EA013117B1 - Ингибиторы циклинзависимых киназ, относящиеся к ним композиции и применения - Google Patents

Abstract

Изобретение имеет отношение к новому ингибитору циклинзависимых киназ (cdk) формулы (I). Как описано в настоящем описании, ингибитор по настоящему изобретению способен ингибировать механизм клеточного цикла и, следовательно, может быть применимым в регуляции прогрессии клеточного цикла, в конечном счете, регуляции роста и дифференцировки клеток. Такое соединение будет применимым для лечения пациентов с избыточной пролиферацией клеток.

Description

I. Область изобретения

Настоящее изобретение относится, в общем, к соединениям, используемым в качестве ингибиторов циклинзависимый киназы (сбк), фармацевтическим композициям, включающим их, способам для их рецензирования или использования для лечения рака или пролиферативных или других заболеваний, и промежуточным соединениям и способам для их получения.

II. Предшествущий уровень техники изобретения

Одним из наиболее важных и фундаментальных процессов в биологии является деление клеток, опосредованное клеточным циклом. Этот процесс обеспечивает регулируемую продукцию клеток с определенной биологической функцией. Это высокорегулируемый феномен, и он реагирует на различные группы клеточных сигналов и внутри клетки, и из наружных источников. Комплексная сеть генетических продуктов, стимулирующих и подавляющих опухоль, являются ключевыми компонентами такого клеточного сигнального процесса. Повышенная экспрессия компонентов, вызывающих опухоль, или последовательная потеря продуктов, подавляющих опухоль, приведет к нерегулируемой клеточной пролиферации и росту опухолей (Рагбее, 8е1еисе 246:603-608, 1989). Циклинзависимые киназы играют ключевую роль в регуляции механизма клеточного цикла. Такие комплексы состоят из двух компонентов: каталитической субъединицы (киназа) и регуляторной субъединицы (циклин). К настоящему времени были идентифицированы девять киназных субъединиц (циклинзависимые киназы 1-9) вместе с несколькими регуляторными субъединицами (циклины А-Н, К, N и Т). Каждая киназа связывается со специфическим регуляторным партнером, и они вместе создают активный каталитический компонент. Каждый переход клеточного цикла регулируется определенным циклинзависимым киназным комплексом: С1/8 посредством циклинзависимой киназы 2/циклина Е, циклинзависимой киназы 4/циклина Ό1 и циклинзависимой киназыб/циклина Ό2; 8/С2 посредством циклинзависимой киназы2/циклина А и циклинзависимой киназы1/циклина А; С2/М посредством циклинзависимой киназы 1/циклина Ό. Согласованная активность этих киназ ведет отдельные клетки через процесс репликации и обеспечивает жизнеспособность каждого последующего поколения (8йегг, Се11 73:1059-1065, 1993; ОгаеЕа, Тгепбк Вюсйет. 8с1. 15:378-382, 1990).

Увеличивающаяся совокупность доказательств показывает связь между развитием опухолей и неправильной работой циклинзависимой киназы. Повышенная экспрессия циклин-регуляторных белков и последующая гиперактивность киназы связана с несколькими типами рака (Лайд, Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 90:9026-9030, 1993; ^аид, №Шге 343:555-557, 1990). Позднее было обнаружено, что эндогенные, высокоспецифичные белковые ингибиторы циклинзависимых киназ оказывают значительный эффект на клеточную пролиферацию (КатЬ е1 а1., 8с1епсе 264:436-440, 1994; Веасй, №Шге 336:701-704, 1993). Такие ингибиторы включают ρ16ΙΝΚ4 (ингибитор циклинзависимой киназы4/О1), р21С1Р1 (общий ингибитор циклинзависимой киназы), и р27К1Р1 (специфический ингибитор циклинзависимой киназы2/Е).

Современная кристаллическая структура р27, связанного с циклинзависимой киназой2/А, выявила, каким образом такие белки эффективно ингибируют активность киназы посредством множества взаимодействий с комплексом циклинзависимой киназы (Рау1еЕсй, №Шге 382:325-331, 1996). Такие белки помогают регулировать клеточный цикл посредством специфических взаимодействий с их соответствующими комплексами циклинзависимой киназы. Клетки с дефицитом таких ингибиторов подвержены нерегулируемому росту и образованию опухоли. Такая совокупность доказательств привела к интенсивному поиску низкомолекулярных ингибиторов семейства сбк в качестве терапевтических агентов.

III. Сущность изобретения

Настоящее изобретение описывает соединение, которое является сильным ингибитором класса ферментов, известных как циклинзависимые киназы. Настоящее изобретение обеспечивает способы лечения рака или других пролиферативных или других заболеваний посредством введения терапевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению или его изомерной, пролекарственной, таутомерной формы, фармацевтически приемлемой соли, Ν-оксида или стереоизомерной формы. Настоящее изобретение, кроме того, обеспечивает способы лечения рака или других пролиферативных или других заболеваний посредством введения терапевтически эффективной комбинации соединения по изобретению и другого противоракового или антипролиферативного агента.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает соединение, включая его изомерные, пролекарственные, таутомерные формы, фармацевтически приемлемые соли, Νоксиды, или стереоизомерные формы, имеющее структуру формулы I

В определенных вариантах осуществления изобретение предусматривает фармацевтически приемлемую соль соединения формулы I, имеющую структуру:

- 1 013117

В определенных вариантах осуществления изобретение предусматривает соединения, описанные в настоящем описании в виде очищенной или синтетической формы.

Определенные варианты осуществления изобретения могут включать фармацевтические композиции, включающие фармацевтически приемлемый наполнитель и соединение любого типа, описанного в настоящем описании, тогда как определенные варианты осуществления изобретения включают способ лечения гиперпролиферативного расстройства, включающий введение животному соединения любого типа, описанного в настоящем описании.

В определенных вариантах осуществления изобретения, соединения, описанные в настоящем описании, могут быть применены в способах ингибирования пролиферации клеток, включающих контакт клетки с соединением типа, описанного в настоящем описании, или в способах лечения вирусной инфекции (такой как инфекция, вызванная вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ)), включающих введение млекопитающему соединения типа, описанного в настоящем описании. Определенные варианты осуществления изобретения предусматривают способы для лечения или предотвращения алопеции, индуцированной химиотерапией или лучевой терапией, включающие введение млекопитающему соединения типа, описанного в настоящем описании, совместно с одним или более химиотерапевтическими агентами или лучевой терапией. Соединения, описанные в настоящем описании, могут также быть использованы для получения лекарственного препарата.

Соединения также могут быть использованы для лечения расстройств, таких как гиперпролиферативные расстройства. Соединения можно вводить людям или животным. Соединения могут быть использованы для ингибирования клеточной пролиферации, например, посредством контакта пролиферирующих клеток с соединениями. Соединения также могут быть использованы для лечения вирусной инфекции путем введения соединения млекопитающему.

Лекарственные препараты, полученные с использованием соединений, могут быть использованы в качестве лекарственных средств для лечения или предотвращения расстройства (например, гиперпролиферативного расстройства, вирусной инфекции, алопеции, индуцированной химиотерапией, заболевания, ассоциированного с активностью циклинзависимой киназы и др.). Применение лекарственного препарата может быть в лечении любого из расстройств, описанных в настоящем описании.

Различные способы также доступны с использованием соединений. Например, способы могут быть приспособлены для ингибирования циклинзависимой киназы введением в организм-хозяин, нуждающийся в таком лечении, терапевтически эффективного количества любого из соединений. Также способы могут быть адаптированы для лечения расстройств, ассоциированных с циклинзависимыми киназами, включающие введение организму-хозяину, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества соединения. Способы лечения человека или животного также предусматриваются в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления изобретения человек или животное может получать лечение с использованием композиции, содержащей терапевтически эффективное количество одного или более соединений по настоящему изобретению.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает новую фармацевтическую композицию, включающую фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество соединения по формуле (I), или его изомерной, пролекарственной, таутомерной формы, фармацевтически приемлемой соли, Ν-оксида или стереоизомерной формы.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает новый способ лечения рака или другого пролиферативного или другого заболевания, включающий введение в организм-хозяин, нуждающийся в таком лечении, терапевтически эффективного количества соединений формулы (I) или его изомерной, пролекарственной, таутомерной формы, фармацевтически приемлемой соли, Ν-оксида или стереоизомерной формы.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает новый способ лечения рака или другого пролиферативного или другого заболевания, включающий введение в организм-хозяин, нуждающийся в таком лечении, терапевтически эффективного количества: (а) соединения формулы (I) или его изомерной, пролекарственной, таутомерной формы, фармацевтически приемлемой соли, Ν-оксида или стереоизомерной формы; и (Ь) по меньшей мере одного соединения, выбираемого из противораковых агентов и антипролиферативных агентов.

Как описано в настоящем описании, ингибиторы по настоящему изобретению способны ингибировать механизм клеточного цикла, следовательно, будут применимыми в регуляции прогрессирования клеточного цикла, что будет, в конечном счете, регулировать клеточный рост и дифференцировку. Такие соединения будут применимыми для лечения пациентов, имеющих расстройства, ассоциированные с избыточной клеточной пролиферацией, такие как рак, псориаз, иммунологические расстройства, вклю

- 2 013117 чающие нежелательную пролиферацию лейкоцитов, в лечении рестеноза и других заболеваний гладких мышц и подобных. Такие соединения также будут полезными в ингибировании транскрипции вируса иммунодефицита человека типа I (ВИЧ-Ι) (^апд с1 а1., 1. Упо1оду 75:7266-7279 (2001).

Также описанные в настоящем описании соединения по изобретению могут быть использованы в получении лекарственного препарата, который может быть использован для лечения заболеваний, таких как обсуждаемые в настоящем описании.

IV. Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает эффекты воздействия соединения на: (а) анализ клеточного цикла клеток НСТ116 посредством анализа ΡΙ ЕАС8; (Ь) индукцию расщепления РАКР.

Фиг. 2 иллюстрирует необратимый эффект соединения на клоногенное выживание опухолевых клеток НСТ-116, что представлено (а) ответом на дозу; и (Ь) временным курсом.

Фиг. 3 изображает необратимый эффект соединения В16 на клоногенное выживание опухолевых клеток НСТ-116, что представлено временным курсом.

Фиг. 4 показывает сниженную выживаемость остановленных опухолевых клеток (НСТ-116), подвергнутых воздействию соединения по сравнению с остановленными нормальными клетками (ΙΜΚ90), подвергнутыми воздействию такого же соединения.

Фиг. 5 представляет результаты, полученные из анализа ксенотрансплантированной опухоли НСТ116 с различными соединениями по изобретению.

Фиг. 6 показывает результаты, полученные из анализа ксенотрансплантированной опухоли А2780 с соединением, представленные (а) временным курсом размера опухоли при различных дозах; и (Ь) таблицей заметных показателей из анализа.

Фиг. 7 показывает результаты, полученные из анализа ксенотрансплантированной опухоли РС3 с соединением, представленные (а) временным курсом размера опухоли при различных дозах; и (Ь) таблицей заметных показателей из анализа.

Фиг. 8 показывает результаты, полученные из анализа ксенотрансплантированной опухоли А2780 с соединением В16, представленные (а) временным курсом размера опухоли при различных дозах; и (Ь) таблицей заметных показателей из анализа.

Фиг. 9 показывает как пример результаты, полученные для связывания СИК2/циклина Е с осколком, нагруженным ингибитором СМ5. Ко, рассчитанная из этих данных, составляет до 8,0 +/- 2,8 нМ.

V. Подробное описание примерных вариантов осуществления изобретения

Изобретение относится к новым ингибиторам циклинзависимых киназ (сбк) и в особенности, но не только, в качестве ингибиторов комплексов сбк/циклин. Как описано в настоящем описании, ингибиторы по настоящему изобретению способны ингибировать механизм клеточного цикла и, следовательно, могут быть применимыми в регуляции прогрессирования клеточного цикла, в конечном счете, регулируя рост и дифференцировку клеток. Такие соединения будут применимыми для лечения пациентов, имеющих заболевания, ассоциированные с избыточной клеточной пролиферацией, таких как лечение рака, псориаза, иммунологических расстройств, включающих нежелательную пролиферацию лейкоцитов, в лечении рестеноза и других расстройств гладких мышц, и подобных, как обсуждается более детально ниже.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает соединение (соединение В16), включая его изомерные, пролекарственные, таутомерные формы, фармацевтически приемлемые соли, Ν-оксид, или стереоизомерные формы, имеющее структуру формулы I

В другом варианте осуществления настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтически приемлемую соль соединения формулы I, имеющую структуру:

В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает выделенное пролекарство или фармацевтически приемлемую соль метаболита соединения В16.

В другом варианте осуществления изобретение обеспечивает новую фармацевтическую композицию, включающую фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество соединения по формуле I или его изомерные, пролекарственные, таутомерные формы, фармацевтически приемлемые соли, Ν-оксиды, или стереоизомерные формы. В альтернативном варианте осуществления изобретения такая фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество пролекарства или фармацевтически приемлемой соли метаболита соединения В16.

- 3 013117

В определенных вариантах осуществления изобретение предусматривает обеспечение соединение, описанное в настоящем описании, в очищенной или синтетической форме.

В другом варианте осуществления изобретения настоящее изобретение обеспечивает новый способ лечения рака или другого пролиферативного или другого заболеваний, включая любое заболевание или состояние, обсуждаемое ниже, включающий введение в организм-хозяин, нуждающийся в таком лечении, терапевтически эффективного количества соединения по формуле I, или его изомерных, пролекарственных, таутомерных форм, фармацевтически приемлемых солей, Ν-оксидов, или стереоизомерных форм. В определенных вариантах осуществления изобретения, по меньшей мере, одно соединение, выбираемое из противораковых агентов и антипролиферативных агентов, может быть введено вместе с соединением по формуле I или его изомерной, пролекарственной, таутомерной формой, фармацевтически приемлемой солью, Ν-оксидом, или стереоизомерной формой. Совместное введение, как термин, используемый в настоящем описании, охватывает лечение, когда два лекарственных препарата смешивают в одном препарате, вводят, например, одновременно или в различное время, в отдельных препаратах или иным образом вводят пациенту, как часть схемы лечения.

В другом варианте осуществления изобретение обеспечивает способ рецептирования фармацевтической композиции, включающей терапевтически эффективное количество соединения формулы I или или его изомерной, пролекарственной, таутомерной формы, фармацевтически приемлемой соли, Νоксида, или его стереоизомерной формы, и необязательно фармацевтически приемлемого носителя. В следующих вариантах осуществления изобретения фармацевтические композиции по изобретению предназначены для применения в лечении заболевания, такого как рак, и других пролиферативных и других заболеваний, включая любое заболевание или состояние, обсуждаемое ниже.

ίί. Определения.

Как используется в настоящем описании, следующие термины и выражения имеют указанные значения. Соединение по настоящему изобретению может содержать асимметрически замещенный атом углерода и может быть выделено в оптически активной или рацемических формах. Хорошо известно в области техники, как получать оптически активные формы, например, разделением рацемических форм или синтезом из оптически активных исходных веществ. Все хиральные, диастереомерные, рацемические формы и все геометрические изомерные формы структуры предусматриваются, если не указана специфически определенная стереохимия или изомерная форма. Все процессы, используемые для получения соединения по настоящему изобретению, и промежуточные соединения, полученные в нем, рассматриваются как часть настоящего изобретения.

Настоящее изобретение предназначено для включения всех изотопов атомов, существующих в настоящих соединениях. Изотопы включают атомы, имеющие такой же атомный номер, но различные массовые номера. В качестве общего примера и без ограничения, изотопы водорода включают тритий и дейтерий. Изотопы углерода включают ¹²С и ¹⁴С.

Как используется в настоящем описании, фармацевтически приемлемая соль относится к производным описанного соединения, где исходное соединение модифицируют посредством получения его кислых или основных солей. Примеры фармацевтически приемлемых солей включают, но не ограничиваются, соли минеральных или органических кислот основных остатков, таких как амины; щелочные или органические соли кислых остатков, таких как карбоновые кислоты; и подобные. Фармацевтически приемлемые соли включают обычные нетоксические соли или соли четвертичного аммония исходного соединения, образуемые, например, из нетоксических неорганических или органических кислот.

Например, такие обычные нетоксические соли включают полученные из неорганических кислот, таких как соляная, бромисто-водородная, серная, сульфамовая, фосфорная, азотная и подобные; и соли, полученные из органических кислот, таких как уксусная, пропионовая, янтарная, гликолевая, стеариновая, молочная, яблочная, винно-каменная, лимонная, аскорбиновая, памоевая, малеиновая, гидроксималеиновая, фенилуксусная, глютамовая, бензойная, салициловая, сульфаниловая, 2-ацетоксибензойная, фумаровая, толуолсульфоновая, метансульфоновая, этандисульфоновая, щавелевая, изетионовая, и подобные.

Фармацевтически приемлемые соли по настоящему изобретению могут быть синтезированы из исходного соединения, которое содержит основный или кислый компонент посредством обычных химических способов. Обычно такие соли могут быть получены реакцией свободных кислых или основных форм таких соединений со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в воде или в органическом растворителе, или в смеси двух; обычно предпочтительными являются неводная среда, как простой эфир, Е1ОАс, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Списки подходящих солей обнаруживаются в К.ешшдои'8 Рйагтасеибса1 8с1еисе5, 18⁴¹¹ еб., Маск РиЫщЫид Сотрапу, Еайои, РА, 1990, р. 1445, описание которой таким образом включено в виде ссылки.

Фраза фармацевтически приемлемый используется в настоящем описании для обозначения таких соединений, материалов, композиций и/или лекарственных форм, которые являются, в рамках озвученного медицинского мнения, подходящими для применения в контакте с тканями человека и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблем или осложнений, соответствующих приемлемому соотношению польза/риск.

- 4 013117

Пролекарства, как термин, используемый в настоящем описании, предназначен для включения любых ковалентно связанных источников, которые высвобождают активное исходное лекарственное средство по настоящему изобретению ίη νίνο когда такое пролекарство вводят пациенту млекопитающему. Так как известно, что пролекарства усиливают ряд желательных качеств фармацевтических препаратов (т.е. растворимость, биодоступность, производство и др.) соединения по настоящему изобретению могут быть доставлены в форме пролекарства. Следовательно, настоящее изобретение предназначено для охватывания пролекарств заявленных настоящим соединением, способов доставки их и композиций, содержащих их. Пролекарства по настоящему изобретению получают модификацией функциональных групп, присутствующих в соединении таким образом, что модификации отщепляются, любой обычной манипуляцией или ίη νίνο, до исходного соединения. Пролекарства включают соединения по настоящему изобретению, где гидрокси, амино или сульфгидрильную группу связывают с любой группой, которая, когда пролекарство по настоящему изобретению вводят пациенту млекопитающему, отщепляется для образования свободной гидроксильной, свободной амино или свободной сульфгидрильной группы, соответственно. Примеры пролекарств включают, но не ограничиваются, ацетатное, форматное и бензоатное производные спиртовой и амино функциональной групп в соединениях по настоящему изобретению.

Термин чистый или очищенный обозначает, что указанная молекула присутствует, по существу, в отсутствии других органических молекул, особенно загрязнений, таких как побочные продукты или продукты пути разложения. В определенных вариантах осуществления изобретения чистое или очищенное соединение составляет по меньшей мере 80% сухой массы, более предпочтительно в диапазоне 95-99% по массе и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99,8% по массе органических соединений в композиции (например, исключая воду, буферы, вспомогательные вещества и подобные молекулы, которые могут присутствовать в фармацевтическом препарате соединения).

Термин терапевтически эффективное количество соединения по настоящему изобретению обозначает количество, эффективное для ингибирования класса ферментов, известных как циклинзависимые киназы или лечения симптомов рака или других пролиферативных или других заболеваний организма-хозяина.

Как используется в настоящем описании, термин противораковый или антипролиферативный агент включает, но не ограничивается, альтретамин, бусульфан, хлорамбуцил, циклофосфамид, ифосфамид, мехлорэтамин, мелфалан, тиотепа, складрибин, флуороурацил, флоксуридин, гемцитабин, тиогуанин, пентостатин, метотрексат, 6-меркаптопурин, цитарабин, кармустин, ломустин, стрептозотоцин, карбоплатин, цисплатин, оксалиплатин, ипроплатин, тетраплатин, лобаплатин, 1М216, 1М335, флударабин, аминоглютетимид, флутамид, госерелин, лейпролид, ацетат мегестрола, ацетат ципротерона, тамоксифен, анастрозол, бикалютамид, дексаметазон, диэтилстильбэстрол, преднизон, блеомицин, дактиномицин, даунорубицин, доксирубицин, идарубицин, митоксантрон, лозоксантрон, митомицин-с, пликамицин, паклитаксел, доцетаксел, топотекан, иринотекан, 9-аминокамптотекан, 9-нитрокамптотекан, 08-211, 1М 118, этопозид, тенипозид, винбластин, винкристин, винорелбин, прокарбазин, аспарагиназу, пегаспаргазу, октреотид, эстрамустин и гидроксимочевину.

ϊϊΐ. Дозировка и композиции.

Ингибитор циклинзависимых киназ по настоящему изобретению может быть введен для лечения рака или пролиферативных или других заболеваний любыми средствами, которые обеспечивают контакт активного агента с местом действия агента в организме млекопитающего. Их можно вводить любыми обычными средствами, доступными для применения в сочетании с фармацевтическими препаратами, и в виде отдельных терапевтических агентов или в комбинации терапевтических агентов. Химические характеристики ингибитора, описанного в настоящем описании, представляют отличные свойства растворимости соединения, делая его подходящими для введения в виде внутривенных композиций, местных композиций, пероральных композиций и других, что обсуждается более детально ниже. Его можно вводить отдельно, но предпочтительно вводят с фармацевтическим носителем, выбираемым на основе выбранного пути введения и стандартной фармацевтической практики. Подходящие носители и их композиции описаны, например, в книге ΒοιηίημΙοη'δ Р11аппасеиНса1 8с1епсе8 (Ροιηίηφοη'δ Р11агтассиНса1 8с1спсс5. Маск РиЫЫшщ ^тра^, ΕαδΙοη. Ра., И8Л 1985).

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтически приемлемые композиции, которые включают терапевтически эффективное количество соединения по предмету изобретения, так как описано выше, рецептированное вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями (добавками) и/или разбавителями. Как описано более детально ниже, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть специально рецептированы для введения в твердой или жидкой форме, включая приспособленные к следующему: (1) пероральное введение, например, жидкие лекарства (водные или неводные растворы или суспензии), таблетки, болюсы, порошки, гранулы, пасты для нанесения на язык; (2) парентеральное введение, например, подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекцией в виде, например, стерильного раствора или суспензии; (3) местное нанесение, например, в виде крема, мази или спрея, наносимого на кожу; или (4) интравагинально или интраректально, например, в виде вагинального суппозитория, крема или пены. В определенных вариантах осуществления изобретения фармацевтические препараты могут быть непирогенными, т.е. не повышать темпера

- 5 013117 туру тела пациента.

Увлажняющие агенты, эмульгаторы и смазывающие агенты, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красящие агенты, агенты высвобождения, оболочечные вещества, подслащающие, вкусовые и ароматизирующие агенты, консерванты и антиоксиданты также могут присутствовать в композициях.

Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина, бисульфат натрия, метабисульфат натрия, сульфит натрия и подобные; (2) жирорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбинпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол, и подобные; и (3) хелатирующие агенты металлов, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), сорбит, винно-каменная кислота, фосфорная кислота и подобные.

Вводимая доза будет, конечно, варьироваться от известных факторов, таких как фармакодинамические характеристики определенного агента и его тип и путь введения; возраст, состояние здоровья и масса реципиента; природа и степень выраженности симптомов; вид сопутствующего лечения; частота лечения; и желаемый эффект. Можно ожидать, что суточная дозировка активного ингредиента составит от около 0,001 до около 1000 мг на килограмм массы тела, с предпочтительной дозой, составляющей от около 0,1 до около 30 мг/кг.

Лекарственные формы композиций, подходящие для введения, содержат от около 1 мг до около 100 мг активного ингредиента на единицу. В таких фармацевтических композициях активный ингредиент обычно присутствует в количестве около 0,95% по массе на основании общей массы композиции. Активный ингредиент может быть введен перорально в твердых лекарственных формах, таких как капсулы, таблетки и порошки, или в жидких лекарственных формах, таких как эликсиры, сиропы и суспензии. Его также можно вводить парентерально, в стерильной жидкой лекарственной форме.

Композиции по настоящему изобретению включают таковые, подходящие для перорального, назального, местного (включая буккальный и сублингвальный), ректального, вагинального и/или парентерального введения. Композиции могут обычно быть представлены в стандартных лекарственных формах и могут быть получены любыми способами, хорошо известными в области техники фармацевтики. Количество активного ингредиента, которое может быть скомбинировано с носителем для получения однократной лекарственной формы, будет варьироваться в зависимости от организма-хозяина, получающего лечение, определенного типа введения. Количество активного ингредиента, которое может быть смешано с веществом носителем для получения однократной лекарственной формы, будет обычно таким количеством ингибитора, которое вызывает терапевтический эффект. Обычно вне 100%, такое количество будет варьироваться от около 1 до около 99% активного ингредиента, предпочтительно от около 5 до около 70%, наиболее предпочтительно от около 10 до около 30%.

Способы получения таких рецептур или композиций включают стадию взаимодействия соединения по настоящему изобретению с носителем и, необязательно, одним или более вспомогательными ингредиентами. В общем, композиции получали посредством гомогенного и непосредственного взаимодействия ингибитора по настоящему изобретению с жидкими носителями, или мелко измельченными твердыми носителями, или обоими и затем, если необходимо, придания формы продукту.

Композиции по изобретению, подходящие для перорального введения могут быть в форме капсул, облаток, пилюль, таблеток, пастилок (с использованием ароматизирующего основания, обычно сахарозы, и акации или трагаканта), порошков, гранул или в виде раствора или суспензии в водной или неводной жидкости, или в виде жидкой эмульсии типа масло-в-воде или вода-в-масле, или в виде эликсира или сиропа, или в виде лепешек (с использованием инертной основы, такой как желатин и глицерин или сахароза и акация), и/или в качестве ополаскивателей для рта и подобных, каждый содержащий заранее определенное количество соединения по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. Ингибитор по настоящему изобретению может также вводиться в виде болюса, электуария или пасты.

В твердых лекарственных формах по изобретению для перорального введения (капсулы, таблетки, пилюли, драже, порошки, гранулы и подобные) активный ингредиент смешивают с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, такими как цитрат натрия или фосфат дикальция, и/или любым из следующего: (1) заполнитель или наполнитель, такой как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и/или кремниевая кислота; (2) вяжущие вещества, такие как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и/или акация; (3) увлажнители, такие как глицерин; (4) дезинтегрирующие агенты, такие как агар-агар, карбонат кальция, крахмал картофеля или тапиоки, альгиновая кислота, определенные силикаты, и карбонат натрия; (5) агенты, замедляющие растворение, такие как парафин; (6) ускорители всасывания, такие как соединения четвертичного аммония; (7) увлажняющие агенты, такие как, например, цетиловый спирт и моностеарат глицерина; (8) поглощающие вещества, такие как каолиновая и бентонитовая глина; (9) смазывающие агенты, такие как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси; и (10) красители. В случае капсул, таблеток и пилюль, фармацевтические композиции могут также включать буферные агенты. Твердые композиции подобного типа также могут использоваться в качестве на

- 6 013117 полнителей в мягких и твердых наполненных желатиновых капсулах с использованием таких вспомогательных веществ, как лактоза или молочные сахара, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и подобные.

Таблетка может быть получена прессованием или литьем, необязательно с одним или более вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть получены с использованием вяжущего вещества (например, желатина или гидроксипропилметилцеллюлозы), смазывающего агента, инертного разбавителя, консерванта, разрыхляющего агента (например, гликолата крахмала натрия или сшитой карбоксиметилцеллюлозы натрия), поверхностно-активного или диспергирующего агента. Литые таблетки могут быть получены литьем в подходящем аппарате смеси порошкообразного ингибитора, увлажненного инертным жидким разбавителем.

Таблетки и другие твердые лекарственные формы фармацевтических композиций по настоящему изобретению, такие как драже, капсулы, пилюли и гранулы, могут необязательно быть сделаны шероховатыми или полученными с оболочками и капсулами, такими как кишечно-растворимые оболочки и другие оболочки, хорошо известные в области техники фармацевтического рецептирования. Также они могут быть композициями для обеспечения медленного или регулируемого высвобождения активного ингредиента в ней с использованием, например, гидроксипропилметилцеллюлозы в различных пропорциях для получения желаемого профиля высвобождения, других полимерных матриц, липосом и/или микросфер. Они могут быть стерилизованы посредством, например, фильтрации через фильтр, удерживающий бактерий, или посредством включения стерилизующих агентов в форме стерильных твердых композиций, которые могут быть растворены в стерильной воде, или какой-либо другой стерильной инъекционной среде непосредственно перед применением. Такие композиции могут также необязательно содержать замутняющие компоненты и могут быть композицией, которой они высвобождают только активный ингредиент(ы) или предпочтительно, в определенную часть желудочно-кишечного тракта, необязательно, отложенным образом. Примеры встроенных композиций, которые могут быть использованы, включают полимерные вещества и воска. Активный ингредиент также может быть в микроинкапсулированной форме, если необходимо, с одним или более из описанных выше вспомогательных веществ.

Жидкие лекарственные формы для перорального введения соединения по изобретению включают фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. В добавление к активному ингредиенту жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в области техники, такие как, например, вода или другие растворители, растворяющие агенты и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, зародышей пшеницы, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры сорбита и жирных кислот и их смеси.

Помимо инертных разбавителей пероральные композиции также могут включать добавки, такие как увлажняющие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, подслащающие, ароматизирующие, красящие, парфюмирующие и консервирующие агенты.

Суспензии в добавление к активному ингибитору по настоящему изобретению могут содержать суспендирующие агенты, как, например, этоксилированные изостеариловые спирты, сложные эфиры полиоксиэтилена-сорбита и сорбита, микрокристаллическую целлюлозу, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, и их смеси.

Композиции фармацевтических композиций по изобретению для ректального или вагинального введения могут быть представлены в виде суппозитория, который может быть получен смешиванием соединения по изобретению с одним или более подходящими нераздражающими носителями или источниками, включающими, например, масло какао, полиэтиленгликоль, воск для суппозиториев или салицилат, и который является твердым при комнатной температуре, но жидким при температуре тела и, следовательно, расплавляется в прямой кишке или полости влагалища и высвобождает активный ингибитор.

Композиции по настоящему изобретению, которые являются подходящими для вагинального введения, также включают композиции пессарии, тампоны, кремы, гели, пасты, пены или спреи, содержащие такие носители, которые известны в области техники как соответствующие.

Лекарственные формы для местного или трансдермального введения соединения по настоящему изобретению включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и ингаляторы. Активное соединение может быть смешано в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и с любыми консервантами, буферами или пропеллентами, которые могут потребоваться.

Мази, пасты, кремы и гели могут содержать, в добавление к активному ингибитору пренилтрансферазы, носители, такие как животные и растительные жиры, масла, воска, парафины, крахмал, трагакант, производные целлюлозы, полиэтиленгликоли, кремнийорганические соединения, бентониты, кремниевую кислоту, тальк и оксид цинка, или их смеси.

Порошки и спреи могут содержать, в добавление к соединению по настоящему изобретению, носители, такие как лактоза, тальк, кремниевая кислота, гидроксид алюминия, силикаты кальция и порошок

- 7 013117 полиамида или смеси таких веществ. Спреи могут кроме того содержать обычные пропелленты, такие как хлорфторгидроуглероды и летучие незамещенные углеводороды, такие как бутан и пропан.

Трансдермальные пластыри имеют дополнительное преимущество обеспечения регулируемой доставки соединения по настоящему изобретению в организм. Такие лекарственные формы могут быть получены растворением или диспергированием ингибитора по настоящему изобретению в соответствующей среде. Усилители абсорбции также могут быть использованы для увеличения тока лекарственного средства через кожу. Скорость такого тока может регулироваться и обеспечением мембраны, регулирующей ток, и диспергированием соединения по настоящему изобретению в полимерной матрице или геле.

Офтальмологические композиции, глазные мази, порошки, растворы и подобные также предусмотрены в рамках настоящего изобретения.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению, подходящие для парентерального введения, включают ингибитор по изобретению в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми стерильными изотоническими водными или неводными растворами, дисперсиями, суспензиями или эмульсиями, или стерильными порошками, которые могут быть восстановлены в стерильных инъекционных растворах или дисперсиях сразу перед применением, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики, растворенные вещества, делающие композицию изотонической с кровью предназначенного реципиента или суспендирующий или загущающий агенты.

Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые могут использоваться в фармацевтических композициях по изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и подобные) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Соответствующую текучесть можно поддерживать, например, посредством использования оболочечных веществ, таких как лецитин, поддержанием требуемого размера частиц в случае дисперсий и применением поверхностноактивных веществ.

Такие композиции могут также содержать добавки, такие как консерванты, увлажняющие агенты, эмульгирующие агенты и диспергирующие агенты. Предотвращение действия микроорганизмов может быть обеспечено включением различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабена, хлорбутанола, фенолсорбиновой кислоты и подобных. Также может быть желательным включать в композиции изотонические агенты, такие как сахара, хлорид натрия и подобные. Кроме того, пролонгированное всасывание инъекционной фармацевтической формы может быть осуществлено посредством включения агентов, которые замедляют всасывание, таких как моностеарат алюминия и желатин.

В некоторых случаях, с целью продления терапевтического эффекта ингибитора, желательно замедлить всасывание ингибитора из подкожной или внутримышечной инъекции. Это может быть осуществлено применением жидкой суспензии кристаллического или аморфного вещества, имеющего плохую растворимость в воде. Затем скорость всасывания ингибитора зависит от его скорости растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от размера кристаллов и кристаллической формы. Альтернативно, отложенное всасывание парентеральной вводимой формы ингибитора осуществляется растворением или суспендированием ингибитора в масляном носителе.

Инъекционные депоты формы получают образованием микроинкапсулированных матриц ингибиторов по изобретению в биоразлагаемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения лекарственного средства к полимеру и природы определенного используемого полимера скорость высвобождения лекарственного средства может контролироваться. Примеры других биоразлагаемых полимеров включают поли(ортосложные эфиры) и поли(ангидриды). Инъекционные депоты композиции также получают захватыванием лекарственного средства в липосомы или микроэмульсии, которые совместимы с тканями организма.

Когда соединение по настоящему изобретению вводят в качестве фармацевтических препаратов людям и животным, его можно давать как таковое или в виде фармацевтической композиции, содержащей, например от 0,1 до 99,5% (более предпочтительно от 0,5 до 90%) активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Препараты по настоящему изобретению можно давать перорально, парентерально, местно или ректально. Их, естественно, дают в формах, подходящих для каждого пути введения. Например, их вводят в форме таблеток или капсул, инъекциями, ингаляцией, лосьоном для глаз, мазью, суппозиторием и др. введением посредством инъекции, инфузии или ингаляции; местно посредством лосьона или мази; и ректально суппозиториями. Пероральное введение является предпочтительным.

Фразы парентеральное введение и вводимые парентерально, как используется в настоящем описании, обозначает пути введения, иные, чем энтеральное и местное введение, обычно путем инъекции, и включает, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, интракапсулярную, интраорбитальную, внутрисердечную, интрадермальную, интраперитонеальную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субарахноидальную, интраспинальную и внутригрудинную инъекцию и инфузию.

Фразы системное введение, вводимый системно, периферическое введение и вводимый пе

- 8 013117 риферически, как используется в настоящем описании, обозначает введение соединения, лекарственного средства или другого вещества, иначе, чем непосредственно, в центральную нервную систему, так что оно попадает в систему пациента и, следовательно, подвергается метаболизму и другим подобным процессам, например, подкожное введение.

Вне зависимости от выбранного пути введения ингибитора СЭК. применимого в заявленном способе, могут быть использованы в подходящей гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции по настоящему изобретению рецептируют в фармацевтически приемлемые лекарственные формы обычными способами, известными специалисту в области техники.

Желатиновые капсулы содержат активный ингредиент и порошкообразные носители, такие как лактоза, крахмал, производные целлюлозы, стеарат магния, стеариновая кислота и подобное. Подобные разбавители могут быть использованы для получения прессованных таблеток. И таблетки и капсулы могут быть получены как продукты замедленного высвобождения для получения непрерывного высвобождения лекарственного препарата в течение периода часов. Прессованные таблетки могут быть покрыты оболочкой из сахара или покрыты пленкой для маскировки любого неприятного вкуса и защиты таблетки от атмосферы, или покрыты кишечно-растворимой оболочкой для селективного распада в желудочнокишечном тракте. Твердые композиции подобного типа также используются как наполнители в мягко- и твердо-наполненных желатиновых капсулах; предпочтительные материалы в этой связи также включают лактозу или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли. Предпочтительной композицией является раствор или суспензия в масле, например, оливковом масле, Мщ1уо1 или Сарти1, в мягкой желатиновой капсуле. Антиксиданты могут быть добавлены для предотвращения длительного разложения, если необходимо.

Жидкие лекарственные формы для перорального введения могут содержать красители и ароматизаторы для увеличения приемлемости пациентом. В общем, вода, подходящее масло, солевой раствор, этанол, водная декстроза (глюкоза), и связанные растворы сахара, гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоли, или их смеси являются подходящими носителями для парентеральных растворов.

Для внутривенного введения соединение, описанное выше, может быть рецептировано в виде стерильного раствора активного ингредиента, или в свободной или в форме соли, в физиологическом буфере или стерильной воде. Жидкие носители, содержащие сахар (такие как лактат Рингера или другие растворы глюкозы или декстрозы) могут быть использованы, если необходимо, с условием, что общее содержание сахара не вызывает нежелательного уровня молочнокислого ацидоза. Внутривенное введение можно проводить или посредством болюсной инъекции (предпочтительно несколько раз в сутки), или посредством непрерывной инфузии в течение продолжительного периода времени. Общие предпочтительные дозировки для болюсной инъекции или инфузии могут варьироваться существенно в зависимости от физического состояния пациента; в общем, они обычно варьируются от около 25 мг/кг до около 250 мг/кг.

Растворы для парентерального введения предпочтительно содержат водо-растворимую соль активного ингредиента, подходящие стабилизирующие агенты и, если необходимо, буферные вещества. Антиоксиданты, такие как бисульфит натрия, сульфит натрия или аскорбиновая кислота, отдельно или в комбинации, являются подходящими стабилизирующими агентами. Также используемыми являются лимонная кислота и ее соли и ЭДТА натрия. Кроме того, парентеральные растворы могут содержать консерванты, такие как хлорид бензалкония, метил- или пропилпарабен, и хлорбутанол. Подходящие фармацевтические носители описаны в К.етшд1ои'8 Рйагтасеи!1са1 Заеисек, 18'¹' её., Маск РиЫйЫид Сотрапу, Еайои, РА, 1990, стандартный ссылочный текст в этой области, описание которого таким образом включено в виде ссылки.

Композиции, растворы и другие препараты с использованием соединения В16 могут быть получены, как описано в заявках РСТ XVО 03/033499 и/или XVО 04/092139, описание которых включены в настоящее описание в виде ссылки.

ίν. Терапевтические применения.

Из-за ключевой роли сёк в регуляции клеточной пролиферации в общем, соединения, описанные в настоящем описании, могут действовать как обратимые цитостатические агенты, которые могут быть применимыми в лечении любого патологического процесса, который характеризуется нарушенной пролиферацией клеток, такого как гиперпролиферативные заболевания, включая рак, доброкачественную гиперплазию предстательной железы, семейный аденоматозный полипоз, нейрофиброматоз, псориаз, грибковую инфекцию, эндотоксический шок, образование гипертрофических шрамов, воспалительные заболевания кишечника, отторжение трансплантата, пролиферация сосудистых гладкомышечных клеток, ассоциированная с атеросклерозом, псориазом, легочным фиброзом, артритом, гломерулонефритом, рестенозом после ангиопластики или сосудистой хирургии, и других постоперационных стенозов и рестенозов. См., например, патенты США №№ 6114365 и 6107305.

Ожидают, что соединение, описанное в настоящем описании, будет применимым в лечении пролиферативных или гиперпролиферативных заболеваний, таких как рак, аутоиммунные заболевания, вирусные заболевания, грибковые заболевания, нейродегенеративные заболевания и сердечно-сосудистые заболевания.

- 9 013117

В частности, соединение, описанное в настоящем описании, является применимым в лечении множества раков, включая (но не ограничиваясь) следующее: карцинома, включая таковую мочевого пузыря, молочной железы, ободочной кишки, почки, печени, легкого, включая мелкоклеточный рак легкого, пищевода, желчного пузыря, яичника, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы, предстательной железы и кожи, включая плоскоклеточный рак; гематопоэтические опухоли лимфоидного происхождения, включая лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, Вклеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина, не-Ходжкинские лимфомы, волосатоклеточную лимфому, и лимфому Беркитта; гематопоэтические опухоли миелоидного происхождения, включая острые и хронические миелоидные лейкозы, миелодиспластический синдром, и промиелоцитарный лейкоз; опухоли мезенхимального происхождения, включая фибросаркому и рабдомиосаркому; опухоли центральной и периферической нервной системы, включая астроцитому, нейробластому, глиому и шванному; и другие опухоли, включая меланому, семиному, тератокарциному, остеосаркому, хепобегоша рщтегНощт. кератоктантому, фолликулярный рак щитовидной железы и саркому Капоши.

Соединение, описанное в настоящем описании, также может быть применимым в лечении болезни Альцгеймера, что предполагается последними находками, что с6к5 вовлечена в фосфорилирование белка тау (1. Вюсйет, 117, 741-749 (1995)).

Соединение, описанное в настоящем описании, может индуцировать или ингибировать апоптоз. Апоптоидный ответ является нарушенным при множестве болезней человека. Соединения, описанные в настоящем описании, как регуляторы апоптоза будут применимыми в лечении рака (включая, но не ограничиваясь типами, упомянутыми выше), вирусных инфекций (включая, но не ограничиваясь герпесвирус, поксвирус, вирус Эпштейн-Барра, вирус Синдбиса и аденовирус), предотвращении развития СПИД у ВИЧ-инфицированных пациентов, аутоиммунных заболеваний (включая, но не ограничиваясь, системную красную волчанку, эритематоз, аутоиммунный гломерулонефрит, ревматоидный артрит, псориаз, воспалительные заболевания кишечника и аутоиммунный сахарный диабет), нейродегенеративных расстройств (включая, но не ограничиваясь, болезнь Альцгеймера, деменцию, связанную с СПИД, болезнь Паркинсона, амиотрофический боковой склероз, пигментную дистрофию сетчатки, спинальную мышечную атрофию и церебральную дегенерацию), миелодиспластических синдромов, апластической анемии, ишемического повреждения, ассоциированного с инфарктом миокарда, инсультом и реперфузионным повреждением, аритмии, атеросклероза, токсических или алкогольных поражений печени, гематологических заболеваний (включая, но не ограничиваясь, хроническую анемию и апластическую анемию), дегенеративных заболеваний скелетно-мышечной системы (включая, но не ограничиваясь, остеопороз и артрит), аспирин-чувствительного риносинусита, муковисцидоза, рассеянного склероза, заболеваний почек и раковой боли.

Соединение, описанное в настоящем описании, как ингибитор сбк, может регулировать уровень клеточного синтеза РНК и ДНК. Следовательно, этот агент будут применим в лечении вирусных инфекций (включая, но не ограничиваясь, ВИЧ, человеческий папилломавирус, герпесвирус, поксвирус, вирус Эпштейн-Барра, вирус Синдбиса и аденовирус).

Соединение, описанное в настоящем описании, также может быть применимым в химиопрофилактике рака. Химиопрофилактику определяют как ингибирование развития инвазивного рака или блокированием начального мутагенного события, или блокированием прогрессирования презлокачественных клеток, которые уже имеют повреждение, или ингибирование рецидива опухоли.

Соединение, описанное в настоящем описании, также может быть применимым в ингибировании опухолевого ангиогенеза и метастазирования.

Соединение, описанное в настоящем описании, также может использоваться в предотвращении потери волос, которая обычно сопровождает множество традиционных схем химиотерапии. Например, ингибитор СЭК по изобретению может быть использован для ингибирования пролиферации клеток в волосяных фолликулах, таким образом избавляя их от поражения цитотоксическим агентом, который нацелен на пролиферирующие клетки.

Соединение, описанное в настоящем описании, также может действовать как ингибитор других протеинкиназ, например, протеинкиназы С, йег2, гаГ 1, МЕК1, МАР киназы, рецептора ЕСЕ, рецептора РИСЕ, рецептора 1СР, Р13 киназы, киназы \\'еек 8гс, АЫ и, следовательно, быть эффективным в лечении заболеваний, ассоциированных с другими протеинкиназами.

Соединение по настоящему изобретению также может быть применимым в комбинации (вводимые вместе или последовательно) с известными противораковыми методами лечения, такими как лучевая терапия или с цитостатическими или цитотоксическими агентами, такими как, например, но не ограничиваясь, агенты, взаимодействующие с ДНК, такие как цисплатин или доксорубицин; ингибиторы топоизомеразы II, такие как этопозид; ингибиторы топоизомеразы I, такие как СРТ-11 или топотекан; агенты, взаимодействующие с тубулином, такие как паклитаксел, доцетаксел или эпотилоны; гормональные агенты, такие как тамоксифен; ингибиторы тимидилат синтазы, такие как 5-фторурацил; и антиметаболиты, такие как метотрексат. В таких композициях соединение и композиции по настоящему изобретению могут быть применимыми для предотвращения или уменьшения частоты алопеции, которую часто индуцирует лучевая терапия или химиотерапия.

- 10 013117

Если рецептируют как фиксированную дозу, такие комбинированные продукты используют соединение по настоящему изобретению в диапазоне доз, описанном ниже, и другой фармацевтически активный агент или лечение в его одобренном диапазоне доз. Например, было обнаружено, что ингибитор сФс2 оломуцин действует синергистически с известными цитотоксическими агентами в индукции апоптоза (1. Се11 8с1., 108, 2897 (1995)). Соединение, описанное в настоящем описании, также можно вводить последовательно с известными противораковыми или цитотоксическии агентами, когда комбинированная композиция является неподходящей. Изобретение не ограничивается последовательностью введения; соединение, описанное в настоящем описании, может вводиться или перед или после введения известного противоракового или цитотоксического агента. Например, на цитотоксическую активность ингибитора циклин-зависимой киназы флавопиридола влияет последовательность введения с противораковыми агентами. Сапсег Кекеагсй, 57, 3375 (1997).

Предусматривается, что все варианты осуществления изобретения, описанные в настоящем описании, являются применимыми ко всем различным аспектам изобретения. Также предусматривается, что любой из описанных вариантов осуществления изобретения может быть свободно комбинирован с одним или более такими вариантами осуществления изобретения, всякий раз, когда предназначено. В частности, различные варианты осуществления соединений по изобретению, различные варианты расстройств, подходящих для лечения такими соединениями, и различные варианты способов лечения с использованием или применением соединений могут быть легко комбинированы друг с другом.

Специфические варианты осуществления изобретения описаны более детально в настоящем описании. Однако это иллюстративные варианты осуществления и не должны рассматриваться как ограничивающие каким-либо образом.

Эквиваленты

Специалист в области техники понимает или способен определить при использовании не более чем рутинных экспериментов, множество эквивалентов для специфических вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящем описании. Такие эквиваленты предназначены быть включенными формулой изобретения. Специалист в области техники также осознает, что все комбинации вариантов осуществления изобретения или характеристики формулы изобретения, описанные в настоящем описании находятся в рамках изобретения.

ν. Синтез.

Соединение по настоящему изобретению может быть синтезировано с использованием способов, описанных ниже, вместе с методами синтеза, известными в области техники синтетической органической химии, или их вариациями, как рассматривается специалистом в области техники. Предпочтительные способы включают, но не ограничиваются, способы, описанные ниже. Каждая из ссылок, цитированных ниже, включена в настоящее описание в виде ссылки.

Ключевые промежуточные продукты для получения определенных соединений описаны в настоящем описании, включая аминонитрилы пиразола, аминокарбоксамиды и аминосложные эфиры. Получение этих промежуточных продуктов имеет приоритет в химической литературе и несколько способов суммированы на схемах А (А. О. АЬФе1йат1Ф, е! а1., 1. Не!егосус1. Сйет. 1984, 21, 1049), В (С. С. Сйепд апФ В. К. КоЬшк, 1. Огд. Сйет. 1956, 21, 1240.), С (Р. 80ιιηίΦΐ апФ 1. Огиеу, Не1т. Сйет. Ас!а 1956, 39, 986.). См. также Тотшада е! а1., 1. Не!егосус1. Сйет. 1990, 21, 775, и заявки РСТ №№ \¥О 00/21926 и \¥О 99/54308. Широкое множество исходных гидразинов и альдегидов являются коммерчески доступными или могут быть получены стандартными органическими преобразованиями. Заместитель Аг, как используется ниже, указывает арильный цикл, замещенный для соответствия или для преобразования в соответствующий арильный заместитель определенных соединения, описанных в настоящем описании. Определенные соединения также могут быть получены обработкой РгСОС1 СН₂(СЫ)₂ в присутствии основания, обработки полученного соединения РС1₅, и реакции продукта с АгЫННН₂.

- 11 013117

Схема В

ΟΑοιΟ,ΝΟΟΗίΟΝ

2) ΑγΝΗΝΗ₂

1) Ас₂О, ΡΚΧΗ-,ΟΟΝΗ, |'-РгС(ОК)₃

Схема С

1) Ас₂О,Ь’ССН₂СО₂Р,

1-Р1С(ОК)₃ ---------------------

2) ΛγΝΗΝΗ₂

Аминонитрилы II могут быть преобразованы в пиразоло[3,4-б]пиримидины по настоящему изобретению, как показано на схеме Ό. В общем, аминокарбоксамид ацилируют необязательно в присутствии подходящего растворителя, такого как дихлорметан, обработкой подходящим основанием, таким как триэтиламин, с последующим галоидангидридом по формуле АгСН₂СОХ, предпочтительно хлорангидридом, для получения карбоксамидонитрилов V. Альтернативно карбоксамидонитрилы V могут быть получены связыванием аминонитрилов II с карбоновыми кислотами по общей формуле АгСН₂СО₂Н в присутствии подходящего основания и связующего реагента в подходящем растворителе. Связывание аминов и карбоновых кислот описано К1аи8иете апб Вобаикку, §уп1йе818 1972, 453-463, и множество реагентов, доступных для воздействия на него, может быть принято во внимание специалистом в области техники.

Схема Ό

или АгСН₂СО,Н + связующий агент

Формула I

Преобразование карбоксамидонитрилов V в соединения по настоящему изобретению может быть осуществлено обработкой избытком перекиси водорода в присутствии подходящего основания, предпоч тительно гидроксида металла или основания алкоксида в растворителе, предпочтительно воде, спирте, или смеси воды-спирта при температуре в диапазоне от около 0 до около 100°С.

Альтернативно, карбоксамидонитрилы V могут быть преобразованы в соединения по настоящему изобретению нагреванием, предпочтительно в течение около часа в концентрированной сильной кислоте, предпочтительно 85% Н₃РО₄. Схема Е показывает альтернативные средства для получения соединений по настоящему изобретению. Аминокарбоксимиды III в подходящем растворителе, предпочтительно низшем алканоле, обрабатывают избытком сложного эфира формулы АгСН₂СО₂В, где В является, например, низшим алкилом, и избытком основания, предпочтительно низшим алкоксидом металла, предпочтительно при температуре кипения растворителя, для получения соединений по настоящему изобретению. Множество арилуксусных сложных эфиров являются коммерчески доступными или могут быть получены в одну стадию из коммерчески доступных арилуксусных кислот посредством этерификации с избытком спирта, ВОН, предпочтительно при орошении этиловым или метиловым спиртом, используемым в качестве растворителя, в присутствии кислого катализатора, такого как Н₂8О₄ или р-ТкОН. Альтернативно, может быть использован связующий реагент, такой как ОСС, предпочтительно в растворителе, таком как СН₂С1₂, с катализатором, таким как ΌΜΑΡ.

Схема Е
/
ΜζΝ----м=г
)— _/ основание /Л	ь Формула 1
ъг 1

Фенилуксусные кислоты могут быть получены кислым или щелочным гидролизом арилацетонитрилов, которые в свою очередь могут быть получены обработкой арилгалоидов СЫ-, предпочтительно в растворителях, таких как ДМФ, МеОН, ЕЮН, вода, ДМСО или их смеси. Другие примеры арилуксусных сложных эфиров могут быть получены из арилкарбоновых кислот в условиях Атиб1-Е181ег1 (Ме1ег апб 2е11ет, Апдете. Сйеш. ШЕ Еб. Епд1. 197 5,14, 32) или связанных условиях гомологизации.

- 12 013117

Аминосложные эфиры по формуле IV могут быть преобразованы в соединения по настоящему изобретению реакцией с избытком нитрила по формуле ΑγΟΡ₂ΟΝ и натрия.

Такую реакцию предпочтительно проводят с нагреванием.

Пиразоло[3,4-Л]пиримидиноны могут быть далее обработаны, как описано ниже, для получения дополнительных соединений по настоящему изобретению. Реакции электрофильного ароматического замещения могут быть проведены на Аг группе для введения заместителей. Такие реакции включают, но не ограничиваются, нитрование, ацилирование (ЕпеЛе1-СгаЙ8), галогенирование, алкилирование (ЕпеЛе1Сгайк), хлорметилирование, сульфирование и аминометилирование (реакция Манниха). Условия для проведения таких реакция известны специалисту в области техники органического синтеза, обычно включающие реакцию электофила с арильным или гетероарильным субстратом в присутствии катализатора. В случае нитрования или реакций Манниха, катализатором является предпочтительно протонная кислота, которая может служить как растворитель, когда электролит образуется на месте из селитры или аминного и карбонильного компонента, соответственно. Для других реакций электрофильного ароматического замещения, предпочтительными катализаторами являются кислоты Льюиса, включая, но не ограничиваясь, ЕеХ₃, А1Х₃, и ΖηΧ₂, где X является галогеном.

Соединения, полученные выше, которые имеют аминогруппу, могут быть обработаны реакцией с электрофилами, включающими, но не ограничиваясь ацилгалоиды, ангидриды, изоцианаты, хлорформаты, сульфонилгалоиды, алкилгалоиды, лактоны или сложные эфиры. Условия для проведения таких дополнительных реакций являются известными специалисту в области техники органического синтеза, обычно включающими дополнение электрофила к нуклеофилу, предпочтительно в растворе при температуре между 0°С и КТ. Добавление основания может быть необходимым. Необходимо отметить, что продукты этих реакций могут реагировать далее с некоторыми электрофилами в азоте пиримидинона (N5). Полученные функциональные группы (амиды, карбаматы, и др.) являются менее стабильными к основному гидролизу, чем желаемые анилино или алифатические группы и могут быть отщеплены обратно до пиримидинона, имеющего Н на Ν5.

Реакция соединений, несущих аминогруппу с агентами, такими как галоацилгалоиды, α,βненасыщенные кислые галоиды или галосульфонилгалоиды дает промежуточные соединения, которые могут реагировать с нуклеофилами, такими как первичные или вторичные амины, диамины, алкоксиды, аминоспирты или тиолы.

Соединения, полученные выше, которые имеют карбоксильную группу, могут быть преобразованы активацией и реакцией с нуклеофилом, включая, но не ограничиваясь, амины и спирты, для получения, соответственно, амидов и сложных эфиров. Связывание аминов и карбоновых кислот с карбодиимидами описано К1аи5пе\\· апй ВоЛапкку, 8νη11κκίκ 1972, 453-463, и множество дополнительных реагентов, доступных для ее осуществления, а также потенциальная необходимость в защитных группах (Сгееп апй ГСиК Рго1ес11уе Сгоирк ίη Огдашс 8νη11κκίκ 8есопЛ Εάίίίοη, 1оЬп ГСПеу & 8опх. 1991) для маскировки реакционно-способной функциональной группы могут быть определены специалистом в области техники. Получение сложных эфиров из кислот описано выше. Восстановление таких амидов и сложных эфиров до аминов и спиртов может быть проведено с использованием подходящего агента, восстанавливающего гидрид.

Соединения, полученные выше, которые имеют аминогруппу, могут быть обработаны преобразованием в электрофильные виды активацией фосгеном или эквивалентом фосгена (Те1гаНе4гон: Акутте1гу 1995, 61, 745; 1. Огд. СЬет. 1994, 59, 1937), предпочтительно в присутствии основания, и реакцией с нуклеофилом, включая, но не ограничиваясь, амины, спирты, и сульфонамиды для получения, соответственно, мочевины, карбаматов и сульфонилмочевины. Условия для проведения таких реакций и опасности, связанные с работой с фосгеном и эквивалентами фосгена известны специалисту в области органического синтеза, и все необходимые предосторожности должны быть предприняты.

Последующие преобразования, которые могут потребоваться для получения соединений по настоящему изобретению, включают восстановление кетонов, альдегидов, сложных эфиров, кислот, амидов или восстановительное аминирование алюмино- и борогидридных реагентов (1. 8еуйеп-Репне, КейисЦопк Ьу Ле А1игато апй ВогоЬуйпЛек ίη Огдашс 8уп1Нек1к νί,Ή РнЬИкНегк, Ле., 1991) и окисления групп, включающих, но не ограничивающихся, спирты, альдегиды, олефины, тиоэфиры, сульфоксиды и гетероарильные группы (М11ок НийНску, ОхИабопк ίη Огдашс СЬет181гу Атепсап СЬет1са1 8ос1е(у, 1990).

Восстановление функциональных групп, таких как алкеновые, алкиновые, азотные, нитро или цианогруппы, может быть осуществлено каталитическим гидрогенированием или растворенным восстанов

- 13 013117 лением металлом. Дальнейшая обработка промежуточных соединений, содержащих электрофильные участки, в соединения по настоящему изобретению может быть осуществлена замещением нуклеофилами, включая, но не ограничиваясь, ΟΝ-, амины, алкоксиды, меркаптаны, или карбанионы. Еще другие соединения по настоящему изобретению могут быть получены связыванием арилгалоидов или трифлатов с соответствующими бороновыми кислотами или станнатами (Зб11е, 1.К., Апдеет. С11сш. Ιηΐ. Еб. Епд1. 1986, 25, 508; διιζιιΚί. А. Риге Арр1. Сйет. 1985, 57, 1749). Соединения, полученные выше, которые имеют карбонильную группу, могут быть обработаны далее реакцией с нуклеофилами для получения вторичных спиртов. Такие нуклеофилы включают, но не ограничиваются, реагенты Гриньяра, алкил-, алкенил-, и алкиниллитиевые реагенты, и аллилстаннаны, силаны, и подобные. Соединения, полученные как описано выше, могут быть далее обработаны посредством перестановок, таких как по Бекману (Са\\'1еу ίη Огд. Кеас!. 1988, 35, 1) или другими перестановками.

Последующая обработка соединений, полученных выше, может быть осуществлена получением магнийорганических и литийорганических видов направленным замещением водорода металлом (Веак апб Меуегк, Асс. Сйет. Кек. 1986,19, 356-363; Веак апб Зшескик, Асс. Сйет. Кек. 1982,15, 306-312; Ка1п12ку, Ьат, апб Зепдир1а, Ргод. Не1егосус1. Сйет. 1989,11, 1-29) или из арилгалоида обменом литиягалогена (Рагйат апб Вгабкйег, Асс. Сйет. Кек. 1982,15, 300-305).

Подход получения соединений по формуле II, 11а и определенных других соединений, описанных в настоящем описании, представлен на схеме 1 и может быть использован для получения соединений по настоящему изобретению. Заместители Ζ, К₅, Кб, и К₇ представляют собой заместители, как указано в формуле II, или заместители, которые могут быть преобразованы с использованием стандартных органических преобразований. Р представляет собой подходящую защитную группу. Примеры защитных групп включают сложные эфиры карбоновых кислот, силиловые эфиры спиртов и ацетали и кетали альдегидов и кетонов, соответственно. Область химии защитных групп описана (Сгеепе, Т.А.; Аи1к, Р.С.М. Рго!есЦуе Сгоирк ш Огдашс 8уп1Пек1к, 2^пб еб.; Абеу: №\ν Уогк, 1991). Нитрогруппу диметилнитрофталата восстанавливали до амина с использованием каталитического гидрогенирования. Анилин ацилировали с использованием уксусного ангидрида и пиридина в качестве основания. Смесь полученного ацетамида 2 и ацетофенона обрабатывали сильным основанием в соответствующем растворителе при повышенной температуре для получения желаемого трикетона 3. Дополнительные средства получения трикетонов известны специалисту в области техники, как описано в Кбдоге е! а1, БчбиМщб апб Епдтееппд СйетМгу 34:494-497, 1946. Трикетон обрабатывали гидразином при повышенной температуре в соответствующем растворителе для получения индено[1,2-с]пиразолоновой системы циклов.

Дополнительные средства получения индено[1,2-с]пиразолонов известны в области техники, как описано в Ьетке е! а1., 1. Не1егосус11с Сйет. 19:1335-1340, 1982; Мокйег апб Зоебег, 1. Не1егосус1ю Сйет. 8:855-59, 1971; Нгпшаг апб Зуапудоуа, Собес!. Оес11. Сйет. Соттип. 59:2734-40, 1994. Амид деацилировали нагреванием с сильной кислотой в соответствующем растворителе для получения анилина 4. Полученный анилин ацилировали в стандартных условиях с применением хлорангидрида в соответствующем растворителе для получения желаемого продукта 5.

- 14 013117

Альтернативный способ получения соединений по настоящему изобретению показан на схеме 2. Промежуточное соединение трикетон 3 может быть деацилирован сильной кислотой и реацилирован соответствующим хлорангидридом с использованием способов, известных специалисту в области техники.

Последовательно, трикетон 6 может быть преобразован в индено[1,2-с]пиразолоновую систему циклов с использованием таких же условий, описанных ранее в схеме 1.

Другой способ для получения трикетонов 6 по схеме 2 использует конденсацию 1,3-дикетона 6а с 3нитрофталовым ангидридом, как описано в КОЬегд апб ОзБкауа, ΖΗ. Огдап. КЫш. 8:84-87, 1972; ΖΗ. Огдап. КЫш. 9:2548 2550, 1973. 1,3-дикетоны, когда недоступны коммерчески, могут быть легко получены специалистом в области техники ацетилированием или трифторацетилированием данного метилкетона. Восстановление полученного нитропроизводного до анилина 6Ь может быть осуществлено множеством способов, включая каталитическое галогенирование, обработку цинком или железом в кислых условиях или обработкой другими восстанавливающими агентами, такими как дитионит натрия или хлорид олова. Впоследствии анилин 6с может быть преобразован в индено[1,2-с]пиразолоны по настоящему изобретению посредством ацилирования с последующей обработкой гидразином, как описано ранее в схеме 2.

Другой способ получения индено[1,2-с]пиразолоновой системы циклов показан на схеме 3. Диметилгидразин реагировал с 3-ацетилпиридином без растворителя для получения гидразона 7. Его обрабатывали подобным образом, как описано на схеме 1 для получения желаемого промежуточного продукта 8.

Альтернативно, 6Ь может быть обработан активированным ацилированным Ν-аминоморфолиновым или пиперазиновым циклом, таким как нитрофенилкарбамат. Дополнительные средства получения подобных промежуточных продуктов известны специалисту в области техники, как описано в Карророг!, I. Огд. СЬет. 49:2948-2953, 1984. Такой промежуточный продукт проводили через последовательность подобным образом, как описано в схеме 1.

Хотя вышеуказанные схемы описывают общие пути синтеза, где М является кислородом, следуя такому общему описанию специалист в области техники будет способен представить и осуществить синтез других соединений по изобретению, где М не является кислородом. Например, где М выбирают из 8, 8(О₂), С(=О), С(=8), СН₂, и ΝΚ.

Другие характеристики изобретения будут очевидны в свете следующего описания примерных вариантов осуществления изобретения, которые даны для иллюстрации изобретения и не предназначены для его ограничения.

ν. Иллюстративный пример.

Соединение В16 может быть синтезировано, как показано в заявках РСТ МО 03/033499 и/или МО 04/092139, руководства которых включены в настоящее описание в виде ссылки.

Протоколы и результаты анализов

Биологическую активность и применимость соединения по изобретению демонстрировали одним или более анализами, включающими описанные более детально ниже.

Анализ 1. Ингибирование прогрессии клеточного цикла соединения по изобретению с использова

- 15 013117 нием анализов йодида пропидия и ВгбИ (результаты показаны на фиг. 1).

Анализ 3. Необратимый эффект соединения по изобретению на клетки в клоногенном анализе выживаемости (результаты показаны на фиг. 2 и фиг. 3).

Анализ 4. Сниженная выживаемость клеток НСТ-116 и ΙΜΚ90, подвергнутых воздействию соединения по изобретению, что оценивали с использованием анализа Кальцеина ΑΜ (результаты показаны в табл. 6).

Анализ 5. Ингибирование выживаемости остановленных опухолевых клеток, но не остановленных нормальных клеток, подвергнутых воздействию соединения по изобретению (результаты показаны на фиг. 4).

Анализ 6. Ингибирующая активность соединения по изобретению в определенных биохимических анализах киназ (результаты показаны в табл. 6).

Анализ 7. Активность соединения в моделях ксенотрансплантированных опухолей (результаты показаны на фиг. 5, 6, 7 и 8).

Анализ 8. Афинность соединения к определенным целевым белкам (результаты показаны на фиг. 9).

Анализ 1. Анализ клеточного цикла с йодидом пропидия и ВгбИ.

Процент клеток в 01, 8 и 02/Μ фазах клеточного цикла определяли окрашиванием ДНК йодидом пропидия и количественным определением количества клеток с 2Ν или 4Ν набором ДНК посредством поточной цитометрии. Таким образом, оценивали изменения в распределении клеток по клеточному циклу в ответ на воздействие ингибиторов Сбк.

Способ для окрашивания клеток йодидом пропидия.

группы клеток НСТ-116 (100000 клеток/ячейку) культивировали в присутствии тестируемого соединения в колбах Т-25 в соответствии с табл. 1 ниже. Анализ проводили через 24, 48 и 72 ч. Прикрепленные клетки собирали трипсинизацией, смешивали с плавающими клетками в пробирках для поточной цитометрии 12x75 и собирали центрифугированием. Среду сливали с осадка клеток, добавляли 100 мкл красителя ΡΙ и клетки инкубировали при 37°С в течение 20-25 мин. Число клеток предпочтительно составляло не более чем 2х10⁶-4х10⁶/мл. Затем равный объем (100 мкл) соли ΡΙ добавляли к клеткам, которые затем инкубировали при 4°С в течение 1-2 ч. Окрашенные клетки анализировали на поточном цитометре Вес1оп Оккткои РАС8сап. Образцы защищали от света. Фиг. 1 показывает, что только при воздействии соединения, клетки окончательно останавливались в 01 и 02, со свидетельствами апоптоза и эндоредупликации.

Определение включения ВгбИ в ДНК.

Этот способ измерял процент клеток, которые включили аналог нуклеотида, ВгбИ, в заново синтезируемую ДНК, когда клетки проходили через фазу 8 клеточного цикла. Ингибирование включения ВгбИ использовали как меру эффекта ингибитора Сбк на прогрессию фазы 8 и репликацию ДНК.

Способ метки ВгбИ.

группы клеток НСТ-116 (100000 клеток/ячейку) сеяли в колбы Т25 и инкубировали с тестируемым соединением как указано выше. Анализ проводили через 24, 48, и 72 ч. ВгбИ добавляли в каждую колбу Т-25 из запаса 10 мг/мл до конечной концентрации 10 мкМ и клетки инкубировали в течение дополнительных 16-18 ч при 37°С. Затем клетки готовили для поточного цитометрического анализа в соответствии с инструкциями производителя (ВгбИ Р1оте кй, ВЭ-РНагттдеп са!а1одие # 2354КК) как указано ниже.

Клетки собирали (прилипшие и плавающие) из колб Т25 непосредственно в пробирки для поточной цитометрии Ра1соп 12x75, как указано выше, с последующей фиксацией и повышением проницаемости посредством добавления 100 мкл буфера Су1оПх/С.'у1орегт (30 мин, комнатная температура). Затем клетки промывали 1 мл буфера Регт \Уа41 и подушки клеток ресуспендировали в 100 мкл буфера Су1орегт Р1и8 и инкубировали на льду в течение 10 мин. Затем клетки снова промывали 1 мл буфера Регт \Уа511 и фиксацию повторяли в 100 мкл буфера Су1оПх/С.'у1о Регт в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки промывали 1 мл буфера Регт \Уа511. Затем клетки обрабатывали в течение одного часа при 37°С 100 мкл ДНказы для воздействия на включившийся ВгбИ с последующей стадией промывки 1 мл буфера Регт \Уа41. Присутствие включившегося ВгбИ выявляли с помощью антитела а-ВМИ-ИТС (50 мкл разведения 1:50 антитела в буфере Регт ^акй). Клетки защищали от света и инкубировали при комнатной температуре в течение 20-30 мин. После инкубации клетки промывали 1 мл буфера Регт ХУаЧг ресуспендировали в 300 мкл 2% РВ8 в РВ8, и анализировали на поточном цитометре. Результаты показаны на фиг. 1, как концентрация соединения (мкМ), которая ингибирует включение ВгбИ на 50%.

Анализ 3. Протокол для анализа клоногенной выживаемости с клетками НСТ-116.

Этот анализ использовали для определения концентрации соединения, которая приводит к необратимой потере выживаемости после установленного периода воздействия. По существу, клетки подвергали воздействию соединения в течение периода 1, 2 или 5 дней, и затем переносили в питательную среду без соединения. После продолжительной инкубации в среде без соединения в течение ряда дней количество восстановившихся колоний подсчитывали как оценку количества выживших клеток.

- 16 013117

Результаты таких анализов выживаемости для различных соединений по изобретению представлены в таблице 3 (клоногенной) в виде концентрации (мкМ) соединения, которая ингибирует восстановление колоний на 50% (ИК50). Фиг. 2 показывает необратимое ингибирование клеточной активности в клетках НСТ-116, и временной курс такого ингибирования соединением А37, с ИК50<50 нМ с воздействием соединения 24 ч. Соединение В16 показало ИК50<100 нМ в таком же анализе, и ИК50 достигалась в течение 30-60 мин при 100 нМ (фиг. 3).

Способ измерения клеточной выживаемости после воздействия соединения.

Среду (КРМ1-1640, 10% РС8, реп/Мгер) заранее нагревали до 37°С на водяной бане. Клетки инкубировали и выращивали при 37°С, 5% СО₂. Клетки восстанавливали трипсинизацией с суб-сливающихся планшетов и подсчитывали с использованием гемоцитометра. 1х10⁴ клеток сеяли в 25 мл среды в 15 см чашки для культур тканей. 14 планшетов устанавливали для каждого тестируемого соединения и инкубировали в течение ночи при 37°С. Соединение разводили в среде в 7 концентрациях и среду на клетках заменяли содержащей тестируемое соединение.

Устанавливали два планшета для каждой тестируемой концентрации соединения, а также два контрольных планшета без соединения. Планшеты инкубировали как указано выше в течение 24, 48 или 74 часов, среду удаляли и замещали свежей средой и планшеты инкубировали дополнительные 7 дней и промывали РВ8. Колонии окрашивали раствором кристаллического фиолетового (0,4% кристаллического фиолетового, 20% этанола) в течение 5 мин, промывали дважды дистиллированной водой и считали.

Анализ 4. Применение анализа выживаемости с кальцеином АМ для оценки ингибиторов Сбк в присутствии и отсутствии белков сыворотки.

Силу ингибиторов Сбк, которую измеряли по потере клеточной выживаемости, определяли в анализе кальцеина АМ (Мо1еси1аг РгоЬек). Кальцеин АМ является субстратом внутриклеточных эстераз, который отщепляется только в живых клетках с образованием флуоресцентного продукта, который может быть оценен количественно с помощью флуоресцентного спектрофотометра для прочтения планшетов. Флуоресцентный сигнал является пропорциональным количеству живых клеток и следовательно потеря сигнала в ответ на воздействие на клетки ингибиторов Сбк коррелирует с потерей выживаемости. Этот анализ может выявить остановку клеточного цикла, в которой клетки могут все еще быть жизнеспособными, от потери жизнеспособности и, следовательно, является хорошо приспособленным для оценки ингибиторов Сбк. Соединение, которое является значительно токсичным, может вызывать значительную потерю выживаемости клеток в таком анализе.

Клеточные ИК50 определяли в клеточной линии человеческой колоректальной карциномы, НСТ116, и нормальных человеческих фибробластах, 1МК90. Установленные на белок ИК50 также определяли в НСТ-116.

Результаты таких анализов выживаемости представлены в табл. 6 (НСТ-116 (выживаемость/установленные на белок) и 1МК-90). ИК50 (мкМ, не установленные на белок) для анализа выживаемости против клеток НСТ-116 показаны были как: (ίί) соединение В16: НСТ-116 (<10 нМ), НСТ-116 установленным на белок (<500 нМ), А2780 (<10 нМ), 1МК90 (<100 нМ). Протокол для анализа выживаемости кальцеина АМ.

Клетки НСТ-116 или 1МК90 получали от суб-сливающихся планшетов трипсинизацией, и 1000 или 4000 клеток, соответственно, сеяли в 24-луночные чашки и инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СО₂. Клетки НСТ-116 культивировали в КРМ1-1640, 10% РС8, и клетки 1МК90 культивировали в М1штит Е<8еп11а1 Мебшт-а1рйа, 10% РС8. После инкубации в течение ночи для возможности прилипания среду аспирировали из каждой ячейки и замещали средой, содержащей тестируемое соединение в концентрации от 0 до 250 нМ, охватывая всего 7 доз. Планшеты возвращали в инкубатор и культивировали в течение дополнительных 72 ч (3 дня). Средой, используемой для определения установленных на белок ИК₅₀, была КРМ1-1640, 10% РС8, плюс 1 мг/мл альфа кислого гликопротеина (81дта С-9885), и 45 мг/мл человеческого альбумина сыворотки (81дта А3782). После 72-часов инкубации с тестируемым соединением клетки промывали дважды 1Х РВ8, особенно стараясь удалить весь оставшийся буфер.

Получали 5 мкМ раствора кальцеина АМ растворением 50 мкг аликвот кальцеина (каталожный номер молекулярных зондов # С3100) в 50 мкл ДМСО. После полного растворения кальцеина (10 минут при комнатной температуре), его разводили в 10 мл РВ8. Кальцеин/РВ8 (0,5 мл) добавляли к каждой ячейке. Планшеты инкубировали в течение 75 мин при 37°С (защищенными от света) и флуоресцентный сигнал считывали на флуоресцентном спектрофотометре для прочтения планшетов (излучение 485/20 и поглощение 530/25).

Анализ 5. Анализ остановленных клеток.

Активность циклинзависимой киназы (Сбк) требуется для обеспечения прогрессирования клеток через отдельные фазы цикла деления клеток. Пролиферация нормальных, нетрансформированных клеток в культуре требует присутствия ростовых факторов, удаление которых посредством удаления сыворотки приводит к потере активности Сбк и последующему выходу из клеточного цикла, когда клетки входят в фазу покоя С₀. Следовательно, с механистической точки зрения, но без связи с теорией, ингибиторы Сбк должны иметь значительно сниженную эффективность в остановленных нормальных клетках по сравне

- 17 013117 нию с их трансформированными аналогами.

Результаты анализов выживаемости, проводимых на остановленных нормальных (ΙΜΚ.90) и остановленных опухолевых клетках (НТ-116) с использованием соединения по изобретению. Было обнаружено, что соединение В16 показало ИК50 <50 нМ для остановленных клеток НСТ-116 и >10 мкм для остановленных клеток ΙΜΚ90.

Остановка клеток НСТ-116 и ΙΜΚ90 лишением сыворотки для оценки эффективности соединения.

Клетки НСТ-116 сеяли в тройном экземпляре для каждой тестируемой концентрации соединения в среде ΡΡΜΙ 1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки телят с плотностью или 200 или 2000 клеток на ячейку в 24 луночные чашки и инкубировали в течение ночи при 37° С, 5% СО₂. Среду из планшета, содержащего 2000 клеток на ячейку, удаляли, клетки промывали один раз средой без сыворотки и 1 мл среды без сыворотки помещали на клетки. Планшеты, содержащие клетки, и в присутствии и в отсутствии сыворотки инкубировали в течение дополнительных 6 дней.

Клетки ΙΜΚ90 сеяли в тройном экземпляре для каждой тестируемой концентрации соединения в среде МЕМ-α, содержащей 10% эмбриональной сыворотки телят, с плотностью или 2000 или 20000 клеток на ячейку в 24 луночные чашки и инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СО₂. Среду удаляли из чашек с 20000 клетками на ячейку, клетки промывали один раз средой без сыворотки и среду без сыворотки помещали на клетки. Планшеты, содержащие клетки, и в присутствии и в отсутствии сыворотки инкубировали в течение 3 дополнительных дней.

Оценка остановки клеточного цикла клеток НСТ-116 и ΙΜΚ.90 удалением сыворотки.

Чтобы удостовериться, что клетки действительно выходят из клеточного цикла при удалении сыворотки, процент клеток, положительных по ВтбИ, показательных для переходящих через фазу 8, определяли в каждом эксперименте. Для цели этого эксперимента выживаемость клеток оценивали одновременно с применением флуоресцентного субстрата внутриклеточных эстераз 8ΝΑΚΕ-1, который активен только в живых клетках. Также, оценка включения ВтбИ и расщепления 8ΝΆΚΕ-1 посредством поточной цитометрии обеспечивали оценку выживаемости остановленных клеток на основании одной клетки. Для этого анализа клетки окрашивали 8ΝΆΚΕ-1, как указано далее, и затем подготавливали для определения включения ВтбИ, как описано выше.

Клетки НСТ-116 и ΙΜΚ90 сеяли с плотностью, описанной ниже, в чашки Т25 в среду, содержащую сыворотку (ΒΡΜΙ-1640 или МЕМ-α с 10% ЕС8, соответственно). После 24 ч роста среду удаляли и после промывки клеток заменяли средой без сыворотки.

НСТ-116+ЕС8 5000 клеток.

НСТ-116-ЕС8 100000 клеток.

IΜΒ90+ΕС8 100000 клеток.

ΙΜΒ90-ΕΌ8 200000 клеток.

Клетки ΙΜΚ90 выращивали в течение дополнительных 3 дней и клетки НСТ-116 выращивали в течение дополнительных 6 дней перед введением ВтбИ. 50 мкг аликвоты 8ΝΆΚΕ-1 (каталожный номер молекулярных зондов #С1272) растворяли в 50 мкл ДМСО при комнатной температуре в течение 10 мин и затем разводили в 10 мл РВ8. Затем 8ΝΆΚΡ-1 разводили 1:64000 перед тем, как 200 мкл добавляли к каждой пробирке клеток, которые культивировали в присутствии или отсутствии сыворотки и вводили ВтбИ в течение 20 ч. Клетки инкубировали при 37°С в течение 30 мин и затем промывали 3 мл РВ8.

Такие клетки затем фиксировали и готовили для измерения включения ВтбИ, как описано выше. Процент выживших (ЕЬ-2) и ВтбИ положительных (ЕЬ-1) клеток определяли на поточном цитометре ЕЛСЗсаи.

Оценка выживаемости остановленных клеток НСТ-116 и ΙΜΚ90 после воздействия соединений по изобретению.

Клетки инкубировали в присутствии соединений в течение 72 ч (3 дня) при 37°С 5% СО₂, как указано далее для определения эффективности соединений на цикл и остановленные клетки. Клетки НСТ116 в цикле и остановленные, а также клетки ΙΜΚ90 в цикле подвергали воздействию панели 6 доз, варьирующихся от 5 до 250 нМ. Для фиксированных нормальных клеток диапазон доз был увеличен до 50 нМ - 25 мкМ для компенсации ожидаемого снижения активности.

Эффект 72 часового воздействия соединения на выживаемость клеток оценивали в анализе кальцеина ΑΜ. Кальцеин ΑΜ является флуоресцентным субстратом внутриклеточных эстераз, которые активны только в живых клетках. Следовательно расщепление субстрата обеспечивает меру выживаемости, которая является пропорциональной количеству клеток.

Основной раствор кальцеина ΑΜ получали растворением 50 мкг аликвот (каталожный № молекулярных зондов # С3100) в 50 мкл ДМСО. Пробирку инкубировали при комнатной температуре в течение приблизительно 10 мин для обеспечения полного растворения кальцеина. Кальцеин разводили в 10 мл РВ8 для получения конечного раствора, который защищали от света.

Среду аспирировали с клеток, которые затем дважды промывали 1 мл РВ8 для полного удаления РВ8 с клеток аспирацией. 0,5 мл раствора кальцеина/РВ8 переносили пипеткой в каждую ячейку. Планшеты инкубировали при 37°С в течение 75 мин (защищенными от света) и прочитывали на флуоресцент

- 18 013117 ном спектрофотометре для прочтения планшетов (возбуждение 485/20 и излучение 530/25).

Анализ 6. Ингибированив биохимической активности киназы.

Ферменты. С6с2/циклин В получали из коммерческих источников. С6к2/Ь18-циклин Е_8||о|, экспрессировали в клетках 819. С6к2/циклин А, с6к4/циклин Ό1, и ебкб/циклин Ό2 экспрессировали в клетках 819. Протеинкиназу А (каталитическая субъединица, из бычьего сердца) и протеинкиназу С (смешанные изоферменты из головного мозга крыс) получали из коммерческих источников.

Субстраты. Гистон Н1 был из коммерческих источников. О8Т-КЬ представляет собой глютатион-8трансферазу, сшитую с Ν-концом остатков 379-928 белка КЬ.

Анализы. Активность С6с2/циклин В определяли измерением включения радиоактивности из аденозина [у-³²Р]трифосфата в гистон Н1 с использованием анализа преципитации ТСА. С6с2/циклин В киназу и гистон Н1 получали из коммерческих источников. Конечный анализируемый раствор содержал 50 мМ Тп8.НС1 10 мМ МдС1₂, 1 мМ дитиотреитола, 50 мкМ аденозинтрифосфата, 2 мкКи ³²Р, 10% диметилсульфоксида (из соединений), рН 7,5, 20 мкг Гистона Н1, 6 ЕД фермента в объеме 50 мкл. Соединение добавляли в различных концентрациях между 1 нМ и 10 мкМ. Реакцию начинали добавлением фермента, позволяли протекать в течение 20 мин при 30°С и останавливали добавлением 20 мкл останавливающего раствора (237 мМ этилендиаминтетраацетата динатрия, 105 мМ аденозинтрифосфата, рН 8,0). Белок осаждали добавлением 35 мкл 70% (мас./об.) трихлоруксусной кислоты, и осадок захватывали на 96-луночную фильтровальную пластину из стекловолокна (М1Шроте, 1пс.), которую увлажняли 25% (мас/об) трихлоруксусной кислотой. Фильтр промывали десять раз 25% (мас./об.) трихлоруксусной кислотой, и количество включившегося ³²Р определяли счетом сцинтилляций после добавления 100 мкл сцинтиллята (Мютоксш! 20, Раскатб 1п81титеп18). Относительную активность определяли делением количества радиоактивности, включившейся в присутствии соединения, на количество радиоактивности, включившейся в контрольном эксперименте, содержащем только ДМСО, без соединения. Фоновую радиоактивность, определенную в эксперименте, содержащем 50 мМ ЭДТА вместо соединения, вычитали из всех результатов перед расчетами. Концентрацию соединения для 50% ингибирования (ИК50) определяли, аппроксимируя данные к стандартному уравнению:

Р = мин + (макс - мин) (1/(1 + (ИК50/[I])⁵) ) (1) где Р = 1 - относительная активность является относительным ингибированием, [I] является концентрацией соединения, макс и мин являются максимальным и минимальным относительным ингибированием (1 и 0, соответственно) и 8 является так называемым угловым коэффициентом.

Активность С6к2/циклин Е, С6к2/циклин А, С6к4/циклин Ό1 и С6к6/циклин Ό2 определяли с использованием анализа захвата глютатион-сефарозы. Ферменты экспрессировали в клетках насекомых 819 в виде гетеродимеров, и субстратом (О8Т-КЬ) была глютатион-8-трансфераза, сшитая с остатками 379 928 белка ретинобластомы КЬ, экспрессируемого в Е. со11. Анализируемый раствор содержал 50 мМ Тп8.НС1, 10 мМ МдС1₂, 1 мМ дитиотреитола, 50 мкМ аденозинтрифосфата, 2 мкКи [γ -³³Р] аденозинтрифосфата, 10% диметилсульфоксида (из соединений), рН 7,5, 40 мкг О8Т-КЬ и фермент в объеме 100 мкл. Соединения добавляли в различных концентрациях между 1 нМ и 10 мкМ. Реакции позволяли протекать в течение 15 мин при 30° С и останавливали добавлением 70 мкл останавливающего раствора (237 мМ этилендиаминтетраацетата динатрия, 105 мМ аденозинтрифосфата, рН 8,0). О8Т-КЬ захватывали связыванием с гранулой глютатиона-сефарозы (Лтет8Йат) в течение 110 мин, и суспензию фильтровали через фильтр из стекловолокна. После промывки удержанных гранул пять раз фосфатным буферным раствором, содержащим 0,3% (мас/об) Тетееп-20, количество включенного ³³Р определяли счетом сцинтилляций после добавления 100 мкл сцинтиллята. Относительную активность определяли делением количества радиоактивности, включившейся в присутствии соединения, на количество радиоактивности, включившейся в контрольном эксперименте, содержащем только ДМСО, без соединения. Фоновую радиоактивность, определенную в эксперименте, содержащем 50 мМ этилендиаминтетраацетата динатрия, вычитали из всех результатов перед расчетами. Концентрацию соединения для 50% ингибирования (ИК50) определяли аппроксимацией данных к уравнению (1).

Протеинкиназу С и протеинкиназу А оценивали с использованием анализа осаждения ТСА с Гистоном Н1 в качестве субстрата. Для протеинкиназы А конечный анализ содержал 50 мМ Тп8, 10 мМ МдС1₂, 1 мМ дитиотреитола, рН 7,5, 12 мкМ аденозинтрифосфата, 10% (об/об) диметилсульфоксида (из соединений), 20 мкг Гистона Н1, 2 мкКи [γ -³²Р] аденозинтрифосфата, 0,2 ЕД протеинкиназы А в 100 мкл анализа. Анализ протеинкиназы С содержал 50 мМ Тп8, 10 мМ МдС1₂, 1 мМ дитиотреитола, 0,8 мМ СаС1₂, рН 7,5, 5 мкМ аденозинтрифосфата, 10% (мас./мас.) диметилсульфоксида (из соединений), 20 мкг Гистона Н1, 2 мкКи [γ -³²Р] аденозинтрифосфата, 0,01 ЕД протеинкиназы С в 50 мкл анализа. Анализы начинали с добавления фермента, позволяли реагировать в течение 10 мин при 3°С и останавливали добавлением 0,4 объемов 237 мМ этилендиаминтетраацетата динатрия, 105 мМ аденозинтрифосфата, рН 8,0. Белок осаждался из остановленной реакции добавлением 0,5 объема 75% (мас/об) трихлоруксусной кислоты и захватывали фильтрованием через 96-луночный фильтровальный аппарат из стекловолокна (М1Шроте). Фильтры промывали десять раз 25% (мас./об.) трихлоруксусной кислотой и количество включившегося [³²Р]фосфата определяли добавлением 100 мкл Мгсгозсш! и счетом сцинтилляций. Концентрацию соеди

- 19 013117 нения для 50% ингибирования (ИК₅₀) определяли аппроксимацией данных до уравнения (1).

Результаты вышеуказанных анализов представлены в табл. 6.

Анализ 7. Модели ксенотрансплантированных опухолей.

Лекарственные средства. Соединение по изобретению синтезировали и получали для в/в введения в биосовместимом носителе. СРТ-11 (СатрШкаг®, Рйагтас1а) получали в виде фармацевтического лекарственного средства и готовили в 5% декстрозе-воде (Ό5\ν). Все препараты делали свежими еженедельно и инъекционные объемы адаптировали к массе тела (0,2 мл/20 г мыши).

Мыши/животные. Самок мышей пи/пи получали от Сйаг1е8 ККег, селили в статические микроизоляторы и обеспечивали по потребности водой и облученным стандартным рационом для грызунов (Ригта Ρχο-Ρ·;·ιό Кебет Э|е1 20).

Определение максимальной переносимой дозы (МТО). Мышей в возрасте 8 недель распределяли парами в группы по 5-8 животных и проводили предварительные исследования токсичности с неизвестными тестируемыми соединениями. Животным вводили в/в ежедневно в течение 10 последовательных дней тестируемое соединение и взвешивали два раза в неделю. Мышей часто обследовали в отношении клинических признаков каких-либо побочных эффектов, связанных с лекарственным средством. Приемлемую токсичность противораковых лекарственных средств у мышей определяли по Νί,Ί как отсутствие потери средней массы в группе более 20% и не более чем 10% токсических смертей у животных, получавших лечение.

Стандартный протокол. Бестимусным голым мышам (самцам или самкам, 6-7 недель) имплантировали п/к одиночные фрагменты опухоли 1 мм3 (опухоль бри) или альтернативно 5-10х10⁶ клеток культуры ткани в бок. Сначала животных наблюдали два раза в неделю в отношении роста опухоли и затем ежедневно, так как имплантаты достигли желаемого размера приблизительно 100 мм3. Когда опухоли вырастали до между 62-221 мг рассчитанного веса опухоли, животных распределяли по парам в соответствующие группы экспериментального лечения (8-10 животных/группа) и начинали лечение тестируемыми соединениями. Положительный контроль дозировали в соответствии с историческим контролем. Рассчитывали массу опухоли, и массу тела измеряли два раза в неделю, и животных часто наблюдали в отношении нежелательных эффектов лекарственного средства. Протокол требовал, чтобы любое животное, чья масса опухоли достигала 1000 мг было немедленно умерщвлено.

Опухоли измеряли, определяя длину и ширину опухоли, с помощью пальцевидного циркуля. Массу опухоли оценивали с использованием следующей формулы:

Масса опухоли (мг) = (те² х1)/2, где те = ширина и 1 = длина в мм опухоли. Эти значения также могут быть выражены в волюметрических единицах (мм³).

Экспериментальное лечение могло вызвать частичное обратное развитие (РК) или полное обратное развитие (СК) опухолей. РК определяют как ситуацию, когда размер опухоли составляет 50% или менее от исходного (день 1) размера, но более чем 0,0 мг в течение трех последовательных дней курса исследования, тогда как СК возникает, когда не существует измеримой массы опухоли в течение трех последовательных дней. Излечившимися определяли животных, чья опухоль уменьшалась до 0 мг и оставалась такой до завершения эксперимента.

Бод убитых клеток (ЬСК) представляет собой расчет, который определяет процент опухолевых клеток, которые были убиты после начала эксперимента и может быть использован в качестве количественной меры эффективности:

Εο§ убитых клеток (ЬСК)=(Т-С)/(3.32) (Тб), где Т представляет собой среднее время, требуемое для группы лечения мышей для достижения размера 1000 мг, С - среднее время для опухолей контрольной группы для достижения размера 1000 мг, Тб = представляет собой время удвоения опухоли, оцененное линейным регрессионным анализом из полу-ΐομ графика роста опухолей контрольной группы во время экспоненциального роста и 3,32 = количество удвоений, требуемое для популяции для увеличения на единицу 1-1ο§10. Каждая единица ЬСК представляет собой 1-1ο§10 единицу убийства клеток (например 1 ЬСК = 90% убито, 2 ЬСК = 99% убито, и др.). Авторы расценивали соединения как существенно активные, если они имели значения ЬСК >1, что соответствовало >90% убитых опухолевых клеток.

Ингибирование роста опухоли (ΤΟΙ) представляет собой расчет, который описывает количество опухолевого роста, которое ингибируется лечением соединением в течение определенного периода времени. Оно выражается как:

%Т01=100(1-Т/С), где Т является средним размером опухоли группы, получавшей лечение соединением в заданный день, и С является средним размером опухоли контрольной группы в тот же самый день.

Токсические смерти определяли как смерти, вызванные лечением соединением, а не тяжелым состоянием заболевания. Смерть расценивают токсической, если животное умирает в течение 1 недели после конечного лечения соединением и размер опухоли не достиг 1000 мг. Смерти, не связанные с опухолью после этой точки записывали, но не расценивали токсическими смертями.

- 20 013117

Регресс опухоли определяли в соответствии со следующими правилами: регресс определяют как частичный (РК), если масса опухоли уменьшается до < 50% исходной массы (< 50 мг). Регресс определяют как полный (СК), если масса опухоли уменьшается ниже измеряемой массы в течение периода эксперимента. Излечение определяют как животных без опухоли в конце периода наблюдения.

Результаты. Фиг. 6 показывает результаты, полученные для соединения по изобретению в модели ксенотрансплантированной опухоли НСТ116. Фиг. 8 показывает результаты модели ксенотрансплантированной опухоли А2780, полученные с соединением В16.

Анализ 8. Измерение афинности между целевыми молекулами и соединениями.

С целью подтверждения пригодности данных химического соединения для применения, предложенного в настоящем описании, может быть полезным характеризовать связующие свойства такого соединения с его известными связывающими партнерами, если они существуют. Это, однако, не должно интерпретироваться как ограничение рамок изобретения.

Афинность химических соединений к их соответствующим связывающим партнерам может быть определена, например, с использованием системы анализа В1АСОКЕ™ (В1асоге АВ, Ирр8а1а, 8Е). Другие системы, дающие количественно подобные результаты, такие как разработанные АГПпЦу 8еи5ОГ5 (СатЬпбде, иК), будут легко очевидными специалисту в области техники.

В характерной методике анализировали связывание Соединения К с его известными связывающими партнерами СЭК2/циклинЕ. Анализ проводили на В1АСОКЕ 2000 8РК-Вю5еи8ог при 22°С в текущем буфере, содержащем 20 мМ НЕРЕ8 (рН 7,4), 150 мМ №С1, 1 мМ ΌΤΤ и 0,005% Т\уееп 20 (белковый градиент, С’а1Ьюс11ет). 10 мкМ раствора Соединения К связывали при рН 8,0 с поверхностью из декстрана чувствительного чипа СМ5 (исследовательский) посредством амидосвязывающей химии. С целью характеристики связывания Соединения К с белками, например СЭК2/циклинЕ, очищенную фракцию белка разводили в текущем буфере для получения девяти отдельных концентраций белка, которым затем позволяли проходить через поверхность сенсора последовательно в течение 5 мин каждый, с последующим 5 мин текущего буфера при такой же скорости потока. Ассоциация и диссоциация комплекса СЭК2/циклинЕ на поверхности чипа СМ5, нагруженного соединением К, измеряли при скорости тока 30 мкл/мин. После каждого эксперимента чип регенерировали двумя последовательными инъекциями 3 М гуанидина-гидрохлорида (20 с, 30 мкл/мин) перед нагрузкой следующего образца.

Данные анализировали с использованием программного обеспечения Вюеуа1иа1юи версии 3.1 (В1асоге АВ, Ирр8а1а, 8Е). Кривые нормализовали к началу инъекции и получали фон с контрольной поверхностью. Скорость ассоциации и диссоциации определяли отдельно и в целом с использованием модели связывания Ьаидтшг 1:1. Афинности (Кэ) рассчитывали с использованием уравнения:

Кэ = кб188/ка88

Вышеуказанная методика может быть проведена аналогично с другими целевыми белками, например, 061(9, Сбк4 и др. Ингибитор Сбк9, например, может быть применимым в лечении или профилактике ВИЧ и/или СПИД.

Фиг. 9 показывает как пример результаты, полученные для связывания СЭК2/циклинЕ с чипом СМ5, нагруженным Соединением К. К_с рассчитанная из этих данных составляет до 8,0+/-2,8 нМ.

Все ссылки, патенты и публикации, цитированные в настоящем описании являются таким образом включенными в виде ссылок полностью.

Таблица 1. Диапазон концентраций соединений, используемых в анализе 1

Соединение	ИК50 (мкМ)
	Сдк2/ Циклин Е	Сс1к4/ Циклин 01	Сс1с2/ Циклин В	Выживаемость НСТ-116
В16	<0,01		<0,01	<0,01

- 21 013117

Таблица В

Соединение	Структура
В16

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (14)

1. Соединение, имеющее структуру формулы I, или его изомерная, пролекарственная, таутомерная форма, фармацевтически приемлемая соль, Ν-оксид, и/или стереоизомерная форма

2. Соединение по п.1, где фармацевтически приемлемая соль имеет структуру

3. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый наполнитель и соединение по п.1 или 2.

4. Способ лечения гиперпролиферативного расстройства, включающий введение животному соединения по п.1 или 2.

5. Способ ингибирования пролиферации клетки, включающий контакт клетки с соединением по п.1 или 2.

6. Способ лечения вирусной инфекции, включающий введение млекопитающему соединения по п.1 или 2.

7. Способ по п.6, где вирусная инфекция вызвана вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ).

8. Способ лечения или предотвращения алопеции, индуцированной химиотерапией или лучевой терапией, включающий введение млекопитающему соединения по п.1 или 2 совместно с одним или более химиотерапевтическими препаратами или лучевой терапией.

9. Способ лечения вирусной инфекции, включающий введение млекопитающему соединения по п.1 или 2 или композиции, содержащей терапевтически эффективное количество такого соединения.

10. Способ по п.9, где вирусная инфекция вызвана вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ).

11. Применение соединения по п.1 или 2 для получения лекарственного препарата.

12. Применение по п.11, где лекарственный препарат является фармацевтическим препаратом для лечения или предотвращения расстройства, выбираемого из гиперпролиферативного расстройства, вирусной инфекции, алопеции, индуцированной химиотерапией и заболевания, ассоциированного с активностью циклинзависимой киназы.

13. Способ ингибирования циклинзависимой киназы, включающий введение в организм-хозяин, нуждающийся в таком лечении, терапевтически эффективного количества соединения по п.1 или 2 или композиции, содержащей терапевтически эффективное количество такого соединения.

14. Способ лечения расстройств, ассоциированных с циклинзависимой киназой, включающий введение в организм-хозяин, нуждающийся в таком лечении, терапевтически эффективного количества соединения по п.1 или 2 или композиции, содержащей терапевтически эффективное количество такого соединения.