CN115379849A - 抗病毒肽的组合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了包括治疗有效量的抗病毒肽以及药学上可接受的载体的广谱抗病毒肽和组合物。抗病毒组合物显示出强大的广谱抗病毒效果，而不产生病毒抗性。抗病毒组合物可用于治疗由病毒感染引起的疾病，特别是呼吸系统病毒诸如包膜冠状病毒(SARS‑CoV‑2、SARS‑CoV和MERS‑CoV)、大流行性A(H1N1)pdm09病毒、禽流感A(H7N9)病毒和无包膜鼻病毒。

Description

抗病毒肽的组合物及其使用方法

本国际专利申请要求于2020年3月18日提交的美国临时专利申请号62/991,407的权益，出于所有目的其全部内容通过引用并入本文。

发明领域

本发明一般涉及广谱抗病毒肽和治疗抗病毒感染的方法。

发明背景

由于缺乏预先存在的免疫力，新型呼吸道病毒通常导致严重的呼吸道感染并迅速传播。近二十年来，三种高致病性冠状病毒已经跨越物种屏障并引起人类疾病，包括2003年与蝙蝠相关的严重急性呼吸系统综合征(SARS)冠状病毒(CoV)(SARS-CoV)^1,2、自2012年起的中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)^3,4和最近的2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)⁵。此外，2009年大流行性流感A(H1N1)pdm09病毒导致了21世纪的第一次流感大流行^6,7。由于缺乏有效的抗病毒药，尤其是针对冠状病毒，这些呼吸系统病毒与显著的发病率和死亡率有关。此外，这些新出现的呼吸系统病毒也引起了严重的经济和社会动荡。

COVID-19的爆发明确地说明了广谱抗病毒药的重要性。目前，没有针对这种新型病毒的特异性药物治疗。有效的广谱抗病毒剂将改善患者的结果，并且甚至在鉴定新出现的病毒和特异性抗病毒药物之前可能减少社区和医院的传播。抗病毒药物的“一病一药”方法对于HIV、丙型肝炎病毒和流感病毒是成功的⁹。然而，在鉴定新型病毒或获得特异性抗病毒药物之前，迫切需要广谱抗病毒药来对抗新出现和重新出现的新病毒爆发，诸如SARS-CoV-2。

发明概述

本发明的一个目的是提供广谱抗病毒剂。

本发明的另一个目的是提供广谱抗病毒剂的组合物。

本发明的又一个目的是提供在有需要的受试者中治疗病毒感染的方法。

提供了抗病毒剂、含有抗病毒剂的组合物及其使用方法。抗病毒剂包括P9R(SEQID NO:2)或衍生自P9R的P9R样肽，其特征在于它们“抑制内体酸化”和“肽-病毒结合”，诸如通过体外内体酸化和肽-病毒结合测定法所确定的。在优选的实施方案中，抗病毒剂是P9R。抗病毒组合物包括治疗有效量的抗病毒剂。

可以向有需要的受试者施用抗病毒组合物以治疗与病毒感染相关的症状。优选地，该受试者感染呼吸系统病毒，更优选地，该受试者感染需要内体酸化来进行病毒-宿主膜融合的pH依赖性病毒。实例包括但不限于包膜冠状病毒(SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV)、大流行性A(H1N1)pdm09病毒、禽流感A(H7N9)病毒和无包膜鼻病毒。

附图简述

图1A显示了肽序列(P9(SEQ ID NO:1)；P9R(SEQ ID NO:2)；PA1(SEQ ID NO:3)；和P9RS(SEQ ID NO:4))和通过InnovaGen的PepCalc分析的正电荷。图1B-1H显示了P9R抑制2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、MERS-CoV、SARS-CoV、H1N1病毒、H7N9病毒、鼻病毒和3型副流感病毒在细胞中的病毒复制。将病毒与不同浓度的P9R或P9预混合然后感染细胞。通过噬斑减少测定法评估抗病毒效率。通过将肽处理的病毒的噬斑数除以BSA处理的病毒的噬斑数计算感染(％)。图1I通过用P9R或BSA(50-100μg mL^-1)处理病毒时测量感染后24h上清液中的病毒RNA拷贝来显示P9R对病毒的有力抗病毒活性。图1J显示了P9R在MDCK、Vero E6和A549细胞中的细胞毒性。当P9R的IC₅₀与P9的IC₅₀比较时，*表示P<0.05，并且**表示P<0.01。通过双尾学生t检验计算P值。数据展示为至少三个独立实验的平均值±SD。

图2A显示了在通过肽处理的MDCK细胞中内体酸化的红色荧光的定量。从10个随机的显微镜场计算红色荧光强度。图2B显示了通过噬斑减少测定法测量25μg mL^-1的P9R、P9RS和PA1对SARS-CoV-2和A(H1N1)pdm09病毒的抗病毒活性。肽处理的病毒的噬斑数(％)归一化至BSA处理的病毒。图2C显示了P9R和PA1与SARS-CoV-2和A(H1N1)pdm09病毒的结合。通过ELISA和RT-qPCR检测病毒结合肽。当与P9R比较时**表示P<0.01。通过双尾学生t检验计算P值。

图3A显示了PA1可以减少P9R与SARS-CoV-2和A(H1N1)pdm09的结合。用PA1或BSA预处理病毒，随后通过RT-qPCR测量处理的病毒与指定的肽的结合。当与用BSA处理的病毒比较时**表示P<0.01。(c)P9R可以抑制病毒的RNP释放进入细胞核。用BSA、P9R或巴弗洛霉素A1(BA1)预处理H1N1病毒，随后用处理的病毒感染MDCK细胞。在感染后3.5h拍摄病毒NP(绿色)和细胞核(蓝色)的图像。图3B-3D包括显示P9R能够广泛与MERS-CoV、H7N9病毒和鼻病毒结合的数据。将与肽结合的病毒的相对RNA拷贝归一化至与P9R结合的病毒。当与P9R比较时*表示P<0.05，**表示P<0.01。通过双尾学生t检验计算P值。图3E显示了与病毒和病毒蛋白结合的肽。对于与SARS-CoV结合的肽(左侧小图)。将SARS-CoV与指定的肽在ELISA板上温育1小时。洗去未结合的病毒并通过RT-qPCR定量结合的SRAR-CoV。将相对RNA拷贝(％)归一化至与P9R结合的病毒的RNA拷贝。与H1N1 HA1蛋白结合的肽(中间小图)。与MERS-CoV S蛋白结合的肽(左侧小图)。在ELISA板上包被肽。通过ELISA测定法测量与肽结合的H1N1HA和MERS-CoV S蛋白。当与P9R比较时*表示P<0.05，**表示P<0.01。通过双尾学生t检验计算P值。

图4A显示了P9R(50μg/剂)对感染A(H1N1)病毒的小鼠的治疗效力与扎那米韦(zanamivir)(50μg/剂)相同。在感染后6h将PBS、扎那米韦、PA1、P9R或P9经鼻内接种于小鼠，并在接下来的一天内再向小鼠施用两剂。每组包括五只小鼠。图4B显示了对应于(图4A)的感染小鼠的体重变化。图4C显示了与P9相比，低剂量的P9R对A(H1N1)pdm09病毒感染的小鼠的作用。在感染后6h将PBS(n＝10)、P9-25(25.0μg/剂,n＝5)、P9-12.5(12.5μg/剂,n＝5)、P9R-25(25.0μg/剂,n＝10)和P9R-12.5(12.5μg/剂,n＝10)经鼻内接种于小鼠并在接下来的一天内再向小鼠施用两剂。图4D显示了对应于(图4C)的感染小鼠的体重变化。通过Gehan-Breslow-Wilcoxon检验计算P值。

图5A显示了扎那米韦和P9R的药物抗性测定法的规程。使A(H1N1)病毒在指定浓度的扎那米韦和P9R存在下进行传代。ND，未检测到，因为针对扎那米韦的高抗性H1N1病毒是在P16之前生成的。图5B显示了扎那米韦抑制亲本A(H1N1)病毒(P0)。扎那米韦对亲本H1N1的IC₅₀是35nM。图5C显示了在扎那米韦存在下扎那米韦对传代的A(H1N1)病毒的抗病毒效率。图5D显示了在P9R存在下P9R对传代的A(H1N1)病毒的抗病毒效率。传代的病毒与扎那米韦(nM)或P9R(μg mL^-1)预混合用于感染。在感染后24h收集上清液。通过RT-qPCR测定上清液中的病毒滴度。将相对复制(％)归一化至未处理的相应的传代病毒。数据展示为三个独立实验的平均值±SD。

发明详述

I.定义

如本文所用，“气雾剂”是指细雾状颗粒的任何制剂，其可以是溶液或悬浮液，无论其是否使用推进剂产生。

“乳浊液”是含有同质混合在一起的不混溶组分的组合物。

如本文所用，“亲水的”是指具有容易与水相互作用的强极性基团的物质。

如本文所用，“疏水的”是指缺乏对水的亲和力、倾向于排斥和不吸收水以及不溶解于水或与水混合的物质。

如本文所用，“亲脂的”是指具有对脂质的亲和力的化合物。

如本文所用，“胃肠外施用”意思是通过除了经由消化道或非侵入性局部或区域途径以外的任何方法施用。

如本文所用，待治疗的“患者”或“受试者”是指人或非人动物。

如本文所用，“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或与合理的收益/风险比相称的其他问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

如本文所用，“药学上可接受的盐”是指本文限定的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸性或碱性盐进行改性。

如本文所用，“治疗有效的”或“有效量”意思是使用的组合物的量是足以改善疾病或病症的一种或多种病因或症状的量。此类改善仅需要减少或改变，不必须要消除。如本文所用，术语“治疗有效量”、“治疗量”和“药学有效量”是同义词。本领域技术人员能够容易地确定合适的治疗量。

“受试者”或“患者”是指人、灵长类动物、非人灵长类动物、实验动物、牲畜动物、家畜或家养宠物。

II.组合物

本发明的组合物包括有力的抗病毒肽P9R(NGAICWGPCPTAFRQIGNCGRFRVRCCRIR；SEQ ID NO:2)，其衍生自鼠β-防御素-4和P9(NGAICWGPCPTAFRQIGNCGHFKVRCCKIR；SEQ IDNO:1)。机理研究显示，带正电荷的P9R通过与不同病毒结合然后抑制病毒-宿主内体酸化，以阻止pH依赖性病毒的内体释放，从而广泛抑制病毒复制。我们使用P9R(不仅与病毒结合，而且抑制内体酸化)、PA1(仅与病毒结合)和P9RS(仅抑制内体酸化)来鉴定和确认碱性肽的新的抗病毒机制。碱性肽的抗病毒活性可以通过增加肽的正电荷来增强并且需要与病毒结合和抑制内体酸化。

A.抗病毒肽

本公开的抗病毒肽优选由P9R序列组成。然而，抗病毒肽可以包括衍生自P9R的肽，只要21、23和28位的氨基酸是带正电荷的氨基酸。因此，该肽可以具有与P9R相同的氨基酸序列，其中21、23和28位的精氨酸由带正电荷的氨基酸诸如赖氨酸或组氨酸替换。然而，重要的是P9R结构的任何修饰确保所得的肽保持对内体酸化的抑制并保持与P9R相同程度的病毒结合。因此，有用的P9R衍生的肽(在本文中，P9R样肽)具有“内体酸化的抑制”和“病毒结合”的特性。如本申请的实施例中所示，改变P9R中的氨基酸并测试所需的活性(“内体酸化的抑制”和“病毒结合”)在本领域普通技术人员的能力范围内。

“病毒结合测定法”包括下列步骤：将肽(每孔0.1μg)溶解在H₂O中并包被到ELISA板上，然后在4℃下温育过夜。然后，在4℃下将2％BSA添加到封闭板中过夜。对于病毒与肽的结合，将病毒在磷酸盐缓冲液中稀释，然后添加至ELISA板以在室温下与包被的肽结合1h。清洗未结合的病毒后，用RNeasy Mini Kit(Qiagen,Cat#74106)的RLT缓冲液裂解结合的病毒，用于病毒RNA提取。通过RT-qPCR测量结合病毒的病毒RNA拷贝。

“内体酸化测定法”如前所述但稍作修改，根据制造商的说明，可以包括用pH敏感染料(pHrodo Red dextran,Invitrogen,Cat#P10361)检测内体酸化¹⁴。首先，在4℃下用BSA(25.0μg mL^-1)、P9(25.0μg mL^-1)、P9R(25.0μg mL^-1)、PA1(25.0μg mL^-1)或P9RS(25.0μg mL^-1)处理MDCK细胞15min。其次，向MDCK细胞中添加100μg mL^-1的pH敏感染料和DAPI，然后在4℃下温育15min。在拍摄图像之前，将细胞在37℃下进一步温育15min，然后用PBS清洗细胞两次。最后，将PBS添加到细胞中并立即用共聚焦显微镜(例如，Carl Zeiss LSM 700，德国)拍摄图像。

因此，P9R衍生的肽应具有至少5，优选至少5.6的总体净正电荷，并且优选不包括如P9RS(SEQ ID NO:4)所示的氨基酸修饰。还优选地，P9R衍生的肽不包括在C端精氨酸处引入另外的氨基酸残基。

P9R中的氨基酸取代以获得P9R样肽优选包括保守氨基酸取代。

保守氨基酸取代的示例包括其中取代在以下五组之一内的那些：1)小的脂肪族、非极性或微极性残基(Ala、Ser、Thr、Pro、Gly)；2)极性、带负电荷的残基及其酰胺(Asp、Asn、Glu、Gln)；极性、带正电荷的残基(His、Arg、Lys)；大的脂肪族、非极性残基(Met、Leu、Ile、Val、Cys)；和大的芳香族残基(Phe、Tyr、Trp)。非保守氨基酸取代的示例是其中：1)亲水残基，例如丝氨酰或苏氨酰，被(或由)疏水残基，例如亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、缬氨酰或丙氨酰取代；2)半胱氨酸或脯氨酸被(或由)任何其他残基取代；3)具有带阳电的侧链的残基，例如赖氨酰、精氨酰或组氨酰，被(或由)带阴电的残基，例如谷氨酰或天冬氨酰取代；或4)具有庞大侧链的残基，例如苯丙氨酸，被(或由)不具有侧链的残基，例如甘氨酸取代的那些。

然而，应当理解，可以使用任何氨基酸或氨基酸类似物在所述氨基酸位置进行取代。例如，可以用任何天然存在的氨基酸(例如，丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸)在所述位置进行取代。

B.制剂

可配制本文所述的肽用于肠内、胃肠外或肺部施用。在优选的实施方案中，配制该肽用于肺部施用。

P9R(或由其衍生的肽)可以与一种或多种药学上可接受的被认为是安全和有效的载体和/或赋形剂组合，并且可以施用于个体而不会引起不期望的生物学副作用或不需要的相互作用。载体是存在于药物制剂中除一种或多种活性成分外的所有组分。

也可以配制本文公开的P9R(或由其衍生的肽)用作消毒剂，例如在医院环境中。

1.肺部制剂

在一个实施方案中，配制P9R(或P9R样肽)用于肺部递送，诸如鼻内施用或口腔吸入。

呼吸道是涉及大气和血流之间气体交换的结构。肺是分支结构，最终以发生气体交换的肺泡结束。肺泡表面积是呼吸系统中最大的，并且是药物吸收发生之处。肺泡由没有纤毛或粘液覆盖层的薄上皮覆盖并分泌表面活性磷脂。呼吸道涵盖上气道，包括口咽和喉，然后是下气道，其包括气管，然后分支成支气管和细支气管。上气道和下气道被称为传导性气道。然后终末细支气管分成呼吸细支气管，然后其通向最终的呼吸区、肺泡或深肺。深肺或肺泡是用于全身性药物递送的吸入治疗气雾剂的主要靶标。

已经观察到包括低分子量药物的肺部施用的治疗组合物，例如β-雄激素拮抗剂来治疗哮喘。已经全身性施用其他在肺部有活性的治疗剂并经由肺部吸收靶向。鼻递送被认为是一种有前途的治疗施用技术，原因如下：由于上皮表面许多微绒毛的覆盖，鼻具有大的表面积可用于药物吸收，上皮下层高度血管化，来自鼻子的静脉血直接通过进入全身循环并因此避免了在肝脏中首过代谢的药物损失，它提供更低的剂量、更快达到治疗血液水平、更快发作药理活性、更少的副作用、每cm³的总血流量高、多孔的内皮基底膜并且容易接近。

用于肺部制剂的载体可分为用于干粉制剂的载体和作为溶液施用的载体。用于将治疗剂递送至呼吸道的气雾剂是本领域已知的。可以使用标准技术生产气雾剂，诸如超声或高压处理。对于经由上呼吸道的施用，制剂可以配制成溶液，例如水或等渗盐水，缓冲的或非缓冲的，或作为悬浮液，用于作为滴剂或喷雾剂鼻内施用。优选地，此类溶液或悬浮液相对于鼻分泌物是等渗的并且具有大约相同的pH，例如范围是约pH 4.0至约pH 7.4，或pH6.0至pH 7.0。缓冲液应该是生理学相容的，并且包括，仅举例而言，磷酸盐缓冲液。例如，代表性的鼻减充血剂被描述为缓冲至pH约为6.2。本领域技术人员可以容易地确定用于鼻和/或上呼吸道施用的无害水溶液的合适盐水含量和pH。

优选地，水溶液是水、含有盐和/或缓冲剂的生理学可接受的水溶液，诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)，或任何其他用于向动物或人施用的可接受的水溶液。此类溶液是本领域技术人员熟知的并且包括但不限于蒸馏水、去离子水、纯水或超纯水、盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)。其他合适的水媒介物包括但不限于林格氏(Ringer’s)溶液和等渗氯化钠。水悬浮液可包括悬浮剂诸如纤维素衍生物、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和黄芪胶，以及润湿剂诸如卵磷脂。适用于水悬浮液的防腐剂包括对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸正丙酯。

作为低毒性有机(即非水性)第3类残留溶剂的溶剂，例如乙醇、丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醚和丙醇可以用于制剂。溶剂的选择基于其容易使制剂雾化的能力。溶剂不应与P9R(或P9R样肽)发生有害反应。应使用合适的溶剂来溶解化合物或形成P9R(或P9R样肽)的悬浮液。溶剂应具有足够的挥发性以使溶液或悬浮液的气雾剂能够形成。可以根据期望添加另外的溶剂或雾化剂，诸如氟利昂，以增加溶液或悬浮液的挥发性。

在一个实施方案中，组合物可包含微量的聚合物、表面活性剂或本领域人员熟知的其他赋形剂。在本文中，“微量”是指不存在可能影响或介导肺中P9R(或P9R样肽)摄取的赋形剂，并且存在的赋形剂以在肺中不对P9R(或P9R样肽)的摄取产生不利影响的量存在。

由于其疏水特性，干脂质粉末可以直接分散在乙醇中。对于储存在诸如氯仿的有机溶剂中的脂质，将期望量的溶液放置在小瓶中，并且在氮气流下蒸发氯仿以在玻璃小瓶表面形成干薄膜。当用乙醇重构时膜很容易膨胀。为了在有机溶剂中充分分散脂质分子，对悬浮液进行声处理。也可以用可重复使用的PARI LC Jet+雾化器(PARI RespiratoryEquipment,Monterey,CA)在无水乙醇中制备脂质的非水悬浮液。

具有大粒度的干粉制剂(“DPF”)具有改进的流动性特征，诸如更少的聚集、更容易气雾化和潜在更少的吞噬作用。用于吸入疗法的干粉气雾剂通常以平均直径主要在小于5微米的范围内生产，尽管优选的空气动力学直径范围在1至10微米之间。大“载体”颗粒(不含药物)与治疗性气雾剂共同递送，以帮助实现高效的雾化以及其他可能的益处。

可以使用单乳液和双乳液溶剂蒸发、喷雾干燥、溶剂萃取、溶剂蒸发、相分离、单凝聚和复凝聚、界面聚合以及本领域普通技术人员熟知的其他方法来制备聚合的颗粒。可以使用本领域已知的制备微球体或微胶囊的方法制备颗粒。优选的制造方法是通过喷雾干燥和冷冻干燥，这需要使用含有表面活性剂的溶液，喷雾以形成期望大小的液滴，并且除去溶剂。

可以用适当的材料、表面粗糙度、直径和振实密度来制造颗粒，以局部递送到呼吸道的选定区域，诸如深肺或上呼吸道。例如，更高密度或更大的颗粒可用于上气道输送。类似地，可以在一次施用中施用以相同或不同EGS提供的不同大小颗粒的混合物以靶向肺的不同区域。

用于肺部递送的制剂包括单层磷脂囊泡、脂质体或脂蛋白颗粒。含有核酸的制剂和制备此类制剂的方法是本领域普通技术人员熟知的。脂质体由包括Avanti PolarLipids,Inc.(Birmingham,Ala.)在内的各种供应商提供的可商购磷脂形成。在一个实施方案中，脂质体可以包括对靶细胞表面上的受体具有特异性的配体分子，以将脂质体引导至靶细胞。

2.胃肠外制剂

本文所述的P9R(或P9R样肽)可以配制用于胃肠外施用。

例如，胃肠外施用可包括经静脉内、经皮内、经动脉内、经腹膜内、经颅内、经关节内、经前列腺内、经胸膜内、经气管内、经玻璃体内、经瘤内、经肌肉内、经皮下、经结膜下、经囊内(intravesicularly)、经心包内、经脐内、经注射和经输注向患者施用。

可以使用本领域已知的技术将胃肠外制剂制备为水性组合物。通常，此类组合物可以制备为可注射制剂，例如溶液或悬浮液、适用于在注射前添加重构介质后制备溶液或悬浮液的固体形式、乳剂诸如油包水(w/o)乳剂、水包油(o/w)乳剂及其微乳剂、脂质体或乳脂体(emulsomes)。

载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、一种或多种多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、油诸如植物油(例如花生油、玉米油、芝麻油等)及其组合。可以例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、在分散体的情况中通过维持所需要的粒度和/或通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，其将优选的包括等渗剂，例如糖或氯化钠。

作为游离酸或碱或其药学上可接受的盐的活性化合物的溶液和分散体可以在水或另一种溶剂或分散介质中制备，该溶剂或分散介质与一种或多种药学上可接受的赋形剂适当混合，该赋形剂包括但不限于表面活性剂、分散剂、乳化剂、pH调节剂、粘度调节剂及其组合。

合适的表面活性剂可以是阴离子、阳离子、两性或非离子表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括但不限于含有羧酸根、磺酸根和硫酸根离子的那些。阴离子表面活性剂的示例包括长链烷基磺酸钠、钾、铵盐和烷基芳基磺酸盐诸如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠(诸如十二烷基苯磺酸钠)；二烷基磺基琥珀酸钠(诸如双-(2-乙基硫氧基)-磺基琥珀酸钠)；和烷基硫酸盐诸如月桂基硫酸钠。阳离子表面活性剂包括但不限于季铵化合物诸如苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、硬脂基二甲基苄基氯化铵、聚氧乙烯和椰子胺。非离子表面活性剂的示例包括单硬脂酸乙二醇酯、肉豆蔻酸丙二醇酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、聚4-油酸甘油酯、脱水山梨糖醇酰化物、蔗糖酰化物、PEG-150月桂酸酯、PEG-400单月桂酸酯、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚山梨醇酯、聚氧乙烯辛基苯基醚、PEG-1000十六烷基醚、聚氧乙烯十三烷基醚、聚丙二醇丁基醚、

401、硬脂酰单异丙醇酰胺和聚氧乙烯氢化牛油酰胺。两性表面活性剂的示例包括N-十二烷基-β-丙氨酸钠、N-月桂基-β-亚氨基二丙酸钠、肉豆蔻酰两性基乙酸盐、月桂基甜菜碱和月桂基磺基甜菜碱。

制剂可以含有防腐剂以防止微生物的生长。合适的防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞(thimerosal)。制剂还可以含有抗氧化剂以防止活性剂降解。

制剂通常缓冲至pH为3-8以便在重构时胃肠外施用。合适的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。

水溶性聚合物常用于胃肠外施用的制剂中。合适的水溶性聚合物包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖酐、羧甲基纤维素和聚乙二醇。

可以通过将所需量的P9R(或P9R样肽)与一种或多种上文列出的赋形剂(根据需要)掺入适当的溶剂或分散介质中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，分散体是通过将各种无菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备的，该媒介物含有基本分散介质和来自上文列出的所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，该技术从其之前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何另外期望成分的粉末。可以以此方式制备粉末使颗粒本质上是多孔的，这可以增加颗粒的溶解。制备多孔颗粒的方法是本领域熟知的。

(a)受控释放制剂

本文所述的胃肠外制剂可以配制用于受控释放，包括立即释放、延迟释放、延长释放、脉冲释放及其组合。

i.纳米粒和微粒

对于胃肠外施用，可以将P9R(或P9R样肽)和任选的一种或多种另外的活性剂掺入微粒、纳米粒或其组合中，以提供所公开的P9R(或P9R样肽)和/或一种或多种另外的活性剂的受控释放。在其中制剂含有两种或更多种药物的实施方案中，药物可以配制用于相同类型的受控释放(例如延迟、延长、立即或脉冲)或者药物可以独立配制用于不同类型的释放(例如立即和延迟、立即和延长、延迟和延长、延迟和脉冲等)。

例如，可以将P9R(或P9R样肽)和/或一种或多种另外的活性剂掺入聚合微粒中，从而提供药物的受控释放。药物的释放通过药物扩散出微粒和/或聚合体颗粒通过水解和/或酶促降解的降解来控制。合适的聚合物包括乙基纤维素和其他天然或合成纤维素衍生物。

在水环境中缓慢溶解并形成凝胶的聚合物，诸如羟丙基甲基纤维素或聚环氧乙烷，也可以适合作为含药物微粒的材料。其他聚合物包括但不限于聚酐、聚(酯酐)、聚羟基酸，诸如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-乙交酯)(PLGA)、聚-3-羟基丁酸酯(PHB)及其共聚物、聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)及其共聚物、聚己酸内酯及其共聚物以及它们的组合。

可替代地，可以将药物掺入由不溶于水溶液或缓慢溶于水溶液但能够在GI道内降解的材料制备的微粒中，降解的方法包括酶促降解、胆汁酸的表面活性剂作用和/或机械侵蚀。如本文所用，术语“缓慢溶于水”是指在30分钟的时段内不溶解于水的材料。优选的示例包括脂肪、脂肪物质、蜡、蜡样物质及其混合物。合适的脂肪和脂肪物质包括脂肪醇(诸如月桂醇、肉豆蔻醇硬脂醇、鲸蜡醇或鲸蜡硬脂醇)、脂肪酸和衍生物，包括但不限于脂肪酸酯、脂肪酸甘油酯(甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)和氢化脂肪。具体示例包括但不限于氢化植物油、氢化棉籽油、氢化蓖麻油、商品名

下可得的氢化油、硬脂酸、可可脂和硬脂醇。合适的蜡和蜡样材料包括天然或合成蜡、烃和普通蜡。蜡的具体示例包括蜂蜡、糖蜡(glycowax)、蓖麻蜡、巴西棕榈蜡、石蜡和小烛树蜡。如本文所用，蜡样材料定义为在室温下通常为固体并且具有约30至300℃的熔点的任何材料。

在某些情况下，可能期望改变水渗入微粒的速率。为此，可以将速率控制(芯吸)剂与上文列出的脂肪或蜡一起配制。速率控制材料的示例包括某些淀粉衍生物(例如蜡质麦芽糖糊精和转鼓干燥的玉米淀粉)、纤维素衍生物(例如羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和羧甲基纤维素)、藻酸、乳糖和滑石粉。另外，可以添加药学上可接受的表面活性剂(例如卵磷脂)以促进此类微粒的降解。

不溶于水的蛋白质，诸如玉米醇溶蛋白(zein)，也可以用作形成含药物微粒的材料。另外，水溶性的蛋白质、多糖及其组合可以与药物配制成微粒并随后交联形成不溶性网状物。例如，环糊精可以与单个药物分子复合并随后交联。

ii.制备纳米粒和微粒的方法

可以通过已知的药物制剂技术实现药物封装或掺入载体材料中以产生含药物的微粒。在脂肪、蜡或蜡样材料中配制的情况下，通常将载体材料加热到其熔化温度以上并添加药物以形成包含悬浮在载体材料中的药物颗粒、溶解在载体材料中的药物或其混合物的混合物。随后可以通过几种方法配制微粒，该方法包括但不限于凝结、挤压、喷雾冷却或水分散体的过程。在优选的过程中，将蜡加热到其熔化温度以上，添加药物，并且随着混合物冷却，在不断搅拌下使熔化的蜡-药物混合物凝结。可替代地，可以将熔化的蜡-药物混合物挤出并滚圆以形成小丸或小珠。这些方法在本领域中是已知的。

对于一些载体材料，可能期望使用溶剂蒸发技术来产生含药物微粒。在这种情况下药物和载体材料共溶解于互溶剂中，并且随后可以通过数种技术产生微粒，该技术包括但不限于在水或其他合适的介质中形成乳液、喷雾干燥或通过从本体溶液蒸发掉溶剂和研磨所得材料。

在一些实施方案中，颗粒形式的药物同质地分散在不溶于水或缓慢溶于水的材料中。为了使组合物中药物颗粒的大小最小化，可以在配制前研磨药物粉末本身以产生细小颗粒。制药领域中已知的喷射研磨法可以用于此目的。在一些实施方案中，通过将蜡或蜡样物质加热到其熔点以上并在搅拌混合物的同时添加药物颗粒，将颗粒形式的药物同质地分散在蜡或蜡样物质中。在这种情况下，可以将药学上可接受的表面活性剂添加到混合物中以促进药物颗粒的分散。

颗粒也可以用一种或多种改良的释放包衣进行包衣。被脂肪酶水解的脂肪酸固体酯可以喷涂在微粒或药物颗粒上。玉米醇溶蛋白是天然不溶于水的蛋白质的示例。可以通过喷涂或湿法制粒技术将其涂层在含有药物的微粒或药物颗粒上。除了天然不溶于水的物质外，消化酶的一些底物可以通过交联规程处理，导致不溶性网状物的形成。已经报道了由化学和物理方法两者引发的许多蛋白质交联方法。获得交联的最常用方法之一是使用化学交联剂。化学交联剂的示例包括醛类(戊二醛和甲醛)、环氧化合物、碳二亚胺和京尼平(genipin)。除了这些交联剂之外，还使用氧化糖和天然糖来交联明胶。也可以使用酶促方法完成交联；例如，谷氨酰转胺酶已被批准为用于交联海鲜产品的GRAS物质。最后，交联可以通过物理方法诸如热处理、紫外线照射和伽马照射来引发。

为了在含药物的微粒或药物颗粒周围产生交联蛋白质的包衣层，可以将水溶性蛋白质喷涂在微粒上并随后通过上述方法之一进行交联。可替代地，可以通过凝聚-相分离(例如通过添加盐)将含药物的微粒微囊化在蛋白质内并随后进行交联。用于此目的的一些合适蛋白质包括明胶、白蛋白、酪蛋白和谷蛋白(gluten)。

多糖也可以交联以形成不溶于水的网状物。对于许多多糖来说，这可以通过与钙盐或多价阳离子反应来实现，它们交联主要的聚合物链。果胶、藻酸盐、葡聚糖、直链淀粉和瓜尔胶在多价阳离子存在下经受交联。带相反电荷的多糖之间也可以形成复合物；例如，果胶和壳聚糖可以经由静电相互作用进行复合。

(b)可注射/可植入制剂

本文所述的P9R(或P9R样肽)可以掺入可注射/可植入固体或半固体移植物中，诸如聚合体植入物。在一个实施方案中，将P9R(或P9R样肽)掺入聚合物中，该聚合物在室温下为液体或糊状物，但在与水性介质诸如生理流体接触后，展现出粘度增加从而形成半固体或固体材料。示例性聚合物包括但不限于羟基链烷酸聚酯，其衍生自与羟基链烷酸共聚的至少一种不饱和羟基脂肪酸的共聚作用。聚合物可以熔化、与活性物质混合并浇铸或注塑成装置。此类熔化制造要求聚合物的熔点低于要输送的物质和聚合物降解或变得有反应性的温度。该装置还可以通过溶剂浇铸制备，其中聚合物溶解在溶剂中并且药物溶解或分散在聚合物溶液中，然后蒸发溶剂。溶剂法需要聚合物可溶于有机溶剂。另一种方法是对聚合物和装载活性剂的药物或聚合物颗粒的混合粉末进行压缩成型。

可替代地，可以将P9R(或P9R样肽)掺入聚合物基质中并模塑、压缩或挤压成在室温下为固体的装置。例如，P9R(或P9R样肽)可以掺入可生物降解的聚合物中，诸如聚酐、聚氢链烷酸(PHAs)、PLA、PGA、PLGA、聚己内酯、聚酯、聚酰胺、聚原酸酯、聚磷腈、蛋白质和多糖诸如胶原蛋白、透明质酸、白蛋白和明胶及其组合物，并压缩成固体装置，诸如圆盘，或挤压成装置，诸如棒。

可以通过聚合物的选择、聚合物的分子量和/或为提高降解的聚合物的改性(诸如孔的形成和/或可水解键的掺入)来改变从植入物的肽的释放。用于改进可生物降解聚合物的特性以改变化合物从植入物中的释放概况的方法是本领域熟知的。

3.肠内制剂

合适的口服剂型包括片剂、胶囊、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和锭剂。可以使用本领域熟知的压缩或成型技术制备片剂。可以使用本领域熟知的技术将明胶或非明胶胶囊制备成硬胶囊壳或软胶囊壳，其可以封装液体、固体和半固体填充材料。在其中制剂是用于涉及经胃肠道传送的口服施用的实施方案中，优选地对制剂进行包衣以保护肽免受胃肠酶的影响。

可以使用药学上可接受的载体制备制剂。如本文通常使用的，“载体”包括但不限于稀释剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、溶胀剂、填充剂、稳定剂及其组合。

载体还包括包衣组合物的所有组分，其可以包括增塑剂、颜料、着色剂、稳定剂和助流剂。

合适的包衣材料的示例包括但不限于纤维素聚合物(诸如乙酸邻苯二甲酸纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素和乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素)、聚乙酸邻苯二甲酸乙烯酯、丙烯酸聚合物和共聚物，以及根据商品名

(Roth Pharma,Westerstadt,Germany)可商购的甲基丙烯酸树脂、玉米醇溶蛋白、虫胶和多糖。

另外，包衣材料可含有常规的载体诸如增塑剂、颜料、着色剂、助流剂、稳定剂、成孔剂和表面活性剂。

“稀释剂”，也称为“填充剂”，通常是增加固体剂型体积所必需的，以便为片剂的压制或小珠和颗粒剂的形成提供适用的大小。合适的稀释剂包括但不限于二水合磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素、微晶纤维素、高岭土(kaolin)、氯化钠、干淀粉、水解淀粉、预糊化淀粉、二氧化硅、二氧化钛、硅酸铝镁和糖粉。

“粘合剂”用于赋予固体剂型制剂以粘合特性，从而确保片剂或小珠或颗粒剂在剂型形成后保持完整。合适的粘合剂材料包括但不限于淀粉、预胶化淀粉、明胶、糖(包括蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖和山梨醇)、聚乙二醇、蜡、天然和合成树胶诸如阿拉伯胶、黄蓍胶、海藻酸钠、纤维素(包括羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素和硅酸铝镁(veegum))以及合成聚合物诸如丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚丙烯酸/聚甲基丙烯酸和聚乙烯吡咯烷酮。

“润滑剂”用于促进片剂的制造。合适的润滑剂的示例包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、山嵛酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉和矿物油。

“崩解剂”用于促进剂型在施用后崩解或“分解”，并且通常包括但不限于淀粉、羟基乙酸淀粉钠、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、预糊化淀粉、粘土、纤维素、藻氨酸(alginine)、树胶或交联聚合物，诸如交联的PVP(来自GAF Chemical Corp的

XL)。

“稳定剂”用于抑制或延缓药物分解反应，其包括，举例而言，氧化反应。合适的稳定剂包括但不限于抗氧化剂、丁基化羟基甲苯(BHT)、抗坏血酸、其盐类和酯类、维生素E、生育酚及其盐类、亚硫酸盐诸如焦亚硫酸钠、半胱氨酸及其衍生物、柠檬酸、没食子酸丙酯和丁基羟基茴香醚(BHA)。

(a)受控释放肠内制剂

口服剂型，诸如胶囊、片剂、溶液剂和混悬剂可以配制用于受控释放。例如，P9R(或P9R样肽)和任选的一种或多种另外的活性剂可以配制成纳米颗粒、微粒及其组合，并封装在软明胶或硬明胶或非明胶胶囊中或分散在分散介质中形成口服混悬剂或糖浆。颗粒可以由药物和受控释放的聚合物或基质形成。可替代地，药物颗粒可以在掺入完成的剂型之前用一种或多种受制释放的包衣进行包衣。

在另一个实施方案中，P9R(或P9R样肽)和任选的一种或多种另外的活性剂分散在基质材料中，该基质材料在与水性介质诸如生理流体接触时凝胶化或乳化。在凝胶的情况中，包埋活性剂的基质膨胀，随着时间的推移，活性剂通过扩散和/或基质材料的降解缓慢释放。此类基质可以配制成片剂或硬胶囊和软胶囊的填充材料。

在又一个实施方案中，将P9R(或P9R样肽)和任选的一种或多种另外的活性剂配制成固体口服剂型，诸如片剂或胶囊，并且固体剂型用一种或多受控释放的包衣进行包衣，诸如延迟释放包衣或延长释放包衣。一种或多种包衣还可以含有P9R(或P9R样肽)和/或另外的活性剂。

i.延长释放剂型

延长释放制剂通常制备为本领域已知的扩散或渗透系统。扩散系统通常由两种类型的装置，贮库和基质组成，并且是本领域熟知且已描述的。基质装置通常通过将药物与缓慢溶解的聚合物载体压缩成片剂形式来制备。用于制备基质装置的三种主要材料是不溶性塑料、亲水性聚合物和脂肪化合物。塑料基质包括但不限于丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯和聚乙烯。亲水性聚合物包括但不限于纤维素聚合物诸如甲基和乙基纤维素、羟烷基纤维素诸如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和

934、聚环氧乙烷及其混合物。脂肪化合物包括但不限于各种蜡诸如巴西棕榈蜡和三硬脂酸甘油酯以及蜡型物质，包括氢化蓖麻油或氢化植物油或其混合物。

在某些优选的实施方案中，塑料材料是药学上可接受的丙烯酸聚合物，包括但不限于丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸)(酸酐)、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚(甲基丙烯酸酐)和甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物。

在某些优选的实施方案中，丙烯酸类聚合物由一种或多种甲基丙烯酸铵共聚物组成。甲基丙烯酸铵共聚物是本领域所熟知的，并且在NF XVII中被描述为具有低含量季铵基团的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的完全聚合的共聚物。

在一个优选的实施方案中，丙烯酸聚合物是丙烯酸树脂漆，诸如根据商品名EUDRAGIT

从Rohm Pharma可商购的丙烯酸树脂漆。在进一步优选的实施方案中，丙烯酸聚合物包含两种丙烯酸树脂漆的混合物，分别根据商品名

RL30D和

RS30D从Rohm Pharma可商购。

RL30D和

RS30D是具有低含量的季铵基团的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的共聚物，在

RL30D中铵基团与剩余的中性(甲基)丙烯酸酯的摩尔比为1:20并且在

RS30D中为1:40。平均分子量约为150,000。

S-100和

L-100也是优选的。代码名称RL(高渗透性)和RS(低渗透性)是指这些试剂的渗透性特性。

RL/RS混合物不溶于水和消化液。然而，形成的包含它们的多颗粒系统在水溶液和消化液中是可膨胀的和可渗透的。

为了最终获得具有期望的溶出曲线的持续释放的制剂，上文所述的聚合物诸如

RL/RS可以以任何期望的比率混合在一起。例如，可以从100％

RL、50％

RL和50％EUDRAGIT

RS以及10％

RL和90％

RS获得期望的持续释放的多颗粒系统。本领域技术人员将认识到也可以使用其他丙烯酸的聚合物，诸如，例如

L。

可替代地，延长释放制剂可以使用渗透系统或通过向剂型施加半渗透的包衣来制备延长释放制剂。在后者的情况中，可以通过以合适的比例组合低可渗透的和高可渗透的包衣来实现期望的药物释放概况。

上文所述具有不同药物释放机制的装置可以组合成包含单个或多个单元的最终剂型。多个单元的示例包括但不限于多层片剂和含有片剂、小珠或颗粒的胶囊。可以通过使用包衣或压制过程在延长释放核心的顶部施加立即释放层，或在多单元系统中施加(诸如含有延长或立即释放小珠的胶囊)，将立即释放部分添加到延长释放系统。

含有亲水性聚合物的延长释放片剂通过本领域公知的技术制备，诸如直接压制、湿法制粒或干法制粒。他们的配方通常包含聚合物、稀释剂、粘合剂和润滑剂以及活性药物成分。通常的稀释剂包括惰性粉末物质，诸如淀粉、粉状纤维素，尤其是结晶和微晶纤维素，糖诸如果糖、甘露醇和蔗糖，谷物粉和类似的可食用粉末。典型的稀释剂包括例如各种类型的淀粉、乳糖、甘露醇、高岭土、磷酸钙或硫酸钙、无机盐诸如氯化钠和糖粉。粉状纤维素衍生物也是有用的。典型的片剂粘合剂包括诸如淀粉、明胶物质和糖类诸如乳糖、果糖和葡萄糖。也可以使用天然和合成树胶，包括阿拉伯树胶、藻酸盐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。聚乙二醇、亲水聚合物、乙基纤维素和蜡也可以用作粘合剂。片剂制剂中需要润滑剂以防止片剂和冲头粘在模具中。润滑剂选自光滑固体诸如滑石粉、硬脂酸镁和硬脂酸钙、硬脂酸和氢化植物油。

含有蜡材料的延长释放片剂通常使用本领域已知的方法制备，诸如直接混合方法、凝结方法和水分散方法。在凝结方法中，将药物与蜡材料混合，并且喷雾凝结或凝结并筛选和加工。

ii.延迟释放剂型

可以通过用聚合物薄膜对固体剂型进行包衣来创造延迟释放制剂，该聚合物薄膜不溶于胃的酸性环境，且溶于小肠的中性环境。

例如，可以通过用选定的包衣材料对药物或含药物的组合物进行包衣，来制备延迟释放剂量单元。例如，含药物的组合物可以是用于掺入胶囊的片剂、用作“包衣核”剂型的内核的片剂或用于掺入片剂或胶囊的多个含药物的小珠、颗粒或颗粒剂。优选的包衣材料包括可生物侵蚀的、逐渐水解的、逐渐水溶性的和/或可酶促降解的聚合物，并且可以是常规的“肠溶”聚合物。如本领域技术人员将理解的，肠溶聚合物在下胃肠道的较高pH环境中变得可溶或随着剂型通过胃肠道而缓慢侵蚀，而可酶促降解的聚合物被存在于下胃肠道特别是在结肠中的细菌酶降解。用于引起延迟释放的合适包衣材料包括但不限于纤维素聚合物诸如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、醋酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、乙基纤维素、乙酸纤维素、醋酸邻苯二甲酸纤维素、醋酸偏苯三酸纤维素和羧甲基纤维素钠；丙烯酸聚合物和共聚物，优选由以下形成：丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和/或甲基丙烯酸乙酯，以及根据商品名

(Rohm Pharma；Westerstadt,Germany)可商购的其他甲基丙烯酸树脂，包括

L30D-55和L100-55(在pH 5.5及以上可溶)、

L-100(在pH 6.0及以上可溶)、

S(由于较高程度的酯化，在pH 7.0及以上可溶)和

NE、RL和RS(具有不同程度的可渗透性和膨胀性的水不溶性聚合物)；乙烯基聚合物和共聚物诸如聚乙烯吡咯烷酮、乙酸乙烯酯、乙酸邻苯二甲酸乙烯酯、乙酸乙烯酯巴豆酸共聚物、和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；可酶促降解的聚合物诸如偶氮聚合物、果胶、壳聚糖、直链淀粉和瓜尔胶；玉米醇溶蛋白和虫胶。也可以使用不同包衣材料的组合。也可以使用不同聚合物施加多层包衣。

通过评估用不同量的各种包衣材料制备的片剂、小珠和颗粒剂的个体释放概况，本领域技术人员可以容易地确定特定包衣材料的优选包衣重量。材料、方法和应用形式的组合产生期望的释放特性，这只能从临床研究中确定。

包衣组合物可以包含常规添加剂，诸如增塑剂、颜料、着色剂、稳定剂、助流剂等。通常存在增塑剂以降低包衣的脆性，并且相对于聚合物的干重将通常占约10wt.％至50wt.％。典型增塑剂的示例包括聚乙二醇、丙二醇、甘油三乙酸酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、乙酰柠檬酸三乙酯、蓖麻油和乙酰化的甘油单酯。优选使用稳定剂来稳定分散体中的颗粒。典型的稳定剂是非离子乳化剂，诸如山梨醇酐酯、聚山梨醇酯和聚乙烯吡咯烷酮。推荐使用助流剂来减少在薄膜形成和干燥过程中的粘性作用，并且将通常在包衣溶液中占聚合物重量的大约25wt.％至100wt.％。一种有效的助流剂是滑石粉。也可以使用其他助流剂诸如硬脂酸镁和单硬脂酸甘油酯。还可以使用颜料诸如二氧化钛。也可以将少量消泡剂诸如硅氧烷(例如二甲基硅油)添加到包衣组合物中。

III.使用方法

本公开的方法是基于显示P9R展示出对包膜SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV、A(H1N1)pdm09、A(H7N9)病毒和非包膜鼻病毒非常广谱的抗病毒活性的研究。在体内施用时P9R高效保护免受病毒攻击，如其保护小鼠(体内施用后)免受致死的A(H1N1)pdm09病毒攻击所例示的。即使A(H1N1)pdm09病毒在P9R存在下传代40代后，P9R也没有引起药物抗性病毒的出现。机制研究表明，P9R的抗病毒活性依赖于与病毒的直接结合以及对病毒-宿主内体酸化的抑制，这提供了结合病毒的碱性肽可以广泛抑制pH依赖性病毒的新概念。

相应地，提供了用于治疗感染病毒的受试者的方法，该方法通过向受试者施用含有有效量的所公开的肽的制剂以改善一种或多种与病毒感染相关的症状。在优选的实施方案中，该治疗对于在受试者体内抑制病毒复制是有效的。可以通过以下方式向受试者施用有效量的肽用所公开的肽治疗受试者：经肠内、经肺部或鼻施用或经胃肠外(经静脉内、经皮内、经动脉内、经腹膜内、经颅内、经关节内、经前列腺内、经胸膜内、经气管内、经玻璃体内、经瘤内、经肌肉内、经皮下、经结膜下、经囊内、经心包内、经脐内、经注射和经输注)。

病毒优选为呼吸系统病毒，并且更优选为pH依赖性呼吸系统病毒。呼吸系统病毒是人中最频繁的疾病病原体，对全世界的发病率和死亡率产生重大影响，主要是儿童。全世界的全部儿童死亡中大约五分之一与急性呼吸系统感染(ARI)有关，特别是在热带地区的贫困人口中，那里ARI的病例与死亡的比率可能显著高于世界温带地区。八种人呼吸系统病毒在所有年龄组中普遍传播，并被公认适应于高效的人对人传播，包括HRSV(人呼吸系统合胞病毒)、HPIV(人副流感病毒)、HRV(人鼻病毒)、ADV(腺病毒)、HCoV(人冠状病毒)(HCoV-NL63、HCoV-HKU1)、SARS-CoV、HMP(人偏肺病毒)、HPIV(人副流感病毒)和HBoV(人博卡病毒)。认为HRSV内化是pH非依赖性的，并且可能发生在血浆或内体膜中。

可以用本公开的制剂治疗的示例性病毒感染包括但不限于寨卡病毒、肠道病毒-A7、埃博拉病毒、流感病毒、HRSV、HPIV、HRV、ADV、HPIV、HCoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV、A(H1N1)pdm09、A(H7N9)病毒和无包膜鼻病毒。

下列非限制性实施例进一步解释所公开和要求保护的组合物和方法。

实施例

材料和方法

细胞和病毒培养

从ATCC(Manassas,VA,USA)获得的Madin Darby犬肾(MDCK,CCL-34)、Vero E6(CRL-1586)、RD(CCL136)、LLC-MK2(CCL-7)、A549(CCL-185)细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)、100IU mL^-1青霉素和100μg mL^-1链霉素的Dulbecco极限必需培养基(DMEM)或MEM中培养。本研究使用的病毒株包括2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)⁴³、SARS-CoV、MERS-CoV(hCoV-EMC/2012)、A/Hong Kong/415742/2009、A/Hong Kong/415742Md/2009(H1N1)(一种高毒性小鼠适应株)、A/Anhui/1/2013(H7N9)¹³，鼻病毒⁴⁴和人副流感病毒3(ATCC-C243)。对于体外实验，病毒在MDCK、Vero E6、RD和LLC-MK2细胞中培养。对于动物实验，如之前所述在卵中培养H1N1病毒⁴⁵。

设计和合成肽

如图1a所示设计P9、P9R、PA1和P9RS并由ChinaPeptide(上海，中国)合成。所有肽的纯度>95％。通过HPLC和质谱法验证每种肽的纯度和质量。

噬斑减少测定法

如我们之前所述用噬斑减少测定法测量肽的抗病毒活性¹⁴。简单来讲，将肽溶解在30mM磷酸盐缓冲液中，该缓冲液含有24.6mM Na₂HPO₄和5.6mM KH₂PO₄，pH为7.4。在室温下将肽或牛血清白蛋白(BSA,0.4-50.0μg mL^-1)与50PFU的冠状病毒(SARS-CoV-2、MERS-CoV和SARS-CoV)、流感病毒(H1N1病毒和H7N9病毒)、鼻病毒或副流感病毒3在磷酸盐缓冲液中预混合。温育1h后，将肽-病毒混合物转移至Vero E6(对于冠状病毒)、MDCK(对于流感病毒)、RD(对于鼻病毒)或LLC-MK2(对于副流感病毒)。在感染后1h，去除感染性培养基并向细胞中添加1％低熔点琼脂。在感染后2-4天使用4％福尔马林固定细胞。添加crystal blue(0.1％)用于染色，并计数噬斑的数量。

抗病毒多周期生长测定法

将冠状病毒(SARS-CoV-2、MERS-CoV和SARS-CoV)、流感病毒(H1N1和H7N9病毒)和鼻病毒(0.005MOI)与P9R或BSA(50-100μg mL^-1)在磷酸盐缓冲液中预混合1h。温育后，将冠状病毒接种到Vero E6上。将流感病毒接种到MDCK细胞上。将鼻病毒接种到RD细胞上。感染1h后，去除感染性培养基并将补充P9R或BSA(50-100μg mL^-1)的新鲜培养基添加到感染细胞中用于病毒和细胞培养。在感染后24-30h，收集细胞上清液用于检测病毒RNA拷贝。

细胞毒性测定法

如我们之前所述¹³，使用基于四唑的比色MTT测定法检测50％细胞毒性浓度(CC₅₀)来确定肽的细胞毒性。简单来讲，将细胞以每孔2×10⁴个细胞的初始密度接种在补充有10％FBS的MEM或DMEM的96孔细胞培养板中中并温育过夜。去除细胞培养基，然后将补充有各种浓度的肽和1％FBS的DMEM添加到每个孔中。在37℃温育24h后，将MTT溶液(5mg mL^-1，每孔10μL)添加到每个孔中，在37℃温育4h。然后，将100μL的0.01M HCl中的10％SDS添加到每个孔中。在室温下进一步温育并摇动过夜后，使用VictorTM X3 Multilabel Reader(PerkinElmer,USA)在OD570读取板。没有肽的细胞培养孔用作实验对照并且仅培养基充当空白对照。

肽-病毒结合测定法

将溶解在H₂O中的肽(每孔0.1μg)包被在ELISA板上并在4℃温育过夜。然后，使用2％BSA在4℃封闭板过夜。对于病毒与肽的结合，将病毒在磷酸盐缓冲液中稀释，然后添加到ELISA板以在室温下与包被的肽结合1h。清洗未结合的病毒后，用RNeasy Mini Kit(Qiagen,Cat#74106)的RLT缓冲液裂解结合的病毒用于病毒RNA提取。通过RT-qPCR测量结合病毒的病毒RNA拷贝。

ELISA测定法

如之前所述进行ELISA测定法¹⁴。将溶解在H₂O中的肽(每孔0.1μg)包被在ELISA板上并在4℃温育过夜。然后，使用2％BSA在4℃封闭板过夜。对于HA和S结合，将溶液I缓冲液(Sino Biological Inc.,Cat^#11055-V08H4)中的150ng HA1或S与肽在37℃温育1h。通过与兔抗-His-HRP(Invitrogen,Cat^#R93125,1:2,000)在室温下温育30min来确定肽与HA1或S蛋白的结合能力。通过添加50μL TMB单一溶液(Life Technologies,Cat^#002023)在37℃持续15min来使反应显影，并用50μL的1M H₂SO₄终止。在ELISA读板器(Victor 1420MultilabelCounter；PerkinElmer)中在450nm处获得读数。

病毒RNA提取和RT-qPCR

根据制造商的说明，通过Viral RNA Mini Kit(QIAGEN,Cat^#52906,USA)提取病毒RNA。如我们之前所述进行实时RT-qPCR¹⁴。使用

PCR system 9700(AppliedBiosystems,USA)用PrimeScript II 1^st Strand cDNA synthesis Kit(Takara,Cat#6210A)将提取的RNA逆转录为cDNA。然后使用

480SYBR Green I Master(Roach,USA)用特异性引物(表1)扩增cDNA，以检测SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV、H1N1、H7N9和鼻病毒。

表1.RT-qPCR引物

为了定量，准备等同于每个反应10¹至10⁶个拷贝的标准质粒的10倍连续稀释物来生成校准曲线。用

96system(Roche,USA)进行实时qPCR实验。

内体酸化测定法

如之前所述但稍作修改¹⁴，根据制造商的说明用pH敏感染料(pHrodo Reddextran,Invitrogen,Cat^#P10361)检测内体酸化。首先，用BSA(25.0μg mL^-1)、P9(25.0μgmL^-1)、P9R(25.0μg mL^-1)、PA1(25.0μg mL^-1)或P9RS(25.0μg mL^-1)在4℃处理MDCK细胞15min。其次，向MDCK细胞中添加100μg mL^-1的pH敏感染料和DAPI，然后在4℃温育15min。在拍摄图像之前，将细胞在37℃进一步温育15min，然后用PBS清洗细胞两次。最后，将PBS添加到细胞中并立即用共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM 700,Germany)拍摄图像。

细胞中肽与病毒结合的共定位测定法

根据制造商的介绍用绿色Dio染料(Invitrogen,Cat^#3898)标记H1N1病毒。在室温下用TAMRA标记的P9R和TAMRA标记的P9RS处理DIO标记的病毒1h。在冰上用肽处理的病毒感染预冷的MDCK细胞15min，然后移至37℃温育15min。用PBS清洗细胞两次然后用4％的福尔马林固定1h。通过DAPI对细胞核进行染色以用共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM 700,Germany)拍摄图像。

核蛋白(NP)免疫荧光测定法

如之前所述实施NP染色¹⁴。将MDCK细胞接种在细胞培养载玻片上，并以1MOI的用BSA(25.0μg mL^-1)、巴弗洛霉素A1(50.0nM)或P9R(25.0μg mL^-1)预处理的A(H1N1)pdm09病毒感染MDCK细胞。在感染后的3.5h后，用4％福尔马林固定细胞1h，然后用PBS中的0.2％Triton X-100透化5min。用PBS清洗细胞，然后在室温下用5％BSA封闭1h。将细胞与小鼠IgG抗NP(Millipore,Cat^#2817019,1:600)在室温下温育1h，然后用PBS清洗，用于下一次与山羊抗小鼠IgG Alexa-488(Life Technologies,Cat#1752514,1:600)在室温下温育1h。最后，用PBS清洗细胞并用DAPI染色。通过共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM 700,Germany)拍摄图像。

P9R的NMR结构分析

新鲜制备的0.5mL溶剂中的1mg mL^-1(0.29mM)的P9R用于NMR研究。数据在H₂O/D₂O(19:1v/v)以及99.996％D₂O中收集，内参为三甲基甲硅烷基丙酸。所有NMR光谱均在BrukerAVANCE III 600MHz光谱仪(Bruker BioSpin,Germany)或Bruker AVANCE III 700MHz光谱仪上在25℃获得。记录2D ¹H-¹H相关光谱术(COSY)、总相关光谱术(TOCSY)和核欧沃豪斯效应光谱术(NOESY)光谱以进行共振归属。质子间距离限制衍生自2D NOESY光谱，混合时间为300ms和500ms，使用自动NOE归属策略然后进行手动检查。使用CCPNMR Analysis 2.4.2⁴⁶提取NOE强度和化学位移并充当Aria程序的输入。使用程序DANGLE⁴⁷从化学位移中预测二面角。使用Aria 2.3程序⁴⁸迭代计算P9R的NMR溶液结构。在组合的自动NOE归属和结构计算算法的八个迭代周期中的每一个中，使用距离限制对一百个随机构象异构体进行退火。从最后一个迭代周期输出的最终上限距离约束经过全面的手动交叉检查和最终的水溶剂结构改进循环。从这些改进的100个结构中保留10个最低能量的构象异构体用于统计分析。使用均方根偏差(RMSD)分析评估计算的结构的收敛性。通过使用PROCHECK-NMR⁴⁹表示Ramachandran二面角样式来评估最终收敛结构的主链二面角

的分布。使用UCSFChimera 1.13.1⁵⁰实现了P9R的三维结构和静电表面电位的可视化。

小鼠中P9R的抗病毒分析

在2级生物安全实验室中饲养10-12周龄的BALB/c雌性小鼠，并准许随意获取标准小丸饲料和水。所有实验方案均遵循经批准的生物安全2级动物设施的标准操作规程，并经香港大学活体动物在教学与研究中的使用委员会(Committee on the Use of LiveAnimals in Teaching and Research)批准⁴⁵。适应小鼠的H1N1病毒用于小鼠的致死攻击。为了评估治疗效果，用3LD₅₀的病毒攻击小鼠，然后在病毒接种后6h经鼻内接种PBS、P9、P9R、PA1或扎那米韦。在接下来的一天，再给予H1N1攻击的小鼠两剂。监测生存和一般状况16天或直至死亡。

统计分析

用GraphPad Prism 5分析小鼠的生存和统计显著性。其他结果的统计显著性用Stata统计软件通过双尾学生t检验计算。认为P<0.05的结果是显著的。

结果

小鼠β-防御素衍生肽P9R可以广泛抑制冠状病毒和其他呼吸系统病毒

经由液泡膜质子泵V-ATPase的质子内流进入内体影响内体酸化²⁷。理论上，具有较强净正电荷的碱性肽会中和内体中的质子，从而抑制内体酸化。因此，为了改善我们之前的抗病毒肽P9¹³，在位点21(H→R)、23(K→R)和28(K→R)将弱正电荷氨基酸(组氨酸和赖氨酸)替换为精氨酸(图1A)以将P9的净正电荷(+4.7)提高到P9R的电荷(+5.6)。在噬斑减少测定中，P9R对SARS-CoV-2的IC₅₀显著低于P9(0.9μg mL^-1vs 2.4μg mL^-1,P<0.01)(图1B)。此外，P9R对MERS-CoV、A(H1N1)pdm09病毒、A(H7N9)病毒和鼻病毒显示出显著强于P9的抑制作用(图1c-1g)。然而，P9R和P9对副流感病毒3的IC₅₀要高得多(>25.0μg mL^-1)，可能是因为在副流感病毒3的病毒生命周期中不需要内体酸化(图1H)²⁸。在多周期生长测定中，P9R将SARS-CoV-2、MERS-CoV和SARS-CoV的病毒复制抑制了1000倍(图1I)。对于A(H1N1)pdm09病毒、A(H7N9)病毒和鼻病毒，P9R可以抑制>20倍的病毒复制(图1I)。此外，对于MDCK、VeroE6和A549细胞，P9R的CC₅₀>300μg mL^-1(图1J)。这些结果指明具有更多正电荷的P9R能够比P9更高效地抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2和其他包膜和无包膜呼吸系统病毒。

正电荷的程度对于内体酸化的抑制和抗病毒活性至关重要

为了确定肽的净电荷是否影响内体酸化的抑制，内体酸化测定发现P9R(+5.6)可以比P9更显著地抑制活细胞中的内体酸化(数据未显示，和图2A)，这与P9R比P9具有更强的抗病毒活性一致。此外，具有较少正电荷(+1.7)的肽PA1，其除了C端有3个额外的酸性氨基酸外具有与P9相同的氨基酸序列，不能抑制内体酸化(数据未显示，和图2B)并失去抗病毒活性(图2B)。因此，净正电荷的程度与内体酸化的抑制程度和抗病毒活性相关。

单独抑制宿主内体酸化不足以使带正电荷的肽抑制病毒复制

为了确定抗病毒活性是否仅依赖于肽的正电荷，设计了与P9R(+5.6)具有相同正电荷的肽P9RS(+5.6)，但P9RS与P9R有30个氨基酸中的11个不同。P9RS高效抑制宿主内体酸化至与活细胞中的P9R相似的程度(数据未显示，和图2A)。然而，在噬斑减少测定中，用甚至25μg mL^-1的P9RS处理病毒时，SARS-CoV-2和A(H1N1)pdm09病毒的噬斑数量也没有显著减少(图2B)。

为了研究为何尽管有力抑制宿主内体酸化，P9RS未能抑制病毒复制，研究了肽和病毒之间的结合。使用ELISA-RT-qPCR测定，P9R和PA1可以高效地与SARS-CoV-2和A(H1N1)pdm09病毒结合，但P9RS不与SARS-CoV-2和A(H1N1)pdm09病毒结合(图2C)。通过共聚焦显微镜在H1N1感染的细胞中进一步证实了P9R而不是P9RS与病毒结合的观察结果(数据未显示)。因此，带正电荷的肽P9R的抗病毒活性需要肽与病毒的直接相互作用。相比之下，不具有与病毒结合能力的P9RS不能抑制病毒复制，即使它携带与P9R相同的正电荷并抑制宿主内体酸化。

P9R的广谱抗病毒活性依赖于靶向病毒以抑制病毒-宿主内体酸化

上述实验表明，P9R和P9RS可以抑制无病毒内体酸化(数据未显示，和图2A)。然而，在不与病毒结合的情况下，P9RS不能抑制病毒复制。为了说明这一结果，其他研究表明P9R和巴弗洛霉素A1可以高效抑制感染的活细胞中的病毒-宿主内体酸化，但P9RS不能抑制感染的活细胞中的病毒宿主内体酸化(图3a)，即使P9R和P9RS两者均可以抑制无病毒内体的内体酸化(数据未显示)。P9R对病毒-宿主内体酸化的高效抑制可能是由于P9R与病毒结合(数据未显示，和图2C)，然后抑制病毒-宿主内体酸化(数据未显示)。由于缺乏与病毒的结合能力(数据未显示，和图2E)，P9RS不能高效地与病毒一起进入内体以抑制病毒-宿主内体酸化，这可能是因为内体中病毒的存在阻止了未结合的P9RS进入内体。内体中没有病毒，无病毒内体中有空的空间以允许P9RS自由进入内体以阻止内体酸化(数据未显示)。需要注意的是，与P9R序列相似的PA1可以高效地与SARS-CoV-2和A(H1N1)pdm09病毒结合(图2C)，但其显著失去对SARS-CoV-2和A(H1N1)pdm09病毒的抗病毒活性(图2B)。当用PA1预处理病毒时，P9R与SARS-CoV-2和A(H1N1)pdm09病毒的结合可以显著降低(图3A)。这指明PA1具有与P9R在病毒颗粒上相同的结合位点，但仅单独的肽与病毒的结合不能解释抗病毒活性。P9R与病毒结合是发挥抗病毒活性的第一步。与病毒结合后(数据未显示)，P9R可以高效抑制病毒-宿主内体酸化(数据未显示)，然后通过阻断RNP释放来抑制病毒复制(数据未显示)。

为了进一步证实P9R的广谱抗病毒活性是由于P9R与不同病毒和病毒蛋白的广泛结合，另外的研究表明P9R而不是P9RS也可以与MERS-CoV、A(H7N9)病毒、鼻病毒、SARS-CoV和病毒蛋白结合(图3B-3D和图3E)。这一结果进一步证实，如果其能够与病毒结合则带正电荷的P9R可以抑制pH依赖性内体病毒。

接下来，使用NMR光谱进行研究以确定P9R的结构。结果表明，P9R的溶液结构是柔性的，具有短的可变螺旋斑(patch)并具有带正电荷的肽表面(数据未显示)。不受理论束缚，P9R可以广泛地与不同的病毒结合，因为这些具有柔性连接的短α-螺旋斑可能允许它调整其结构以适应不同病毒蛋白的结合口袋。综上所述，本研究证明了新的抗病毒机制，即带正电荷的P9R需要靶向病毒然后阻止病毒-宿主内体酸化以抑制pH依赖性病毒的复制。

在体内P9R治疗的功效

研究表明，在体外P9R的高效抗病毒活性依赖于与病毒的结合以及P9R的正电荷以抑制病毒-宿主内体酸化。为了进一步研究在体内P9R的抗病毒活性，A(H1N1)pdm09感染的小鼠在感染后6h在接下来的一天用另外的两剂处理。在该模型中，80％的P9R处理小鼠存活，其显著优于PBS处理组和PA1处理组(图4A)。P9R对感染小鼠的保护与扎那米韦处理组相同(80％)并且优于P9。从感染后第4天到第10天，P9R组的体重减轻显著少于PBS处理组和PA1处理组(图4B)。P9R对感染小鼠的低剂量保护(25μg/剂和12.5μg/剂)和减少的体重减轻进一步表明，与PBS处理组相比，P9R可以显著保护小鼠(图4C和4D)。P9R在体内的抗病毒活性优于P9(图4C，对于12.5μg/剂P<0.05)，这与在体外P9R的抗病毒活性显著优于P9一致。

在P9R存在下病毒连续传代后未出现对P9R的抗性病毒

抗性突变体的出现时有发生¹⁴，尤其是用新的聚合酶抑制剂巴洛沙韦²⁹。为了确定P9R处理是否诱导病毒抗性，A(H1N1)pdm09病毒在P9R存在下在MDCK细胞中连续传代40次(图5A)。A(H1N1)pdm09病毒在扎那米韦存在下连续传代作为抗性测定的对照(图5A)。扎那米韦对亲本A(H1N1)pdm09病毒(P0)的IC₅₀为35nM(图5B)。在扎那米韦(100nM)存在下10次病毒传代和在扎那米韦(1000nM)存在下另外5次病毒传代后，2000nM和8000nM扎那米韦不能分别抑制P10和P15病毒复制(图5C)。这些表明在扎那米韦存在的情况下病毒传代10次后对扎那米韦产生了显著的病毒抗性。然而，对于P9R，即使在P9R存在下A(H1N1)pdm09病毒进行40次传代(5.0μg mL^-1P9R用于最初的10代，50.0μg mL^-1P9R用于剩余的30代)，P9R(5.0μgmL^-1)可以高效抑制P30和P40病毒复制(图5D)。未检测到对P9R明显的药物抗性病毒。这些结果表明P9R引起药物抗性病毒的可能性非常低。

讨论

在本研究中，确定了对包膜冠状病毒(SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV)、流感病毒和无包膜鼻病毒具有有力抗病毒活性的广谱抗病毒肽P9R。首先，研究表明P9R的抗病毒活性可以通过增加净正电荷来显著增强，从而更高效地抑制内体酸化。其次，机理研究进一步证明了新型抗病毒机制，即带正电荷的P9R可以与不同的呼吸系统病毒结合以抑制病毒-宿主内体酸化。PA1(仅与病毒结合)或P9RS(仅抑制内体酸化)没有显示出抗病毒活性。机理研究表明，带正电荷的P9R通过与不同病毒结合然后抑制病毒-宿主内体酸化以阻止pH依赖性病毒的内体释放，从而广泛抑制病毒复制。P9R(不仅与病毒结合，还抑制内体酸化)、PA1(仅与病毒结合)和P9RS(仅抑制内体酸化)用于鉴定和确认碱性肽的新型抗病毒机制。第三，通过保护小鼠免受致死流感病毒攻击证明了P9R的体内抗病毒活性。碱性肽的抗病毒活性可以通过增加肽的正电荷来增强，并且需要与病毒结合和抑制内体酸化两者。第四，连续传代病毒(40代)对P9R的易感性没有降低。

内体酸化是许多pH依赖性病毒生命周期中的关键步骤，是广谱抗病毒靶标之一⁹。在本研究中，随着P9R中正电荷的增加，它可以比P9更高效地抑制pH依赖性病毒。P9R中更多的正电荷允许该肽更高效地中和内体内的质子，从而抑制内体酸化。在之前的研究中，已证明临床批准的具有抑制内体酸化活性的抗疟疾药物氯喹抑制肠道病毒-A7³⁰、寨卡病毒³¹和SARS-CoV-2³²。抗寄生物药氯硝柳胺也可以通过干扰内体酸化抑制流感病毒、鼻病毒和登革热病毒^33,34。然而，研究人员证明在体内氯喹缺乏对治疗流感病毒和埃博拉病毒的保护^35,36。与这些药物通过干扰宿主内体酸化而不靶向病毒不同，P9R通过与病毒结合并随后抑制病毒-宿主内体酸化抑制病毒复制，这允许P9R选择性并高效地抑制内体病毒。P9R对A(H1N1)感染小鼠的保护进一步证实了体内抗病毒效率。

P9R的抗病毒活性需要与病毒结合和抑制内体酸化。带较少正电荷的PA1不能抑制SARS-CoV-2和H1N1病毒，即使它具有与P9R相似的对病毒的结合能力和结合位点(图3b)。当在P9R上进行多个取代以产生P9RS时，即使P9RS具有与P9R相同的正电荷并高效抑制宿主内体酸化，P9RS失去对所有测试病毒的结合能力和抗病毒活性。虽然不受理论束缚，P9R与不同病毒蛋白的广泛结合机制可能是由于P9R带正电荷表面的柔性结构(图3h)。柔性结构可能允许P9R改变其结构以适应靶向蛋白以便广泛特异性结合³⁷,³⁸，并且P9R的正电荷可能在与表面带负电荷的病毒结合中发挥作用^39,40。P9R中的五个半胱氨酸也可能影响基于结构的结合，因为之前的研究表明半胱氨酸取代可能影响防御素肽的结构和活性^41,42。

此外，与在扎那米韦存在下经过10次病毒传代后引起显著病毒抗性的扎那米韦相比，即使A(H1N1)pdm09病毒在P9R存在下传代40次，P9R显示出非常低的引起药物抗性病毒的风险。

总之，大多数高致病性新出现的病毒是内体pH依赖性病毒。新出现和再次出现的病毒爆发提醒我们迫切需要广谱抗病毒药物。本研究提供了一种此类广谱抗病毒药物。

可以通过以下编号的段落进一步理解所公开的组合物和方法。

1.抗病毒剂，其包含P9R(SEQ ID NO:2)或衍生自P9R的P9R样肽。

2.段落1所述的抗病毒剂，其中所述P9R样肽的特征在于所述P9R样肽抑制内体酸化并保持病毒结合，如通过体外内体酸化，任选地与对照相比，以及肽-病毒结合测定法所确定的。

3.段落1或2所述的抗病毒剂，其由P9R(SEQ ID NO:2)组成。

4.段落1-3中任一项所述的抗病毒剂，其中所述抗病毒剂具有至少5的净正电荷。

5.段落1-4中任一项所述的抗病毒剂，其中所述抗病毒剂具有约5.6的净正电荷。

6.段落1-5中任一项所述的抗病毒剂，其中所述抗病毒剂具有5.6的净正电荷。

7.组合物，其包含治疗有效量的段落1-6中任一项所述的抗病毒剂和药学上可接受的载体。

8.段落7所述的组合物，其中所述抗病毒剂在受试者体内抑制抗病毒复制。

9.段落7或8所述的组合物，其中所述组合物是单位剂型。

10.段落9所述的组合物，其中所述单位剂型选自片剂或胶囊。

11.段落7所述的组合物，其呈适合于鼻内或肺部递送的形式。

12.段落9所述的组合物，其中所述单位剂型是可注射的，其中所述组合物进一步包含用于向人注射的药学上可接受的载体。

13.在有需要的受试者中治疗病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的段落1-6中任一项所述的抗病毒剂或段落7-12中任一项所述的组合物。

14.段落13所述的方法，其中所述感染由呼吸系统病毒引起。

15.段落13或14所述的方法，其中所述感染由需要内体酸化以进行病毒-宿主膜融合的pH依赖性病毒引起。

16.段落13-15中任一项所述的方法，其中所述组合物经胃肠外或口服施用。

17.段落13-15中任一项所述的方法，其中所述组合物经鼻内施用或通过肺部施用。

18.段落13-17中任一项所述的方法，其中所述感染由寨卡病毒、肠道病毒-A7、埃博拉病毒、流感病毒、SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、A(H1N1)pdm09病毒、禽流感A(H7N9)病毒和无包膜鼻病毒引起。

本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的等同方案。此类等同方案旨在被以下权利要求所涵盖。

应当理解，本公开的方法和组合物不限于所述的特定的方法、方案和试剂，因为这些可能不同。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求限制。

必须指出，如本文以及在所附权利要求中使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。

在本说明书的整篇描述和权利要求书中，词语“包含”和词语的变体，诸如“包括”和“含有”意思是“包括但不限于”，并且不旨在排除，例如其他添加剂、组分、整数或步骤。

“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件、情况或材料可能或可能不发生或存在，并且该描述包括事件、情况或材料发生或存在的情况以及其不发生或不存在的情况。

范围在本文中可以表示为从“约”一个特定值，和/或至“约”另一个特定值。当表达此类范围时，还具体设想和考虑公开的是从一个特定值和/或至另一个特定值的范围，除非上下文另有明确说明。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，会理解该特定值形成另一个具体设想的实施方案，该实施方案应被视为公开，除非上下文另有明确说明。还将进一步理解，每个范围的端点相对于另一个端点和独立于另一个端点都是重要的，除非上下文另有明确说明。应当理解，包含在明确公开范围内的所有单个值和值的子范围也被具体设想并且应该被认为是公开的，除非上下文另有明确说明。最后，应当理解，所有范围都将所列举的范围称为范围和从(且包括)第一端点至(且包括)第二端点的各个数字的集合。在后一种情况下，应该理解，可以选择任何个体数字作为该范围所指的数量、值或特征的一种形式。以这种方式，范围描述了从(且包括)第一端点到(且包括)第二端点的数字或值集，从中可以选择集的单个成员(即单个数字)作为范围所指的数量、值或特征。无论在特定情况下是否明确公开了这些实施方案中的一些或全部，上述内容都适用。

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属领域的技术人员普遍理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些相似或等效的任何方法和材料可以用于本方法和组合物的实践或测试，但特别有用的方法、装置和材料如所述。本文引用的出版物和它们所引用的材料在此通过引用具体并入。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权因在先发明而早于此类公开。不承认任何参考构成现有技术。参考文献的讨论说明了作者的主张，并且申请人保留质疑引用文件的准确性和相关性的权利。将清楚地理解，尽管本文提到了许多出版物，但此类引用并不构成承认这些文件中的任何一篇构成本领域公知常识的一部分。

尽管对材料、组合物、组分、步骤、技术等的描述可能包括许多选择和替代方案，这不应被解释为并且不是承认此类选择和替代方案彼此等效，或者特别地，是显而易见的替代方案。因此，例如不同部分的列表并不表明列出的部分彼此之间是显而易见的，也不是对等效或显而易见的承认。

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序列表

<110> 香港大学

<120> 抗病毒肽的组合物及其使用方法

<130> IP00937

<150> US 62/991,407

<151> 2020-03-18

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P9肽

<400> 1

Asn Gly Ala Ile Cys Trp Gly Pro Cys Pro Thr Ala Phe Arg Gln Ile

1 5 10 15

Gly Asn Cys Gly His Phe Lys Val Arg Cys Cys Lys Ile Arg

20 25 30

<210> 2

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P9R肽

<400> 2

Asn Gly Ala Ile Cys Trp Gly Pro Cys Pro Thr Ala Phe Arg Gln Ile

1 5 10 15

Gly Asn Cys Gly Arg Phe Arg Val Arg Cys Cys Arg Ile Arg

20 25 30

<210> 3

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA1肽

<400> 3

Asn Gly Ala Ile Cys Trp Gly Pro Cys Pro Thr Ala Phe Arg Gln Ile

1 5 10 15

Gly Asn Cys Gly His Phe Lys Val Arg Cys Cys Lys Ile Arg Asp Glu

20 25 30

Asp

<210> 4

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P9RS肽

<400> 4

Asn Gly Ala His Ser Trp His Pro Asn Glu Thr His Phe Arg Gln Ile

1 5 10 15

His Asn Ser Gly Arg His Arg Val Arg Ser His Arg Ile Arg

20 25 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SARS-CoV-2的引物序列

<400> 5

cctactaaat taaatgatct ctgctttact 30

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SARS-CoV-2的引物序列

<400> 6

caagctataa cgcagcctgt a 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MERS-CoV的引物序列

<400> 7

caaaaccttc cctaagaagg aaaag 25

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MERS-CoV的引物序列

<400> 8

gctcctttgg aggttcagac at 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SARS-CoV的引物序列

<400> 9

accagaatgg aggacgcaat 20

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SARS-CoV的引物序列

<400> 10

gctgtgaacc aagacgcagt attat 25

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H1N1的引物序列

<400> 11

cttctaaccg aggtcgaaac g 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H1N1的引物序列

<400> 12

ggcattttgg acaaakcgtc ta 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H7N9的引物序列

<400> 13

cttctaaccg aggtcgaaac g 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H7N9的引物序列

<400> 14

ggcattttgg acaaakcgtc ta 22

<210> 15

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼻病毒的引物序列

<400> 15

agccygcgtg gckgcc 16

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼻病毒的引物序列

<400> 16

agccygcgtg gtgccc 16

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼻病毒的探针序列

<400> 17

tccggcccct gaatgyggct aa 22

Claims (18)

1.抗病毒剂，其包含P9R(SEQ ID NO:2)或衍生自P9R的P9R样肽。

2.权利要求1所述的抗病毒剂，其中所述P9R样肽的特征在于所述P9R样肽抑制内体酸化并保持病毒结合，如通过体外内体酸化，任选地与对照相比，以及肽-病毒结合测定法所确定的。

3.权利要求1或2所述的抗病毒剂，其由P9R(SEQ ID NO:2)组成。

4.权利要求1-3中任一项所述的抗病毒剂，其中所述抗病毒剂具有至少5的净正电荷。

5.权利要求1-4中任一项所述的抗病毒剂，其中所述抗病毒剂具有约5.6的净正电荷。

6.权利要求1-5中任一项所述的抗病毒剂，其中所述抗病毒剂具有5.6的净正电荷。

7.组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-6中任一项所述的抗病毒剂和药学上可接受的载体。

8.权利要求7所述的组合物，其中所述抗病毒剂在受试者中抑制抗病毒复制。

9.权利要求7或8所述的组合物，其中所述组合物是单位剂型。

10.权利要求9所述的组合物，其中所述单位剂型选自片剂或胶囊。

11.权利要求7所述的组合物，其呈适合于鼻内或肺部递送的形式。

12.权利要求9所述的组合物，其中所述单位剂型是可注射的，其中所述组合物进一步包含用于向人注射的药学上可接受的载体。

13.在有需要的受试者中治疗病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-6中任一项所述的抗病毒剂或权利要求7-12中任一项所述的组合物。

14.权利要求13所述的方法，其中所述感染由呼吸系统病毒引起。

15.权利要求13或14所述的方法，其中所述感染由需要内体酸化以进行病毒-宿主膜融合的pH依赖性病毒引起。

16.权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述组合物经胃肠外或口服施用。

17.权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述组合物经鼻内施用或通过肺部施用。

18.权利要求13-17中任一项所述的方法，其中所述感染由寨卡病毒、肠道病毒-A7、埃博拉病毒、流感病毒、SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、A(H1N1)pdm09病毒、禽流感A(H7N9)病毒和无包膜鼻病毒引起。

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