KR20060042056A - 세포 및 조직의 파열 방법 - Google Patents

세포 및 조직의 파열 방법 Download PDF

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로버트 벨리
더스틴 헤이스
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베리덱스, 엘엘씨
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Abstract

세포 및/또는 조직을 파열시키는 방법은 샘플이 파열되도록 위치하는 용기의 내부 치수보다 약간만 작은 외부 치수를 갖는 파열 부재를 갖는 파열기를 사용한다. 세포 및/또는 조직을 파열시키기 위한 장치가 또한 제시된다. 당해 장치 및 방법은 핵산의 추출과 같은 과정에서 사용된다.
파열기, 파열 부재, 스테인레스 스틸 비드, RNA 추출

Description

세포 및 조직의 파열 방법{Disruption of cell and tissues}
RNA 발현은 스크리닝, 진단, 예후, 치료학적 모니터링 및/또는 질환 재발의 추적관찰에서 유용한 시험관내 진단 시험의 기초로서 사용될 수 있다. 세포 또는 조직으로부터 추출된, 온전한 비분해 RNA는 RNA 발현의 유효한 측정을 위해 중요하다. RNA 발현은 수많은 유전자가 관여하는 마이크로어레이(microarray) 및 PCR 검정에서 특히 유용하다.
대부분의 RNA 추출 방법에서, RNA는 기계적 수단에 의해 세포로부터 방출된다. 흔히, 이는 구아니디늄 염과 같은 RNA 안정화제의 존재하에 수행된다. 이는 공정 동안 세포 또는 조직으로부터 방출된 RNAase에 의한 RNA 분해를 최소화한다. 생물학적 샘플의 기계적 파열을 위한 장치는 다음의 예시적 미국 특허에 제안되어 있다: 미국 특허 제4,307,846호(Spelsberg); 제5,197,483호(Rogalsy); 제5,840,878호(Collis); 제5,829,696호(DeStefano); 제6,235,501호(Gautsch); 및 제5,567,050호(Zoblinsky). 이러한 장치에서, 부재는 추출하고자 하는 세포 성분을 함유하는 샘플을 마쇄, 분쇄 또는 접촉시키는데 사용한다. 본 명세서 전반에 걸쳐서, 상기 부재는 파열 부재로서 지칭된다. 보다 흔히, 장치는 유리 비드와 같은 비드 또는 볼인 파열 부재를 사용한다.
RNA 추출이 보다 신속하고 보다 효율적이며 보다 생산적이고 자동화에 적합할 수 있도록 세포 및 조직 파열 방법을 개선시켜야 하는 지속적인 요구가 있어 왔다. 이는 수술중(intra-operative) 검정의 경우에 특히 요망된다.
본 발명은 세포 및 조직의 파열 방법이다. 바람직하게는, 본 방법은 기계적 장치의 사용을 포함하며 45초 이내에 수행된다.
본 발명의 다른 측면은 세포 또는 조직 샘플로부터 RNA를 추출하는 방법이다. 바람직하게는, 샘플은 림프절 조직이다. 본 방법에서, 세포 및/또는 조직은 바람직하게는 45초 이내에 기계적으로 파열된다. 이어서, 이러한 파열에 노출된 샘플로부터 세포 파편 및 기타 비-RNA 물질, 예를 들어, 기포가 제거된다. 이어서, RNA가 샘플로부터 추출된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 세포 및 조직 파열용 장치는, 파열 부재가 위치하는 격납 부분을 포함한다. 파열기의 외부 표면(비드의 경우에 원주)의 공간은 격납 부분의 내부 치수(튜브의 경우에 직경)보다 단지 약간만 작다.
본 발명의 가장 바람직한 양태에서, "FASTPREP" 기기(시판원: Qbiogene, Inc., 캘리포니아주 칼스바드 소재)와 같은 기계적 세포 및 조직 파열기가 사용된다. 이러한 파열기는 본원에서 참조로 인용되는 미국 특허 제5,567,050호에 기재되어 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 "O-링" 또는 이의 등가물을 함유하는 2.0ml 스크류-캡 냉동용기 튜브를 사용한다. 조직 약 30mg 내지 400mg을 파열 부재와 함께 튜브내에 위치시킨다. 가장 바람직하게는, 파열기 부재는 BioSpec Products(오클라호마 바텔스빌 소재)로부터 시판되는 비드와 같은, 직경이 6.35mm인 스틸 비드이다. 튜브에, 이 튜브 용적의 약 절반 이상이 되는 용적의 균질화 완충액(예: RLT 완충액, 제조원: Qiagen Corp.)을 첨가한다. 바람직하게는, 2.0ml 튜브를 사용할 경우에 상기 완충액 약 1ml를 첨가한다. 균질화 완충액은 RLT 안정화제, 바람직하게는 구아니디늄 염을 함유한다. 이어서, 파열기를 45초 이하 동안 가동시키고, 샘플을 바람직하게는 미량원심분리기에서 원심분리하여 샘플로부터 세포 파편과 기포를 제거한다. 이어서, 상청액을 경사 분리한다. 바람직하게는, 상청액은 스핀 컬럼으로 옮기고, 상기 컬럼을 상이한 세척 완충액으로 처리하여 RNA를 정제한다. 경우에 따라서는 스핀 컬럼 대신에 용매계 RNA 정제 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 장치는 상기한 바와 같지만, 이전에는 가능하지 않은 방식으로 조직을 신속하고 효율적으로 파열시키는 치수 및/또는 조성의 파열 부재가 제공된 파열기이다. 상기한 바와 같이, 파열 부재는 조직과 접촉되도록 하는 장치의 부분이다. 바람직하게는, 이는 비드이다. 본 발명의 파열 부재는 샘플이 처리되는 용기의 내부 치수보다 단지 약간만 작은 외부 치수를 갖는다. 바람직한 양태에서, 용 기는 내부 치수가 8.28mm인 상기한 바와 같은 튜브이고 파열 부재는 6.35mm 스틸 비드이다. 다른 용기와 파열 부재를 또한 사용할 수도 있는데, 단 이의 내부 및 외부 치수는 유사한 비율이다. 비드의 밀도도 본 발명의 장치의 개선된 성능에 기여한다. 밀도가 7.0g/cm3 이상인 비드가 사용될 수 있지만, 바람직하게는 비드는 밀도가 8.03g/cm3 이상인 스테인레스 스틸로 이루어진다.
실시예
실시예 1. 상이한 비드 크기 및 조성의 평가
상이한 비드 크기 및 물질을 동결된 돼지 림프절 조직을 파열시키는 능력에 대해서 평가하였다. 내부 직경이 8.28mm인 2ml 스크류-캡 튜브(제조원: BioSpec Products, 오클라호마주 바틀스빌 소재)를 사용하였다. 6.35mm(0.25인치) 스테인레스 스틸 비드를 함유하는 튜브[여기서, 튜브마다 1개의 비드가 첨가되었다]를 제외한 각 튜브의 절반을 비드로 충전시시켰다. 동결된 분쇄 돼지 림프절 조직 200 내지 250mg을 튜브마다 첨가하였다. 상기 튜브를 완충액 RLT(제조원: Qiagen, Inc, 캘리포니아주 발렌시아 소재)으로 충전시키고, Mini-Bead Beater 8 기기(입수원: BioSpect Products)를 사용하여 1, 3 또는 5분 동안 균질화시켰다.
다음과 같은 크기와 조성의 비드를 Biospec Products로부터 구입하였다:
O.1mm 직경 지르코니아/실리카(카탈로그 11107901z), O.1mm 직경 유리(카탈로그 11079101), O.5mm 직경 유리(카탈로그 1107905), O.5mm 직경 지르코니아/실리카(카탈로그 110791O5z), 1.0mm 직경 유리(카탈로그 11079110), 2.5mm 직경 지르코 니아/실리카(카탈로그 11079125z), 6.35mm 직경 스테인레스 스틸(카탈로그 11079635ss) 및 6.35mm 직경 유리 비드(110796325).
상기 연구의 결과는 하기 표 1에 제시하며, 다음 스케일로 가시적으로 측정한 바에 의하면 다수의 6.35mm 직경 유리 비드 또는 1개의 6.35mm 스테인레스 스틸 비드의 경우에 최상의 조직 파열을 나타낸다: (1) 불량하게 균질화된 조직, (2) 부분적으로 균질화된 조직 및 (3) 완전히 균질환된 조직.
Figure 112005008419269-PAT00001
실시예 2. 비드 밀도의 효과
실시예 1은 완전한 조직 균질화가 직경이 6.35mm인 파열 부재(비드)를 사용하여 가장 잘 달성됨을 예시한다. 비드 밀도도 또한 균질화의 질에 영향을 준다.
직경이 동일(6.35mm)하지만 밀도가 상이한 비드 간에 비교를 수행하였다. 돼지 림프절 약 225mg을 구아니디늄계 용해 완충액(Qiagen 완충액 RLT 1㎖)와 1개의 세라믹, 유리 또는 스테인레스 스틸의 6.35mm 비드를 함유하는 2ml 스크류-캡 바이알 내에서 파열시켰다. 비드를 함유하는 조직 샘플을 Biospec Bead Beater 8에서 1분, 3분 및 5분 동안 처리하였다. 샘플을 간단히 원심분리하고, 실시예 1에서와 같이 균질화의 질에 대해 가시적으로 평가하였다.
Figure 112005008419269-PAT00002
표 2에는 다음 스케일을 사용하여 가시적으로 스코어를 매긴 3회의 반복 실험의 평균이 요약되어 있다: (1) 불량하게 균질화된 조직, (2) 부분적으로 균질화된 조직 및 (3) 완전히 균질화된 조직. 본 실험은 조직 파열이 비드 물질의 밀도가 증가함에 따라 개선되고 최상의 성능은 스테인레스 스틸 비드로 달성됨을 제시한다.
실시예 4. BeadBeater 기기 및 유리 또는 스테인레스 스틸 비드 경우의 RNA 수율 및 순도
RNA 수율 및 순도는 6.35mm 이상의 몇가지 직경의 유리 또는 스테인레스 스틸 비드를 이용하여 측정하였다. Mini-Bead Beater 8을 1분 동안 고속으로 사용하였다. 조건은 실시예 1에서 이미 기술한 바와 같았다. 스테인레스 스틸 및 유리 비드 6.35mm는 Biospec Products로부터 입수하였다. 모든 다른 비드는 글렌 밀스사(Glen Mills Inc, 뉴저지주 클립톤 소재)로부터 구입하였다.
조직 파열 후, 수득된 균질화물을 에펜도르프 모델 5415(Brinkman Instruments, 뉴욕 웨스트베리 소재)를 사용하여 15초 동안 원심분리하고, RNA를 QIAGEN RNeasy Mini 키트(제조원: Qiagen Inc, 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 정제하였다. 용해물의 일부를 30mg 조직/완충액 RLT ml의 농도로 희석시켰다. 용해물 400㎕를 70% 에탄올 400㎕을 함유하는 미량원심분리 튜브에 첨가하고, 샘플을 피펫팅하여 혼합하였다. 샘플(700㎕)를 진공 다기관(vaccume manifold)상에 위치한 RNeasy 미니 컬럼에 적용시켰다. 진공을 적용시켜 나머지 여과 단계 동안 유지시켰다. 컬럼을 완충액 RWI 700㎕으로 세척한 다음, 완충액 RPE 700㎕로 세척하였다. 이어서, 스핀 컬럼을 1.5ml 수집관에 위치시키고 30초 동안 14,000 RPM으로 원심분리하여 컬럼을 건조시켰다. 상기 컬럼을 새로운 1.5ml 수집관으로 옮겼다. RNAase 비함유 물 50㎕를 막에 직접 적용하고, 컬럼을 함유하는 튜브를 30초 동안 14,000RPM으로 원심분리하여 RNA를 용출시켰다. RNA 샘플을 빙상에 위치시키고, 분석하기 전에 -80℃에서 저장하였다.
RNA 수율을 Gene Spec III 기기(제조원: MiraiBio, 캘리포니아주 알라메다 소재)에서 측정한 샘플의 260/280nm 비에 기초하여 분광광도측정법으로 측정하였다. Agilent 2100 Bioanalyzer 및 Agilent RNA 6000 Nano Assay Reagents 및 Supplies(제조원: Agilent Technologies, 캘리포니아주 포스터 시티 소재)를 또한 사용하여 RNA 수율 및 질을 측정하였다.
결과는 하기 표 3에 요약되어 있으며, 튜브의 가시적 검사로 측정된 바에 의하면 직경이 6.35mm인 스테인레 스틸 비드가 가장 높은 RNA 수율과 최상의 조직 균질화를 제공함을 입증한다. 게다가, 동일한 직경의 유리 비드와 비교한 스테인레스 스틸 비드는 수율의 현저한 개선을 나타낸다. Agilent Bioanalyzer 전기영동도는 높은 품질의 RNA가 신속한 균질화 방법으로 수득되었음을 확인시킨다. 명백하게 한정된 18s 및 28s 리보솜 피크는 신속한 비드계 방법으로 파열된 샘플에서 나타났으며, 모든 샘플은 18s 대 28s 비가 1.5를 초과하였다.
Figure 112005008419269-PAT00003
실시예 3. FastPrep 기기에서의 조직 파열
다음 실험을 수행하여, FastPrep 균질화기(제조원: Qbiogene, Inc, 캘리포니아주 칼스바드 소재)에서 파열시킨 경우에 중량이 50 내지 500mg인 돼지 림프절 샘플에 대한 RNA 수율의 정확성을 측정하였다. 이들 실험은 1개의 6.35mm 스테인레스 스틸 비드를 함유하는 2㎖ Sarstedt 스크류-캡 바이알을 사용하여 수행하였다.
이들 실험에서는, 표 4에 제시한 상이한 중량의 동결된 분쇄 돼지 림프절 조직을 튜브마다 1개의 6.35mm 스테인레스 스틸 비드를 함유하는 2ml Sarstedt 스크류-캡 바이알에 첨가하였다. 완충액 RLT 1ml를 첨가하고 튜브를 속도가 6.5미터/초인 FastPrep 기기에서 45초 동안 처리하였다(본 실험을 수행하기 위해, 스포크플레이트로부터 세척기를 제거하여 FastPrep 기기를 변형시킴으로써 이러한 대형 튜브 크기가 수용될 수 있도록 하였다). 파열 후, 튜브를 에펜도르프 모델 5415C(제조원: Brinkman Instruments, 뉴욕즈 웨스트베리 소재)에서 15초 동안 14,000 x g로 원심분리하여 세포 파편을 펠렛화시키고 샘플로부터 기포를 제거하였다. 각 용해물의 일부분을 조직 30mg/완충액 RLT ml의 농도로 희석시키고 피펫팅하여 잘 혼합하였다. 조직을 처리하여 RNA를 추출하고, RNA를 실시예 3에서 정량하였다.
Figure 112005008419269-PAT00004
이들 연구로부터의 결과는 400mg 미만의 조직 샘플에서 전체 RNA 회수량이 20㎍ 이상임을 입증한다. 다소 적은 전체 RNA 회수량은 400 내지 500mg의 돼지 림프절 샘플에서 관찰되었으며, 이는 이러한 실험 조건하에 조직 파열의 효율이 다소 낮음을 제시한다.
중량이 낮은 조직 샘플을 함유하는 튜브는 부정확성이 가장 높았다. 그러나, 후속적 실험에서, 본 발명자들은, 조직 회수량의 정확성은 보다 큰 조직이 분쇄되어 보다 작은 조직 중량이 균질화를 위해 사용되는 경우에 유의적으로 개선되기 때문에 보다 적은 림프절 조직 중량에서의 가장 큰 표준 편차는 조직 비균질성 및 표본추출 때문일 수 있음을 밝혀냈다.
실시예 5. 돼지 B-액틴 유전자 발현의 실시간 PCR 검정
다음 실험을 수행하여, Fast Prep 방법에서의 신속한 균질화 후에 회수된 RNA가 실시간 PCR 검정으로 증폭될 수 있음을 입증하였다. 실시예 4로부터의 정제된 RNA를 사용하였다. 비교를 위해, 돼지 림프절 조직을 Omni 조직 균질화기 및 1회용 PCR 프로브(제조원: Omini International, 버지니아주 워렌턴 소재)를 사용하여 기계적 파열에 의해 파열시킨 대조군을 포함시켰다. Omini 조직 균질화기는 조직 파열을 증진시키기 위해 비드를 사용하지 않는다. Omini 조직 균질화기에서의 처리의 경우, 돼지 림프절 조직 100 내지 400mg를 완충액 RLT 6ml와 혼합하고 수동식 균질화기(모델 PCR258)로 1분 동안 균질화시켰다. 샘플을 동일한 용적의 70% 에탄올과 혼합하고, 700㎕를 Qiagen 스핀 컬럼에 적용시키고, RNA를 실시예 3에서와 같이 정제하였다.
RNA를 전사시켜 다음과 같은 cDNA 카피를 제조하였다: RNA 1㎍를, 고정된 올리고 dT23의 75μM 스톡 용액 1.25㎕, 10mM의 각각의 dNTP 0.31㎕ 및 RNAase-처리된 물(제조원: Sigma Chemical Co, St. Louis, Mo.)를 혼합하여 13㎕의 용적이 되도록 제조된 마스터 혼합물에 첨가하고, 용액을 5분 동안 70℃로 가열한 다음, 빙상에 위치시켰다. 이어서, 5X Superscript First-Strand 완충액 5㎕, 0.1M 디티오트레이톨 2.5㎕, 40U/㎕ Rnasin(제조원: Promega Corp, 위스콘신주 매디슨 소재) 0.75㎕ 및 200U/㎕ Superscript II 역전사효소 1.25㎕를 포함하는 혼합물 9.5㎕를 첨가하고, 튜브를 42℃에서 50분 동안 항온처리하였다. 0.5M NaOH 5㎕를 첨가하고, 튜브를 70℃에서 5분 동안 항온처리한 다음, Tris-HCl 완충액(2.5㎕의 1M, pH 7.0)을 첨가하고 이어서 RNAase 비함유 물 67.4㎕를 첨가하였다. RNA가 cDNA로 완전히 전환되고 1㎍의 전환 인자가 50,000 세포 등가물(CE)인 것으로 가정하여, 25mM Tris 완충액 중의 500CE/㎕의 농도를 모든 후속적 실시간 PCR 검정을 위해 사용하였다.
돼지 B-액틴 프라이머(서열 1 및 서열 2)는 인비트로겐사(Invitrogen Corp., 캘리포니아주 칼스바드 소재)에 의해 합성되었으며 B-액틴 Taqman 프로브(서열 3)은 신테젠(SYNTHEGEN, LLC, 텍사스주 휴스턴 소재)에 의해 합성되었다. 모든 Taqman 프로브의 경우, 카복시플루오레세인(FAM) 및 카복시테트라메틸로다민(TAMRA)를 염료 및 소광제 쌍으로서 사용하였다.
서열 1 CCACACGGTG CCCATCTACG
서열 2 AGGATCTTCA TGAGGTAGTC GGTCAG
서열 3 6-FAM -ACGCCCTGCC CCACGCCATC CTGCGTCTGG-TAMRA
Taqman 검정의 경우, 마스터 혼합물은 바람직하게는 2X Taqman Universial PCR 혼합물(제조원: Applied Biosystems, Inc) 25㎕, 10μM 스톡 프로브 용액 1.25㎕ 및 각 프라이머의 0.5μM 용액 5㎕를 첨가하여 제조하였다. cDNA(2㎕)를 각 광학 반응 미세역가 플레이트 웰에 첨가하였다. 광학 캡으로 밀봉한 후, 플레이트를 ABI 프리즘 7900 HT 서열 검출 시스템(제조원: Applied Biosystems, Inc., 캘리포니아주 포스터 시티 소재)에서 처리하고, 제조업자에 의해 권장된 프로토콜에 따라서 검정을 수행하였다. Taqman 검정에 의한 3개의 측정치의 평균은 표 5에 제시한다.
이의 결과는 표 5에 요약되어 있으며 유사한 RNA 수율이 본 발명의 방법 및 Omni 균질화기로 수득될 수 있음을 입증한다. 본 발명의 방법은 다수의 샘플을 동시에 처리할 수 있다는 점에서 유리하다. 게다가, 밀봉된 튜브가 사용되기 때문에 샘플간 오염이 최소화된다.
Figure 112005008419269-PAT00005
본 발명에 의해, RNA 추출이 보다 보다 신속하고 보다 효율적이며 보다 생산적이고 자동화에 적합할 수 있도록 하는 개선된 세포 및 조직의 파열 장치 및 방법이 제공된다.
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Claims (17)

  1. 샘플 용기와 함께 사용하기 위한 파열 부재를 갖는 세포 또는 조직 파열기를 포함하고 당해 파열 부재의 외부 치수가 당해 용기의 내부 치수보다 단지 약간만 작은 장치.
  2. 제1항에 있어서, 파열 부재의 외부 치수가 용기의 내부 치수보다 0.3배 큰 장치.
  3. 제1항에 있어서, 파열 부재의 외부 치수가 용기의 내부 치수보다 0.75배 큰 장치.
  4. 제1항에 있어서, 파열 부재가 밀도가 7.0 이상인 조밀한 물질을 포함하는 장치.
  5. 제4항에 있어서, 파열 부재가 스틸 또는 밀도가 8.0 이상인 물질을 포함하는 장치.
  6. 제1항에 있어서, 파열 부재가 직경이 약 6mm인 스테인레스 스틸 볼이고 용기가 내부 치수가 약 8mm인 튜브인 장치.
  7. 세포 또는 조직을 포함하는 샘플을 용기내에 위치시키는 단계, 핵산 안정화 용액을 상기 용기에 첨가하는 단계, 파열 부재를 상기 용기 내로 위치시키는 단계 및 파열 장치를 45초 이하 동안 사용하는 단계를 포함하는, 세포 또는 조직의 파열 방법.
  8. 제7항에 있어서, 파열 장치가 사용되는 샘플이 림프절 샘플이고, 상기 샘플로부터의 상청액을 경사 분리하고, 이로부터 핵산을 추출하는 방법.
  9. 세포 또는 조직을 포함하는 샘플을 용기내에 위치시키는 단계, 핵산 안정화 용액을 상기 용기에 첨가하는 단계, 파열 부재를 상기 용기 내로 위치시키는 단계, 파열 장치를 45초 이하 동안 사용하는 단계, 파열 장치가 사용된 샘플을 제거하는 단계 및 상기 샘플로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하여, 조직 또는 세포 샘플로부터 핵산을 추출하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 파열 부재의 외부 치수가 용기의 내부 치수보다 단지 약간만 작은 방법.
  11. 제10항에 있어서, 파열 부재의 외부 치수가 용기의 내부 치수보다 0.3배 큰 방법.
  12. 제10항에 있어서, 파열 부재의 외부 치수가 용기의 내부 치수보다 0.75배 큰 방법.
  13. 제10항에 있어서, 파열 부재가 밀도가 조밀한 물질을 포함하는 방법.
  14. 제10항에 있어서, 파열 부재가 스틸 또는 밀도가 스틸의 밀도 이상인 물질을 포함하는 방법.
  15. 제10항에 있어서, 파열 부재가 직경이 약 6mm인 스테인레스 스틸 볼이고 용기가 내부 치수 약 8mm의 튜브인 방법.
  16. 제10항에 있어서, 수술중(intra-operative)에 수행되는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 샘플이 림프절 조직인 방법.
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