KR20060092098A

KR20060092098A - 로도코커스―대장균 셔틀벡터

Info

Publication number: KR20060092098A
Application number: KR1020060014208A
Authority: KR
Inventors: 이주원; 조준형; 이상현; 박오진; 박시재
Original assignee: 주식회사 엘지화학
Priority date: 2005-02-16
Filing date: 2006-02-14
Publication date: 2006-08-22
Also published as: WO2006088307A1; US20060263868A1; KR100738002B1; TW200641127A

Abstract

본 발명은 로도코커스 에리쓰로폴리스 IAM1484 유래 신규 플라스미드의 복제원점과 대장균(E. coli) 유래 DNA 복제원점을 포함하는 대장균과 로도코커스에서 상호복제가 가능한 신규 로도코커스-대장균 셔틀벡터, 상기 셔틀벡터와 목적유전자가 작동가능하게 연결된 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 셔틀벡터는 상대적으로 크기가 작고, 다양한 로도코커스 속의 미생물 숙주에서 복제가 가능하며, 숙주세포 내에서 복제안정성이 높아 로도코커스 유래의 다양한 유전자들을 클로닝 하는데 유용하다.

대장균, 로도코커스, 셔틀벡터

Description

로도코커스―대장균 셔틀벡터{Rhodococcus-E. coli shuttle vector}

도 1은 로도코커스 에리쓰로폴리스(Rhodococcus erythropolis) IAM1484 유래 플라스미드 pIAM1484의 제한효소 지도이다.

도 2는 플라스미드 pIAM1484와 pBluscript SK(-)로부터 셔틀벡터 pJW1484을 제작하는 과정을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 셔틀벡터 pLG1484의 제작과정을 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명에 따른 셔틀벡터 pLG1484의 복제안정성을 나타낸 것이다.

발명의 분야

본 발명은 로도코커스 에리쓰로폴리스(Rhodococcus erythropolis) IAM1484 유래 신규 플라스미드의 복제원점과 대장균(E. coli) 유래 DNA 복제원점을 포함하는 대장균과 로도코커스에서 상호복제가 가능한 신규 로도코커스-대장균 셔틀벡터, 상기 셔틀벡터와 목적유전자가 작동가능하게 연결된 재조합벡터 및 상기 재조합벡 터로 형질전환된 미생물에 관한 것이다.

배경기술

로도코커스 속 미생물은 생체계면활성제(biosurfactant) (Philp, J.C. et al ., Appl . Microbiol. Biotechnol ., 59:318, 2002), 항생제(Hu, T.L., Water Sci . Technol., 47:169, 2003) 등을 생산함은 물론, 스테로이드 화합물을 생분해하며, 이원 생화합물(xenobiotic compound) (Golovleva, L.A. et al ., Rev . Environ . Contam . Toxicol., 124:41, 1992) 및 니트릴 화합물을 생전환(US 5,135,858) 하거나, 아크릴산을 분해(US 5,998,180; US application no. 11/224,314)하는 등 광범위한 대사활성을 갖고 있어, 그 중요성이 점차 강조되고 있다.

이러한 중요성에 비추어 로도코커스 속 미생물에 대한 유전적, 생리적 연구가 광범위하게 진행(Rahman, M.T. et al ., Vet . Microbiol., 94:143, 2003)되고 있으나, 로도코커스나 이와 비슷한 미생물에서 대사 활동을 연구 개발하는 것은 적절한 숙주/벡터시스템의 부재로 매우 제한적이다 (Finnerty, Annu . Rev . Microbiol., 46:193, 1992). 이에 따라 높은 대사활성을 갖는 균주개발을 위해서는 로도코커스 속 숙주에 대한 효과적인 숙주/벡터 시스템이 요구된다.

미국특허 4,952,500호에는 로도코커스 속 H13-A로부터 얻은 원형 플라스미드를 이용하여 로도코커스-대장균 셔틀벡터가 개시되어 있고, 미국특허 4,920,054에는 로도코커스의 복제원점을 이용하여 로도코커스 에퀴(Rhodococcus equi), 코리네박테리움(Corynebacterium), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 스타필로 코커스 아우레우스(Stappylococcus aureus) 등에서 복제 가능한 셔틀벡터가 개시되어 있다. 미국특허 5,654,180에는 로도코커스 로도크로스에서 복제가능한 플라스미드(pRC001, pRC002, pRC003, pRC004)에서 유래한 복제원점, 대장균에서 복제가능한 플라스미드(pHSG299, pHSG298, pUC19, pUC18)에서 유래한 복제원점을 함유하는 셔틀벡터가 개시되어 있다. 국내공개특허 1999-048213에는 대장균의 pEK 유래 DNA 복제원점, 로도코커스 로도크로스의 pCSP21197 유래 DNA 복제원점, 대장균에서 발현되고 선택표지인 암피실린 저항유전자 및 로도코커스 로도크로스에서 발현되고 선택표지인 카나마이신 저항유전자를 포함하는 셔틀벡터가 개시되어 있다. 또한 일본공개특허 평8-056669에는 대장균 유래의 DNA 복제원점, nocardiform bacterium에 속하는 균주에서 유래된 플라스미드 (pNC500, pNC903)에서 유래된 로도코커스 속 균주에서 복제가능한 DNA 복제원점을 함유하는 대장균 및 로도코커스 속에서 상호 복제가 가능한 셔틀벡터가 개시되어 있다.

이 외에도 로도코커스 패스시언스(Rhodococcus fascians) (Desomer et al ., J. Bacteriol., 170:2401, 1998; Desomer et al ., Appl . Environ . Microbiol ., 56:2818, 1990), 로도코커스 에리쓰로폴리스 (JP 10248578; EP 757101; JP 09028379; US 5,705,386; De Mot et al ., Microbiol., 146:3137, 1997), 로도코커스 로도크로스(Kulakov et al ., Plasmid, 38:61, 1997), 로도코커스 에퀴(Zeng st al., Plasmid, 38:180, 1997), 로도코커스 sp. (WO 89/07151; US 4,952,500; Vogt Singer st al., J. Bacteriol., 170:638, 1988; Appl . Environ . Microbiol ., 64:4363, 1998) 유래 플라스미드를 이용한 셔틀벡터가 보고되어 있다.

이러한 셔틀벡터의 개발에도 불구하고, 상기 셔틀벡터들은 이론상의 연구개발에 머물렀을 뿐, 로도코커스나 이와 비슷한 미생물의 유전자 조작을 가능하게 하는 상업적으로 시판되는 도구는 현재 존재하지 않는 실정이다. 그 이유 중 하나는, 숙주에서 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 리플리카제(replicase)나 리플리케이션 단백질(replication protein)이 많이 알려져 있지 않기 때문이다.

발현벡터나 셔틀벡터를 제조할 때 사용되는 단백질에 대해서는 몇 개 알려져 있는 것이 있으나(Denis-Larose et al ., Appl . Eviron . Micorbiol., 64:4363, 1998; Billington, et al ., J. Bacteriol. 180:3233, 1998; Dasen, G..H. GI:3212128; 및 Mendes, et al, GI:6523480), 그 수 및 유용성이 매우 제한적이다. 또한, 로도코커스 셔틀벡터의 경우 복제안정성이 매우 중요한데, 이러한 복제안정성이 우수한 셔틀벡터는 거의 없는 실정이다. 플라스미드의 복제 안정성은 미생물의 산업적인 이용시 경제적으로나 안전상 문제를 일으킬 수 있는 항생제를 이용해야만 확보되는 경우가 대부분인데, 항생제를 이용하지 않고 복제안정성이 유지되는 기작이나 이에 관계하는 단백질에 대해서는 자세히 알려져 있지 않고 있다.

이런 문제점들을 해결하기 위해서는 다른 유전자의 클로닝을 쉽게 할 수 있고, 강한 리플리케이션 단백질을 포함하며 여러 가지 숙주 내에서 복제 안정성이 높은 셔틀벡터가 필요하다.

이에 본 발명자들은 로도코커스 및 다양한 세포 유래의 목적유전자들을 클로 닝하는데 유용한 대장균 셔틀벡터를 생산하고자 예의 노력한 결과, 대장균과 로도코커스에서 상호복제가 가능한 셔틀벡터를 제조할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 대장균과 로도코커스에서 상호 복제가 가능한 셔틀벡터, 상기 셔틀벡터와 목적유전자가 작동가능하게 연결된 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대장균(E. coli) 유래 DNA 복제원점, 로도코커스 에리쓰로폴리스(Rhodococcus erythropolis) 유래 DNA 복제원점, 대장균에서 발현되고 선택표지가 되는 암피실린 저항유전자, 로도코커스에서 발현되고 선택표지가 되는 카나마이신 저항유전자를 포함하는 대장균과 로도코커스 속에서 상호 복제가 가능한 셔틀벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 에리쓰로폴리스(Rhodococcus erythropolis) 유래 DNA 복제원점은 로도코커스 에리쓰로폴리스(Rhodococcus erythropolis) IAM1484의 플라스미드 유래인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 플라스미드는 pIAM1484인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 셔틀벡터는 pJW1484 또는 서열번호 1의 염기서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 서열번호 1의 염기서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 셔틀벡터는 pLG1484인 것을 특징으로 할 수 있 다.

본 발명은 또한, 상기 셔틀벡터와 목적유전자가 작동가능하게 연결된 (operably linked) 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 로도코커스 속 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 형질전환된 로도코커스 속 미생물은, 로도코커스 코프로필루스(Rhodococcus coprophilus), 로도코커스 에퀴(R. equi), 로도코커스 에리쓰로폴리스(R. erythropolis), 로도코커스 패스시언스(R. fascians), 로도코커스 그로베룰라(R. globerula), 로도코커스 로드니(R. rhodnii), 로도코커스 로도크로스(R. rhodochrous), 로도코커스 루버(R. ruber), 로도코커스 루브룸(R. rubrum)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 산업적으로 중요한 균주로 이용되는 로도코커스에서 효율적으로 복제가 가능한 새로운 로도코커스-대장균 셔틀벡터에 관한 것이다.

본 발명에서는 로도코커스 에리쓰로폴리스 IAM1484에서 분리 정제한 플라스미드 pIAM1484와 대장균에서 많이 이용되는 플라스미드 pBluescript SK(-)를 이용하여 로도코커스-대장균 셔틀벡터(pJW1484)를 제작한 다음, 이중 복제 및 안정성에 기여하는 부위만을 최종 선별하여 셔틀벡터(pLG1484)를 제작하고, 상기 셔틀벡터 pLG1484가 다양한 미생물에서 복제가 가능하다는 점과 복제 안정성이 높다는 점을 확인하였다.

본 발명에 따른 셔틀벡터의 제조하기 위하여, 우선 로도코커스 에리쓰로폴리스 IAM1484 미생물에서 크립틱 플라스미드(cryptic plasmid, pIAM1484)를 분리하고, 이 플라스미드의 제한효소 자리를 검색한 결과, 제한효소 EcoRI 1자리가 발견되어, 크립틱 플라스미드와 대장균 플라스미드인 pBluescript SK(-)를 EcoRI으로 처리하여 대장균에 클로닝하였다. 다음으로 트랜스포존(transposon)을 이용하여 상기 클로닝된 플라스미드에서 크립틱플라스미드 부분의 DNA 서열을 결정한 다음, 복제와 관련하여 중요한 부위라 추정되는 복제 원점 및 리플리카제 부위를 확인하고, 여기서 부수적으로 얻어진 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자를 포함하는 플라스미드(pJW1484)를 수득하였다.

숙주로의 원활한 전달 및 유전자 조작의 편의성을 위해 pJW1484의 서열에서 복제와 관련이 없는 부분을 제거하여 최종적으로 셔틀벡터 pLG1484를 제작하였다.

이후 다양한 로도코커스 속의 균주들를 대상으로 pLG1484의 숙주 범위를 조사하고, 로도코커스 에리쓰로폴리스 LG12 숙주에서 복제 안정성을 검토하여, 본 발명에 따른 셔틀벡터는 강력한 리플리케이션 단백질을 포함하며 여러 가지 숙주 내에서 복제 안정성이 매우 높다는 것을 확인하였다.

본 발명에 따른 셔틀벡터는 목적유전자를 로도코커스 속 미생물에 도입하는데 유용하다. 따라서 본 발명은, 다른 관점에서, 상기 셔틀벡터와 목적유전자가 작동가능하게 연결된(operably linked) 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 로도코커스 속 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 셔틀벡터에 외래유전자를 도입하는 것은 통상의 방법에 의해 달성될 수 있다. 상기 셔틀벡터에 목적유전자의 도입을 용이하게 하기 위하여, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용할 수 있다.

또한, 목적유전자의 발현을 증가시키기 위하여, 발현 조절 서열 (expression control sequence)을 부가할 수 있다. 본 발명에서 “발현조절서열”이란 특정한 숙주에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 이러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 작동가능하게 연결된다. 이것은 적절한 목적유전자가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.

일반적으로, “작동가능하게 연결된(operably linked)”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의 미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다.　이들 서열의 연결은 편리한 제한효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 제한효소 부위가 존재하지 않는 경우에는 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본 발명에 따른 셔틀벡터와 목적유전자가 작동가능하게 연결된 (operably linked) 재조합벡터는 적절한 숙주세포로 통상의 방법으로 형질전환할 수 있다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 로도코커스 속 박테리아이다. 본 발명에 있어서, 사용 가능한 로도코커스 속 박테리아는, 특별히 제한되지는 않지만, 일반적으로 로도코커스 코프로필루스(Rhodococcus coprophilus), 로도코커스 에퀴(R. equi), 로도코커스 에리쓰로폴리스(R. erythropolis), 로도코커스 패스시언스(R. fascians), 로도코커스 그로베룰라(R. globerula), 로도코커스 로드니(R. rhodnii), 로도코커스 로도크로스(R. rhodochrous), 로도코커스 루버(R. ruber), 로도코커스 루브룸(R. rubrum)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 로도코커스 에리쓰로폴리스 IAM1484 유래 크립틱 플라스미드의 분리

본 실시예에서는 로도코커스 에리쓰로폴리스 IAM1484 (Rhodococcus erythropolis IAM1484; ACTC 15961)로부터, 크립틱 플라스미드를 분리하였다. 먼저 로도코커스 에리쓰로폴리스 IAM1484 균주를 5mL YEPD 배지(박토펩톤 2 %, 효모 추출물 1 %, 포도당 2 %)에서 30℃, 200rpm으로 시험관에서 밤샘 배양한 다음, 배양물을 원심분리하여 세포 펠렛을 얻었다. 얻어진 세포 펠렛을 500 ㎕의 TE 버퍼 (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8)로 두 차례 세척한 다음, 원심분리하여 펠렛을 얻고, 500 ㎕의 TE 버퍼에 재현탁한 다음, 1 mg의 리소자임(lysozyme)을 첨가하여 충분히 현탁한 후 37℃에서 한 시간 동안 보관하여 세포벽을 약화시켰다. 이후에는 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989에 개시된 바와 같은 절차를 통해, 플라스미드(pIAM1484; 도 1)를 분리 정제하였다.

실시예 2: 크립틱 플라스미드의 클로닝

크립틱 플라스미드의 취급을 간편하게 하기 위하여, 실시예 1에서 분리된 pIAM1484를 대장균에서 작용하는 복제원점(ori) 및 암피실린(ampicilin) 저항유전자를 가지는 pBluescript SK(-) 플라스미드와 결합하였다 (도 2). 크립틱 플라스미드의 정확한 복제원점의 위치는 알려져 있지 않으나, 본 발명에서는 EcoRI 제한효소자리가 한 개 존재하여 크립틱 플라스미드를 EcoRI 제한효소로 절단할 경우 1개의 선형 플라스미드를 확보할 수 있었고, 이것을 이미 EcoRI 제한효소로 절단하고 탈인산화 반응시킨 pBluescript SK(-) 플라스미드와 라이게이션 시킨 다음, 대장균에 도입하여 약 8kb의 플라스미드를 수득하였다.

실시예 3: pJW1484 의 제작

Cryptic plasmid의 전제 염기서열을 결정하기 위해, 선행문헌 (Goryshin, I.Y. and Reznikoff, W.S., J. Biol . Chem ., 273: 7367, 1998)에 개시된 바와 같이, Epicentri사의 EZ::TN™ <KAN-2> Insertion Kits를 이용하여 크립틱 플라스미드의 전체 염기서열을 결정하였다. 크립틱 플라스미드 부위에 트랜스포존이 약 500bp정도의 간격으로 첨가된 콜로니들을 선별하여 이것을 로도코커스 에리쓰로폴리스 LG12에 각각 형질전환 시킨 후 형질전환 성공여부를 이용하여 복제에 중요한 부위를 추정하였다.

그 결과, 형질전환이 불가능하였던 콜로니는 크립틱 플라스미드의 시작부위로부터 각각 300bp, 800bp 및 1300bp에 트랜스포존이 삽입된 플라스미드였으며, 이를 바탕으로 1~2000bp부위를 블라스트(Balst) 검색을 통해 이중 706~1877bp부위는 플라스미드를 직접 복제하는 리플리카제와 결합단백질 부위로 추정하였고, 1~706bp부위는 복제원점(origin)임을 알 수 있었다. 이중 카나마이신 내성 유전자를 포함하는 트랜스포존이 크립틱 플라스미드의 EcoRI 자리에서부터 2kb정도의 위치에 존재하는 플라스미드를 분리하고, 이것을 pJW1484라 명명하였다 (도 2).

상기 분리된 pJW1484 1μg을 Biorad 사의 Gene Pulser II System에서 1250 Volt, 25μF 조건에서 1mm 간극을 가지는 일렉트로포레이션(electorphoration)용 큐벳을 이용하여, 로도코커스 에리쓰로폴리스 LG12(KCTC 10838BP)에 도입하였다.

실시예 4: pLG1484 의 제작

셔틀벡터의 크기를 최소화하기 위하여, 실시예 3에서 제작된 pJW1484 플라스미드의 서열중에서 대장균과 로도코커스에서 복제에 무의미한 서열을 제거하고, 로도코커스 내에서 복제와 항생제 저항에 관련 있을 것으로 추정되는 부위만을 선별하였다. 즉, pJW1484를 주형으로 하고, 서열번호 2와 3의 프라이머를 이용한 PCR을 통해 3.3kb정도의 DNA 증폭물을 얻었다. 상기 프라이머는 5’인산기로 수식되어 있다.

Cryptic forward(정방향 프라이머) (서열번호 2):

5-P-GACACATTTCGACCGAAGGACATC-3

Kan reverse(역방향 프라이머) (서열번호 3):

5-P-CACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAG-3

또한 대장균에서 복제와 항생제 내성에 관련이 있는 부분을 수득하기 위하여, pJW1484를 주형으로 하고, 서열번호 4와 5의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 그 결과, 2.8kb의 DNA 절편을 수득하였다.

M13 forward RC(정방향 프라이머) (서열번호 4):

5-ACTGGCCGTCGTTTTAC-3

M13 reverse RC(역방향 프라이머) (서열번호 5):

5-CATGGTCATAGCTGTTTCC-3

각각의 PCR 산물을 T4 DNA 폴리머라아제를 이용하여 평활 말단화 시킨 후, T4 DNA 리가아제를 이용하여 라이게이션시킨 다음, 대장균에 도입하였다. 여기서 클로닝된 6153bp의 plasmid를 pLG1484(도 3)로 명명하고, 이를 2005년 1월 21일 자로, 국제기탁기관인 KCTC에 기탁하였다 (KCTC 10770BP). pLG1484의 DNA 서열은 서열번호 1에 나타내었다.

실시예 5: pLG1484 의 복제 안정성

실시예 4에서 제작된 pLG1484를 함유하고 있는 로도코커스 에리쓰로폴리스 LG12 세포를 먼저 40μg/mL의 카나마이신을 포함하는 액체 YEPD 배지에서 늦은 지수성장기(late exponential phase)까지 배양한 후 100배 희석 조건으로 항생제를 포함하지 않는 액체 YEPD배지 50mL에 접종하고 30℃에서 배양하였다. 24 시간 후에 다시 100배 희석 조건으로 항생제를 포함하지 않는 액체 YEPD 배지 50mL에 접종하였다. 이 과정을 반복하면서 각 단계의 세포를 항생제를 포함하지 않는 고체 YEPD 배지에 도말하고, 콜로니(colony)의 수를 측정하여 generation time을 측정하였다.

상기 고체배지에서 생성된 100개의 콜로니를 항생제를 포함하지 않는 고체 YEPD 배지에 접종하여 24시간을 배양한 후, 각각의 콜로니를 40μg/mL의 카나마이신을 포함하는 고체 YEPD 배지에 접종하여, 100개의 콜로니 중 카나마이신에 감수성을 가지는 콜로니의 수를 측정하여 pLG1484의 복제안정성을 조사하였다 (도 4).

그 결과, FIG. 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 pLG1484를 함유하고 있는 로도코커스 에리쓰로폴리스 LG12 세포는 항생제에 의한 선택이 없는 경우에도 매우 우수한 복제안정성을 나타냈다. 항생제를 포함하지 않는 배지에서 1회 분열 당 전체 세포들 중 약 0.22%정도가 셔틀벡터 pLG1484를 포함하지 않는 세포였다. Rhodococcus sp . AS-50-1에서 pMVS301 플라스미드(Vogt Singer & Finnerty, J. Bacteriol., 170:638, 1998) 및 Rhodococcus rhodochrous ATCC12674에서 pK4 플라스미드(Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 93(20):10572, 1996)가 1~1.5% 실활된다고 보고된 것와 비교할 때, 본 발명에 따른 pLG1484는 매우 높은 복제안정성을 가진다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6: pLG1484 의 숙주범위

로도코커스-대장균 셔틀벡터 pLG1484의 숙주범위를 확인하기 위하여, 한국미생물보존센터(KCCM, Korea Culture Center of Microorganisms)로부터 입수한 로도코커스 그로베룰라(Rhodococcus globerulla, KCCM 40036), 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous, KCCM 40120), 로도코커스 에퀴(Rhdococcus equi, KCCM 12541), 로도코커스 루버(Rhodococcus ruber, KCCM 41053)을 각각 pLG1484로 형질전환시켰다. 각각의 세포를 배양한 후, 1μg의 재조합 플라스미드 pLG1484와 혼합한 다음, 1250 Volt, 25μF 조건에서 1mm 간극을 가지는 일렉트로포레이션 용 큐벳을 이용하여 형질전환을 수행하였다. 형질전환체는 50μg/mL의 카나마이신에 대한 저항성 획득에 의해 결정하였다.

Table 1

Host cells	형질전환체/1μg pLG1484 DNA
R. erythropolis LG12	4.3 X 10⁴
R. equi KCCM12541	3.2 X 10⁵
R. globerulla KCCM40036	2.6 X 10⁴
R. rhodochrous KCCM 40120	0
R. ruber KCCM41053	0

그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 pLG1484는 계통도상에서 비교적 멀리 떨어져 있는 로도코커스 에퀴, 로도코커스 그로베룰라, 로도코커스 에리쓰로폴리스 등의 균주에서 복제가 가능하여 비교적 넓은 숙주범위를 가지는 것으로 나타났다. 로도코커스 에퀴의 경우, 로도코커스 에리쓰로폴리스에 비해 7배 정도 형질전환 효율이 좋았고, 로도코커스 그로베룰라는 로도코커스 에리쓰로폴리스의 절반 정도의 형질 전환률을 보였으며, 로도코커스 로도코러스와 로도코커스 루버에서는 형질전환이 되지 않았다. 이 결과로부터 본 발명에 따른 셔틀벡터 pLG1484는 이미 개발된 로도코커스용 셔틀벡터인 pAN12 (WO 02/055709 A2), pDA71 (Dabbs E.R. et al ., Plasmid, 23:242, 1990) 및 pFAJ2600 (De Mot et al ., Microbiol., 146:3137, 1997)에 비해 매우 넓은 숙주범위를 가진다는 것을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정 의된다고 할 것이다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 대장균과 로도코커스에서 상호 복제가 가능한 셔틀벡터, 상기 셔틀벡터와 목적유전자가 작동가능하게 연결된 재조합벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 셔틀벡터는 상대적으로 크기가 작아 유전자 조작시에 많은 장점을 가지며, 강한 리플리케이션 단백질을 포함하고 있고, 로도코커스 내에서 복제 안정성이 높아 항생제를 포함하지 않는 배지에서도 충분한 복제가 가능하므로 발효공정이나 생물전환공정에서 안정성을 확보할 수 있다. 또한, 여러 종류의 로도코커스 속에 대하여 넓은 숙주범위를 가지고 있어 로도코커스 속 및 다양한 세포 유래의 목적유전자들을 클로닝 하는데 유용하다.

<110> LG CHEM, LTD. <120> RHODOCOCCUS-E. COLI SHUTTLE VECTOR <130> P06-B030 <150> KR 10-2005-12892 <151> 2005-02-16 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6153 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A shuttle vector which can replicate in Rhodococcus and E. coli <400> 1 cacctgacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg 60 tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc 120 tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc 180 gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta 240 gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta 300 atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg 360 atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa 420 aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgcttacaat ttccattcgc cattcaggct 480 gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 540 agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 600 ttggaattct ccgcgcacca ccgacacatt tcgaccgaag gacatcgatg cttccggacc 660 gactgaccgc gctcgcctcc gccgcacaca acgccggagc acgtgagaac ctccacaacc 720 tcggcggcgt ccaccacgac gcacaccacg ccaccctcac cctcgatcgc tacacacccg 780 agaagctccc agcgtcctcc tgggccgcga tactcgacca ccacgcacgc acaccgcact 840 aacgattcgg ccggcgctcg attcggccgg cgctcgattc ggccggcgct cgattcggcc 900 ggcgctcgat tcggccggcg ctcgattcgg ccgagcagaa gagtgaacaa ccaccgacca 960 cgcttccgct ctgcgcgccg tacccgacct acctcccgca gctcgaagca gctcccggga 1020 gtaccgccgt actcacccgc ctgtgctcac catccaccga cgcaaagccc aacccgagca 1080 cacctcttgc accaaggtgc cgaccgtggc tttccgctcg cagggttcca gaagaaatcg 1140 aacgatccag cgcggcaagg ttcaaaaagc aggggttggt ggggaggagg ttttgggggg 1200 tgtcgccggg atacctgata tggctttgtt ttgcgtagtc gaataatttt ccatatagcc 1260 tcggcgcgtc ggactcgaat agttgatgtg ggcgggcaca gttgccccat gaaatccgca 1320 acggggggcg tgctgagcga tcggcaatgg gcggatgcgg tgttgcttcc gcaccggccg 1380 ttcgcgacga acaacctcca acgaggtcag taccggatga gccgcgacga cgcattggca 1440 atgcggtacg tcgagcattc accgcacgcg ttgctcggat ccatcgtcat cgactgcgat 1500 cacgtcgacg ccgcgatgcg cgcattcgag caaccatccg accatccggc gccgaactgg 1560 gtcgcacaat cgccgtccgg ccgcgcacac atcggatggt ggctcggccc caaccacgtg 1620 tgccgcaccg acagcgcccg actgacgcca ctgcgctacg cccaccgcat cgaaaccggc 1680 ctcaagatca gcgtcggcgg cgatttcgcg tatggcgggc aactgaccaa aaacccgatt 1740 caccccgatt gggagacgat ctacggcccg gccaccccgt acacattgcg gcagctggcc 1800 accatccaca caccccggca gatgccgcgt cggcccgatc gggccgtggg cctgggccgc 1860 aacgtcacca tgttcgacgc cacccggcga tgggcatacc cgcagtggtg gcaacaccga 1920 aacggaaccg gccgcgactg ggaccatctc gtcctgcagc actgccacgc cgtcaacacc 1980 gagttcacga caccactgcc gttcaccgaa gtacgcgcca ccgcgcaatc catctccaaa 2040 tggatctggc gcaatttcac cgaagaacag taccgagccc gacaagcgca tctcggtcaa 2100 aaaggcggca aggcaacgac actcgccaaa caagaagccg tccgaaacaa tgcaagaaag 2160 tacgacgaac atacgatgcg agaggcgatt atctgatggg cggagccaaa aatccggtgc 2220 gccgaaagat gacggcagca gcagcagccg aaaaattcgg tgcctccact cgcacaatcc 2280 aacgcttgtt tgctgagccg cgtgacgatt acctcggccg tgcgaaagct cgccgtgaca 2340 aagctgtcga gctgcggaag caggggttga agtaccggga aatcgccgaa gcgatggaac 2400 tctcgaccgg gatcgtcggc cgattactgc acgacgcccg caggcacggc gagatttcag 2460 cggaagatct gtcggcgtaa ccaagtcagc gggttgtcgg gttccggccg gcgctcggca 2520 ctcggaccgg ccggcggatg gtgttctgcc tctggcgcag cgtcagctac cgccgaaggc 2580 ctgtcatcga ccggcttcga ctgaagtatg agcaacgtca cagcctgtga ttggatgatc 2640 cgctcacgct cgaccgctac ctgttcagct gccgcccgct gggcatgagc aacggccaac 2700 tctcgttcaa gatccgcgat ccgctggaca tggtcaaaat cagggcggcc atgaccgtgg 2760 gcaccttcgg gcgggctggg ctgtctctta tacacatctc aaccatcatc gatgaattgt 2820 gtctcaaaat ctctgatgtt acattgcaca agataaaaat atatcatcat gaacaataaa 2880 actgtctgct tacataaaca gtaatacaag gggtgttatg agccatattc aacgggaaac 2940 gtcttgctcg aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtataaatg 3000 ggctcgcgat aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgattgtatg ggaagcccga 3060 tgcgccagag ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacagatga 3120 gatggtcaga ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat 3180 ccgtactcct gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccggaaaaa cagcattcca 3240 ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct 3300 gcgccggttg cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc gcgtatttcg 3360 tctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga 3420 cgagcgtaat ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataaac ttttgccatt 3480 ctcaccggat tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt gataacctta tttttgacga 3540 ggggaaatta ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc gataccagga 3600 tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga gttttctcct tcattacaga aacggctttt 3660 tcaaaaatat ggtattgata atcctgatat gaataaattg cagtttcatt tgatgctcga 3720 tgagtttttc taatcagaat tggttaattg gttgtaacac tggcagagca ttacgctgac 3780 ttgacgggac ggcggctttg ttgaataaat cgaacttttg ctgagttgaa ggatcagatc 3840 acgcatcttc ccgacaacgc agaccgttcc gtggcaaagc aaaagttcaa aatcaccaac 3900 tggtccacct acaacaaagc tctcatcaac cgtggccgcc accgcggtgg agctccagct 3960 tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 4020 ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 4080 gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 4140 ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 4200 ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 4260 cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 4320 cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 4380 accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 4440 acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 4500 cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 4560 acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 4620 atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 4680 agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 4740 acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 4800 gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg 4860 gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 4920 gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 4980 gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 5040 acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 5100 tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 5160 ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt 5220 catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat 5280 ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag 5340 caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct 5400 ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt 5460 tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg 5520 cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca 5580 aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt 5640 tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat 5700 gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac 5760 cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa 5820 aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt 5880 tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt 5940 tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa 6000 gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt 6060 atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa 6120 taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgc 6153 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gacacatttc gaccgaagga catc 24 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cacggttgat gagagctttg ttgtag 26 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 actggccgtc gttttac 17 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 catggtcata gctgtttcc 19

Claims

대장균(E. coli) 유래 DNA 복제원점, 로도코커스 에리쓰로폴리스(Rhodococcus erythropolis) 유래 DNA 복제원점, 대장균에서 발현되고 선택표지가 되는 암피실린 저항유전자, 로도코커스에서 발현되고 선택표지가 되는 카나마이신 저항유전자를 포함하는 로도코커스-대장균 셔틀벡터.
제1항에 있어서, 상기 로도코커스 에리쓰로폴리스(Rhodococcus erythropolis) 유래 DNA 복제원점은 로도코커스 에리쓰로폴리스(Rhodococcus erythropolis) IAM1484의 플라스미드 유래인 것을 특징으로 하는 셔틀벡터.
제2항에 있어서, 상기 플라스미드는 pIAM1484인 것을 특징으로 하는 셔틀벡터.
제1항에 있어서, pJW1484인 것을 특징으로 하는 셔틀벡터.
제1항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 것을 특징으로 하는 셔틀벡터.
제5항에 있어서, pLG1484인 것을 특징으로 하는 셔틀벡터.
제4항의 셔틀벡터 pJW1484와 목적유전자가 작동가능하게 연결된 재조합벡터.
제7항의 재조합벡터로 형질전환된 미생물.
제8항에 있어서, 로도코커스 속인 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
제9항에 있어서, 로도코커스 속 미생물은, 로도코커스 코프로필루스(Rhodococcus coprophilus), 로도코커스 에퀴(R. equi), 로도코커스 에리쓰로폴리스(R. erythropolis), 로도코커스 패스시언스(R. fascians), 로도코커스 그로베룰라(R. globerula), 로도코커스 로드니(R. rhodnii), 로도코커스 로도크로스(R. rhodochrous), 로도코커스 루버(R. ruber), 로도코커스 루브룸(R. rubrum)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환된 로도코커스 속 미생물.
제6항의 셔틀벡터 pLG1484와 목적유전자가 작동가능하게 연결된 재조합벡터.
제11항의 재조합벡터로 형질전환된 미생물.
제12항에 있어서, 로도코커스 속인 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
제13항에 있어서, 로도코커스 속 미생물은, 로도코커스 코프로필루스(Rhodococcus coprophilus), 로도코커스 에퀴(R. equi), 로도코커스 에리쓰로폴리스(R. erythropolis), 로도코커스 패스시언스(R. fascians), 로도코커스 그로베룰라(R. globerula), 로도코커스 로드니(R. rhodnii), 로도코커스 로도크로스(R. rhodochrous), 로도코커스 루버(R. ruber), 로도코커스 루브룸(R. rubrum)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환된 로도코커스 속 미생물.