MXPA05004970A - Aislamiento automatico de alto rendimiento de acidos nucleicos, y metodos de cuantificacion de los mismos. - Google Patents

Abstract

Se provee un protocolo de laboratorio de ARN de alto rendimiento para la extraccion y el mantenimiento de una cantidad suficiente de ARN de alta calidad durante la preparacion de muestras, para analizar varios genes a la vez con ayuda de un analisis de computo; la presente invencion incluye un metodo para analizar ARN, que comprende los pasos de extraer ARN de una construccion biologica compleja en cantidades suficientes para proveer datos precisos del ARN, transferir el ARN a un aparato que mantiene el ARN y reactivos necesarios a una temperatura entre aproximadamente 0 y 10¦C, y analizar el ARN con un analisis matematico de los datos generado por computadora para acceder la presencia de ARN, y poner a prueba finalmente la eficacia de un farmaco.

Description

AISLAMIENTO AUTOMATICO DE ALTO RENDIMIENTO DE ACIDOS NUCLEICOS, Y METODOS DE CUANTIFICACION DE LOS MISMOS REFERENCIA RECIPROCA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reclama prioridad bajo el título 35, código de los Estados Unidos, § 119(e)(1) de las solicitudes de patente provisionales de E.U.A. Nos. de serie 60/425,136 y 60/425,139, presentadas en noviembre 8 de 2002.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Un área clave de la investigación farmacéutica, es la determinación de la expresión genética. La experimentación in vivo de productos farmacológicos, demanda un análisis preciso de la función celular y la expresión génica para determinar eficacia y seguridad. La expresión de un gen particular indica con frecuencia la eficacia o el riesgo de administrar el producto a un paciente. La reacción en cadena de polimerasa ("PCR") ha revolucionado la investigación genética, proveyendo un medio rápido para amplificar e identificar subsecuentemente secuencias de ácido nucleico específicas de muestras genéticas complejas sin la necesidad de protocolos de purificación de ácidos nucleicos y selección y clonación que consumen tiempo. La PCR fue descrita y reclamada originalmente por Mullís et al., en las patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195, 4,683,202 y 4,965,188, incorporadas en la presente como referencia. Desde ese tiempo, se han logrado avances considerables en los reactivos, equipo y técnicas disponibles para la PCR. Estos avances han aumentado la eficiencia y utilidad de la reacción de PCR, llevando a su adopción a un número creciente de situaciones y aplicaciones científicas diferentes. Las primeras técnicas de PCR fueron dirigidas hacia métodos cualitativos y preparativos, más que hacia métodos cuantitativos. La PCR se usó para determinar si una secuencia de ADN determinada estaba presente de algún modo en alguna cantidad, o para obtener cantidades suficientes de una secuencia de ácido nucleico específica para mayor manipulación. Originalmente, la PCR no se usó típicamente para medir la cantidad de un ADN o ARN específico presente en una muestra. Sólo en años recientes, la PRC cuantitativa ha venido a la vanguardia de la investigación de ácidos nucleicos. Mientras que el ADN es necesario para el análisis mediante PCR, en la prueba de la eficacia y seguridad de fármacos, es el ARN mensajero el indicador más preciso de la expresión génica. Existen muchos pasos en la vía que lleva del ADN a la proteína, y todos ellos pueden en principio ser regulados. Una célula controla las proteínas que produce: 1 ) controlando cuándo y con qué frecuencia un gen determinado es transcrito (control por transcripción), 2) controlando cómo el transcrito de ARN primario es empalmado o de otra manera procesado (control del procesamiento del ARN), 3) seleccionando qué moléculas de ARN mensajero concluidas en el núcleo de la célula son llevadas hacia el citoplasma (control del transporte del ARN), 4) seleccionando qué moléculas de ARN mensajero en el citoplasma son traducidas por ribosomas (control de la traducción), 5) desestabilizando selectivamente ciertas moléculas de ARN mensajero en el citoplasma (control de la degradación del ARN mensajero), o 6) activando, inactivando o compartimentando selectivamente moléculas de proteína específicas después de que se han producido (control de la actividad de la proteína). Véase Molecular Biology of the Cell, 3a. ed., en 403. Aunque todos estos pasos que intervienen en la expresión de un gen pueden en principio ser regulados, para la mayoría de los genes, los controles de la transcripción son supremos, y el inicio de la transcripción del ARN es el punto de control más importante. Id. Por lo tanto, el ARN mensajero es purificado, y se producen clones de ADNc para medir la expresión génica en la experimentación de productos farmacológicos. La amplificación del ARN en clones de ADNc se logra incluyendo un paso de transcripción inversa antes del inicio de la amplificación mediante PCR. La transcriptasa inversa ("RT") es una ADN polimerasa usada para sintetizar una cadena de ADNc usando un molde de ARN mensajero e iniciador, y se usa con frecuencia en conjunto con la PCR para medir la expresión génica. Este procedimiento se conoce como RT-PCR. Mediante la purificación del ARN mensajero, producción de ADNc y amplificación del ADNc, se mide la expresión génica. En un procedimiento de RT-PCR de un paso, se añaden transcriptasa inversa, Taq polimerasa, iniciadores, dNTPs y ARN mensajero al mismo tubo, y ocurre transcripción inversa y amplificación sin más remoción o adición de reactivos. En la RT-PCR de dos pasos, se usan transcriptasa inversa, ARN mensajero, dNTPs e iniciadores para producir ADNc. El ADNc puede transferirse a un nuevo tubo, y se añaden entonces iniciadores, dNTPs, sondas y Taq polimerasa para amplificar el ADN. El protocolo de dos pasos está sujeto a contaminación debido a la necesidad de exponer las muestras al aire, mientras se añaden reactivos. Además, la transcriptasa inversa es una enzima sensible a ia temperatura que comienza a degradarse arriba de aproximadamente 10°C. Aunque la actividad óptima de la enzima ocurre a 37 a 48°C, la enzima se degrada rápidamente a esta temperatura. Aún cuando la transcripción inversa se lleva a cabo entre 37 y 48°C, la transcriptasa inversa pierde actividad durante períodos prolongados de temperatura elevada. La transcriptasa inversa mantiene su actividad durante por lo menos 8 horas cuando se almacena a 4°C. Sin embargo, la actividad puede perderse dentro de 30 minutos a una temperatura de 48°C. Una vez a temperatura ambiente, el ARN mensajero puede desnaturalizarse si no se usa de inmediato, ya que el ARN se degrada cuando se expone al calor o pH alto. La degradación del ARN mediante hidrólisis alcalina es acelerada por el calor. Mientras que pueden añadirse inhibidores de ribonucleasa para proteger al ARN mensajero, puede ocurrir contaminación de la ribonucleasa, y puede degradar el ARN mensajero. Si el ARN es degradado, puede resultar análisis impreciso. En consecuencia, mantener el ARN a una baja temperatura, reduce al mínimo la degradación. Asimismo, a temperatura ambiente, la actividad de la Taq polimerasa puede comenzar antes del inicio de la PCR. Cuando esto ocurre, el rendimiento y el carácter específico de la PCR disminuyen por lo menos parcialmente debido a la cebadura (o cebadura errónea) de secuencias. Por consiguiente, la actividad prematura de la Taq polimerasa provee resultados imprecisos en el análisis de la expresión genética. En el laboratorio de ARN de alto rendimiento activo, transcriptasa inversa, Taq polimerasa, iniciadores, dNTPs, ARN mensajero y otros constituyentes, se añaden con frecuencia simultáneamente a numerosas rejillas de tubos y/o placas. Con frecuencia a veces y por muchas razones, existe una demora en la amplificación y subsecuentemente la identificación de secuencias de ácido nucleico específicas de muestras genéticas complejas mediante la reacción de RT-PCR. Teniendo placas y rejillas de tubos de pie esperando la amplificación a temperatura ambiente, es muy probable corromper los resultados del análisis de la expresión. Además, sin importar el método usado, el resultado final es el mismo, se requiere una gráfica de fluorescencia contra número de ciclos. Más análisis de estos datos se usa entonces para derivar valores cuantitativos para las moléculas de ARN presentes en las muestras. La amplificación exitosa de la muestra resultará en una gráfica sigmoidal que consiste de un periodo en donde la amplificación no es detectable arriba del ruido de fondo del experimento, un periodo de amplificación exponencial, y un período en donde la amplificación alcanza una meseta. Para analizar los datos, se selecciona un valor umbral que sea mayor que el ruido de fondo del experimento. Cada curva de amplificación se analiza para determinar el punto en el cual la curva aumenta arriba de los valores umbrales. Esto se registra en términos del ciclo en el cual esto ocurrió, y se conoce como el ciclo umbral (CT). Como se publicó originalmente en el boletín de usuario número 2 para el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7700, incorporado en la presente como referencia, en la escala lineal (o fase exponencial), el ciclo umbral es inversamente proporcional a la cantidad de ARN en una muestra. Estos valores pueden compararse con una gráfica de ciclos umbrales obtenidos de la amplificación de diluciones graduales de un estándar añadido exogenamente para determinar la concentración de ARN en las muestras experimentales. Si se conoce la cantidad absoluta del estándar añadido exogenamente, pueden determinarse las cantidades absolutas de ARN en las muestras experimentales. Sin embargo, el estándar puede ser también de concentración desconocida, en cuyo caso se obtendrá una cuantificación relativa. El uso de curvas estándar requiere la amplificación de ácidos nucleicos añadidos exogenamente, aumentando el número total de amplificaciones requeridas y disminuyendo el rendimiento del experimento.

Además, debido a variaciones en la cantidad y calidad de los ácidos nucleicos entre diferentes muestras, es con frecuencia útil comparar la cantidad de ácido nucleico con un control endógeno. Si está presente un control endógeno, la cuantificación relativa puede lograrse mediante el análisis matemático de las diferencias en el ciclo umbral entre la muestra experimental y el control endógeno, eliminando la necesidad de curvas estándar y reduciendo el número total de amplificaciones requeridas en un experimento. Este análisis matemático es realizado por el investigador, y puede tardar semanas para prepararlo, publicarlo y analizarlo. Falta una forma automatizada de preparar los datos para análisis, para satisfacer los requisitos de alto rendimiento del procedimiento de descubrimiento de fármacos actual. Además, falta una forma efectiva y eficiente de preparar y analizar los resultados de un experimento de alto rendimiento para detectar transcritos de ADN o ARN específicos. Por consiguiente, la mayoría de los laboratorios se enfocan en aislar un lote de ARN para satisfacer las necesidades del grupo de microdisposiciones. Sin embargo, para un laboratorio activo, esto no es práctico. Existe por lo tanto la necesidad de un protocolo de análisis y aislamiento de alto rendimiento usado en el laboratorio para producir un rendimiento suficiente de ARN de alta calidad para analizar con precisión mediante medios automatizados, varios genes a la vez.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Se provee un protocolo de laboratorio de ARN de alto rendimiento para la extracción y el mantenimiento de una cantidad suficiente de ARN de alta calidad durante la preparación de muestras y resultados y análisis precisos de varios genes a la vez. La presente invención es un método para analizar ARN, el cual comprende los pasos de extraer ARN de una construcción biológica compleja en cantidades suficientes para proveer datos de ARN, transferir el ARN a un aparato que mantiene el ARN y los reactivos necesarios a una temperatura entre aproximadamente 0 y 10°C, y analizar los niveles y la función del ARN con un análisis matemático de los datos generado por computadora. La construcción biológica compleja puede ser pulverizada o licuada. El ARN es después aislado y purificado en una estación de trabajo automatizada de ácidos nucleicos. El laboratorio de ARN de alto rendimiento de la presente invención comprende un aparato para extraer y aislar ácidos nucleicos de una construcción biológica compleja, un aparato para mantener dichas muestras de ARN a una temperatura entre aproximadamente 0 y 10°C, y un programa legible en computadora para su uso con relación a un aparato de presentación visual de información, en donde dicho programa legible en computadora hace que una computadora calcule y presente visualmente valores de ciclo umbral, un delta CT, un delta delta d y un cambio de transcripción relativo (XRel), de dicha muestra de ARN. El laboratorio de la presente invención puede incluir también de preferencia una estación de trabajo automatizada de ácidos nucleicos para aislar ARN mensajero de dicha construcción biológica compleja y un aparato automatizado de manejo de líquidos para preparar muestras de ARN para transcripción inversa y amplificación mediante PCR. El laboratorio de ARN de alto rendimiento puede incluir también un sistema de amplificación mediante PCR cuantitativa de tiempo real. El aparato para la extracción y el aislamiento de moléculas genéticas tales como ADN, ARN, ARNm, ARNr o ARNt de un animal para su uso en el análisis de la expresión genética, comprende un componente para romper las células de la construcción biológica compleja, una cámara para conservar dicha construcción biológica compleja en donde la cámara está diseñada para permitir el movimiento libre de dicho componente a través de la cámara, y medios para aplicar fuerza a la cámara, en donde la construcción biológica compleja es licuada o pulverizada, liberando moléculas genéticas intactas. El aparato para mantener la muestra de ARN a una temperatura entre aproximadamente 0 y 10°C, incluye un bloque de metal novedoso que tiene una pluralidad de cavidades, en donde cada cavidad tiene un extremo superior cilindrico abierto y un extremo inferior cónico cerrado, y acomoda un receptáculo de muestras biológicas que tiene sustancialmente la misma forma que dicha cavidad. Cada cavidad mantiene la temperatura de una muestra biológica en el receptáculo durante la disposición de las muestras y antes del análisis mediante reacción en cadena de polimerasa y transcriptasa inversa, y es útil con relación a un dispositivo automatizado de manejo de líquidos. Otro aparato que puede usarse para mantener la muestra de ARN a una temperatura entre aproximadamente 0 y 10°C comprende una incubadora, una máquina de análisis cuantitativo y un mecanismo de transferencia para la transferencia automatizada de una placa hacia y desde la incubadora, y hacia y desde la máquina de análisis cuantitativo ("el mecanismo"). La placa (referida a veces como una "microplaca") es mantenida en una hilera en la incubadora antes del análisis en la máquina cuantitativa, a una temperatura abajo de aproximadamente 10°C. El mecanismo mueve la placa desde un dispositivo de manejo de líquidos, o desde un apilador de placas, en donde la placa puede estar en la hilera, y transfiere la placa hacia la incubadora. Después, la placa es removida de la incubadora por el mecanismo, y colocada en una máquina de análisis cuantitativo. El laboratorio de la presente invención tiene también un programa de cómputo para analizar un experimento que detecta ARN de una configuración de placa bidimensional. Un medio legible en computadora contiene instrucciones para controlar un sistema de cómputo en el análisis de un experimento, para detectar ARN en una muestra. El medio usable en computadora tiene un código de programa legible en computadora incluido en el mismo, para determinar la presencia de ARN en una muestra contenida dentro de una capa de colorante de una cavidad de una placa. Un dispositivo de almacenamiento del programa legible por una computadora, describe tangiblemente el programa de instrucciones ejecutado por la computadora, y realiza los pasos del método para analizar la presencia de ARN en una muestra. Provisto también es un medio legible en computadora que contiene una estructura de datos. Una memoria para almacenar datos para acceso por el programa de cómputo, comprende la estructura de datos. La combinación de extraer ARN de una construcción biológica compleja, mantener la temperatura del ARN y los reactivos entre aproximadamente 0 y 10°C, y preparar el análisis con ayuda del programa de cómputo, provee un laboratorio de ARN de alto rendimiento extremadamente eficiente. El foco de este laboratorio no está en extraer altas cantidades de ARN para muestreo. Más bien, cantidades suficientes de ARN de alta calidad para transcritos de genes múltiples, se necesitan y se analizan rápidamente.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Para mejor entendimiento de la invención, y para mostrar a manera de ejemplo cómo la invención puede llevarse a cabo en efecto, se hace ahora referencia a la descripción detallada de la invención junto con las figuras acompañantes, en las cuales números correspondientes en las diferentes figuras se refieren a partes correspondientes, y en las cuales: La figura 1 es un diagrama de flujo lógico que describe la metodología general usada en un sistema de cómputo de la presente invención, para analizar un experimento para detectar ARN o ADN de una configuración de placa bidimensional.

La figura 2 es un diagrama de flujo lógico que describe el paso 1, información del experimento, de la metodología general usada en el sistema de cómputo. La figura 3 es un diagrama de flujo lógico que describe el paso 2, información de las placas, de la metodología general usada en el sistema de cómputo. La figura 4 es un diagrama de flujo lógico que describe el paso 3, plan de las placas, de la metodología general usada en el sistema de cómputo. La figura 5 es un diagrama de flujo lógico que describe el paso 4, información de grupos, de la metodología general usada en el sistema de cómputo. La figura 6 es un diagrama de flujo lógico que describe el paso 5, información de archivos, de la metodología general usada en el sistema de cómputo. La figura 7 es un diagrama de flujo lógico que describe el paso 6, datos en bruto y manejo de datos aberrantes, de la metodología general usada en el sistema de cómputo. La figura 8 es un diagrama de flujo lógico que describe el paso 7, cálculo, de la metodología general usada en el sistema de cómputo. La figura 9 es un diagrama de flujo lógico que describe el paso 8, publicación, de la metodología general usada en el sistema de cómputo. La figura 10 describe una vista en sección transversal de una cámara sellada con elemento de molienda. La figura 11 describe una vista en perspectiva de una cámara sellada con componente de licuefacción/pulverización. La figura 12 describe una vista en perspectiva de un molino congelador adecuado para su uso con relación a la presente invención. La figura 13 describe una vista en perspectiva de un molino mezclador adecuado para su uso con relación a la presente invención. La figura 14 describe una vista en perspectiva de un triturador de tejidos adecuado para su uso con relación a la presente invención. La figura 15 es un diagrama de flujo general de una primera modalidad del laboratorio de ARN de alto rendimiento de la presente invención. La figura 16 es un diagrama de flujo de la preparación de tejido licuado. La figura 17 es un diagrama de flujo de la máquina de preparación de ácidos nucleicos ABI 6700. La figura 18 es un diagrama de flujo de la máquina de preparación de ácidos nucleicos ABI 6100. La figura 19 es un diagrama de flujo del procedimiento para preparar la muestra para análisis Taqman. La figura 20 es un diagrama de flujo del análisis de ARN preparado en las máquinas ABI 7900 o ABI 7700. La figura 21 A es una vista en perspectiva del bloque de metal adecuado para tubos de polipropileno. La figura 21 B es una vista en perspectiva del bloque de metal adecuado para un formato de 96 cavidades. La figura 22 es una vista esquemática del bloque de metal y receptáculos de muestras biológicas. La figura 23 es una vista en sección transversal del bloque de metal. La figura 24 es una vista en perspectiva de un dispositivo de manejo de líquidos adecuado para su uso con relación a la presente invención.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención es un laboratorio de ARN de alto rendimiento que aplica un método novedoso de análisis de ARN. En el laboratorio de la presente invención, el método comprende los pasos de extraer ARN de una construcción biológica compleja en cantidades suficientes para proveer datos de ARN precisos, transferir el ARN a un aparato que mantiene el ARN y los reactivos necesarios a una temperatura entre aproximadamente 0 y 10°C, y analizar los niveles y la función del ARN con un análisis matemático de los datos generado por computadora. La construcción biológica compleja puede ser pulverizada o licuada. El ARN es después aislado y purificado en una estación de trabajo automatizada de ácidos nucleicos. El laboratorio de ARN de alto rendimiento de la presente invención comprende un aparato para extraer y aislar ácidos nucleicos de una construcción biológica compleja, un aparato para mantener dichas muestras de ARN a una temperatura entre aproximadamente 0 y 10°C, y un programa legible en computadora para su uso con relación a un aparato de presentación visual de información. El programa legible en computadora hace que una computadora calcule y presente visualmente valores de ciclo umbral, un delta C-T, un delta delta CT y un cambio de transcripción relativo (XRel), de la muestra de ARN. El laboratorio de la presente invención puede incluir también una estación de trabajo automatizada de ácidos nucleicos para aislar ARN mensajero de la construcción biológica compleja y un aparato automatizado de manejo de líquidos para preparar muestras de ARN para transcripción inversa y amplificación mediante PCR. El laboratorio de ARN de alto rendimiento incluye además un sistema de amplificación mediante PCR cuantitativa de tiempo real. Como se describe en la solicitud de patente de E.U.A. número de serie 60/360,136, presentada en febrero 26 de 2002, solicitud de patente de E.U.A. número de serie 60/411 ,174, presentada en septiembre 17 de 2002, solicitud de patente de E.U.A. número de serie 60/41 1 ,175, presentada en septiembre 17 de 2002 y la solicitud de patente de E.U.A. número de serie no asignado, presentada en octubre/noviembre de 2002, incorporadas en su totalidad en la presente, y para facilitar el entendimiento de esta invención, se definen a continuación varios términos. Los términos definidos en la presente tienen significados como lo entienden comúnmente los expertos en la técnica en las áreas relevantes a la presente invención. No se pretende que términos tales como "un", "una" y "la" se refieran solamente a una entidad singular, sino incluyan la clase general de la cual puede usarse un ejemplo específico para ilustración. La terminología de la presente se usa para describir modalidades específicas de la invención, pero su uso no limita la Invención, salvo como se describe en las reivindicaciones. Como se usa a lo largo de la presente especificación, se usan las siguientes abreviaturas: CT significa valor de ciclo umbral, y es el ciclo durante la PCR cuando existe un incremento detectable en la intensidad de señal o fluorescencia arriba de la línea de referencia. CV significa el coeficiente de variación que se calcula para cada serie de cavidades de réplica que tienen la misma marca de grupo, ID de la muestra, y gen. ACt (referido también como "delta CT") = media (valores de CT para FPR de la muestra) - media (FPR del control endógeno de los valores de CT). Vehículo de la media de ACT (grupo comparador) = media (ACT para todas las amplificaciones del grupo de FPR en el grupo comparador). Vehículo de la mediana de ACT (grupo comparador) = mediana (ACT para todas las amplificaciones del grupo de FPR en el grupo comparador). ???t (referido también como "delta delta CT") = (AC para la muestra, tratada o enferma) - vehículo de la mediana de ACT (grupo comparador). E significa la eficiencia de amplificación para cada experimento, y se asume que es 1 (uno). El grupo de FPR significa grupo de iniciador hacia delante, sonda e iniciador inverso, usado para identificar la presencia de un gen. -RT significa menos (-) transcriptasa inversa, una amplificación usada para determinar si existen contaminantes de ADN en el ARN. Una cavidad de -RT contiene ARN y un grupo de FPR, pero no contiene transcriptasa inversa. Las cavidades de menos transcriptasa inversa se refieren a cavidades de muestras que tienen el mismo ARN y grupo de FPR que la cavidad de -RT. NTC significa sin control de molde, y es una cavidad que no contiene ARN. PCR significa reacción en cadena de polimerasa. Rn> señal normalizada del reportero, se determina que es la actividad de la señal del colorante reportero dividida entre la actividad de la señal del colorante de referencia pasivo. RT significa transcriptasa inversa. XRel significa cambio de transcripción relativo, o nivel de expresión relativo, del gen.

Otros términos como se usan a lo largo de la especificación, se definen de la manera siguiente: Amplificación, cuando se usa con relación a ácidos nucleicos, se refiere a la producción de un gran número de copias de una secuencia de ácido nucleico mediante cualquier método conocido en la técnica. La amplificación es un caso especial de replicación de ácidos nucleicos que incluye carácter específico del molde. Comparador o grupo comparador se refiere a la muestra usada como la base para los resultados comparativos. Construcción biológica compleja significa cualquier porción de un animal que tenga más de un tipo de tejido. La construcción biológica compleja puede comprender una extremidad completa de un animal u otra estructura anatómica gruesa tal como apéndices, órganos, conjunto de órganos o sistemas de órganos. La construcción biológica compleja puede incluir, pero no está limitada a, cabello, hueso, sangre, vasos sanguíneos, músculos, tejido conectivo, cartílago, nervio, médula ósea, epitelio y tejidos adiposos. Colorante se refiere a cualquier molécula fluorescente o no fluorescente que emite una señal tras la exposición a la luz, como es evidente para los expertos en la técnica de biología molecular. El colorante reportero se refiere al colorante usado con el ARN de la muestra. Control endógeno se refiere a un ARN o ADN que está siempre presente en cada muestra experimental. Mediante el uso de un ARN mensajero (ARNm) endógeno, el objetivo puede normalizarse para diferencias en la cantidad de ARN total añadido a cada reacción. Típicamente, el control endógeno es un gen de mantenimiento requerido para mantenimiento celular, tal como un gen para enzima metabólica o el ARN ribosomal. Control exógeno se refiere a un ARN o ADN caracterizado no seleccionado en cada muestra a una concentración conocida. Una referencia activa exógena es usualmente una construcción in vitro que puede usarse como un control positivo interno (IPC) para distinguir objetivos negativos verdaderos de la inhibición de la PCR. Una referencia exógena puede usarse también para normalizar diferencias en eficiencia de extracción de muestras o síntesis de ADN complementario (ADNc) mediante transcriptasa inversa. Experimento significa un grupo de placas analizadas en conjunto. Gen se usa para referirse a una unidad funcional que codifica para proteínas, polipéptidos o péptidos. Como lo entenderán los expertos en la técnica, este término funcional incluye secuencias genómicas, secuencias de ADNc, o fragmentos o combinaciones de los mismos, así como productos génicos que incluyen los que pueden haber sido alterados por la mano del hombre. Genes, ácidos nucleicos, proteínas y similares purificados, se usan para referirse a estas entidades cuando se identifican y se separan de por lo menos una proteína o ácido nucleico contaminante con el cual se asocian ordinariamente. Moléculas genéticas, como se refieren en la presente, incluyen ADN genómico, ADN episómico, ARN mensajero ("ARNm"), ARN heteronuclear ("ARNhn"), ARN de transferencia ("ARNt") y ARN ribosomal ("ARNr"). Licuefacción y licuar se refieren a cualquier procedimiento en el cual un sólido o suspensión sólida es homogenizado, de modo que el material parece ser un líquido. El material puede ser, de hecho, una solución, o suspensión de partículas de tamaño submicroscópico. PRC de correlación múltiple significa el uso de más de una capa de colorante en un experimento, y/o más de un grupo de FPR con un colorante reportero asociado en cada cavidad de una placa. En una cavidad, el ARN objetivo y el control endógeno se amplifican mediante diferentes grupos de FPR. Todas las cavidades en una placa en un experimento contendrán siempre el mismo grupo de FPR endógeno. Si existen tres grupos de FPR usados en el experimento, entonces todas las cavidades tendrán por lo menos uno de los mismos tres grupos de FPR, a menos que las cavidades sean cavidades vacías en la placa. Cada grupo de FPR tiene un colorante reportero asociado. Se reporta un valor de CT para cada grupo de FPR en cada cavidad. Se registra un valor de CT para cada capa de colorante en cada cavidad en la placa. Página de libreta significa una página en una libreta usada para seguir la pista de experimentos y otra información confidencial. Acido nucleico se refiere a ADN o ARN, de cadena sencilla o de doble cadena, y cualquier modificación química de los mismos. Las modificaciones incluyen, pero no están limitadas a, las que añaden otros grupos químicos que proveen carga adicional, polarizabilidad, formación de puentes de hidrógeno e interacción electrostática. Control de consistencia de la placa significa un ARN especificado, el cual se pone en cada placa en experimentos de placas múltiples para garantizar consistencia a través de las placas. Iniciador se refiere a un oligonucleótido, ya sea purificado o producido en forma sintética, el cual es capaz de actuar como un punto de inicio de la síntesis cuando se pone bajo condiciones en las cuales se induce la síntesis de un producto de extensión del iniciador que es complementario a una cadena de ácido nucleico (es decir, en presencia de nucleótidos y un agente inductor tal como ADN polimerasa y a una temperatura y pH adecuados). El iniciador puede ser de cadena sencilla para eficiencia máxima en la amplificación, pero puede ser en forma alternativa de doble cadena. Si es de doble cadena, el iniciador se trata primero para separar sus cadenas antes de que sea usado para preparar productos de extensión. El iniciador debe ser suficientemente largo para iniciar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los iniciadores dependerán de muchos factores, que incluyen temperatura, fuente del iniciador y el uso del método. Sonda se refiere a cualquier compuesto que puede actuar sobre un ácido nucleico en una forma deseable predeterminada, incluyendo una proteína, péptido, ácido nucleico, carbohidrato, lípido, polisacárido, glucoproteína, hormona, receptor, antígeno, anticuerpo, virus, patógeno, sustancia tóxica, substrato, metabolito, análogo de estado de transición, cofactor, inhibidor, fármaco, colorante, nutriente, factor de crecimiento o célula. Se refiere también a una secuencia de nucleótidos, ya sea purificada o producida en forma sintética, en forma recombinante o mediante amplificación por PCR, la cual es capaz de hibridar con otra secuencia de nucleótidos de interés. Una sonda puede ser de cadena sencilla o de doble cadena. Las sondas son útiles en la detección, identificación y aislamiento de secuencias génicas particulares. Se contempla que cualquier sonda usada en la presente invención será marcada con una "molécula reportera", de modo que sea detectabie en cualquier sistema de detección que incluya, pero no esté limitado a, enzima (por ejemplo, ELISA, así como pruebas histoquímicas basadas en enzimas) o sistemas fluorescentes, radiactivos y luminiscentes. No se pretende que la presente invención se limite a alguna marca o sistema de detección particular. Referencia se refiere a una señal pasiva o activa usada para normalizar resultados experimentales. Controles endógenos y exógenos son ejemplos de referencias activas. Referencia activa significa que la señal se genera como resultado de amplificación mediante PCR. La referencia activa tiene su propio grupo de iniciadores y sonda. ARN de la muestra o muestra se refiere a un ARN de cadena sencilla o de doble cadena usado en uno o más experimentos, que puede obtenerse de un donador tal como una persona, animal o cultivo de células. Cuando es de un animal o persona, puede ser de una variedad de fuentes diferentes, que incluyen sangre, plasma, orina, semen, saliva, fluido linfático, fluido meníngeo, fluido amniótico, fluido glandular y fluido cerebroespinal, o de soluciones o mezclas que contengan material sólido homogenizado, tales como heces, células, tejidos y muestras para biopsia. Una muestra de ARN puede usarse para determinar la expresión de uno o más genes. La misma serie de genes se usa con cada muestra en el mismo experimento. Estándar se refiere a una muestra de concentración conocida usada para construir una curva estándar. Vehículo se refiere a sustancias que se inyectan en un animal como vehículos para un compuesto de prueba. Vehículos comunes incluyen agua, soluciones salinas, compuestos orgánicos fisiológicamente compatibles tales como varios alcoholes, y otros vehículos bien conocidos en la técnica. Vehículo puede referirse también a un animal control inyectado con dicho vehículo en ausencia de un compuesto de prueba. El vehículo animal sirve como un control para imitar alteraciones de la transcripción que resultan de la carga de la administración, pero no del fármaco mismo.

Cálculos Como se describe en detalle a continuación, se usan los siguientes cálculos con relación a la presente invención: % de CV para valores de CT (coeficiente de variación) = 100* (desviación estándar/media) XRel (cambio de transcripción relativo o nivel de expresión relativo). Este valor se calcula como (1 + E) ( T para grupo de FPR), en donde E refleja la eficiencia de amplificación y se asume que es 1. E se almacena como un parámetro experimental y puede cambiarse si es necesario por el experimento determinado. Los valores de XRel mayores de 1 (uno) indican más expresión génica en la muestra de ARN que en el grupo comparador del gen particular. En forma similar, los valores de XRel menores de 1 (uno), indican menos expresión génica en la muestra de ARN que en el grupo comparador del gen particular. Media de XRel del grupo = media (XRel de cada amplificación del grupo de FPR en el grupo). Desviación estándar de XRel del grupo = desviación estándar (XRel de cada amplificación del grupo de FPR en el grupo). Error estándar de la media del XRel del grupo = desviación estándar (XRel de cada amplificación del grupo de FPR en el grupo/(n)"5, en donde n es el número de amplificaciones con el grupo de FPR en el grupo). % de CV del XRel = 100* error estándar de la media del XRel *SQRT (n)/media del XRel, en donde n es el número de moléculas de ARN del grupo. Si los iniciadores de amplificación se optimizan para eficiencia de amplificación (es decir, E = 1), XRel, la cantidad de una muestra de ácido nucleico normalizada a una referencia endógena y respecto a un grupo comparador, puede calcularse mediante la fórmula matemática: XRel = 2" CT La fórmula anterior se derivó de la manera siguiente: La amplificación exponencial que resulta de una reacción de PCR determinada, puede representarse mediante la fórmula: Xn = X0 x ( l + EX )" en donde Xn es el número de moléculas de la muestra después de n ciclos, X0 es el número inicial de moléculas de la muestra; Ex es la eficiencia de amplificación de la muestra; y n es el número de ciclos. Esta fórmula se usa entonces para calcular la cantidad de producto presente en el ciclo umbral, Cy. El ciclo umbral es el punto en el cual la cantidad de muestra aumenta arriba de un umbral establecido, típicamente en donde la amplificación exponencial puede detectarse primero arriba del ruido de fondo del experimento. En este punto, la cantidad de producto es: XT = X0 x (1 + EX)CT X = KX en donde ?t es el número de moléculas de la muestra en el ciclo umbral, CT,x es el número de ciclos en el cual la cantidad de la muestra excede el valor umbral, y Kx es una constante. Además, puede usarse una fórmula similar para calcular la cantidad de muestra amplificada en la reacción control de la referencia endógena en su ciclo umbral: RT = RO X ( 1 + ER )C™= KR en donde RT es el número de copias de la referencia endógena amplificada en su ciclo umbral, R0 es el número inicial de copias de la referencia endógena, ER es la eficiencia de amplificación de la referencia endógena, CT,R es el número de ciclos umbrales para la referencia endógena en donde la referencia amplificada excede el valor umbral, y KR es una constante para la referencia endógena.

El número de moléculas de la muestra (Xj) en el ciclo umbral de la muestra, se divide entonces entre el número de moléculas de referencia endógenas en el ciclo umbral de referencia para dar una constante designada como K: La constante, K, no es necesariamente igual a 1 debido a que los valores exactos de ?? y RT pueden variar por muchas razones que dependen de los colorantes reporteros usados en las sondas, los efectos diferenciales de las secuencias de la sonda en la fluorescencia de las sondas, la eficiencia de desdoblamiento de la sonda, la pureza de las sondas, y el ajuste del umbral de fluorescencia. Si se asume que las eficiencias de amplificación de la muestra y la referencia endógena son ¡guales, es decir, Ex = ER = E, la ecuación anterior puede simplificarse hasta: X0 x (1 + E)CTX -CT R = K Ro la puede rescribirse como: XNX(1 +E)ACR = K. en donde XN es la cantidad normalizada de la muestra (Xo/Ro); y ??t es la diferencia en ciclos umbrales para la muestra y la referencia (CT,X - CT,R). La ecuación puede volver a disponerse de la manera siguiente: XRel se obtiene entonces dividiendo la cantidad normalizada de la muestra respecto al control endógeno, entre la cantidad normalizada del comparador respecto al control endógeno, según se representa mediante la ecuación: XN. g = X ( 1 + ? )"?€t " = ( I + E )" ^CT XN, cb x ( l + E)"A°r'cb en donde ??0t = ??t,? - ?0?,0_>· Si los grupos de FPR se optimizan adecuadamente para la eficiencia de amplificación, E debe ser casi igual a 1 , y la ecuación puede simplificarse hasta: XRel = ZA Cr Para un experimento determinado, como se discute en detalle a continuación, el ARN de la muestra puede obtenerse de una variedad de fuentes de tejido. La muestra puede ser tejido de un órgano particular de un animal o sangre de un animal, o una combinación de los mismos. La muestra podría ser de cultivos de células. A pesar de todo, existe típicamente más de una muestra que tiene la misma característica. La característica común puede ser el tipo de tratamiento recibido (vehículo, compuestos, etc.), la especie, sexo o edad del donador, o algún otro tratamiento similar. Se asigna una marca de grupo a cada grupo de muestras que comparten la misma característica. Los experimentos de cultivo de células en los cuales cada cavidad en la placa de cultivo de células se trata diferentemente y no se replica en otra placa de cultivo de células, resultarán en sólo una muestra por grupo. El análisis estadístico asume que existe más de una muestra por grupo, y que cada muestra es independiente de otras muestras tratadas de la misma forma.

Uno de los grupos debe identificarse como el grupo comparador.

Es con frecuencia el vehículo o el grupo no tratado. El grupo comparador puede ser también una edad o punto de tiempo particular en el experimento. El grupo comparador es el único grupo con el cual se compararán los demás grupos en ese experimento. Por ejemplo, el grupo comparador puede ser la muestra no tratada o normal con la cual se comparan las muestras tratada o enferma. Todos los valores de expresión relativos se definen respecto al grupo comparador, siendo iguales, mayores o menores que el grupo comparador.

Ocasionalmente en un experimento, puede haber la necesidad de calcular valores de expresión relativos varias veces usando más de un grupo comparador. Por ejemplo, puede ser necesario ver los cambios de veces relativos en un mensaje comparados con puntos de tiempo diferentes en un experimento, creando de esta manera la necesidad de ser capaz de cambiar fácilmente el grupo comparador y de volver a calcular rápidamente los valores de expresión relativos.

Para llevar a cabo el experimento para detectar ARN en la muestra, puede usarse la tecnología actual de placas de 96 ó 384 cavidades. Valores de CT de cada cavidad son provistos típicamente por el fabricante del sistema de reacción en cadena de polimerasa (referido de otra manera en la presente como el sistema de detección de secuencias). Puede identificarse que cada cavidad contiene ARN de la muestra o uno de varios tipos de controles de prueba.

Puede haber uno o más tipos de cavidades control en cada placa, o puede no haber cavidades control. El tipo de control más común ocurre cuando el experimento se lleva a cabo en más de una placa, y se denominará por lo tanto control de la placa. El control de la placa tiene la misma fuente de ARN en todas las placas, y se monitorea para determinar si existe consistencia en los resultados a través de las placas. El control de la placa puede ser una de las muestras para la cual existe ARN suficiente para repetirlo en todas las placas. Otro tipo de cavidad control se denomina control sin molde, o NTC, en donde no está presente ARN. De esta manera, este control se usa para determinar la señal de fondo. Un tercer tipo de cavidad control se denomina control de menos transcriptasa inversa, o -RT. Estas cavidades no contienen transcriptasa inversa. De esta manera, este control se usa para verificar si están presentes contaminantes de ADN en la preparación de ARN. Si existen placas múltiples y no se usan tarjetas personalizadas, debe haber controles de las placas en cada placa. Estos controles de ARN se comparan usualmente con cada gen (incluyendo controles endógenos), estando en las mismas hileras o en las mismas columnas que las muestras de ARN para ese gen.

Todas las muestras y controles se replican, teniendo dos o más cavidades para cada muestra o control. Las réplicas deben estar en la misma placa, y estarán usualmente en la misma hilera o en la misma columna. Las muestras de ARN pueden ponerse a prueba para la expresión de uno o más genes. La misma serie de genes se usa con cada muestra en el mismo experimento. Habrá comparación de cavidades de control endógeno para cada serie de cavidades de genes en la misma placa que se usarán en los cálculos. El control endógeno más común es la ciclofilina. Estos controles endógenos estarán usualmente en las mismas hileras o en las mismas columnas, que la muestra de genes. Si se introduce una muestra para genes múltiples en la misma placa, el mismo control endógeno se usa para todos los genes. Si más de un control endógeno está presente, sólo se identificará uno para su uso en los cálculos. Una excepción ocurre cuando se usan placas personalizadas. Por ejemplo, una muestra de ARN puede analizarse para los niveles de transcripción de genes más un control endógeno. Tener el control endógeno contenido en la misma cavidad que el gen, se denomina correlación múltiple. De preferencia, cada cavidad es especificada por la siguiente información: 1) ubicación de la cavidad en la placa o tarjeta personalizada, 2) tipo de muestra (no usada, control de prueba, muestra de ARN o control.de prueba y muestra de ARN), 3) marca de grupo (tal como grupo de tratamiento, especie, sexo, edad, tipo de control, etc.), 4) ID de la muestra (usualmente un número) dentro del grupo, 5) número de los grupos de FPR que identifican a los genes. Si el tipo de muestra es el control de prueba, la marca de grupo identificará al tipo de control como control de ARN de la placa, NTC o -RT. Puede usarse el campo de ID de la muestra para indicar la muestra de ARN particular que corresponde al control. Por ejemplo, cada ARN (ID de la muestra) puede tener una -RT que corresponde al mismo para verificar la contaminación por ADN en esa preparación de la muestra. El número de grupo de FPR identifica la marca del gen para las gráficas y resultados control de ARN, NTC o -RT de la placa. Para las muestras de ARN, la ID de la muestra puede ser una ID de ARN de base de datos remota o un nombre o número asignado. Puede haber dos números de grupo de FPR para la misma cavidad, uno para el control endógeno y uno para el gen, si se está llevando a cabo correlación múltiple, como en tarjetas personalizadas. La correlación múltiple puede hacerse en muestras regulares o en placas personalizadas, pero no se hace necesariamente en alguna de las mismas. Si se van a hacer comparaciones estadísticas entre los grupos, siempre que sea posible, es deseable tener las muestras para los varios grupos en la misma placa. Sin embargo, se entiende que este tipo de disposición de la placa no siempre es posible. El coeficiente de variación (100 x desviación estándar/media), o CV, puede calcularse para cada serie de cavidades de réplica que tengan la misma marca de grupo, ID de la muestra, y gen. Se muestra la ubicación de las cavidades o series de cavidades en donde el CV excede un valor de referencia (actualmente 2%, pero puede ser menor), o un valor que sea especificado por el usuario. El usuario puede elegir entonces si debe eliminar una o más de esas cavidades del procesamiento posterior. El promedio de los valores de réplica se calcula para cada control de prueba, control endógeno, y gen. Un valor de ACT (delta CT) se calcula para cada combinación de gen/muestra de ARN como el CT promedio para el gen, menos el CT promedio para el control endógeno para esa muestra. Los cálculos descritos hasta ahora pueden realizarse al nivel de placa. El resto de los cálculos requiere que estén disponibles los datos para todas las placas. Todas las muestras para el grupo comparador pueden no estar en la misma placa. Asimismo, las muestras para el grupo comparador pueden o no estar en la misma placa que las muestras para los otros grupos. La mediana de los valores de Cj se determina para todas las muestras en este grupo comparador, sin importar la ubicación de la placa. Entonces, se calcula un valor de ?? (delta delta CT) como el valor de ACT para cada muestra menos la mediana (valor intermedio o promedio de dos valores intermedios) del valor de ACj para el grupo comparador. Como se mencionó anteriormente, el cambio de transcripción relativo (o nivel de expresión relativo), XRel, se calcula como (1 + E)(~ CT). E refleja la eficiencia de amplificación y valores predeterminados a 1. Puesto que ???t será de aproximadamente cero para el grupo comparador, su valor de XRel será cercano a 1. Valores de XRel mayores de 1 indican más expresión que el grupo comparador, mientras que valores de XRel menores de 1, indican menos expresión que el grupo comparador por el gen particular. Existen reglas especiales para la correlación múltiple. Cuando existe correlación múltiple, cualquier grupo de FPR determinado no puede existir en más de una combinación de grupos de FPR. Por ejemplo, si el gen 2 existe en una cavidad con ei gen 1 y el control endógeno ("EndoCT"), entonces el gen 2 SOLO puede existir en cavidades que contengan también el gen 1 y el control endógeno ("EndoCT"). El gen 2 no puede existir en una cavidad de cualquier otra combinación. Por ejemplo, el gen 2 no puede existir en una cavidad que contenga el gen 3 y el EndoCj- Cualquier experimento de correlación múltiple que no siga esta regla, resultará en el reporte de cálculos inválidos. La presente invención es adecuada para cualquier configuración de placa bidimensional que incluya, pero no esté limitada a, placas de 96 cavidades, placas de 384 cavidades, personalizadas o estandarizadas. La invención tiene la capacidad de analizar datos de un experimento de placas parciales, placas individuales o placas múltiples. Puede acomodarse también análisis de colorantes individuales o colorantes múltiples (con correlación múltiple). El código del programa legible en computadora aceptará cualquier plan de placas, número ilimitado de muestras de ARN y número ilimitado de series de sondas/iniciadores (grupos de FPR) en un experimento. Los archivos de resultados exportados de algún ciclo de experimentos, pueden cargarse en el programa para cálculo. Como parte de la presente invención, el usuario puede elegir qué grupo de FPR se tratará como el control endógeno, y qué grupo de ARN se tratará como el grupo comparador, haciendo posible comparar reportes con diferentes combinaciones de control endógeno y grupo comparador. Además, puede calcularse el por ciento de CV (% de CV) entre las cavidades de réplica en una placa, y se señalizan las réplicas de datos aberrantes. Pueden calcularse también la media, desviación estándar y error estándar de la media, entre los grupos de ARN. Como se describe en detalle a continuación, el análisis del experimento incluye una serie de pasos. Los resultados del análisis pueden presentarse visualmente en un libro de trabajo y similares de Microsoft Excel, o en un aparato de presentación visual de información. Existen varios niveles de documentación y presentación visual de información. A partir del sistema de PCR, típicamente se obtiene una salida de impresora u otra presentación visual que muestra los detalles de los valores de CT para cada cavidad en la placa. La presente invención calcula y presenta visualmente a partir de estos valores, por gen, los valores de CT, ACT, AACt y XRel para cada muestra en cada grupo. Además, puede mostrarse un resumen para cada grupo y gen que contenga la estadística descriptiva para el grupo (n, media y error estándar de la media). Puede producirse una gráfica para cada gen que presente visualmente las medias de grupo (con barras de errores). Además, debe generarse un archivo de salida electrónico que contenga los valores de XRel para cada muestra junto con la marca del gen, marca de grupo e ID de la muestra. Este archivo de salida puede usarse entonces para más análisis estadístico. Pueden producirse archivos de bases de datos más detallados usando los valores originales del lector de placa de modo que, si se desea, pueden volver a hacerse cálculos, ejercitando diferentes opciones. Pueden producirse gráficas para propósitos de validación de la prueba. Asumiendo que los valores de CT están disponibles en la misma placa para muestras de control endógeno y controles de prueba, se produce una gráfica cuyo eje X puede presentar visualmente el promedio de CT de las cavidades de control endógeno que se usaron para calcular el ACT para todos los genes en la placa. El eje Y puede presentar entonces visualmente los valores de CT para los varios tipos de cavidades control de prueba, por gen, incluyendo controles endógenos. El símbolo impreso refleja la marca del gen, como se describe en una leyenda. Puede haber tantos de cada símbolo, como existen placas en la prueba. Si no están disponibles muestras del control de prueba, puede proveerse una gráfica de barras de las cavidades de control endógeno. La barra para cada placa refleja la media, mientras que las barras de errores reflejan los valores de CT mínimo y máximo. Pueden producirse también tablas y gráficas similares para controles de NTC y -RT. Como se muestra en las figuras 1 a 9, el método de la presente invención comprende muchos pasos específicos. La figura 1 describe la metodología general de la presente invención. Las figuras 1 a 9 son diagramas de flujo lógico que describen la metodología general usada en un sistema de cómputo de la presente invención, para analizar un experimento para detectar ARN. La figura 2 es un diagrama de flujo del primer paso, el registro de la información del experimento. Para crear un nuevo experimento, se presenta visualmente una pantalla separada y se provee información tal como ID del experimento, descripción, capas de colorante y otros parámetros que incluyen referencia de las páginas del libro de notas, cese de datos aberrantes, y eficiencia de amplificación "E". Pueden eliminarse también experimentos de la base de datos. Sin embargo, se recomienda que se anexe un privilegio a esta función. En el paso 2, se especifica la información de la placa que incluye el número de placas y el tipo de placas. La figura 3 es un diagrama de flujo de este segundo paso. Pueden especificarse placas reales o virtuales. Una placa virtual puede ser una placa de un experimento previo. Pueden seleccionarse placas de tamaño variable. Para un nuevo experimento, no existen ¡nicialmente placas definidas. Pueden añadirse placas al experimento en un número ilimitado como placas reales o virtuales. Las placas reales son las nuevas placas definidas por el experimento actual. Los archivos de datos obtenidos al momento del experimento deberán analizarse y registrarse bajo la placa adecuada. Se selecciona también un tipo de placa tal como una placa de 96 cavidades o 384 cavidades o tarjeta personalizada. Las placas virtuales son placas que ya existen en otro experimento. Los datos para estas placas se obtuvieron en el otro experimento. Las placas virtuales son opcionales. Por ejemplo, el primer experimento es en el tiempo cero, el segundo experimento es en el tiempo 3 meses, y el tercer experimento y experimento actual es en el tiempo 6 meses. El análisis para este experimento actual incluiría los datos de la placa de los dos experimentos anteriores, tiempo cero y tiempo 3 meses. El experimento actual, tiempo 6 meses, incluiría entonces sus propias placas (placas reales), junto con las placas de los dos experimentos anteriores, tiempo cero y tiempo 3 meses, como placas virtuales. Cuando se añaden placas virtuales a un experimento, los colorantes usados en la placa virtual, deben igualar los colorantes para el experimento. Por ejemplo, un experimento que se define usa el colorante FAM, no puede tener una placa virtual que use el colorante VIC. Cuando se especifica la información de la placa, se incluye información acerca de la placa particular, tal como el número de cavidades, tipo de cavidad, capas de colorante y grupo de FPR. El contenido de la cavidad o tipo de cavidad puede ser menos RT, control de consistencia de la placa, muestra, y control de consistencia de la placa y muestra. Cada cavidad contiene ARN o su NTC. Todas las cavidades que no estén vacías, contienen un grupo de FPR.

En el paso 3, y como se muestra en la figura 4, se provee el plan de la placa que incluye definir el grupo de FPR y el ARN asociado a cada cavidad en la placa para el experimento. Antes de generar esta información, debe haberse concluido la información del experimento y la información de la placa. Los grupos de FPR se agrupan por capa de colorante y especie. Para aplicar un grupo de FPR, seleccionar las cavidades de interés y seleccionar el grupo de FPR deseado. A la inversa, para remover un grupo de FPR, seleccionar las cavidades de interés y eliminar o remover el grupo de FPR de su designación. Si el experimento es correlacionado en forma múltiple, sólo un grupo de FPR por cada capa de colorante puede usarse en cada cavidad. Capas de colorante se asocian al experimento a través de la información del experimento. Si el experimento no es correlacionado en forma múltiple, sólo un grupo de FPR por cavidad puede especificarse. Cuando se aplican grupos de FPR, si alguna de las cavidades seleccionadas contiene ya un grupo de FPR, no será pasada por alto con el grupo de FPR que se selecciona actualmente. Para reemplazar un grupo de FPR, el grupo de FPR existente debe primero removerse o eliminarse. El ARN es clasificado por el usuario, y una vez que es registrado como parte de una base de datos interna, es referido como registrado. Cuando el usuario cambia, las moléculas de ARN registradas relevantes son enlistadas. Para aplicar el ARN registrado, seleccionar las cavidades de interés y el ARN registrado. Para remover el ARN registrado, seleccionar las cavidades de interés y eliminar el ARN registrado. Sólo puede especificarse un ARN registrado por cavidad. Cuando se aplica el ARN registrado, si alguna de las cavidades seleccionadas contiene ya ARN registrado, será pasada por alto con ARN registrado que se selecciona actualmente. Para reemplazar el ARN registrado, debe removerse. El ARN registrado no puede aplicarse a cavidades de NTC o cavidades vacías. Para crear ARN no registrado o ARN que no ha sido registrado previamente, identificar el número de ARN no registrado por generar. En esta ocasión, el nombre, la página del libro de notas y los comentarios pueden asociarse al ARN no registrado. Esta información del ARN no registrado puede modificarse, si es necesario. El ARN no registrado se asocia entonces con cavidades de interés. Sólo un ARN no registrado puede especificarse por cavidad. No se aplicará ARN no registrado a cavidades que contienen ya ARN no registrado. El ARN no registrado debe removerse de una cavidad antes de seleccionar otro ARN no registrado. Puede no aplicarse ARN no registrado a cavidades de NTC o cavidades vacías. Varios tipos de cavidades están disponibles para su uso con relación al método de la presente invención. Los tipos de cavidades incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: muestra, NTC, RT, consistencia de la placa, muestra y consistencia de la placa, o vacía. La información de la placa que incluye grupos de FPR, ARN registrado, ARN no registrado y tipo de cavidad, puede copiarse de otra placa. Para guardar la información de la placa, las cavidades de los siguientes tipos deben contener ARN y grupos de FPR: menos RT, control de consistencia de la placa, muestra, y control de consistencia de la placa y muestra. Las cavidades de NTC deben contener ua grupo de FPR. Cuando se realiza correlación múltiple, todas las cavidades no vacías deben compartir un grupo de FPR común. El siguiente paso (paso 4) en el método de la presente invención, es crear un poblar grupos de ARN. La figura 5 es un diagrama de flujo de este paso. Un grupo de ARN puede ser sólo un ARN, pero puede contener moléculas de ARN múltiples. Están disponibles moléculas de ARN registradas y no registradas para asignarlas a los grupos. Sólo se provee en la presente ARN que pertenece a una muestra o cavidades de consistencia de la placa y muestra. Cada nuevo grupo de ARN debe tener un nombre de grupo. Cada ARN específico es asignado a un grupo, y puede removerse después, si es necesario. Todas las moléculas de ARN deben asignarse a por lo menos un grupo. En el paso 5, los archivos de datos exportados se asocian a placas reales específicas en el experimento. Como se muestra en la figura 6, la información del archivo para placas virtuales usada en el experimento existe ya, y puede sobrescribirse. Puede usarse cualquiera de muchos formatos de archivos de datos. Si no se especificó un control endógeno, debe seleccionarse en esta ocasión un gen de control endógeno. En el paso 6, los valores de CT pueden revisarse, y los datos aberrantes manejarse. Los datos aberrantes pueden calcularse en cualquier punto, hasta el momento en el que el experimento haya sido publicado. Como se muestra en la figura 7, los datos aberrantes pueden activarse o desactivarse al nivel de cavidad para cada capa de colorante. Dos tipos de datos aberrantes existen, incluyendo datos auto-aberrantes identificados durante el paso de información del archivo, y datos aberrantes del usuario establecidos explícitamente por el usuario. Varios valores de datos aberrantes pueden identificarse a la vez. Cuando se realiza correlación múltiple, los datos aberrantes pueden verse para diferentes capas de colorante. Una vez que todas las capas de colorante han sido accedidas, los datos aberrantes pueden guardarse o recalcularse. Los datos aberrantes se determinan calculando el coeficiente de variación, CV, para cada serie de valores de CT de réplica dentro del mismo grupo de ARN. Un valor de CT de réplica se define como una cavidad de muestra que contiene el mismo grupo de FPR y el mismo ARN. Cuando se realiza correlación múltiple, una cavidad de muestra puede contener valores de CT múltiples. Si el CV para un valor de CT de réplica excede un porcentaje predeterminado, ese valor de CT se marca como un dato auto-aberrante. La marcación de un valor de CT como un dato auto-aberrante, indica que el usuario debe revisar ese valor de CT para precisión. Si el usuario determina que el valor de CT no debe incluirse en algún cálculo, el usuario tiene la capacidad de marcarlo como un dato aberrante del usuario. La marcación de un valor de CT como un dato aberrante del usuario, evita que el valor sea usado en algún cálculo. En el paso 7, como se muestra en la figura 8, los cálculos concluyen. Primero, se seleccionan los grupos comparativo y control endógeno. Los grupos comparativo y control endógeno son la base que sustenta el cálculo reportado para todos los genes. La elección de diferentes grupos comparativos, es una característica única del método de la presente invención. A través de esta característica, es posible comparar resultados de delta delta CT y XRel con diferentes grupos comparativos. El usuario puede excluir datos aberrantes marcados, si es necesario. El control endógeno es seleccionado inicialmente por el usuario en los datos de tiempo que se analizan para el experimento (paso 5 descrito anteriormente). El procedimiento de datos auto-aberrantes se lleva a cabo cada vez que los datos se cambian en el análisis del experimento. El usuario puede seleccionar un control endógeno diferente durante los cálculos (paso 7) del análisis. Si el control endógeno se cambia, el usuario puede iniciar de nuevo el procedimiento de datos aberrantes para reflejar un cambio en el control endógeno. Para determinar el valor de expresión relativo de alguna muestra determinada, debe seleccionarse una muestra (ARN) o un grupo de muestras (grupo de moléculas de ARN) como un comparador. El grupo comparador es uno con el cual se compararán los demás grupos. Todos los valores de expresión relativos se definen respecto al grupo comparador, siendo ¡guales, mayores o menores que el grupo comparador. Ocasionalmente en un experimento, puede haber la necesidad de calcular varias veces valores de expresión relativos, usando más de un grupo comparador. Por ejemplo, puede ser necesario ver cambios de veces relativos en un mensaje en comparación con diferentes puntos en el experimento, creando de esta manera la necesidad de ser capaz de cambiar fácilmente el grupo comparador y recalcular rápidamente los valores de expresión relativos. La capacidad para seleccionar diferentes grupos comparadores es una característica de la presente invención, que hace posible comparar resultados de ???t y XRel usando diferentes grupos comparadores. Se hacen cálculos con respecto a cada control endógeno para cada grupo de FPR a través de todas las moléculas de ARN para lo siguiente: media, % de CV y delta CT. LOS cálculos para cada grupo comparador incluyen media y mediana de delta CT- A través de todas las moléculas de ARN con respecto al grupo comparador, se calcula el delta delta CT y el XRel para cada grupo de FPR. Se calcula la media de XRel, desviación estándar de XRel, error estándar de la media de XRel y % de CV de Xrel, para cada grupo de FPR a través de todas las moléculas de ARN, excluyendo el control endógeno. La presente invención es un método y aparato para la extracción y el aislamiento de moléculas genéticas tales como ADN, ARN, ARNm, ARNr o ARNt de un animal, para su uso en el análisis de la expresión genética. Los presentes método y aparato de la presente invención, son particularmente útiles en el análisis automatizado de alto rendimiento de la función y los niveles genéticos moleculares. Para extraer y aislar moléculas genéticas para su uso en el análisis anterior, la presente invención incluye además un método de extracción y aislamiento de expresión genética, que comprende los pasos de licuar o pulverizar una construcción biológica compleja en solución o polvo que tiene moléculas genéticas completas o no contaminadas, transferir la solución a una microdisposición o prueba Taqman, y determinar la función y/o expresión génica. El aparato para llevar a cabo el método, comprende una cámara adaptada con un componente que fracturará la construcción biológica compleja y romperá las células. El aparato comprende también medios para aplicar fuerza mecánica a la cámara, con lo cual el componente romperá las células, liberando moléculas genéticas en solución. Una construcción biológica compleja útil en el método de la presente invención, puede contener muchos de los tejidos que constituyen un animal. El cuerpo del animal, referido también como el organismo, puede entenderse en siete niveles estructurales relacionados: químico, organelo, celular, tejido, órgano, sistema de órganos y, finalmente, el cuerpo u organismo entero, o una porción discreta o parte del mismo. Un tejido por definición es un grupo de células con estructura y función similar. Un órgano se forma de dos o más tipos de tejido que realizan una o más funciones en común. El sistema de órganos es un grupo de órganos clasificados como una unidad debido a una función o serie de funciones común. Sin embargo, la construcción biológica compleja de la presente invención contendrá varios tipos de tejido que tienen potenciaimente una diversidad de funciones, y puede contener potenciaimente numerosos tipos de células. Por ejemplo, existen más de 200 tipos de células en el cuerpo humano ensambladas en una variedad de tipos de tejido. Los cuatro tipos de tejido primarios, son epitelial, conectivo, muscular y nervioso. Cada tipo de tejido primario tiene varios subtipos. Los tejidos epiteliales incluyen epitelio membranoso y glandular. Los tejidos conectivos incluyen tejido conectivo propio y tejido conectivo especializado. Los tres subtipos de tejido muscular son esquelético, cardiaco y liso. Las células nerviosas son una forma de comunicación especializada, y se forman de una red de neuronas entre células gliales de soporte. Los epitelios y tejidos conectivos son los más abundantes y diversos de los cuatro tipos de tejido, y son componentes de cada órgano en el cuerpo humano. En los tejidos epiteliales, las células están apretadamente unidas entre sí en capas denominadas epitelios. El tejido epitelial consiste principalmente de células, y son las células más que la matriz lo que soporta la mayor parte del esfuerzo mecánico. Las capas de células epiteliales revisten internamente todas las cavidades y superficies libres del cuerpo, y las uniones especializadas entre las células permiten que estas capas formen barreras al movimiento de agua, solutos y células de un compartimento del cuerpo a otro. Las capas epiteliales casi siempre descansan sobre un lecho de soporte de tejido conectivo que puede unirlas a otros tejidos tales como el músculo, que no tengan por sí mismos organizaciones de tejido estrictamente epitelial o estrictamente conectivo. Existen muchos tipos de epitelio especializados. Sin embargo, mientras que los epitelios pueden estar especializados para funciones únicas en un sistema de órganos, tienen algunas características en común. Primero, las células están yuxtapuestas a alguna otra, y revisten internamente una superficie. Segundo, descansan sobre una capa de filamentos finos, denominados "lámina basal". En conjunto, estas capas forman un límite entre el ambiente externo y el resto del órgano. De esta manera, al nivel más básico, los epitelios están organizados para controlar el movimiento de sustancias dentro y fuera de ese órgano. Además, un epitelio estratificado puede proveer más protección al órgano contra la fricción y similares, puesto que las capas exteriores de las células podrían desprenderse conforme el epitelio encuentra fricción. Los epitelios simples regulan el transporte a través de las células epiteliales mediante proteínas de transporte de la membrana, endocitosis y uniones de barrera especiales. La forma de la célula facilita la determinación de su función. Por ejemplo, pueden verse células aplanadas en forma de escama (referidas como escamosas) en una capa (simple) o en capas múltiples (estratificadas). Si estas células están en una sola capa brindan protección mínima, pero proveen con frecuencia más oportunidad para el transporte pasivo de sustancias a través de la célula. Por ejemplo, la pared capilar es en donde las células epiteliales proveen el área de superficie para el transporte de gases y otras moléculas. Si las células escamosas están en un epitelio estratificado, están diseñadas con frecuencia para protección contra la invasión o la fricción.

Tienen desmosomas (uniones), y pueden desprenderse y ser reemplazadas rápidamente. Los epitelios que tienen forma de cubo se denominan, adecuadamente, "cuboidales". Con frecuencia, estos epitelios tienen uniones especializadas y procesos de transporte que controlan el movimiento de sustancias de un lado al otro. A veces, son secretorios. De esta manera, cuanto más alta es la célula, más activa puede ser en términos de transporte regulado. Esto es particularmente cierto de las células epiteliales más altas, las células columnares. Configuradas como una columna, estas células tienen con frecuencia superficies especializadas muy diferentes diseñadas para proteger la barrera y el transporte en la célula, y entonces fuera de la célula. Algunas células epiteliales, tales como las de la tiroides, se vuelven más altas conforme secretan más. Por último, existe el epitelio de transición en la vejiga o el uréter que no está clasificado. Este epitelio puede tener células que son escamosas e incluso columnares. Es definitivamente multiestratificado. Puede distenderse también, de modo que se observa como si tuviera 2 a 3 capas de células. Varios tipos de células en el epitelio realizan diferente función. Las células absorbentes en el epitelio tienen numerosas microvellosidades en forma de pelo que se proyectan desde su superficie libre para aumentar el área de absorción. Las células ciliadas tienen cilios en su superficie libre que baten en sincronía para mover sustancias sobre la capa epitelial. Las células secretorias se encuentran en la mayoría de las capas epiteliales, y exudan sustancias sobre la superficie de la capa de células. Los tejidos conectivos se clasifican como tejido conectivo propio y tejido conectivo especializado. El tejido conectivo especializado incluye cartílago, hueso y sangre. El tejido conectivo propio tiene una matriz que comprende numerosas fibras que son colagenosas, elásticas o reticulares (ramificadas). El tejido conectivo propio incluye tejido conectivo denso y tejido conectivo laxo. El tejido conectivo laxo o areolar tiene una matriz intercelular distribuida ampliamente en el cuerpo, y se encuentra más fácilmente bajo la piel y la fascia superficial (tejido conectivo graso) que separa los músculos, en todos los espacios potenciales, y bajo el revestimiento epitelial en la lámina propia del sistema digestivo. El tejido en forma de red une las células y órganos, pero permite que las células y órganos se muevan, según sea necesario, en relación mutua. El tejido conectivo laxo se forma de una gran cantidad de sustancia fundamental amorfa cuya consistencia varía de líquido a gel, que permite que las células se muevan alrededor libremente, y que otras estructuras tales como vasos sanguíneos y nervios, pasen a través de la misma. Este tipo de tejido conectivo es importante debido a su contenido celular en la defensa contra la infección y la reparación de los tejidos dañados. Las células presentes en el tejido conectivo laxo incluyen, pero no están limitadas a, los siguientes: fibroblastos, que sintetizan fibras de tejido conectivo colagenoso que son flexibles pero de gran resistencia a la tracción; macrófagos y monocitos, los cuales ingieren, digieren o colectan partículas microscópicas tales como desechos de células muertas; ciertos microorganismos; y otra materia no biodegradable. Las células cebadas sintetizan y liberan sustancias de importancia fisiológica (por ejemplo, heparina e histamina). El tejido conectivo denso aparece en dos formas: tejido conectivo denso irregular y tejido conectivo denso regular. El tipo irregular se encuentra en la dermis de la piel, fascia profunda que rodea y define los músculos, cápsulas de órganos y vainas nerviosas. El tejido conectivo denso regular se encuentra principalmente en ligamentos y tendones, y también en ligamentos, aponeurosis y la córnea del ojo. Aunque un tendón puede confundirse con el músculo estriado a bajo aumento, las diferencias estructurales son fácilmente evidentes a mayor aumento. El tejido conectivo denso contiene menos células pero, cuando está presente, las células son de tipo similar a las que se encuentran en el tejido conectivo laxo. Las fibras colagenosas predominan en el tejido conectivo denso. El cartílago es un tejido no vascular que contiene tejido conectivo fibroso (colágena tipo 2) incluido en una matriz abundante y firme. Las células que producen cartílago se denominan condroblastos y, en el cartílago maduro en donde las células están alojadas en lagunas, se denominan condrocitos. Se reconocen tres tipos de cartílago: hialino, elástico y fibrocartílago. El cartílago hialino se encuentra en los extremos ventrales de las costillas, y en la nariz, laringe, tráquea y superficies articulares de huesos adyacentes de articulaciones móviles. El fibrocartílago se forma predominantemente de fibras colagenosas (tipo 1 ) dispuestas en haces, con células de cartílago rodeadas por una matriz de cartílago esparcida entre los haces fibrosos. El fibrocartílago tiene características similares al tejido conectivo denso y el cartílago hialino. Siempre se asocia con el tejido conectivo denso y, debido a su escasez usual de células de cartílago, parece ser una transición gradual entre los dos tipos de tejido conectivo. Aunque las células de cartílago no son abundantes, están dispuestas en racimos dispersos en formaciones paralelas, reflejando la dirección de los esfuerzos aplicados sobre el tejido. El fibrocartílago no tiene pericondrio identificable, y difiere a este respecto del cartílago hialino y elástico. El cartílago elástico se encuentra en el oído extemo (pabellón de la oreja), conducto auditivo, epiglotis, y cartílagos corniculado y cuneiforme de la laringe. El hueso es un tejido que forma la mayor parte del esqueleto, y es una de las estructuras más duras del cuerpo. Es el enrejado sobre el cual todas las partes blandas están suspendidas o unidas. El esqueleto es firme y ligeramente elástico, soportando tensión y compresión. El hueso difiere del cartílago por tener su matriz de tejido conectivo colagenoso impregnada con sales orgánicas (principalmente fosfato de calcio y menores cantidades de carbonato de calcio, fluoruro de calcio, fosfato de magnesio y cloruro de sodio). Los osteoblastos, los cuales forman el tejido óseo, llegan a ser encapsulados en lagunas, pero mantienen el contacto con el sistema vascular mediante canalículos microscópicos. Cuando son encapsulados, son referidos como osteocitos.

La sangre y la linfa son un tipo de tejido conectivo que es peculiar debido a que su matriz es líquida. La sangre es llevada en vasos sanguíneos, y se mueve por todo el cuerpo mediante el poder contráctil del corazón. La linfa se encuentra en los vasos linfáticos, pero se origina en espacios extracelulares como fluido extracelular, el cual es normalmente extravasado de los capilares sanguíneos. El fluido extracelular, el cual entra al sistema de vasos linfáticos, tendrá glóbulos blancos mononucleares añadidos al mismo conforme el fluido es filtrado a través de los nodulos linfáticos, los cuales producen dichas células. La linfa es regresada a la corriente sanguínea cerca de los ángulos venosos derecho e izquierdo (unión de las venas yugular interna y subclavia). Derivado del mesodermo embrionario, el mesénquima es el primer tejido conectivo formado. Las células están ampliamente espaciadas, con una abundancia de matriz intercelular. Las células mesenquimáticas primitivas se diferencian en todos los tejidos de soporte del cuerpo. Las células derivadas del mesénquima incluyen células sanguíneas, megacariocitos, endotelio, mesotelio, células reticulares, fibroblastos, células cebadas, células plasmáticas, células fagocíticas especiales del bazo e hígado, células de cartílago y células óseas, así como músculo liso. Distribuido ampliamente en el embrión como un tejido conectivo laxo, el tejido mucoide se forma de grandes fibroblastos estrellados en una sustancia intercelular abundante, la cual es homogénea y blanda. En el cordón umbilical, se conoce como jalea de Wharton.

Las células musculares producen fuerza mecánica por su contracción. En vertebrados, existen tres tipos principales de músculo. El músculo esquelético mueve las articulaciones por su contracción fuerte y rápida. Cada músculo es un haz de fibras musculares, cada una de las cuales es una célula multinucleada enorme. El músculo liso está presente en el tracto digestivo, vejiga, arterias y venas. Se forma de células alargadas delgadas (no estriadas), cada una de las cuales tiene un núcleo. El músculo cardiaco, intermedio en carácter entre el músculo esquelético y liso, produce el latido del corazón. Células adyacentes son enlazadas por uniones eléctricamente conductoras que hacen que las células se contraigan en sincronía. El tejido nervioso es tejido especializado que forma los sistemas nervioso central y periférico. El tejido nervioso consiste de neuronas con sus procesos, otras células especializadas o de soporte, tales como la neuroglia, y la matriz extracelular. La neuroglia es la estructura de soporte del tejido nervioso.

Consiste de una red fina de tejido formado de elementos ectodérmicos modificados, en los cuales están encerradas células ramificadas peculiares conocidas como células de neuroglia o células gliales. Las células de neuroglia son de tres tipos: astrocitos y olígodendrocitos (astroglia y oligodendroglia), que parecen tener una función en la formación de mielina, transporte de material hacia las neuronas, y mantenimiento del ambiente iónico de las neuronas; y microcitos (microglia), que fagocitan los productos de desecho del tejido nervioso.

La construcción biológica compleja de la presente invención contiene por lo menos dos subtipos de tejido, cada uno teniendo una función diferente. Los tejidos de la construcción biológica compleja tienen función diversa. Por ejemplo, la construcción biológica compleja puede ser la garra de un animal que tiene músculo, huesos, nervios, piel, tejido conectivo y pelo. En otro ejemplo, la construcción biológica compleja puede ser el tracto digestivo completo de un animal e incluye, pero no está limitado a, tejidos musculares de las paredes del estómago e intestino, tejido que produce enzimas digestivas, y las microvellosidades del intestino que intervienen en la absorción de nutrientes. El aislamiento de una construcción biológica compleja usa cualquier método de separación y/o división de la construcción de un animal. El aislamiento puede realizarse mediante procedimientos quirúrgicos en un animal anestesiado que incluyen extracción o resección quirúrgica y amputaciones. Métodos que resultan en terminación del animal, incluyen disección, separación y excisión. En la modalidad preferida, la construcción biológica compleja es congelada instantáneamente con nitrógeno líquido inmediatamente después de la eutanasia, para mantener los contenidos subcelulares de la construcción en el mismo estado al momento del aislamiento. Los componentes subcelulares incluyen cualquier molécula, macromolécula o estructura presente originalmente dentro de la célula o sobre la superficie de la célula, o que resulte de la disolución de las células. Ejemplos incluyen ácidos nucleicos, proteínas, metabolitos, complejos macromoleculares y desmosomas. Proteínas específicas pueden incluir enzimas, proteínas estructurales, receptores y proteínas de señalización. Los complejos macromoleculares incluyen ribosomas, fragmentos del citoesqueleto, cromosomas, proteosomasy centrómeros. La congelación instantánea puede ser cualquier método en donde la construcción biológica compleja sea congelada completamente intacta, o como una solución o suspensión de componentes subcelulares dentro de unos cuantos segundos después de la exposición a bajas temperaturas. Esto se logra en general aplicando frío extremo al sujeto mediante un líquido criogénico tal como nitrógeno líquido o hielo seco suspendido en un alcohol. Se ponen a prueba construcciones biológicas complejas con base en su función en un proceso de enfermedad o su función en una función normal. Pueden surgir problemas si sólo unas cuantas células en la construcción de prueba intervienen activamente en el mecanismo o evento. Por lo tanto, las células restantes pueden diluir cualquier señal que pudiera ser detectada por la masa física sola. Por ejemplo, 1% de las células en un tejido da una señal, pero el 99% de la masa restante diluye la señal a menos detectable o indetectable. La construcción biológica compleja es licuada entonces en regulador de pH de Tisis (ya sea solo o en combinación con un regulador de pH de lisis). Cuando la construcción biológica compleja es licuada, ocurre lisis celular. La lisis celular es la ruptura de la membrana plasmática de la célula, y resulta finalmente en la muerte de la célula. Cuando la membrana plasmática de la célula se rompe, los contenidos de la célula son liberados. Los contenidos de la célula incluyen: retículo endoplásmico responsable de la síntesis y el transporte de lípidos y proteínas de la membrana; mitocondrias; citosol; aparato de Golgi; citoesqueleto filamentoso; lisosomas o vesículas limitadas por membrana que contienen enzimas hidrolítícas que intervienen en digestiones intracelulares; peroxisomas o vesículas limitadas por membrana que contienen enzimas oxidativas que generan y destruyen peróxido de hidrógeno; y el núcleo de la célula. El núcleo de la célula almacena genes en cromosomas, organiza genes en cromosomas que permiten la división celular, transporta factores reguladores y productos génicos mediante poros nucleares, produce ácido ribonucleico mensajero (ARNm), y organiza el desenrollamiento del ADN para replicar genes clave. El núcleo de la célula está separado del citoplasma por la membrana nuclear. Los contenidos nucleares comunican con el citosol por medio de aberturas en la membrana nuclear, denominadas poros nucleares. El núcleo tiene también al nucléolo, en donde se producen los ribosomas. El nucléolo se organiza a partir de las regiones de organización nucleolar en diferentes cromosomas. Muchos cromosomas transcriben ARN ribosomal en este sitio. Todo el ADN cromosómico es mantenido en el núcleo, empacado en fibras de cromatina por su asociación con proteínas histonas.

Antes de la división celular, el ADN en los cromosomas se replica, de modo que cada célula hija tiene un juego idéntico de cromosomas. El ADN es responsable de la codificación de todas las proteínas. Cada aminoácido del ADN es designado por una o más series de tripletes de nucleotidos, código producido a partir de una cadena de ADN, mediante un proceso denominado transcripción, que produce ARN mensajero. El ARN mensajero es enviado fuera del núcleo, en donde su mensaje es traducido en proteínas. La traducción puede llevarse a cabo en el citoplasma en grupos de ribosomas denominados polirribosomas, o sobre las membranas del retículo endoplásmico. Los ribosomas proveen el sitio estructural en donde el ARN mensajero descansa. Los aminoácidos para las proteínas son transportados a este sitio por el ARN de transferencia (ARNt). Cada ARNt tiene un triplete de nucleotidos que se une a la secuencia complementaria en el ARN mensajero. Un regulador de pH de lisis es una solución que contiene varios componentes que facilitan la lisis celular o ruptura celular, y estabilizan los componentes intracelulares resultantes. Ejemplos incluyen detergentes, sales, inhibidores de nucleasa, inhibidores de proteasa, quelatos de metal tales como EDTA y EGTA, lisozima, y solventes. El método de la presente invención es especialmente útil para la extracción y el aislamiento de moléculas genéticas tales como ADN o ARN. El uso de una construcción biológica compleja, opuestamente a una muestra de tejido u órgano particular, elimina la necesidad de analizar los patrones de expresión en cada uno y cualquier tejido en la misma para lograr un conocimiento de los patrones de expresión génica dentro de la construcción. En una modalidad preferida de la presente invención, la construcción biológica compleja congelada se pone en una cámara sellada junto con un componente de licuefacción o pulverización (referido a veces en la presente como "componente"). Mediante la aplicación de fuerza, el componente de licuefacción o pulverización disolverá, degradará y romperá la construcción biológica compleja. Como se muestra en las figuras 10 a 14, el aparato de la modalidad preferida incluye una cámara 10 adecuada para contener la construcción biológica y el componente de pulverización o licuefacción 12. La cámara 10 se refiere a cualquier contenedor diseñado para contener una construcción biológica compleja. De preferencia, la cámara 10 será de una forma y diámetro constante en dos dimensiones para facilitar el movimiento del componente a través de la cámara completa. La cámara 10 puede tener la forma de un tubo o cilindro, ya sea recto o curvo. De preferencia, el interior de la cámara 0 será del mismo material que el componente 12 para prevenir el desgaste excesivo de la cámara o el componente 12 del contacto de superficies de dureza variable. La cámara 10 puede hacerse de acero inoxidable, vidrio porcelanizado, acero cromado, ágata, o cualquier otro material adecuado. De preferencia, el interior de la cámara 10 se hará de acero inoxidable o, en el caso del molino congelador 14, puede ser de plástico con extremos de acero. Cámaras adecuadas incluyen microtubos que contiene pequeñas perlas, cilindros con perlas de ajuste estrecho, o impactores tales como la gran cámara cilindrica producida por Retch®, las cámaras criogénicas en forma de tubo del molino/congelador 14 SPEX® CentiPrep 6750, y cámaras esféricas o hemiesféricas tales como BioSpec® Beadbeater®. La cámara 10 está diseñada para facilitar el movimiento del componente de licuefacción o pulverización 12 (referido a veces como un elemento de molienda 12) dentro y a través de la cámara 10, o en el caso del molino congelador 14, el tejido que se mueve a través de un campo magnético que en conjunto con una varilla de acero inoxidable dentro del cilindro, pulveriza el tejido. Este componente 12 puede ser cualquier objeto que aplique abrasión o fuerza mecánica a los contenidos de la cámara 10. El componente puede ser una esfera, pistón o cilindro de ajuste estrecho a los contornos de la cámara descritos anteriormente. En forma alternativa, el componente 12 puede consistir de pequeñas perlas o arena, un martillo, una superficie de abrasión, o cualquier objeto capaz de triturar, destrozar, golpear, abrasar, compactar, o de otra manera apoyarse sobre, un objeto. El componente 12 puede ser considerablemente más pequeño que la cámara 10, y de esta manera capaz de movimiento libre en la misma. En forma alternativa, el componente 12 y la cámara 10 pueden diseñarse de modo que el componente 12 sea de forma y tamaño para una sección transversal de la cámara 10, la cual se mantiene constante a lo largo de la longitud de la cámara 10, permitiendo de esta manera el movimiento lateral del componente 2 de un lado a otro a través de la cámara 10.

Se provee un ensamble mecánico para impartir movimiento al componente 12 o la cámara 10. En una modalidad preferida, la cámara 10 se hace oscilar, impartiendo momento a uno o más componentes libremente movibles presentes en la misma. Un ensamble puede ser cualquier dispositivo mecánico capaz de ser puesto en movimiento, ya sea manualmente o mediante un motor. Las figuras 12 y 13 describen dos ejemplos de dichos ensambles. El ensamble puede tomar la forma de un brazo mecánico, plataforma, dispositivo centrífugo y dispositivos de impactación accionados magnéticamente, tales como pistones y perlas. Movimiento oscilatorio y oscilación se refieren a cualquier movimiento que siga un patrón repetitivo. Dicho movimiento puede consistir de vibraciones, agitación, tambaleo o pendulación. Esta oscilación puede ser accionada por la aplicación de movimiento al elemento de molienda, o el ensamble mismo. Puede aplicarse fuerza mecánica a la cámara misma para impartir momento a un componente libremente móvil 12 dentro la cámara 10, o al componente 12. El impacto físico a alta velocidad del componente 12 sobre la construcción biológica compleja, resultará en licuefacción o pulverización de la construcción, ruptura de las células, y liberación de los componentes intracelulares de la construcción. Están disponibles actualmente dispositivos en los cuales se procesan muestran biológicas en el componente intracelular a través del movimiento oscilatorio rápido de perlas, esferas u otros objetos, a través de una cámara sellada que contiene a la muestra. Estos incluyen el molino/congelador SPEX® CertiPrep 6750, el BioSpec®Beadbeater®, el molino mezclador MM 300 Retsch®, y el molino mezclador MM 200 Qiagen® (véase, por ejemplo, las figuras 3 y 4). Asimismo, como se muestra en la figura 5, puede usarse cualquier tipo de triturador de tejidos 18 para procesar la muestra biológica. Como se muestra en la figura 12, el SPEX® CertiPrep 6750 está diseñado para moler una amplia variedad de muestras que incluyen polímeros, madera, caucho y tejidos biológicos. La molienda se lleva a cabo a temperaturas criogénicas, que proveen las ventajas de aumentar la fragilidad de la muestra y prevenir la degradación por el calor durante el procesamiento de molienda. La molienda misma es movimiento vibratorio de impactores de acero accionados magnéticamente a través de una a cuatro cámaras de molienda individuales. Cada cámara de molienda 10 o recipiente se forma de un policarbonato o una sección central de acero inoxidable con tapones de extremo de acero que pueden soportar el impacto de los elementos de molienda. Una bobina magnética dirige los movimientos del impactor de acero, y está colocada alrededor de la cámara. Se mantienen temperaturas criogénicas sumergiendo las cámaras y bobinas en nitrógeno líquido durante la pulverización y licuefacción, ya que este es sólo el procedimiento de molienda. El BioSpec® Beadbeater® está diseñado específicamente para la disolución de células. Un impulsor sólido de teflón que gira a alta velocidad, fuerza miles de perlas de vidrio diminutas que chocan con la muestra en una cámara especialmente diseñada. 90% de disolución de las células puede lograrse en menos de tres minutos. Como se muestra en la figura 13, el molino mezclador Retsch® está diseñado como triturador de uso múltiple capaz de procesar una gran variedad de muestras que van de minerales y minerales metálicos, a células biológicas. La muestra se coloca en cámaras especialmente diseñadas hechas de una variedad de materiales que incluyen acero inoxidable, ágata, porcelana dura, carburo de tungsteno, zirconia y Teflón®, junto con una o más bolas especialmente diseñadas hechas de materiales similares. La vibración rápida de la cámara a frecuencias vibracionales tan altas como 60 Hz, impulsan las bolas a través de la cámara 10. Las desventajas del molino mezclador Retsch® 16, son su dependencia de las cámaras especialmente diseñadas y el hecho de que sólo puede procesar dos cámaras a la vez si se usan grandes masas de tejido. Pueden procesarse 48 pequeñas muestras de tejido (2 mg-20 mg) si se usa un adaptador. El molino mezclador Qiagen® funciona en forma muy similar al sistema Retsch®, pero está diseñado sólo para el procesamiento de muestras biológicas. El sistema Qiagen® ofrece la ventaja de ser capaz de procesar hasta 192 muestras al mismo tiempo usando adaptadores especiales que pueden contener 96 microtubos de 1.2 mi o 24 microtubos de 1.5-2.0 mi. El molino mezclador Qiagen® puede procesar también mayores volúmenes de muestras usando las cámaras fabricadas por Retsch®, pero al igual que el sistema Retsch®, no puede acomodar más de dos de dichas cámaras a la vez. Pueden obtenerse perlas de carburo de tungsteno Qiagen® de 3 mm para procesar las muestras más pequeñas, pero pueden obtenerse perlas de acero inoxidable similares a partir del Retsch® o el BioSpec®. Al igual que el molino mezclador Retsch®, las perlas son impulsadas por la vibración rápida de la cámara o tubos, las cuales pueden ser llevadas a una frecuencia vibracional de 3-30 Hz. Las figuras 13 a 20 describen un repaso de un laboratorio de ARN de alto rendimiento típico. La figura 15 es un diagrama de flujo lógico del laboratorio que describe los procesos individuales que se requieren para analizar la muestra de ARN. La figura 16 es un diagrama de flujo para la preparación de tejido licuado para varios tipos de tejidos. Típicamente, se lleva a cabo congelación instantánea, colocando las muestras en tubos Eppendorf preenfriados en hielo seco, y congelando el tubo en nitrógeno líquido (80 grados centígrados). Aunque se establece un protocolo independiente para cada tipo de tejido, todas las muestras se diluyen en un regulador de pH de lisis para prevenir la obstrucción de los filtros corriente abajo. Aunque la purificación es semiautomática en el ABI 6100, esta máquina permite cargas múltiples durante la purificación y usos de los mismos reactivos como el ABI 6700 más sofisticado. El ABI Prism 6700 es una unidad contenida accionada por vacío con filtro de HEPA, que puede usarse para muestras humanas infecciosas. La máquina no funcionará, a menos que se cierre con circuito de seguridad volteado.

La figura 17 es un diagrama de flujo de la preparación de ácidos nucleicos realizada en un ABI 6700. La figura 18 es un diagrama de flujo de la preparación de ácidos nucleicos realizada en un ABI 6100. La mayor parte del ADN es removido por el lavado 1. La solución de lavado 2 hace que ocurra un evento de precipitación basado en etanol. La figura 19 es un diagrama de flujo del procedimiento para preparar la muestra para análisis Taqman. Como se discute más adelante, el Biomek es un dispositivo flexible y fácil de usar que sustenta muchos usuarios. El Biomek incluye una cabeza de pipeta múltiple y es útil para placas de 96 cavidades o rejillas de tubos Eppendorf. El Biomeck es muy rápido, y puede pipetear una placa en tan poco como 10 minutos. El Biomek requiere cierta programación. Aunque se provee el programa, el usuario individualiza el programa. La figura 20 es un diagrama de flujo del análisis Taqman preparado con relación a la presente invención. Este análisis es particularmente adecuado para su uso con relación al sistema de detección de secuencias ABI 7900 o ABI 7700 y discutido en mayor detalle anteriormente. La presente invención incluye también un aparato para mantener ARN a una temperatura entre aproximadamente 0 a 10°C. Como se describe y se reclama en la solicitud de patente de E.U.A. número de serie 60/411,174 y como se muestra en las figuras 21 A hasta 24, dicho dispositivo es un bloque de metal 20 para su uso en un laboratorio de ARN de alto rendimiento que comprende una pluralidad de cavidades 22. Cada cavidad 22 tiene un extremo superior cilindrico abierto 24 y un extremo inferior cónico cerrado 26. Cada cavidad 22 está diseñada para acomodar un receptáculo 28 de muestras biológicas. El receptáculo 28 tiene sustancialmente la misma forma que la cavidad, manteniendo de esta manera la temperatura de una muestra biológica en el receptáculo durante la disposición de la muestra y antes de la reacción en cadena de polimerasa. El uso del bloque de metal con un dispositivo automatizado de manejo de líquidos 30 y para el análisis genético de muestras biológicas, provee una mejora a los sistemas de manejo de líquidos disponibles actualmente. El bloque de metal 20 es particularmente útil para el análisis de ARN de alto rendimiento de una muestra biológica, en combinación con un dispositivo automatizado de manejo de líquidos. Aquí, la muestra biológica es insertada en el receptáculo 28 de muestras biológicas mantenido por las cavidades 22 del bloque de metal 20 en el dispositivo automatizado de manejo de líquidos 30. Después, se usa reacción en cadena de polimerasa-transcriptasa inversa para determinar la presencia de ARN o ADN en la muestra mediante el uso de una máquina de amplificación de ácidos nucleicos. Se provee también un dispositivo automatizado mejorado de manejo de líquidos 30 para el análisis genético de muestras biológicas. El dispositivo de manejo 30 controla la dispensación, aspiración y transferencia de líquido de una primera cavidad de placa de microtítulo u otro receptáculo de muestras biológicas, a una segunda cavidad de placa de microtítulo u otro segundo receptáculo de muestras biológicas. El dispositivo automatizado de manejo de líquidos es capaz de funcionar con tubos de prueba, recipientes de congelación, depósitos y otros contenedores de química húmedos. La mejora al dispositivo de manejo de líquidos comprende el uso del bloque de metal 20 que comprende una pluralidad de cavidades 22, en donde cada cavidad 22 tiene un extremo superior cilindrico abierto 24 y un extremo inferior cónico cerrado 26. Cada cavidad 22 acomoda un receptáculo 28 de muestras biológicas que tiene sustancialmente la misma forma que la cavidad 22. La muestra biológica y los reactivos se pipetean en el receptáculo 28, y se mantiene la temperatura de una muestra biológica durante la disposición de la muestra y antes del análisis de reacción en cadena de polimerasa. Además, se provee un método para manejar una muestra biológica líquida en un laboratorio de ARN de alto rendimiento. Dicho método incluye los pasos de enfriar el bloque de metal, insertar el receptáculo de muestras biológicas en el bloque de metal, posicionar el bloque de metal en un dispositivo automatizado de manejo de líquidos, y transferir la muestra biológica en el receptáculo de muestras biológicas en el bloque de metal para análisis mediante reacción en cadena de polimerasa. El bloque de metal de la presente invención se hace de preferencia de aluminio, pero puede hacerse de otros materiales que incluyen, pero no están limitados a, cobre, oro o plata. Cualquier material que tenga alta conductividad térmica, puede ser adecuado para su uso en la presente invención. El bloque de metal está diseñado para mantener la temperatura de la muestra de O a 10°C. El receptáculo de muestras biológicas adecuado incluye tubos de polipropileno, tubos de ciclizador térmico, una placa de 96 cavidades o una placa de 384 cavidades. Los receptáculos de muestras biológicas pueden hacerse de plástico o vidrio. Con frecuencia, los receptáculos de muestras biológicas son de plástico, y se hacen de polipropileno o policarbonato. Se prefieren placas y tubos de pared delgada, ya que permiten la transferencia de calor rápida y consistente. La capacidad volumétrica de los tubos puede variar de aproximadamente 0.2 mi a 1.7 mi. Las capacidades volumétricas de los tubos de microplaca individuales varían de alrededor de 0.2 mi en un formato de 96 cavidades, a aproximadamente 0.04 mi para el formato de 384 cavidades. Como se discutió anteriormente, la muestra biológica como se usa en la presente puede ser cualquier composición que comprenda ARN, ADN o secuencias genéticas creadas usando ARN o ADN de cualquiera de uno o más de los tejidos que constituyen un animal o cultivo de tejidos. El tejido del cual el ARN se origina puede incluir, pero no está limitado a, tejidos epitelial, conectivo, muscular y nervioso. Para purificar una secuencia de ácido nucleico o ARN mensajero, una muestra se colecta primero y se licúa o pulveriza. Es importante que la purificación del ARN se haga mediante un método que reduzca al mínimo la degradación. El investigador que analiza los resultados de la expresión génica debe colectar y analizar tejidos animales tan rápido como sea posible, comenzando al momento en que el animal es sometido a eutanasia, y se cosechan los órganos. El ARN mensajero se purifica después usando uno de muchos métodos o dispositivos que incluyen una estación de trabajo automatizada de ácidos nucleicos, tal como un ABI Prism® 6700. Otros dispositivos para purificación incluyen, pero no están limitados a, el BioRobot 9604 u 8000 Qiagen. El técnico puede purificar también el ARN o ADN sin usar una estación de trabajo de ácidos nucleicos usando métodos de purificación alternativos que incluyen, pero no están limitados a, sistemas de filtración de fibra de vidrio tales como RNeasy por Qiagen, tecnología RNaqueous de Ambion, o equipo absolutamente de micropreparaciones de ARN de Stratagene. El ARN puede purificarse también a través de reacciones de precipitación usando productos basados en fenol, alcohol isopropílico y cloruro de litio. Asimismo, está disponible un producto conocido como Nucieopin por BD Biosciences. Después de la purificación del ARN o ADN, se añaden reactivos a la muestra biológica en el receptáculo 18 de muestras biológicas, de modo que pueda ocurrir la reacción de RT-PCR o PCR. Transcriptasas inversas usadas comúnmente incluyen, pero no están limitadas a, virus de la mieloblastosis de aves (AMV) o virus de la leucemia de murinos Moloney (MMLV o MuLV). MMLV y MuLV tiene menores actividades de ribonucleasa H que el AMV, pera el AMV es más estable a mayores temperaturas. Como una alternativa, algunas ADN polimerasas termoestables tales como la ADN polimerasa de Thermus thermophilus, tienen actividad de transcriptasa inversa en presencia de manganeso, permitiendo el uso de sólo una enzima para la reacción en cadena de polimerasa y la transcripción inversa. Si se usa regulador de pH de bicine con manganeso, no se necesitan adiciones intermedias entre la transcripción inversa y la amplificación, y la estabilidad a temperaturas elevadas no es un problema. Sin embargo, la presencia de manganeso puede reducir la fidelidad de la incorporación de nucleotidos. Por lo tanto, este método no es adecuado para un análisis de ARN de alto rendimiento. Como se describe en más detalle a continuación, otros reactivos pueden incluir, pero no están limitados a, oligonucleótidos iniciadores, una ADN polimerasa termoestable y un regulador de pH de reacción adecuado tal como KCI a 500 mM, Tris-HCI a 100 mM y EDTA a 0.1 mM. Los dispositivos automatizados de manejo de líquidos se usan con frecuencia en laboratorios para aumentar el rendimiento de muestras y disminuir el error de pipeteo en comparación con un ser humano. Estos dispositivos son capaces de transferir reactivos de un sitio a otro de acuerdo a un diseño preprogramado. La tabla refrigerada diseñada para mantener la tabla de temperatura de la muestra, no es satisfactoria para mantener la muestra a una temperatura suficiente para preservar la actividad de la enzima. El Biomek® 2000 Beckman es un ejemplo de dicho dispositivo. El Biomek 2000 es una estación de trabajo automatizada de manejo de líquidos capaz de realizar tareas programadas tales como pipeteo de muestras, dilución gradual, adición de reactivos, mezcla, regulación de la reacción y procedimientos manuales conocidos similares. El Biomek® 2000 está adaptado para aspirar líquido de un sitio, para dispensar el líquido en otro sitio automáticamente de acuerdo con las instrucciones programadas por el usuario. En este sistema de manejo de líquidos, placas de microtítulo, placas de soporte de punta y canales, son sostenidos en una tabla unida a la base de la estación de trabajo de laboratorio. El movimiento de la tabla es provisto por medio de un motor que hace que la tabla se mueva recíprocamente en por lo menos un eje. Un receptáculo modular suspendido arriba de la tabla tiene un brazo unido a un extremo para movimiento hacia arriba y hacia abajo de una torre que se extiende verticalmente que se eleva desde la base de la estación de trabajo. El receptáculo es capaz de movimiento a lo largo del brazo en por lo menos un segundo eje que es perpendicular al primer eje de movimiento de la tabla de soporte. El brazo se mueve hacia arriba y hacia abajo en una tercera dirección perpendicular a la primera y segunda direcciones. Como se describe en más detalle en las patentes de E.U.A. Nos. 5,104,621 y 5,108,703, incorporadas en la presente como referencia, el receptáculo está conectado con medios de dispensación, aspiración y transferencia de fluidos, y sostiene a los mismos. En el Biomek® 2000, una bomba de dispensación de fluidos está conectada al receptáculo mediante conductos de fluido que proveen capacidad de pipeteo, dispensación y aspiración. El fluido es dispensado usando módulos intercambiables de una o más boquillas. Las boquillas tienen puntas de pipettor adheridas a las mismas que son levantadas automáticamente y expulsadas por el receptáculo.

Como se muestra en la figura 24, este dispositivo automatizado de manejo de líquidos tiene una tabla 34, un receptáculo 38 para transferir fluido a una cavidad localizada en la tabla 34, y medios 40 para mover el receptáculo respecto a la tabla entre posiciones seleccionadas en la tabla 34. La tabla 34 actúa como una superficie para soportar el bloque de metal, los receptáculos de muestras biológicas, los depósitos de reactivo y las puntas del pipettor. El receptáculo 38 es capaz de movimiento horizontalmente y verticalmente. La temperatura de la tabla 34 es controlable, y se logra mediante el uso de uno o más baños de agua circulantes. Como con muchos dispositivos de manejo de líquidos, el dispositivo de manejo de líquidos Biomek® 2000 es capaz de ser programado para mantener la tabla a una temperatura determinada, y para pipetear todos los reactivos requeridos para una prueba determinada en un receptáculo de muestras biológicas. El programa del dispositivo le permite al usuario especificar la posición de la aspiración, dispensación y mezcla, de y en qué tipo de material de laboratorio el líquido está siendo aspirado, y el volumen y la altura de la aspiración y dispensación. En la presente invención, una muestra biológica se prepara licuando o pulverizando una construcción biológica compleja. Se extrae entonces ARN mediante una de una variedad de metodologías. El bloque de metal 20, habiendo sido previamente refrigerado o congelado, es fijado en posición sobre un dispositivo automatizado de manejo de líquidos 30. Receptáculos 18 de muestras biológicas se insertan entonces en el bloque de metal 20. Conforme se mantiene la temperatura de la muestra biológica licuada, se añaden reactivos a la muestra biológica líquida para análisis mediante reacción en cadena de polimerasa. Se añaden reactivos en los receptáculos 18 de muestras biológicas, mediante el dispositivo automatizado de manejo de líquidos. Los receptáculos de muestras biológicas son entonces movidos por robot o manualmente hacia un sistema de detección de secuencias, en donde ocurren la transcripción inversa, amplificación mediante reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR), y análisis. En otra modalidad, el aparato para mantener el ARN a una temperatura entre aproximadamente 0 y 10°C, comprende una combinación de dispositivos que incluyen una incubadora, una máquina de análisis cuantitativo y un mecanismo de transferencia para la transferencia automatizada de una placa hacia y desde la incubadora, y hacia y desde la máquina de análisis cuantitativo. Aquí, la placa es mantenida en una hilera en la incubadora antes del análisis en la máquina cuantitativa a una temperatura abajo de aproximadamente 10°C. Los dispositivos automatizados de manejo de líquidos se usan con frecuencia en laboratorios para aumentar el rendimiento de muestras y disminuir el error de pipeteo en comparación con un ser humano. Estos dispositivos son capaces de transferir reactivos de un sitio a otro de acuerdo a un diseño preprogramado. El Biomek® 2000 Beckman es un ejemplo de dicho dispositivo. El Biomek 2000 es una estación de trabajo automatizada de manejo de líquidos capaz de realizar tareas programadas tales como pipeteo de muestras, dilución gradual, adición de reactivos, mezcla, regulación de la reacción y procedimientos manuales conocidos similares. El Biomek® 2000 está adaptado para aspirar líquido de un sitio, para dispensar el líquido en otro sitio automáticamente de acuerdo con las instrucciones programadas por el usuario. Otros dispositivos que pueden usarse incluyen, pero no están limitados a, el Qiagen 8000, 3000 ó 9600, el manipulador de líquidos Gilson Constellation® 1200, el Zymark Sciclone ALH, la estación de trabajo de replicación de placas Staccato®, o la estación de trabajo de pipeteo de microplacas de 96/384 cavidades RapidPlate®. El BioRobot 8000 Qiagen es una estación de trabajo de manejo de líquidos y de purificación de ácidos nucleicos. Tiene manejo robótico, vacío automatizado y un sistema de suministro de regulador de pH. Receptáculos de muestras y artesas de reactivo están presentes sobre una plataforma, y un sistema de pipeteo de 8 canales realiza dispensación de alta velocidad. El BioRobot 3000 Qiagen es una estación de trabajo de procesamiento de muestras y de manejo automatizado de líquidos. Permite la integración de otra herramienta, tales como ciclizadores o espectrofotómetros. Tiene procesamiento de placas totalmente automatizado, que transfiere material de laboratorio a varias posiciones en y desde la mesa de trabajo, así como control de temperatura, manejo de líquidos de pequeño volumen y parámetros de procesamiento adaptables. El BioRobot 9600 Qiagen es una estación de trabajo automatizada para la purificación de ácidos nucleicos, plan de reacción, limpieza de los productos de PCR, carga de gel de agarosa y redisposición de muestras, y tiene una mesa de trabajo y mecanismo de pipeteo programable. El manipulador de líquidos Gilson Constellation 1200 tiene un lecho que puede sostener hasta 12 microplacas, un brazo sujetador robótico, capacidad para dispensar volúmenes en nanolitros, y un recirculador de enfriamiento y calentamiento opcional. La estación de trabajo Zymark Sciclone ALH tiene una plataforma de 20 posiciones; capacidades de dispensación de volumen hacia microplacas mediante jeringa o bomba peristáltica, y puede pipetear usando una cabeza de un solo canal, 8 canales, 12 canales o 96 canales. El sistema de manejo de líquidos Robbins Scientific Tango comprende una mesa de trabajo y aspiración automatizada y dispensación de líquidos en un formato de 96 ó 384 cavidades. Todos los dispositivos son capaces de transferir reactivos de un sitio a otro de acuerdo a un diseño preprogramado. Una tabla refrigerada que mantiene la temperatura de las muestras puede estar presente sobre el dispositivo, pero en un laboratorio de ARN de alto rendimiento, la tabla refrigerada no es satisfactoria para mantener la muestra a una temperatura suficiente para preservar la actividad de la enzima, prevenir la degradación del ARN y prevenir la actividad prematura de la marca. En la presente invención, se añaden reactivos a los receptáculos de muestras biológicas (referidos también en la presente como "placas") posicionados sobre un dispositivo de manejo de líquidos. Las placas pueden posicionarse después sobre un apilador de placas, en donde son mantenidas en una hilera. El mecanismo de la presente invención transfiere la placa del dispositivo de manejo de líquidos o apilador de placas, a una incubadora para refrigeración. Incubadoras adecuadas incluyen Cytomat Heraeus, a veces disponible con robots internos. La incubadora de la presente invención es capaz de mantener la temperatura deseada abajo de 10°C. La cavidad interior de la incubadora está diseñada de preferencia con la capacidad para mantener varios tipos de material de laboratorio. Asimismo, una incubadora preferida tiene una primera puerta para el acceso del usuario a las placas mantenidas en hilera, y una segunda puerta en donde las placas pueden transferirse hacia y desde la incubadora. La segunda puerta es programada para abrirse y cerrarse cuando las placas están en proceso de ser transferidas hacia y desde la incubadora. La incubadora comprende también de preferencia un manipulador de placas de la incubadora y plataforma de la incubadora para cargar y descargar placas en y desde la incubadora. La incubadora tiene la capacidad de detectar cuándo el manipulador de placas de la presente invención se aproxima a la plataforma de la incubadora, y después de dicho tiempo, la segunda puerta de la incubadora se abre para transferir las placas hacia y desde la incubadora. El manipulador de placas transfiere después la placa desde la incubadora hacia una máquina de análisis cuantitativo, tal como el sistema de detección de secuencias, en donde ocurren la transcripción Inversa, la amplificación mediante la reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR), y el análisis. Con la modificación adecuada, los manipuladores de placas existentes pueden ser adecuados para su uso con relación a la presente invención. Los manipuladores de placas incluyen el Zymark Twister. Una versión del Zymark Twister se describe en la patente de E.U.A. No. 4,835,711, incorporada en la presente como referencia. El Zymark Twister tiene un manipulador robótico que mueve individualmente hasta 20 placas de cada plataforma. Una plataforma es una columna vertical en donde las placas son apiladas. Pueden añadirse más plataformas. El manipulador de placas transfiere entonces la placa desde la Incubadora hasta una estación de placas sobre una máquina de análisis cuantitativo. Máquinas de análisis cuantitativo adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, los sistemas de detección de secuencias ABI Prism 7700 ó 7900. Otros sistemas o dispositivos de detección de secuencias que realizan funciones individuales de un sistema de detección de secuencias y que pueden usarse con la presente invención incluyen, pero no están limitados a, un sistema de PCR cuantitativa Science LightCycler de Roche Applied, iCycler de BloRad, Opticon de MJ Research, Rotorgene Corbett o Mx4000 Multiplex de Stratagene. Un fluorímetro y programa de análisis pueden usarse con relación a los dispositivos en los cuales estas funciones no están integradas. El sistema de detección de secuencias es capaz de hacer variar las condiciones de reacción para optimizar la amplificación de una secuencia de ácido nucleico, analizar la cantidad de una secuencia de ácido nucleico determinada presente detectando sondas fluorescentes usando un dispositivo de detección de fluorescencia, y analizando los resultados mediante un programa del sistema de detección de secuencias. Una vez que la placa es posicionada dentro de la máquina de análisis cuantitativo, se lleva a cabo entonces RT-PCR. La amplificación de un segmento de ADN específico mediante PCR, referido como el molde, requiere que se conozca la secuencia de nucleótidos de por lo menos una porción de cada extremo del molde. A partir del molde, puede diseñarse un par de oligonucleótidos iniciadores sintéticos correspondientes ("iniciadores"). Los iniciadores están diseñados para unirse a las cadenas complementarias separadas del molde, una en cada lado de la región que se va a amplificar, orientada con su extremo 3' hacia la región entre los iniciadores. La PCR necesita un molde de ADN junto con un gran exceso de los dos oligonucleótidos iniciadores, una ADN polimerasa termoestable, dNTPs y un regulador de pH de reacción adecuado. La amplificación de un segmento de ADN específico mediante PCR, referido como el molde, requiere que se conozca la secuencia de nucleótidos de por lo menos una porción de cada extremo del molde. A partir del molde, puede diseñarse un par de oligonucleótidos iniciadores sintéticos correspondientes ("iniciadores"). Los iniciadores están diseñados para unirse a las cadenas complementarias separadas del molde, una en cada lado de la región que se va a amplificar, orientada con su extremo 3' hacia la región entre los iniciadores. La PCR necesita un molde de ADN junto con un gran exceso de los dos oligonucleótidos iniciadores, una ADN polimerasa termoestable, dNTPs y un regulador de pH de reacción adecuado. Para efectuar la amplificación, la mezcla es desnaturalizada con calor que hace que las cadenas complementarias del molde de ADN se disocien. La mezcla es enfriada entonces a una temperatura menor para permitir que los oligonucleótidos iniciadores se unan a las secuencias adecuadas sobre las cadenas separadas del molde. Después de la unión, la temperatura de la reacción se ajusta a una temperatura eficiente para la extensión de cada iniciador por la ADN polimerasa 5' a 3' en las secuencias presentes entre los dos iniciadores. Esto resulta en la formación de un nuevo par de cadenas complementarias. Los pasos de desnaturalización, unión del iniciador y extensión por la polimerasa, pueden repetirse muchas veces para obtener una alta concentración de la secuencia objetivo amplificada. Cada serie de desnaturalización, unión y extensión constituye un "ciclo". Puede haber numerosos "ciclos". La longitud del segmento amplificado es determinada por las posiciones mutuas relativas de los iniciadores, y por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. En virtud del aspecto de repetición del procedimiento, el método es referido como la "reacción en cadena de polimerasa" (en lo sucesivo, "PCR"). Puesto que la secuencia objetivo amplificada deseada llega a ser la secuencia predominante en términos de concentración en la mezcla, se dice que esta secuencia es amplificada mediante PCR. Con la PCR, es posible amplificar una copia individual de una secuencia de ADN objetivo específica hasta un nivel detectable mediante varias metodologías diferentes. Estas metodologías incluyen tinción con bromuro de etidio, hibridación con una sonda marcada, incorporación de iniciadores biotinilados seguida de detección de conjugado de enzima-avidina, e incorporación de trifosfatos de desoxinucleótido marcados con 32P, tales como Dctp o Datp en el segmento amplificado. El desarrollo de la PCR de tiempo real, conocida también como PCR cinética, ha provisto un método mejorado para la cuantificación de ácidos nucleicos específicos. En la PCR de tiempo real, se hace posible la medición, ciclo por ciclo, del producto de PCR acumulado, combinando ciclización térmica y detección por fluorescencia del producto amplificado en un solo instrumento. Debido a que el producto se mide en cada ciclo, la acumulación del producto puede graficarse como una función del número de ciclos. La fase exponencial de la amplificación del producto se determina fácilmente y se usa para calcular la cantidad de molde presente en la muestra original. Muchos métodos alternativos están disponibles actualmente para la PCR de tiempo real. El protocolo original desarrollado por Grossman et al. (patente de E.U.A. No. 5,470,705, incorporada en la presente como referencia), usó marcas radiactivas en las sondas, pero otros refinamientos del método se han enfocado en sondas fluorescentes de autoextinción. Originalmente, se usó separación de los productos amplificados mediante electroforesís u otros métodos para medir y calcular la cantidad de marca liberada. Esto añadió al análisis pasos que consumen tiempo. Además, este análisis de etapa final de las reacciones no pueden aplicarse fácilmente a la PCR de tiempo real. En un método actual, se usan sondas de exonucleasa fluorogénicas para la detección de productos mediante PCR de tiempo real. Este tipo de tecnología es capturado en el sistema de detección de secuencias ABI Prism® 7700, y descrito en Livak et al. (patente de E.U.A. No. 5,538,848, incorporada en la presente como referencia). En una modificación de un método existente que usa marcas radiactivas, se diseñan sondas de exonucleasa fluorogénicas que se unen a secuencias entre los dos iniciadores de amplificación, pero que contienen uno o más nucleótidos que no se aparean en el extremo 5'. Los nucleótidos de no apareamientos se enlazan a un donador de fluorescencia. Un extintor de fluorescencia es posicionado típicamente en el extremo de la sonda. Cuando el donador y el extintor están en la misma vecindad, el extintor evita que el donador de fluorescencia emita luz. Los extintores de fluorescencia tradicionales absorben la energía luminosa emitida por una molécula reportera excitada, y liberan esta energía emitiendo fluorescencia a una longitud de onda mayor. Puede lograrse sensibilidad incrementada en la detección de tiempo real con extintores oscuros tales como dabcyl, o el extintor Eclipse desarrollado de Epoch Biosciences, Inc. Los extintores oscuros absorben energía fluorescente, pero no emiten fluorescencia por sí mismos, reduciendo de esta manera la fluorescencia de fondo en la muestra. El extintor oscuro funciona efectivamente contra muchos fluoroporos cambiados a rojo, tales como FAM, Cy3 y Tamra, debido a su escala de absorbancia más amplia sobre dabcyl (400-650 mm contra 360-500 nm, respectivamente), y es de esta manera más adecuado para pruebas de correlación múltiple. La sensibilidad de la PCR de tiempo real puede aumentarse también mediante el uso de enlazadores de ranura menor ("MGBs") (también de Epoch Biosciences, Inc.), los cuales son ciertos antibióticos de ocurrencia natural y compuestos sintéticos capaces de adaptarse en la ranura menor del ADN de doble cadena para estabilizar dúplex de ADN. Los enlazadores de ranura menor pueden unirse al extremo 5', extremo 3', o un nucleótido interno de oligonucleótidos, para aumentar la temperatura de fusión del oligonucleótido, es decir, la temperatura a la cual el oligonucleótido se disocia de su secuencia objetivo, y por ende crea estabilidad. El uso de MGBs permite el uso de sondas de oligonucleótidos más cortas, así como la colocación de sondas en secuencias ricas en AT sin pérdida alguna en carácter específico del oligonucleótido, así como mejor discriminación de no apareamientos entre secuencias estrechamente relacionadas. Pueden usarse enlazadores de ranura menor con relación a extintores oscuros, o solos. La ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) usada para la amplificación mediante PCR, tiene la capacidad de separar nucleótidos no apareados del extremo 5' de fragmentos de ADN. En la reacción de PCR, la sonda fluorogénica se une al molde (la secuencia de nucleótido de interés en una muestra). Una extensión de ambos iniciadores y la sonda ocurre hasta que uno de los iniciadores de amplificación se extiende hasta la sonda. La Taq polimerasa rompe entonces los nucleótidos no apareados del extremo 5' de la sonda, liberando de esta manera el donador de fluorescencia. Una vez que se separa físicamente del extintor, el donador de fluorescencia puede emitir fluorescencia en respuesta al estímulo por la luz. Debido a la función de la Taq polimerasa en este procedimiento, estas sondas son referidas con frecuencia como sondas Taqman®. Conforme se forma más producto de PCR, más donadores de fluorescencia son liberados, permitiendo que la formación del producto de PCR sea medida y graficada como una función del ciclo de tiempo. La fase lineal exponencial de la gráfica puede seleccionarse y usarse para calcular la cantidad de nucleótido en la muestra. El desarrollo de estas sondas fluorescentes de autoextinción, fue un avance considerable en la PCR cuantitativa. Numerosas sondas de autoextinción mejoradas, y métodos para el uso de las mismas, se han reportado después en las patentes de E.U.A. 5,912,148, 6,054,266 (Kronick et al.) y 6,130,073 (Eggerding). El LightCycler® usa hibridación en lugar de desdoblamiento por exonucleasa, para cuantificar la reacción de amplificación. Este método añade también sondas fluorogénicas adicionales a la amplificación mediante PCR. Sin embargo, a diferencia del sistema Taqman®, la fluorescencia aumenta en este sistema cuando dos diferentes sondas fluorogénicas se reúnen en el mismo molde mediante extensión o hibridación, permitiendo que ocurra transferencia de energía por resonancia entre las dos sondas.

Otros sistemas están también disponibles. Los iniciadores Amplifluor® producidos por Intergen® son oligonucleótidos de pasador, los cuales forman pasadores cuando son de cadena sencilla, y los cuales traen un donador de fluorescencia y extintor en estrecha proximidad. Cuando los iniciadores se incorporan en una molécula de doble cadena, los pasadores son enderezados, lo cual separa al donador y extintor para causar un incremento en fluorescencia. Otras aplicaciones usan colorantes de intercalación, los cuales se asocian solos con ADN de doble cadena. Conforme se genera más ADN de doble cadena mediante la reacción, se observa más fluorescencia conforme más colorante llega a asociarse con el ADN. Sin importar el método usado, el resultado final es el mismo, una gráfica de fluorescencia contra número de ciclos. Más análisis de estos datos se usa entonces para derivar valores cuantitativos para el ARN presente en las muestras. Por lo tanto, los segmentos amplificados creados mediante el procedimiento de PCR, son moldes eficientes para amplificaciones subsecuentes mediante PCR que llevan a una cascada de mayor amplificación. La amplificación de secuencias de ácido nucleico puede ocurrir, y pueden analizarse mediante un sistema de detección de secuencias, tal como el ABI Prism® 7900. El sistema de detección de secuencias es capaz de hacer variar las condiciones de reacción para optimizar la amplificación de una secuencia de ácido nucleico. El sistema puede analizar la cantidad de una secuencia de ácido nucleico determinada presente, usando cualquier número de sondas fluorescentes, un mecanismo de detección de fluorescencia, y el programa del sistema. Otros dispositivos que pueden usarse para proveer ciclización de temperatura con o sin capacidades de detección incluyen, pero no están limitados a, un sistema de PCR cuantitativa LightCycler® de Roche Applied Science, ¡Cycler de BioRad, Opticon de MJ Research, Rotorgene Corbett y Mx4000® Multiplex de Stratagene. Puede usarse un fluorímetro y programa de análisis en conjunto con dispositivos en los cuales estas funciones no están integradas. El sistema de detección de secuencias es capaz de hacer variar las condiciones de reacción para optimizar la amplificación de una secuencia de ácido nucleico. El sistema puede analizar la cantidad de una secuencia de ácido nucleico determinada presente, usando cualquier número de sondas fluorescentes, un mecanismo de detección de fluorescencia, y programa del sistema de detección de secuencias. Modalidades detalladas de la presente invención se describen en la presente. Sin embargo, se entenderá que las modalidades descritas son solamente ejemplares de la invención que pueden describirse en varias formas y formas alternativas. Estas figuras no están necesariamente a escala, en donde algunas características pueden exagerarse o reducirse al mínimo para mostrar los detalles de componentes particulares. Por lo tanto, los detalles funcionales y estructurales específicos descritos en la presente no deberán interpretarse como limitativos, sino solamente como una base para las reivindicaciones, y como una base representativa para enseñarle al experto en la técnica cómo usar diversamente la presente invención.

Aunque la realización y el uso de varias modalidades de la presente invención se describieron en detalle anteriormente, debe apreciarse que la presente invención provee muchos conceptos inventivos aplicables que pueden describirse en una amplia variedad de contextos específicos. Las modalidades específicas discutidas en la presente son solamente ilustrativas de formas específicas para realizar y usar la invención, y no delimitan el alcance de la misma.

Claims (8)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un método para analizar ARN, que comprende los pasos de: extraer ARN de la construcción biológica compleja en cantidades suficientes para detectar ARN, transferir el ARN a un aparato para mantener el ARN a una temperatura entre aproximadamente 0 y 10°C, y analizar los niveles y la función del ARN con un análisis matemático generado por computadora.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente el paso de aislar y purificar el ARN.

3. - Un método para analizar ARN, que comprende los pasos de: pulverizar una construcción biológica compleja, extraer ARN de la construcción biológica compleja en cantidades suficientes para detectar ARN, transferir el ARN a un aparato para mantener el ARN a una temperatura entre aproximadamente 0 y 10°C, y analizar los niveles y la función del ARN con un análisis matemático generado por computadora.

4. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque comprende adicionalmente el paso de aislar y purificar el ARN.

5. - Un laboratorio de ARN de alto rendimiento, que comprende: un aparato para extraer ácidos nucleicos de una construcción biológica compleja; una estación de trabajo automatizada de ácidos nucleicos para aislar y purificar ARN de dicha construcción biológica compleja; un aparato para mantener dichas muestras de ARN a una temperatura entre aproximadamente 0 y 10°C, y un programa legible en computadora para su uso con relación a un aparato de presentación visual de información, en donde dicho programa legible en computadora hace que la computadora calcule y presente visualmente datos de ARN.

6. - El laboratorio de ARN de alto rendimiento de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque los datos de ARN incluyen valores de ciclo umbrales, un delta CT, un delta delta CT y un cambio de transcripción relativo (XRel) de dicha muestra de ARN provista mediante un sistema de amplificación por PCR cuantitativa de tiempo real.

7. - El laboratorio de ARN de alto rendimiento de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque comprende adicionalmente un aparato automatizado de manejo de líquidos para preparar muestras de ARN para transcripción inversa y amplificación mediante PCR.

8. - El laboratorio de ARN de alto rendimiento de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque comprende adicionalmente un sistema de amplificación mediante PCR cuantitativa de tiempo real.