KR20060013207A

KR20060013207A - 케라티노사이트 및/또는 섬유아세포를 함유하는 화장용조성물

Info

Publication number: KR20060013207A
Application number: KR1020040062079A
Authority: KR
Inventors: 전세화; 장동일
Original assignee: 테고사이언스 (주)
Priority date: 2004-08-06
Filing date: 2004-08-06
Publication date: 2006-02-09
Also published as: JP2006045175A; WO2006014089A1; KR100614903B1

Abstract

본 발명은 동결건조된 케라티노사이트와 섬유아세포 중 적어도 어느 하나를 함유한 화장용 조성물 및 (1) 케라티노사이트 또는 섬유아세포를 배양하는 단계; (2) 상기 배양된 케라티노사이트 또는 섬유아세포를 동결건조시키는 단계 및 (3) 상기 동결건조된 케라티노사이트와 섬유아세포 중 적어도 어느 하나를 화장용으로 허용된 담체에 첨가하는 단계를 포함하는 상기 화장용 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 상기 화장용 조성물을 피부에 적용하면 케라티노사이트 및 섬유아세포의 기 발현된 사이토카인이 방출되어 피부 재생을 촉진한다.

동결건조, 케라티노사이트, 피부각질세포, 섬유아세포

Description

케라티노사이트 및/또는 섬유아세포를 함유하는 화장용 조성물{Cosmetic Composition Containing Keratinocyte and/or Fibroblast}

도 1a 및 1b는 각각 피부조직 또는 모낭에서 유래된 케라티노사이트의 형태를 위상차 도립현미경을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 피부조직에서 유래된 섬유아세포의 형태를 위상차 도립현미경을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

도 3a 및 3b는 각각 피부조직 또는 모낭에서 유래된 케라티노사이트의 분화유무를 삼차원 배양피부모델을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 케라티노사이트에서 발현되는 단백질의 패턴을 배양기간에 따라 나타낸 것이다(레인1: 배양 8일째, 레인2: 9일째, 레인3: 10일째, 레인4: 10일 후 동결건조).

도 5는 섬유아세포에서 발현되는 단백질의 패턴을 배양기간에 따라 나타낸 것이다.(레인 1: 혈청, 레인 2 - 5: 배양배지의 단백질 패턴으로 각각 50, 70, 90, 100% 컨플루언시, 레인 6 - 9: 추출 단백질의 단백질 패턴으로 각각 50, 70, 90, 100% 컨플루언시, 레인 10: 마커)

도 6은 케라티노사이트 및 섬유아세포가 동결건조 전과 후에 분비하는 사이토카인의 양을 비교한 것이다.

도 7은 케라티노사이트(a) 또는 섬유아세포(b)가 케라티노사이트의 증식에 미치는 영향을 콜로니 형성실험을 통하여 나타낸 것이다.

도 8은 케라티노사이트 또는 섬유아세포가 섬유아세포의 증식에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이다.

도 9는 케라티노사이트 또는 섬유아세포가 섬유아세포의 콜라젠 생성에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이다.

도 10은 케라티노사이트를 포함한 조성물에서 분비되는 케라티노사이트의 사이토카인의 안정성을 나타낸 그래프이다.

도 11은 케라티노사이트 및 섬유아세포를 함유한 화장용 조성물이 각질 수분 함유량에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 12는 케라티노사이트 및 섬유아세포를 함유한 화장용 조성물이 경피 수분 증발량에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

본 발명은 화장용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로 동결건조된 케라티노사이트와 섬유아세포 중 적어도 어느 하나를 함유하는 화장용 조성물 및 (1) 케라티노사이트 또는 섬유아세포를 배양하는 단계; (2) 상기 배양된 케라티노사이트 또는 섬유아세포를 동결건조시키는 단계 및 (3) 상기 동결건조된 케라티노사이트와 섬유아세포 중 적어도 어느 하나를 화장용으로 허용된 담체에 첨가하는 단계 를 포함하는 상기 화장용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

피부는 표피와 진피로 이루어져 있고 표피층의 바깥층은 죽은 각질세포(corneocyte), 안층은 살아있는 케라티노사이트(keratinocyte)로 이루어져 있다. 세분하면 기저층(basal layer), 유극층(spinous layer), 과립층(granular layer) 및 각질층(cornified layer)의 네층으로 나누어진다. 케라티노사이트는 표피의 90%를 차지하고 나머지는 멜라닌 세포, T 림프구, 특수 마크로파지(macrophage)인 랑거한스 세포(Langerhans cell), 신경전달물질 분비세포인 머켈 세포(Merkel cell) 등이 존재한다. 활발하게 증식하는 케라티노사이트는 표피와 진피 사이의 기저층(basement membrane)에 접한 작은 세포들(즉, 기저세포들)로서, 분화가 시작되면 크기가 커지고 세포질의 형태가 바뀌며 예정된 프로그램에 따라 표피의 윗층으로 이동하면서 사멸한다. 표피층 아래 진피층은 섬유아세포(fibroblast)와 이의 부산물로 이루어지고 진피층의 주요세포군인 섬유아세포는 세포외기질(extracellular matrix) 역할을 하는 콜라젠(collagen)과 엘라스틴(elastin)을 생성한다. 이러한 섬유아세포 생성물은 표피층의 케라티노사이트의 증식에 필수적이다. 피부에는 전술한 표피와 진피 외에도 피부부속기관인 모낭, 땀샘, 피지샘 및 모세혈관이 존재한다. 모낭에는 케라티노사이트가 존재하는데 근접한 섬유아세포와의 상호작용을 통하여 형태발생물질(morphogen)의 발현이 유도되어 털로 분화하게 된다.

1975년 당시 미국 MIT 대학의 Howard Green 박사 실험실에서 배양방법을 개발하면서 인체 케라티노사이트 배양이 시작되었고(Rheinwald and Green, Cell, 1975, vol.6, pp.331-344), 이 방법은 다른 종류의 상피세포에도 적용되었다. 또한, 1979년에 소량의 피부조직으로부터 케라티노사이트를 분리하고 약 2주 배양하여 피부이식에 적합한 시트를 제조하는데 성공함에 따라 케라티노사이트를 배양하여 인체 이식용 배양피부단편(Cultured Epidermal Graft, CEG)을 제조하기 시작하였다. 1984년 Boston의 Shriner's Hospital에서 95% BSA(Burn Surface Area)의 소아에게 성공적으로 이식된 후 현재까지 미국과 유럽에서 임상에 적용되어 왔다(Gallico et al. New England Journal of Medicine, 1984, vol.311, pp.448-451). 그러나 자기유래 배양피부는 피부조직을 채취한 후 배양기간이 3주 이상 걸리므로 바로 상처에 적용할 수 없는 단점이 있었다. 이를 보완하기 위하여 1980년대 후반에는 다른 사람의 피부조직으로부터 유래한(동종유래) 배양피부를 사용하기 시작하였다. 초기에는 동종유래 배양피부도 자기유래와 마찬가지로 이식되어 인체에 존재하며 증식하는 것으로 여겨졌으나, 후에 동종유래 피부는 환부에 남아있는 케라티노사이트를 자극하여 증식과 이동을 촉진하는 상처 치유용 드레싱 재료로 판명되었다.

정확한 작용기작은 밝혀지지 않았으나 케라티노사이트의 탁월한 상처치유 효과는 여러 연구자들에 의해 확인되었다. 이러한 효과는 케라티노사이트로부터 유래하는 사이토카인과 세포외기질(ECM)의 작용에 기인한다는 것이 밝혀졌다. 케라티노사이트에서 분비되는 사이토카인은 면역 및 염증반응에 관여하고 세포 증식 및 이동을 조절하는 역할을 한다. 케라티노사이트가 생성 및 분비하며 상처 치유에 영향을 미치는 사인토카인 및 세포외 기질로는 basic FGF, TGF-α, PDGF, TGF-β, TNF, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, GM-CSF 등이 포함된다(Nowinski et al. Journal of Investigative Dermatology, 2003, vol.122, pp.216-221; Uchi et al. Journal of Dermatological Science, 2000, vol.24, pp.S29-S38; Hashimoto, Journal of Dermatological Science, 2003, vol.24, pp.S46-S50).

이외에도 알려지지 않은 인자들이 복합적으로 분비되어 진피의 섬유아세포를 자극해서 콜라젠 생성을 촉진하여 상처주변과 피부부속기관 등으로부터 상처의 재상피화가 일어날 수 있는 환경을 만들어주는 역할을 한다(Garner, Plastic and Reconstructive Surgery, 1998, vol.102, pp.135-139). 특히, IL-1a의 경우에는 섬유아세포에 작용하여 KGF라는 성장인자의 발현을 촉진시키는데 KGF는 섬유아세포에서 발현되어 케라티노사이트의 증식을 매개하는 대표적인 파라크린 인자(paracrine factor)로 작용한다(Chedid et al. Journal of Biological Chemistry, 1994, vol.269, pp.10753-10757; Mass et al. Journal of Cell Science, 1995, vol.112, pp.1843-1853).

즉, 케라티노사이트에서 분비되는 사이토카인은 직접 상처 치유에 작용할 뿐만 아니라 다른 종류의 피부 세포에서 특정 사이토카인의 분비를 유도함으로써 간접적으로도 상처 치유를 촉진한다(Nowinski et al. Journal of Investigative Dermatology, 2002, vol.119, pp.449-455). 또한 케라티노사이트에서 분비되는 MMP와 같은 효소는 콜라젠 합성과 분해에 관여하여 상처치유 초기 단계에서는 콜라젠 합성을 촉진하고 시간이 경과되면 감소시키는 기전을 통하여 콜라젠 과다 합성으로 인한 비후성 반흔의 생성을 저해하는 작용을 한다(McCawley et al. Current Opinion in Cell Biology, 2001, vol.13, pp.534-540).

이상과 같이 케라티노사이트와 섬유아세포에서 발현 및 분비되는 단백질들의 탁월한 상처 치유 및 피부 재생 효과가 알려지면서 이를 이용하는 다양한 약제학적 조성물 및 화장용 조성물이 개발되어져 왔다.

일본공개특허 JP3068506호는 동물세포, 바람직하게는 사람의 피부, 머리카락 또는 속눈썹의 모간으로부터 추출한 케라티노사이트 또는 섬유아세포를 배양하는 동안 UV, 온도 변화, 자기장, 화학약품, 필수 영양분의 결핍과 같은 스트레스 요인을 제공하고 이에 반응하여 상기 세포가 생산 및 분비하는 물질을 수집하고 화장품으로 허용 가능한 운반체에 포함시켜 제조한 화장용 조성물을 개시하고 있다.

국제공개특허 WO0114527호는 배양된 피부세포에서 생산된 성장 인자를 함유하고 있는 조성물에 관한 것으로 케라티노사이트 및 섬유아세포와 같은 피부세포를 생체외(in vitro) 배양하고 배양 중에 상기 피부세포에서 발현 및 분비되는 사이토카인을 수집하여 약제 또는 화장품에 첨가하는 방법을 개시하고 있다.

그러나 케라티노사이트 또는 섬유아세포에서 발현 및 분비되는 단백질을 이용하는 경우에는 상기 단백질을 배지에서 분리해야 하는 공정을 수반해야한다. 또한, 분리된 단백질 그 자체는 보관하기 어려울 뿐만 아니라 그대로 화장용 조성물 또는 약제학적 조성물에 투입하는 경우에 고유의 생물학적 활성을 잃게 될 수 있기 때문에 이를 방지하기 위한 공정을 또한 거쳐야만 한다.

이에 본 발명자들은 간단한 공정으로 지속적인 피부 재생 효과를 발휘할 수 있는 화장용 조성물을 제공하기 위하여 케라티노사이트 및 섬유아세포 자체를 동결 건조하여 화장용으로 허용된 담체에 혼입시킨 결과 전술한 효과를 달성할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 한 관점으로 동결건조된 케라티노사이트와 섬유아세포 중 적어도 어느 하나를 함유하는 화장용 조성물을 제공한다.

다른 관점으로 (1) 케라티노사이트 또는 섬유아세포를 배양하는 단계; (2) 상기 배양된 케라티노사이트 또는 섬유아세포를 동결건조시키는 단계 및 (3) 상기 동결건조된 케라티노사이트와 섬유아세포 중 적어도 어느 하나를 화장용으로 허용된 담체에 첨가하는 단계를 포함하는 상기 화장용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 화장용 조성물은 피부 재생을 촉진하는 작용을 한다. 상기 "피부 재생"은 피부의 탄력성 증대, 주름 개선, 노화 진행 저해 등을 의미하는 것으로, 본 발명의 화장용 조성물을 피부에 적용하면 케라티노사이트 또는 섬유아세포에서 기 발현된 사이토카인이 방출되어 새로운 케라티노사이트 또는 섬유아세포의 증식을 개시하고 기존 세포의 사멸을 감소시켜서 피부의 탄력성을 증가시키고 주름의 생성을 지연 및 방지하여 노화를 지연시킬 수 있다.

이와 같이 케라티노사이트 또는 섬유아세포에서 생산되어 피부 재생을 촉진하는 사이토카인에는 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor; bFGF), 상피세포 성장인자(epidermal growth factor; EGF), 케라티노사이트 성장인자(keratinocyte growth factor; KGF), 형질전환 성장인자 알파 (transforming growth factor alpha; TGFα), 형질전환 성장인자 베타(transforming growth factor beta-1; TGFβ), 과립구 형성 자극인자(granulocyte colony stimulating factor; GCSF), 인슐린 유사 성장인자(insulin-like growth factor; IGF), 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 종양괴사인자(tumor necrosis factor; TNF), IL-1, IL-6, IL-8, IL-11을 포함한 다수의 인터루킨 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 화장용 조성물의 한 성분인 케라티노사이트는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 사람에서 유래된 것을 사용한다. 상기 케라티노사이트의 기원조직으로는 분화된 피부, 피부 부속기관 또는 배아 간세포(embryonic stem cell)가 적합하다. 기원조직이 피부인 경우에는 포피(foreskin), 겨드랑이, 엉덩이, 유방, 두피, 치골부 또는 음낭으로부터 유래된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 기원조직이 피부 부속기관인 경우에는 모낭, 땀샘, 피지샘 또는 모세혈관에서 유래된 것을 사용하는 것이 적합하다. 모낭은 성숙기(anagen)의 모낭으로부터 유래되고 모낭의 케라티노사이트가 붙어있는 머리카락을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 화장용 조성물에 상기 케라티노사이트는 조성물 전체 중량당 0.01 % 내지 2.0 중량%, 바람직하게는 0.1 % 내지 1.0 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 % 내지 0.2 중량% 양으로 포함된다.

본 발명에 따른 화장용 조성물의 다른 성분인 섬유아세포는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 사람에서 유래된 것을 사용한다. 상기 섬유아 세포는 분화된 피부 조직을 분해(disaggregation)하거나 배아 간세포(embryonic stem cell)를 분화하여 수득할 수 있다. 분해는 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있는데, 그러한 방법에는 물리적 분해 및/또는 소화 효소 및/또는 이웃한 세포와의 연결을 약하게 하는 킬레이팅제의 처리 등이 포함된다. 이러한 방법을 이용하여 세포를 파괴하지 않고 조직을 단일 세포로 분산할 수 있다. 특히, 효소에 의한 분리는 먼저 조직을 분쇄(mincing)한 다음 다수의 소화 효소 중 어느 하나를 단독으로 또는 혼합하여 처리함으로써 용이하게 달성될 수 있다. 적합한 효소의 예에는 트립신, 키모트립신, 콜라게나제, 엘라스타제, 히알루로니다제, DNase, 프로나제 및 디스파제 등이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 물리적인 분해 방법은 그라인더(grinder), 블렌더(blender), 체(sieve), 호모게나이저(homogenizer) 또는 소니케이터(sonicator)를 이용하는 방법이 있다.

본 발명의 화장용 조성물에 상기 섬유아세포는 조성물 전체 중량당 0.01% 내지 5.0 중량%, 바람직하게는 0.05 내지 2.0 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1.0 중량% 양으로 포함된다.

한편, 본 발명에 따른 화장용 조성물은 (1) 케라티노사이트 또는 섬유아세포를 배양하는 단계; (2) 상기 배양된 케라티노사이트 또는 섬유아세포를 동결건조시키는 단계 및 (3) 상기 동결건조된 케라티노사이트와 섬유아세포 중 적어도 어느 하나를 화장용으로 허용된 담체에 첨가하여 제조할 수 있다.

케라티노사이트 또는 섬유아세포는 통상적인 동물 세포 배양용 배지에서 배양함으로써 증식할 수 있다. 그러한 배지는 당업계에 공지된 성분 및 조성에 따라 제조하거나 상업적으로 입수할 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지에는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM); Minimal Essential Medium(MEM); M199; RPMI 1640; Iscove's Modified Dulbecco's Medium(EDMEM), MCDB, Ham's F-12, Ham's F-10, NCTC 109, NCTC 135, Keratinocyte-Serum Free Medium (keratinocyte-SFM), Keratinocyte Growth Medium (KGM) 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 케라티노사이트의 배양에는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), Ham's F-12 또는 이들의 혼합물을, 섬유아세포의 배양에는 Ham's F-12 또는 DMEM을 이용하는 것이 바람직하다.

상기 배지는 소 태아 혈청(fetal bovine serum), 소 혈청(bovine serum), 트리요오도타이로닌(triiodothyronine, T3), 인슐린(insulin), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 글루타민(glutamine), 아데닌(adenin), 트랜스페린(transferrin), 겐타마이신(Gentamycin) 및 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)과 같은 항생제 등을 추가로 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 케라티노사이트 또는 섬유아세포는 실온에서의 안정성을 증가시키고 값비싼 저온 저장의 필요성을 줄이며, 저장 수명을 연장하기 위해 동결건조시키는 것이 바람직하다. 동결건조 공정은 동결, 일차 건조 및 이차 건조의 연속 단계로 이루어질 수 있다. 조성물을 동결시킨 후의 일차 건조 단계는 압력을 강하하고 수증기의 승화를 위해 가열하는 것이다. 이차 건조 단계는 일차 건조물로부터 흡수된 잔여 수분을 증발시키는 것이다.

케라티노사이트 또는 섬유아세포는 상업적으로 입수할 수 있는 동결건조기를 이용하여 당업계에 공지된 동결건조 방법에 따라 동결건조할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면 Janoff 등의 미국특허 제4,880,835호에 개시되어 있다. 동결건조에 앞서 세포가 녹아있는 용액에 동결건조 보호제를 첨가할 수 있다. 동결건조 보호제는 세포 및 생물학적 분자를 보호하여 그 크기 및 형태가 건조 및 해동 공정 동안 일정하게 유지되도록 해준다. 이용 가능한 동결건조 보호제는 덱스트로스, 수크로오스, 말토스, 만노스, 갈락토오스, 라피노오스, 트레할로즈, 락토오스 및 트리오스를 포함한 사카라이드이다. 이들은 상기 세포가 용해된 용액에 5 내지 20 중량%로 바람직하게는 약 10중량%로 첨가되는 것이 바람직하다. 또한, 동결건조 공정 이전에 세포가 녹아있는 용액에 부형제를 첨가할 수도 있다. 부형제로는 이들로 제한되는 것은 아니지만 약 0.9% NaCl 및 약 10mM 인산나트륨(pH7.0M) 또는 약 10mM 나트륨 시트레이트(pH 7.0)의 완충액이 포함된다.

한 양태로서, 본 발명에서 케라티노사이트 또는 섬유아세포의 동결건조 방법은 다음의 순서와 같다: (1) 적합한 용기에 세포를 넣고 완충용액으로 부유한 후 초저온 냉동고에 넣어 -70 내지 -80℃에서 약 12시간 이상 냉동시킨다; (2) 동결건조기의 샘플 컨테이너에 용기를 넣고 샘플 컨테이너의 압력이 약 1x10^-3 torr가 될 때까지 천천히 압력을 내린다; (3) 동결건조기 챔버 온도는 약 -50℃를 유지하며 샘플 컨테이너 압력을 약 2x10^-4 torr로 조절하고 약 12시간 이상 상기 온도와 압력을 유지하면서 건조를 완료한다; (4) 동결건조기에서 용기를 꺼낸 다음 마개로 밀 봉하여 2 내지 8℃에 저장한다.

이렇게 동결건조된 케라티노사이트와 섬유아세포 중 적어도 어느 하나는 화장용으로 허용된 담체에 첨가되어 본 발명에 따른 화장용 조성물로 제공될 수 있다. 상기 화장용 조성물에 케라티노사이트와 섬유아세포 중 적어도 어느 하나는 동결건조된 자체로 포함되거나, 당업계에서 통상적으로 이용되는 기술에 따라 마이크로캡슐, 미립자 또는 지질 소포체로 가공되어 포함될 수도 있다. 또한, 화장용으로 허용된 담체와 혼합하기 보다는 물리적으로 분리된(즉, 별도의 용기에 보관된) 형태로 제공해서 임의의 화장용 조성물을 피부에 도포하기 전에 혼합하여 사용하도록 제형화할 수도 있다.

본 발명에 따른 화장용 조성물은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 일반적인 화장용 조성물의 제형(예를 들면 화장수, 로션, 크림, 젤 등)으로 제형화할 수 있다. 목적한 제형에 따라 이용할 수 있는 담체의 종류와 농도는 다양하지만 당업자라면 용이하게 결정할 수 있다.

"화장용으로 허용된 담체(cosmetically acceptable carrier)"는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제(thickening agent), 항산화제, 점도 안정화제(viscosity stabilizer), 킬레이팅제, 완충제, 방부제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 필요에 따라 미백제, 보습제, 항염증제, 항박테리아제, 항진균제, 비타민, 자외선 차단제, 항생제, 여드름 방지제, 향수, 염료가 포함될 수도 있으며, 이들은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 양으로 본 발명에 따른 화장용 조성물에 포함될 수 있다. 조성물 총 중량 당 0.01 내지 20중량%가 적합하다.

구체적으로 상기 오일로서 수소화 식물성유, 파마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다. 지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸 도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트가 이용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

계면 활성제의 예에는 소듐 스테아레이트, 소듐 세틸설페이트, 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르 포스페이트, 소듐 N-아실 글루타메이트와 같은 음이온 계면활성제; 스테아릴디메틸벤질암모늄 클로라이드 및 스테아릴트리메틸암모늄 클로라이드와 같은 양이온 계면활성제; 알킬아미노에틸글리신 하이드로클로라이드 및 레시틴과 같은 양성 계면활성제; 글리세린 모노스테아레이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 수크로오스 지방산 에스테르, 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 올레일에테르, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 코코넛 지방산 모노에탄올아르니드(monoethanolarnide), 폴리옥시프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 캐스터유, 폴리옥시에틸렌 라놀린과 같은 비이온성 계면활성제 등이 포함된다.

흡습제에는 글리세린, 1,3-부틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜이 이용될 수 있 으며 저급 알콜로는 에탄올, 이소프로판올이 이용 가능하다. 증점제의 예에는 알긴산 나트륨, 카제인산 나트륨, 젤라틴 한천, 크산탄 고무, 전분, 셀룰로오스 에테르(예, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 하이드록시 프로필메틸 셀룰로오스), 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 항산화제로는 부틸레이티드 하이드록시톨루엔, 부틸레이티드 하이드록시아니솔, 프로필 갈레이트, 시트르산, 에톡시퀸(ethoxyquin)이 이용 가능하고, 킬레이팅제로는 디소듐 에데테이트, 에탄하이드록시 디포스페이트가 이용 가능하며, 완충제로는 시트르산, 소듐 시트레이트, 붕산, 보랙스(borax), 디소듐 하이드로젠 포스페이트가 이용 가능하고 방부제로는 메틸 파라하이드록시벤조에이트, 에틸 파라하이드록시벤조에이트, 디하이드로아세트산, 살리실산, 벤조산이 이용 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

피부 또는 모낭으로부터 유래한 케라티노사이트/섬유아세포의 배양

(a) 케라티노사이트의 배양

피부 또는 모낭으로부터 유래한 케라티노사이트는 감마선 조사된 3T3 피더(feeder)와 Dulbecco's modified Eagle medium과 Ham-F12를 3:1로 혼합하여 만든 배지를 사용하여 배양하였다. 약 1cm² 크기의 피부조직을 트립신으로 처리하여 단일세포화한 후 약 백만개의 피부세포를 수득하여 계대 배양하였고, 모낭의 경우는 20여개의 머리카락의 외근부(Outer Root Sheath: ORS)를 조직 배양하여 7일 후 만개 이상의 케라티노사이트를 수득하였다. 이 때 접종 2일 및 5일 경과 후에 케라티노사이트의 세포성장형태를 위상차 도립현미경을 사용하여 100배의 배율로 관찰하였다(도 1a 및 b).

도 1a 및 b에 나타낸 바와 같이 케라티노사이트가 콜로니를 형성하며 성장하는 형태는 케라티노사이트가 유래한 조직과 관계없이 유사하였다.

(b) 섬유아세포의 배양

섬유아세포는 피부조직을 단일세포화한 후 피더 없이 Ham-F12를 바탕으로 하는 배양액을 사용하는 방법으로 162cm² 면적의 배양용기에 5 × 10⁵개의 밀도로 접종하여 37℃, 10% CO₂의 조건에서 배양하였다. 이 조건을 사용하여 피부조직에 존재하는 세포 중 섬유아세포를 선택적으로 배양하였다. 7일 후 선택적으로 배양한 섬유아세포를 트립신:EDTA로 단일세포화하여 계대배양하였다. 전술한 실시예 1의 (a)와 마찬가지로 접종 2일 후 및 5일 후에 위상차 도립현미경을 사용하여 100배의 배율로 세포성장형태를 관찰하였다(도 2).

도 2에 나타낸 바와 같이 접종 5일 후 세포는 섬유아세포의 방사형 형태를 유지하면서 성장하여 100% 콘플루언시에 도달하였고 이 시점에서 배양용기로부터 4~5 × 10⁶개의 섬유아세포를 수득하였다.

(c) 케라티노사이트 및 섬유아세포의 동결건조

실시예 1의 (a) 및 (b)에서 수득한 세포를 배양하여 90%의 컨플루언시(confluency)에 도달하였을 때 트립신:EDTA를 사용하여 단일 세포화하여 케라티노사이트 및 섬유아세포를 수득하였다.

이렇게 수득한 세포를 50ml 튜브에 넣고 약 5ml의 인산완충용액으로 분산시키고 상기 튜브를 초저온 냉동고에 넣고 -75℃에서 약 12시간 이상 완전 냉동시켰다. 미리 가동된 동결건조기의 샘플 컨테이너에 튜브를 넣고 샘플 컨테이너의 압력이 1x10^-3 torr가 될 때까지 천천히 압력을 내렸다. 동결건조기 챔버 온도는 약 -50℃를 유지하며 샘플 컨테이너 압력을 2x10^-4 torr로 조절하였다. 이러한 온도와 압력을 12시간 이상 유지하여 건조를 완성하였다. 동결건조기에서 튜브을 꺼낸 다음 마개로 밀봉하여 2 내지 8℃에 저장하였다.

동결건조된 세포는 PBS 또는 화장용 조성물에 포함시켜서 하기 실시예에 따른 세포증식정도 분석, ELISA 분석, 단백질 패턴 및 함유량 분석 등에 사용하였다.

<실시예 2>

케라티노사이트의 분화능력 비교

실시예 1의 (b)로부터 얻은 섬유아세포를 포함한 콜라젠 층 위에 실시예 1의 (a)로부터 얻은 케라티노사이트를 접종하여 실시예 1과 같은 배지를 사용하여 37℃, 10% CO₂, 80-100% 습도의 조건으로 5일간 배양한 후 공기 중에 노출시키는 방법으로 피부조직 유래 케라티노사이트 및 모낭 유래 케라티노사이트의 분화를 유도하였다. 즉, 배양액에 잠긴 상태로 콜라젠 층 위에서 100% 콘플루언시에 도달한 케라티노사이트를 공기 중으로 띄우기 위하여 흡수력이 강한 면 패드(cotton pad)를 콜라젠 층 밑에 깔아주어 배지의 수위가 종이와 일치하게 하였다. 이러한 상태로 3주 동안 배양 및 분화된 피부모델을 10% 포르말린으로 고정하고 파라핀 조직을 만든 다음 박절하여 H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색을 하였다(도 3a 및 b).

도 3a 및 b에 나타낸 바와 같이 실시예 1에서 수득한 케라티노사이트는 유래한 조직과 무관하게 기저층, 유극층, 과립층, 각질층을 형성하며 정상적으로 분화하는 것을 확인하였다.

<실시예 3>

케라티노사이트의 배양기간에 따른 단백질 발현패턴 비교

케라티노사이트 0.2 × 10⁶개를 피더 위에 접종하여 8일, 9일, 10일동안 배양하였고 10일 동안 배양한 세포의 일부는 동결건조하였다. 세포는 트립신:EDTA를 사용하여 단일세포화 하였고 이러한 단일세포 부유액을 용해용 완충용액(lysis buffer)으로 처리하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 SDS(Sodium Dodecyl Sulphate)를 포함한 샘플 완충용액(sample buffer)에 부유하여 끓인 후 10% SDS-PAGE에 걸어 크기에 따라 분리한 다음 코마시 블루(Coommassie blue) 염색을 하여 육안으로 평가하였다(도 4).

도 4에 나타낸 바와 같이 케라티노사이트의 단백질 발현 패턴과 총 발현양은 배양기간에 관계없이 일정하였고 동결건조 전 · 후(레인 3 및 4)를 비교하였을 때에도 차이가 나타나지 않았다. 이로부터 동결건조는 세포의 단백질 발현 및 분비에 영향을 미치지 않음을 알 수 있다.

<실시예 4>

섬유아세포의 배양기간에 따른 단백질 발현패턴 비교

피부유래 섬유아세포를 배양하여 전술한 실시예 3에서와 같이 세포를 분리하고 단백질을 추출하고 SDS-PAGE를 이용하여 단백질 발현 패턴을 분석하였다(도 5의 레인 2 내지 6). 상기 섬유아세포의 컨플루언시가 50%, 70%, 90%, 100%에 도달하였을 때 배양배지 일부를 수집하여 SDS-PAGE를 이용하여 단백질 발현 패턴을 분석 하였다.(도 5의 레인 6 내지 9).

도 5에 나타낸 바와 같이 추출된 단백질의 패턴은 시간에 관계없이 일정하였으나 분비된 단백질의 패턴을 분석하기 위한 배양배지의 단백질 패턴과는 상이하였다. 또한 두 경우 모두 케라티노사이트에서 분비되는 단백질과는 다른 패턴을 나타내었다. 배양배지의 단백질 패턴은 10% 혈청만을 분석한 결과(도 5의 레인 1)와 비슷한 패턴을 보이는 것으로부터 알 수 있듯이 단백질 패턴의 변화를 측정하는 것이 어려웠으나 컨플루언시가 증가함에 따라 분자량 120-200kD 사이에서 밴드(2줄)가 굵어지는 것을 볼 수 있었다. 이는 콜라젠의 단백질 질량과 유사하므로 콜라젠으로 추측된다. 반면 배지에 포함된 혈청이 배제된 추출된 단백질의 패턴은 컨플루언시가 증가함에 따라 콜라젠을 포함한 모든 단백질의 양이 증가함을 알 수 있었다.

<실시예 5>

케라티노사이트와 섬유아세포에서 분비되는 사이토카인 양 비교

동결건조 전 및 후의 케라티노사이트와 섬유아세포에서 분비되는 사이토카인의 양을 ELISA 방법으로 분석하였다. 구체적으로 R&D System의 Quantikine Immunoassay Kit를 사용하여 세포에서 분비되는 IL-1α, bFGF, TGF-β, PDGF의 양을 측정하였다(도 6).

도 6에 나타낸 바와 같이 동결건조는 사이토카인들의 분비에 영향을 미치지 않기 때문에 동결건조 전의 살아있는 세포와 비교했을 때 동결건조로 사멸한 세포도 유사한 양의 사이토카인을 분비하는 것을 알 수 있었다.

<실시예 6>

케라티노사이트의 콜로니 형성능력 비교

일차 배양한 케라티노사이트인 TG004를 3T3 피더 위에 약 100개 접종하여 12일간 배양하였다. 상기 케라티노사이트 배양액에 동결건조한 케라티노사이트 또는 섬유아세포를 0.5 × 10⁶/ml의 농도로 부유하여 배양배지로 사용하였다. 배양이 끝난 다음 10% 포르말린 용액을 첨가하여 고정하고 로다민 블루(Rhodamine blue) 용액으로 염색하였다. 콜로니 형성능력(Colony Forming Efficiency; CFE)은 접종한 세포수 대비 콜로니 형성수의 비율로 정의하였다.

［수학식 1］

콜로니 형성능력(CFE)% = 콜로니 형성수/접종한 세포수 × 100

도 7에 나타낸 바와 같이 동결건조한 세포가 배제된 배양액을 사용한 경우(대조군) 세포의 콜로니 형성능력은 35%였고, 케라티노사이트 또는 섬유아세포를 함유한 배양액을 사용한 경우는 각각 46% 및 44%로 콜로니 형성능력을 보였다. 특 히, 콜로니 크기는 직경 3.2mm에서 각각 8.3mm와 7.9mm로 증가하였다. 이로부터 케라티노사이트 또는 섬유아세포가 함유된 배양액은 케라티노사이트의 증식과 이동에 필요한 사이토카인을 분비하여 콜로니 수와 크기의 증가를 유도함을 알 수 있었다.

<실시예 7>

섬유아세포의 증식능력 비교

24-구판(well plate)에 0.5 × 10⁵개의 섬유아세포를 10% 소태아혈청을 함유한 DMEM을 사용하여 배양하였다. 24시간 후 5%의 소태아혈청을 함유한 DMEM으로 교체하면서 배양액에 0.5 × 10⁵/ml의 농도로 동결건조한 케라티노사이트 또는 섬유아세포를 부유하였다. 계속해서 24시간 동안 배양한 후 섬유아세포의 증식률은 MTT(tetrazolium salt 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 방법으로 측정하였다. 구체적으로 세포가 성장하고 있는 판에 MTT 용액(5mg/ml in PBS)을 첨가하여 37℃의 가습 조건에서 4시간동안 반응시켰다. 배양액을 제거한 후 10% SDS와 pH4.7의 45% dimethyl foramide로 구성된 용해용(lysis) 용액을 첨가한 후 12-24시간 반응시켰다. 탈수소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolioum을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT Formazon(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)으로 환원시키는 미토콘 드리아의 능력, 즉 세포의 증식률을 590nm에서 흡광도를 측정하여 판단하였다(도 8).

도 8에서 보는 바와 같이 케라티노사이트 또는 섬유아세포를 함유한 배양액을 사용하여 섬유아세포를 배양한 경우 증식률이 21-30%의 증가를 보였다. 따라서 케라티노사이트 또는 섬유아세포가 실시예 6에서와 같이 케라티노사이트의 증식뿐 아니라 섬유아세포의 증식도 촉진시킴을 알 수 있다.

<실시예 8>

섬유아세포의 콜라젠 생성능력 비교

화장용 조성물에 함유된 케라티노사이트 또는 섬유아세포가 지시세포인 섬유아세포가 발현하는 세포외 기질 중의 하나인 콜라젠을 측정함으로써 피부 재생을 촉진시킬 수 있는지 여부를 평가하였다. 전술한 실시예 7과 동일한 조건으로 배양하고 배양하면서 수집한 조정배지(conditioned medium) 500㎕와 1ml의 시리우스 레드(Sirius Red) 염색시약을 혼합한 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다(도 9).

도 9에 나타낸 바와 같이 케라티노사이트 또는 섬유아세포가 함유되지 않은 배양액(대조군)을 사용하여 배양한 경우와 비교하여 케라티노사이트 또는 섬유아세포를 함유한 배양액을 사용하였을 때 각각 35.4% 와 25.6%의 콜라젠 생성 증가를 보였다.

<실시예 9>

케라티노사이트 및 섬유아세포를 함유하는 조성물의 안정성

케라티노사이트에서 분비되는 인자 중의 하나인 IL-1α의 양을 실시예 5에서와 같이 측정함으로써 시간 경과에 따라 조성물 내의 케라티노사이트가 안정적으로 단백질을 분비하여 피부재생 효능을 나타낼 수 있는지 여부를 평가하였다. 이는 세포가 함유된 조성물의 효능이 유지되는 기간을 판단할 수 있는 기준을 제공할 수 있다(도 10).

도 10에서와 같이 케라티노사이트가 함유된 조성물에서 IL-1α의 분비량은 8주가 경과한 시점에서도 제조시 분비량의 70% 이상을 보이며 안정적으로 유지되었다.

<실시예 10>

케라티노사이트 및 섬유아세포를 함유한 화장용 조성물의 제조

본 발명에 따른 화장용 조성물을 사람의 피부에 직접 적용하고 제형내에 포함된 세포에서 분비되는 사이토카인의 활성 및 안정성을 확인하기 위해서 앞서 수득한 동결건조된 케라티노사이트 및 섬유아세포를 함유하는 에센스로 제형화하였다.

［표 1］

케라티노사이트 및 섬유아세포를 함유한 화장용 조성물

성분 그룹	성분 번호	성분	조성물(A)의 성분비	조성물(B)의 성분비
A	1	정제수	전체량이 100g이 되도록 첨가	전체량이 100g이 되도록 첨가
	2	1,3 베타 글루칸	5.0	5.0
	3	펜틸렌 글리콜	3.0	3.0
	4	소듐 히아루론산	0.15	0.15
	5	구연산	1.44	1.44
	6	글리세린	3.0	3.0
B	7	카보머	0.14	0.14
C	8	에탄올	3.0	3.0
	9	피오이 60 경화 피마자유	0.5	0.5
	10	메틸파라벤	0.1	0.1
D	11	소듐하이드록시드	1.0	1.0
E	12	동결건조된 케라티노사이트 및 섬유아세포	0	0.2

용기에 상기 표의 성분들 중에서 A 그룹의 성분들을 투입하고 믹서를 이용하여 혼합해서 수용액 상을 만든 다음 B 그룹의 성분들을 상기 수용액 상에 천천히 투입하여 충분히 교반시켜 균질하게 하였다. C 그룹의 성분들은 별도의 용기에 약간 가온(50도)하여 균질화시킨 후에 상기 A 및 B 그룹 성분들의 혼합액에 천천히 투입하면서 교반하여 미셀 형성하였다. 그 다음성분 D를 가하여 중화시켜 점도를 부여하고 조성물(B)의 경우에는 E 성분을 첨가하여 점액상의 에센스 화장품을 제조하였다.

<실시예 11>

케라티노사이트와 섬유아세포를 포함한 화장품 조성물의 피부재생실험

아토피 피부염을 갖고 있는 자원자를 대상으로 상기 실시예 10에서 제조된 조성물(A) 또는 조성물(B)를 4주간 도포하여 피부가 얼마나 빨리 재생되는지를 각질층 수분 보유량 및 경피 피부 수분량을 측정함으로써 확인하였다.

경증 이상의(즉, 심한 아토피가 아닌 경미한 아토피가 피부 전체에 골고루 퍼져있는) 아토피 환자로 진단된 지원자(이하, 피험자라고 한다) 30명을 선정하였다. 본 발명에 따른 화장품용 조성물을 도포하기에 앞서 피험자의 피부를 사진 촬영하고 각질 수분량(Skin hydration) 및 피부 수분 손실량(TEWL)을 측정하였으며, 피부의 외견상 증상을 기록하였다. 이러한 결과로부터 각 피험자에게서 수분 손실량 및 피부 수분량이 오차 범위 내에서 유사한 값을 갖는 2 부위(이하, 측정 부위라고 한다)를 선정하였다. 그 다음 피험자가 직접 1일 2회(아침 및 저녁) 조성물(A) 또는 조성물(B)를 측정 부위에 적용하였다.

각질층 수분보유량 및 경피수분 증발량은 6주 동안(도포 전, 1주, 2주, 4주, 6주 (총 5회 측정) 주 1회씩 측정하였다. 측정하기 전에 측정 부위를 자극 없게 세정(cleansing)한 후에 항온 항습실(20℃, 습도 50%)에서 30분 이상 적응시킨 후 측정하였다.

(a) 각질층 수분보유량 측정

측정 부위의 각질층내 수분 함유량은 수분 측정기(corneometer, C&K)를 이용하여 측정(단위: corneometer units)하였고 측정값은 하기 표 2 및 도 11에 나타내었다.

［표 2］

각질층 수분 보유량에 대한 결과

	조성물(A)		조성물(B)
방문	평균	표준편차	평균	표준편차
0주	31.21	14.71	44.67	11.59
1주	38.58	15.36	49.96	17.28
2주	37.19	17.40	49.30	13.37
4주	36.61	14.76	47.51	16.33
6주	38.54	11.99	49.04	15.71

조성물 간의 각질층 수분 함유량을 살펴보면 조성물(A)보다 조성물(B)를 적용한 측정 부위의 수분 함유량이 높은 것을 확인할 수 있다. 각각을 살펴보면 수분 함유량은 시간이 경과함에 따라 증가하는 것을 알 수 있었다.반복측정 분석 결과 조성물(A)와 조성물(B) 간에는 유의한 각질층 수분함유량에 차이가 있었으나(p값 = 0.011), 각 조성물내 시점 간에는 유의한 차이가 나타나지 않았다(p값 = 0.09664). 통계적으로 유의하지는 않지만 수분 함유량이 0주에 비해 시간에 따라 높아지며 6주의 수분 함유량은 0주에 비해 약 23.5% 정도 증가하였다.

(b) 경피 수분 증발량 측정

측정 부위의 경피 수분 증발량은 수분 증발량 측정기(tewameter)를 이용하여 측정(단위: g/m²/h)하였고 측정값은 하기 표 3 및 도 12에 나타내었다.

［표 3］

경피 수분 증발량에 대한 결과

	조성물(A)		조성물(B)
방문	평균	표준편차	평균	표준편차
0주	21.16	13.69	8.14	10.60
1주	25.09	18.74	10.17	7.18
2주	24.56	19.35	7.75	5.61
4주	20.43	15.42	6.13	4.99
6주	18.32	13.65	6.91	4.01

조성물 간의 경피 수분 증발량을 살펴보면 조성물(A)가 조성물(B)보다 수분 증발량이 높은 것을 확인할 수 있었다. 조성물(B)의 경우 0주에 8.14에서 1주에 높아졌다가 2주부터 약간씩 떨어지는 것을 알 수 있다. 조성물(A)의 경우 수분 증발량은 0주에 21.16에서 1주에는 25.09로 증가하였다가 이후부터는 갈수록 수분 증발량이 떨어지는 것을 알 수 있다.

반복측정 분석 결과 조성물(A)와 조성물(B) 간에는 유의한 경피 수분증발량에 차이가 있었으나(p값 = 0.0055), 각 조성물내 시점 간에는 유의한 차이가 나타나지 않았다(p값 = 0.4373). 통계적으로 유의하지는 않지만 0주의 수분 증발량에 비해 6주의 수분증발량은 약 13.4%정도 감소하였다.

상기 실시예를 통하여 동결건조된 케라티노사이트 및 섬유아세포는 화장품용 담체에 포함된 형태로도 신속한 피부 재생을 유도할 수 있음을 확인하였다.

동결건조된 케라티노사이트 중 섬유아세포 어느 하나를 함유한 화장용 조성물은 장시간에 걸쳐서 기 발현된 사이토카인을 분비함에 따라 피부에 적용하였을 때 지속적인 피부재생 효과를 발휘할 수 있다.

Claims

동결건조된 케라티노사이트 및 섬유아세포 중 적어도 어느 하나를 포함하는 화장용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 케라티노사이트 및 섬유아세포는 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF), 상피세포 성장인자(EGF), 케라티노사이트 성장인자(KGF), 형질전환 성장인자 알파(TGFα), 형질전환 성장인자 베타(TGFβ), 과립구 형성 자극인자(GCSF), 인슐린 유사 성장인자(IGF), 혈관내피 성장인자(VEGF), 종양괴사인자(TNF) 및 인터류킨으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사이토카인을 분비하는 것을 특징으로 하는 화장용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 케라티노사이트는 화장용 조성물 전체 중량당 0.01 내지 2.0 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 케라티노사이트는 분화된 피부, 피부 부속기관 또는 배아 간세포로부터 유래된 것을 특징으로 하는 화장용 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 피부는 포피, 겨드랑이, 엉덩이, 유방, 두피, 치골부 및 음낭으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화장용 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 피부 부속기관은 모낭, 땀샘, 피지샘 및 모세혈관으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화장용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 섬유아세포는 화장용 조성물 전체 중량당 0.01 내지 5.0 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 섬유아세포는 분화된 피부 또는 배아 간세포에서 유래된 것을 특징으로 하는 화장용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 화장용 조성물은 화장수, 로션, 크림 또는 젤로 제형화된 것을 특징으로 하는 화장용 조성물.
(1) 케라티노사이트 또는 섬유아세포를 배양하는 단계; (2) 상기 배양된 케라티노사이트 또는 섬유아세포를 동결건조시키는 단계 및 (3) 상기 동결건조된 케라티노사이트와 섬유아세포 중 적어도 어느 하나를 화장용으로 허용된 담체에 첨가하는 단계를 포함하는 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 화장용 조성물의 제조방법.