외된다:
    Figure 112006052222957-PCT00078
    Figure 112006052222957-PCT00079
    Figure 112006052222957-PCT00080
    Figure 112006052222957-PCT00081
  2. 제 1항에 있어서, n은 1인 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제 1항 또는 2항에 있어서, R8은 모르폴리노 또는 피페라진 고리인 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제 1항 내지 3항중 어느 한항에 있어서, Q는 치환 또는 비치환된 피롤리딘, 치환 또는 비치환된 피페라진, 또는, 치환 또는 비치환된 피페리딘인 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물:
    B1
    Figure 112006052222957-PCT00082
         B2
    Figure 112006052222957-PCT00083
    B3
    Figure 112006052222957-PCT00084
         B4
    Figure 112006052222957-PCT00085
         B5
    Figure 112006052222957-PCT00086
         B6
    Figure 112006052222957-PCT00087
         B7
    Figure 112006052222957-PCT00088
         B8
    Figure 112006052222957-PCT00089
         B9
    Figure 112006052222957-PCT00090
         B10
    Figure 112006052222957-PCT00091
         B11
    Figure 112006052222957-PCT00092
         B12
    Figure 112006052222957-PCT00093
         B13
    Figure 112006052222957-PCT00094
         B14
    Figure 112006052222957-PCT00095
         B15
    Figure 112006052222957-PCT00096
         B16
    Figure 112006052222957-PCT00097
         B17
    Figure 112006052222957-PCT00098
         B18
    Figure 112006052222957-PCT00099
         B19
    Figure 112006052222957-PCT00100
         B20
    Figure 112006052222957-PCT00101
         C1
    Figure 112006052222957-PCT00102
  6. 제 1항 내지 4항중 어느 한항에 있어서, Q는 치환된 2급 아미노 치환기, 치환된 3급 아미노 치환기 또는 치환된 질소 함유성 헤테로사이클인 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 제 6항에 있어서, 하나 이상의 치환기는 각각 독립적으로 알킬, 옥소, 아실 아미노, 하이드록실, 카르보닐, 설포닐, 에스테르, 아미드, NR'', 하이드록시 알킬, 알콕시 알킬, 아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬 및 올리고(에틸렌 글리콜)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 제 1항 내지 4항중 어느 한항에 있어서, R8은
    Figure 112006052222957-PCT00103
    의 구조를 가지며,
    Z는 O 또는 NR''이고, R''는 H 또는 저급 알킬인 것을 특징으로 하는 화합물.
  9. 하기 구조를 가지는, 화합물, 또는 그것의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체:
    Figure 112006052222957-PCT00104
  10. 하기 구조를 가지는, 화합물, 또는 그것의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체:
    Figure 112006052222957-PCT00105
  11. 하기 구조를 가지는, 정제된 또는 합성 화합물, 또는 그것의 이성질체, 프로드럭, 호변 이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, N-산화물 또는 입체 이성질체:
    Figure 112006052222957-PCT00106
  12. 제 1항 내지 11항중 어느 한항에 따른 화합물과 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  13. 제 1항 내지 11항중 어느 한항에 따른 화합물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 과다증식성 장애의 치료 방법.
  14. 제 1항 내지 11항중 어느 한항에 따른 화합물을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포의 증식을 저해하는 방법.
  15. 제 1항 내지 11항중 어느 한항에 따른 화합물을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염을 치료하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 바이러스 감염은 인간 면역결핍성 바이러스(HIV)에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항 내지 11항중 어느 한항에 따른 화합물을 하나 이상의 화학치료제 또는 방사능 치료와 병행하여 포유류에 투여하는 단계를 포함하는, 화학치료 또는 방사능 치료에 의해 유발된 탈모의 치료 또는 예방 방법.
  18. 제 11항에 따른 화합물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 과다증식성 장애의 치료 방법.
  19. 제 11항에 따른 화합물을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포의 증식을 저해하는 방법.
  20. 제 11항에 따른 화합물 또는 그것을 치료학적 유효량으로 포함하는, 조성물을 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염의 치료 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 바이러스 감염은 인간 면역결핍성 바이러스(HIV)에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 의약제 제조에 있어서의 제 1항 내지 11항중 어느 한항에 따른 화합물의 용도.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 의약제는 과다증식성 장애, 바이러스 감염, 화학치료 유발성 탈모 및 사이클린 의존적 키나제 활성과 관련된 질병의 치료 또는 예방용 약제인 것을 특징으로 하는 용도.
  24. 장애 치료용 제 1항 내지 11항중 어느 한항에 따른 화합물.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 장애는 과다증식성 장애, 바이러스 감염, 화학치료 유발성 탈모 및 사이클린 의존적 키나제 활성과 관련된 질병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  26. 치료학적 유효량의 제 1항 내지 11항중 어느 한항에 따른 화합물을 또는 상기 화합물을 치료학적 유효량으로 포함하는 조성물을 치료가 필요한 숙주에게 투여하는 단계를 포함하는, 사이클린 의존적 키나제를 저해하는 방법.
  27. 치료학적 유효량의 제 1항 내지 11항중 어느 한항에 따른 화합물을 또는 상기 화합물을 치료학적 유효량으로 포함하는 조성물을 치료가 필요한 숙주에게 투여하는 단계를 포함하는, 사이클린 의존적 키나제 관련 장애의 치료 방법.
KR1020067014820A 2003-12-23 2004-12-21 사이클린 의존적 키나제 저해제, 그 조성물 및 그의 용도 KR101155883B1 (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US53187203P 2003-12-23 2003-12-23
US60/531,872 2003-12-23
US56013804P 2004-04-06 2004-04-06
US60/560,138 2004-04-06
US61648004P 2004-10-06 2004-10-06
US60/616,480 2004-10-06
PCT/US2004/043492 WO2005063765A1 (en) 2003-12-23 2004-12-21 Inhibitors of cyclin-dependent kinases, compositions and uses related thereto

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20060130624A true KR20060130624A (ko) 2006-12-19
KR101155883B1 KR101155883B1 (ko) 2012-06-20

Family

ID=34743691

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067014820A KR101155883B1 (ko) 2003-12-23 2004-12-21 사이클린 의존적 키나제 저해제, 그 조성물 및 그의 용도

Country Status (13)

Country Link
US (1) US8097619B2 (ko)
EP (1) EP1709051A1 (ko)
JP (1) JP4791975B2 (ko)
KR (1) KR101155883B1 (ko)
AU (1) AU2004309415B2 (ko)
BR (1) BRPI0418095A (ko)
CA (1) CA2551640C (ko)
EA (1) EA013117B1 (ko)
HK (1) HK1101399A1 (ko)
IL (1) IL176543A0 (ko)
MX (1) MXPA06007399A (ko)
NO (1) NO20063186L (ko)
WO (1) WO2005063765A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2584493A1 (en) * 2004-06-18 2006-01-05 Gpc Biotech, Inc. Kinase inhibitors for treating cancers
EP2019101A1 (en) 2007-07-26 2009-01-28 GPC Biotech AG Pyrazol[3,4-d]pyrimidin-4-one useful as Kinase Inhibitor
US8822447B2 (en) 2010-04-22 2014-09-02 Janssen Pharmaceutica Nv Indazole compounds useful as ketohexokinase inhibitors
BRPI1107312B1 (pt) 2011-11-25 2021-09-08 Universidade Federal De Santa Catarina Composto de acil-hidrazona
EP3548488A1 (en) 2016-11-30 2019-10-09 Oncotyrol Center for Personalized Cancer Medicine GmbH 3-amino-1,5-dihydro-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-ones as cyclin dependent kinase inhibitors

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3211732A (en) 1965-10-12 Pyrazolob:x-d]pyrlil/hdines
CH398626A (de) 1960-05-11 1966-03-15 Ciba Geigy Verfahren zur Herstellung neuer Pyrazolopyrimidine
JPS60130521A (ja) 1983-12-19 1985-07-12 Morishita Seiyaku Kk 抗癌剤
US4678499A (en) 1985-03-11 1987-07-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Herbicidal sulfonamides
JPS6299361A (ja) 1985-10-25 1987-05-08 Morishita Seiyaku Kk インデノ〔１，２−ｃ〕ピラゾ−ル誘導体
TW444018B (en) 1992-12-17 2001-07-01 Pfizer Pyrazolopyrimidines
US5593997A (en) 1995-05-23 1997-01-14 Pfizer Inc. 4-aminopyrazolo(3-,4-D)pyrimidine and 4-aminopyrazolo-(3,4-D)pyridine tyrosine kinase inhibitors
US5866702A (en) 1996-08-02 1999-02-02 Cv Therapeutics, Incorporation Purine inhibitors of cyclin dependent kinase 2
US6407103B2 (en) * 1998-04-21 2002-06-18 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Indeno [1,2-c] pyrazol-4-ones and their uses
CN1297442A (zh) 1998-04-21 2001-05-30 杜邦药品公司 用作抗癌剂和抗增殖剂的5－氨基茚并[1,2－c]吡唑－4－酮类化合物
US6531477B1 (en) 1998-10-13 2003-03-11 Dupont Pharmaceuticals Company 6-substituted pyrazolo [3,4-d] pyrimidin-4-ones useful as cyclin dependent kinase inhibitors
US6559152B2 (en) 1998-10-13 2003-05-06 Dupont Pharmaceuticals Company 6-substituted pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-ones useful as cyclin dependent kinase inhibitors
US6291504B1 (en) 1999-10-20 2001-09-18 Dupont Pharmaceuticals Company Acylsemicarbazides and their uses
JP2004524277A (ja) 2000-10-20 2004-08-12 ブリストル−マイヤーズ スクイブ ファーマ カンパニー アシルセミカルバジド及びサイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）阻害剤としてのその使用
US6491971B2 (en) 2000-11-15 2002-12-10 G.T. Equipment Technologies, Inc Release coating system for crucibles
US6706718B2 (en) 2000-12-01 2004-03-16 Bristol-Myers Squibb Company 3-(2,4-dimethylthiazol-5-yl)indeno[1,2-c]pyrazol-4-one derivatives and their uses
CA2439263C (en) 2001-03-02 2012-10-23 Frank Becker Three hybrid assay system
US7605175B2 (en) * 2001-03-02 2009-10-20 Gpc Biotech Ag Inhibitors of cyclin-dependent kinases, compositions and uses related thereto
EP1404670A4 (en) 2001-07-06 2004-11-24 Bristol Myers Squibb Pharma Co SEMICARBAZIDES AND THEIR USE
US20040248905A1 (en) 2001-07-10 2004-12-09 Markwalder Jay A 6-Substituted pyrazolo [3,4-d] pyrimidin-4-ones useful as cyclin dependent kinase inhibitors
PL369742A1 (en) * 2001-10-15 2005-05-02 Gpc Biotech Inc. Inhibitors of cyclin-dependent kinases, compositions and uses related thereto
US6753329B2 (en) 2001-12-03 2004-06-22 Gpc Biotech Inc. Inhibitors of cyclin-dependent kinases, compositions and uses related thereto

Also Published As

Publication number Publication date
US8097619B2 (en) 2012-01-17
HK1101399A1 (en) 2007-10-18
AU2004309415A1 (en) 2005-07-14
CA2551640A1 (en) 2005-07-14
NO20063186L (no) 2006-09-20
US20090209530A1 (en) 2009-08-20
AU2004309415B2 (en) 2010-08-26
BRPI0418095A (pt) 2007-04-17
JP2007516296A (ja) 2007-06-21
WO2005063765A1 (en) 2005-07-14
JP4791975B2 (ja) 2011-10-12
EA200601216A1 (ru) 2006-12-29
KR101155883B1 (ko) 2012-06-20
MXPA06007399A (es) 2007-01-26
CA2551640C (en) 2012-09-11
EP1709051A1 (en) 2006-10-11
EA013117B1 (ru) 2010-02-26
IL176543A0 (en) 2006-10-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI464172B (zh) 吡唑并－喹唑啉化合物
ES2656471T3 (es) Derivados de pirazolo-pirrolidin-4-ona como inhibidores de BET y su uso en el tratamiento de enfermedades
CA2584493A1 (en) Kinase inhibitors for treating cancers
JP2002537223A (ja) サイクリン依存性キナーゼ阻害剤として有用な６−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン類
JP2003509428A (ja) 治療薬としてのピラゾロピリミジン
AU2010295622A1 (en) Tricyclic compounds and pharmaceutical uses thereof
EP1832589A1 (en) Inhibitors of cyclin-dependent kinases,compositions and uses related thereto
JP2019507779A (ja) 尿素系化合物、その製造方法及びその医薬用途
JP7109919B2 (ja) Ｕｓｐ７阻害剤化合物及び使用方法
JP2004524277A (ja) アシルセミカルバジド及びサイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）阻害剤としてのその使用
KR101155883B1 (ko) 사이클린 의존적 키나제 저해제, 그 조성물 및 그의 용도
US7893057B2 (en) Inhibitors of cyclin-dependent kinases, compositions and uses related thereto
US6753329B2 (en) Inhibitors of cyclin-dependent kinases, compositions and uses related thereto
US7605175B2 (en) Inhibitors of cyclin-dependent kinases, compositions and uses related thereto
AU2002361570A1 (en) Inhibitors of cyclin-dependent kinases, compositions and uses related thereto
JP6927959B2 (ja) ベンジリデングアニジン誘導体と化学療法剤の併用による癌の治療方法
CN100471858C (zh) 依赖细胞周期蛋白的激酶抑制剂及其组合物和相关用途
CN107353286A (zh) 新型咪唑并[1,2-b]哒嗪酰胺类Bcr-Abl激酶抑制剂及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee