JP4683844B2 - インフルエンザウイルス感染予防剤 - Google Patents

Description

本発明は、生体内において、自然免疫（または、先天性免疫：innate immunity）を増強させることにより、インフルエンザウイルスからの感染を予防する薬剤に関わり、さらには、インフルエンザウイルスによる感染から予防するための当該薬剤の使用方法に関する。

インフルエンザ（influenza）は、呼吸気道の粘膜上皮へのインフルエンザウイルスが感染することによって発症する呼吸器疾患であり、わが国では毎年冬に流行が起こり、高齢者での肺炎ならびに若年者での重篤な脳症が致死的であり、社会的な問題となっている疾患である。

インフルエンザウイルスは増殖が早いものであり、感染後数日で発症するために、インフルエンザウイルスからの罹患を防ぐためには、予めワクチンを接種し、インフルエンザウイルスへの抗体反応によるウイルス感染を阻止するか、あるいは生体の免疫力自体を高めておく必要がある。現在わが国では、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（赤血球凝集素：hemagglutinin:ＨＡ）を主成分としたエーテル処理不活化ワクチンを用いて、インフルエンザウイルス感染予防に一定の効果が得られているものの、遺伝因子の多型性により、ワクチンが必ずしも著効するとは限らない問題がある。

また、インフルエンザワクチンの生産面においても、発育鶏卵を用いて製造しているため、ウイルスの変異株に合わせた短期間での大量生産が不可能であり、流行株の予測が外れた場合などには対応できない問題点がある。さらに、鶏卵に対してアレルギーを有するヒトへの投与は危険を伴うものでもある。例えば、１９９７年に香港で発生し、瞬く間に流行し、多くの死者を出した、ヒトに対する強毒型の鳥型のインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１では、鶏卵での増殖が困難であり、したがってインフルエンザワクチンの調製が不可能であった例もある。

そこで、安全であり、しかも低コストでインフルエンザウイルスからの感染を防御する方法の開発が望まれているが、これまでかかる問題に直接的に応えた感染予防方法は提案されていない。

インフルエンザウイルスからの感染予防の方法の一つとして、従来の獲得免疫を引き起こすワクチンの他に、自然免疫（先天性免疫：innate immunity）を増強させて、ウイルス感染を防御する方法が考えられる。

本発明者等は、上記問題点に鑑み、インフルエンザウイルスの変異株に対しても広く予防し得る手段として、生体における自然免疫（先天性免疫）を増強させることに着目した。その一つとして、生体における自然免疫の増強を担う生体内抗菌ペプチドと呼ばれる物質の分泌に注目した。

この生体内抗菌ペプチドは、免疫反応を担う宿主由来の防御物質と把握することができるものであり、生体には本来的に、外来異物（細菌、ウイルス）の進入に対する保護を行うため、先天的な免疫反応のメカニズムが備わっている。この場合の先天的な免疫反応（Innate Immune Response）の構成要素の一つとして、生体由来の抗菌ペプチドの分泌、通常は、デフェンシン類の分泌が挙げられる（非特許文献１）。

すなわち、生体の免疫的な防御機構として、細菌、ウイルス感染等の危険性が生じた場合には、デフェンシンなどいくつかのタイプの抗菌ペプチドが上皮細胞表面において産生され、この抗菌ペプチドが、病原体となり得るものに対する先天性免疫のエフェクターとして作用していることが知られている。
R.I. Lehrer, et al., Cell, 64, 229-230(1991)

ところでこのような生体内抗菌ペプチドの分泌が、アミノ酸のなかでも分枝鎖を有する必須アミノ酸であるロイシン、イソロイシンまたはバリンを投与することにより促進されることが知られている。そこで本発明者等はかかる分枝鎖を有する必須アミノ酸によるインフルエンザウイルス感染を抑制する先天性免疫（innate immunity）の誘導を検討したところ、分枝鎖必須アミノ酸のなかでもイソロイシンが特異的に先天性免疫を誘導し、インフルエンザウイルス感染を抑制することを見出し、本発明を完成させるに至った。

したがって本発明は、かかる検討結果に基づき完成されたものであり、生体において先天性免疫（innate immunity）の誘導を生じさせることにより、インフルエンザウイルスからの感染予防剤を提供すること、さらに、かかる感染予防のため、イソロイシンの使用方法を提供することを課題とする。

しかして本発明の基本的態様である請求項１に記載の発明は、イソロイシンを有効成分として含有するインフルエンザウイルス感染予防剤である。

そのなかでも、より具体的な請求項２に記載の発明は、請求項１記載の発明において、かかる予防剤が、鼻腔内投与剤形である感染予防剤である。
すなわち、インフルエンザは、呼吸気道の粘膜上皮にウイルス感染することによって生じる急性の呼吸器疾患であることより、特に鼻腔内粘膜への感染が問題とされることが多い。したがって、かかる鼻腔内にイソロイシンを投与することにより、インフルエンザウイルスの感染をより効果的に予防し得るものである。

また、本発明の別の基本的態様である請求項３に記載の発明は、インフルエンザウイルスによる感染症を予防するために、イソロイシンを投与することからなる生体での先天性免疫（innate immunity）を増強させる方法である。

すなわち本発明は、イソロイシンである分枝鎖必須アミノ酸を投与することで生体抗菌ペプチド、例えばデフェンシンの分泌を誘導し、粘膜や上皮の防御バリヤーを増強し、インフルエンザウイルスからの感染を予防するために先天性免疫（innate immunity）を増強させるこという、全く新しい方法を提供する点に特徴を有するものである。

本発明が提供するイソロイシンを有効成分として含有するインフルエンザウイルス感染予防剤により、生体にウイルスの感染に対する先天性免疫（innate immunity）を増強させることができる。したがって、増強された先天性免疫により効果的なインフルエンザウイルス感染予防を行うものであり、極めて安全なものであり、インフルエンザの流行に左右されることが無く、効果的にインフルエンザからの感染を防止することができる。
また、インフルエンザワクチンの投与を行うことなくインフルエンザからの感染を防御し得るものであり、ワクチンによる副作用等の発生を回避し得る利点を有している。

本発明は上記したように、生体における先天的免疫能を発揮する抗菌ペプチドの分泌を誘発させ、先天性免疫（innate immunity）を増強させることによりインフルエンザウイルスからの感染を予防する予防剤である。

本発明が提供するインフルエンザウイルス感染予防剤を投与するにあたっては、その有効成分であるイソロイシン含有する組成物を、経口的あるいは非経口的に投与することで行い得る。

その含有量は特に限定されるものではなく、生体に投与することにより、先天性免疫応答を増強させ、その結果インフルエンザウイルスからの感染を予防するに十分な量を投与すればよい。なお、本発明が提供する予防剤の有効成分であるイソロイシンは、必須アミノ酸の一種であり、その安全性は十分確認されていることより、ある程度過剰量を投与しても、何ら悪影響をあたえるものではない。

例えば、経口的に投与する場合には、適宜他の製剤用担体、例えば、デンプン、乳糖、白糖、結晶セルロース、リン酸水素カルシウム等の賦形剤；アカシア、ヒドロキシプロピルセルロース、アルギン酸、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等の結合剤；ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク等の滑沢剤；加工デンプン、カルシウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の崩壊剤、カルボキシビニルポリマー等と共に、製剤学的に汎用されている経口投与製剤である錠剤、顆粒剤、カプセル剤、あるいは散剤等の形態に製剤化することができる。

また、非経口的に投与する場合には、経鼻投与による鼻腔内投与が特に好ましく、その場合の剤形としては、液剤によるスプレー投与、微粉末製剤によるスプレー投与等が挙げられる。また、注射剤の形態で投与することができる。液剤として調製する場合には、適宜蒸留水、低級アルコール、多価アルコール等の有機溶媒、さらには適宜界面活性剤等と共にイソロイシンを溶解し、液剤として調製することができる。

特に、インフルエンザは、呼吸気道の粘膜上皮におけるウイルス感染することによって生じる急性の呼吸器疾患であり、鼻腔内粘膜を通して感染されることが問題とされる。したがって、本発明が提供するインフルエンザウイルス感染予防剤は、かかる鼻腔内に投与することにより、効果的にインフルエンザウイルスの感染を予防し得るものであり、かかる剤形としては、有効成分であるイソロイシンの水溶液をスプレーにより鼻腔内に投与し得る剤形とするのが好ましく、鼻腔内投与と経口投与の併用を用いることも可能である。

以下に本発明が提供する、有効成分であるイソロイシンによるインフルエンザウイルスの感染防御の実際を、マウスを用いた試験検討で行い、その結果を説明することにより、本発明をさらに詳細に説明する。

試験例１：イソロイシンの経鼻接種によるインフルエンウイルス感染防御検討
［材料と方法］
試験動物：Ｂａｌｂ／ｃマウス；雌性６週齢
ウイルス：インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１(Ａ／ＰＲ８)株
薬剤：
イソロイシン：イソロイシン粉末を蒸留水で溶解し、使用した。
ロイシン：ロイシン粉末を蒸留水で溶解し、使用した。

試験−１：イソロイシン投与後の日数と、インフルエンザ防御効果の検討
マウスを、インフルエンザウイルスＰＲ８（Ｎ１Ｈ１）の１×１０^３pfuのウイルス量で感染させた。感染処理前１、５および９日前に、イソロイシン１００μｇ／ｍＬの溶液を、２．２μＬ／鼻腔の用量（０．２２μｇ）で経鼻投与し、その感染防御効果を、ウイルス感染３日後の鼻腔洗浄液中のウイルス価で判定した。
判定には、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラーク法を用いた。なお、コントロールとして、ロイシン投与群、および無処置群を設けた。

結果
その結果を表１にまとめて示した。

表１に示したように、インフルエンザウイルス感染前にイソロイシンの１００μｇ／ｍＬ溶液を２．２μＬ／鼻腔内の用量で経鼻投与し、インフルエンザウイルスＰＲ８（Ｎ１Ｈ１）を、ウイルス量１×１０^３ｐｆｕを１．２μＬで接種したマウスでは、１日前の投与群で、最もウイルス価の抑制が認められた。しかしながらその効果は、鼻腔洗浄液中のウイルス価をコントロール群の１０^４．９ｐｆｕ／ｍＬを１０^３．５ｐｆｕ／ｍＬに下げる程度のものでしかなかった。
なお、コントロールのロイシン投与グループでは、１０^４．２ｐｆｕ／ｍＬと抑制の効果はほとんど認められないものであった。

試験−２：イソロイシン投与後の日数と、インフルエンザ防御効果の持続時間の検討
マウスを、インフルエンザウイルスＰＲ３８（Ｎ１Ｈ１）の１×１０^２ＰＦＵ量および１×１０^３ＰＦＵ量で感染させ、感染処理前６時間、１、３および７日前にイソロイシン１００μｇ／ｍＬの溶液を５μＬ／鼻腔内（投与量：０．５μｇ）投与し、そのインフルエンザウイルスの感染防御効果を、鼻腔内洗浄液中のウイルス価で判定した。判定には、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラーク法を用いた。なお、コントロールとして、無処置群を設けた。
その結果を表２にまとめて示した。

表２から明らかなように、インフルエンザウイルス感染前にイソロイシンの１００μｇ／ｍＬ溶液を５μＬ／鼻腔内の用量で経鼻投与し、インフルエンザウイルスＰＲ８（Ｎ１Ｈ１）１×１０^２ＰＦＵ量を感染させたマウスでは、ウイルス価の抑制が１日効果的に継続していることが判明した。
なお、インフルエンザウイルスＰＲ８（Ｎ１Ｈ１）１×１０^３ＰＦＵ量を感染させたマウスでは、この投与量では感染を防御することはできなかった。しかしながら、自然界のインフルエンザウイルス感染を考えると、１×１０^２ｐｆｕのウイルス価の感染を予防できることは、充分実用に耐え得る値であるといえる。

試験−３：イソロイシン投与後の時間とインフルエンザ防御効果の検討
インフルエンザウイルスの感染処置６時間前、または９時間前、ならびに６時間前および９時間前の両時間に、イソロイシンの１００μｇ／ｍＬ溶液を５．０μＬ／鼻腔内の用量（０．５μｇ）で経鼻投与し、感染処置３日後の鼻腔内洗浄液中のウイルス価で判定した。判定には、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラーク法を用いた。
コントロール群として無処置の群を設けた。

結果
その結果を表３に示した。

表３に示したように、インフルエンザウイルス感染前６時間前および９時間前にイソロイシン１００μｇ／ｍＬ溶液を５μＬ／鼻腔内投与用量（投与量：０．５μｇ）で経鼻投与することにより、鼻腔でのウイルス増殖を抑制することができていることが判明する。この抑制は、感染６時間前のイソロイシンの投与で顕著なものであった。なお、感染６時間前および９時間前の２回投与では抑制が認められなかった。

試験−４：イソロイシンによるインフルエンザウイルス感染防護に与えるチャレンジウイルスのウイルス価の影響の検討
各群５匹のマウスを使用し、チャレンジウイルスのウイルス価を、１×１０^４ｐｆｕ、１×１０^３ｐｆｕ、１×１０^２ｐｆｕと変化させて、イソロイシン１００μｇ／ｍＬ溶液を５μＬ／鼻腔内投与用量で鼻腔内投与し、その感染防御効果を、感染３日後の鼻腔洗浄液中のウイルス価で判定した。判定には、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラーク法を用いた。なお、コントロールとして、ロイシン投与群、および無処置群を設けた。

結果
その結果を表４にまとめて示した。

各群５匹のマウスを用いて、各薬剤を鼻腔内投与前６時間前に、１００μｇ／ｍＬのインフルエンザウイルス（ＰＲ８／Ｈ１Ｎ１）を各鼻に１．２μＬの接種を行った。ウイルスの希釈は、１×１０^３ｐｆｕが２０μＬで投与時にウイルス価４０ＬＤ_５０に相当する。表４に示した結果からも判明するように、ウイルス価１×１０^４ｐｆｕではイソロイシンの投与によりウイルス増殖抑制はほとんど認められないが、１×１０^３，１×１０^２ｐｆｕのウイルス価で感染していくと、ウイルス増殖抑制効果が現れ、１×１０^２ｐｆｕのウイルス価においては、１０^３．４ｐｆｕを１０^０．１ｐｆｕと、ほぼ検出できない値までの顕著なウイルス増殖抑制効果が観察された。
自然界のインフルエンザウイルス感染を考えると、１×１０^２ｐｆｕのウイルス価の感染を予防できることは、充分実用に耐え得る値であるといえる。

試験例２：Ａ型インフルエンザウイルス／Ｂ型インフルエンザウイルス感染に対する防御効果
Ａ型インフルエンザウイルスとしてA/Guizhouウイルスを、Ｂ型インフルエンザウイルスとしてB/Ibarakiウイルスにより経鼻感染させ、同時にイソロイシン１００μｇ／ｍＬ溶液を５μＬ／鼻腔内投与用量（投与量：０．５μｇ）で経鼻投与し、そのインフルエンザウイルスの感染防御効果を、鼻腔内洗浄液中のウイルス価で判定した。なお、対照としてＡ型インフルエンザウイルスであるA/Guizhouウイルス、およびＢ型インフルエンザウイルスであるB/Ibarakiウイルスを単独経鼻感染した群をおいた。判定には、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラーク法を用いた。
その結果を表５に示した。

表中の結果からも判明するように、ウイルス感染と共にイソロイシンを経鼻投与することにより、Ａ型インフルエンザウイルスであるA/Guizhouウイルス、およびＢ型インフルエンザウイルスであるB/Ibarakiウイルス共にその感染が抑制されており、特に、Ａ型インフルエンザウイルスであるA/Guizhouウイルスの感染の抑制が顕著であることが判明した。

試験例３：イソロイシンの経鼻投与による、抗菌ペプチドであるデフェンシン類の分泌の確認
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、イソロイシン１００μｇ／ｍＬの溶液を５μＬ／鼻腔内投与用量（投与量：０．５μｇ）で経鼻投与し、投与後０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５および５時間後の気管支組織における生体内抗菌ペプチドであるβ−デフェンシン遺伝子の発現を、常法によりＰＣＲ−電気泳動法により検討した。
なお、対照として、経鼻投与しなかったマウスの気管支組織における発現も検討した。
その結果を図１に示した。図から判明するように、イソロイシンの経鼻投与後において、生体内抗菌ペプチドであるβ−デフェンシン遺伝子として、β−デフェンシン１遺伝子は投与後４．５時間においても確認され、β−デフェンシン２遺伝子、β−デフェンシン３遺伝子およびβ−デフェンシン３ファミリー遺伝子の発現は、投与後４時間においても確認された。
したがって、本発明のイソロイシンを有効成分とするインフルエンザウイルス感染予防剤により、効果的に自然免疫が獲得されていることが確認された。

試験例４：イソロイシンの経口投与によるインフルエンウイルス感染防御検討
［材料と方法］
試験動物：Ｂａｌｂ／ｃマウス；雌性６週齢
ウイルス：インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１(Ａ／ＰＲ８)株
薬剤：
イソロイシン：イソロイシン粉末を蒸留水で溶解し、使用した。

マウスを、インフルエンザウイルスＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）の１×１０^３ｐｆｕのウイルス量で感染させた。感染処理前に、イソロイシンを経口投与し、その感染防御効果を、ウイルス感染３日後の鼻腔洗浄液中のウイルス価で判定した。
イソロイシンの経口投与に当たっては、イソロイシン１０ｍｇ／ｍＬの溶液（原液）１００μＬ投与群、原液を１０倍希釈した溶液１００μＬ投与群、および原液を１００倍希釈した溶液１００μＬ投与群をおいた。
判定には、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラーク法を用いた。なお、コントロールとして、無処置群（無投与群）を設けた。

結果
その結果を表６に示した。

表中に示した結果からも判明するように、イソロイシン原液（１０ｍｇ／ｍＬ）を１００μＬ経口投与した群では、インフルエンザウイルスＰＲ８（Ｎ１Ｈ１）を、ウイルス量１×１０^３ｐｆｕを１．２μＬで接種したマウスにおいてウイルス価の抑制が認められ、イソロイシンの経口投与によるインフルエンザウイルスの感染予防が確認された。

製剤例１：鼻腔内スプレー剤
イソロイシン５ｇを注射用蒸留水２００ｍＬに溶解し、鼻腔内スプレー用の液剤を得た。
本液剤を、１日適宜の回数鼻腔内にスプレーし、投与する。

製剤例２：顆粒剤
組成：
イソロイシン ３００ｇ
乳糖 １３４ｇ
結晶セルロース ２０ｇ
トウモロコシ澱粉 ２０ｇ
３％ヒドロキシプロピルメチルセルロース水溶液 １００ｍＬ

製法：
イソロイシンに乳糖、結晶セルロースおよびトウモロコシ澱粉を６０メッシュのふるいで篩化し、均一に混合した後、練合機に入れ、３％ヒドロキシプロピルメチルセルロース水溶液を注加して、さらに練合した。次いで１６メッシュのふるいで篩化し、造粒を行い、５０℃で通風乾燥し、顆粒剤とした。

以上記載のように、本発明は、イソロイシンを投与することにより、生体にウイルスの感染に対する先天性免疫（innate immunity）を増強させることにより効果的なインフルエンザウイルス感染予防を行うものであり、安全であり、しかも低コストで予防し得る点から、その医療上の価値は多大なものである。

図１は、試験例３における結果を示す電気泳動写真である。

Claims (2)

1. イソロイシンを有効成分として含有する鼻腔内投与形態にあるインフルエンザウイルス感染予防剤。
2. インフルエンザウイルスによる感染症を予防するための、イソロイシンを有効成分として含有する鼻腔内投与形態にある生体の先天性免疫（innate immunity）増強剤。

Images