JP2005237381A

JP2005237381A - 細胞及び組織の粉砕

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Publication number: JP2005237381A
Application number: JP2005040913A
Authority: JP
Inventors: Robert Belly; ロバート・ベリー; Dustin Hays; ダスティン・ヘイズ
Original assignee: Janssen Diagnostics LLC
Current assignee: Janssen Diagnostics LLC
Priority date: 2004-02-18
Filing date: 2005-02-17
Publication date: 2005-09-08
Also published as: CA2497600A1; EP1577011A2; EP1577011A3; CN1673354A; AU2005200376A1; KR20060042056A; MXPA05001949A; AR050817A1; US20050178726A1; BRPI0500597A

Abstract

【課題】ＲＮＡの抽出をより迅速、より効率的、かつより生産的に実施でき、更に自動化が可能な改善された細胞及び組織の粉砕法を提供すること。
【解決手段】細胞及び／または組織を粉砕するための方法であって、粉砕すべきサンプルを入れる容器の外寸よりも僅かに小さい内寸を有する粉砕要素を使用する。細胞及び／または組織を粉砕するための装置も提供する。本発明の装置及び方法を用いて核酸の抽出などの処理を行うことができる。
【選択図】なし

Description

ＲＮＡの発現を、疾患のスクリーニング、診断、予防、治療モニタリング、及び／または再発追跡に有用なｉｎｖｉｔｒｏ診断検査の基準として用いることができる。ＲＮＡ発現の有効な測定には、細胞または組織から抽出した無傷の分解されていないＲＮＡが重要である。ＲＮＡの発現は、特に多数の遺伝子が関係するマイクロアレイ及びＰＣＲアッセイに有用である。

殆どのＲＮＡ抽出法では、ＲＮＡは機械的手段によって細胞から放出される。しばしば、ＲＮＡの抽出は、グアニジウム塩などのＲＮＡ安定化剤の存在下で行われる。こうすることにより、処理中に細胞または組織から放出されるＲＮＡ分解酵素によるＲＮＡの分解が最小限になる。生体サンプルを機械的に粉砕するための装置が、例えば特許文献１‐６に開示されている。このような装置では、要素を用いて、抽出する細胞成分を含むサンプルを粉砕または微粉砕するか、或いは他の方法で接触させる。本明細書において、この要素は粉砕要素と呼ぶことにする。殆どの場合、このような装置は、ガラスビーズなどのビーズやボールなどの粉砕要素を用いている。
米国特許第４，３０７，８４６号明細書米国特許第５，１９７，４８３号明細書米国特許第５，８４０，８７８号明細書米国特許第５，８２９，６９６号明細書米国特許第６，２３５，５０１号明細書米国特許第５，５６７，０５０号明細書

ＲＮＡの抽出をより迅速、より効率的、かつより生産的に実施でき、更に自動化が可能な改善された細胞及び組織の粉砕法が要望されている。これは、手術中のアッセイの場合に特に有用である。

本発明は、細胞及び組織を粉砕する方法を提供する。好ましくは、この方法では、機械的装置を４５秒以下作動させる。

本発明の別の態様は、細胞または組織サンプルからＲＮＡを抽出する方法である。好ましくは、このようなサンプルはリンパ節組織である。この方法では、細胞及び／または組織は、好ましくは４５秒以下、機械的に粉砕される。細胞残屑や気泡などの他の非ＲＮＡ成分は、粉砕されたサンプルから除去される。次いで、ＲＮＡをサンプルから抽出する。

本発明の更に別の態様では、細胞及び組織を粉砕する装置は粉砕要素を入れる容器部分を含む。粉砕装置の外面の空間（ビーズの場合は外周）が、容器部分の内寸（チューブの場合は直径）よりも僅かに小さい。

ＲＮＡの抽出をより迅速、より効率的、かつより生産的に実施でき、更に自動化が可能な改善された細胞及び組織の粉砕法が提供される。

本発明の最も好適な実施形態では、カリフォルニア州カールスバッドに所在のキューバイオジーン社（Qbiogene Inc.）が販売する「ＦＡＳＴＰＲＥＰ」装置などの機械的な細胞及び組織粉砕装置が用いられる。このような粉砕装置は、言及することを以って本明細書の一部とする米国特許第５，５６７，０５０号に開示されている。好ましくは、本発明の方法は、Ｏリングを含む２．０ｍｌねじキャップクリオバイアルチューブ（2.0ml screw-capped cryovial tubes）などを用いる。このチューブ内に約３０ｍｇ〜４００ｍｇの組織を粉砕要素と共に入れる。最も好ましくは、粉砕要素は、オクラホマ州バーテレズビル（Bartelesville）に所在のバイオスペック・プロダクツ社（BioSpec Products）が販売するような直径が６．３５ｍｍのスチールビーズである。チューブに、そのチューブの約半分またはそれ以上の所定量の均質化バッファー（homogenization buffer）（例えば、キアゲン社（Qiagen Corp）のＲＬＴバッファー）を添加する。好ましくは、２．０ｍｌチューブを用いる場合は、約１ｍｌの均質化バッファーを添加する。均質化バッファーは、好ましくはグアニジウム塩であるＲＬＴ安定化剤を含む。次いで、粉砕装置を４５秒またはそれ以下、運転した後、好ましくは微量遠心管でサンプルを遠心分離し、サンプルから細胞残屑や気泡を除去する。次いで、上清をデカントする。好ましくは、上清はスピンカラムに移し、そのスピンカラムを別の洗浄バッファーで処理してＲＮＡを精製する。溶媒を用いたＲＮＡ精製法を、所望に応じてスピンカラムの代わりに用いることもできる。

本発明の装置は、上記したような粉砕装置であるが、以前は不可能だった方法で組織を高速かつ効率的に粉砕できる寸法及び／または組成の粉砕要素を備えている。上記したように、粉砕要素は、組織に接触させる装置の一部である。好ましくは、このような粉砕要素はビーズである。本発明の粉砕要素は、サンプルを処理する容器の内寸よりも僅かに小さい外寸を有する。好適な実施形態では、容器は内径が８．２８ｍｍの上記したようなチューブであり、粉砕要素は６．３５ｍｍのスチールビーズである。内寸と外寸に比率が同様であれば、他の容器及び粉砕要素も用いることができる。ビーズの密度もまた、本装置の改善された性能に貢献している。ステンレス鋼からなるビーズの密度は、好ましくは８．０３ｇ／ｃｍ³以上であるが、密度が７．０ｇ／ｃｍ³を超えるビーズを用いることもできる。

例
例１．様々なビーズの大きさ及び組成の評価
様々なビーズの大きさ及び材料を、ブタリンパ節組織を粉砕する能力について評価する。内径が８．２８ｍｍの２．０ｍｌねじキャップチューブ（オクラホマ州バーテレズビル（Bartelesville）に所在のバイオスペック・プロダクツ社（BioSpec Products））を用いた。それぞれのチューブをＲＬＴバッファー（カリフォルニア州バレンシアのキアゲン社（Qiagen Corp））で満たし、バイオスペック・プロダクツ社が販売するミニビーズビーター８（Mini-Bead Beater 8）を用いて、１分間、３分間、または５分間ホモジナイズした。

バイオスペック・プロダクツ社から以下の大きさ及び組成のビーズを購入した。
１．直径０．１ｍｍのジルコニア／シリカ（カタログ番号11107901z）
２．直径０．１ｍｍのガラス（カタログ番号11079101）
３．直径０．５ｍｍのガラス（カタログ番号1107905）
４．直径０．５ｍｍのジルコニア／シリカ（カタログ番号11079105z）
５．直径１．０ｍｍのガラス（カタログ番号11079110）
６．直径２．５ｍｍのジルコニア／シリカ（カタログ番号11079125z）
７．直径６．３５のステンレス鋼（カタログ番号11079635ss）
８．直径６．３５のガラス（カタログ番号110796325）

この実験結果が以下の表１に示されている。この表に示されているように、１：不完全にホモジナイズされた組織、２：部分的にホモジナイズされた組織、３：完全にホモジナイズされた組織の３つスケールで目視で判定すると、複数の直径６．３５ｍｍのガラスビーズまたは１つの直径６．３５ｍｍのステンレス鋼ビーズが最も良く組織を粉砕した。

例２．ビーズ密度の影響
例１に示されているように、直径６．３５ｍｍの粉砕要素（ビーズ）を用いて最良の完全な組織ホモジナイゼーションが得られた。ビーズ密度もホモジナイゼーションの質に影響を及ぼす。

直径（６．３５ｍｍ）は同じであるが密度が異なるビーズ同士を比較した。約２２５ｍｇのブタリンパ節を、１ｍｌのグアニジニウム系溶解バッファー（キアゲン、ＲＬＴバッファー）とセラミック、ガラス、またはステンレス鋼からなる６．３５ｍｍのビーズ１つを含む２ｍｌねじキャップバイアルで粉砕した。ビーズを含む組織サンプルを、バイオスペック社のビーズビーター８で１分間、３分間、及び５分間処理した。サンプルを短時間遠心分離し、例１と同様にホモジナイゼーションの質を目視で評価した。

表２は、１：不完全にホモジナイズされた組織、２：部分的にホモジナイズされた組織、３：完全にホモジナイズされた組織の３つスケールを用いて目視で評価した３つのデータの平均値の要約である。この実験から、ビーズ材料の密度が増大すると組織粉砕が改善され、ステンレス鋼ビーズが最も良い成績であることが分かる。

例４．ビーズビーター装置とガラスまたはステンレス鋼ビーズを用いたＲＮＡの収量及び純度
ＲＮＡの収量及び純度を、６．５ｍｍまたはそれ以上の様々な直径のガラスまたはステンレス鋼ビーズについて決定した。ミニビーズビーター８を１分間、高速で作動させた。条件は、上記した例１の条件と同様である。６．３５ｍｍのステンレス鋼及びガラスビーズはバイオスペック・プロダクツ社から入手した。他のビーズは全て、ニュージャージー州クリフトンに所在のグレン・ミルズ社（Glen Mills Inc.）から購入した。

組織を粉砕した後、得られたホモジネートをＥｐｐｅｎｄｏｒｆモデル５４１５（ニューヨーク州のウエストバーリーのブリンクマン・インスツルメンツ社（Brinkman Instruments））を用いて１５秒間遠心分離し、ＲＮＡをＱＩＡＧＥＮＲＮｅａｓｙミニキット（カリフォルニア州バレンシアのキアゲン社）で精製した。溶解物の一部を、ＲＬＴバッファーの組織濃度が３０ｍｇ／ｍｌになるまで希釈した。４００μｌの溶解物を、４００ｍｌの７０％エタノールを含むミクロチューブに添加し、サンプルをピペッティングで混合した。サンプル（７００μｌ）を、真空マニフォールドに配置されたＲＮｅａｓｙにカラムに適用した。残りのろ過ステップの間、真空をかけて保持した。カラムを７００μｌのＲＷＩバッファーで洗浄し、続いて７００μｌのＲＰＥバッファーで洗浄した。次いで、スピンカラムを１．５ｍｌの収集チューブに入れ、１，４０００回転／分で３０秒間遠心分離してカラムを乾燥させた。カラムを、新しい１．５ｍｌの収集チューブに移した。５０ｍｌのＲＮＡ分解酵素を含まない水を膜に直接適用し、カラムを含むチューブを１，４０００回転／分で３０秒間遠心分離してＲＮＡを溶出した。このＲＮＡサンプルを氷上に置き、アッセイする前に８０℃で保管した。

ＲＮＡの収量は、ＧｅｎｅＳｐｅｃ装置（カリフォルニア州アラメダのミライバイオ（MiraiBio））で決定したサンプルの２６０／２８０ｎｍの比率に基づいて分光光度的に測定した。アジレントの２１００バイオアナライザー及びアジレントのＲＮＡ６０００ナノアッセイ試薬及び供給品（カリフォルニア州フォスターシティのアジレント・テクノロジーズ社（Agilent Technologies））を用いてＲＮＡの収量及び質を決定した。

この結果が表３に要約されている。この表は、チューブの目視検査による決定で、直径が６．３５ｍｍのステンレス鋼ビーズが、ＲＮＡ収量が最も高く最良のホモジナイゼーションであることを実証している。更に、ステンレス鋼ビーズの収量が、同じ直径のガラスビーズに比べて著しく改善されていることが示されている。アジレントのバイオアナライザー電気泳動図により、高速ホモジナイゼーションで高品質のＲＮＡが得られることが確認された。高速のビーズを用いた方法によって粉砕されたサンプルで１８ｓリボソーム及び２８ｓリボソームの明確なピークが確認され、全てのサンプルで２８ｓに対する１８ｓの比率が１．５を超えていた。

例３．ＦａｓｔＰｒｅｐ装置での組織粉砕
以下の実験は、５０ｍｇ〜５００ｍｇの範囲のブタリンパ節サンプルをＦａｓｔＰｒｅｐホモジナイザー（カリフォルニア州カールバッドのキュービオジーン社（Qbiogene Inc.））で粉砕した時のＲＮＡ収量の精密を決定するために実施した。これらの実験は、１つの６．３５ｍｍステンレス鋼ビーズを含む２ｍｌＳａｒｓｔｅｄｔねじキャップバイアルで実施した。

これら実験では、表４に示されている様々な質量の粉砕された凍結ブタリンパ節組織を、１本のチューブに付き１つの６．３５ｍｍステンレス鋼シーズを含む２ｍｌＳａｒｓｔｅｄｔねじキャップバイアルに添加した。１ｍｌのＲＬＴバッファーを添加し、そのチューブをＦａｓｔＰｒｅｐ装置で４５秒間、６．５ｍ／秒の速度で処理した（この実験を行うために、大きなチューブを受容できるようにＦａｓｔＰｒｅｐ装置のスポークプレート（spokeplate）からワッシャーを外した）。粉砕の後、チューブをＥｐｐｅｎｄｏｒｆモデル５４１５Ｃ（ニューヨーク州のウエストバーリーのブリンクマン・インスツルメンツ社（Brinkman Instruments））で１５秒間、１４，０００ｇで遠心分離して細胞残屑をペレットにし、サンプルから気泡を除去した。それぞれの溶解物の一部を、ＲＬＴバッファー中の組織の濃度が３０ｍｇ／ｍｌまで希釈し、ピペッティングで十分に混合した。この組織を処理してＲＮＡを抽出し、そのＲＮＡを例３で定量した。

この実験結果は、４００ｍｇ未満の組織サンプルで２０μｇを超える全ＲＮＡの回収を実証している。４００ｍｇ〜５００ｍｇの範囲のブタリンパ節サンプルではやや少ない全ＲＮＡの回収が観察され、この実験条件下での組織粉砕の効率がやや低いことを示唆している。

より少ない質量の組織サンプルを含むチューブで精密が最も低い。しかしながら、続く実験で、より少ない質量のリンパ節組織で標準偏差が大きいのは組織の不均一性及びサンプリングによるものであると推定した。なぜなら、より大きい組織が粉砕されて少量の組織がホモジナイゼーションに用いられる場合に組織回収の精密が著しく改善されるためである。

例５．ブタＢ‐アクチン遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲアッセイ
以下の実験は、ＦａｓｔＰｒｅｐ法で高速ホモジナイゼーションした後に回収したＲＮＡをリアルタイムＰＣＲアッセイで増幅可能であることを実証するために実施した。例４の精製ＲＮＡを用いた。比較のために、コントロールを含めた。このコントロールは、ブタリンパ節組織をＯｍｎｉ組織ホモジナイザー及び使い捨てＰＣＲプローブ（バージニア州ワーレントンのオムニ・インターナショナル社（Omni International））によって機械的に粉砕したものである。Ｏｍｎｉ組織ホモジナイザーは、組織を粉砕するためにビーズを用いていない。Ｏｍｎｉ組織ホモジナイザーで処理するために、１００ｍｇ〜４００ｍｇのブタリンパ節組織を６ｍｌのＲＬＴバッファーと混合し、手動ホモジナイザー（モデルＰＣＲ２５８）で１分間ホモジナイズした。サンプルを等量の７０％エタノールと混合し、７００μｌをキアゲンのスピンカラムに添加し、例３に示されているようにＲＮＡを精製した。

ｃＤＮＡコピーを作製するためにＲＮＡを次のように転写した。まず、１．２５μｌの７５μＭアンカーオリゴｄＴ２３の保存液、０．３１μｌの１０ｍＭ各ｄＮＴＰ、及びＲＮＡ分解酵素処理水（ミズーリー州セントルイスのシグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co））を１３μｌになるように混合して作成した主混合物に１μｇのＲＮＡを添加し、この混合物を７０℃で５分間加熱し、氷上に移した。次いで、５μｌの５×ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄバッファー、２．５μｌの０．１Ｍジチオスレイトール、０．７５μｌの４０Ｕ／μｌＲａｎａｓｉｎ溶液（ウイスコンシン州マジソンのプロメガ社（Promega Corp））、及び１．２５μｌの２００Ｕ／μｌＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素を含む９．５μｌの混合物を添加し、チューブを４２℃で５０分間インキュベートした。５μｌの０．５ＭＮａＯＨを添加し、チューブを７０℃で５分間インキュベートした。次いで、２．５μｌの１ＭＴｒｉｓ‐ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）を添加し、更に６７．４μｌのＲＮＡ分解酵素を含まない水を添加した。ＲＮＡがｃＤＮＡに完全に変換され、１μｇの転換率が５０，０００細胞当量（ＣＥ）に等しいと仮定して、５００ＣＥ／μｌの濃度の２５ｍＭＴｒｉｓバッファーを、続く全てのリアルタイムＰＣＲアッセイに用いた。ブタＢ‐アクチンプライマー（配列番号１及び２）が、インビトロジェン社（Invitrogen Corp）（カリフォルニア州のカールスバッド）によってテキサス州ヒューストンのシンセゲン・ＬＬＣ社（SYNTHEGEN LLC）のＢ‐アクチンＴａｑｍａｎプローブ（配列番号３）を用いて合成された。全てのＴａｑｍａｎプローブに対して、色素とクエンチャーの対としてカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）とカルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）を用いた。配列番号１及び２の配列は配列表の通りである。配列番号３の配列は、配列表の配列番号３の左側に６‐ＦＡＭ、右側にＴＡＭＲＡが付加されている。

Ｔａｑｍａｎアッセイのために、主混合物は、２５μｌの２×ＴａｑｍａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲ混合物（アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems, Inc））、１．２５μｌの１０μＭプローブ保存液、及び５μｌの０．５μＭ各プライマー液を加えて作成した。ｃＤＮＡ（２μｌ）を光反応微量定量プレートの各ウェルに添加した。光キャプでキャプした後、プレートをＡＢＩＰｒｉｓｍ７９００ＨＴ配列検出システム（カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ社）で処理し、製造者の推奨するプロトコルに従ってアッセイを実施した。Ｔａｑｍａｎアッセイによる３つの測定の平均が表５に示されている。

アッセイの結果が表５に要約されている。このアッセイにより、本発明の方法及びＯｍｎｉホモジナイザーで同等の収量のＲＮＡが得られることが実証された。本発明の方法は、複数のサンプルを同時に処理できるという点で有利である。更に、密閉チューブを用いるため、サンプルからサンプルへの汚染を最小限にすることができる。

本発明の実施態様は以下の通りである。
（１）サンプルの容器と共に用いる粉砕要素を有する細胞または組織の粉砕機を含む装置であって、前記粉砕要素の外寸が前記容器の内寸よりも僅かに小さいことを特徴とする装置。
（２）前記粉砕要素の外寸が前記容器の内寸の０．３倍よりも大きいことを特徴とする実施態様（１）に記載の装置。
（３）前記粉砕要素の外寸が前記容器の内寸の０．７５倍よりも大きいことを特徴とする実施態様（１）に記載の装置。
（４）前記粉砕要素が、密度が７．０よりも高い高密度材料を含むことを特徴とする実施態様（１）に記載の装置。
（５）前記粉砕要素が、鋼または密度が８．０以上の材料を含むことを特徴とする実施態様（４）に記載の装置。

（６）前記粉砕要素が、直径が約６ｍｍのステンレス鋼ボールであり、前記容器が、内径が約８ｍｍのチューブであることを特徴とする実施態様（１）に記載の装置。
（７）細胞または組織を粉砕するための方法であって、
細胞または組織を含むサンプルを容器に入れるステップと、
核酸安定液を前記容器に添加するステップと、
粉砕要素を前記容器内に入れるステップと、
粉砕装置を４５秒以下作動させるステップとを含むことを特徴とする方法。
（８）前記粉砕装置で処理される前記サンプルがリンパ節サンプルであり、前記リンパ節サンプルから上清をデカントし核酸を抽出することを特徴とする実施態様（７）に記載の方法。
（９）組織または細胞サンプルから核酸を抽出するための方法であって、
細胞または組織を含むサンプルを容器に入れるステップと、
核酸安定液を前記容器に添加するステップと、
粉砕要素を前記容器内に入れるステップと、
粉砕装置を４５秒以下作動させるステップと、
前記粉砕装置で処理したサンプルを取り出すステップと、
前記取り出したサンプルから核酸を抽出するステップとを含むことを特徴とする方法。
（１０）前記粉砕要素の外寸が前記容器の内寸よりも僅かに小さいことを特徴とする実施態様（９）に記載の方法。

（１１）前記粉砕要素の外寸が前記容器の内寸の０．３倍よりも大きいことを特徴とする実施態様（１０）に記載の方法。
（１２）前記粉砕要素の外寸が前記容器の内寸の０．７５倍よりも大きいことを特徴とする実施態様（１０）に記載の方法。
（１３）前記粉砕要素が高密度材料を含むことを特徴とする実施態様（１０）に記載の方法。
（１４）前記粉砕要素が、鋼またはその鋼の密度以上の材料を含むことを特徴とする実施態様（１０）に記載の方法。
（１５）前記粉砕要素が、直径が約６ｍｍのステンレス鋼ボールであり、前記容器が、内径が約８ｍｍのチューブであることを特徴とする実施態様（１０）に記載の方法。

（１６）前記方法が手術中に実施されることを特徴とする実施態様（１０）に記載の方法。
（１７）前記サンプルがリンパ節組織であることを特徴とする実施態様（１６）に記載の方法。

Claims

サンプルの容器と共に用いる粉砕要素を有する細胞または組織の粉砕機を含む装置であって、前記粉砕要素の外寸が前記容器の内寸よりも僅かに小さいことを特徴とする装置。
前記粉砕要素の外寸が前記容器の内寸の０．３倍よりも大きいことを特徴とする請求項１に記載の装置。
前記粉砕要素の外寸が前記容器の内寸の０．７５倍よりも大きいことを特徴とする請求項１に記載の装置。
前記粉砕要素が、密度が７．０よりも高い高密度材料を含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
前記粉砕要素が、鋼または密度が８．０以上の材料を含むことを特徴とする請求項４に記載の装置。
前記粉砕要素が、直径が約６ｍｍのステンレス鋼ボールであり、前記容器が、内径が約８ｍｍのチューブであることを特徴とする請求項１に記載の装置。
細胞または組織を粉砕するための方法であって、
細胞または組織を含むサンプルを容器に入れるステップと、
核酸安定液を前記容器に添加するステップと、
粉砕要素を前記容器内に入れるステップと、
粉砕装置を４５秒以下作動させるステップとを含むことを特徴とする方法。
前記粉砕装置で処理される前記サンプルがリンパ節サンプルであり、前記リンパ節サンプルから上清をデカントし核酸を抽出することを特徴とする請求項７に記載の方法。
組織または細胞サンプルから核酸を抽出するための方法であって、
細胞または組織を含むサンプルを容器に入れるステップと、
核酸安定液を前記容器に添加するステップと、
粉砕要素を前記容器内に入れるステップと、
粉砕装置を４５秒以下作動させるステップと、
前記粉砕装置で処理したサンプルを取り出すステップと、
前記取り出したサンプルから核酸を抽出するステップとを含むことを特徴とする方法。
前記粉砕要素の外寸が前記容器の内寸よりも僅かに小さいことを特徴とする請求項９に記載の方法。
前記粉砕要素の外寸が前記容器の内寸の０．３倍よりも大きいことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
前記粉砕要素の外寸が前記容器の内寸の０．７５倍よりも大きいことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
前記粉砕要素が高密度材料を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
前記粉砕要素が、鋼またはその鋼の密度以上の材料を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
前記粉砕要素が、直径が約６ｍｍのステンレス鋼ボールであり、前記容器が、内径が約８ｍｍのチューブであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
前記方法が手術中に実施されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
前記サンプルがリンパ節組織であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。