KR20230147250A - 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주로 고체발효시킨 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액을 포함하는 피부상태 개선용 조성물 - Google Patents

모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주로 고체발효시킨 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액을 포함하는 피부상태 개선용 조성물 Download PDF

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Abstract

모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주로 고체발효시킨 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액을 포함하는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것으로, 일 양상에 따른 조성물은 아미노산 특히, 콜라겐의 주요 구성 아미노산들을 고함량으로 포함하고 있는 바, 기존의 화학적 및 동물성 콜라겐 소재를 대체할 수 있는 콜라겐 제제로서 화장품, 식품, 약학 조성물 등 다양한 분야에 유용하게 사용될 수 있으며, 항노화 및 항염증 등의 피부상태 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주로 고체발효시킨 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액을 포함하는 피부상태 개선용 조성물 {Composition for improving skin condition comprising an amino acid concentrate derived from fermented rice extract fermented by solid state fermentation with Monascus sp. strain}
모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주로 고체발효시킨 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액을 포함하는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것이다.
모나스커스 (Monascus) 속의 홍국균은 Monascaeae Family에 분류되며, 생장 환경에 따라 유성생식과 무성생식을 하는 것으로 알려져 있다. 홍국균이 생산하는 홍국 색소는 식품첨가물로 이용되고 있으며, 모나콜린 K(monacolin K), 로바스타틴(lovastatin), 메비놀린(mevinolin), 가바(GABA, Gamma aminobutyric acid), 아세틸콜린(acethylcholine)과 같은 생리활성 물질이 콜레스테롤 생합성 효소(HMG-CoA reductase) 활성 억제 및 항산화 활성과 같은 유효성에 관한 많은 연구결과가 보고되고 있다 (한국공개특허 10-2018-0094396).
이러한 모나스커스 속 균주는 건강기능성 식품 개발에 대한 연구가 활발하지만, 화장품 분야에서는 단순히 배양액 또는 쌀 발효물에 한해 제한적으로 연구 및 활용되고 있을 뿐, 모나스커스 속 균주로 고체 발효한 발효 쌀 추출물에서 유래된 아미노산 농축액을 콜라겐 제제로 적용한 예는 보고된 바 없다.
최근 들어 비건(Vegan), 클린 뷰티(Clean Beauty) 등에 관심이 높아짐과 동시에 유기농 및 Non-GMO 등과 같이 깨끗하고 안전한 천연 소재에 대한 소비자 선호도가 높아지고 있다. 뿐만 아니라, 먹는 피쉬 콜라겐, 먹는 히알루론산 등 건강기능 식품 및 이너 뷰티 제품에 대한 관심도 증가하고 있다. 특히, 피부 미용 분야 중 주름 개선 및 탄력에 대한 수요자들의 관심이 증가하고 있다.
이에, 본 발명자들은 주름 개선 및 탄력에 우수한 효능을 가지면서, 기존의 화학적 및 동물성 콜라겐 소재를 대체할 수 있는 비동물성 콜라겐 성분 원료를 제공함으로써, 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 쌀을 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주로 고체 발효시킨 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
다른 양상은 쌀을 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주로 고체발효시킨 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 쌀을 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주로 고체발효시킨 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액을 유효성분으로 포함하는 피부 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 쌀을 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주로 고체발효시켜 발효 쌀을 수득하는 단계; 상기 발효 쌀을 C1-C6의 알콜, 물, 또는 이들의 혼합물로 추출하여 발효 쌀 추출물을 수득하는 단계; 상기 발효 쌀 추출물에 식물성 단백질 분해 효소를 혼합하여 생성된 가수분해물을 수득하는 단계; 및 상기 가수분해물을 여과하여 아미노산 농축액을 수득하는 단계;를 포함하는 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액을 제조하는 방법을 제공한다.
일 양상은 쌀을 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주로 고체 발효시킨 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주는 모나스커스 퍼퓨리우스 (Monascus purpureus), 모나스커스 루베르 (Monascus ruber), 모나스커스 필로수스 (monascus pilosus), 및 모나스커스 앵카 (Monascus anka)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 예를 들어, 모나스커스 퍼퓨리우스 (Monascus purpureus)일 수 있다.
상기 "모나스커스 퍼퓨리우스 (Monascus purpureus)"는 반자낭균과(Hemiascomycetaceae) 종의 홍국균속 (Monascaceae)에 속하며 황국균에 가까운 균족으로 현재 약 20종, 균주로서 약 70종류가 분리 동정되어 있고 균의 종류에 따라 생물활성에 차이가 있다. 모나스커스 퍼퓨리우스가 생산하는 색소는 균종에 따라 적색소인 루브로펀테인(rubropuntain) 및 모나스코루빈(monascorubin), 황색소인 모나신(monascin) 및 안카플라빈(ankaflavin), 자색소인 루브로펀크타민(rubropunctamine) 및 모나스코루브라민(monascorubramine) 등으로 분류된다.
일 구체예에 있어서, 상기 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주는 모나스커스 퍼퓨리우스 (Monascus purpureus) GHP-3 균주 (수탁번호: KCCM13100P)일 수 있다. 모나스커스 퍼퓨리우스 GHP-3 균주는 자연발효된 고두밥에서 분리된 신규한 균주로서, 구체적으로 자연발효된 고두밥을 NaCl 용액으로 희석하는 단계; 희석된 고두밥을 클로람페니콜(chloramphenicol)이 첨가된 감자한천배지에서 배양하는 단계; 및 배지에서 붉은 색의 콜로니를 형성하는 균주를 선별하는 단계를 포함하는 방법에 의해 분리된 균주일 수 있다. 상기 NaCl 용액은 0.50%(w/w) 내지 0.99%(w/w), 0.60%(w/w) 내지 0.95%(w/w), 0.70%(w/w) 내지 0.90%(w/w), 0.80%(w/w) 내지 0.90(w/w), 0.84%(w/w) 내지 0.86%(w/w), 예를 들어 0.85%(w/w) NaCl 용액일 수 있다. 상기 배양은 20 내지 40℃, 25 내지 40℃, 25 내지 35℃, 27 내지 35℃, 28 내지 32℃의 온도에서 수행할 수 있다. 상기 배양은 10 내지 100시간, 20 내지 90시간, 30내지 80시간, 40 내지 70시간, 48 내지 65시간, 48 내지 60시간 동안 수행할 수 있다.
상기 "쌀”은 벼 열매의 껍질을 벗긴 알갱이로서, 그 종류를 제한하지 않는다. 상기 쌀은 통상적으로 입수할 수 있는 방법에 의해 얻은 것일 수 있고, 예를 들어 시중에서 판매하는 것을 구입한 것일 수 있다. 상기 쌀은 멸균된 쌀을 사용할 수 있으며, 멸균 방법은 당해 기술분야에서 통상적인 방법으로 수행할 수 있다.
상기 쌀은 수분함량이 30 내지 60%(w/w), 예를 들어, 30 내지 50%(w/w), 30 내지 55%(w/w), 40 내지 60%(w/w), 40 내지 55%(w/w)가 되도록 가수한 것일 수 있다. 상기 쌀의 수분함량이 상기 범위를 초과하는 경우 뭉침 현상이 발생하여 통기량 및 열교환이 나빠져 발효가 잘 안될 수 있고, 반대로 수분함량이 상기 범위 미만일 경우 발효가 조기 종료될 수 있다.
용어, "고체 발효"는 수분이 적은 고체 상태의 원료에 미생물을 접종하여 발효하는 것을 의미할 수 있다. 고체 발효법은 종래의 발효법인 액체 발효법 또는 반 고체 발효법에 비해 잡균의 오염을 받지 않고, 생산물의 회수가 쉽다는 장점이 있을 수 있다.
상기 발효 쌀은 25 내지 40℃, 25 내지 35℃, 28 내지 35℃, 30 내지 35℃, 31 내지 34℃, 32 내지 34℃, 33℃에서 발효시킨 것일 수 있다. 발효 온도가 상기 범위를 초과하는 경우 균의 생장이 억제될 수 있고, 반대로 온도가 상기 범위 미만일 경우 균의 성장이 느려져 오염될 확률이 증가될 수 있다.
상기 발효 쌀은 10 내지 100시간, 20 내지 100시간, 20 내지 90시간, 30 내지 90시간, 30 내지 80시간, 40 내지 80시간, 40 내지 70시간, 48 내지 65시간, 50 내지 65시간, 55 내지 65시간, 60 내지 65시간 동안 발효시킨 것일 수 있다. 발효 시간이 상기 범위를 초과하는 경우 생산 시간이 길어져 양산시 생산량이 낮아질 수 있고, 반대로 발효 시간이 상기 범위 미만일 경우 충분한 발효가 되지 않아 목적하는 물질의 생산량이 낮아질 수 있다.
상기 발효 쌀은 10 내지 99.9% 습도, 20 내지 99.9% 습도, 30 내지 99.9% 습도, 40 내지 99.9% 습도, 50 내지 99.9% 습도, 50 내지 90% 습도, 60 내지 90% 습도, 70 내지 90% 습도, 75 내지 85% 습도, 80 내지 85% 습도 조건에서 발효시킨 것일 수 있다. 습도가 상기 범위를 초과하는 경우 기질 사이의 공극이 작아져 발효 중에 발생되는 열의 제거 효과가 나빠지며, 기질 내부에는 통기량이 낮아져 이산화 탄소 농도가 높아 발효가 잘 안될 수 있고, 반대로 습도가 상기 범위 미만일 경우 기질 내의 수분이 발효 중에 급격히 증발하여 충분한 발효가 일어나지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 발효 쌀은 25 내지 40℃에서 40 내지 80시간 동안 75 내지 85% 습도 조건에서 발효시킨 것일 수 있으며, 예를 들어, 30 내지 35℃에서 60 내지 65시간 동안 75 내지 85% 습도 조건에서 발효시킨 것일 수 있다.
상기 발효 쌀은 발효 쌀의 전체, 그 일부분, 또는 이들로부터 유래된 재료일 수 있다. 추출에 사용된 상기 발효 쌀은 전체, 그 일부분, 또는 이들로부터 유래된 재료를 분쇄 또는 세절하거나 적당하게 건조한 것일 수 있다.
상기 추출물은 친수성 용매 (hydrophilic solvent), 예를 들면, 알콜, 물, 또는 그 조합에 의하여 추출된 것일 수 있다. 상기 알콜은 C1 내지 C10의 하나 이상의 -OH기를 갖는 화합물일 수 있다. 상기 알콜은 C1 내지 C6의 알코올, C3 내지 C6의 다가 알콜일 수 있다. 상기 알콜은 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, sec-부탄올, 이소부탄올, tert-부탄올, n-펜탄올, n-헥산올, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 용매는 예를 들면, 물과 알콜의 혼합물, 즉 알콜 수용액일 수 있다. 알콜 수용액의 알콜 농도는 1 내지 100%(w/w), 예를 들면, 1 내지 99.5%(w/w), 10 내지 100%(w/w), 20 내지 100%(w/w), 30 내지 100%(w/w), 40 내지 100%(w/w), 50 내지 100%(w/w), 60 내지 100%(w/w), 70 내지 100%(w/w), 75 내지 100%(w/w), 60 내지 90%(w/w), 60 내지 80%(w/w), 65 내지 75%(w/w), 또는 70%(w/w)일 수 있다. 상기 알콜 수용액은 메탄올, 에탄올, 또는 부탄올 수용액일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 추출물은 물 추출물일 수 있다.
상기 추출물은 가온 추출, 가압 추출, 초음파 추출, 열수 추출, 환류 냉각 추출, 아임계 추출, 또는 초임계 추출 등 당업 기술분야에서 통상적인 방법으로 추출된 것일 수 있다.
상기 추출 용매는 발효 쌀의 5 내지 15 (부피/중량)배, 예를 들면, 5 내지 13 (부피/중량)배, 5 내지 11 (부피/중량)배, 8 내지 15 (부피/중량)배, 8 내지 13 (부피/중량)배, 8 내지 11 (부피/중량)배, 또는 9 내지 11 (부피/중량)배일 수 있다. 예를 들면, 상기 발효 쌀 전체, 그 일부분, 또는 이들로부터 유래된 재료 100g에 대하여 상기 추출 용매를 0.5 내지 1.5L 첨가하는 것을 포함할 수 있다.
상기 추출은 4℃ 내지 70℃, 예를 들면, 4℃ 내지 50℃, 4℃ 내지 40℃, 4℃ 내지 30℃, 10℃ 내지 70℃, 15℃ 내지 70℃, 20℃ 내지 70℃, 20℃ 내지 30℃, 20℃ 내지 25℃, 4℃ 내지 50℃, 10℃ 내지 50℃, 4℃ 내지 40℃, 4℃ 내지 30℃, 10℃ 내지 40℃, 10℃ 내지 35℃, 또는 10℃ 내지 30℃, 또는 실온에서 수행하는 것일 수 있다.
상기 추출 시간은 선택된 온도 및 추출 방법에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 추출 시간은 1시간 내지 3일, 1시간 내지 2일, 1시간 내지 1일, 5시간 내지 3일, 5시간 내지 2일, 5시간 내지 1일, 10시간 내지 3일, 10시간 내지 2일, 10시간 내지 1일, 12시간 내지 3일, 12시간 내지 2일, 12시간 내지 1일, 15시간 내지 2일, 15시간 내지 36시간, 18시간 내지 30시간, 1일 내지 3일, 1일 내지 2일, 또는 24시간일 수 있다.
상기 추출은 1회 이상, 예를 들면 1 내지 5회, 1 내지 4회, 1 내지 3회, 2 내지 5회, 또는 2 내지 4회 추출되는 것일 수 있고, 각 추출은 동일한 방법으로 수행되거나, 다른 방법으로 수행될 수 있다.
상기 추출은 식물체 잔사 및 추출액을 여과 등의 알려진 방법에 의하여 분리할 수 있다. 상기 추출은 또한 얻어진 추출액으로부터 감압 농축과 같은 알려진 방법에 의하여 용매를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 상기 추출은 또한 얻어진 추출물을 동결건조와 같은 건조에 의하여 건조 추출물을 제조하는 것을 포함할 수 있다.
용어 “아미노산 농축액”은 용어 “아미노산 및 펩티드 단편 혼합물”과 상호 호환적으로 사용될 수 있으며, 상기 발효 쌀 추출물에 식물성 단백질 분해 효소를 혼합하여 가수분해하여 생성되는 것으로서, 아미노산뿐만 아니라, 디펩티드, 트리펩티드 등의 펩티드 단편을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 아미노산 농축액은 상기 발효 쌀 추출물에 식물성 단백질 분해 효소를 혼합한 후 엑티브 에어로빅 믹싱 (Active Aerobic Mixing) 공정을 수행하여 생성되는 가수분해물을 여과 등을 통해 아미노산 및/또는 펩티드 단편 성분을 농축한 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 식물성 단백질 분해 효소는 파파인, 파인애플, 배, 무화과, 생강, 아스파라거스, 키위, 민트, 및 멜론으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 식물에서 유래된 단백질 분해 효소일 수 있다. 예를 들어, 파파인(papain), 카이모파파인(chymopapain), 브로멜라인(bromelain) 등일 수 있다.
용어, "엑티브 에어로빅 믹싱(Active Aerobic Mixing)"은 물 속에서 통기량을 1 vvm(air 1L/min)으로 멸균 공기를 강제적으로 투입하여 혼합하는 기술로, 외부로부터 공급된 대기압 이상의 압력으로 물 속에서 산소 기체에 의한 버블이 형성되어 효율적으로 물질간의 혼합이 이뤄질 수 있다. 상기 엑티브 에어로빅 믹싱 공정을 수행함으로써 물리적 교반에 의한 아미노산의 가수분해를 촉진하는 효과가 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 엑티브 에어로빅 믹싱 공정은 통기량 0.5 내지 1.5 vvm에서, 4 내지 48시간, 4 내지 36 시간, 4 내지 24 시간, 12 내지 24 시간, 18 내지 36 시간, 18 내지 30 시간, 24 내지 36 시간 또는 24 내지 32시간 동안 수행될 수 있다. 이때, 엑티브 에어로 믹싱 공정의 수행 시간이 상기 범위 미만인 경우, 가수분해가 원활하게 진행되지 않아 콜라겐의 구성 아미노산인 하이드록시프롤린, 프롤린, 글리신 및/또는 이들의 혼합물이 충분히 생성되지 않는다는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, 분리된 아미노산이 부패 또는 변질되거나, 기기 손상, 공정비 상승 등의 문제점이 있다.
상기 아미노산 농축액은 콜라겐을 구성하는 아미노산을 다량 함유하는 아미노산 혼합물로, 하이드록시프롤린, 프롤린, 글리신, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 용어, "콜라겐"은 단백질의 일종으로 종류에 따라 뼈나 피부, 연골, 결합 조직 등을 구성한다. 콜라겐 합성에는 수많은 콜라겐 합성 유전자가 관여하며, 콜라겐을 비롯한 결합조직 성분을 분해하는 MMPs(matris metalloproteinase)가 존재한다. 노화에 의해 콜라겐 합성이 감소하고 콜라겐을 분해하는 MMPs 효소의 활성 증가로 인해 콜라겐의 분해가 증가하여 탄력을 감소시킴으로써 주름이 증가한다. 콜라겐을 구성하는 아미노산으로는 하이드록시프롤린 (Hydroxyproline), 프롤린 (Proline), 및 글리신 (Glycine)이 대부분을 차지하고 있다. 따라서, 상기 모나스커스 속 균주, 보다 구체적으로, 모나스커스 퍼퓨리우스 (Monascus purpureus)로 고체발효 시킨 발효 쌀 추추물로부터 분리된 아미노산 농축액은 특히 하이드록시프롤린 (Hydroxyproline), 프롤린 (Proline), 및 글리신 (Glycine)을 고함량으로 함유하므로, 상기 아미노산 농축액은 콜라겐을 구성하는 아미노산의 농축액일 수 있다. 상기 "하이드록시프롤린(Hydroxyproline)"은 프롤린(Proline)의 4번 위치의 탄소에 하이드록시기(-OH)가 붙은 아미노산 성분으로 콜라겐에 다량 함유되어 있다. 상기 하이드록시프롤린은 콜라겐 섬유의 수축작용을 촉진하고 엘라스틴을 보호하는데 관여하며, 피부 노화를 촉진하는 활성산소로부터 피부를 보호함으로써 탄력 있고 생기 있는 피부 관리에 도움을 준다. 또한, 상기 "프롤린(Proline)"은 단백질을 구성하는 지방족 아미노산의 하나로 하이드록시프롤린과 함께 콜라겐의 대부분을 차지하고 있다. 상기 프롤린은 피부에 컨디셔닝 역할을 하여 윤기 있고 탄력 있는 피부 관리에 도움을 준다. 또한, 상기 "글리신(Glycine)"은 콜라겐을 구성하는 필수 아미노산으로서 우수한 보습력을 가지며, 피부 세포에 빠르게 침투하여 피부에 윤기와 촉촉함을 준다. 따라서, 일 양상에 따라 분리된 아미노산 농축액은 모나스커스 추출물과 비교하여 콜라겐을 구성하는 하이드록시프롤린, 프롤린 및 글리신과 같은 아미노산의 함량이 현저하게 높은 바, 상기 성분들에 의한 항노화 활성, 피부 염증 완화 효과가 우수하다.
일 실시예에서는 모나스커스 속 균주, 보다 구체적으로, 모나스커스 퍼퓨리우스 (Monascus purpureus)로 고체발효 시킨 발효 쌀 추추물로부터 식물성 단백질 분해 효소를 혼합하고 엑티브 에어로빅 믹싱 공정을 수행하여 분리된 아미노산 농축액이 기존의 일반적인 모나스커스 추출물과 비교하여 COL1A과 ELN의 발현 증가, 증가된 MMP-1의 발현 감소, 염증성 인자 발현 감소 효과가 우수함을 확인하였다. 따라서, 상기 아미노산 농축액을 포함하는 조성물은 피부 상태 개선 효과를 갖는 것일 수 있다.
상기 피부상태 개선은 피부 노화 억제 또는 개선, 피부 주름 개선, 피부 탄력 개선, 및 항염증으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
용어, "피부 노화"란 나이가 들어가면서 피부에 나타나게 되는 유형과 무형상의 변화를 통틀어 말하는 것으로, 예컨대 표피 두께가 얇아지는 현상, 진피의 세포 수나 혈관 수, DNA 손상복구 능력, 세포교체주기, 상처 회복, 피부장벽기능, 표피의 수분 유지, 땀분비, 피지분비, 비타민D 생산, 물리적 손상방어, 화학물질 제거능력, 면역반응, 감각 기능, 체온조절의 감소를 말한다. 특히, 피부 노화의 주요한 증상으로 주름 및 탄력 저하가 있으며, 이는 진피 내 주 단백질인 콜라겐 및 엘라스틴(elastin)의 감소와 이들 탄력 섬유의 네트워크 변형에 의한 것으로 알려져 있다. 진피와 표피에 존재하는 엘라스틴, 피브로넥틴(fibronectin)이 촘촘하게 네트워크를 구성하여 피부 쿠션층을 유지하고 있으나, 노화에 의해 콜라겐 섬유의 수가 줄어들고 이들이 조각화되어 꼬이면서 탄력 섬유의 네트워크 밀도가 감소함에 따라 정상적인 피부 지탱력을 상실하게 된다.
상기 피부 노화는 외인성 요인 또는 내인성 요인에 의해 유발되는 것일 수 있다. 상기 외인성 요인은 여러 가지 외부 요인, 예컨대 자외선(광)을 말하고 내인성 요인은 연대기적 요인이라고도 지칭되며 주로 시간의 흐름에 의해 발생하는 요인을 말한다. 즉, 상기 피부 노화는 구체적으로는 자외선, 공해, 담배연기, 화학물질 등에 의한 외부 자극에 의해 유도되는 조기 노화 증상 뿐만 아니라, 나이가 들어감에 의해 피부세포의 증식이 감소함에 따라 발생하는 자연 노화 현상을 포함하며 주름, 탄력 감소, 피부 쳐짐 및 건조 현상 등을 모두 포함하는 개념이다. 또한 주름은 내ㆍ외부 요인의 변화에 의한 자극이 피부조직을 구성하고 있는 성분을 변화시켜 주름을 유발하는 것을 포함한다.
상기 노화는 광노화일 수 있다. 용어, "광노화(Photoaging)"는 외부 환경적인 요인에 의해 유발되는 현상으로, 가장 대표적인 인자로는 자외선이 있다. 자외선은 단백질 분해효소의 활성화와 기질단백질의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합 등의 생체 구성 성분들의 손상을 가져오고, 이러한 메커니즘의 반복은 외관상으로도 확연한 피부노화를 초래하게 된다.
용어, "피부 주름 개선"이란 주름과 관련된 인자의 발현을 억제하여 주름을 방지 또는 개선하거나, 콜라겐 총량을 증가시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.
용어 “피부 탄력 개선”은 피부 탄력이 저하되는 것을 억제 또는 저해하거나, 피부 탄력 관련 인자의 발현이 증진되는 모든 작용을 의미할 수 있다.
용어, "항염증"이란 "염증 억제 또는 개선"과 혼용될 수 있으며, 면역 반응이 완화되어 TNF-α의 발현이 억제되는 모든 작용을 의미할 수 있다.
용어, "개선"이란 상태의 완화 도는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
상기 아미노산 농축액은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%로 포함될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 MMP-1의 발현을 억제하는 것일 수 있고, 구체적으로 MMP-1의 발현을 억제하여 피부 주름 개선 효과를 나타내는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 TNF-α의 발현을 억제하는 것일 수 있고, 구체적으로 TNF-α의 발현을 억제하여 항염증 효과를 나타내는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 COL1A1의 발현을 증가시키는 것일 수 있고, 구체적으로 COL1A1의 발현을 증가시켜 피부 주름 개선 효과를 나타내는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 ELN의 발현 증가시키는 것일 수 있고, 구체적으로 ELN의 발현을 증가시켜 피부 탄력 개선 효과를 나타내는 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 조성물은 상기 아미노산 농축액을 유효한 양, 또는 유효 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 유효한 양은 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환 내지 상태의 중증도, 개체의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 추출물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 투여 기간, 상기 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 다른 조성물을 포함한 요소 및 기타 생리 내지 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 “화장료 조성물”은 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 화장수(스킨로션), 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양 로션, 마사지크림, 영양 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 현탁액, 겔, 분말, 페이스트, 마스크팩 또는 시트, 및 에어로졸로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야에서 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 보존제, 안정화제, 계면활성제, 용해제, 보습제, 에몰리언트제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 보습제 등의 추가 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.
다른 양상은 쌀을 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주로 고체발효시킨 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 상기 건강기능식품 조성물에 있어서, 쌀, 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주, 고체발효, 발효, 발효 쌀, 추출물, 아미노산 농축액, 피부상태 개선에 대해서는 상술한 바와 같다.
상기 “건강기능식품 조성물”은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 산제, 과립제, 정제, 환제, 캅셀제, 현탁액, 유제, 시럽제, 침제, 액제, 엑스제 등의 일반적인 제형으로 제조될 수도 있고, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 젤리, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등의 임의의 건강식품 형태로 제조될 수도 있다. 상기 건강식품의 제제화를 위해 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 사용할 수 있으며, 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다. 상기 첨가제로서 각종 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 이외에도 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 첨가제의 비율은 조성물 총 중량을 기준으로 0.001 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 중의 상기 아미노산 농축액의 함량은 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 포함할 수 있으며, 음료로서 제조될 경우 100 mL를 기준으로 0.02 내지 10 g, 구체적으로 0.3 내지 1 g의 비율로 함유할 수 있다.
상기 음료는 상기 아미노산 농축액 이외의 다른 성분을 더 포함할 수 있으며, 통상적으로 음료에 사용되는 다양한 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 더 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 단당류(예: 포도당, 과당 등), 이당류(예: 말토즈, 수크로즈 등), 다당류(예: 덱스트린, 시클로덱스트린 등)와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 함유될 수 있다. 또한, 향미제로서 천연 향미제(예: 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예: 사카린, 아스파탐 등)를 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 음료 100 mL 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 구체적으로 약 5 내지 12g으로 함유될 수 있다.
또 다른 양상은 쌀을 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주로 고체발효시킨 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액을 유효성분으로 포함하는 피부 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물에 있어서, 쌀, 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주, 고체발효, 발효, 발효 쌀, 추출물, 아미노산 농축액에 대해서는 상술한 바와 같다.
상기 피부 염증 질환은 면역 자극에 의해 유발되는 모든 질환을 의미할 수 있다. 예를 들어, 아토피성 피부염, 알레르기성 피부염, 여드름, 지루성 피부염 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
용어, “예방”은 질병의 발생을 억제하는 것을 포함한다.
용어, “치료”는 질병의 발전의 억제, 경감, 또는 제거를 포함한다.
상기 약학 조성물은 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제등을 필요에 따라서 적절하게 배합할 수 있다.
상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.
상기 화장품, 식품, 또는 약학 조성물은 화장품학적으로, 식품적으로, 또는 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 화장품, 식품, 또는 약학 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 피부상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 조성물에 대해서는 상술한 바와 동일하다. 상기 방법에 있어서, 피부 상태, 예방, 개선, 치료, 조성물에 대해서는 전술한 바와 같다.
용어, "투여하는", "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 아미노산 농축액 또는 아미노산 농축액 성분의 적어도 일부를 생존하는 개체 내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부상태 개선, 예를 들어, 피부 노화 억제, 피부 주름 개선, 피부 탄력 개선, 또는 항염증 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 투여는 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액을 개체당 일당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.
또 다른 양상은 쌀을 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주로 고체발효시켜 발효 쌀을 수득하는 단계; 상기 발효 쌀을 C1-C6의 알콜, 물, 또는 이들의 혼합물로 추출하여 발효 쌀 추출물을 수득하는 단계; 상기 발효 쌀 추출물에 식물성 단백질 분해 효소를 혼합하여 생성된 가수분해물을 수득하는 단계; 및 상기 가수분해물을 여과하여 아미노산 농축액을 수득하는 단계;를 포함하는 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 제조하는 방법에 있어서, 쌀, 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주, 고체발효, 발효, 발효 쌀, 추출물, 식물성 단백질 분해 효소, 아미노산 농축액에 대해서는 상술한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 방법은 상기 발효 쌀을 수득하는 단계 이전에 쌀의 수분 함량이 30 내지 60%(w/w)가 되도록 가수한 후 침지하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 상기 쌀의 수분함량에 대해서는 전술한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 가수분해물을 수득하는 단계는 엑티브 에어로빅 믹싱 (Active Aerobic Mixing) 공정을 통기량 0.5 내지 1.5 vvm에서 4 내지 48 시간 동안 수행하는 것일 수 있다. 엑티브 에어로빅 믹싱 (Active Aerobic Mixing) 공정에 대해서는 전술한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 아미노산 농축액을 수득하는 단계는 0.3 um 내지 0.5 um, 예를 들어, 0.45um 막 여과를 하여 여과액을 수득한 후 동결건조하는 단계를 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 조성물은 아미노산 특히, 콜라겐의 주요 구성 아미노산들을 고함량으로 포함하고 있는 바, 기존의 화학적 및 동물성 콜라겐 소재를 대체할 수 있는 콜라겐 제제로서 화장품, 식품, 약학 조성물 등 다양한 분야에 유용하게 사용될 수 있으며, 항노화 및 항염증 등의 피부상태 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 모나스커스 속 균주로 고체 발효된 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액의 제조 방법을 개략적으로 나타낸 순서도이다.
도 2는 모나스커스 퍼퓨리우스 (Monascus purpureus) GHP-3 (수탁번호: KCCM13100P)을 동정한 결과이다.
도 3은 모나스커스 퍼퓨리우스 (Monascus purpureus) GHP-3 (수탁번호: KCCM13100P)로 고체 발효된 발효 쌀 추출물 유래의 아미노산 농축액을 나타낸 사진이다.
도 4는 실시예 1의 아미노산 농축액의 MMP-1 발현 억제 효과를 확인한 그래프이다.
도 5는 실시예 1의 아미노산 농축액의 TNF-α 발현 억제 효과를 확인한 그래프이다.
도 6은 실시예 1의 아미노산 농축액의 COL1A1 발현 증진 효과를 확인한 그래프이다.
도 7은 실시예 1의 아미노산 농축액의 ELN 발현 증진 효과를 확인한 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 모나스커스 퍼퓨리우스( Monascus purpureus )로 고체발효시킨 모나스커스 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액의 제조
(1.1) 모나스커스 퍼퓨리우스( Monascus purpureus ) GHP-3 균주의 분리 및 동정
자연발효된 고두밥을 85%(w/w) NaCl 용액으로 적절하게 연속 희석한 다음 클로람페니콜(chloramphenicol)이 첨가된 감자한천배지(Potato Dextrose Agar: PDA, Himedia, India, M1942)에 도말 한 후, 30℃에서 60시간 동안 배양하였다. 우점한 균주들 중에 붉은색의 콜로니를 형성하는 균주를 선별하여 동정하였다. 도 2는 상기 분리된 균주를 랩지노믹스 검사센터에 의뢰하여 18S rRNA의 염기서열을 분석하여 동정한 결과로, 상기 분리된 균주는 모나스커스 퍼퓨리우스(Monascus purpureus)와 99%의 상동성을 나타내어 모나스커스 퍼퓨리우스(Monascus purpureus)임을 확인하였다. 상기 분리된 균주는 모나스커스 퍼퓨리우스(Monascus purpureus) GHP-3로 명명하였으며, 이를 한국미생물보존센터에 2022년 1월 04일자로 기탁하고, 기탁번호 KCCM13100P를 부여받았다.
(1.2) 모나스커스 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액의 제조
상기 실시예 1.1에서 분리된 모나스커스 퍼퓨리우스 (Monascus purpureus) GHP-3로 쌀을 고체 발효하여 발효 쌀을 제조하고, 발효 쌀 추출물을 가수분해하여 아미노산 농축액을 분리하였다.
구체적으로, 실시예 1.1에서 분리된 모나스커스 퍼퓨리우스 (Monascus purpureus) GHP-3를 정제수 1kg에 당(수크로오즈 혹은 글루코오즈) 10 ~ 20g, 효모추출물 2 ~ 5 g, NaCl 2~5g을 첨가된 배지에서 종 배양을 하였다. 세척된 쌀을 2시간 동안 침지하고 최종 수분함량이 40~55%(w/w)가 되게 가수한 후, 121℃, 60분간 멸균하였다. 냉각 후, 종 배양된 상기 균을 쌀에 초기 균수가 1.0 ~ 5.0 e + 6 cfu/ml이 되도록 접종하고 30 ~ 33 ℃, 60~65시간, 85% 상대 습도에서 고체발효를 하였다.
고체 발효된 쌀 10~11g에 물을 89~90g을 넣고 20~25℃, 200 rpm에서 12 ~ 16 시간동안 추출하였다. 추출액을 4,000 ~ 6,000 rpm으로 원심분리하여 상등액을 버린 후 농축된 추출물을 회수하였다. 이후, 농축된 추출물에 식물성 단백질 분해 효소를 혼합한 뒤 밀폐된 수조에서 통기량이 1 vvm이 되도록 공기를 넣어주는 엑티브 에어로빅 믹싱 공정을 24시간 동안 수행하여 가수분해하였다. 가수분해물에 포함된 아미노산 성분들을 분리하기 위하여 0.45um 막 여과를 하여 여과액을 수득한 뒤, 농축된 아미노산 성분들을 12~24시간 동안 동결건조하여 아미노산 성분 파우더를 제조하였다. 제조된 파우더를 15 kGy의 감마선을 조사하여 살균처리 하였다. 도 3은 모나스커스 퍼퓨리우스 (Monascus purpureus) GHP-3 (수탁번호: KCCM13100P)로 고체 발효된 발효 쌀 추출물 유래의 아미노산 농축액을 나타낸 사진이다.
비교예 1. 모나스커스 추출물의 제조
상기 실시예 1.1에서 분리된 모나스커스 퍼퓨리우스 (Monascus purpureus) GHP-3를 정제수 1kg에 당(수크로오즈 혹은 글루코오즈) 10 ~ 20g, 효모추출물 2 ~ 5 g, NaCl 2~5g을 첨가된 배지에서 종 배양 및 주 배양을 하였다. 종 배양된 균을 주 배양액에 초기 균수가 1.0 ~ 5.0 e+ 6 cfu/ml이 되도록 접종하고 30 ~ 33 ℃, 200 rpm에서 24 ~ 36 시간동안 호기적인 조건에서 진탕 배양하였다. 배양액을 4,000 ~ 6,000 rpm으로 원심분리하여 상등액을 버린 후 농축된 세포를 회수하였다. 2차례의 0.9 % NaCl 용액으로 세척하고 원심분리하여 농축된 세포를 준비하였다. 이후, 모나스커스 세포를 50 ~ 60℃의 물을 사용하여 모나스커스 추출물을 제조하였다. 2회에 걸쳐 여과하여 여과액을 수득한 뒤, 12 ~ 24시간 동안 동결건조하여 모나스커스 추출물 파우더를 제조하였다. 제조된 파우더를 15 kGy의 감마선을 조사하여 살균처리 하였다.
비교예 2. 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액의 제조
세척된 쌀을 2시간 동안 침지하고 최종 수분함량이 40~55%(w/w)가 되게 가수한 후, 121℃, 60분간 멸균하였다, 냉각 후, 쌀 10~11g에 물을 89~90g을 넣고 20~25℃, 200 rpm에서 12 ~ 16 시간동안 추출하였다. 추출액을 4,000 ~ 6,000 rpm으로 원심분리하여 상등액을 버린 후 농축된 추출물을 회수하였다. 이후, 농축된 추출물에 실시예 1에서와 동일한 식물성 단백질 분해 효소를 혼합한 뒤 밀폐된 수조에서 통기량이 1 vvm이 되도록 공기를 넣어주는 엑티브 에어로빅 믹싱 공정을 24시간 동안 수행하여 가수분해하였다. 가수분해물에 포함된 아미노산 성분들을 분리하기 위하여 0.45um 막 여과를 하여 여과액을 수득한 뒤, 농축된 아미노산 성분들을 12~24시간 동안 동결건조하여 아미노산 성분 파우더를 제조하였다. 제조된 파우더를 15 kGy의 감마선을 조사하여 살균처리 하였다.
실험예 1. 콜라겐 구성 아미노산의 함량 분석
상기 실시예 1의 모나스커스 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액 내에 포함되어 있는 콜라겐 구성 아미노산의 함량을 비교예 1, 2와 비교분석하기 위하여, 고성능액체크로마토그래피 (High Performance Liquid Chromatography; HPLC) 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조한 아미노산 농축액 1.0 ㎕를 컬럼에 주입한 후, 2.0 ㎖/min 유속으로 용매를 흘려주었다. 이때, 용매는 2개의 이동상인 40 mM Phosphate buffer pH 7.8 (용매 A)와 메탄올/아세토나이트릴/물 (45/45/10, v/v, 용매 B)로 구성하였으며, 다음과 같은 농도 구배 조건을 사용하였다: 50~100 % 용매 A (20분). 또한, 검출 파장은 262 ㎚, 338 ㎚로 하였다. 비교예 1의 모나스커스 추출물과 비교예 2의 발효하지 않은 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액도 동일한 방법으로 실험하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
성분 실시예 1 비교예 1 비교예 2
하이드록시프롤린 (Hydroxyproline) 370 ㎎/㎏ 9.16 ㎎/㎏ N.D
프롤린 (Proline) 147.46 mg/kg 47.23 mg/kg 2.94 mg/kg
글리신 (Glycine) 295.01 mg/kg 42.54 mg/kg 2.78 mg/kg
그 결과, 상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 1은 비교예 1과 2에 비해 콜라겐의 주 구성 아미노산인 하이드록시프롤린, 프롤린, 및 글리신의 함량이 현저하게 높았다. 구체적으로, 실시예 1은 비교예 1에 비해 하이드록시프롤린, 프롤린, 글리신의 함량이 각각 40.4배, 3.12배, 6.93배 이상 높게 측정되었다. 또한, 실시예 1은 비교예 2에 비해 프롤린, 글리신의 함량은 각각 50.2배, 106.1배 이상 높게 측정되었으며, 비교예 2에서는 하이드록시프롤린은 측정되지 않았다.
즉, 실시예 1의 모나스커스 고체발효 쌀 추출물에서 유래된 아미노산 농축액은 비교예 1의 모나스커스 추출물 또는 비교예 2의 발효하지 않은 쌀 추출물에서 유래된 아미노산 농축액에 비해 콜라겐을 구성하는 아미노산들을 다량 함유하는 것을 확인하였다. 이는 모나스커스 고체발효 쌀 추출물에서 분리된 아미노산 농축액이 기존 화학적 또는 동물성 소재를 대신할 수 있는 천연 소재 기반의 안전한 콜라겐 원료로서 사용될 수 있음을 시사한다.
실험예 2. 유리 아미노 질소 함량 분석
실시예 1과 비교예 1, 2의 각 시료 10g을 가열된 증류수 100ml와 혼합한 후 최종 부피가 250 ml이 되도록 증류수를 첨가하였다. 이를 잘 혼합하여 filter paper (Whatman No.1)로 여과한 용액을 유리 아미노 질소 함량 분석의 시료액으로 사용하였다. 유리 아미노산 함량은 시료액 25 ml에 중성 포르말린 용액 20ml와 증류수 20ml을 첨가하여 pH8이 될 때까지 0.1N NaOH용액으로 적정하고, 적정 시 소비된 NaOH용액의 양을 이용하여 측정하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
실시예 1 비교예 1 비교예 2
Free Amino Nitrogen, % 46.91 8.71 1.86
그 결과, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1은 비교예 1과 2에 비해 유리 아미노 질소의 함량이 현저하게 높았다. 구체적으로, 실시예 1은 비교예 1과 비교예 2에 비해 유리 아미노 질소의 함량이 각각 5.4배, 25.2배 이상 높게 측정되었다.
즉, 실시예 1의 모나스커스 고체발효 쌀 추출물에서 유래된 아미노산 농축액은 비교예 1의 모나스커스 추출물 또는 비교예 2의 발효하지 않은 쌀 추출물에서 유래된 아미노산 농축액에 비해 유리되는 아미노산의 함량이 현저하게 높은 것을 확인하였다.
실험예 3. 항노화 및 항염 활성 확인
실시예 1의 모나스커스 고체발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액의 항노화 효과를 확인하기 위하여, 피부 탄력, 주름 생성 등과 관련된 인자에 미치는 영향을 분석하였다.
구체적으로, 인간 섬유아세포 세포주(Human dermal fibroblast, Hs68)를 10% 우태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린를 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양하였고, 배양은 37℃, 5% CO2 및 습도 95% 조건의 배양기에서 24시간 동안 수행하였다. 이후, 배지를 제거하고 DPBS를 넣은 후 20 mJ/㎠의 UVB를 조사하거나 조사하지 않았다. UVB 조사 직후 DPBS를 제거하고 FBS가 없는 배지로 교체한 후, 실시예 1 및 비교예 1을 농도별(10ppm, 100ppm)로 처리하고 24시간 동안 추가 배양하였다. 양성대조군으로서 1 μM EGCG 첨가군을 사용하였다. 이후, 각 배지의 세포를 수득하여 냉각된 DPBS로 세척하고 RNAprep 키트(Monarch® Total RNAprep Kit, NEB, 미국)를 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop으로 260 ㎚에서 RNA를 정량한 후, 각각 2㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA를 주형으로 타겟 유전자인 MMP-1, TNF-α, COL1A1, ELN에 대하여 사이버그린 (SYBR Green supermix, Applied Biosystems, USA)을 프라이머(하기 표 3 참조) 및 cDNA와 함께 첨가하여 실시간(real-time) PCR 기계 (Step One Plus, Applied Biosystems, 미국)에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 실시간 PCR 반응은 94℃에서 5분 동안 중합효소 활성화 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 반응의 사이클을 40 사이클로 반복하여 수행하였다. MMP-1, TNF-α, COL1A1, 및 ELN 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였고, 그 결과를 도 3 내지 6에 각각 나타내었다.
유전자 정방향 프라이머 역방향 프라이머
MMP-1 5'-CGAATTTGCCGACAGAGATGA-3'
(서열번호 1)		 5'-GTCCCTGAACAGCCCAGTACTT-3'
(서열번호 2)
TNF-α 5'-GTGCCTCAGCCTCTTCTCATT-3'
(서열번호 3)		 5'-CTCTGCTTGGTGGTTTGCTAC-3'
(서열번호 4)
COL1A1 5'-GAGGGCCAAGACGAAGACATC-3'
(서열번호 5)		 5'-CAGATCACGTCATCGCACAAC-3'
(서열번호 6)
ELN 5'-CACCTTGCCCTTGTAGAATCCA-3'
(서열번호 7)		 5'- CCATGACAGGTCAACCAGGTT-3'
(서열번호 8)
β-actin 5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3'
(서열번호 9)		 5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3'
(서열번호 10)
도 4는 실시예 1의 아미노산 농축액의 MMP-1 발현 억제 효과를 확인한 그래프이다. 도 5는 실시예 1의 아미노산 농축액의 TNF-α 발현 억제 효과를 확인한 그래프이다. 도 6은 실시예 1의 아미노산 농축액의 COL1A1 발현 증진 효과를 확인한 그래프이다. 도 7은 실시예 1의 아미노산 농축액의 ELN 발현 증진 효과를 확인한 그래프이다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 실시예 1은 UV에 의해 증가한 MMP-1의 발현을 농도 의존적으로 유의하게 억제하였으며, 특히 비교예 1에 비해 MMP-1 발현 억제 효과가 현저하게 우수한 것을 확인하였다.
또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1은 UV에 의해 증가한 TNF-α의 발현을 농도 의존적으로 유의하게 억제하였으며, 특히 비교예 1에 비해 TNF-α 발현 억제 효과가 현저하게 우수한 것을 확인하였다.
또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 1은 COL1A1의 발현을 농도 의존적으로 유의하게 증가시켰으며, 특히 비교예 1에 비해 COL1A1 발현 증진 효과가 현저하게 우수한 것을 확인하였다.
또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 실시예 1은 ELN의 발현을 농도 의존적으로 유의하게 증가시켰으며, 특히 비교예 1에 비해 ELN 발현 증진 효과가 현저하게 우수한 것을 확인하였다.
이는 본 발명의 아미노산 농축액이 UV에 의해 증가되는 콜라겐 분해효소와 염증인자의 발현을 억제하고, 콜라겐과 엘라스틴의 발현을 증가시킴으로써, 탄력 감소, 주름 생성 억제 등과 같은 피부 노화 방지에 탁월한 효과가 있음을 의미한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM13100P 20220104
SEQUENCE LISTING <110> Cosmax Co., Ltd. <120> Composition for improving skin condition comprising an amino acid concentrate derived from fermented rice extract fermented by solid state fermentation with Monascus sp. strain <130> PN143717 <160> 10 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-1-F primer <400> 1 cgaatttgcc gacagagatg a 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-1-R primer <400> 2 gtccctgaac agcccagtac tt 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-α-F primer <400> 3 gtgcctcagc ctcttctcat t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-α-R primer <400> 4 ctctgcttgg tggtttgcta c 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL1A1-F primer <400> 5 gagggccaag acgaagacat c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL1A1-R primer <400> 6 cagatcacgt catcgcacaa c 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELN-F primer <400> 7 caccttgccc ttgtagaatc ca 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELN-R primer <400> 8 ccatgacagg tcaaccaggt t 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> β-actin-F primer <400> 9 ggccatctct tgctcgaagt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> β-actin-R primer <400> 10 gagaccttca acaccccagc 20

Claims (19)

  1. 쌀을 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주로 고체 발효시킨 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 화장료 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 피부상태 개선은 피부 주름 개선, 피부 탄력 개선, 및 항염증으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 화장료 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주는 모나스커스 퍼퓨리우스 (Monascus purpureus), 모나스커스 루베르 (Monascus ruber), 모나스커스 필로수스 (monascus pilosus), 및 모나스커스 앵카 (Monascus anka)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인 화장료 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주는 모나스커스 퍼퓨리우스 (Monascus purpureus) GHP-3 균주 (수탁번호: KCCM13100P)인 것인 화장료 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 발효 쌀은 25 내지 40℃에서 40 내지 80시간 동안 75 내지 85% 습도 조건에서 발효시킨 것인 화장료 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 추출물은 C1-C6의 알콜, 물, 또는 이들의 혼합물의 추출물인 것인 화장료 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 아미노산 농축액은 발효 쌀 추출물에 식물성 단백질 분해 효소를 혼합하여 가수분해하여 생성되는 것인 화장료 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 식물성 단백질 분해 효소는 파파인, 파인애플, 배, 무화과, 생강, 아스파라거스, 키위, 민트, 및 멜론으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 식물에서 유래된 단백질 분해 효소인 것인 화장료 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 아미노산 농축액은 하이드록시프롤린, 프롤린, 글리신, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 화장료 조성물.
  10. 쌀을 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주로 고체발효시킨 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 건강기능식품 조성물.
  11. 쌀을 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주로 고체발효시킨 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액을 유효성분으로 포함하는 피부 염증 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 피부 염증 질환은 아토피성 피부염, 알레르기성 피부염, 여드름, 및 지루성 피부염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 약학적 조성물.
  13. 쌀을 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주로 고체발효시켜 발효 쌀을 수득하는 단계;
    상기 발효 쌀을 C1-C6의 알콜, 물, 또는 이들의 혼합물로 추출하여 발효 쌀 추출물을 수득하는 단계;
    상기 발효 쌀 추출물에 식물성 단백질 분해 효소를 혼합하여 생성된 가수분해물을 수득하는 단계; 및
    상기 가수분해물을 여과하여 아미노산 농축액을 수득하는 단계;를 포함하는 발효 쌀 추출물 유래 아미노산 농축액을 제조하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주는 모나스커스 퍼퓨리우스 (Monascus purpureus), 모나스커스 루베르 (Monascus ruber), 모나스커스 필로수스 (monascus pilosus), 및 모나스커스 앵카 (Monascus anka)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인 방법.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 모나스커스 속 (Monascus sp.) 균주는 모나스커스 퍼퓨리우스 (Monascus purpureus) GHP-3 균주(수탁번호: KCCM13100P)인 것인 방법.
  16. 청구항 13에 있어서, 상기 발효는 25 내지 40℃에서 40 내지 80시간 동안 75 내지 85% 습도 조건에서 수행되는 것인 방법.
  17. 청구항 13에 있어서, 상기 식물성 단백질 분해 효소는 파파인, 파인애플, 배, 무화과, 생강, 아스파라거스, 키위, 민트, 및 멜론으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 식물에서 유래된 단백질 분해 효소인 것인 방법.
  18. 청구항 13에 있어서, 상기 발효 쌀을 수득하는 단계 이전에 쌀의 수분 함량이 30 내지 60%(w/w)가 되도록 가수한 후 침지하는 단계;를 더 포함하는 것인 방법.
  19. 청구항 13에 있어서, 상기 가수분해물을 수득하는 단계는 엑티브 에어로빅 믹싱 (Active Aerobic Mixing) 공정을 통기량 0.5 내지 1.5 vvm에서 4 내지 48 시간 동안 수행하는 것인 방법.

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