KR20220105891A

KR20220105891A - 살구 유래 콜라겐 성분의 농축액을 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20220105891A
Application number: KR1020210008794A
Authority: KR
Inventors: 이은정; 경서연; 권영지; 유정진; 강승현; 박명삼; 한현옥; 이지원; 옥자경; 송혜림
Original assignee: 주식회사 클리오; 코스맥스 주식회사
Priority date: 2021-01-21
Filing date: 2021-01-21
Publication date: 2022-07-28
Also published as: KR102534346B1

Abstract

화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상기 조성물은 콜라겐을 구성하는 아미노산을 고함량으로 포함하고 있는바, 피부 관련 상태의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

살구 유래 콜라겐 성분의 농축액을 포함하는 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising a concentrate of collagen ingredients isolated from apricot}

화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

살구(Prunus armeniaca)는 장미과 벚나무속에 속하는 식물로 한의학에서는 행인이라 불리며, 본초강목과 동의보감 등에 살구씨를 이용한 치료 방법이 200여 가지나 기록되어 있을 정도로 쓰임새와 약효가 많다. 특히, 살구씨를 갈아서 만든 한방 외용제는 기미나 주근깨 등 피부 색소 침착, 종기, 부스럼 등에 사용되며, 피부를 하얗고 윤기 있게 한다.

최근 들어 비건(Vegan), 클린 뷰티(Clean bueaty) 등에 관심이 높아짐과 동시에 유기농 및 non-GMO 등과 같이 깨끗하고 안전한 천연 소재에 대한 소비자 선호도가 높아지고 있다. 뿐만 아니라, 먹는 피쉬 콜라겐, 먹는 히알루론산 등 건강기능식품 및 이너 뷰티 제품에 대한 관심도 증가하고 있다. 특히, 피부 미용 분야 중 안티-에이징(anti-aging)에 대한 수요자들의 관심이 증가하고 있다.

따라서, 안티-에이징 효능을 가지면서 화학적 및 동물성 소재를 대체할 수 있는 깨끗하고 안전한 식물성 원료를 개발할 필요가 있다.

일 양상은 살구에서 분리된 아미노산 농축액을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 살구에서 분리된 아미노산 농축액을 유효성분으로 포함하는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 살구에서 분리된 아미노산 농축액을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 건조된 살구에 식물성 효소를 혼합하는 단계; 및 상기 효소와 혼합된 살구에서 아미노산을 가수분해하는 단계;를 포함하는 살구에서 콜라겐의 구성 아미노산을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 살구에서 분리된 아미노산 농축액을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 일 구체예에 있어서, 상기 아미노산은 콜라겐을 구성하는 성분인 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "콜라겐"은 단백질의 일종으로 종류에 따라 뼈나 피부, 연골, 결합 조직 등을 구성한다. 콜라겐 합성에는 수많은 콜라겐 합성 유전자가 관여하며, 콜라겐을 비롯한 결합조직 성분을 분해하는 MMPs(matris metalloproteinase)가 존재한다. 노화에 의해 콜라겐 합성이 감소하고 콜라겐을 분해하는 MMPs 효소의 활성 증가로 인해 콜라겐의 분해가 증가하여 탄력을 감소시킴으로써 주름이 증가한다. 콜라겐을 구성하는 아미노산으로는 하이드록시프롤린 (Hydroxyproline), 프롤린 (Proline), 및 글리신 (Glycine)가 대부분을 차지하고 있다. 따라서, 일 양상에 따른 조성물은 살구에서 분리된 아미노산으로서 콜라겐을 구성하는 하이드록시프롤린 (Hydroxyproline), 프롤린 (Proline), 및 글리신 (Glycine) 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 "하이드록시프롤린(Hydroxyproline)"은 프롤린(Proline)의 4번 위치의 탄소에 하이드록시기(-OH)가 붙은 아미노산 성분으로 콜라겐에 다량 함유되어 있다. 상기 하이드록시프롤린은 콜라겐 섬유의 수축작용을 촉진하고 엘라스틴을 보호하는데 관여하며, 피부 노화를 촉진하는 활성산소로부터 피부를 보호함으로써 탄력 있고 생기 있는 피부 관리에 도움을 준다. 또한, 상기 "프롤린(Proline)"은 단백질을 구성하는 지방족 아미노산의 하나로 하이드록시프롤린과 함께 콜라겐의 대부분을 차지하고 있다. 상기 프롤린은 피부에 컨디셔닝 역할을 하여 윤기 있고 탄력 있는 피부 관리에 도움을 준다. 또한, 상기 "글리신(Glycine)"은 콜라겐을 구성하는 필수 아미노산으로서 우수한 보습력을 가지며, 피부 세포에 빠르게 침투하여 피부에 윤기와 촉촉함을 준다.

일 실시예에서는 살구에서 분리된 아미노산 농축액이 항노화 및 항주름 인자, 예를 들어 COL1A1의 함량을 증가시키거나 또는 자외선에 의해 증가된 MMP-1의 발현을 감소시키고, 피부 보습 및 피부 장벽 관련 인자인 히알루론산 합성 효소(Hyaluronan synthase　3, HAS3) 또는 아쿠아포린 3(Aquaporin 3, AQP3)의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 따라서, 살구에서 분리된 아미노산 농축액을 포함하는 조성물은 피부 미용 개선 효과, 예를 들어, 피부 노화 억제, 피부 장벽 강화, 피부 주름 억제 또는 피부 보습 효과를 갖는 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 상기 피부 상태 개선 또는 피부 미용 개선용인 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 피부 상태 또는 피부 미용 개선은 피부 노화 억제 또는 개선, 항 주름, 피부 탄력, 피부 재생, 피부 장벽 강화, 또는 피부 보습인 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "피부 노화"란 나이가 들어가면서 피부에 나타나게 되는 유형과 무형상의 변화를 통틀어 말하는 것으로, 예컨대 표피 두께가 얇아지는 현상, 진피의 세포 수나 혈관 수, DNA 손상복구 능력, 세포교체주기, 상처 회복, 피부장벽기능, 표피의 수분 유지, 땀분비, 피지분비, 비타민D 생산, 물리적 손상방어, 화학물질 제거능력, 면역반응, 감각 기능, 체온조절의 감소를 말한다. 특히, 피부 노화의 주요한 증상으로 주름 및 탄력 저하가 있으며, 이는 진피 내 주 단백질인 콜라겐 및 엘라스틴(elastin)의 감소와 이들 탄력 섬유의 네트워크 변형에 의한 것으로 알려져 있다. 진피와 표피에 존재하는 엘라스틴, 피브로넥틴(fibronectin)이 촘촘하게 네트워크를 구성하여 피부 쿠션층을 유지하고 있으나, 노화에 의해 콜라겐 섬유의 수가 줄어들고 이들이 조각화되어 꼬이면서 탄력 섬유의 네트워크 밀도가 감소함에 따라 정상적인 피부 지탱력을 상실하게 된다.

상기 조성물은 외인성 요인 또는 내인성 요인에 의해 유발되는 피부 노화 개선용일 수 있다. 상기 외인성 요인은 여러 가지 외부 요인, 예컨대 자외선(광)을 말하고 내인성 요인은 연대기적 요인이라고도 지칭되며 주로 시간의 흐름에 의해 발생하는 요인을 말한다. 즉, 상기 피부 노화는 구체적으로는 자외선, 공해, 담배연기, 화학물질 등에 의한 외부 자극에 의해 유도되는 조기 노화 증상 뿐만 아니라, 나이가 들어감에 의해 피부세포의 증식이 감소함에 따라 발생하는 자연 노화 현상을 포함하며 주름, 탄력 감소, 피부 쳐짐 및 건조 현상 등을 모두 포함하는 개념이다. 또한 주름은 내ㆍ외부 요인의 변화에 의한 자극이 피부조직을 구성하고 있는 성분을 변화시켜 주름을 유발하는 것을 포함한다.

상기 노화는 광노화일 수 있다. 본 명세서에서 용어, "광노화(Photoaging)"는 외부 환경적인 요인에 의해 유발되는 현상으로, 가장 대표적인 인자로는 자외선이 있다. 자외선은 단백질 분해효소의 활성화와 기질단백질의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합 등의 생체 구성 성분들의 손상을 가져오고, 이러한 메커니즘의 반복은 외관상으로도 확연한 피부노화를 초래하게 된다.

본 명세서에서 용어, "주름"은 피부의 탄력성이 상실되어 느슨해진 상태를 의미하며, 예를 들면 피부가 접히는 것일 수 있다. 상기 "피부 주름 예방 또는 개선"이란 주름과 관련된 인자의 발현을 억제하여 주름을 방지 또는 개선하거나, 콜라겐 총량을 증가시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.

상기 "피부 장벽 강화"는 피부 가장 바깥쪽에 위치하여 수분과 영양 손실을 막아주는 피부 장벽의 기능이 증진되는 모든 작용을 의미할 수 있다. 또한, "피부 장벽 기능 손상"은 피부 장벽의 기능이 저하되거나 손상되어 피부에 나타나는 모든 변화를 의미할 수 있다. 예를 들어, 피부 주름 증가, 건조, 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 여드름 등을 포함할 수 있다.

상기 "피부 보습"은 피부 수분을 유지하거나 수분 손실을 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물인 것일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 에센스, 팩, 젤, 앰플 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다.

상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 피부 외용제 조성물인 것일 수 있다.

상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류 등도 적절하게 배합할 수 있다.

또 다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 건강기능식품 조성물인 것일 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물은 상기 조성물 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 건강식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.

다른 양상은 유효한 양의 상기 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 개체의 피부 상태를 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 피부 상태의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

본 명세서에서 용어, "투여하는", "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다.

투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.

상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부미용 개선, 예를 들어 피부 보습, 피부 장벽 강화, 피부 주름 개선 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.

상기 투여는 일 구체예에 따른 조성물을 개체당 일당 0.1 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 예를 들면, 0.1 ㎎ 내지 500 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 100 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 50 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 25 ㎎, 1 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 1 ㎎ 내지 500 ㎎, 1 ㎎ 내지 100 ㎎, 1 ㎎ 내지 50 ㎎, 1 ㎎ 내지 25 ㎎, 5 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 5 ㎎ 내지 500 ㎎, 5 ㎎ 내지 100 ㎎, 5 ㎎ 내지 50 ㎎, 5 ㎎ 내지 25 ㎎, 10 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 10 ㎎ 내지 500 ㎎, 10 ㎎ 내지 100 ㎎, 10 ㎎ 내지 50 ㎎, 또는 10 ㎎ 내지 25 ㎎을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인 가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.

다른 양상은 건조된 살구에 식물성 효소를 혼합하는 단계; 및 상기 효소와 혼합된 살구에서 아미노산을 가수분해하는 단계;를 포함하는 살구에서 콜라겐의 구성 아미노산을 분리하는 방법을 제공한다.

일 구체예에 있어서, 상기 효소는 식물성 천연 효소인 것일 수 있다. 상기 효소는 파파인, 파인애플, 배, 무화과, 생강, 아스파라거스, 키위, 민트, 멜론 등에서 유래된 것일 수 있으며 예를 들어, 파파인(papain), 카이모파파인(chymopapain), 브로멜라인(bromelain) 등인 것일 수 있다.

또한, 상기 아미노산을 가수분해 하는 단계에서 에어 버블 브루잉(Air bubble brewing) 공정을 4 내지 48 시간 동안 수행하는 것일 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "에어 버블 브루잉(Air bubble brewing)"은 물 속에서 1 ㎛ 내지 5㎜ 사이즈의 미세 공기방울을 생성시키는 기술로, 외부로부터 공급된 대기압 이상의 압력으로 물 속에서 산소 기체에 의한 버블을 형성할 수 있다. 상기 에어 버블 브루잉 공정을 수행함으로써 물리적 교반에 의한 아미노산의 가수분해를 촉진하는 효과가 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 에어 버블 브루잉 공정은 4 내지 48시간, 4 내지 36 시간, 4 내지 24 시간, 12 내지 24 시간, 18 내지 36 시간, 18 내지 30 시간, 24 내지 36 시간 또는 24 내지 32시간 동안 수행될 수 있다. 이때, 에어 브루잉 공정의 수행 시간이 상기 범위 미만인 경우, 가수분해가 원활하게 진행되지 않아 콜라겐의 구성 아미노산인 하이드록시프롤린, 프롤린, 글리신 및/또는 이들의 혼합물이 충분히 생성되지 않는다는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, 살구에서 분해된 아미노산이 부패 또는 변질될 뿐만 아니라 공정비가 상승하는 문제점이 있다.

일 실시예에서는 살구 추출물과 비교하여 건조 및 식물성 효소와 혼합된 살구를 에어 버블 브루잉 공정을 수행하여 아미노산을 분리하여 제조한 파우더에서 COL1A 발현 증가, 증가된 MMP-1의 발현 감소, 엘라스틴, HAS3 및 AQP3 발현 증가 효과가 현저한 것을 확인하였다. 따라서, 일 양상의 방법에 따라 분리된 아미노산은 살구 추출물과 비교하여 콜라겐을 구성하는 하이드록시프롤린, 프롤린 및 글리신의 함량이 현저하게 높은 바, 상기 아미노산에 의한 항노화 활성, 피부 장벽 강화, 피부 보습 활성이 우수하다.

일 양상에 따른 조성물은 콜라겐을 구성하는 아미노산을 고 함량으로 포함하고 있는바, 피부 관련 상태의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 일 구체예에 따른 농축액이 MMP-1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2는 일 구체예에 따른 농축액이 COL1A1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 세포 내 콜라겐과 엘라스틴의 위치와 생성량을 형광 항체로 관찰한 사진이다.
도 4는 형광 항체를 통하여 세포 내 엘라스틴의 위치와 생성량을 관찰한 사진이다.
도 5는 일 구체예에 따른 농축액이 HAS3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 6은 일 구체예에 따른 농축액이 AQP3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 살구 아미노산 농축액의 제조

살구를 자연 건조한 뒤 세척하였다. 이후, 건조한 살구에 식물성 천연 효소를 혼합한 뒤 수조에서 미세 공기방울을 생성시키는 에어 버블 브루잉(Air bubble brewing) 공정을 24시간 동안 수행하여 살구의 과육에서 콜라겐 성분을 가수분해하였다. 가수분해된 콜라겐 성분을 분리 및 추출하고 2회에 걸쳐 여과하여 여과액을 수득한 뒤 농축된 콜라겐 성분만을 분리하였다. 이후, 농축된 콜라겐 성분들을 12~24시간 동안 동결건조하여 살구 농축 콜라겐 성분 파우더를 제조하였다. 제조된 파우더를 15 kGy의 감마선을 조사하여 살균처리 하였다.

[비교예]

비교예 1. 살구 추출물의 제조

살구를 자연 건조한 뒤 세척하였다. 이후, 건조한 살구를 50℃의 물을 사용하여 살구 추출물을 제조하였다.

[실험예]

실험예 1. 콜라겐 구성 성분의 함량 확인

상기 실시예 1의 살구 아미노산 농축액에 포함된 콜라겐 구성 성분의 함량을 고성능액체크로마토그래피 (High Performance Liquid Chromatography; HPLC) 분석을 통해 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조한 농축액 1.0 ㎕를 컬럼에 주입한 후, 2.0 ㎖/min 유속으로 용매를 흘려주었다. 이때, 용매는 2개의 이동상인 40 mM Phosphate buffer pH 7.8 (용매 A)와 메탄올/아세토나이트릴/물 (45/45/10, v/v, 용매 B)로 구성하였으며, 다음과 같은 농도 구배 조건을 사용하였다: 50~100 % 용매 A (20분). 또한 검출 파장은 262 ㎚, 338 ㎚로 하였다. 비교예 1의 추출물도 동일한 방법으로 실험하였다.

성분	실시예 1	비교예 1
하이드록시프롤린 (Hydroxyproline)	48.34 ㎎/㎏	19.59 ㎎/㎏
프롤린 (Proline)	178.78 ㎎/㎏	66.58 ㎎/㎏
글리신 (Glycine)	41.04 ㎎/㎏	0.2 ㎎/㎏

그 결과, 상기 표 1에 나타낸 바와 같이 실시예 1은 비교예 1에 비해 하이드록시프롤린, 프롤린 및 글리신의 함량이 현저하게 높았다. 구체적으로, 실시예 1은 비교예 1에 비해 하이드록시프폴린, 프롤린 및 글리신의 함량이 각각 2.5배, 2.7배 및 200배 이상 높게 측정되었다.

즉, 일 구체예에 따른 살구 농축액은 살구 추출물에 비해 콜라겐을 구성하는 아미노산의 함량이 현저하게 높은 것을 확인할 수 있다.

실험예 2. 항노화 활성 1

상기 실시예 1의 살구 아미노산 농축액이 노화피부 노화 및 주름 생성과 관련된 인자에 미치는 영향을 분석하였다.

구체적으로, 인간 섬유아세포 세포주(Human dermal fibroblast, Hs68)를 10% 우태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린를 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양하였고, 배양은 37℃, 5% CO₂ 및 습도 95% 조건의 배양기에서 24시간 동안 수행하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS를 넣은 후 20 mJ/㎠의 UVB를 조사하거나 조사하지 않았다. UVB 조사 직후 DPBS를 제거하고 FBS가 없는 배지로 갈아 준 후, 실시예 1 및 비교예 1을 농도별(10ppm, 100ppm)로 처리하고 24시간 동안 추가 배양하였다. 음성 대조군으로 순수 증류수 첨가 및 양성대조군으로서 1 μM EGCG 첨가군을 사용하였다. 이후, 각 배지의 세포를 수득하여 냉각된 PBS로 세척하고 RNAprep 키트(Monarch®Total RNAprep Kit, NEB, 미국)를 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop으로 260 ㎚에서 RNA를 정량한 후, 각각 2㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA를 주형으로 타겟 유전자인 COL1A1, 및 MMP-1에 대하여 사이버그린 (SYBR Green supermix, Applied Biosystems, USA)을 프라이머(하기 표 2 참조) 및 cDNA와 함께 첨가하여 실시간(real-time) PCR 기계 (Step One Plus, Applied Biosystems, 미국)에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 실시간 PCR 반응은 94℃에서 5분 동안 중합효소 활성화 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 반응의 사이클을 40 사이클로 반복하여 수행하였다. COL1A1와 MMP-1 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였고, 그 결과를 도 1 및 도 2에 각각 나타내었다.

유전자	정방향 프라이머	역방향 프라이머
COL1A1	5'-GAGGGCCAAGACGAAGACATC-3'	5'-CAGATCACGTCATCGCACAAC-3'
MMP-1	5'-CGAATTGCCGACAGAGATGA-3'	5'-GTCCCTGAACAGCCCAGTACTT-3'
β-actin	5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3'	5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3'

도 1은 일 구체예에 따른 아미노산 농축액이 MMP-1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고, 도 2는 일 구체예에 따른 아미노산 농축액이 COL1A1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 및 비교예 1은 자외선에 의해 증가된 MMP-1의 발현을 농도 의존적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 실시예 1의 경우, 비교예 1과 비교하여 MMP-1 발현량이 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 및 비교예 1은 COL1A1의 발현을 농도 의존적으로 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 실시예 1의 경우, 비교예 1과 비교하여 COL1A1 발현량이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

즉, 일 양상에 따른 아미노산 농축액은 자외선에 의해 증가된 MMP-1의 생성을 억제하고, 콜라겐을 증가시킴으로써 탄력 감소, 주름 생성 억제 등과 같은 피부 노화 방지에 탁월한 효과가 있다.

실험예 3. 항노화 활성 2

상기 실험예에서 배양한 세포의 Type 1 콜라겐과 엘라스틴의 세포 내 위치와 생성량을 컨포컬 현미경으로 관찰하였다.

구체적으로, 상기 실험예 1의 세포주를 Poly-L-Lysine으로 코팅한 4 well lab-tek chambered cover glass에 3.0ⅹ10⁴세포/웰로 분주하여 37 ℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 PBS로 세척해 준 후, Serum free media로 교체하여 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 48시간 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 10% Neutral buffered formalin으로 10분간 고정한 후, 0.5% Trixon X-100으로 Permeabilization을 수행하였다. 이후, 1% BSA(0.01 g/㎖ in PBS)를 첨가한 후 상온에서 1시간 동안 Blocking하고, 1차 항체인 Anti-collagen 1 antibody와 Anti-Elastin antibody를 첨가하여 4℃에서 밤새(overnight) 배양하였다. 다음 날 2차 항체인 Anti-Rabbit 및 Anti-Mouse Antibody를 넣고 상온에서 1시간 동안 빛을 차단한 채로 염색하였다. 이후, Lab-tek cover를 제거한 후 VECTASHIELD® MOUNTING MEDIUM with DAPI 1drop을 첨가하여 coverslip으로 덮어주고 Nail polish로 주변을 발라서 고정한 뒤 완전히 말려서 관찰용 샘플을 제작하였다. 이 후 해당 샘플을 confocal 현미경(Olympus FV 1200)을 이용하여 형광을 관찰하였다. 아스코르브산(Ascorbic acid)은 양성 대조군으로 사용하였다.

도 3은 세포 내 콜라겐 typeⅠ과 엘라스틴의 위치와 생성량을 형광 항체로 관찰한 사진이다.

도 4는 형광 항체를 통하여 세포 내 엘라스틴의 위치와 생성량을 관찰한 사진이다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1은 비교예 1과 비교하여 엘라스틴(빨간색)과 콜라겐 typeⅠ(녹색)의 형광 세기가 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 1은 비교예 1과 비교하여 엘라스틴(빨간색)의 형광 세기가 더 강하게 나타났으며 양성 대조군과 비교하여도 형광 세기가 더 강하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

즉, 일 양상에 따른 아미노산 농축액은 피부 탄력에 영향을 미치는 인자인 콜라겐과 엘라스틴을 생성을 촉진시킴으로써 피부 탄력을 증가에 도움을 줄 수 있다.

실험예 4. 피부 장벽 강화 및 피부 보습 활성

상기 실시예 1의 아미노산 농축액이 피부장벽강화 및 피부 보습 활성에 미치는 영향을 분석하였다.

구체적으로, 인간 각질형성 세포주(human keratinocyte)인 HaCaT 세포를 10% 우혈청 (fetal bovine serum) 및 1% 페니실린을 포함한 DMEM 배지(Dulbecco'smodified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃ 5% CO₂ 및 습도 95% 조건의 배양기에서 수행하였다. 상기 배양된 세포주에 실시예 1 및 비교예 1을 농도별(10ppm, 100ppm)로 처리하고 24시간 동안 추가 배양하였다. 양성 대조군으로 레티논산(Retionic acid) 1 μM을 사용하였다. 이후, 각 배지의 세포를 회수하여 냉각된 PBS로 세척하고 RNAprep 키트(Monarch® Total RNAprep Kit, NEB, 미국)를 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop으로 260㎚에서 RNA를 정량한 후, 각각 2㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA를 주형으로 타겟 유전자인 피부 장벽 강화 및 보습과 관련된 인자인 HAS3(히알루론산 합성 효소), 및 AQP3(아쿠아포린 합성 단백질)에 대한 프라이머(하기 표 3 참조) 및 cDNA와 함께 첨가하여 실시간(real-time) PCR 기계 (Step One Plus, Applied Biosystems, 미국)에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 실시간 PCR 반응은 94℃에서 5분 동안 중합효소 활성화 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 반응의 사이클을 40 사이클로 반복하여 수행하였다. HAS3 및 AQP3 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였고, 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

유전자	정방향 프라이머	역방향 프라이머
HAS3	5'-CTTAAGGGTTGCTTGCTTGC-3'	5'-GTTCGTGGGAGATGAAGGAA-3'
AQP3	5'-GTCACTCTGGGCATCCTCAT-3'	5'-CTATTCCAGCACCCAAGAAGG-3'
β-actin	5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3'	5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3'

도 5는 일 구체예에 따른 아미노산 농축액이 HAS3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이고, 도 6은 일 구체예에 따른 아미노산 농축액이 AQP3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

그 결과, 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 및 비교예 1은 농도 의존적으로 HAS3 및 AQP3의 발현을 유의적으로 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 실시예 1은 비교예 1과 비교하여 동일한 농도에서 HAS3 및 AQP3 발현 증가 효과가 현저한 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 일 양상에 따른 조성물은 손상된 피부 장벽을 복원시키고 피부 장벽을 강화하여 피부 방어력을 높여줄 수 있다. 또한, 피부 보습에 탁월하여 보습 관련 질환의 예방 또는 치료에 효과적이다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

살구에서 분리된 아미노산 농축액을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 아미노산은 콜라겐을 구성하는 것인 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 아미노산은 하이드록시프롤린 (Hydroxyproline), 프롤린 (Proline), 및 글리신 (Glycine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서, 피부 상태 개선, 또는 보습용 화장료 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 피부 상태는 피부 노화, 피부 장벽 강화, 피부 주름, 피부 탄력, 또는 피부 재생인 것인 화장료 조성물.
살구에서 분리된 아미노산 농축액을 유효성분으로 포함하는 피부 외용제 조성물.
살구에서 분리된 아미노산 농축액을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품 조성물.
건조된 살구에 식물성 효소를 혼합하는 단계; 및
상기 효소와 혼합된 살구에서 아미노산을 가수분해하는 단계;를 포함하는 살구에서 콜라겐의 구성 아미노산을 분리하는 방법.