ES2559812T3

ES2559812T3 - Ensayo de detección de la carga viral con el virus sincitial respiratorio (RSV)

Info

Publication number: ES2559812T3
Application number: ES11166466.0T
Authority: ES
Inventors: David Nauwelaers; Lieven Jozef Stuyver; Alison Velyian Todd; Elisa Mokany; Paul Ean Young
Original assignee: SpeeDx Pty Ltd; Janssen Infectious Diseases Diagnostics BVBA
Current assignee: SpeeDx Pty Ltd; Janssen Infectious Diseases Diagnostics BVBA
Priority date: 2007-04-06
Filing date: 2008-04-04
Publication date: 2016-02-16
Anticipated expiration: 2028-04-04
Also published as: US20130244223A1; US20100221711A1; WO2008122598A2; EP2147101A2; DK2385119T3; EP2385119A1; WO2008122598A3; CA2682337A1; AU2008235527B2; EP2385119B1; AU2008235527A1; US8409803B2; CA2682337C; CA2950685A1

Abstract

Método para identificar, detectar o cuantificar la presencia de por lo menos un virus sincitial respiratorio (RSV) que comprende las siguientes etapas (a) proporcionar dos o más componentes oligonucleótidos en los que por lo menos un primer componente oligonucleótido y por lo menos un segundo componente oligonucleótido son capaces de autoensamblarse en la presencia de dicha diana para formar una enzima de ácido nucleico multicomponentes que es activa catalíticamente (MNAzima); (b) poner en contacto dichos componentes oligonucleótidos con una muestra que putativamente contiene dicha por lo menos una diana en unas condiciones: (1) que permiten la fijación de dicha diana a dichos componentes oligonucleótidos y (2) que permiten la actividad catalítica de la MNAzima; y (c) identificar; detectar o cuantificar la presencia de la actividad catalítica de la MNAzima, en donde la presencia de la actividad catalítica es indicativa de la presencia de dicha diana, en donde: cada componente oligonucleótido comprende una porción de brazo de substrato, una porción de núcleo catalítico, y una porción de brazo de sensor y en donde en la presencia de una diana, las porciones de brazo de sensor de los componentes oligonucleótidos se hibridan con y se emparejan en bases con unas porciones complementarias de la diana, en donde después de haber puesto en contacto la diana de esta manera, la MNAzima se autoensambla formando un núcleo catalítico, que puede modificar a un substrato que está unido a los brazos de substrato.

Description

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ensamble puede comprender cualquier célula o cualquier porción de la misma, por ejemplo cualquier célula eucariótica o procariótica, virus, prion, levadura u hongo, o cualquier otra molécula que, por ejemplo, incluya, pero no esté limitada a, una proteína, un polipéptido, un péptido o un ácido nucleico. En otras formas de realización, una facilitadora del ensamble puede comprender un virus, un prion, una levadura o un hongo, o cualquier otra molécula que, por ejemplo, incluya, pero no esté limitada a, glicoproteínas, lípidos, lipoproteínas, organismos enteros, células, virus, bacterias, arqueas, hongos, anticuerpos, metabolitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, pequeñas moléculas, polímeros, iones metálicos, sales metálicas, priones o cualesquiera derivados, porciones o combinaciones de los/as mismos/as.

El término "diana", tal como se usa en el presente contexto, incluye cualquier entidad, constituyente o analito, natural

o sintético/a que se desee detectar, identificar o cuantificar por medio de una(s) particular(es) MNAzimas. Por lo tanto, las dianas abarcan la más amplia gama de entidades, constituyentes o analitos detectables para los/las que sean deseables unos sensibles métodos de detección, identificación y/o cuantificación. En algunas formas de realización, una diana comprende una facilitadora del ensamble. Algunas dianas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, proteínas, polipéptidos, péptidos o ácidos nucleicos, glicoproteínas, lípidos, lipoproteínas, organismos enteros, células, virus, bacterias, arqueas, levaduras, hongos, anticuerpos, metabolitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, pequeñas moléculas, polímeros, iones metálicos, sales metálicas, priones o cualesquiera derivados, porciones o combinaciones de los/as mismos/as. Otras dianas se consideran también para su uso en el presente contexto.

Los términos "substrato", "molécula de substrato" y "substrato químico" como se usan en el presente contexto, incluyen cualquier molécula que sea apta para ser reconocida y afectada o modificada químicamente por una molécula catalítica. En unas formas de realización particulares, un substrato puede ser reconocido y modificado por una enzima. En otras formas de realización, un substrato puede ser reconocido y modificado por una molécula de ácido nucleico catalítico. La modificación química de un substrato puede ser medida por la aparición de, o el aumento en, un producto de la reacción de modificación, o por la desaparición de, o la disminución en, un substrato de las tandas de reacción de modificación. Una molécula catalítica particular puede reconocer a una o más diferentes moléculas de substratos, con tal de que cada molécula de substrato tenga por lo menos una estructura mínima, que sea reconocible en cuanto a una actividad catalítica por la molécula catalítica.

Los términos "substrato reportero", "sonda reportera" o "substrato de sonda reportera" como se usan en el presente contexto, se refieren a un substrato que está particularmente adaptado para facilitar la medición de, o bien la desaparición de un substrato o la aparición de un producto en conexión con una reacción catalizada. Los substratos reporteros pueden presentarse libremente en disolución o unidos (o "trabados"), por ejemplo, a un substrato, o a otra molécula. Un substrato reportero puede ser marcado por uno cualquiera de una gran diversidad de medios, incluyendo, por ejemplo fluoróforos (con o sin uno o más componentes adicionales, tales como desactivadores), marcas radiactivas, una marcación con biotina (p.ej. una biotinilación) o unas marcas quimioluminiscentes. Unos substratos reporteros para ácidos nucleicos catalíticos pueden incluir también unas enzimas de proteínas o ácidos nucleicos, unidas covalentemente a sus extremos terminales.

Como se usan en el presente contexto, los términos "partzima", "componente de partzima" y "componente de oligonucleótido" se refieren a un oligonucleótido que contiene un ADN o que contiene un ARN o que contiene un ADN y un ARN, dos o más de los cuales, solamente en la presencia de una molécula facilitadora del ensamble de una MNAzima, pueden formar conjuntamente una "MNAzima". En ciertas formas de realización preferidas, una o más partzimas componentes, y preferiblemente por lo menos dos de ellas, pueden comprender tres regiones o dominios: un dominio "catalítico" que forma parte del núcleo catalítico de la MNAzima, que cataliza una modificación química; un "brazo de sensor" que puede asociarse con, y fijarse a, una facilitadora del ensamble (p.ej. a una diana); y a un dominio de "brazo de substrato" que puede asociarse con, y/o fijarse a, un substrato. Una descripción de estas regiones o estos dominios se puede ver, por ejemplo, en la Figura 2. Una partzima puede comprender una o más moléculas.

Abreviaturas

MNAzima : enzima de ácido nucleico de componentes múltiples, o enzima de ácido nucleico multipartita; ADNzima : enzima de ácido desoxirribonucleico; ARNzima : enzima de ácido ribonucleico, o ribozima; PCR : reacción en cadena de la polimerasa; dH2O : agua destilada desionizada;

: F : fluoróforo

: Q : desactivador JOE o 6-JOE : 6-Carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína; FAM o 6-FAM : 6-Carboxifluoresceína; BHQ1 : Desactivador de Agujero Negro 1;

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Tabla 1. Reseña de diferentes tipos de muestras y diferentes métodos de preparación. NPW: Lavado Nasofaríngeo; BAL: Lavado Bronquioalveolar

Esputo (humano): NPW (humano) Fluido BAL (de ratón) Cultivo de Virus (Sobrenadante) Cultivo de Virus (Fracción celular) Tejido de pulmón (de rata)

Covaris S2: Sí Sí Sí Sí Sí No

Dyspomix: Sí Sí Sí Sí Sí Sí

EasyMAG: No Sí Sí Sí No No

Las muestras se almacenaron en el mismo laboratorio a -80 °C. El peso de las muestras congeladas se determinó mientras que éstas todavía estaban congeladas, se añadió 1 volumen de una mezcla de PBS y 10 % de DTT a las muestras con un volumen final mínimo de 2,2 ml (en un tubo de fondo redondo de polipropileno de Becton Dickinson con una capacidad de 14 ml, número de referencia 352059 (25 por bolsa, estéril)). Unas muestras con un volumen inicial estimado mayor que 1,5 ml fueron en primer lugar transferidas a un tubo de 50 ml antes de la adición de un volumen de PBS y 10 % de DTT por medio de un ligero calentamiento del tubo de 15 ml hasta que las muestras congeladas pudieran ser deslizadas dentro del tubo Falcon de 50 ml (Tapón rojo). La muestra congelada en PBS10 % de DTT se colocó en el instrumento de Covaris S2 y se trató con el SonoLAB Single v2,4,3 con los siguientes ajustes:

Modalidad = Seguimiento de la energía, Número de ciclos = 10, Límite de la temperatura del baño = 15ºC

Tratamiento 1: "Ciclo de Trabajo" = 20 %, "Intensidad" = 10 y "Ciclos/Ráfaga" = 100 durante 30 s.

Tratamiento 2: "Ciclo de Trabajo" = 0,1 %, "Intensidad" = 0,1 y "Ciclos/Ráfaga" = 50 durante 10 s.

En la mayor parte de los casos era suficiente un (1) ciclo para disolver a la muestra, en el caso de que no fuese así, se añadieron tantos ciclos suplementarios como se necesitasen.

El enfriamiento del Covaris se ajustó a 1 °C.

Después del tratamiento de Covaris, se añadieron 4 volúmenes de muestras iniciales de un Tampón de lisis (EasyMAG, de BioMérieux) y se incubaron durante 10 minutos.

El instrumento de Covaris S2 que se ha descrito más arriba puede ser encontrado en el sitio web de Covaris viz www.covarisinc.com. En resumen, el proceso de Covaris produce un campo acústico controlado dentro de un recipiente que está cerrado herméticamente. El proceso se basa en una tecnología de energía acústica enfocada controlada por ordenador. El proceso Adaptive Focused Accoustics (con el acrónimo AFA) de Covaris trabaja enviando unos paquetes de ondas de energía acústica a partir de un transductor en forma de plato, que converge y enfoca en una pequeña zona localizada (él es visualizado algunas veces como un cono vibrante de altavoz). En este punto focal, la densidad de energía puede ser enfocada de una manera controlable en la muestra que interesa, lo que ha probado ser beneficioso para numerosas aplicaciones de preparación de muestras. Esencialmente, el proceso hace posible que la energía mecánica sea aplicada a una muestra sin entrar en contacto directamente con la muestra.

Un instrumento de Covaris avanzado comprende un denominado intensificador que está unido con el transductor que produce las ondas. Dichas ondas, comenzando a partir del centro del intensificador cóncavo, son reflejadas por el cono y las ondas verticales obtenidas producen un calentamiento suplementario en el fondo del recipiente.

Extracción automática de ARN El ARN fue extraído usando la plataforma de EasyMAG (de BioMérieux) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el suministrador con la siguiente adaptación: se usaron 3 ml del volumen de la muestra lisada (No se dispensaba lisis en el EasyMAG), por 8 muestras que se habían de extraer: 110 µl de IEC-B (testigo de control de la extracción interna para los RSV-B, almacenados a -80 °C) se mezclaron con 440 µl del Tampón 3 de EasyMAG y 550 µl de perlas magnéticas. En total, 125 µl de esta mezcla se dispensaron en pocillos separados usando los ajustes previamente programados número 2 de la pipeta dispensadora de EasyMAG. Usando los ajustes previamente programados número 3 de la pipeta dispensadora de EasyMAG se añadieron 100 µl de esta mezcla a cada una de las muestras. Se realizó una elución en 110 µl (Tampón 3, de EasyMAG). Tan pronto como se hubo completado la extracción, se ejecutó la tecnología de q-RT-PCR o la tecnología de MNAzima tal como se describirá en los Ejemplos 2 (A) y (B) respectivamente. El resto del ARN se almacenó a -80 °C.

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Para cada muestra, se prepararon tres mezclas para q-RT-PCR en duplicado: RSV-A, RSV-B y IEC

Muestras: 1

Volumen de reacción (µl): 30

Detalle de la mezcla: Concentración Volumen para (µl)

Unidad: Existencias Final 1 muestra X muestras

Agua libre de Rnasa: 0,77 2,31

ARNt de levadura: ng/ml 10.000 120 0,360 1,08

2x Tampón de reacción: X 2,00 1,000 15,000 45,00

Euroscript RT: kU/ml 50,00 0,250 0,150 0,45

Sonda de RSV: µM 25,00 0,100 0,120 0,36

Cebador FW de RSV: µM 20,00 0,900 1,350 4,05

Cebador RV de RSV: µM 20,00 0,900 1,350 4,05

MgCl2: mM 50,00 1,500 0,900 2,70

Volumen total de la mezcla (µl): 60,00

Volumen de la mezcla / tubo (µl): 20,00

ARN total de RSV-A: 10,00

5 Cuando todos los componentes se hubieron añadido a la placa, la placa fue cerrada herméticamente con una Tapa Adhesiva Óptica (de ABI) y centrifugada durante 1 minuto a 1,500 rpm (revoluciones por minuto). Antes de tratar en la ABI7900HT, la placa fue tapada con una Snap-On Optical Film Compression Pad [Almohadilla de Compresión de Película Óptica de Salto Elástico] MicroAmp™ (de ABI).

10 El perfil térmico fue:

"Escalón 1" reacción de la transcriptasa inversa: 48 °C, 30 minutos

"Escalón 2" activación de la polimerasa: 95 °C, 10 minutos

"Escalón 3": 45 repeticiones:

Desnaturalización a 95 °C, 15 segundos

15 Elongación a 60 °C, 1 minuto

Construcción del testigo de control de la cuantificación externa (EQC) para el ensayo por q-RT PCR de RSV Con el fin de definir el intervalo dinámico del ensayo por q-RT-PCR, se construyeron unos controles de la cuantificación externa. Esto incluía:

 El diseño de las siguientes construcciones artificiales plasmídicas que contenían:

20 O La secuencia situada entre los cebadores directo (EQC-RSV-A-FW) e inverso (EQC-RSV-A-RV) que cubre una región de RSV-A de 1.004 pares de bases incluyendo la región en donde se reanillan los cebadores y las sondas de ensayo por q-RT-PCR de RSV-A. Esta construcción artificial es marcada como testigo de control de la cuantificación externa de RSV-A (pEQC-A). O La secuencia situada entre los cebadores directo (EQC-RSV-B-FW) e inverso (EQC-RSV-B-RV)

25 que cubre una región de RSV-A de 1.399 pares de bases incluyendo la región en donde se reanillan los cebadores y las sondas de ensayo por q-RT-PCR de RSV-B. Esta construcción artificial es marcada como testigo de la cuantificación externa de RSV-B (pEQC-B).

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Cuantificación del IEC en tiempo real

Los transcritos purificados se diluyeron a 1/1.000 y se sometieron a una cuantificación por PCR en tiempo real o bien en la presencia o en la ausencia de la enzima RT. Las composiciones de las diversas mezclas are representan más abajo. El programa de amplificación que se usó en el equipo de PCR en tiempo real ABI9700 HT era de 48 °C durante 30 minutos, de 95 °C durante 10 minutos seguido por 45 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y de 60 °C durante 1 minuto.

Volumen de reacción (µl): 25

Detalle de la mezcla: Concentración Volumen para (µl)

Unidad: Existencias Final 1 muestra X muestras

Agua libre de Rnasa tARN de Levadura 2x Mezcla Master w/o UNGr 40X MultiScribe y Mezcla Inhibidora de Rnase Sonda de IEC-B Cebador 1 Cebador 2: 0,325 7,15

ng/ml: 10,000 120 0,300 6,60

X: 2,00 1,000 12,500 275,00

X: 40,00 0,013 0,625 13,75

µM: 5,00 0,100 0,500 11,00

µM: 20,00 0,300 0,375 8,25

µM: 20,00 0,300 0,375 8,25

Volumen total de la mezcla (µl): 330,00

Volumen de la mezcla / Tubo (µl): 15,00

ARN total: 10,00

Tratamiento de las muestras, un ejemplo

En total se trataron 5 muestras clínicas. Cada una de las muestras clínicas se diluyó en PBS/1 % de DTT hasta llegar a un volumen final de 2,2 ml. Esta mezcla se trató en el AFA (de Covaris) durante 60 segundos antes de la adición de 4 ml del tampón de lisis (EasyMAG, de BioMérieux). A partir de estos 6,2 ml por muestra, 3 ml se trataron en el EasyMAG (de BioMérieux) y el ARN se eluyó en 110 µl de los que 10 µl se trataron en la q-RT-PCR en duplicado. El experimento se repitió una vez comenzando a partir de la extracción con los restantes 3 ml.

Reparto en partes alícuotas y almacenamiento de IEC

En total 24 muestras negativas (PBS, 10 % de DTT, volumen final 1 ml) se lisaron con 2 ml del Tampón de lisis (de BioMérieux) y se incubaron durante 10 minutos. Tres partes alícuotas de IEC-B (110 µl) se descongelaron y se diluyeron con el tampón 3 (440 µl, de BioMérieux). En total se añadieron 550 µl de perlas magnéticas de sílice (de BioMérieux) a esta dilución de IEC y las tres mezclas se agruparon para obtener un volumen final de 3.300 µl de una mezcla de IEC y perlas magnéticas de sílice. Esta mezcla se diluyó tal como se ha descrito para la adición al IEC del EasyQ (de BioMérieux), es decir, 125 µl de la mezcla se dispensaron en 24 pocillos (usando el protocolo "2" previamente programado en la pipeta dispensadora automática de BioMérieux) y de esta mezcla total, se añadieron 100 µl a cada una de las muestras, usando el protocolo "3" previamente programado en la pipeta dispensadora automática BioMérieux. Los IEC se extrajeron adicionalmente en el EasyMAG y se eluyeron en 110 µl. A partir de esta mezcla, 10 µl se sometieron a una amplificación por q-RT-PCR.

Resultados PCR

El amplicón para la construcción artificial del testigo de control de la extracción interna de RSV-A tenía un tamaño de 77 pares de bases mientras que el amplicón para la construcción artificial del testigo de control de la extracción interna de RSV-B tenía un tamaño de 74 pares de bases. Estos fragmentos amplificados por PCR se ligaron en un vector TOPO-TA y se transformaron en el seno de E.coli competentes. Los transformantes se dejaron crecer durante una noche sobre unas placas de LB sólido/ampicilina. En total se transfirieron 10 colonias a un medio LB líquido/Ampicilina y de nuevo se dejaron crecer durante una noche. Se preparó un miniprep (de Qiagen, Hilden, Alemania) a partir de estos cultivos y el resultante ADN se sometió a una secuenciación.

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Tabla 4

SEQ. ID No.: Secuencia de cebador enumerada en dirección de 5' a 3' Nombre

34: GTGATAGAGTTCCAACAAAAGA 5RSVA/3

35: AAGTGCTTACAGGTGTAGTTA 3RSVA/3

36: GCTCCAGAATATAGGCATGAT 5RSVB/3

37: GATCTATCTCCTGCTGCTAAT 3RSVB/3

38: CTTGTAATAACCAAAGGGCGA 5IECB/1

39: GGAAACAGCTATGACCATGATT 3IECA3/3

4. Componentes de la Reacción: Amplificación y cuantificación de secuencias dianas

La transcripción inversa, la amplificación en tiempo real y la cuantificación de las secuencias dianas se ejecutaron en

5 un volumen total de reacción de 25 µl. Todas las reacciones se condujeron en un Sistema de QPCR Mx3005P™ (de Stratagene). Los parámetros de ciclación fueron de 50 °C durante 30 minutos (etapa de transcripción inversa), seguidos por 95 °C durante 7 minutos, luego 10 ciclos de 95 °C durante 15 segundos e inicialmente de 65 °C durante 30 segundos con una disminución de la temperatura a razón de 1 °C por ciclo hasta 55 °C, y finalmente 50 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y de 50 °C durante 120 segundos. Las tandas de reacción contenían 40 nM de

10 5RSVA/3, 40 nM de 5RSVB/3, 40 nM de 5IECB/1, 200 nM de 3RSVA/3, 200 nM de 3RSVB/3, 200 nM de 3IECA3/3, 200 nM de cada substrato (SubBi-2-FB, SubBi-3-JB y SubBi-6-Q6B2), 8 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTP, 10 unidades de Arnsin (de Promega), 1 x Immobuffer (de Bioline), 1 unidad de Immolase (de Bioline) y 40 U de MMLV(-H) (de Promega). Cada tanda de reacción en duplicado contenía una dilución de ambos ARN genómicos de RSVA y RSVB junto con una preparación de ARN de una transcripción con T7 de la secuencia de IECB, o ningún

15 ácido nucleico de molde.

Se produjeron dos curvas patrón, cada una de ellas ejecutada en duplicado. La primera curva patrón se generó ejecutando cuatro veces las diluciones de ambos ARN genómicos virales de RSVA y el transcrito con T7 del IECB por medio de una constante concentración de fondo del ARN genómico viral de RSVB. La segunda curva patrón se

20 generó ejecutando cuatro veces las diluciones de ambos ARN genómicos virales de RSVB y el transcrito con T7 del IECB por medio de una constante concentración de fondo del ARN genómico viral de RSVB . Tabla 5 : Curvas patrones de RSVA /IECB

Umbral (Ct)

RSVA (FAM): RSVB (JOE) IECB (Quasar 670)

Patrón 1: 22,9 19,6 11,6

Patrón 2: 25,3 19,9 13.8

Patrón 3: 28,1 20,4 15,9

Patrón 4: 30,6 20,4 19,0

Patrón 5: 32,9 20,3 20,8

Patrón 6: 36,4 20,6 23,4

Agua solamente (no testigo de molde): No Ct No Ct No Ct

Curva Patrón: R2 = 0,995 Pendiente = -4,102 Eficiencia = 75,2 % N/A R2 = 0,997 Pendiente = -3,954 Eficiencia = 79 %

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Tabla 7: Análisis de esputos y/o lavados nasofaríngeos usando el Método A y el Método B respectivamente Ct = ciclo de umbral/señal positiva; ND = no detectado; + = resultado positivo; -= resultado negativo

Muestra: Datos (Cts) Método B Datos (Cts) Método A Resultados Método B Resultados Método A

RSVA: RSVB IECB RSVA RSVB RSVA RSVB RSVA RSVB

Esputo 36: 15,6/17,1 ND x 2r 30/27,3 21,2 ND + - + -

NPW 10: 19,7/20,2 ND x 2r 28,2 25,0 ND + - + -

NPW 11: 34,4/36,0 23,2/24,0 29,1 39,8 22,4 + + + +

NPW 12: 37,1/39,3 25,1/26,3 28,3 42,5 24,0 + + + +

NPW 13: ND x 2r 27,2/39 28,8 ND 25,1 - + - +

NPW 14: 18,9/19,5 ND x 2r ND 24,3 ND + - + -

NPW 15: 18,4/18,9 ND x 2r 28,5 23,5 ND + - + -

NPW 16: ND/41,7 26,1/26,8 27,8 43,6 24,7 + (1/4) + + +

NPW 17: 38/37 ND x 2r 28,2 ND 40,7 + - - +

NPW 18: ND x 2r 14,2/15,3 26,4 ND 15,1 - + . +

NPW 19: 37,1/ND 21,1/21,7 28,7 ND 20,8 + (1/4) + - +

NPW 20: ND/41,4 19,7/20,0 27,5 ND 19,6 + (1/4) + - +

NPW 21: 19,2/20,1 ND x 2r 29,1 23,7 ND + - + -

NPW 22: 41,8/ND ND x 2r 28,6 ND 30,3 + (1/4) - - +

NPW 23: 38,3/36,4 23,5/23,8 28,3 ND 22,7 + (3/4) + - +

NPW 24: 40,6/ND 34,5/ND 27,9 ND 30,7 + (1/4) + (1/4) - +

NPW 25: 30,7/34,3 ND x 2r 28,5 34,8 42,5 + - + +

NPW 26: 18,6/19,3 ND x 2r 28,2 23,4 ND + - + -

NPW 27: ND x 2r 19,0/20,1 27,7 ND 19,6 - + - +

NPW 30: 18,1/19,2 ND x 2r 28,2 23,4 ND + - + -

NPW 32: ND x 2r 25,1/26,3 29,1 ND 24,3 - + - +

NPW 33: 15,2 ND 28,4 20,2 ND + - + -

NPW 34: 21,4 ND 27,8 25,7 ND + - + -

NPW 36: 19,4 ND 27,7 24,3 ND + - + -

NPW 37: ND 19,5 28,6 ND 20,7 - + - +

NPW 38: 17,1 ND ND 21,8 42,0 + - + +

NPW 39: 36,7 21,5 27,3 40,6 21,2 + + + +

Esputo 1: 27,2/29,6 15,0/14,2 ND 35,4 15,8 + + + +

Esputo 2: 22,8/25,1 15,2/14,0 ND 28,0 15,5 + + + +

Muestra: Método B Método A Método B Resultados Método A Resultados

RSVA: RSVB RSVA RSVB RSVA RSVB RSVA RSVB

Esputo 3: 27,5/29,2 NDx2r NA 17,4 NA - + - + -

NPW 6: 25,4/26,5 NDx2r 38,0 - 22,9 21,6 + - + +

NPW 7: 23.8/25,1 NDx2r 25,9 21,7 - - + - + -

NPW 8: 23,7/25,6 NDx2r NA - NA 25,5 + - - +

NPW 9: 26.8/28,7 NDx2r 26,1 24,6 - - + - + -

Hasta (4) réplicas de cada muestra se analizaron y cuando solamente algunas de ellas fueron detectables, se indica el número de positivas por el número total de réplicas que se habían analizado (p.ej. 1 entre 4 = 1/4).

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Claims

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