KR20060079133A - 분무건조 고분자형 콜렉틴족 단백질 및 그의 제조방법 - Google Patents

분무건조 고분자형 콜렉틴족 단백질 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

호흡기로의 흡입 또는 다른 표피세포의 감염에 직접 전달하는데 적합한 미생물 감염성 질환 치료 및 예방용 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체를 함유하는 분무건조 분말 조성물 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 분무건조 분말 조성물은 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체를 유효성분으로 포함하고 입자크기가 0.1 내지 10 ㎛인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 분무건조 분말 조성물은 바이러스, 세균, 진균류 등의 감염을 억제하는 효과가 있고 흡입에 적당한 형태로 제제화되었기 때문에, 이들 미생물에 의한 호흡기 감염이나 외상의 예방 및/또는 치료제로 직접 감염 부위나 감염가능 부위에 유효성분을 공급할 수 있는 형태로 제제화 한 것이다. 본 발명의 분무건조 분말 조성물은 다른 부형제와 혼합되어 정제(tablet)형태의 제형을 제조하는데도 이용될 수 있다.
만노스 결합형 렉틴, 분무건조, 제조방법, 콜렉틴족 단백질

Description

분무건조 고분자형 콜렉틴족 단백질 및 그의 제조방법{Spray-dried Multimeric Collectin Family Protein and Process for Preparing the Same}
도 1은 본 발명의 분무건조 MBL 조성물의 크기 분포를 확인한 그래프이다.
도 2는 분무건조 전, 후의 MBL이 형태적으로 같게 유지되는지를 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 분무건조 MBL 분말의 C4 활성화 정도를 분무건조 전의 MBL 용액과 비교한 그래프이다.
도 4a 내지 4e는 온도 조건을 달리하여 제조한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물의 C4 활성화 정도를 분무건조 전의 MBL 용액과 비교한 그래프이다.
도 5a 내지 5d는 첨가제로 사용하는 당의 종류를 달리하여 제조한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물의 C4 활성화 정도를 분무건조 전의 MBL 용액과 비교한 그래프이다.
도 6은 첨가제로 사용하는 당의 종류를 달리하여 제조한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물의 크기 분포를 확인한 그래프이다.
도 7a 내지 7d는 첨가제로 사용하는 당의 종류를 달리하여 제조한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물 분말에 대한 전자현미경 사진이다.
도 8a 내지 8d는 첨가제로 사용하는 락토오스의 농도를 달리하여 제조한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물의 C4 활성화 정도를 분무건조 전의 MBL 용액과 비교한 그래프이다.
도 9a 내지 9e는 첨가제로 사용하는 수크로스의 농도를 달리하여 제조한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물의 C4 활성화 정도를 분무건조 전의 MBL 용액과 비교한 그래프이다.
도 10는 첨가제로 사용하는 락토오스의 농도를 달리하여 제조한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물 분말의 크기분포를 확인한 그래프이다.
도 11는 첨가제로 사용하는 수크로스의 농도를 달리하여 제조한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물 분말의 크기분포를 확인한 그래프이다.
도 12a 내지 12d는 첨가제로 사용하는 락토오스의 농도를 달리하여 제조한 본 발명의 MBL 조성물 분말에 대한 전자현미경 사진이다.
도 13a 내지 13e는 첨가제로 사용하는 수크로스의 농도를 달리하여 제조한 본 발명의 MBL 조성물 분말에 대한 전자현미경 사진이다.
도 14a 내지 14d는 당에 카세인(casein)이 포함되거나 포함되지 않은 첨가제를 첨가하여 제조한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물 분말의 C4 활성화 정도를 분무건조 전의 MBL 용액과 비교한 그래프이다.
도 15a 내지 15d는 가혹 온도조건에서 보관한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물의 C4 활성화 정도를 상온에 보관한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물과 비교한 그래프이다.
도 16a 및 16b는 첨가제를 달리하여 제조한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물 이 미생물과 결합하는 경향을 분무건조 전의 MBL 용액과 비교한 그래프이다.
호흡기로의 흡입 또는 다른 표피세포의 감염에 직접 전달하는데 적합한 미생물 감`염성 질환 치료 및 예방용 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체를 직접 감염된 부위 및 감염 가능한 부위에 공급할 수 있는 분무건조 분말 형태로 제조하는 방법과 필요한 조성물에 관한 것이다.
만노스 결합형 렉틴(mannose binding lectin, 이하 'MBL'로 약칭함)은 인체 혈중에 존재하는 단백질로 미생물에 의한 감염을 극복하는 선천성 면역을 담당하고 있는 것으로 알려져 있다. MBL은 몸 안에 침입한 미생물 표면단백질의 특징적인 당화형태(glycosylation pattern)를 인식해서 미생물과 결합한 후 아래의 세 가지 경로로 미생물에 의한 감염을 차단한다. 첫 번째 방법은 MBL이 미생물의 표면 당화 단백질과 결합체를 형성한 후 렉틴 경로(lectin pathway)를 통해 MBL 연관 세린 프로테아제가 활성화되어 C4와 C2를 분할함으로써 보체계(complement system)를 활성화 시키는 것이다. 두 번째 방법은 미생물의 표면 당화 단백질에 결합한 MBL 자체가 옵소닌(opsonin)으로 작용하여 중성구(neutrophil) 또는 대식세포(macrophage) 와 같은 식균세포에 의한 식균작용(phagocytosis)을 유도하는 것이다. 세 번째 방법은 MBL이 미생물의 표면 당화 단백질과 결합하여 미생물이 세포 내로 침입하는 감염성을 중화시켜(neutralization) 미생물의 증식을 차단하는 방법이다. 따라서 MBL이 미생물의 침입을 방어하는데 있어서 가장 중요한 첫 단계는 미생물을 인지해 결합하는 것이다.
MBL은 콜렉틴족에 속하는 한 단백질인데 이에 속한 단백질은 공통적으로 콜라겐 도메인과 탄수화물 인식 도메인을 갖는다. MBL은 단위 분자량이 32 kDa으로, C-말단 부위에 탄수화물 인식 도메인(C-type carbohydrate recognition domain, CRD)이 있고, N-말단 부위에 시스테인 풍부 지역(cysteine rich region)이 있으며, 콜라겐 도메인(collagen Domain)을 가지고 있다. 세 개의 단위 분자 MBL이 모여 콜라겐 도메인을 통해 삼중나선 구조를 갖는 단위 복합체를 형성하게 되는데 이 삼중나선 복합체는 다시 N-말단 부위의 시스테인에 의한 분자간 이황화결합(-S-S-)을 하게 되어 MBL의 경우 여섯 개까지의 복합체를 형성할 수 있게 된다. 이는 콜렉틴족에 속해있는 SP-A(surfactant protein-A), SP-D(surfactant protein D), CL-L1(collectin1-liver 1), CL-P1(collectin-placenta 1) 등 모든 단백질의 구조적 특징이므로 이들 콜렉틴족에 속해 있는 단백질들은 물리화학적으로 비슷한 성격을 가지고 있다. 이들은 또한 공통적으로 혈청과 폐 표면에서 미생물에 대한 전면역 방어(preimmune defense)에 있어 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Hans-Jurgen Hoppe and Kenneth B.M. reid, Protein Science, 3: 1143-1158, 1994). 상기 단백 질 외에도 콜렉틴족에 속한 단백질로는 소의 콘글루티닌(bovine conglutinin)인 CL-43 및 인간 콘글루티닌 유사 단백질이 있다.
MBL은 다양한 종류의 미생물과 결합할 수 있는 것으로 알려져 있다. MBL은 주로 외피막을 갖는 바이러스들과 잘 결합하는데, 대표적으로 독감 바이러스(Hatrshorn K. L. et al., J. Clin. Invest., 91:1414, 1993; Kase T. et al., Immunol., 97:385, 1999), HIV(Ezekowitz R. A. et al., J. Exp. Med., 169:185, 1989; Haurum J. C. et al., AIDS, 7:1307, 1993), 헤르페스 바이러스(Fischer C. B. et al., Scan. J. Immunol. 39:439, 1994) 및 사스 코로나(SARS corona) 바이러스(Ksiazek T. G. et al., N. Eng. J. Med., 348:1953, 2003; Peiris J. S. M. et al., Lancet, 361:1319, 2003) 등이 포함되며, 일반 감기를 일으키는 리노바이러스(rhinovirus) 등에도 잘 결합할 것으로 예상된다. MBL은 박테리아 중에는 Staphylococcus aureus (Neth O. et al., Infect. Immunol., 68:688, 2000), Hemophilus influenzae(Van E. et al., Clin. Exp. Immunol., 97:411, 1994) 등과 잘 결합하고, 균류 중에는 Candida albicans (Tabona P. et al., Immunol., 85:153, 1995)와 잘 결합하는 것이 보고되었다.
MBL과 결합하는 미생물 중 독감 바이러스, 리노바이러스, 사스 코로나 바이러스, 동물유래 독감 바이러스 등은 주로 호흡기의 상피세포에 감염되어 증상을 일으키고, S. aureus, H. influenzae는 폐에 감염을 일으킨다. S. aureus는 외부 상 처에도 감염이 되고, C. albicans는 여성의 질염과 관련이 있다. 이들 호흡기 질환 및 외부 감염의 치료에 MBL을 사용하기 위해서는 용액 상태로는 사용하기 부적절하므로 특수한 제제화가 요구된다. MBL은 혈액중에 존재하는 단백질로 많은 연구가 이루어져 있으나 MBL이 위에 언급된 상피세포 및 외부상처 감염에 대한 방어 및 대처에 얼마나 관여하는지는 잘 알려져 있지 않다. 단지 침과 모유(Tregoat V. et al., J. Clin. Lab. Anal., 16(6):304, 2002) 등에서 MBL이 검출되었다는 보고가 있다.
독감 바이러스에 의한 감염 시 바이러스는 호흡기 표면의 상피세포 내로 감염하고, 감염된 세포에서 증식한 후 밖으로 나와 이웃 상피세포를 다시 감염시키게 된다. 따라서 당화된 미생물 표면단백질을 인지하여 결합하는 MBL을 이용하여 독감바이러스와 결합시키면, 바이러스가 상피세포에 접촉하여 감염하는 것을 차단할 수 있다. 이와 같이 표면으로 노출된 세포에 대한 미생물의 감염에 있어서, 위에서 언급한 MBL의 세 가지 선천적 면역 기작 중 결합에 의한 물리적 차단에 의한 방어가 가능하며, 옵소닌으로의 작용에 의한 방어 효과는 식세포가 표면으로 스며 나올 경우에 가능하다.
실제로 배양세포에서 바이러스에 의한 감염이 MBL에 의해 차단되는 경우, MBL에 결합하는 물리적 중화만으로도 이웃세포로의 미생물 감염을 충분히 차단할 수 있음이 관찰되었다. 그 예로 사스 코로나 바이러스를 배양된 세포에 감염시킬 때 MBL을 배양액 속에 넣어주면 바이러스 감염이 차단되는 것을 관찰할 수 있었다( 대한민국 특허출원 제 2004-0106194 호). 또한 독감 바이러스 감염에서도 이와 유사하게 MBL이 바이러스의 감염을 차단할 수 있다는 것이 알려져 있다(Wakamiya N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 187:1270, 1992; Hartley C. A. et al., J. Virol., 66:4358, 1992; Patrick C. R. et al., J. Virol., 71:8204, 1997; Kase T. et al., Immunol., 97:385, 1999).
MBL을 호흡기 감염 또는 외상에 적용하기 위해서는 용액 상태가 아닌 분말 형태로 제제화하는 것이 여러 면에서 바람직하다. 분말 형태의 제제는 감염된 부위로 MBL을 효과적으로 공급할 수 있고, 공급량을 극대화할 수 있으며, 국부적으로 사용하기 때문에 부작용을 줄일 수 있고, 사용량을 절감할 수 있다.
단백질 의약품을 분말 형태로 제제화 하기 위한 방법은 일반적으로 동결건조법과 분무건조법이 사용된다. 현재 가장 보편적으로 사용되는 분말화 방법은 동결건조법이다. 동결건조법은 열에 민감한 단백질에 사용하기에 적당한 방법이지만, 효과적으로 흡입할 수 있는 수 ㎛ 크기의 균일한 분말을 만드는데 적당치 않다. 또한 동결건조를 위해 얼리는 과정에서 단백질과 용매성분이 얼음결정 사이에서 농축되는 경향이 있는데, 이런 농축효과는 단백질 주변의 pH와 이온강도(ionic strength)의 급격한 변화를 일으켜 단백질의 변성과 침전을 유발할 수 있다(Schwartz P. L. et al., Endocrinology, 92(6):1795, 1973; Koseki T. et al., J. Biochem., 107:389, 1990).
이에 반하여 분무건조법은 액체시료를 연속적으로 흘려보내면서 분무시켜 미세하게 분산된 형태의 물방울을 만드는 동시에 열풍으로 순간적으로 건조시키는 방법으로 다수의 의약품 제제화에 이미 사용되고 있는 방법이다. 분무건조법은 흡입을 통해 의약품을 기도나 폐로 운반하기에 적당한 크기의 입자로 분말을 만들 수 있는 장점이 있고, 에너지 소비가 적기 때문에 생산현장에서 비용과 시간을 절약할 수 있다(Broadhead J. et al., Drug Dev. Ind. Pharm., 18(11&12):1169, 1992). 일반적으로 단백질은 열에 안정하지 않기 때문에 고온의 열풍을 이용하는 분무건조법을 단백질 의약품의 분말화에 적용한 경우는 많지 않지만, 옥시헤모글로빈(oxyhemoglobin, Labrude P. et al., J. Pharm. Sci. 78(3):223, 1989), 인간 성장 호르몬 (hGH, Mumenthaler M. et al., Pharm. Res., 11(1):12, 1994; Bosquillon C., J. Cont. Rel., 96:233, 2004), t-PA(Mumenthaler M. et al., Pharm. Res. 11(1):12, 1994), DNase(Chan H. K. et al., Pharm. Res. 14(4):431, 1997), 부갑상선 호르몬(PTH, Codrons V. et al., J. Pharm. Sci. 92(5):938, 2003), 인간화 단일클론 항체(anti-IgE, Maa Y. F. et al., Biotechnol. Bioeng., 60(3):301, 1998) 등에 대한 시도가 이루어지고 있다.
특히, 호흡기에 사용할 목적으로 분무 건조된 단백질 조성물을 제조하는 경우에는 5 ㎛ 이하 크기의 분말 형태로 제제화하는 것이 바람직한데, 이 때, 분말의 크기 분포, 모양, 수분 함유량 등이 치료효능에 있어 중요한 요인이 된다(Hickey A. J. et al., Pharm. Tech., 18:58, 1994). 이러한 분말의 물리적 특성을 결정하는데 열풍의 공급속도 및 온도, 단백질 용액의 공급속도 및 분무압력 등의 기기적 조건(Maa Y. F. et al., Pharm. Res. 15(5):768, 1998)과 단백질 용액이 포함하는 염류, 당, 부형 단백질 등 첨가제의 종류 및 농도(Andya J. D. et al., Pharm. Res., 16(3):350, 1999; Maa Y. F. et al., Pharm. Dev. Tech., 2(3):213, 1997)가 중요한 요인으로 작용한다. 아울러, 재조합 인간 MBL을 분무 건조하여 분말형으로 제제화하고자 할 때, 중요하게 고려되어야 할 사항은 분무 건조된 재조합 인간 MBL 분말을 녹였을 때 결합형 당화 단백질 및 세린 프로테아제의 존재하에 MBL 결합형 당화 단백질에 특이적으로 결합하여 보체를 활성화하는 효과를 분무 건조전의 용액상태와 마찬가지로 유지하고 있어야 하며, 상기 활성이 장기적으로도 보존되어야 한다.
그러나, 아직까지 호흡기의 염증 등을 치료할 목적으로 인간 재조합 MBL 조성물을 분무 건조하여 제조하는 방법에 대한 연구성과는 알려지지 않고 있는 바, 호흡기를 통한 흡입이나 외상에 적용할 수 있는 분무 건조에 의한 재조합 인간 MBL 조성물의 제조방법에 대한 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 MBL 용액에 첨가제로 당 및/또는 첨가단백질을 첨가하여 분무건조할 경우, 상기 방법에 의하여 제조된 MBL 건조분말이 장기간 보관에도 안정적이고 효능이 유지됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체를 호흡기를 포함한 상 피세포에 미생물 감염 예방 및 치료용으로 직접 감염 부위 및 감염 가능 부위에 전달할 수 있는 분무건조 분말을 제조하는 방법을 제공 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미생물 감염성 질병의 예방 및 치료용 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체를 함유하는 분무건조 분말을 제조 하는데 필요한 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체를 유효성분으로 포함하고 입자크기가 0.1 내지 10 ㎛로서 호흡기, 다른 체강 및 체표면의 미생물 감염 부위에 감염성 질환 치료 및 예방용으로 직접 전달 할 수 있는 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체를 함유하는 분무건조 분말 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 (ⅰ) 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체 및 당이 포함된 수용액을 제조하는 단계; (ⅱ) 분무건조기를 이용하여 분무 공기 압력 500 내지 2,000 L/h, 공급 열풍의 압력 400 내지 1,200 L/min, 열풍온도 50 내지 220 ℃ 및 배기온도 42 내지 150 ℃의 조건으로 상기 단계 (ⅰ)에서 제조된 수용액을 분무하는 단계; 및, (ⅲ) 상기 단계 (ii)에 의하여 생성된 분말을 수득하는 단계를 포함하는 호흡기로의 흡입 또는 표피 세포 감염 치료에 적합한 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체를 함유하는 분무건조 분말 조성물의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체를 유효성분으로 포함하고 입자크기가 0.1 내지 10 ㎛로서 호흡기로의 흡입 또는 다른 표피세포의 감염에 직접 전달하는데 적합한 미생물 감염성 질환 치료 및 예방용 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체를 함유하는 분무건조 분말 조성물을 제공한다.
이때, 콜렉틴족 단백질이란 공통적으로 탄수화물 인식 도메인과 콜라겐 도메인을 포함하는 단백질로, 서로 물리화학적 성질이 매우 유사하다. 유사체란 본래의 콜렉틴족 단백질의 아미노산 서열 중 일부 아미노산에 변이가 존재하나 기능적으로는 등가인 단백질을 의미한다. 상기 유사체는 동일 종 또는 다른 종의 콜렉틴족 단백질 상동체와 구조적, 생리학적 기능이 유사한 자연적 또는 인위적 돌연변이체를 모두 포함한다.
콜렉틴족 단백질에는, 예를 들어, SP-A(surfactant protein-A), SP-D(surfactant protein D), CL-L1(collectin1-liver 1), CL-P1(collectin-placenta 1), CL-43 및 인간 콘글루티닌 유사 단백질(human conglutinin-like protein)이 있다. 상기 콜렉틴족에 속하는 단백질은 모두 C-말단에 렉틴 도메인을 가지고 있어서 탄수화물을 인식하여 결합할 수 있다(Hans-Jurgen Hoppe and Kenneth B.M. reid, Protein Science, 3: 1143-1158, 1994). 예를 들어, CL-43은 HIV-1의 외피를 구성하는 당단백질인 gp160에 결합하여 gp160이 CD4 수용체에 결합하는 것을 억제하고(Anderson et al. Scand J Immunology, 32: 81-88, 1990) 인간 콘글루티닌 유사 단백질은 HIV-1의 gp120에 결합하여 감염을 막는다(Ushijima et al. Jpn. J. Cancer Res. 83: 458-464, 1992). SP-A 및 SP-D도 여러가지 미생물에 결합하여 감염을 막는다는 사실이 알려져 있다(Zimmerman et al., J. Clin. Invest. 89: 143-149, 1992; McNeely and Coonrod, J. Infect. Dis. 91-97, 1993; Kuan et al., J. Clin. Invest.90: 97-106, 1992). 이러한 사실로부터 콜렉틴족에 속하는 단백질은 모두 만노스 결합형 렉틴과 마찬가지로 본 발명의 미생물 감염성 질환 치료 및 예방용 분무건조 분말 조성물의 유효성분으로 포함될 수 있을 것이다.
상기 콜렉틴족에 속하는 단백질은 상업적으로 시판되는 물질을 구입하거나 재조합 벡터 등을 이용한 당업계 공지의 분자생물학적 기술을 이용하여 사용할 수 있다. 예를 들어, CL-P1은 R & D systems사의 Recombinant Human CL-P1(Catalog Number: 2690-CL)를 구입하여 본 발명의 조성물 제작에 이용할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 바람직한 조성예로는 0.001 내지 60 중량부 재조합 MBL, 0.1 내지 10 중량부 NaCl, 0.1 내지 10 중량부 CaCl2, 당은 5 내지 80 중량부를 포함하고, 보다 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량부 재조합 MBL, 8 내지 9 중량부 NaCl 및 1 내지 2 중량부 CaCl2, 20 중량부 락토오스 또는 20 중량부 수크로스와 0.5 중량부 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol, PVA)을 포함하는 분무건조 분말 조성물을 들 수 있다. 중량부는 조성물내의 상기 구성요소들의 중량의 비율로서, 본원 발명의 조성물은 수용액에 용해시킨 후 분무건조하여 제조되었고 상기 구성요 소들은 모두 비휘발성이므로 용액 제조시 사용된 용질의 질량비가 분무건조 조성물의 최종 질량비가 됨은 자명하다. 따라서, 백분율 또는 몰농도로 표시된 용질의 비율은 쉽게 중량부로 환산된다. 예를 들어, 용액 1리터당 1g의 용질의 중량비를 1로 설정하였을 경우, 분자량이 111인 CaCl2의 몰농도 10 mM은 10× 10-3× 111로 계산하여 1.11 중량부가 된다.
상기 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체는 0.001 내지 60 중량부가 함유되는 것이 바람직하나 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 만노스 결합형 렉틴은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 자연형 만노스 결합형 렉틴 또는 재조합 만노스 결합형 렉틴인 것이 바람직하며, 재조합 만노스 결합형 렉틴인 것이 더욱 바람직하다. 이때, 재조합 만노스 결합형 렉틴은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 적어도 삼중나선 복합체가 세 개 이상으로 구성된 다량체(multimeric) 재조합 만노스 결합형 렉틴인 것이 바람직하며, 수탁번호 KCTC 10472BP(대한민국 공개특허 제2004-0106194호)의 세포주로부터 생산된 것이 더욱 바람직하다.
또한, 만노스 결합형 렉틴 함유 분무건조 분말의 입자크기는 호흡기 등으로의 흡입에 의하여 치료효과를 보이기 위하여 대략 5 ㎛ 내외인 것이 바람직하고, 0.1 내지 4 ㎛인 것이 더욱 바람직하다.
아울러, 본 발명의 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체를 함유하는 분무건조 분말 조성물은 상기 유효성분 외에 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하고, 이때, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 특별히 이에 제 한되는 것은 아니나, 당인 것이 바람직하고, 상기 당은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 수크로스 또는 락토오스인 것이 바람직하다. 이때, 상기 당의 함량은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 5 내지 80중량부 함유된 것이 바람직하다.
한편, 상기 미생물은 바이러스, 세균 또는 진균류인 것이 바람직하고, 상기 바이러스는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 독감 바이러스, HIV(human immunodeficiency virus), 헤르페스 바이러스, 사스 코로나 바이러스 및 리노바이러스인 것이 바람직하며, 세균은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, Staphylococcus aureus, Hemophilus influenzae 또는 S. pyogens인 것이 바람직하고, 진균류는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, Candida albicans인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체를 함유하는 분무건조 분말 조성물은 제형화된 이후 안정적인 활성을 위하여 카세인을 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다. 이때, 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 카세인은 0.1 내지 20중량부 함유되는 것이 바람직하다.
한편, 상기 치료 및 예방 대상이 되는 미생물은 바이러스, 세균 또는 진균류인 것이 바람직하고, 상기 바이러스는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 독감 바이러스, HIV(human immunodeficiency virus), 헤르페스 바이러스, 사스 코로나 바이러스 및 리노바이러스를 포함하는 외막을 갖는 바이러스인 것이 바람직하고, 상 기 세균은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, Staphylococcus aureus, Hemophilus influenzae 또는 S. pyogens을 포함하는 MBL이 인지할 수 있는 당 패턴을 갖는 세균인 것이 바람직하며, 상기 진균류는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, Candida albicans을 포함하는 MBL이 인지할 수 있는 당 패턴을 갖는 진균인 것이 바람직하다.
아울러, 본 발명은 (ⅰ) 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체 및 당이 포함된 수용액을 제조하는 단계; (ⅱ) 분무건조기를 이용하여 분무 공기 압력 500 내지 2,000 L/h, 공급 열풍의 압력 400 내지 1,200 L/min, 열풍온도 50 내지 220 ℃ 및 배기온도 42 내지 150 ℃의 조건으로 상기 단계 (ⅰ)에서 제조된 수용액을 분무하는 단계; 및, (ⅲ) 상기 단계 (ii)에 의하여 생성된 분말을 수득하는 단계를 포함하는 호흡기로의 흡입 또는 표피세포의 감염 부위에 직접 전달하기에 적합한 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체를 함유하는 분무건조 분말 조성물의 제조방법을 제공한다.
이때, 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 단계 (ⅰ)에서 수용액은 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체가 0.0005 내지 10%(w/v) 함유되고, 당이 0.1 내지 4%(w/v) 함유되는 것이 바람직하고, 상기 당은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 수크로스 또는 락토오스인 것이 바람직하며, 단계 (ⅰ)에서 수용액은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 카세인을 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다. 이때, 상기 카세인은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 0.005 내지 0.2%(w/v) 함유되는 것이 바람직하다.
본 발명자들은 폐렴 등의 세균 감염성 호흡기 질환의 치료에 유용한 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체를 경구 투여 또는 주사에 의한 투여방식이 아닌 에어로졸 형태로 직접 흡입시킴으로써 표적기관의 상피세포에 직접 작용시킬 수 있는 제형을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 통상의 현탁액 조성물이 아닌 미세입자크기의 분말 조성물의 형태로 제형화할 경우, 보다 효율적인 투여가 가능함을 인지하게 되었다. 그러나, 단백질 제제에 있어서, 통상적인 분말 제조 방법인 동결건조 방식에 의하여 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체 분말 조성물을 제조할 경우, 흡입에 적절한 크기(5 ㎛ 미만)의 입자가 형성되지 않기 때문에, 흡입형 제제로는 부적합하다. 따라서, 적절한 크기의 입자의 형성에 유리한 방법으로 분무건조방법을 고려하게 되었다. 상기 분무건조방법은 강한 압력으로 현탁액을 분무하고 이를 열풍에 의하여 건조하는 방식으로 열에 약한 단백질의 입자를 형성하는데는 사용이 제한되는 방법으로서 극히 일부 단백질에 대한 제제화의 예가 있을 뿐이며, 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체를 상기 방법으로 제제화한 예는 없다.
이에, 본 발명자들은 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체를 함유하는 미세분말 조성물을 제조하는데 있어서 분무건조방법을 적용할 경우, 상기 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체의 활성 및 안정성이 유지되는 지 분석한 결과, 분무건조방법으로 제조된 미세분말 조성물이 건조 전의 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체를 함유하는 현탁액과 그 활성 면에서 큰 차이가 없고, 상온에서 장기간 안정적으로 보 관될 수 있음을 확인하였다. 또한, 흡입에 효율적인 입자크기를 갖는 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체를 함유하는 분말 조성물을 제조하기 위하여, 첨가제로서의 당의 종류 및 농도를 변화함으로써 최적의 조건을 확립하였으며, 분말 조성물의 활성을 유지하는 온도 및 압력 조건을 확입하였다. 더 나아가, 카세인을 포함시킬 경우, 카세인이 포함되지 않는 대조군에 비하여 우수하게 활성이 유지됨을 확인함으로써, 보다 효과적인 미생물 감염성 질병의 치료 및 예방용 조성물을 제조할 수 있었다.
본 발명의 조성물은 에어로졸 형태로 직접 흡입할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 투여량은 약 50 ㎍/dose 내지 20 mg/dose 이고, 바람직하게는 1 mg/dose 내지 5 mg/dose 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니며, 하기 실시예에서 사용되는 백분율(%)는 특별히 언급하지 않는 한, 체적대중량(w/v)을 의미한다.
<실시예 1> MBL 분말의 특성 분석 및 분석 방법의 확립
재조합 MBL을 흡입이나 외상에 적용할 수 있는 형태 또는 이를 이용해 정제 (tablet)로 만들 수 있는 형태인 MBL 분말로 제제화하기 위해서는 다음의 조건을 충족시켜야 한다. 분무건조 방법으로 만들어진 MBL 분말이 에어로졸(aerosol) 형태로 흡입 가능한 크기로 만들어져야 하고, MBL 구조적 특징인 복합체 형성의 정도와 분포가 열풍에 의해 분무 건조되는 과정에서도 변함없이 유지되어야 하며, 만들어진 MBL 분말을 녹였을 때 MBL 결합형 당화 단백질 및 세린 프로테아제의 존재 하에 보체를 활성화하는 효과가 유지되어야 한다. 또한, 이러한 특성을 확인할 수 있는 분석 방법의 확립이 필요하다.
우선, 일반적인 단백질의 분무 건조 조건에서 MBL 분말을 생산하였다. 분무 건조를 위해 사용한 MBL 용액은 재조합 MBL(Dobeel, Korea) 5 ㎍/mL, NaCl 150 mM, CaCl2 10 mM, 수크로스0.4%(w/v)의 조성에 1 mg/mL casein의 카세인을 첨가하여 조제되었다. 실험실용 분무건조기(LaPlant SD-05, UK)를 사용하였다. MBL 용액은 3.5 mL/min의 속도로 페리스탈틱 펌프를 이용해 노즐(0.5 mm 직경)로 공급하였고, 분무 공기의 압력은 1600 L/hour로 사용하였다. 건조관으로 제공한 열풍의 압력은 1150 L/min, 온도는 100℃로 유지하였고 배기 온도는 69℃로 유지되었다.
상기 방법에 의하여 백색의 미세한 MBL 분말이 제조되었고, 제조된 MBL 분말은 아래에 기술한 방법으로 특성을 확인하였다.
<실시예 1-1> MBL 분말의 미세입자 크기 및 분포
분말 형태로 제제화된 의약품이 효과적으로 기도나 폐로 흡입되기 위해서는 aerosol 형태로 흡입되어야 하며, 이때 요구되는 미세 분말의 크기는 5 ㎛ 정도나 그 이하가 적당한 것으로 알려져 있다. 레이저 제타 전위측정기(OTSUKA Electronics, ELS-8000, Japan)를 이용하여 분무 건조된 MBL 분말의 크기와 분포를 관찰하였다(도 1).
도 1에서 보듯이, 상기 방법에 의하여 제조된 MBL 분말은 2.18 내지 3.18㎛의 크기로 분포하고 있었으며, 평균 크기는 2.57 ± 0.24㎛ 임이 관찰되었다. 따라서 분무 건조 방법으로 효과적으로 기도나 폐로 흡입 가능한 크기의 MBL 분말을 만들 수 있음을 확인하였다.
<실시예 1-2> 웨스턴 블롯 분석
MBL 구조상의 특징인 복합체 형성의 정도와 분포가 열풍에 의해 분무 건조되는 과정에서도 변함없이 유지되는지를 알아보았다. MBL 분말을 적당한 양의 물에 녹인 후 비변성 조건에서 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 분무건조 전의 시료와 차이점을 관찰하였다(도 2).
도 2는 분무건조 전, 후의 MBL이 형태적으로 같게 유지되는지를 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 결과를 나타내는 사진이다. 상기 도에서 M은 분자량 표지를 나타내고, 1은 분무건조 전의 MBL 용액, 그리고 2는 MBL의 분무건조 분말을 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 분무 건조 과정 전, 후에 구조적으로 뚜렷한 형태의 변화는 관찰되지 않았다. 그러므로 분무건조법을 이용하여, MBL의 구조적 변화가 없이 MBL 분 말 제제화가 가능함이 확인되었다.
<실시예 1-3> 보체계에서의 C4 활성화 시험
분무건조법으로 제조된 MBL 분말이 녹았을 때 MBL 결합형 당화 단백질 및 세린 프로테아제의 존재 하에 보체를 활성화하는 효과가 유지되는지를 하기와 같은 방법으로 알아보았다: 먼저, 면역반응용 플레이트(MaxiSorpTM Immunoplate, Nunc, Denmark)를 웰 당 500 ng의 프리에스로 코팅하고, 여기에 분무 건조전 MBL(대조군)과 분무 건조된 MBL 분말을 물에 용해시킨 다음 각각 웰당 200 ng, 100 ng, 50 ng, 25 ng, 12.5 ng, 6.25 ng 및 3.125 ng을 첨가하여 상온에서 2시간 동안 결합시켰다. MBL 결합형 세린 프로테아제(MBL-associated serine protease, MASP) 공급원으로 무-MBL 혈청(MBL-free serum, Dobeel, Korea)을 희석 완충액에 1:100으로 희석하여 웰당 100㎕씩 넣어 반응시켰다. 세척 완충액으로 6회 세척한 다음, C4 500 ng을 첨가하고, 상온에서 2시간 반응시켰다. 항-C4 항체-HRP(Biogenesis, UK)를 1:1500으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후에 OPD 용액 150 ㎕를 첨가하여 20분 동안 발색시켜 C4b 침전물(deposit)을 측정하였다. 50 ㎕의 3 M HCl을 가한 후, 492 nm에서 ELISA 측정기로 OD값을 측정하였다(도 3).
도 3은 본 발명의 분무건조 MBL 조성물과 대조군의 C4 활성화 정도를 비교한 그래프이다. 이때, 개방환(-○-)은 본 발명의 분무건조 MBL 조성물의 C4 활성화 정도를 나타내며, 폐쇄환(-●-)은 대조군의 C4 활성화 정도를 나타낸다.
분무 건조전의 MBL과 분무 건조 후의 MBL은 비슷한 정도로 C4 활성화를 유도하였다. 따라서, 분무건조 방법을 사용하여 제조된 분말형태의 MBL 조성물은 호흡기 감염이나 외상에 적용하기 위한 활성을 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 실시예 1에서 기술한 바와 같이, 일반적인 분무 건조 방법으로 만들어진 MBL 분말은 1) 흡입 가능한 크기로 만들어졌고, 2) MBL 구조상의 특징인 복합체 형성의 정도와 분포가 유지되었으며, 3) 보체를 활성화하는 효과가 유지되어 있음을 알 수 있었다. 그러므로 MBL은 분무 건조기를 이용해 분말 형태로 제제화가 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 위의 분석 방법을 이용해 다양한 조건에서 만들어진 MBL 분말을 비교분석하였다.
<실시예 2> 분무 건조시 열풍의 온도가 MBL 분말의 활성에 미치는 영향
대부분의 단백질은 열에 의해 변성되기 쉽고, 변성된 단백질은 생물학적 활성을 잃게 된다. 분무건조기는 열풍을 사용해 액체시료를 분말화 하기 때문에 본 발명에서는 여러 온도 조건에서 만들어진 MBL 분말이 MBL 결합형 당화 단백질 및 세린 프로테아제의 존재 하에 보체를 활성화하는 정도를 비교분석하였다.
분무건조를 위해 사용한 MBL 용액은 5㎍/mL 재조합 MBL, 150mM NaCl, 10mM CaCl2, 250 ㎍/mL 카세인, 2%(w/v) 수크로스(sucrose)의 조성으로 조제되었다. 분무 건조에 적용된 흡입/배기 온도는 각각 80℃/58℃, 100℃/68℃, 115℃/78℃, 130℃/87℃, 150℃/100℃로 설정되었다.
각각의 온도 조건에서 만들어진 MBL 분말 조성물을 적당량의 물에 녹여 상기 실시예 1-3에 기재된 방법으로 보체계에서의 C4 활성화 정도를 측정하여 분무 건조전의 MBL(대조군) 용액과 비교하였다(도 4a 내지 4e).
도 4a 내지 4e는 온도 조건을 달리하여 제조한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물의 C4 활성화 정도를 분무건조 전의 MBL 용액과 비교한 그래프이다. 이때, 각각의 흡입/배기 온도는 80℃/58℃(도 4a), 100℃/68℃(도 4b), 115℃/78℃(도 4c), 130℃/87℃(도 4d) 및 150℃/100℃(도 4e)이며, 개방환(-○-)은 본 발명의 분무건조 MBL 조성물을 나타내고, 폐쇄환(-●-)은 대조군을 나타낸다.
도 4a 내지 4e에서 보듯이, 80℃/58℃와 100℃/68℃의 온도 조건에서 분무건조된 MBL은 대조군 MBL 용액과 비슷한 정도의 활성을 갖지만, 그 이상의 온도 조건에서 생산된 MBL 분말 조성물의 활성은 온도와 반비례하게 낮아지는 것을 확인하였다. 그러므로, 보다 높은 활성을 갖는 MBL 분말 조성물을 만들기 위해서는 100℃/68℃ 이하의 온도 조건에서 분무 건조 하는 것이 효과적임을 알 수 있었다.
<실시예 3> MBL 분말 제조시 안정화를 위해 첨가제로 사용되는 당의 종류에 따른 MBL 분말의 특성
일반적으로 단백질의 분무건조시 열풍에 의해 분말화되는 단백질의 물리적, 생물학적 안정성을 위해 여러 종류의 당을 이용한다. 본 발명에서는 분무건조 과정에서 MBL의 안정화를 위한 첨가제로 사용하고자 하는 당의 종류(수크로스, 락토오스, 트레할로스, 풀루란 등)에 따른 MBL 분말의 보체계 활성화 정도, 미세 입자의 크기 및 분포, 분말의 모양을 알아보았다. 분무 건조를 위해 사용한 MBL 용액은 재조합 MBL 5 ㎍/mL, NaCl 150 mM, CaCl2 10 mM에 250 ㎍/mL 카세인을 첨가한 것을 기본 조성으로 하고, 여기에 각각 수크로스 0.4%, 락토오스 0.5%, 트레할로스 0.4% 또는 풀루란 0.4%을 포함하도록 조제하여 분무건조하였다.
<실시예 3-1> 보체계에서의 C4 활성화 시험
서로 다른 종류의 당을 첨가제로 사용해 조제한 MBL 용액을 분무 건조한 후 각각의 MBL 분말이 갖는 활성을 상기 실시예 1-3에 기재된 방법으로 측정하여, 분무건조전 MBL 용액(대조군)과 비교하였다(도 5a 내지 5d). 도 5a 내지 5d는 첨가제로 사용하는 당의 종류를 달리하여 제조한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물의 C4 활성화 정도를 분무건조 전의 MBL 용액과 비교한 그래프이다. 이때, 도 5a는 0.4% 수크로스, 도 5b는 0.5% 락토오스, 도 5c는 0.4% 트레할로스 및 도 5d는 0.4% 풀루란을 이용하여 제제화한 조성물을 나타내며, 개방환(-○-)은 본 발명의 분무건조 MBL 조성물을 의미하고, 폐쇄환(-●-)은 대조군을 의미한다.
도 5a 내지 5d에서 보듯이, 분무 건조된 MBL의 활성은 0.4% 수크로스(도 5a) 와 0.5% 락토오스(도 5b)를 이용해 제제화한 경우 대조군과 거의 유사하게 남아있었고, 0.4% 트레할로스(도 5C)와 0.4% 풀루란(도 5d)을 이용하여 제제화한 경우 활성이 많이 사라졌음을 확인하였다. 그러므로, 분무건조시 MBL의 안정성을 위해 사용하는 당 첨가제는 수크로스와 락토오스가 보다 효과적임을 확인하였다.
<실시예 3-2> MBL 분말의 미세입자 크기 및 분포
레이저 제타 전위측정기(OTSUKA Electronics, ELS-8000, Japan)를 이용하여 분무건조된 MBL 분말의 크기와 분포를 관찰하였다(도 6 및 표 1).
도 6은 첨가제로 사용하는 당의 종류를 달리하여 제조한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물의 크기 분포를 확인한 그래프이다. 이때, 폐쇄환(-●-)은 0.4% 수크로스, 개방환(-○-)은 0.5% 락토오스, 폐쇄삼각형(-▲-)은 0.4% 트레할로스를 이용하여 제제화한 분무건조 MBL 분말을 의미하고, 개방삼각형(-△-)은 0.4% 풀루란을 이용하여 제제화환 분무건조 MBL 분말을 의미한다.
도 6 및 표 1에서 보듯이, 전체적인 MBL 분말의 평균 크기는 1.04 내지 4.00 ㎛로 나타났으며, 수크로스, 락토오스 또는 트레할로스를 첨가제로 넣어준 경우, 분말입자의 크기분포가 고르게 생산되었음을 확인하였다. 그러나 풀루란을 첨가제로 넣어준 경우는 크기 분포가 0.39 내지 15.43 ㎛로 고르지 않았다. 그러므로, 흡입효과가 좋을 것으로 기대되는 MBL 분말을 제조하기 위해서는, MBL 용액에 수크로스, 락토오스 또는 트레할로스를 첨가제로 사용하는 것이 풀루란을 첨가제로 사용하는 것보다 효과적이라는 것을 알 수 있었다.
당의 종류에 따라 제형화된 분무건조 MBL 분말입자의 크기분포
당의 종류 최소값(㎛) 최대값(㎛) 평균값 ± 표준편차(㎛)
수크로스 2.18 3.18 2.57 ± 0.24
락토오스 0.85 6.16 3.32 ± 1.17
트레할로스 0.23 3.32 1.04 ± 0.37
풀루란 0.39 15.43 4.00 ± 5.43
<실시예 3-3> MBL 분말의 모양
MBL 분말의 모양을 주사 전자 현미경(Scanning electron microscope, SEM)으로 관찰하였다(도 7a 내지 7d).
도 7a 내지 7d는 첨가제로 사용하는 당의 종류를 달리하여 제조한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물 분말에 대한 전자현미경 사진이다. 이때, 도 7a는 0.4% 수크로스, 7b는 0.5% 락토오스, 7c는 0.4% 트레할로스를 이용하여 제제화한 분무건조 MBL 조성물 분말을 나타내고, 도 7d는 0.4% 풀루란을 이용하여 제제화한 분무건조 MBL 조성물 분말을 나타낸다.
도 7a 내지 7d에서 보듯이, 분무건조시 MBL의 안정성을 유지하기 위해 MBL 용액에 첨가제로 사용한 당의 종류에 따라, 서로 다른 모양으로 MBL 분말이 만들어진 것을 관찰할 수 있었고, 레이저 제타 전위 측정기를 이용해 측정한 MBL 미세 분말입자의 크기분포와 전자 현미경으로 관찰된 크기분포가 대략적으로 일치함을 확인할 수 있었다.
상기 세 가지 분석결과로부터 흡입에 적당한 크기를 갖으며 보체계의 C4활성이 보다 좋은 MBL 분말 조성물을 제조기 위해서는 MBL 용액에 수크로스나 락토오스를 첨가제로 사용하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 4> 당의 함량 변화에 따른 MBL 분말의 특성 분석
분무건조되는 단백질의 안정성을 높이기 위하여 당을 첨가제로 사용할 때, 사용하는 당의 종류와 그 농도에 따라 다른 결과를 보인다. 본 발명에서는 MBL의 분무 건조에 적당한 당의 농도를 각 당의 종류별로 알아보았다. 여기에서는 MBL 용액에 락토오스와 수크로스를 첨가제로 사용해 분무 건조할 때, 생산된 MBL 분말의 보체계의 C4 활성화 정도, 미세 분말입자의 크기 및 분포, 분말의 모양이 첨가제로 사용한 당의 농도에 따라 어떤 영향을 받는지를 설명하고자 하였다. 분무건조를 위해 사용한 MBL 용액은 조합 MBL 5 ㎍/mL, NaCl 150 mM), CaCl2 10 mM에 250 ㎍/mL 카세인을 첨가한 것을 기본 조성으로 하고, 여기에 락토오스를 첨가제로 사용한 경우엔 각각 0.5%, 1%, 2% 및 4%가 되도록 조제하고, 수크로스를 첨가제로 사용한 경우엔 0.5%, 1%, 2%, 4% 및 8%가 되도록 조제해 분무건조하였다.
<실시예 4-1> 보체계에서의 C4 활성화 시험
당을 첨가제로 첨가하여 생산한 MBL 분말이 MBL 결합형 당화 단백질 및 세린 프로테아제의 존재하에 보체를 활성화하는 효과를 상기 실시예 1-3에 기재된 방법으로 측정하여, 같은 조성의 분무 건조 전 MBL 용액(대조군)과 비교하였다(도 8a 내지 8d 및 도 9a 내지 9e).
도 8a 내지 8d는 첨가제로 사용하는 락토오스의 농도를 달리하여 제조한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물의 C4 활성화 정도를 분무건조 전의 MBL 용액과 비교한 그래프이다. 이때, 도 8a는 락토오스 농도 0.5%, 도 8b는 1%, 도 8c는 2% 및 도 8d는 4%가 함유된 현탁액을 의미하며, 개방환(-○-)은 본 발명의 분무건조 MBL 조성물을 의미하고 폐쇄환(-●-)은 대조군을 의미한다.
도 8a 내지 8d에서 보듯이, 분무건조된 MBL의 활성은 락토오스 농도를 0.5% 내지 4%로 변화한 경우 모두 대조군과 거의 유사하게 남아있었다. 특히 1% 락토오스의 경우(도 8b) MBL 활성이 비교적 높게 유지되었고, 0.5% 락토오스의 경우 대조군과 비교해 약간의 차이를 보였다. 이 결과로부터 분무건조법으로 제조된 MBL의 활성을 유지하기 위해서는 MBL 용액의 락토오스 농도가 1 내지 2%가 되도록 조제하는 것이 바람직함을 확인하였다.
도 9a 내지 9e는 첨가제로 사용하는 수크로스의 농도를 달리하여 제조한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물의 C4 활성화 정도를 분무건조 전의 MBL 용액과 비교한 그래프이다. 이때, 도 9a는 수크로스 농도 0.5%, 도 9b는 1%, 도 9c는 2%, 도 9d는 4% 및 도 9e는 8%가 함유된 현탁액을 의미하며, 개방환(-○-)은 본 발명의 분무건조 MBL 조성물을 의미하고 폐쇄환(-●-)은 대조군을 의미한다.
도 9a 내지 9e에서 보듯이, 분무건조된 MBL의 활성은 수크로스 농도를 0.5% 내지 8%로 변화한 경우 모두 대조군과 거의 유사하게 남아있었다. 특히, 수크로스의 경우 MBL 활성이 1%(도 9b) 및 2%(도 9c)에서는 비교적 높게 유지되었으나, 8%(도 9e) 수크로스 경우 대조군과 비교해 차이를 보였다. 이 결과로부터 MBL 용액의 수크로스 농도가 1 내지 2%가 되도록 조제하는 것이 분무 건조된 MBL의 활성을 유지하는데 바람직함을 확인하였다.
<실시예 4-2> MBL 분말의 미세입자 크기 및 분포 분석
레이저 회절 분석기(Mastersizer Micro, Malvern Instruments, Malvern U.K.)를 이용해 당 농도를 변화하여 분무 건조된 MBL 분말의 크기와 분포를 관찰하였다(도 10, 도 11, 표 2 및 표 3).
도 10은 첨가제로 사용하는 락토오스의 농도를 달리하여 제조한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물 분말의 크기분포를 확인한 그래프이다. 이때, 폐쇄환(-●-)은 락토오스 농도 0.5%, 개방환(-○-)은 1.0%, 폐쇄삼각형(-▲-)은 2.0% 및 개방삼각형(-△-)은 4.0%를 각각 이용하여 제제화한 분무건조 MBL 분말 조성물을 의미한다.
당의 함량의 변화에 따른 분무건조 MBL 분말입자의 크기분포
당의 함량 DV0.1(㎛) DV0.9(㎛) 평균값 ± 표준편차(㎛)
0.5% 락토오스 2.01 4.90 3.22 ± 1.17
1.0% 락토오스 2.37 7.56 4.67 ± 2.06
2.0% 락토오스 2.64 13.39 7.36 ± 4.31
4.0% 락토오스 2.82 15.51 8.32 ± 5.35
상기 표에서, DV0.1은 누적부피 10%에서의 입자의 직경을 나타내고, DV0.9는 누적부피 90%에서의 입자의 직경을 나타낸다.
도 10 및 표2에서 보듯이, 전체적인 MBL 분말의 평균 크기는 3.22 내지 8.32㎛로 나타났다. 분무 건조된 분말의 크기는 MBL 안정화를 목적으로 첨가된 락토오스의 농도가 높아짐에 따라 커지는 경향을 뚜렷하게 보여 락토오스를 2%이상의 농도로 첨가하면 5 ㎛ 이상의 미세분말 분포가 증가하는 것을 알 수 있었다. 분무 건조된 분말이 에어로졸(aersol)의 형태로 기도나 폐에 효과적으로 흡입되기 위해서는 미세 분말의 크기가 5㎛ 이하로 제제화 될 때 효과적인 것으로 알려져 있다. 그러므로 MBL 용액에 락토오스를 당 첨가제로 사용할 경우 2% 이하의 농도로 첨가할 때 효과적으로 흡입할 수 있는 크기의 MBL 분말을 만들 수 있다는 것을 확인하였다.
도 11은 첨가제로 사용하는 수크로스의 농도를 달리하여 제조한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물 분말의 크기분포를 확인한 그래프이다. 이때, 폐쇄환(-●-)은 수크로스 농도 0.5%, 개방환(-○-)은 1.0%, 폐쇄삼각형(-▲-)은 2.0%, 개방삼각형(-△-)은 4.0% 및 폐쇄역삼각형(-▼-)은 8.0%를 각각 이용하여 제제화한 분무건조 MBL 분말 조성물을 의미한다.
수크로스 함량의 변화에 따른 분무건조 MBL 분말입자의 크기분포
당의 함량 DV0.1(㎛) DV0.9(㎛) 평균값 ± 표준편차(㎛)
0.5% 수크로스 2.28 5.32 3.52 ± 1.22
1.0% 수크로스 2.68 9.59 5.83 ± 2.71
2.0% 수크로스 2.38 7.49 4.64 ± 2.03
4.0% 수크로스 2.94 12.21 7.07 ± 3.61
8.0% 수크로스 2.52 9.98 5.85 ± 2.94
상기 표에서, DV0.1은 누적부피 10%에서의 입자의 직경을 나타내고, DV0.9는 누적부피 90%에서의 입자의 직경을 나타낸다.
도 11 및 표3에서 보듯이, 전체적인 MBL 분말의 평균 크기는 3.52 내지 7.07 ㎛로 나타났다. 분무 건조된 분말의 크기는 MBL 안정화를 목적으로 첨가된 수크로스 농도와는 뚜렷한 연관성을 보이지는 않았으나 수크로스를 4% 이상의 농도로 MBL 용액에 첨가되면 5㎛ 이상의 미세분말 분포가 증가하는 것을 알 수 있었다. 분무 건조된 분말이 에어로졸(aersol)의 형태로 기도나 폐에 효과적으로 흡입되기 위해서는 미세 분말의 크기가 5㎛ 이하로 제제화 될 때 효과적인 것으로 알려져 있다. 그러므로 MBL 용액에 수크로스를 당첨가제로 사용할 경우 4% 이하의 농도로 첨가할 때 효과적으로 흡입할 수 있는 크기의 MBL 분말을 만들 수 있다는 것을 확인하였다.
<실시예 4-3> MBL 분말의 모양 분석
서로 다른 농도의 락토오스와 수크로스를 첨가제로 넣어준 MBL용액을 이용해 생산한 MBL 분말의 모양을 주사전자현미경(Scanning electron microscope, SEM, JSM-5400, JEOL, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다(도 12a 내지 12d 및 도 13a 내지 13e).
도 12a 내지 12d는 첨가제로 사용하는 락토오스의 농도를 달리하여 제조한 본 발명의 MBL 조성물 분말에 대한 전자현미경 사진이다. 이때, 도 12a는 락토오스 농도 0.5%, 도 12b는 1.0%, 도 12c는 2.0% 및 도 12d는 4.0%를 각각 이용하여 제제화한 분무건조 MBL 조성물 분말을 나타낸다.
도 13a 내지 13e는 첨가제로 사용하는 수크로스의 농도를 달리하여 제조한 본 발명의 MBL 조성물 분말에 대한 전자현미경 사진이다. 이때, 도 13a는 수크로스 농도 0.5%, 도 13b는 1.0%, 도 13c는 2.0%, 도 13d는 4.0% 및 도 13e는 8.0%를 각각 이용하여 제제화한 분무건조 MBL 조성물 분말을 나타낸다.
도 12a 내지 12d 및 도 13a 내지 13e에서 나타난 바와 같이, 생산된 MBL 분말의 모양은 당 첨가제의 농도가 높을수록 구의 형태에 가깝게 변화하는 것을 확인할 수 있었고, 각 분말의 크기 또한 당 첨가제의 농도에 비례해 커짐을 전자현미경 사진으로도 확인할 수 있었다.
상기의 세 가지 분석결과로부터, 흡입 효과와 보체계에서의 C4활성이 보다 좋은 MBL 분말을 만들기 위해서는 MBL 용액에 수크로스 또는 락토오스가 1 내지 2%의 농도로 첨가되는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 5> MBL 분말 제조시 활성유지를 위해 사용한 CaCl 2 첨가제의 농도에 따른 MBL 분말의 특성분석
MBL이 미생물 표면의 당화단백질과 결합하는 과정 및 이후 보체계를 활성화시키는 과정에서 CaCl2 존재가 필수적이다. 일반적으로 혈액내의 CaCl2농도는 MBL 활성에 요구되는 5 mM에서 10 mM 정도인 것으로 알려져 있으므로 MBL을 혈관에 주사하는 경우 CaCl2를 추가적으로 투여할 필요가 없다. 그러나 MBL 분말을 기도나 폐로 전달하는 경우, 흡입된 MBL 분말이 기도나 폐 점막의 체액에 녹아 활성을 가져야 하는데 이때 체액의 CaCl2 농도는 잘 알려져 있지 않다. 따라서 흡입된 MBL분말이 체액에 녹아 충분한 활성을 갖게 하기 위해 제제화시 CaCl2의 첨가를 고려할 필요가 있다.
본 발명에서는 분무 건조시 MBL의 안정성 및 분말의 생산 과정에 미치는 CaCl2의 영향을 알아보았다. 분무 건조를 위해 사용한 MBL 용액은 조합 MBL 5 ㎍/mL, NaCl 150 mM), CaCl2 10 mM, 수크로스 2%를 기본 조성으로 하고, 여기에 첨가제로 사용한 CaCl2의 농도를 각각 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200 mM가 되도록 조제하여 분무건조하였다.
CaCl2 농도를 100 mM 이상 첨가한 경우, 흡입 가능한 바람직한 형태의 MBL 분말이 만들어지지 않았다. 10 내지 50 mM 사이의 농도 범위에서 CaCl2를 첨가제로 사용할 경우 에어로졸의 형태로 흡입이 가능하며, MBL 결합형 당화 단백질 및 세린 프로테아제의 존재 하에 보체를 활성화하는 MBL 분말을 생산할 수 있었다. 그러나 10 내지 50mM 사이의 농도 범위에서는 CaCl2의 농도에 따른 유의성 있는 차이점이 발견되지는 않았다. 그러므로 CaCl2를 MBL의 분무 건조에 첨가제로 사용할 때는 50 mM 이하의 농도에서 사용하는 것이 더욱 바람직하다는 것을 확인하였다.
<실시예 6> 당과 함께 단백질을 첨가제로 사용하여 제조한 MBL 분말의 특성
일반적으로 단백질을 안정적으로 제제화할 때 다양한 종류의 단백질이 첨가되기도 한다. 본 발명에서는 분무건조 과정에서 MBL의 안정화를 위해 카세인(casein)을 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우(대조군)에 생산된 MBL 분말의 보체계 활성화 정도를 분석하였다(도 14a 내지 14d): 이때, MBL의 분무건조시 사용된 첨가제의 조성은 각각 2%의 수크로스 또는 락토오스로 하고, 여기에 250 ㎍/mL의 카세인을 첨가하거나 첨가하지 않고 MBL 분말을 제조하였다.
도 14a 내지 14d는 MBL 용액에 카세인(casein)을 첨가하거나 첨가하지 않은 조건에서 제조한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물 분말의 C4 활성화 정도를 분무건조 전의 MBL 용액과 비교한 그래프이다. 이때, 도 14a는 카세인이 함유된 2% 수크로스를 이용한 경우를 나타내고, 도 14b는 카세인이 함유되지 않은 2% 수크로스를 이용한 경우를 나타내며, 도 14c는 카세인이 함유된 2% 락토오스를 이용한 경우를 나타내고, 도 14d는 카세인이 함유되지 않은 2% 락토오스를 이용한 경우를 나타내며, 개방환(-○-)은 본 발명의 분무건조 MBL 조성물을 나타내고, 폐쇄환(-●-)은 분무건조 전의 MBL 용액인 대조군을 의미한다.
도 14a 내지 14d에서 보듯이, 당과 함께 카세인을 첨가하여 만든 MBL 분말의 C4 활성화 정도는 카세인을 첨가하지 않고 제조된 MBL 분말의 경우보다 활성이 잘 유지되는 것을 확인할 수 있었고, 특히 락토오스를 당 첨가제로 사용할 때는 카세인의 사용이 보다 효과적이라는 것을 알 수 있었다.
아울러, 카세인의 농도에 따른 MBL 분말의 특성을 알아보기 위하여, 여러 농도의 카세인을 첨가하여 MBL 용액을 분무건조하였고, 제조된 MBL 분말의 보체계 활성화 정도, 미세 입자의 크기 및 분포, 분말의 모양을 상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라 비교, 분석하였다: 이때, 분무건조를 위해 사용한 MBL 용액은 조합 MBL 5 ㎍/mL, NaCl 150 mM, CaCl2 10 mM, 수크로스0.8%를 기본 조성으로 하고, 여기에 카세인을 각각 0㎍/mL, 50 ㎍/mL, 200 ㎍/mL, 500 ㎍/mL, 1 mg/mL 또는 2 mg/mL의 농도로 첨가하여 분무건조하였다. 보체계의 C4 활성화 정도는 카세인을 첨가하여 제조한 MBL 분말이 카제인을 첨가하지 않고 제조한 MBL 분말에 비하여 농도에 관계없이 활성이 잘 유지됨을 확인할 수 있었고, 첨가된 카세인의 농도에 따른 활성의 변화는 관찰되지 않았다. 분무 건조된 MBL 분말의 크기 및 분포는 에어로졸의 형태로 흡입 가능한 2.1 내지 3.1 ㎛ 사이로 측정되었고, 카세인의 포함 여부 및 농도의 차이에 따른 차이는 보이지 않았다. 그러므로, MBL 용액을 분무 건조할 때 낮은 농도의 카세인을 첨가하여 사용하는 것이 보다 바람직하다는 것을 확인하였다.
<실시예 7> MBL 분말 제조시 첨가제로 생분해성 고분자의 사용
약물전달계에서 많이 사용하고 있는 생분해성 고분자 물질도 MBL의 분무 건조시 첨가제로 사용 가능한지를 알아보았다. 앞서 언급되었던 2% 수크로스, 250 ㎍/mL의 카세인과 함께 물에 잘 녹은 생분해성 고분자 물질의 일종인 폴리비닐 알콜(polyvvinyl alcohol, PVA)을 각각 0.05, 0.1, 0.2, 0.3 또는 0.4% 농도로 재조합 MBL 용액에 넣고 분무건조를 실시하였다. 제조된 MBL 분말의 C4 활성화 정도는 0.4% 미만의 PVA 농도에서 용액상태의 MBL과 거의 유사하게 보존되었고, 0.4% PVA 첨가시엔 용액상태의 MBL 보다 낮아지는 것을 확인했다. 위의 결과에서 생분해성 고분자 물질중 하나인 PVA도 0.2% 이하의 농도에서 MBL의 분무건조시 첨가제로 사용 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 1> MBL 분말의 장기 보관시 안정성 분석
제조된 MBL 분말의 장기 보존시 MBL의 생물학적 활성이 유지되는지를 알아보기 위해 가혹 온도 조건에서의 보존 안정성을 확인해 보았다. 1년간의 상온 보존에 상응하는 조건으로 알려진 70℃에서 2일, 60℃에서 4일간 MBL 분말을 보관한 뒤, MBL 결합형 당화 단백질 및 세린 프로테아제의 존재하에 C4 보체의 활성화 정도를 비교하였다(도 15a 내지 15d). MBL 5 ㎍/mL, NaCl 150 mM, CaCl2 10 mM를 기본 조성으로 하고 락토오스(2 %)를 첨가하거나 위의 기본 조성에 수크로스(2 %) 및 PVA(0.05%)를 첨가하였고, 이를 각각의 분무건조 MBL 조성물로 제작하여 안정성 분석을 수행하였다.
도 15a 내지 15d는 가혹 온도조건에서 보관한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물의 C4 활성화 정도를 상온에 보관한 본 발명의 분무건조 MBL 조성물과 비교한 그래프이다. 이때, 도 15a는 70℃에서 2일간 보관된 2% 락토오스 함유 분무건조 MBL 조성물을 나타내고, 도 15b는 70℃에서 2일간 보관된 2% 수크로스 및 0.05% PVA 함유 분무건조 MBL 조성물을 나타내며, 도 15c는 60℃에서 4일간 보관된 2% 락토오스 함유 분무건조 MBL 조성물을 나타내고, 도 15d는 60℃에서 4일간 보관된 2% 수크로스 및 0.05% PVA 함유 분무건조 MBL 분말 조성물을 나타낸다.
도 15a 내지 15d에서 보듯이, 시험에 사용된 모든 MBL 분말 조성물에서 C4 활성이 그대로 유지되고 있음을 확인할 수 있었다. 상온에서 실험한 경우 1년 동안 안정성이 100% 유지되었다.
따라서 본 발명에서 제안한 제조방법은 MBL 활성에 영향이 없이 분말형태로 제조할 수 있으며, 제조된 MBL 분말은 장기간 활성이 유지됨을 확인하였다.
<실험예 2> MBL 분말과 미생물의 결합력 분석
미생물의 표면에 발현되는 당화 단백질의 종류는 미생물 마다 다르기 때문에, MBL은 미생물의 종류에 따라 서로 다른 결합력을 갖는다. 용액상태의 MBL과 분무건조 방법에 의하여 제조된 MBL 분말 조성물의 미생물에 대한 결합 경향을 비교해 보았다(도 16a 및 16b): 이때, 시험에 사용된 MBL 분말은 MBL 5 ㎍/mL, NaCl 150 mM, CaCl2 10 mM를 기본 조성으로 하고, 여기에 2 % 락토오스 또는 2% 중량부 수크로스 및 0.5 % PVA가 되도록 첨가제를 넣어준 MBL 용액을 제조하였다.
먼저, 면역반응용 플레이트(MaxiSorpTM Immunoplate, Nunc, Denmark)에 웰당 1× 107, 1× 105, 1× 103, 1× 101의 미생물을 각각 코팅하고, 여기에 분무 건조전 MBL 또는 분무 건조된 MBL 분말을 물에 녹인 후 이들을 각각 5 ㎍/mL의 농도로 웰당 100 ㎕씩 첨가하여 상온에서 2시간 동안 결합시켰다. 반응액을 제거한 후, 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 희석 완충액에 항-MBL 항체(Dobeel, Korea)를 1:10,000 로 희석해 웰당 100㎕씩 첨가하여 상온에서 1시간 동안 결합시켰다. 반응액을 제거한 후 세척 완충액으로 6회 세척하였고, 다시 항-마우스 항체-HRP(KPL, USA)를 희석 완충액에 1:10,000으로 희석하여 웰당 100 ㎕씩 넣어주고 상온에서 1시간 반응하였다. 세척 완충액으로 6회 세척한 다음, TMB 기질 용액(KPL, USA) 100 ㎕를 첨가하여 상온에서 30분 동안 발색시켰다. 50 ㎕의 3 N H2SO4을 가해 발색반응을 멈춘 후, 450 nm에서 ELISA 측정기로 OD값을 측정하였다(도 16a 및 16b).
도 16a는 분무건조 전의 용액상태의 MBL이 각종 미생물과 결합하는 정도를 측정한 그래프이고, 도 16b는 본 발명의 분무 건조 MBL 분말 조성물이 각종 미생물과 결합하는 정도를 측정한 그래프이다. 이때 각 그래프에서 a는 S. aureus ATCC29213, b는 S. aureus CCARM3197, c는 S. aureus CCARM3114, d는 S. epidermidis ATCC12228 e는 S. epidermidis CCARM35048, f는 S. pyogens ATCC8668, g는 H. influenza ATCC51907, h는 E. faecalis ATCC51907, i는 E. faecium CCARM5028 j는 K. pneumoniae ATCC10031 및 k는 C. albicans를 각각 나타내고, 도 13b에서 검은 막대는 2% 락토오스를 첨가제로 분무건조한 MBL 조성물을 나타내고, 회색 막대는 2% 수크로스 및 0.05% PVA를 첨가제로 분무건조한 MBL 조성물을 나타낸다.
도 16a 및 16b에서 보듯이, 분무건조 전의 MBL 용액은 S. aureus ATCC29213, S. aureus CCARM3197, H. influenza ATCC51907, C. albicans에는 강한 결합력을 보이며, S. aureus CCARM3114와 S. pyogens ATCC8668에는 약하게 결합했고, S. epidermidis ATCC1228, S. epidermidis CCARM35048, E. faecalis ATCC51907, E. faecium CCARM5028, K. pneumonia ATCC10031에는 거의 결합하지 않는 것으로 관찰되었다. 이러한 MBL의 결합경향은 두 종류의 첨가제로 생산한 MBL 분말에서도 비슷하게 나타났다. 결합정도에 있어서는 분무건조 전과 후, 그리고 첨가제의 종류에 따라 약간의 차이를 보이는데 이는 실험적 오차일 것으로 예측된다.
MBL을 기도나 폐 등 호흡기로 효과적으로 흡입하거나 외상에 적용하기 위해서는 MBL 용액을 분말 조성물의 형태로 제제화하는 것이 필요하다. 이때 만들어진 MBL 분말 조성물은 에어로졸 형태로 흡입 가능한 크기로 만들어져야 하고, MBL 구조상의 특징인 복합체 형성의 정도와 분포를 유지하여야 하며, MBL 결합형 당화 단백질 및 세린 프로테아제의 존재 하에 보체를 활성화하는 효과가 유지되어야 한다. 이상에서 입증한 바와 같이, 본 발명자들은 분무건조법을 이용하여, 위의 조건들을 충족시킬 수 있는 본 발명의 분무 건조 MBL 분말 조성물을 개발하였고, 분무 건조된 MBL 분말 조성물의 물리적 및 생물학적 특성이 MBL 용액의 조제시 사용되는 첨가제의 종류 및 농도에 의해 큰 영향을 받음을 확인하고, 활성이 안정적으로 유지되면서, 보다 효율적인 투여가 가능한 형태의 MBL 분말 조성물 제조방법을 개발하였다. 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 분무건조 MBL 분말 조성물은 바이러스, 세균, 진균류 등의 감염을 억제하는 효과가 있고 흡입에 적당한 형태로 제제화되었기 때문에, 이들 미생물에 의한 호흡기 감염이나 외상의 예방 및/또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있고, 본 발명의 분무건조 MBL 분말 조성물은 다른 부형제와 혼합되어 정제(tablet)형태의 제형을 제조하는데도 이용될 수 있다.
미생물 감염성 질환 치료 및 예방용 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체를 함유하는 분무건조 분말 조성물 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 분무건조 분말 조성물은 바이러스, 세균, 진균류 등의 감염을 억제하는 효과가 있고 흡입에 적당한 형태로 제제화되었기 때문에, 이들 미생물에 의한 호흡기 감염이나 외상의 예방 및/또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있고, 본 발명의 분무건조 분말 조성물은 다른 부형제와 혼합되어 정제(tablet)형태의 제형을 제조하는데도 이용될 수 있다.

Claims (24)

  1. 적어도 하나의 콜렉틴족 단백질 또는 그 유사체를 유효성분으로 포함하고 입자크기가 0.1 내지 10 ㎛로서 기도 또는 폐로의 흡입 또는 다른 표피세포의 감염 부위에 직접 전달하는데 적합한 미생물 감염성 질환 치료 및 예방용 분무건조 분말 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 입자크기는 3 내지 5 ㎛인 것을 특징으로 하는 분무건조 분말 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 분무건조 분말 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체는 당 또는 생분해성 고분자인 것을 특징으로 하는 분무건조 분말 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 당은 수크로스 또는 락토오스인 것을 특징으로 하는 분무건조 분말 조성물.
  6. 제 4항에 있어서, 생분해성 고분자는 폴리비닐 알콜인 것을 특징으로 하는 분무건조 분말 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 카세인(casein)을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 분무건조 분말 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 카세인은 0.1 내지 20 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 분무건조 분말 조성물.
  9. 0.001 내지 60 중량부 재조합 MBL, 0.1 내지 10 중량부 NaCl, 0.1 내지 10 중량부 CaCl2, 5 내지 80중량부의 당을 포함하는 분무건조 분말 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 조성물은 0.001 내지 0.1 중량부 재조합 MBL, 8 내지 9 중량부 NaCl 및 1 내지 2 중량부 CaCl2, 20 중량부 락토오스 또는 20 중량부 수크로스와 0.5 중량부 PVA를 포함하는 분무건조 분말 조성물.
  11. 제 1항 내지 제 9항에 있어서, 미생물은 바이러스, 세균 또는 진균류인 것을 특징으로 하는 분무건조 분말 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 바이러스는 독감 바이러스, HIV(human immunodeficiency virus), 헤르페스 바이러스, 사스 코로나 바이러스 및 리노바이러스를 포함하는 외막을 갖는 바이러스를 특징으로 하는 분무건조 분말 조성물.
  13. 제 11항에 있어서, 세균은 Staphylococcus aureus, Hemophilus influenzae 또는 S. pyogens을 포함하는 콜렉틴족 단백질이 인지할 수 있는 당 패턴을 갖는 세균인 것을 특징으로 하는 분무건조 분말 조성물.
  14. 제 11항에 있어서, 진균류는 Candida albicans을 포함하는 콜렉틴족 단백질이 인지할 수 있는 당 패턴을 갖는 진균인 것을 특징으로 하는 분무건조 분말 조성물.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 콜렉틴족 단백질은 만노스 결합형 렉틴, SP-A(surfactant protein-A), SP-D(surfactant protein D), CL-L1(collectin-liver 1), CL-P1(collectin-placenta 1) 및 CL-43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분무건조 분말 조성물.
  16. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 콜렉틴족 단백질은 만노스 결합형 렉틴인 것을 특징으로 하는 분무건조 분말 조성물.
  17. (ⅰ) 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체 및 당이 포함된 수용액을 제조하는 단계;
    (ⅱ) 분무건조기를 이용하여 분무 공기 압력 500 내지 2,000 L/h, 공급 열풍의 압력 400 내지 1,200 L/min, 열풍온도 50 내지 220 ℃ 및 배기온도 42 내지 150 ℃의 조건으로 상기 단계 (ⅰ)에서 제조된 수용액을 분무하는 단계; 및,
    (ⅲ) 단계 (ii)에 의하여 생성된 분말을 수득하는 단계를 포함하는 호흡기로의 흡입 또는 다른 표피세포의 감염 부위에 직접 전달에 적합한 분무건조 분말 조성물의 제조방법.
  18. 제 17항에 있어서, 단계 (ⅰ)에서 수용액은 콜렉틴족 단백질 또는 그의 유사체가 0.0005 내지 10%(w/v) 함유되고, 당이 0.1 내지 4%(w/v) 함유되는 것을 특징으로 하는 호흡기로의 흡입 또는 다른 표피세포의 감염 부위에 직접 전달에 적합한 분무건조 분말 조성물의 제조방법.
  19. 제 17항 또는 제 18항에 있어서, 당은 수크로스 또는 락토오스인 것을 특징으로 하는 호흡기로의 흡입 또는 다른 표피세포의 감염 부위에 직접 전달에 적합한 분무건조 분말 조성물의 제조방법.
  20. 제 17항에 있어서, 단계 (ⅰ)에서 수용액은 약제학적으로 허용되는 담체가 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 호흡기로의 흡입 또는 다른 표피세포의 감염 부위에 직접 전달하는데 적합한 분무건조 분말 조성물의 제조방법.
  21. 제 17항에 있어서, 단계 (ⅰ)에서 수용액은 카세인을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 호흡기로의 흡입 또는 다른 표피세포 감염 부위에 직접 전달에 적합한 분무건조 분말 조성물의 제조방법.
  22. 제 17항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 콜렉틴족 단백질은 만노스 결합형 렉틴, SP-A(surfactant protein-A), SP-D(surfactant protein D), CL-L1(collectin-liver 1), CL-P1(collectin-placenta 1) 및 CL-43으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분무건조 분말 조성물.
  23. 제 17항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 콜렉틴족 단백질은 만노스 결합형 렉틴인 것을 특징으로 하는 분무건조 분말 조성물.
  24. 제 17항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 입자 크기는 0.1에서 10 ㎛인 것을 특징으로 하는 분무건조 분말 조성물.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008266179A (ja) * 2007-04-19 2008-11-06 Fujifilm Corp 経肺用組成物
PL2328601T3 (pl) 2008-08-15 2020-07-13 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Formulacje zawierające linaklotyd do podawania doustnego
EP2331077A2 (en) * 2008-09-04 2011-06-15 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Stable forlulation comprising therapeutic polypeptides for oral administration
JP5365158B2 (ja) * 2008-11-25 2013-12-11 住友化学株式会社 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法
WO2011017502A2 (en) 2009-08-06 2011-02-10 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Linaclotide-containing formulations for oral administration
UA108636C2 (xx) 2010-02-17 2015-05-25 Пептид
SI2603232T1 (sl) 2010-08-11 2020-03-31 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Stabilne formulacije linaklotida
RU2013143149A (ru) * 2011-02-24 2015-03-27 Пэксвэкс, Инк. Составы, пригодные для вакцин, получаемых сушкой распылением
JP6312592B2 (ja) 2011-08-17 2018-04-18 アイアンウッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 消化器疾患の治療
AU2012340107B2 (en) 2011-11-18 2017-06-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Polymer protein microparticles
CN106163539A (zh) * 2014-01-28 2016-11-23 人口委员会股份有限公司 用于预防性传播感染的组合产品
GB201609940D0 (en) * 2016-06-07 2016-07-20 Novabiotics Ltd Microparticles
CA3094966A1 (en) * 2018-03-29 2019-10-03 Airway Therapeutics, Inc. Systems and methods for characterizing surfactant protein d (sp-d) oligomers
WO2023281523A1 (en) * 2021-07-09 2023-01-12 Indian Council Of Medical Research A pharmaceutical composition with a recombinant fragment of human surfactant protein-d for sars-cov-2 infection

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5855880A (en) * 1987-06-04 1999-01-05 Washington University Avirulent microbes and uses therefor
US5270199A (en) * 1987-08-20 1993-12-14 The Children's Medical Center Corporation Human mannose-binding protein
US5006343A (en) * 1988-12-29 1991-04-09 Benson Bradley J Pulmonary administration of pharmaceutically active substances
US5993805A (en) * 1991-04-10 1999-11-30 Quadrant Healthcare (Uk) Limited Spray-dried microparticles and their use as therapeutic vehicles
US5464649A (en) * 1992-10-30 1995-11-07 Hershey Foods Corporation Reduced fat confectionery products and process
DK0748213T3 (da) 1994-03-07 2004-08-02 Nektar Therapeutics Fremgangsmåder og sammensætninger til pulmonal indgivelse af insulin
DK0877602T3 (da) * 1996-01-24 2002-05-06 Byk Gulden Lomberg Chem Fab Fremgangsmåde til fremstilling af pulverformede lungesurfactant-præparater
US7049099B2 (en) * 1998-01-23 2006-05-23 Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. Recombinant human mannan-binding proteins and producing method of the same
EP0933029A1 (en) * 1998-02-03 1999-08-04 Xyrofin Oy Skimmed milk powder substitute
US5883084A (en) * 1998-06-08 1999-03-16 Clarion Pharmaceuticals Inc. Treatment of respiratory diseases utilizing α-tocopheryl-phosphocholine
US6429192B1 (en) * 1998-06-10 2002-08-06 Statens Serum Institut Purification process for production of mannan-binding lectin and an MBL medicinal product
US6447806B1 (en) * 1999-02-25 2002-09-10 Novartis Ag Pharmaceutical compositions comprised of stabilized peptide particles
ES2281341T3 (es) * 1999-05-14 2007-10-01 Steffen Thiel Lectina humana recombinante que se une a manano.
US6967023B1 (en) * 2000-01-10 2005-11-22 Foamix, Ltd. Pharmaceutical and cosmetic carrier or composition for topical application
US7871598B1 (en) * 2000-05-10 2011-01-18 Novartis Ag Stable metal ion-lipid powdered pharmaceutical compositions for drug delivery and methods of use
JP2004515467A (ja) * 2000-08-07 2004-05-27 ネクター セラピューティックス 吸入可能な、噴霧乾燥した、最少の凝集物を有する４−ヘリックスバンドルタンパク質粉末
IL154628A0 (en) 2000-09-01 2003-09-17 Lung surfactant compositions with dynamic swelling behaviour
CN1287856C (zh) * 2000-10-31 2006-12-06 德比奥药物股份有限公司 Epi－hne蛋白质干粉
JP4034530B2 (ja) * 2001-02-20 2008-01-16 日本ケミカルリサーチ株式会社 抗ｈｉｖ剤
WO2003035030A1 (en) * 2001-10-24 2003-05-01 Pari Gmbh Kit for the preparation of a pharmaceutical composition
US20030181356A1 (en) * 2002-03-11 2003-09-25 Edward Ingenito Compositions and methods for treating emphysema
CN1652813A (zh) * 2002-03-15 2005-08-10 纳蒂芒公司 包含甘露糖结合凝集素的药用组合物
IL164795A0 (en) * 2002-04-25 2005-12-18 Scripps Research Inst Treatment and prevention of pulmonary conditions
EP1581639A4 (en) * 2002-12-17 2006-03-08 Medimmune Vaccines Inc HIGH PRESSURE PULVISATION OF BIOACTIVE MATERIALS
CA2517396A1 (en) * 2003-02-28 2005-03-10 Antigenics Inc. Use of lectins to promote oligomerization of glycoproteins and antigenic molecules
US20050137126A1 (en) * 2003-04-09 2005-06-23 Natlmmune A/S Treatment of SARS in individuals
WO2004091436A2 (en) * 2003-04-15 2004-10-28 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating ocular disease
KR100755931B1 (ko) 2003-06-11 2007-09-06 (주)두비엘 고분자형 만노스 결합형 렉틴의 대량 생산방법 및 상기방법으로 제조된 만노스 결합형 렉틴 재조합 단백질의제제화
WO2005021037A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-10 Altana Pharma Ag Composition comprising a pulmonary surfactant and a pde2 inhibitor
EP1674085A1 (en) * 2004-12-22 2006-06-28 Universite Libre De Bruxelles Solid lipidic particles as pharmaceutically acceptable fillers or carriers for inhalation
US8337815B2 (en) * 2004-12-23 2012-12-25 Discovery Laboratories, Inc. Pulmonary surfactant formulations
US7550150B2 (en) * 2005-03-15 2009-06-23 Barros Research Institute Methods of treating or preventing a disease, disorder or condition associated with a viral infection
CN101193651A (zh) * 2005-04-11 2008-06-04 内蒂穆恩公司 甘露聚糖结合凝集素(mbl)在治疗与癌症相关的免疫削弱的病症中的用途
CA2628472C (en) * 2005-11-03 2015-01-27 Children's Hospital Medical Center Surfactant protein-d for prevention and treatment of lung infections and sepsis

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Publication number Publication date
EP1830810A1 (en) 2007-09-12
US8173599B2 (en) 2012-05-08
CN101094651A (zh) 2007-12-26
WO2006071102A1 (en) 2006-07-06
JP4744533B2 (ja) 2011-08-10
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