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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren für die Vorbereitung einer
pflanzlichen oder tierischen Probe für eine Prozessierung,
also beispielsweise für die Isolierung von Nukleinsäuren
oder Proteinen aus der Probe sowie einen Pulverisator. Solche Vorbereitungen
und Untersuchungen werden in einem Labor von einer Laborantin oder
von einem Laboranten anhand von standardisierten Arbeitsanleitungen
durchgeführt. Zu einer solchen Arbeitsanleitung gehört
ein sogenanntes Protokoll. Ein Beispiel für ein solches Protokoll
zur Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli. geht aus der Druckschrift
DE 101 53 957 A1 hervor.
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Um
eine Probe in gewünschter Weise zu prozessieren, also beispielsweise
die Nukleinsäuren oder Proteine zu isolieren, können
in Abhängigkeit von der Probe und vom gewünschten
Ergebnis sogenannte „Kits" kommerziell erhalten werden,
so zum Beispiel das „UltraClean Tissue DNA Isolation
Kit" der Fa. Qiagen (www.Qiagen.com). Bevor eine Probe
mit Hilfe eines solchen Kits gemäß einem vorgegebenen
Protokoll prozessiert wird, muss diese geeignet vorbereitet werden.
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Nachfolgend
werden solche aus dem Stand der Technik bekannte typische Vorbereitungen
beschrieben.
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Einem
Versuchstier, so zum Beispiel einer Ratte, wird beispielsweise ein
Organ entnommen. Es hängt von der Zielsetzung ab, welches
Organ eines Tieres ausgewählt wird.
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Das
entnommene Gewebe des Tieres wird in einer Waschpufferlösung
gewaschen, so zum Beispiel in PBS (Phosphate Buffered Saline mit
folgendem Inhalt: Na2HPO4 (getrocknet),
NaH2PO4 (getrocknet),
NaCl und destilliertes Wasser). Durch die Waschung wird das Gewebe
des entnommenen Teils blutfrei bereitgestellt und von unerwünschten
Bestandteilen befreit.
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Im
Anschluss daran wird das entnommene Gewebe im flüssigen
Stickstoff gekühlt und zwar u. a., um Zellaktivitäten
zu stoppen. Andernfalls würde nicht die gewünschte
Information in der gewünschten Qualität im Anschluss
an die Prozessierung erhalten. Typischerweise wird dabei Gewebe
mit einer Körpertemperatur von beispielsweise 37°C
in flüssigen Stickstoff eingetaucht. Es entwickeln sich
Blasen. Das Gewebe wird erst wieder dem flüssigen Stickstoff
entnommen, wenn die Blasenbildung stoppt. Im Anschluss daran wird
das Gewebe bei –80°C beispielsweise mit Hilfe
von Trockeneis gelagert.
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Soll
der Kühlschritt in Flüssigstickstoff vermieden
werden, so wird alternativ im Anschluss an die Waschung das entnommene
Gewebe chemisch konserviert und zwar über Stabilisierungsreagenzien wie
z. B. RNAlater®. RNAlater® ist eine viskose Flüssigkeit,
die von der Firma Ambion (www.ambion.com) zur Konservierung
von Frischgewebe entwickelt wurde. Die Konservierungswirkung beruht
vor allem darauf, dass alle Enzyme durch Wasserentzug im Gewebe
inaktiviert und Zellaktivitäten gestoppt werden. Die viskose
Flüssigkeit muss schnell in alle Zellen des Gewebes hinein
diffundieren. Die Größe der Gewebestücke
ist daher auf eine Kantenlänge von maximal einem halben
Zentimeter zu beschränken. Im Anschluss an die chemische
Behandlung wird auch das so behandelte Gewebe bei –80° gekühlt,
um es so bis zur Prozessierung zu lagern.
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Für
eine Prozessierung werden typischerweise 10 bis 100 mg an Gewebe
benötigt, um die gewünschte Untersuchung, Isolierung
oder dergleichen durchzuführen. Es wird nun vor Beginn
der Prozessierung die benötigte Menge an tierischem Gewebe beispielsweise
mit einem Skalpell abgetrennt.
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Die
abgetrennte Probe, also das abgetrennte Gewebe wird nun aufgeschlossen,
das heißt, die Zellwände müssen geöffnet
werden. Dies kann mechanisch, chemisch oder enzymatisch erfolgen.
Ein mechanischer Aufschluss erfolgt beispielsweise mit Hilfe eines „TissueRuptor"
der Firma Qiagen, bekannt aus dem TissueRuptor Handbook, Juli 2006 der
Firma Qiagen. Dabei zerschlägt ein drehendes Messer
mit 35.000 Umdrehungen pro Minute Zellwände des Gewebes.
Mechanische Aufschlüsse werden regelmäßig
in einem Puffer durchgeführt, um Schädigungen
der Inhaltsstoffe wie zum Beispiel Nukleinsäuren zu vermeiden.
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Es
ist auch bekannt (siehe zum Beispiel http://www.laborpraxis.de/fachartikel/Ip
fachartikel nh 2384859.html, Stand 12. März 2007),
Proben in einer Kryomühle vorzubereiten. Bei dieser Mühle
wird die Probe bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff gemahlen.
Die Probe bleibt während des gesamten Mahlvorgangs tiefgekühlt,
ohne mit dem Stickstoff in Kontakt zu kommen. Dieses technisch recht
aufwendige Verfahren kann bei solchen Proben durchgeführt
werden, bei denen das vorgenannte Verfahren versagt, so zum Beispiel
bei sehr harten Materialien wie Knochen oder bei klollagenhaltigen
Materialien wie Haut. Soll ein Knochen vorbereitet werden, so ist auch
bekannt, diesen in ein mit flüssigem Stickstoff gefülltes
Gefäß zu bringen und mit Hilfe eines Metallbolzens
zu zerstoßen, Der Knochen liegt anschließend in
Pulverform vor.
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Sollen
histologische Untersuchungen mittels eines Mikroskops durchgeführt
werden, so wird eine Probe zunächst in Parafin eingeblockt
und dann mittels Mikrotom in dünne Gewebeschichten geschnitten.
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Sollen
pflanzliche Proben prozessiert werden, ist ein Zurechtschneiden
mittels Skalpell nur bei weichen Materialien wie zum Beispiel Blättern,
weichen Bohnen usw. möglich. Bei getrockneten oder gefrorenen
Pflanzenproben werden diese in flüssigem Stickstoff gekühlt
und in einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten
Mörser mit Hilfe eines Stößels zermahlen.
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Mit
einer Probenvorbereitung der vorgenannten Art wird das Ziel verfolgt,
im Anschluss an die Prozessierung ein möglichst gutes gesuchtes
Resultat zu erhalten. In Übereinstimmung hiermit ist es Aufgabe
der vorliegenden Erfindung, eine Probenvorbereitung bereitzustellen,
die verbesserte gesuchte Resultate im Anschluss an eine Prozessierung
ermöglicht.
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Eine
Lösung der Aufgabe umfasst die Merkmale von Anspruch 1.
Eine Weitere Lösungen umfassen die Merkmale der Nebenanspruche,
die ebenfalls auf ein Verfahren gerichtet sind. Eine Vorrichtung
zur Durchführung des Verfahrens umfasst die Merkmale des
letzten Nebenanspruchs. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich
aus den Unteransprüchen.
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Die
anspruchsgemäße Lehre funktioniert sowohl für
pflanzliches als auch für tierisches oder menschliches
Gewebe und zwar sowohl für stabilisierte als auch für
frische Proben von Pflanzen oder Geweben.
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Zur
Lösung der Aufgabe wird in einer Ausführungsform
eine Probe zunächst wie eingangs geschildert gewaschen
und beispielsweise mit flüssigem Stickstoff behandelt oder
in RNAlater gelagert. Es wird ein verschließbares, vorzugsweise
aus Metall bestehendes Gefäß oder aus Kunststoff
bestehendes Gefäß, welches mit einem Metall-Inlay
ausgestattet ist, mit einem im Gefäß befindlichen
und beweglichen Körper gekühlt und zwar auf eine
Temperatur, die deutlich unterhalb von 0°C liegt.
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Die
Temperatur, auf die das Gefäß gekühlt wird,
sollte wenigstens –50°C betragen. Vorzugsweise
ist eine Temperatur von ca. –80°C, so zum Beispiel
von –70°C bis –90°C zu wählen,
da diese deutlich weiter weg von 0°C liegt. Auch können –80°C bzw. –70°C
bis –90°C mit Hilfe von Trockeneis preiswert bereitgestellt
werden. Es hat sich gezeigt, dass sich durch eine Kühlung
auf ca. –80°C besonders gute Ergebnisse erzielen
lassen. Tiefere Temperaturen als –80°C sind bis
zu einem gewissen Grad möglich. Zu beachten ist allerdings,
dass das Gefäß nicht zu stark abgekühlt
werden darf. So hat sich eine Temperatur von flüssigem
Stickstoff, also von –196°C als zu tief herausgestellt,
um zu guten Resultaten zu gelangen.
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Mit
dem im Gefäß befindlichen Körper wird das
Ziel verfolgt, durch Schüttelbewegung des Gefäßes
eine darin befindliche tiefgekühlte Probe zu zerstoßen.
Entsprechend diesem Ziel ist der Innenraum des Gefäßes
nebst dem darin befindlichen beweglichen Körper dimensioniert
und gestaltet. Besonders geeignet ist ein zylinderförmiger
Innenraum mit hohlkugelförmigen Enden. Der bewegliche Körper
ist dann bevorzugt eine Kugel oder aber ein Bolzen mit kugelförmigen
Enden. Der Durchmesser der Kugel oder des Bolzens ist kleiner als
der Durchmesser des Innenraums, um so die Beweglichkeit zu gewährleisten.
Der bewegliche Körper besteht aus einem harten, vorzugsweise
schweren Material wie Metall, um die Probe zerstoßen zu
können.
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Die
biologische Probe, so zum Beispiel ein gekühltes Rattenherz
wird vorzugsweise vollständig in das Gefäß gegeben,
ohne die Probe zuvor zu zerkleinern, um so zu guten Resultaten zu
gelangen. Insbesondere wird eine wenigstens –50°C
kalte Probe in das Gefäß gegeben. Anschließend
wird das Gefäß insbesondere 10 bis 30 Sekunden
insbesondere mit der Hand so geschüttelt, dass der bewegliche
Körper hin und her geschleudert wird. Im Anschluss daran
wird die so zerstoßene Probe entnommen und die gewünschte
Menge mit Hilfe eines Kits gemäß einem Protokoll
prozessiert. Grundsätzlich befinden sich in dem Gefäß außer
der Probe und einem oder mehreren beweglichen Körper keine
weiteren Substanzen und zwar insbesondere auch kein Kühlmittel
wie flüssiger Stickstoff oder aber beispielsweise Pufferlösungen.
Diese würden lediglich das gewünschte Ergebnis
verschlechtern.
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Es
hat sich überraschend gezeigt, dass bei dieser Form der
Probenvorbereitung bessere Ergebnisse erzielt werden im Vergleich
zu den aus dem Stand der Technik bekannten Probenvorbereitungen, obwohl
kein großer technischer Aufwand betrieben wird und die
Handhabung einfach ist. Der technische Aufwand ist nicht groß,
da das Gefäß mit dem darin befindlichen, beweglichen
Körper lediglich in Trockeneis auf eine Temperatur von
beispielsweise –80°C gekühlt wird. Anschließend
kann das gekühlte Gefäß von Hand, die
mit Handschuhen leicht hinreichend vor der Kälte geschützt
werden kann, entnommen, die Probe hineingegeben und das Gefäß verschlossen.
Anschließend wird es noch nicht einmal eine Minute lang
geschüttelt und die Probe kann entnommen und beispielsweise
erst einmal wieder beispielsweise gekühlt in einem weiteren
Gefäß gelagert werden. Alternativ wird die Probe
nicht entnommen und in einem weiteren Gefäß gelagert,
sondern sofort in dem Gefäß, welches den beweglichen
Körper enthält. Es dient also dann zugleich als
Aufschlussgefäß und Aufbewahrungsbehälter.
Die gewünschte Probenmenge für die Prozessierung
kann genau und einfach bereitgestellt werden. Auch wird dabei eine
homogene Gewebeverteilung erreicht. Selbst stabilisierte Gewebe,
Blätter und Samen von Pflanzen können in dieser
Weise für die weitere Prozessierung vorbereitet werden.
Für Haut und Knochen und vergleichbar harte bzw. viskose
Proben ist allerdings dieses Verfahren nicht geeignet.
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Da
die Bearbeitung im gekühlten, geschlossenen Gefäß nicht
sehr viel Zeit in Anspruch nimmt, ist es nicht erforderlich, den
Schüttelvorgang zu unterbrechen und das Gefäß zwischendurch
wieder auf geeignete tiefe Temperaturen abzukühlen. Dies
gilt vor allem, wenn das Gefäß aus Metall besteht
und hinreichend dicke Wandungen aufweist. Eine Wandung von wenigen
Millimeter Dicke genügt bereits. Überraschend
hat sich weiter herausgestellt, dass ein Aufschluss in beispielsweise
einem TissueRupter entfallen kann. Die so vorbereitete Probe kann
also sofort prozessiert werden und dies mit besonders guten Endergebnissen.
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Nachfolgend
wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher
erläutert.
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1 zeigt
im Schnitt ein Gefäß 1, auf welches ein
Deckel 2 aufgeschraubt werden kann. Im Gefäß 1 befindet
sich eine Kugel 3, die einen kleineren Durchmesser im Vergleich
zum Durchmesser des Gefäßes 1 aufweist.
Der Durchmesser des Gefäßes liegt im Bereich von
wenigen Zentimetern. Der Innenraum des Gefäßes 1 ist
zylinderförmig. Im geschlossenen Zustand sind die Enden 5 und 6 des
Gefäßes halbkugelförmig geformt. Durch
entsprechendes Schütteln des Gefäßes 1 wird
die Kugel 3 im Inneren hin und her bewegt und schlägt
auf die Enden 5 und 6 auf. Das Gefäß 1,
der Deckel 2 und die Kugel 3 bestehen aus Metall
und zwar aus Edelstahl.
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Zunächst
wird das Gefäß in Trockeneis bei –80°C
gekühlt.
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Eine
Probe 7 wird einem Tier entnommen, Die Probe wird gewaschen
und in Stickstoff getaucht, bis sich keine Blasen mehr bilden oder
beispielsweise für 24 h in RNAlater gelagert. Im Anschluss
daran kann die Probe zunächst in Trockeneis bei minus 80°C
gelagert werden. Im Fall einer Pflanze wird getrocknetes Pflanzengewebe
wie zum Beispiel Samen im Gefäß 1 auf
Trockeneis gekühlt. Frisches Pflanzenmaterial wie zum Beispiel
Blätter werden zuvor auf –80°C gekühlt.
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Ist
das Gefäß 1 auf die gewünschte
Temperatur gekühlt worden, so wird dieses mit von Hand entnommen.
Die Hand ist dabei zweckmäßigerweise mit einem
Baumwollehandschuh und einem aus Latex bestehenden Handschuh vor
der Kälte geschützt. Mit einer Pinzette wird die
Probe 7 in das Gefäß 1 hinein
gegeben, in dem sich auch die Kugel 3 befindet. Im Anschluss
daran wird der Deckel 2 auf das Gefäß 1 aufgeschraubt
und dieses so fest verschlossen. Nun wird das Gefäß 1 von
Hand hin und her geschüttelt, so dass die Kugel 3 auf
die beiden Enden 5 und 6 abwechselnd auftrifft.
Die Probe 7 wird dadurch zerschlagen. Dieser Vorgang endet
nach sogar 20 bis 30 Sekunden. Es entsteht so ein rieselfähiges Pulver,
das in dem Gefäß 1 zunächst
weiter gelagert werden kann. Es wird unmittelbar oder im Anschluss an
eine Lagerung der Deckel 2 abgeschraubt und die zerstoßene
Probe entnommen. Eine gewünschte Menge kann nun beispielsweise
durch Wiegen bereitgestellt werden.
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Es
wurde einer Ratte eine Leber entnommen und in PBS gewaschen. Im
Anschluss daran wurde die Leber für 24 Stunden in RNAlater® gelagert. Im Anschluss daran wurde
die Rattenleber bis zur weiteren Verwendung bei –80°C
gelagert.
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Die
Leber wurde wie zuvor beschrieben im gekühlten, geschlossenen
Gefäß 20 Sekunden lang zerstoßen. Mit
Hilfe eines Trichters wurde die zerstoßene Probe in ein
Falcon Röhrchen eingefüllt und in Trockeneis bei –80°C
zunächst weiter gelagert.
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10
mg der in dem Falcon Röhrchen befindlichen Probe wurde
schließlich mit einer Waage abgewogen. Dabei wurde darauf
geachtet, dass die Probe nicht auftaute.
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180 μl
einer wässrigen Lösung enthaltend 100 mM SDS,
100 mM EDTA; 50 mM Tris; 100 mM NaCl (PUFFER 1) und 20 μl
ProtK wurden in ein 2 ml Reaktionsgefäß abgefüllt
und danach wurde die abgewogene Menge an Probe, also 10 mg unter
Vortexen hinzugegeben. Dies verhindert eine Verklumpung der Probe,
wodurch verhindert wird, dass sich DNeasy bzw. RNeasy Säulen
zusetzen, die im Rahmen eines entsprechenden Protokolls bzw. Kits
eingesetzt werden.
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Das
verwendete DNeasy Protokoll der Firma Qiagen beinhaltet folgende
Schritte. Die 10 mg Gewebe werden mit 180 μl PUFFER 1 +
20 μl Proteinase K bei 56°C für eine
Stunde in einer Rocking Plattform inkubiert. Im Anschluss werden
4 μl RNase A hinzu pipettiert und für 2 min. bei
Raumtemperatur inkubiert. Danach werden 200 μl AL (Lysispuffer)
hinzu pipettiert und bei 70°C für 10 min in einer
Rocking Plattform inkubiert. Im weiteren Verlauf werden 200 μl Ethanol
(100 %) hinzu pipettiert und durch leichtes Invertieren gemischt.
Hier ist der Punkt, wo die DNA als „Wolke" zu erkennen
ist. Ein Zeichen für die Sensitivität der Methode,
da es zeigt, dass das Molekül kaum beschädigt
wird und hochmolekular vorliegt. Um die Säuleneffizienz
zu steigern, wird die erhaltende Lösung 3 × mit
der Pipette durch Aufziehen gemischt. Im Anschluss wird die gesamte
Lösung in eine DNeasy Säule pipettiert und für
1 min. bei 8000 rpm zentrifugiert. Die entsprechende Nukleinsäure hat
nun an das Säulenmaterial gebunden. Der Überstand
wird verworfen und die Säule nun mit 500 μl Waschbuffer
AW 1 bei 8000 rpm für 1 min. gewaschen. Dieser Schritt
wurde zusätzlich nochmals angewendet, auch wenn dieser
durch das Protokoll nicht empfohlen wird. Im Anschluss wird die
Säule wie im Protokoll beschrieben mit 500 μl
Puffer AW 2 für 3 min bei 14000 rpm gewaschen. Der Überstand wird
abermals verworfen. Zusätzlich findet der im Protokoll
beschriebene optionale Schritt der Trocknung für 1 min.
bei 14000 rpm Anwendung. Zuletzt werden 200 μl RNase freies
Wasser in die Mitte der Säule pipettiert und bei Raumtemperatur
für 1 min inkubiert um dann bei 8000 rpm für 1
Minute zentrifugiert zu werden. Dieses Eluat wird mittels eines Spektrometers
vermessen. Dieses dient zur Konzentrationsbestimmung und zur Bestimmung
des Reinheitsgrades. Letztendlich wird zur qualitativen und quantitativen
DNA Bestimmung ein Agarosegel angefertigt. Hierauf kann die Qualität
der DNA, der Grad der Degradation, die Größe des
Moleküls sowie dessen Menge bestimmt werden.
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Die
so erhaltenen Ergebnisse werden in der 2 verdeutlicht
und mit Vergleichsbeispielen verglichen. Oberhalb von „TR"
wird das Ergebnis gezeigt, bei dem eine Rattenleber zunächst
gemäß dem Stand der Technik in der eingangs genannten
Art vorbehandelt wurde, also zunächst gewaschen und in RNAlater
gelagert wurde. Anschließend wurde eine gewünschte
Probenmenge von 10 mg abgetrennt und in einem TissueRupter® aufgeschlossen.
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Rechts
daneben oberhalb von „TR+" wird das Ergebnis gezeigt, welches
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten
wurde. Damit die Säuleneffizienz der DNeasy Säule
im Rahmen der Prozessierung besser ausgenutzt werden kann, wurde die
nach DNeasy Protokoll verarbeitete Lösung nach Zugabe von
200 μl Ethanol (100%) mittels Pipette durch dreimaliges
Aufziehen und wieder Abgeben gemischt. Hierdurch wird die hochmolekulare
DNA so vorbereitet, dass sie an die DNeasy Säule binden kann.
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Rechts
daneben oberhalb von „TD–„ wird das nach
dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Ergebnis
gezeigt, bei dem keine Durchmischung mithilfe einer Pipette durchgeführt
wurde, um so die Säuleneffizienz zu verbessern.
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Rechts
daneben oberhalb von „TD/TR" wird das Ergebnis gezeigt,
bei dem die Probe zunächst einmal erfindungsgemäß vorbereitet
wurde. Abschließend wurde die zerstoßene Probe
jedoch in einem TissueRuptor® 3
Sekunden lang weiter aufgeschlossen. An den verschmierten Rändern
ist deutlich zu sehen, dass schon nach 3 Sekunden eine Verstärkung
der Degradierung stattfindet.
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Die
hellen oberen Bereiche in der 2 charakterisieren
die genomische DNA. Der helle Bereich oberhalb von TR reicht nicht
so hoch wie oberhalb von TD+, TD– oder TD/TR. Je höher
der helle Bereich reicht, desto hochmolekularer ist die erhaltene DNA
und desto besser ist also das erhaltene Ergebnis.
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Der
helle Bereich oberhalb von TR, der nach dem Stand der Technik erhalten
wurde, verschmiert und geht in einen hellgrauen Bereich über.
Dies ist ein Zeichen, dass die DNA degradiert, also beschädigt
worden ist. Eine solche Beschädigung konnte durch das erfindungsgemäße
Verfahren gemäß TD+ sowie gemäß TD– vermieden
werden.
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Die 2 zeigt
Aufnahmen von DNA Agarosegelen, die wie oben beschrieben eingesetzt
werden um die Quantität und Qualität der DNA zu
bestimmen. Hierzu wird ein 1% Gel gegossen. Hierfür wird
1 g Agarosepulver (langkettige Kohlenhydratmoleküle die
Polymerisieren können) abgewogen und in 100 ml (1 ×)
TAE Puffer gelöst und in der Mikrowelle erhitzt. Die erhaltende
Lösung wird mit 5 μl Ethidiumbromid versetzt und
durch Schütteln der Kolbenflasche vermischt und in eine
Form gegossen. In die heiße Lösung werden nun
Kämme eingespannt, die beim Abkühlen der Lösung,
wobei diese polymerisiert, Abdrücke im Gel hinterlassen,
die später die Slots bilden, in denen die Probe vermischt
mit 5 μl Loading Dye hinein pipettiert wird. Um später
unter UV-Licht eine Aussage treffen zu können, wird zum späteren
Größenvergleich ein Marker zusätzlich
auf das Gel gegeben. Die DNA verteilt sich nach Anlegung einer elektrischen
Spannung aufgrund Ihres unterschiedlichen Gewichtes und der Ladung,
d. h. kleine degradierte Fragmente bewegen sich schneller im Gel
als hochmolekulare DNA.
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Die
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene
DNA kann in Form einer Wolke mit bloßem Auge gesehen werden.
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Im
Rahmen eines weiteren Versuchs wurde 25 mg „frisches" Rattenherz
untersucht. „Frisch" bedeutet, dass es nicht mit dem Stabilisierungsreagenz behandelt
worden ist, sondern zunächst in flüssigem Stickstoff
tiefgekühlt wurde. Es wurde mit Hilfe des erfindungsgemäßen
Verfahrens die doppelte Konzentration an RNA erhalten im Vergleich
zur aus dem Stand der Technik bekannten Methode.
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In
diesem Versuch wurde dasselbe Verfahren zur Pulverisierung angewendet
wie bei dem zuvor beschriebenen Versuch. Das Herz der Ratte wurde
entnommen und mittels Flüssigstickstoff gekühlt, bis
keine Blasen mehr entstanden sind. Im Anschluss wurde das Herz auf
Trockeneis (–80°C) gelagert. Kurz vor der Prozessierung
wurde das Gefäß 1 auf Trockeneis gekühlt
und mit dem gefrorenen ganzen Herzen gefüllt und für
20 sek. mit der Hand geschüttelt. Im Anschluss wurde das
Pulver im Gefäß gelagert um Zeit zu haben, die
Materialien für das RNeasy Fibrous Tissue Mini Protokoll
zu besorgen. Dieses stellt kein Problem dar, denn das Gefäß war
Aufschluss- und Aufbewahrungsgefäß in einem. Zur
weiteren Bearbeitung nach dem genannten Protokoll wurden unter einem
Abzug 300 μl einer wässrigen Lösung enthaltend
3,5 M GTC; 28 mM Na3-Citrate × 2 H2O (RLT Puffer, Lysispuffer)
mit 3 μl β-Mercaptoethanol in einem 2 ml Reaktionsgefäß vermischt
und 25 mg des gelagerten Herz-Gewebepulvers in das Reaktionsgefäß eingewogen
und im Anschluss gevortext. Hinzu kamen 590 μl RNase-freies-Wasser und
10 μl ProtK (Enzym), welches mittels Pipette gemischt wurde,
bevor es für 10 min. bei 55°C auf einer Rocking
Plattform inkubiert wurde, um danach für 3 min bei Raumtemperatur
bei 10000 × g zentrifugiert zu werden. Der Überstand
wurde dann in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß pipettiert
und das 0,5fache Volumen an 96–100% Ethanol hinzu pipettiert
und durch die Pipette vermischt. Im Anschluss wurden zunächst 700 μl
der Lösung in die RNeasy Säule pipettiert und für
15 sek. bei 10000 rpm zentrifugiert, Da die Säule nur 700 μl
Fassungsvermögen hat, wurde dieser Schritt für
die verbleibende Lösung wiederholt, so dass die gesamte
Probe über die Säule gegeben worden ist. Der Überstand
nach dem Zentrifugieren wurde verworfen. Danach wurde die Säule
mit 350 μl Puffer RW1 für 15 sek bei 8000 g gewaschen
und der Überstand verworfen. Nun wurden je Probe 10 μl DNase
I Stock Solution mit 70 μl RDD Puffer vermischt und durch
invertieren gemischt. Von dieser Lösung wurden 80 μl
genau in die Mitte der Säule gegeben und für 15
min. bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss wurden 350 μl
Puffer RW1 auf die Säule gegeben, um diese für
15 sek bei 8000 g zu waschen. Die RNeasy Säule wurde hiernach
in ein neues 2 ml Collection Tube überführt und
mit 500 μl RPE Puffer befüllt, um diese wieder
für 15 sek. bei 8000 g zu waschen. Der Überstand
wurde wieder verworfen. Der letzte Schritt wurde wiederholt, nur
mit dem Unterschied, dass nun für 2 min. bei 8000 g zentrifugiert wurde.
Die Säule wurde nun ein weiteres mal in ein neues 2 ml
Reaktionsgefäß überführt und
darin für 1 min. full speed getrocknet. Für den
abschließenden Schritt wurde die Säule in ein
neues 2 ml Reaktionsgefäß überführt
und mit 30 μl RNase-freiem-Wasser befüllt und
zum Eluieren für 1 min. bei 10000 rpm zentrifugiert. Das
Eluat wurde dann ebenfalls mittels Spektrometers vermessen und mittels
RNA Agarosegel ausgewertet.
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Es
wurden ergänzend diverse Zerkleinerungsversuche unter anderem
in einem Mörser bei –196°C durchgeführt.
Letzten Endes haben diese Versuche ergeben, dass eine Kühlung
auf –196°C aber auch die Verwendung eines Mörsers
nicht geeignet sind, um zu den gewünschten Ergebnissen
zu gelangen.
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3 zeigt
eine besonders bevorzugte Ausführungsform eines verschließbaren
Gefäßes, mit dem eine Probe pulverisiert wird.
Dieses Gefäß wird nachfolgend Pulverisator genannt.
Es umfasst ein Inlay 10, welches vorzugsweise aus Metall
aus oben genannten Gründen besteht. Das Inlay 10 wird
von einer vorzugsweise aus Kunststoff bestehenden Hülle 11 umfasst.
Die Kunststoffhülle dient vor allem als Isolator, um die
tiefe Temperatur während des Schüttelns aufrechtzuerhalten.
Insgesamt kann so das Gewicht im Vergleich zu einem ganz aus Metall
bestehenden Pulverisator vorteilhaft reduziert werden, was die Handhabung
erleichtert. Der Doppelpfeil unterhalb des in 3 gezeigten
Pulverisators verdeutlicht die bevorzugte Bewegungsrichtung, um
die Probe 7 zu zerkleinern.
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Die
in der vorliegenden Anmeldung erwähnten Puffer und Reagenzien
können bei der Fa. Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland kommerziell
erworben werden, falls etwas anderes nicht ausdrücklich ausgesagt
wurde.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Diese Liste
der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert
erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Zitierte Patentliteratur
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - „UltraClean
Tissue DNA Isolation Kit" der Fa. Qiagen (www.Qiagen.com) [0002]
- - www.ambion.com [0007]
- - „TissueRuptor" der Firma Qiagen, bekannt aus dem
TissueRuptor Handbook, Juli 2006 der Firma Qiagen. [0009]
- - http://www.laborpraxis.de/fachartikel/Ip fachartikel nh 2384859.html,
Stand 12. März 2007 [0010]