KR20210045715A

KR20210045715A - 성장인자 복합체를 포함하는 레이저 치료 후 피부 재생용 조성물

Info

Publication number: KR20210045715A
Application number: KR1020190129093A
Authority: KR
Inventors: 신항철; 노영우
Original assignee: 텐텍 주식회사
Priority date: 2019-10-17
Filing date: 2019-10-17
Publication date: 2021-04-27
Also published as: KR102257532B1

Abstract

본 발명은 EGF (epidermal growth factor), bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor), IGF-1 (Insulin-like growth factor 1), 및 KGF (keratinocyte growth factor) 를 유효성분으로 포함하는 성장인자 복합체를 포함하는, 피부 재생용 화장료 조성물, 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 EGF (epidermal growth factor), bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor), IGF-1 (Insulin-like growth factor 1), 및 KGF (keratinocyte growth factor) 를 포함하는 성장인자 복합체는 피부 세포의 재생을 촉진하고 피부 박피술과 같은 시술 후 유발될 수 있는 피부 자극을 완화할 수 있으므로, 피부 재생이 필요한 다양한 미용, 의료 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

성장인자 복합체를 포함하는 레이저 치료 후 피부 재생용 조성물 {Composition for skin regeneration after laser treatment comprising growth factor complex}

본 발명은 EGF (epidermal growth factor), bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor), IGF-1 (Insulin-like growth factor 1), 및 KGF (keratinocyte growth factor) 를 유효성분으로 포함하는 성장인자 복합체를 포함하는, 피부 재생용 화장료 조성물, 약학적 조성물에 관한 것이다.

피부는 체내의 근육들과 기관을 보호하는 다수의 상피 조직으로 이루어진 외피체계에서 가장 큰 조직이며 몸의 가장 바깥쪽에 위치하여 외부환경을 접할 때에 병원균으로부터 신체를 보호하고, 단열과 체온조절기능, 감각기능, 비타민D의 합성과 비타민B 엽산염의 보호 기능을 수행한다.

피부는 중층 편평 상피인 표피와 촘촘한 결합 조직인 진피(眞皮), 느슨한 결합조직인 피하지방층으로 이루어진다. 표피층은 피부의 가장 바깥쪽에 위치하고 신체의 표면을 덮는 방수, 보호 막을 만들며 층상의 비늘 상피세포와 그 밑의 기저층으로 이루어진다. 표피에는 혈관이 없고, 중추신경계와 관련되어 미약하게나 신경이 존재한다. 표피를 만드는 주된 세포들의 종류로 각질형성세포, 멜라닌세포, 랑게르한스세포, 메르켈 세포가 존재한다. 진피(dermis)는 연결조직으로 이루어진 표피 밑의 피부 층으로 완충작용을 하여 신체를 압력과 장력으로부터 보호한다. 진피는 기저막을 통해 표피와 단단히 연결되어 표피를 지지하고 영양분을 공급하며, 접촉과 열을 감지하는 복수의 신경 말단을 담고 있다.

한편 외부로부터 받는 과도한 물리적, 화학적 자극 및 스트레스, 영양결핍 등은 피부의 정상기능을 저하시키고 탄력손실, 각질화, 주름생성 등의 피부 노화현상을 촉진시키게 된다. 이러한 현상을 방지하고 보다 건강하고 탄력있는 피부를 유지하기 위하여 종래 각종 동물, 식물, 미생물 등으로부터 얻은 생리활성물질들이 강화된 화장품을 사용함으로써 피부의 고유기능을 유지시키고 피부세포를 활성화시켜 피부노화를 효과적으로 억제하고 피부 재생을 촉진시키기 위한 노력이 계속되고 있다.

최근에는 피부 재생, 상처 치료와 같은 미용이나 질환 치료 목적으로 레이저 치료나 박피술 등이 성행되고 있다. 박피술은 외상, 자외선 및 환경변화에 의한 노화 등에 의해 손상된 상피와 진피의 일부를 제거함으로써 새로운 피부가 재생되게 하여 흉터 또는 주름을 제거하는 방법으로 기계적 박피술(dermabrasion)과 화학적 박피술(chemical peel)이 이용되어 있고, 기계적 박피술 중 이산화탄소 레이져를 이용하는 박피술이 1960년 이후 시행되고 있다. 최근에는 초단파와 극초단파 이산화탄소 레이져가 도입되어 많은 양의 에너지를 목표 조직에 짧은 시간 조사함으로써 주위 조직에 최소한의 열 손상 입히고, 이를 통해 목표 조직의 반흔과 주름 제거를 하기 위한 목적으로 많이 사용되고 있다. 이러한 레이저 치료나 박피술 이후에는 염증 반응 없이 피부재생을 유도하도록 하는 것이 중요하며, 이를 위해 피부 재생 및 항염 작용을 나타내는 화장품이 다양하게 개발되고 있다.

그러나, 이러한 기존의 화장품 원료들은 대부분 그 효능이 미진하거나 피부 부작용을 유발하는 등 여러 가지 문제점을 가지고 있으며, 인간에게 안전하면서 피부 재생 효과를 극대화할 수 있는 새로운 물질에 대한 필요성이 있다.

본 발명자는 세포 독성을 나타내지 않으면서 피부 재생 효과를 나타내는 물질에 대하여 연구하던 중, EGF (epidermal growth factor), bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor), IGF-1 (Insulin-like growth factor 1), 및 KGF (keratinocyte growth factor) 를 포함하는 성장인자 복합체가 피부 세포의 재생을 촉진하고 특히 레이저를 이용한 피부 박피술 이후의 피부 자극 완화와 재생을 촉진하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 EGF (epidermal growth factor), bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor), IGF-1 (Insulin-like growth factor 1), 및 KGF (keratinocyte growth factor) 를 포함하는, 피부 재생용 화장료 조성물 및 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 EGF (epidermal growth factor), bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor), IGF-1 (Insulin-like growth factor 1), 및 KGF (keratinocyte growth factor) 를 포함하는, 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 EGF (epidermal growth factor), bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor), IGF-1 (Insulin-like growth factor 1), 및 KGF (keratinocyte growth factor) 를 포함하는, 피부 재생용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 EGF (epidermal growth factor), bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor), IGF-1 (Insulin-like growth factor 1), 및 KGF (keratinocyte growth factor) 를 포함하는 성장인자 복합체는 피부 세포의 재생을 촉진하고 피부 박피술과 같은 시술 후 유발될 수 있는 피부 자극을 완화할 수 있으므로, 피부 재생이 필요한 다양한 미용, 의료 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 EGF (epidermal growth factor), bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor), IGF-1 (Insulin-like growth factor 1), 및 KGF (keratinocyte growth factor) 를 포함하는 성장인자 복합체 (Growth factor complex, GF complex) 및 양성 대조군 EGF 처리에 따른 인간 피부 섬유아 세포주 NHDF의 세포 생존율을 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*P < 0.05)
도 2는 성장인자 복합체 (GF complex) 농도에 따른 상처 재생 효과를 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 성장인자 복합체 (GF complex) 농도에 따른 상처 재생 효과를 image J 프로그램을 통해 정량화한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 성장인자 복합체 (GF complex) 처리 농도에 따른 세포외기질 MMP-1, MMP-2, COLA1A, 엘라스틴, HAS3 의 mRNA 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다. (*P < 0.05, ** <0.001)
도 5는 성장인자 복합체 (GF complex) 처리 농도에 따른 콜라겐 I, 엘라스틴, MMP-3 의 단백질 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 성장인자 복합체 (GF complex) 처리 농도에 따른 콜라겐 I, 엘라스틴, MMP-3 의 단백질 발현을 image J 프로그램을 사용하여 정량화한 결과를 나타낸 도이다.
도 7 은 성장인자 복합체 (GF complex) 처리에 의한 피부 재생 간이 임상 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 EGF (epidermal growth factor), bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor), IGF-1 (Insulin-like growth factor 1), 및 KGF (keratinocyte growth factor) 를 포함하는, 피부 재생용 화장료 조성물 및 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 EGF (epidermal growth factor), bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor), IGF-1 (Insulin-like growth factor 1), 및 KGF (keratinocyte growth factor) 를 포함하는 성장인자 복합체는 인체에 독성이 없으며, 피부 세포의 재생을 촉진하고 피부 박피술과 같은 시술 후 유발될 수 있는 피부 자극을 완화하는 효과가 우수하다.

본 발명에 있어, EGF (epidermal growth factor), bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor), IGF-1 (Insulin-like growth factor 1), 및 KGF (keratinocyte growth factor) 를 포함하는 조성물은 “성장인자 복합체 (growth factor complex, GF complex)” 로 명명될 수 있으며, 상기 성장인자 복합체는 EGF, bFGF, IGF-1 및 KGF 외에 펜틸렌 글라이콜 (Pentylene Glycol), 1,2-헥산다이올 (1,2-Hexanediol), 레시틴 및 인산나트륨을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 성장인자 복합체는 EGF, bFGF, IGF-1, KGF 를 KGF 농도를 기준으로 2 내지 3 : 0.5 내지 1.5 : 0.55 내지 1.5: 1의 농도비, 바람직하게는 2 내지 2.75 : 0.75 내지 1.2 : 0.75 내지 1.25: 1의 농도비로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 2.5: 1: 0.75: 1 의 농도비로 포함할 수 있고, 본 발명의 일 구현예에서는 EGF 를 10ppm, bFGF 는 4ppm, IGF-1 은 3ppm, KGF는 4ppm 농도로 포함한 성장인자 복합체를 이용하였다.

또한 본 발명의 성장인자 복합체의 크기는 50 내지 150nm, 바람직하게는 75 내지 125nm, 더욱 바람직하게는 80 내지 110nm 일 수 있다.

본 발명에 있어 “피부 재생” 이란 피부 외부 및 내부 원인에 의한 손상에 대하여 피부 조직이 회복되는 것을 의미한다. 상기 외부 원인에 의한 손상은 자외선, 외부 오염 물질, 창상, 외상 등을 들 수 있으며, 상기 내부 원인에 의한 손상은 스트레스 등을 들 수 있다.

특히 본 발명은 피부 재생을 통해 피부 상처를 치료할 수 있으며, 바람직하게 상기 피부 재생은 피부 레이저에 의한 손상 또는 피부 박피 후 손상 재생용일 수 있고, 예컨대 CO₂레이져나 프락셀과 같은 피부 미용 시술에 의한 손상을 치료하고, 피부를 재생시키는 것일 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 피부 손상에 의해 유발되는 피부 자극, 따가움, 화끈거림, 건조함 등의 증상을 효과적으로 완화시킬 수 있다.

본 발명의 성장인자 복합체는 세포외기질의 합성을 증가시키는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 세포 간 기질 분해 효소인 MMP-1, MMP-2의 발현은 감소시키고 COLA1A, 엘라스틴, HAS3 및 콜라겐 I 의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 성장인자 복합체를 화장품, 화장료 조성물로 사용하는 경우, 상기 EGF (epidermal growth factor), bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor), IGF-1 (Insulin-like growth factor 1), 및 KGF (keratinocyte growth factor) 를 포함하는 성장인자 복합체를 유효성분으로 함유하여 제조되는 화장품은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수, 훼이셜 로션, 바디로션 등과 같은 유액, 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등과 같은 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션, 파우더, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제, 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬 등과 같은 세정제 등의 제형을 가질 수 있다.

또한, 상기 화장품은 상기 성장인자 복합체에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

상기 성장인자 복합체를 화장품으로 제품화하는 경우에 유효성분이 단기간 내에 피부에 머무르게 되는 메이크업 제거제, 세정제 등과 같은 워쉬-오프(wash-off) 타입의 화장품의 경우에는 비교적 높은 농도의 성장인자 복합체를 포함할 수 있을 것이다. 반면, 유효성분이 장기간 동안 피부에 머무르게 되는 화장수, 유액, 크림, 에센스 등의 리브-온(leave-on) 타입의 화장품의 경우에는 워쉬-오프 타입의 화장품에 비해 낮은 농도의 상기 성장인자 복합체를 포함해도 무방할 것이다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 한 구체예에서, 상기 조성물은 상기 성장인자 복합체를 전체 조성물 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%(바람직하게는 0.0001 중량% 내지 1 중량%)로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물이 상기 성장인자 복합체를 0.0001 중량% 미만으로 포함할 경우에는 충분한 피부 재생, 상처 회복, 피부 자극 완화 효과를 기대할 수 없고, 10 중량% 를 초과하여 포함할 경우에는 알러지 등 원치 않는 반응이 발생하거나 피부 안전성에 문제가 있을 수 있으므로 이를 방지하기 위한 것이다.

또한, 본 발명의 상기 성장인자 복합체를 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 예컨대, 공지의 피부 재생, 주름 개선, 상처 치료, 피부 자극 완화 성분을 포함할 수 있을 것이다. 추가적인 피부 재생, 주름 개선, 상처 치료, 피부 자극 완화 성분을 포함하게 되면 본 발명의 조성물의 피부 재생, 주름 개선, 상처 치료, 피부 자극 완화 효과는 더욱 증진될 수 있을 것이다. 상기 성분 추가 시에는 복합 사용에 따른 피부 안전성, 제형화의 용이성, 유효성분들의 안정성을 고려할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 상기 조성물은 당업계에 공지된 피부 재생 성분으로서, 레티노산, TGF, 동물 태반 유래의 단백질, 베튤린산 및 클로렐라 추출물, 당업계에 공지된 항산화 성분으로서, 토코페롤, 셀레늄, 비타민 C 및 페놀성 화합물, 당업계에 공지된 미백 성분으로서, 코지산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin) 등과 같은 티로시나제 효소활성을 억제하는 물질, 하이드로퀴논(Hydroquinone), 비타민-C(L-Ascorbic acid) 및 이들의 유도체와 각종 식물 추출물로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 재생, 주름 개선, 상처 치료, 피부 자극 완화용 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체는 완충액, 주사용 멸균수, 일반 식염수 또는 인산염 완충 식염수, 슈크로스, 히스티딘, 염 및 폴리솔베이트 등과 같은 여러 성분을 함유할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 일반 의약품 제제의 형태, 예를 들어, 임상 투여 시 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌 글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다.

실험예 1. 인간 피부 섬유아 세포주 배양 및 세포 성장인자 혼합물 제조

인간 피부 섬유아 세포주 NHDF 는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), 우태아 혈청 10%, 항생제 10%를 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

피부 재생 및 상처 회복을 촉진하기 위하여 EGF, bFGF, IGF-1, 및 KGF 를 사용하였으며, 제조된 혼합물을 “성장인자 복합체 (Growth factor complex)” 로 명명하였다. EGF는 10ppm, bFGF 는 4ppm, IGF-1 은 3ppm, KGF는 4ppm 농도로 혼합하였으며, 최종적으로 모든 성장인자의 총합이 21ppm 이 되도록 하고, 성장인자 복합체의 사이즈는 100nm가 되도록 제조하였다.

실시예 1. 세포 생존율 측정

인간 섬유아 세포주인 NHDF를 96-웰 플레이트에 비처리군, 양성 대조군 (Cat. 236-EG / R&D)과 성장인자 복합체 각 농도별 처리군으로 나누어 각각 3 웰씩(1 X 10³ 개/ 웰) 배양하였다. 12시간 배양 후 양성 대조군에는 EGF를 1ng/ml, 50ng/ml 처리하고, 나머지 well에는 성장인자 복합체를 1, 5, 10, 20, 50 ng/ml 농도별로 처리하고 24시간 배양하였다. 24시간 후 각 웰 당 90㎕의 새 배지에 Ez-Cyto(MTT) 시약 10㎕를 넣은 후 30분간 반응시켰다. 인큐베이션 한 색이 변하기 시작한 후, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay plate reader)를 이용하여 450nm(reference 650nm)에서 흡광도를 측정하고 그래프로 나타내었으며 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 성장인자 복합체를 처리한 실험군에서는 농도의존적인 세포 생존율 증가가 확인되었고, 양성 대조군 대비 1ng/ml 처리군에서 5% 이상, 50ng/ml 처리군에서 약 20% 이상 세포 성장이 더 증가되는 것을 확인하였다.

실시예 2. 상처 재생 효과 확인

성장인자 복합체의 상처 재생 효과를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 먼저 인간 섬유아 세포주인 NHDF를 6-웰 플레이트에 비처리군, 양성 대조군 (Cat. 236-EG / R&D), 성장인자 복합체 각 농도별 처리군으로 나누어 각각 2 웰씩(1 X 10⁶ 개/ 웰) 배양하였으며, 다음 날, 세포가 약 70% 이상 자랐을 때, 10㎕ 팁으로 동일한 간격으로 세포 표면을 긁어 상처를 유도하였다. 이후 비처리군은 새 배지만 공급하고, 나머지 처리군에는 새 배지 2ml에 양성 대조군으로 EGF 1ng/ml, 50ng/ml 를 처리하고, 나머지 well에는 성장인자 복합체를 1, 5, 10, 20, 50 ng/ml 농도별로 처리한 후 24시간 이후 현미경으로 세포 재생 효과를 확인하였다. 현미경으로 확인한 결과를 도 2에, 이를 image J 프로그램을 통해 수치로 정량화하여 그래프로 나타낸 결과를 도 3에 나타내었다.

도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 성장인자 복합체 농도가 증가함에 따라 더 많은 세포의 재생이 확인되었고, 대조군 및 양성 대조군 대비 상처 치유(wound closure)가 우수하게 나타남을 확인하였다. 특히 본원 발명의 성장인자 복합체를 50ng/ml, EGF 를 똑같이 50ng/ml 로 처리한 실험군을 비교한 결과 본원 발명의 성장인자 복합체 처리군에서 25% 이상 증가된 현저한 세포 재생 효과를 확인하였다.

실시예 3. 세포 외기질 ( extracellular matrix;. ECM) 발현 확인

실시예 1 및 2를 통해 성장인자 복합체의 인간 피부 섬유아 세포주 성장 및 재생 촉진 효과를 확인하였으므로, 이들이 세포외기질 MMP-1, COLA1A, MMP-2, HAS3, 엘라스틴의 유전자 및 단백질 발현에 영향을 주는지 확인하였다. 실시예 2와 동일한 방법으로 세포주를 배양하고, 6cm 플레이트에 비처리군, 양성 대조군 (Cat. 236-EG / R&D), 성장인자 복합체 각 농도별 처리군으로 나누어 2 X 10⁶ 개/ 웰 배양하였다. 다음 날, 비처리군에는 새 배지만을 공급하고, 나머지 처리군에는 새 배지 3ml에 양성 대조군은 EGF 50ng/mg 을 처리하고, 나머지 플레이트에는 성장인자 복합체를 1, 10, 20, 50 ng/ml 농도별로 처리 후 24시간 이후 다음과 같이 mRNA를 추출하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 1X PBS로 세척한 후에 PureHelix RNA Extraction Solution(Nanohelix Co., South Korea)을 이용하여 제공된 프로토콜에 따라 mRNA를 추출하였다. 이후 GE Nano vue로 정량 후, cDNA합성 Kit5x RT premix (reverse transciption -elips biotech)를 이용하여 1ug으로 합성하였다. 본 실험에 사용한 프라이머 서열을 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

실시간 정량-PCR(RT Q-PCR) cDNA 1ug- GAPDH, 3ug-MMP-1,MMP-2, 2ug-COL1A1, HAS, ELASTIN로 하고, SYBR green Kit-SYBR green with low ROX (enzynomics)10ul, 나머지는 H₂O로 총 20ul가 되도록 하여, StepOne Plus 실시간 PCR system (AB Applied biosystems) 기계로 PCR을 수행하였다. 실험에 사용된 PCR 조건은 다음과 같다.

[표 2]

결과의 통계처리는 평균 Δcycle threshold) 값과 표준편차 값을 구하고, one-way ANOVA로 분석 한 후에 p>0.05 수준에서 유의성을 검증하여 처리하였다. 항존유전자(House-keeping gene)로 GAPDH의 분석 값과 비교하여 보정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이 본 발명의 성장인자 복합체 처리군은 농도 의존적으로 MMP-1, MMP-2의 mRNA 발현을 감소시켰으며, 농도의존적으로 COLA1A, 엘라스틴, HAS3 의 mRNA 발현을 증가시켰다. 성장인자 복합체 50ng/ml 을 처리한 모든 실험에서는 대조군인 EGF 50ng/ml 처리군과 비교하여 유사하거나 현저히 우수한 효과를 확인하였다.

성장인자 복합체가 단백질 수준에서도 세포외기질에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 콜라겐 I, 엘라스틴, MMP-3의 단백질 발현에 대한 실험을 수행하였다. 실시예 2와 동일한 방법으로 세포주를 배양 후, 6cm 플레이트에 비처리군, 양성 대조군(Cat. 236-EG / R&D), 성장인자 복합체 각 농도별 처리군으로 나누어 2 X 10⁶ 개 배양하였다. 다음 날, 비처리군은 새 배지만을 공급하고, 나머지 처리군에는 새 배지 3ml에 양성 대조군은 EGF 50ng/ml를, 나머지 플레이트에는 성장인자 복합체를 1, 10, 20, 50 ng/ml 농도별로 처리 후 24시간 이후 다음과 같이 단백질을 추출하고, 웨스턴 블랏을 수행하였다. 먼저 배지를 제거하고, 1X PBS로 워싱한 후에 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 3 mM EDTA, 3 mM EGTA, 0.5% NP40, 10 mM beta-glycerophosphate, 50 mM sodium fluoride, 0.2 mM sodium vanadate, 10 mM PNPP, 5 mM PMSF 및 10 ㎍/㎖ 류펩틴(leupeptin)으로 만들어진 lysis buffer로 세포를 용해시켰다. Bradford protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA)로 용해시킨 단백질의 농도를 잰 다음 10ug를 정량하여 Laemmli sample buffer와 농도에 맞게 섞어 끓인 후 SDS-PAGE에 로딩하였다. 이후 전개(transfer), 블로킹 (milk blocking)하고 TBS-T로 씻어준 후 1차 항체를 넣고 24시간 인큐베이션하였다. 다음날 TBS-T 세척 후 Rabbit 2차 항체를 1시간 인큐베이팅 한 뒤, 20분간 TBS-T로 3차례 씻어준 후 필름으로 현상하였다. 1차 항체는 collagen(ab138492)-AbCam, Elastin(sc-374638), MMP-3(sc-21732), GAPDH(#5174s)-Cell Signaling Tech를 사용하였고, 2차 항체로는 mouse, rabbit-Komabiotech를 사용하였다. 웨스턴 블랏을 수행한 결과 및 이를 image J 프로그램을 사용하여 정량화한 결과를 도 5 및 도 6 에 나타내었다.

도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 성장인자 복합체 처리에 따란 세포외 기질 활성 유전자인 콜라겐, 엘라스틴은 처리해준 성장인자 복합체의 농도에 따라 발현이 증가함을 확인하였다. 반면, 세포 간 기질 분해 효소인 MMP-3는 성장인자 복합체 처리에 의하여 발현이 감소함을 확인하였다. 이러한 결과를 통해, 성장인자 복합체는 세포외 기질의 재건 및 합성을 증가시켜서 상처 재생을 돕고, 세포 간 기질 분해 효소인 MMP-3의 발현을 크게 억제함으로써 상처 재생 및 피부 재생에 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.

도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 세포외 기질 활성 유전자인 콜라겐, 엘라스틴은 처리해준 성장인자 복합체의 농도에 따라 발현이 증가함을 확인하였다. 반면, 세포 간 기질 분해 효소인 MMP-3는 성장인자 복합체 처리에 의하여 발현이 감소함을 확인하였다. 이러한 결과를 통해, 성장인자 복합체는 세포외 기질의 재건 및 합성을 증가시켜서 상처 재생을 돕고, 세포 간 기질 분해 효소인 MMP-3의 발현을 크게 억제함으로써 상처 재생 및 피부 재생에 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.

실시예 4. 간이 임상 효과 검증

성장인자 복합체가 우수한 피부 재생 효과를 나타내는지 여부를 확인하기 위하여 프락셔널 CO₂ 레이져에 의해 유도되는 미세 박피 피부에 성장인자 복합체를 처리하고 이에 따른 효과를 확인하였다. 간이 임상 실험을 위해서는 실험예 1에서 제조된 성장인자 복합체에 추가적으로 방부제를 포함하고, 정제수, 펜틸렌 글라이콜 (Pentylene Glycol), 1,2-헥산다이올 (1,2-Hexanediol), 레시틴, 인산나트륨을 혼합하여 제조한 제형을 사용하였다.

프락셀 레이져는 1cm²당 약 300~2000개 정도의 가느다란 레이져 빔을 조사하여 피부에 미세한 구멍을 만들어 눈에 보이지 않는 미세한 박피를 하는 레이져 시술로 마이크로 레이져 빔이 조사한 부위 (미세열 시술구역 -Microthermal Treatment Zone)의 진피층까지 침투하여 1cm²당 약 300~2000개 정도의 모공보다도 미세한 기둥을 뚫고 그 미세치료구역이 재생되면서 시술효과를 나타낸다.

본 발명의 레이저 시술에 사용한 10cell specification 을 하기 표 3에 나타내었다.

[표 3]

본 발명의 성장인자 복합체의 효과 검증은 왼쪽 및 오른쪽 얼굴에 동일하게 10cell 6mJ 이 시술된 환자에서 수행하였다. 각 환자들은 3일간 타제품을 사용하지 않았으며, 왼쪽 얼굴에는 성장인자 복합체를, 오른쪽 얼굴에는 손상된 피부 극복 및 피부 재생 목적으로 제조, 판매되고 있는 FDA 승인 약물 (B) 을 매일 2회씩 왼쪽 오른쪽에 모두 1ml 씩 도포하였다. 피부 재생효과를 확인하기 위하여 시술 전, 후, 성장인자 복합체 적용 후 1, 3, 5 또는 7일, 14일에 사진 촬영을 수행하였으며, 시술을 받은 환자들에게 피부 자극에 대한 설문을 수행하였다.

그 결과 환자들은 모두 성장인자 B 제품 대비 성장인자 복합체를 도포한 얼굴에서 프락셀 시술 후 화끈거림, 따가움과 같은 피부 자극이 감소하였다고 답했으며 도 7 에 나타낸 바와 같이, 7일을 전후하여 피부가 재생되고, 레이저 후 피부 회복 및 재생 효과가 우수함을 확인하였다.

Claims

EGF (epidermal growth factor), bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor), IGF-1 (Insulin-like growth factor 1), 및 KGF (keratinocyte growth factor) 를 포함하는, 피부 재생용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 EGF, bFGF, IGF-1 및 KGF 는 2 내지 3: 0.5 내지 1.5: 0.55 내지 1.5: 1의 농도 비로 포함되는 것을 특징으로 하는, 피부 재생용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 펜틸렌 글라이콜 (Pentylene Glycol), 1,2-헥산다이올 (1,2-Hexanediol), 레시틴 및 인산나트륨을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 피부 재생용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 피부 재생은 피부 상처 치료인, 피부 재생용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 피부 재생은 피부 레이저에 의한 손상 또는 피부 박피 후 손상 재생인, 피부 재생용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 세포외기질의 합성을 증가시키는 것인, 피부 재생용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 콜라겐 및 엘라스틴의 발현을 증가시키는 것인, 피부 재생용 화장료 조성물.
EGF (epidermal growth factor), bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor), IGF-1 (Insulin-like growth factor 1), 및 KGF (keratinocyte growth factor) 를 포함하는, 피부 재생용 약학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 EGF, bFGF, IGF-1 및 KGF 는 2 내지 3: 0.5 내지 1.5: 0.55 내지 1.5: 1의 농도 비로 포함되는 것을 특징으로 하는, 피부 재생용 약학적 조성물.
제8항에 있어서, 피부 재생은 피부 레이저에 의한 손상 또는 피부 박피 후 손상 재생인, 피부 재생용 약학적 조성물.