KR20120128193A - 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 ‘GAL4 driver’를 이용한 고효율의 신규한 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상기 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터는 조직 특이적인 형광 발현을 통하여 기존의 ‘GAL4-UAS system’의 문제점을 근본적으로 해결하고, 목적 단백질을 원하는 시기에 원하는 세포(또는 조직)에서 대량발현 시킬 수 있는 장점 뿐 아니라 보다 높은 효율성으로 생명과학과 공학의 근간이 되는 재조합유전자 조작기술에 크게 기여할 것이다.

Description

조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터 및 이의 제조방법{Tissue-specific recombination vector and manufacturing method thereof}

본 발명은 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 ‘GAL4 driver’를 이용한 고효율의 신규한 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

GAL4-UAS system’이란 원하는 유전자를 원하는 시기에 원하는 조직에서 발현시키는 것을 가능하게 해주는 방법으로써 타겟 유전자의 발현을 가능하게 만들어진 시스템이다. 상기 GAL4는 효모의 전사인자로서 ‘GAL4 driver’의 장점이 있다. 상기 ‘GAL4 driver’는 GAL4의 조절부위인 UAS(upstream activating sequence)에 결합하여 그 인근의 유전자 발현을 유도하는데, UAS 뒤에 관심 있는 유전자를 달아 GAL4를 통해 그 유전자의 발현을 유도할 수 있는 장점이 있다.

목적하는 유전자를 UAS 뒤에 달아 형질전환 동물을 만든 후, 특정 시기 특정 조직에 발현되는 ‘GAL4 driver’를 가진 제브라피쉬와 교배를 통하여 특정시기 특정 조직에서 목적 유전자를 대량발현 시킬 수 있다.

그러나 GAL4-UAS system은 유전자 기능 탐색을 위해서 광범위하게 사용되어온 방법의 하나지만 목적 유전자들이 가지는 다양한 조직의 특이성으로, 상기의 발현 시스템만으로는 일률적으로 적용이 어려운 한계점을 가지고 있다.

뿐만 아니라 기존의 형질전환 발현 벡터의 경우 알려진 특정 조직에서 발현하는 프로모터를 이용하여 transcription factor(GAL4)를 발현하도록 하는 것으로, 이는 알려진 특정 프로모터를 이용함에 따라 지금까지 알려진 유전자에 대한 정보를 이용하여 벡터를 재조하여 형질전환체를 만드는 것이다.

이에, 본 발명자들은 조직 특이적인 형광 발현을 통하여 기존의 ‘GAL4-UAS system’의 문제점을 근본적으로 해결하고, 알려지지 않은 특정 유전자에 대한 인핸서 트랩(enhancer trap)을 이용하여 알려진 특정 유전자의 발현뿐만 아니라 알려지지 않은 유전자를 trap하여 발현 시키고, 또한 특정 시간에서의 발현 양상을 확인할 수 있도록 EosFP를 벡터안에 유전자 재조합하여 목적 단백질을 원하는 시기에 원하는 세포(또는 조직)에서 대량발현 시킬 수 있는 고효율의 신규한 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터를 제조하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 목적 단백질을 원하는 시기에 원하는 세포(또는 조직)에서 효율적으로 형광을 발현시켜 다양한 단백질의 생체 내 기능 분석이 가능한 고효율의 신규한 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터를 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터의 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터는 Tol2 트랜스포존(transposon)과 Tol2 트랜스포존(transposon) 사이에 인헨서 트랩(enhancer trap), GAL4 및 EosFP의 유전자 단편이 순차적으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열이 순차적으로 이루어지는 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 용어, “벡터” 란 연결되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터의 하나의 유형인 “플라스미드”는 그 안에 추가적으로 DNA 조각을 연결시킬 수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 말한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 Tol2 트랜스포존(transposon)과 Tol2 트랜스포존(transposon) 사이에 인헨서 트랩(enhancer trap), GAL4 및 EosFP의 유전자 단편의 순차적인 구성을 갖는 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터를 제공한다. 도 1을 참조한다.

본 발명에 있어서, 상기 인헨서 트랩(enhancer trap) 유전자 단편은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다. 도 2를 참조한다.

본 발명에 있어서, 상기 GAL4 유전자 단편은 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터. 도 3을 참조한다.

본 발명에 있어서, 상기 EosFP 유전자 단편은 서열번호 5의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다. 도 4를 참조한다.

보다 상세하게는 상기 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열이 순차적으로 이루어지는 뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 도 7을 참조한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 발현벡터인 것으로, 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 지시할 수 있으며, 일반적으로 재조합 DNA 기술의 사용에 있어서 발현 벡터는 플라스미드 형태이다.

본 발명은

1) 서열번호 1의 인헨서 트랩(enhancer trap) 프로모터를 클로닝하는 단계;

2) 서열번호 2의 Gal4VP16 유전자 단편 및 서열번호 5의 2A-EosFP 유전자 단편을 클로닝하는 단계; 및

3) 상기 1) 단계의 인헨서 트랩(enhancer trap) 프로모터와 상기 2) 단계의 Gal4VP16 유전자 단편 및 2A-EosFP 유전자 단편을 Tol2 트랜스포존 시스템(transposon system)에 재조합하는 단계;

를 포함하는 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터의 제조방법을 제공한다.

보다 상세하게는 1) 서열번호 1의 인헨서 트랩(enhancer trap) 프로모터를 p5E 벡터에 클로닝하여 p5E-EnT 벡터를 제조하는 단계;

2) 서열번호 2의 Gal4VP16 유전자 단편 및 서열번호 5의 2A-EosFP 유전자 단편을 pME 벡터에 클로닝하여 pME Gal4VP16-2A-EosFP 벡터를 제조하는 단계; 및

3) 상기 1) 단계의 p5E-EnT 벡터 및 상기 2) 단계의 pME Gal4VP16-2A-EosFP 벡터를 Tol2 트랜스포존 시스템(transposon system)에 재조합하는 단계;로 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 2) 단계의 서열번호 2의 Gal4VP16 유전자 단편은 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머로 증폭할 수 있으며, 상기 2) 단계의 서열번호 6의 2A-EosFP 유전자 단편은 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머로 증폭할 수 있다.

상기 제조방법에 따른 본 발명의 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터를 이용한 형질전환체를 제공한다.

보다 상세하게는 상기 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터를 제브라피쉬의 발생배에 통상의 형질전환시키는 방법을 이용하여 제브라피쉬 형질전환체를 제조하고, 상기 형질전환 제브라피쉬의 발생배아에서 형광발현을 확인한 결과, 특정 시간에서의 목적 단백질을 원하는 시기에 원하는 세포(또는 조직)에서 대량발현 시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터는 조직 특이적인 형광 발현을 통하여 기존의 ‘GAL4-UAS system’의 문제점을 근본적으로 해결하고, 목적 단백질을 원하는 시기에 원하는 세포(또는 조직)에서 대량발현 시킬 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 따른 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터는 보다 높은 효율성으로 생명과학과 공학의 근간이 되는 재조합유전자 조작기술에 크게 기여할 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터(pDestTol2CG2-EnT-Gal4VP16 2A EosFP) 내 구성을 모식화한 도면이고,
도 2는 본 발명에 따른 인헨서 트랩(enhancer trap)의 염기서열을 보여주는 것이며,
도 3은 본 발명에 따른 Gal4VP16 유전자의 염기서열을 보여주는 것이고,
도 4는 본 발명에 따른 2A 펩타이드(peptide) 및 EosFP 유전자의 염기서열을 보여주는 것이며,
(A: 2A peptide, B: EosFP 유전자)
도 5는 본 발명에 따른 2A-EosFP 유전자 단편의 염기서열을 보여주는 것이고,
도 6은 본 발명에 따른 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터(pDestTol2CG2-EnT-Gal4VP16 2A EosFP)를 제한효소로 처리하여 확인한 결과를 보여주는 것이며,
(1: 제한효소 NcoI, B: 제한효소 XbaI)
도 7은 본 발명에 따른 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터(pDestTol2CG2-EnT-Gal4VP16 2A EosFP)의 전체 염기서열을 보여주는 것이고,
도 8은 본 발명에 따른 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터(pDestTol2CG2-EnT-Gal4VP16 2A EosFP)를 이용한 형질전환 제브라피쉬의 발생배아에서의 형광발현을 보여주는 것이다.
(1; 명시야 상의 제브라피쉬 사진, 2: 녹색형광이 적색형광으로 변한 제브라피쉬 사진, 3: 녹색형광발현을 보여주는 제브라피쉬의 사진, 4: 적색형광을 보여주는 제브라피쉬의 사진)

이하, 본 발명을 구체적인 실시 예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에 종사하는 업자에게는 명백한 것이다.

이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

[실시예 1]. EnT minimal promoter의 클로닝

EnT minimal promoter(Genbank ID : 100037748)를 p5E 다중 클로닝 위치 벡터(multiple cloning site vector, 미국 Chien Lab에서 제공)에 클로닝 하기 위해 Tol2-EnT-Gal4VP16 벡터(일본 Kawakami lab에서 제공받음)를 제한효소 SalI과 BamHI으로 각각 1 unit을 같이 혼합하고, 2시간 동안 37℃ 배양기에서 보관 후 Agarose 전기영동을 통해서 EnT minimal promoter를 분리한 뒤, 역시 제한효소 SalI과 BamHI으로 각각 1 unit로 37℃배양기에서 2시간동안 처리된 p5E 벡터를 다중 클로닝 위치에 클로닝 하여 p5E-EnT 벡터를 제조하였다. 각각의 제한효소는 37℃에서 2시간 동안 반응하여 143 bp의 EnT minimal promoter와 2808 bp의 p5E 벡터를 다중 클로닝 위치에 분리 및 정제하였으며, 상온에서 Ligation Mix(Takara Co.)를 이용하여 30분간 라이게이션(ligation) 한 뒤, 이를 DH5α 대장균 균주에 형질전환 하여 p5E-EnT 벡터를 제작하였다.

상기 플라스미드 DNA의 정제는 MACHEREY-NAGEL에서 판매하는 NucleoBond XtraMidi kit을 이용하였고, 각각의 벡터의 염기서열은 SolGent에 분석을 의뢰하여 도 2의 염기서열을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 2] Gal4VP16 및 2A- EosFP 의 클로닝

Gal4VP16-2A-EosFP를 pME 다중 클로닝 위치 벡터(multiple cloning site vector,미국 Chien Lab에서 제공 )에 클로닝 하기 위하여, 우선 PCR을 통하여 하기의 프라이머 세트를 이용하여 Gal4VP16 유전자 단편 및 2A-EosFP 유전자 단편을 증폭하였다. PCR조건은 anealing 온도 60℃(40초), extension 온도는 72℃(40초), denaturatio 온도는 94(1분)으로 하여 30회 운전하였다.

상기 유전자 단편은 2A(GenBank: FJ863663.1), Gal4vp16(GenBank: GU452684.1), EosFP(GenBank: AY765217.1)를 이용하였다.

서열번호 7: Gal4VP16(F) HindIII (ataagcttTGGACCATGAAGCTACTGTCT),

서열번호 8: Gal4VP16(R) BamHI (atggatccCATATCCAGAGCGCCGTAGG),

서열번호 9: 2A peptide EosFP(F) BamHI (GtggatccGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCCATGGATATGAGTGCGA),

서열번호 10: EosFP(R) XbaI (tctagaTTATCGTCTGGCATTGTC)

상기 증폭된 유전자 단편의 염기서열을 확인한 결과, 도 3의 염기서열을 가진 651 bp의 Gal4VP16 유전자 단편과 도 5의 염기서열을 가진 753 bp의 2A-EosFP 유전자 단편을 수득할 수 있었다.

상기 증폭된 유전자 단편을 제한효소 HindIII, BamHI 및 XbaI을 각각 1unit씩 37℃에서 2시간동안 처리한 후, pME 벡터를 다중 클로닝 위치(multiple cloning site)에 클로닝하여, pME Gal4VP16-2A-EosFP 벡터를 제작하였다.

[ 실시예 3] 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터의 제조

상기 실시예 1의 p5E-EnT 벡터 및 상기 실시예 2의 pME Gal4VP16-2A-EosFP 벡터를 Tol2 트랜스포존 시스템(transposon system)에 재조합하기 위하여 LR 재조합 시스템(recombination system)을 사용하였다.

상기 클로닝된 p5E-EnT 벡터, pME Gal4VP16-2A-EosFP 벡터 및 p3E polyA 벡터(미국 Chien Lab에서 제공)는 각각 10 fmole, pDestTol2CG2 게이트웨이 벡터(invitrogen cat#: 12537-103)는 20 fmole의 양을 1.5 ml 튜브에 전체 양을 7 ul에 맞추도록 TE 버퍼를 사용하였고, 다음에 LR 리컴비네이즈(recombinase) 2 ul를 천천히 혼합하여 상온에서 16시간 동안 반응하였다. 이후 프로테이나제 K(proteinase K)를 1 ul(2 ug/ul)를 넣은 후 37℃배양기에서 15분간 처리한 후, DH5α 대장균 균주에 형질전환하여 pDestTol2CG2-EnT-Gal4VP16-2A-EosFP-pA 벡터를 제조하였다.

참조: p5E MCS, pME MCS 및 pDestTol2CG2 vector

정보: Tol2 kit(http://chien.neuro.utahedu/tol2kitwiki/ index.php/Main_Page)

[ 실시예 4] 제브라피쉬를 이용한 재조합 벡터의 미세주입

상기 실시예 3에서 만들어진 재조합 벡터을 이용하여 제브라피쉬의 배아에 미세주입 하였다. 미세주입방법은 일반적인 제브라피쉬의 미세주입방법으로 제브라피쉬 1세포기 발생배아에 미세주입을 위해 하루 전날 밤에 암컷과 수컷을 교미상자(mating cage)에 넣고 암처리화 하였다. 다음날 아침에 암수를 섞어서 교배시키면서 산란된 발생배아를 수집하여 인젝션용 1% 아가로즈 플레이트(agarose plate)의 일직선의 홈에 차례로 정렬시킨 뒤 끝이 둥근 미세 유리관을 이용하여 발생배의 세포방향이 미세주입기구(microinjector)를 향하도록 하였다. 미세유리바늘 (microcapillary)을 이용하여 재조합 된 벡터를 100 ng/ul 농도로 발생배아의 세포질에 적당량(~50 pl)을 주입한 후, 발생배들을 egg water에 옮긴 뒤 28.5℃에서 배양하였다.

도 8에서도 확인할 수 있듯이, 배양 후 24시간이 지나서 재조합 벡터의 EosFP에 의한 형광발현을 관찰할 수 있다. 여기서 발현된 형광이 EosFP에 의한 발현인지를 확인하기 위해서 형광현미경 하(Observer.Z1, ZEISS)에서 우선 녹색형광을 확인하였고, 또한 적색형광이 없음을 확인하였다. 다음 1분 동안 DAPI 필터를 통해서 30초 동안 UV(<400nm)을 주사한 후 같은 위치에서 녹색이 적색으로 형광을 발현함을 확인할 수 있었다.

<110> Hanbat National University Industry-Academic Cooperation Foundation Genomic Design Bioengineering Company <120> Tissue-specific recombination vector and manufacturing method thereof <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 180 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> enhancer trap <400> 1 ctgcaggcgg ccgcgaattc actagtgatt atcgatctcg ggtcgatcag gaagcggggg 60 gttgcagccg gccgctcggt cctcctcccg catataaatt ctccaaccaa agcgtttttc 120 ttcatctttc tgttacctgg caaaggggag cagcagctga ggagtgatct ctcaatcttg 180 180 <210> 2 <211> 650 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Gal4VP16 <400> 2 atgaagctac tgtcttctat cgaacaagca tgcgatattt gccgacttaa aaagctcaag 60 tgctccaaag aaaaaccgaa gtgcgccaag tgtctgaaga acaactggga gtgtcgctac 120 tctcccaaac caaaaggtct ccgctgacta gggcacatct gacagaagtg gaatcaaggc 180 tagaaagact ggaacagcta tttctactga tttttcctcg agaagacctt gacatgattt 240 tgaaaatgga ttctttacag gatataaaag cattgttaac aggattattt gtacaagata 300 atgtgaataa agatgccgtc acagatagat tggcttcagt ggagactgat atgcctctaa 360 cattgagaca gcatagaata agtgcgacat catcatcgga agagagtagt aacaaaggtc 420 aaagacagtt gactgtatct tcgaggtcga ccccgggaat tcagatctct cgagccgccc 480 ccccgaccga tgtcagcctg ggggacgagc tccacttaga cggcgaggac gtggcgatgg 540 cgcatgccga cgcgctagac gatttcgatc tggacatgtt gggggacggg gattccccgg 600 gtccgggatt taccccccac gactccgccc cctacggcgc tctggatatg 650 <210> 3 <211> 66 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> 2A peptide <400> 3 ggatccggag ccacgaactt ctctctgtta aagcaagcag gagacgtgga agaaaacccc 60 ggtccc 66 <210> 4 <211> 687 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> EosFP gene <400> 4 atggatatga gtgcgattaa gccagacatg aagatcaacc tccgtatgga aggcaacgta 60 aacgggcacc actttgtgat cgacggagat ggtacaggca ggccttttga gggaaaacag 120 agtatggatc ttgaagtcaa agagggcgga cctctgcctt ttgcctttga tatcctgacc 180 actgcattcc attacggcaa cagggtattc gccgaatatc cagaccacat acaagactat 240 tttaagcagt cgtttcctaa ggggtattcg tgggaacgaa gcttgacttt cgaagacggg 300 ggcatttgca ttgccagaaa cgacataaca atggaagggg acactttcta taataaagtt 360 cgatttcacg gtacaaactt tcccgccaat ggtccagtta tgcagaagaa gacgctgaaa 420 tgggagccct ccactgagaa aatgtatgtg cgtgatggag tgctgacggg tgatattcac 480 atggctttgt tgcttgaagg aaatgcccat taccgatgtg acttcagaac tacttacaaa 540 gctaaggaga agggtgtcaa gttaccaggc taccactttg tggaccactg cattgagatt 600 ttaagccatg acaaagatta caacaaggtt aagctgtatg agcatgctgt tgctcattct 660 ggattgcctg acaatgccag acgataa 687 <210> 5 <211> 753 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> 2A-EosFP sequense <400> 5 ggatccggag ccacgaactt ctctctgtta aagcaagcag gagacgtgga agaaaacccc 60 ggtcccatgg atatgagtgc gattaagcca gacatgaaga tcaacctccg tatggaaggc 120 aacgtaaacg ggcaccactt tgtgatcgac ggagatggta caggcaggcc ttttgaggga 180 aaacagagta tggatcttga agtcaaagag ggcggacctc tgccttttgc ctttgatatc 240 ctgaccactg cattccatta cggcaacagg gtattcgccg aatatccaga ccacatacaa 300 gactatttta agcagtcgtt tcctaagggg tattcgtggg aacgaagctt gactttcgaa 360 gacgggggca tttgcattgc cagaaacgac ataacaatgg aaggggacac tttctataat 420 aaagttcgat ttcacggtac aaactttccc gccaatggtc cagttatgca gaagaagacg 480 ctgaaatggg agccctccac tgagaaaatg tatgtgcgtg atggagtgct gacgggtgat 540 attcacatgg ctttgttgct tgaaggaaat gcccattacc gatgtgactt cagaactact 600 tacaaagcta aggagaaggg tgtcaagtta ccaggctacc actttgtgga ccactgcatt 660 gagattttaa gccatgacaa agattacaac aaggttaagc tgtatgagca tgctgttgct 720 cattctggat tgcctgacaa tgccagacga taa 753 <210> 6 <211> 8226 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> pDestTol2CG2 EnT Gal4VP16 2A EosFP vector sequence <400> 6 attatacata gttgataatt cactggccgt cgttttacgg taccatcgat gatgatccag 60 acatgataag atacattgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat 120 gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata 180 aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg 240 aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtat ggctgattat gatcctctag 300 atcagatctc ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 360 tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 420 tgtatcttat catgtctgga tctacgtaat acgactcact atagttctag aggctcgaga 480 ggggccgctt tacttgtaca gctcgtccat gccgagagtg atcccggcgg cggtcacgaa 540 ctccagcagg accatgtgat cgcgcttctc gttggggtct ttgctcaggg cggactgggt 600 gctcaggtag tggttgtcgg gcagcagcac ggggccgtcg ccgatggggg tgttctgctg 660 gtagtggtcg gcgagctgca cgctgccgtc ctcgatgttg tggcggatct tgaagttcac 720 cttgatgccg ttcttctgct tgtcggccat gatatagacg ttgtggctgt tgtagttgta 780 ctccagcttg tgccccagga tgttgccgtc ctccttgaag tcgatgccct tcagctcgat 840 gcggttcacc agggtgtcgc cctcgaactt cacctcggcg cgggtcttgt agttgccgtc 900 gtccttgaag aagatggtgc gctcctggac gtagccttcg ggcatggcgg acttgaagaa 960 gtcgtgctgc ttcatgtggt cggggtagcg gctgaagcac tgcacgccgt aggtcagggt 1020 ggtcacgagg gtgggccagg gcacgggcag cttgccggtg gtgcagatga acttcagggt 1080 cagcttgccg taggtggcat cgccctcgcc ctcgccggac acgctgaact tgtggccgtt 1140 tacgtcgccg tccagctcga ccaggatggg caccaccccg gtgaacagct cctcgccctt 1200 gctcaccatg gtcactgtct gctttgctgt tggtctgggc tcctgggtca ctggcttact 1260 aatggagtct ttatgtatga ggactcttat caattgttct tctataaagg tctgcagtgt 1320 ttctgttcgt cccctacatg gacacccaga gcctcctaaa tacaggagcc ctgataactg 1380 cacaagtgct cagattccag cagggtggaa aatgagataa agtgtgcaga tggggagggg 1440 gacgtgaatg agagatttga gggatgaaaa ggatggatga acgcattgaa aatagcccct 1500 ttcacaaaat aataccagta aattgtcata taattaatga ccagaccttt acctgtaaat 1560 gatgtgatgt tcatatacag aagaatgcca acaatttaca gatgatttta caaattctta 1620 attttccttt tctaaatgga tttgttcaca cattatctct tcaaagcaat tgaattttct 1680 ggaaaagatt ggctgtgtgt gtaaaaggtg ctactgagga atttaatgtg acatggaatg 1740 aagcaaacag cagcctaaga caggatggca ggaaaaatgt cacatgttta aaataagagt 1800 gaaaccaacg acctggactt atagagactg tgtgtcctta ggcaaagctc ttgtacaaac 1860 agtgcttgtg actgtgaaat tcggggtttg cctggattgt gttaaatgtg tgcttggatg 1920 tatcataaaa aagaatcggt tctctgtatt tgacattttc tgtaatttat ctaaagttac 1980 aactggctat gcctgatttt tatcactatt gaatcaatca ttttaaagaa tgttaagtct 2040 gctgatttgg agagctcatt tacatttatt ttgaatgtct cttatttaac acaactgatt 2100 taagctttag atctgcgaag atacggccac gggtgctctt gatcctgtgg ctgattttgg 2160 actgtgctgc tcgcagctgc tgatgaatca catacttcct ccattttctt ccactgattg 2220 actgttataa tttccctaat ttccaggtca aggtgctgtg cattgtggta atagatgtga 2280 catgacgtca cttccaaagg accaatgaac atgtctgacc aatttcatat aatgtgaaaa 2340 cgattttcat aggcagaata aataacattt aaattaaact gggcatcagc gcaattcaat 2400 tggtttggta atagcaaggg aaaatagaat gaagtgatct ccaaaaaata agtacttttt 2460 gactgtaaat aaaattgtaa ggagtaaaaa gtactttttt ttctaaaaaa atgtaattaa 2520 gtaaaagtaa aagtattgat ttttaattgt actcaagtaa agtaaaaatc cccaaaaata 2580 atacttaagt acagtaatca agtaaaatta ctcaagtact ttacacctct ggttcttgac 2640 cccctacctt cagcaagccc agcagatcca ctagttctag agcggccgcc accgcggtgg 2700 agctccagct tttgttccct ttagtgaggg ttaattgcgc gcttggcgta atcatggtca 2760 tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga 2820 agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg 2880 cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc 2940 caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 3000 tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 3060 cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 3120 aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 3180 gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 3240 agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 3300 cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 3360 cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 3420 ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 3480 gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 3540 tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg 3600 acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 3660 tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 3720 attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 3780 gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 3840 ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 3900 taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 3960 ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 4020 ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 4080 gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 4140 ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 4200 gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 4260 tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 4320 atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 4380 gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 4440 tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 4500 atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 4560 agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 4620 ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 4680 tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 4740 aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 4800 tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 4860 aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctaa attgtaagcg 4920 ttaatatttt gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat 4980 aggccgaaat cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg 5040 ttgttccagt ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc 5100 gaaaaaccgt ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt 5160 tggggtcgag gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag 5220 cttgacgggg aaagccgggc tggctaagaa ctcatcagcc tccccggtcc atctacccac 5280 gtaccaatgc accaattggc cacaatgacg gctactacat ggtgccattc cttcctcttt 5340 ataggaatgg agactacctc ctgtccaaca aggctcttgg atacgagtac gcctacctgt 5400 tggacccagg tcattgcaca acaccagaaa tgccctctga tctgcaaaag acgtgaatat 5460 ctgttcagac acccatatcc actctgttcc acacaggtca gaggtttgtc caggagttct 5520 tgacagaggt gtaaaaagta ctcaaaaatt ttactcaagt gaaagtacaa gtacttaggg 5580 aaaattttac tcaattaaaa gtaaaagtat ctggctagaa tcttacttga gtaaaagtaa 5640 aaaagtactc cattaaaatt gtacttgagt attaaggaag taaaagtaaa agcaagaaag 5700 aaaactagag attcttgttt aagcttttaa tctcaaaaaa cattaaatga aatgcataca 5760 aggttttatc ctgctttaga actgtttgta tttaattatc aaactataag acagacaatc 5820 taatgccagt acacgctact caaagttgta aaacctcaga tttaacttca gtagaagctg 5880 attctcaaaa ttgttagtgt caagcctagc tcttttgggg ctgaaaagca atcctgcagt 5940 gctgaaaagc ctctcacagg cagccgatgc gggaagaggt gtattagtct tgatagagag 6000 gctgcaaata gcaggaaacg tgagcagaga ctccctggtg tctgaaacac aggccagatg 6060 ggccctcgag caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agctatcaac tttgtataga 6120 aaagttgtaa tacgactcac tatagggcga attgggtacc gggccccccc tcgaggtcga 6180 cctgcaggcg gccgcgaatt cactagtgat tatcgatctc gggtcgatca ggaagcgggg 6240 ggttgcagcc ggccgctcgg tcctcctccc gcatataaat tctccaacca aagcgttttt 6300 cttcatcttt ctgttacctg gcaaagggga gcagcagctg aggagtgatc tctcaatctt 6360 gggatccact agttctagag cggccgccac cgcggtggag ctccagcttt tgttcccttt 6420 agtgagggtt aatcaagttt gtacaaaaaa gcaggcttaa tacgactcac tatagggcga 6480 attgggtacc gggccccccc tcgaggtcga cggtatcgat aagctttgga ccatgaagct 6540 actgtcttct atcgaacaag catgcgatat ttgccgactt aaaaagctca agtgctccaa 6600 agaaaaaccg aagtgcgcca agtgtctgaa gaacaactgg gagtgtcgct actctcccaa 6660 aaccaaaagg tctccgctga ctagggcaca tctgacagaa gtggaatcaa ggctagaaag 6720 actggaacag ctatttctac tgatttttcc tcgagaagac cttgacatga ttttgaaaat 6780 ggattcttta caggatataa aagcattgtt aacaggatta tttgtacaag ataatgtgaa 6840 taaagatgcc gtcacagata gattggcttc agtggagact gatatgcctc taacattgag 6900 acagcataga ataagtgcga catcatcatc ggaagagagt agtaacaaag gtcaaagaca 6960 gttgactgta tcttcgaggt cgaccccggg aattcagatc tctcgagccg cccccccgac 7020 cgatgtcagc ctgggggacg agctccactt agacggcgag gacgtggcga tggcgcatgc 7080 cgacgcgcta gacgatttcg atctggacat gttgggggac ggggattccc cgggtccggg 7140 atttaccccc cacgactccg ccccctacgg cgctctggat atgggatccg gagccacgaa 7200 cttctctctg ttaaagcaag caggagacgt ggaagaaaac cccggtccca tggatatgag 7260 tgcgattaag ccagacatga agatcaacct ccgtatggaa ggcaacgtaa acgggcacca 7320 ctttgtgatc gacggagatg gtacaggcag gccttttgag ggaaaacaga gtatggatct 7380 tgaagtcaaa gagggcggac ctctgccttt tgcctttgat atcctgacca ctgcattcca 7440 ttacggcaac agggtattcg ccgaatatcc agaccacata caagactatt ttaagcagtc 7500 gtttcctaag gggtattcgt gggaacgaag cttgactttc gaagacgggg gcatttgcat 7560 tgccagaaac gacataacaa tggaagggga cactttctat aataaagttc gatttcacgg 7620 tacaaacttt cccgccaatg gtccagttat gcagaagaag acgctgaaat gggagccctc 7680 cactgagaaa atgtatgtgc gtgatggagt gctgacgggt gatattcaca tggctttgtt 7740 gcttgaagga aatgcccatt accgatgtga cttcagaact acttacaaag ctaaggagaa 7800 gggtgtcaag ttaccaggct accactttgt ggaccactgc attgagattt taagccatga 7860 caaagattac aacaaggtta agctgtatga gcatgctgtt gctcattctg gattgcctga 7920 caatgccaga cgataatcta gagcggccgc caccgcggtg gagctccagc ttttgttccc 7980 tttagtgagg gttaataccc agctttcttg tacaaagtgg gggatccaga catgataaga 8040 tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt 8100 gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac 8160 aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttcc 8220 aacttt 8226 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gal4VP16 forward primer <400> 7 ataagctttg gaccatgaag ctactgtct 29 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gal4VP16 reverse primer <400> 8 atggatccca tatccagagc gccgtagg 28 <210> 9 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2A peptide EosFP forward primer <400> 9 gtggatccgg agccacgaac ttctctctgt taaagcaagc aggagacgtg gaagaaaacc 60 ccggtcccat ggatatgagt gcga 84 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EosFP reverse primer <400> 10 tctagattat cgtctggcat tgtc 24

Claims (9)

1. Tol2 트랜스포존(transposon)과 Tol2 트랜스포존(transposon) 사이에 인헨서 트랩(enhancer trap), GAL4 및 EosFP의 유전자 단편의 순차적인 구성을 갖는 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 인헨서 트랩(enhancer trap) 유전자 단편은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 GAL4 유전자 단편은 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 EosFP 유전자 단편은 서열번호 4의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터.
5. 제 1항 내지 제 4항에서 선택되는 어느 한 항에 있어서,
   상기 재조합 벡터는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터.
6. 제 5항에 있어서,
   상기 재조합 벡터는 발현벡터인 것을 특징으로 하는 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터.
7. 1) 서열번호 1의 인헨서 트랩(enhancer trap) 프로모터를 클로닝하는 단계;
   2) 서열번호 2의 Gal4VP16 유전자 단편 및 서열번호 5의 2A-EosFP 유전자 단편을 클로닝하는 단계; 및
   3) 상기 1) 단계의 인헨서 트랩(enhancer trap) 프로모터와 상기 2) 단계의 Gal4VP16 유전자 단편 및 2A-EosFP 유전자 단편을 Tol2 트랜스포존 시스템(transposon system)에 재조합하는 단계;
   를 포함하는 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터의 제조방법.
8. 제 7항에 있어서,
   상기 2) 단계의 서열번호 2의 Gal4VP16 유전자 단편은 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머로 증폭하는 것을 특징으로 하는 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터의 제조방법.
9. 제 7항에 있어서,
   상기 2) 단계의 서열번호 6의 2A-EosFP 유전자 단편은 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머로 증폭하는 것을 특징으로 하는 조직 특이적 형질전환용 재조합 벡터의 제조방법.

Images