KR20050071474A - 바이오센서와 그의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 간편하면서도 신속하게 높은 정밀도로 시료 중의 특정 성분의 정량 분석이 가능한 바이오센서, 및 그의 제조 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 장기간의 보존 후에도 높은 정밀도로 정량 분석이 가능한, 즉 보존 안정성이 뛰어난 바이오센서, 및 그의 제조 방법을 제공한다. 전기절연 기판(1), 상기 기판 위에 설치된 작용전극(21)과 대전극(22)을 가지는 전극부(2), 및 상기 전극부(2)의 일단에 고착되는 반응부(4)를 구비한 바이오센서로서, 상기 반응부가 산화 환원 효소, 전자 수용체, 미세 결정 셀룰로오스 분체, 및 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트로 구성되어 있는 친수성 폴리머를 주성분으로 해서 이루어지는 것을 특징으로 하는 바이오센서 등에 관한 것이다.

Description

바이오센서와 그의 제조 방법 {BIOSENSOR AND METHOD FOR MANUFACTURING SAME}
본 발명은 시료 중의 특정 성분에 대해서 신속하면서도 간편하게 높은 정밀도로 정량 분석이 가능한 바이오센서 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
시료액 중의 특정 성분에 대해서 시료액의 희석이나 교반 등을 행하지 않고 간편하게 정량할 수 있는 방식으로서 바이오센서가 이용되고 있다. 종래의 바이오센서의 결점을 개량하는 기술에 대해서는 지금까지 많은 보고예가 있다.
예를 들면 일본 특허 공개 평3-202764호 공보에는 반응층에 친수성 고분자를 첨가함으로써, 측정 정밀도를 향상시키는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 일본 특허 공개 평3-202764호 공보에 기재된 글루코오스 센서에 있어서 페리시안화칼륨이 석출되기 때문에 얻어지는 반응부의 형상이 불균일해지기 때문에, 센서의 측정 정밀도는 만족할만한 것이 아니었다.
또한, 효소와 전자 메디에이터를 반응층으로 하는 계에, 미세 결정 셀룰로오스를 공존시키는 기술이 있다(일본 특허 공개 2001-311712호 공보). 그러나, 일본 특허 공개 2001-311712호 공보에 기재된 효소 센서에서는 반응층 막 두께의 균일화, 센서 칩의 정밀도 향상이나 칩 개체간의 성능 안정화에는 기여하지만, 시료에의 용해성이 나쁘기 때문에 충분히 용해, 혼합되는 것이 느리고, 결과적으로 측정에 시간이 걸린다고 하는 문제가 있었다. 그 원인의 하나로서 헥사시아노철(III)칼륨의 결정이 크게 성장하고, 반응층의 표면이 시료와 접하는 면적이 작기 때문에, 분산 및 용해되기 어려운 것을 생각할 수 있다.
또한, 일본 특허 공개 2001-281202호 공보에는 반응층을 승화법에 의해 형성하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 이 방법에서는 바이오센서의 제조 과정에서 감압시킬 필요가 있으므로 설비 등에 비용이 들어 저비용으로의 제조에 적합하지 않다. 또한, 작업이 번잡해지기 때문에 생산성도 낮다고 하는 문제점이 있다.
도 1은 센서 칩 구성의 일례를 도시하는 도이다.
도 2는 실시예 1 및 비교예 1의 반응부 단면의 모식도이다.
도 3은 비교예 1에 있어서의 반응부 표면 상태의 전자 현미경 사진의 사본을 나타낸다.
도 4는 실시예 1에 있어서의 반응부 표면 상태의 전자 현미경 사진의 사본을 나타낸다.
도 5는 실시예 1 및 비교예 1에 있어서의 패러데이 전류값의 비교를 나타내는 도이다.
도 6은 실시예 1 및 비교예 1에 있어서의 센서 출력의 비교를 나타내는 도이다.
도 7은 본 발명의 바이오센서의 실시형태를 나타내는 도이며, 동도(a)는 평면도이며, 동도(b)는 A-A선 단면도이다.
도 8은 본 발명의 바이오센서의 분해 사시도이다.
도 9는 본 발명의 바이오센서의 보류공간부로 액체 시료를 도입할 때의 도입과정을 설명하는 부분 평면도이다.
도 10은 효소 센서의 경과일에 대한 출력 변화와 CV값을 나타내는 그래프이다.
본 발명의 목적은 간편하면서도 신속하게 높은 정밀도로 액체 시료 중의 특정 성분의 정량 분석이 가능한 바이오센서, 및 그의 제조 방법을 제공하는 것에 있다. 본 발명의 다른 목적은 더 장기간의 보존 후에도 높은 정밀도로 정량 분석이 가능한, 즉 보존 안정성이 뛰어난 바이오센서, 및 그의 제조 방법을 제공하는 것에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 액체 시료의 보류공간부 내의 기체를 빼는 배기구를 설치하지 않더라도, 보류공간부에 기포를 남기지 않고 원활하게 액체 시료를 도입할 수 있는 구성이 간소한 바이오센서를 제공하는 것에 있다.
본 발명자는 상기의 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 행한 결과, 안료화 기술을 응용한 석출법을 채용하여 바이오센서의 반응부의 결정성 화합물을 미립자화함으로써, 센서 칩 반응부의 시료에의 분산 용해성을 향상시켜 반응 시간의 단축을 도모할 수 있음을 발견하고, 이것을 더욱 발전시켜 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기에 나타내는 바이오센서(이하, 「제1발명 바이오센서」라고도 부른다) 및 그의 제조 방법을 제공한다.
제1항. 전기절연 기판(1), 상기 기판 위에 설치된 작용전극(21)과 대전극(22)을 가지는 전극부(2), 및 상기 전극부(2)의 일단에 고착되는 산화 환원 효소, 전자 수용체 및 미세 결정 셀룰로오스 분체를 포함하는 반응부(4)를 구비한 바이오센서의 제조 방법으로서, 다음의 (A1) 내지 (C1)에 기재된 각 공정을 순차적으로 행하는 것을 특징으로 하는 제조 방법:
(A1) 전기절연 기판(1) 위에 작용전극(1)과 대전극(2)을 평행 근접시켜서 설치하는 전극부(2) 형성 공정,
(B1) 미리 산화 환원 효소, 전자 수용체 및 미세 결정 셀룰로오스 3성분과 양용매를 포함하는 혼합액 A를, 빈용매에 교반하면서 적하해서 분산액 B를 조제하는 반응부용 도포액의 조제 공정, 및
(C1) 상기 (A1)공정에서 얻어진 전기절연 기판(1) 위의 전극부(2)의 일단에, 상기 (B1)공정에서 얻어진 반응부용 도포액을 도포·건조시켜서 반응부(4)를 형성하는 반응부 형성 공정.
제2항. 전극이 백금, 금, 팔라듐, 및 인듐-주석 산화물로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상으로 이루어지는 것인 제1항에 기재된 제조 방법.
제3항. 제1항 또는 제2항에 기재된 제조 방법에 의해 제조된 바이오센서.
제4항. 제3항에 기재된 이온센서를 이용하여 시료액 중의 글루코오스 성분, 알코올 성분, 락트산 성분 또는 요산 성분을 측정하는 방법.
또한, 본 발명자는 상기의 이온 센서의 반응부에 특정의 친수성 폴리머 성분을 공존시킴으로써, 뛰어난 보존 안정성을 가지는 바이오센서를 얻을 수 있음을 발견하고 이것을 더욱 발전시켜 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기에 나타내는 바이오센서(이하, 「제2발명 바이오센서」라고도 부른다) 및 그의 제조 방법을 제공한다.
제5항. 전기절연 기판(1), 상기 기판 위에 설치된 작용전극(21)과 대전극(22)을 가지는 전극부(2), 및 상기 전극부(2)의 일단에 고착되는 반응부(4)를 구비한 바이오센서로서, 상기 반응부(4)가 산화 환원 효소, 전자 수용체, 미세 결정 셀룰로오스 분체, 및 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트로 구성되어 있는 친수성 폴리머를 주성분으로 하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제6항. 상기 친수성 폴리머가 직쇄 옥시알킬렌 세그먼트와 알킬기 분지 옥시알킬렌 세그먼트를 포함하는 제5항 기재의 바이오센서.
제7항. 상기 친수성 폴리머 중의 알킬기 분지 옥시알킬렌 세그먼트의 평균 분자량이 1500 내지 4000이고, 전체 분자 중의 직쇄 옥시알킬렌 세그먼트가 30 내지 80 중량％인 제6항에 기재된 바이오센서.
제8항. 상기 반응부(4)가, 산화 환원 효소, 전자 수용체, 미세 결정 셀룰로오스, 및 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트로 구성되어 있는 친수성 폴리머를 포함하는 분산액의 코팅에 의해 형성되는 제5항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 기재된 바이오센서.
제9항. 다음의 (A2) 내지 (C2)에 기재된 각 공정을 순차적으로 행하는 것을 특징으로 하는, 제8항에 기재된 바이오센서의 제조 방법.
(A2) 전기절연 기판(1) 위에 작용전극(21)과 대전극(22)을 평행 근접시켜서 설치하는 전극부(2) 형성 공정,
(B2) 미리 산화 환원 효소, 전자 수용체 및 미세 결정 셀룰로오스 3성분과 양용매를 포함하는 혼합액 Ma를, 상기 3성분에 대해서는 빈용매이지만 상기 친수성 폴리머에 대해서는 양용매인 용매에 용해시킨 상기 친수성 폴리머 용액 Pa 중에 교반하면서 적하하여 분산액을 조제하는 반응부용 도포액의 조제 공정, 및
(C2) 상기 (A2)공정에서 얻어진 전기절연 기판(1) 위의 전극부(2)의 일단에, 상기 (B2)공정에서 얻어진 반응부용 도포액을 도포·건조시켜서 반응부(4)를 형성하는 반응부 형성 공정.
또한, 본 발명자는 선단부에 있어서 전기절연 기판과 커버 시트가 스페이서 시트에 의해 간격을 두고 대향 배치된 바이오센서에 있어서, 액체 시료의 보류공간부에 있어서, 상기 스페이서의 선단 가장자리의 한 쪽에 센서 선단측으로 돌출되는 돌출부를 형성함으로써, 기포를 남기지 않고 원활하게 액체 시료를 보류공간부에 도입할 수 있음을 발견하고, 이것을 더욱 발전시켜 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기에 나타내는 바이오센서(이하, 「제3발명 바이오센서」라고도 부른다) 및 그의 제조 방법을 제공한다.
제10항. 선단부에 있어서 전기절연 기판(1)과 커버 시트(6)가 스페이서 시트(5)에 의해 간격을 두고 대향 배치되고, 상기 기판과 상기 커버 시트와 상기 스페이서 시트의 선단 가장자리에 의해 형성된 보류공간부(S)에, 산화 환원 효소를 포함하는 반응부(4)를 구비하고,
액체 시료를 센서 선단측에서 상기 보류공간부 내로 모세관 현상을 이용하여 도입하고, 상기 액체 시료와 상기 반응부(4)의 효소반응에 의한 전기화학 변화를, 작용전극(21)과 대전극(22)을 포함하는 전극부(2)에서 검출하며,
상기 보류공간부(S)에 있어서, 상기 스페이서 시트의 선단 가장자리의 한 쪽에 센서 선단측으로 돌출되는 돌출부(51)를 형성한 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제11항. 상기 스페이서 시트의 선단 가장자리에 입우부(入隅部)(52)가 형성되는 제10항에 기재된 바이오센서.
이하, 본 발명을 「제1발명 바이오센서」, 「제2발명 바이오센서」 및 「제3발명 바이오센서」로 나누어 상세하게 설명한다.
I. 제1발명 바이오센서
제1발명 바이오센서
본 발명의 제1발명 바이오센서에 대해서, 그 일 실시양태인 도 1을 이용해서 상세하게 설명한다. 본 발명은 전기절연 기판(1), 상기 기판 위에 설치된 작용전극(21)과 대전극(22)을 가지는 전극부(2), 및 상기 전극부의 일단에 고착되는 산화 환원 효소, 전자 수용체 및 미세 결정 셀룰로오스 분체를 포함하는 반응부(4)를 구비한 바이오센서의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이오센서는 바이오센서의 반응부의 형성 과정에 있어서, 안료화 기술을 응용한 석출법을 이용하고 있는 점에 특징을 가지고, 이것에 의해 균일한 미세 결정의 반응부를 구축할 수 있고, 반응부의 시료액에 대한 높은 분산 용해성이 달성된다.
우선, 제1발명 바이오센서의 하드 부위를 구성하는 신호 변환 부위의 전극부(2)부터 설명한다.
상기 전극부(2)는 작용전극(21)(측정전극이라고도 부른다)과 대전극(22)(필요에 따라 참조전극도 가질 수 있다)이 한쌍이 되어 평행 근접하여 전기절연 기판(1) 위에 설치되어 있다. 상기 기판으로서는 예를 들면 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 폴리에틸렌나프탈레이트, 지방족 유닛과 방향족 유닛을 포함하는 생분해성 폴리에스테르 수지 등의 폴리에스테르계 수지 필름, 내열성, 내약품성, 강도 등이 보다 뛰어난 폴리아미드이미드 필름, 폴리이미드 필름 등의 플라스틱 필름, 세라믹 등의 무기계 기판을 들 수 있다. 그 두께는 약 50 내지 200 ㎛정도일 수 있다.
일반적으로는 플라스틱 필름이 이용되지만, 제조의 용이성, 내열성, 내약품성, 강도 등의 특성을 겸비한다고 하는 의미에서, 폴리에스테르계 수지 필름과 폴리이미드 필름을 라미네이트한 2층 기판으로 하는 경우도 있다.
또한, 폴리에스테르계 수지 필름의 경우에는 보기 쉬운 등의 점에서 산화 티탄 등을 이겨 넣어 백색 기판으로 하는 것이 바람직하다.
작용전극(21)과 대전극(22)은 상기 기판(1) 위에 (직접 또는 간접적으로) 예를 들면 백금, 금, 팔라듐, 인듐-주석 산화물 등의 양전도체에 의해 형성된다. 형성 수단은 핫 스탬핑에 의해도 만들 수 있지만, 진공증착 또는 스퍼터링에 의한 방법이 미세한 전극 패턴을 정밀도 높고 신속하게 형성할 수 있으므로 바람직하다. 이 스퍼터링의 경우는 상기 양극 형성외를 마스킹함으로써 일거에 형성할 수 있다.
물론, 우선 상기 양도체에 의한 전면 박막을 형성하고 나서, 이것을 포토 에칭법에 의해 상당하는 전극 패턴으로 하는 것으로도 형성할 수 있다.
전극의 두께는 상기 양전도체가 가지는 고유 저항에 따라 다르지만, 필요 이상으로 두꺼워지지 않도록 한다. 일반적으로는 약 30 내지 150 nm가 좋다.
전극의 형상은 기본적으로는 스트라이프상으로, 작용전극(21) 및 대전극(22)을 상기 기판 위에 평행 근접배치로 한다. 그리고 반응부(4)가 설치되는 상기 전극 선단의 형상은 일반적으로는 스트라이프상 그대로이지만, 상기 반응부와의 접촉면적을 보다 크게 하도록, 예를 들면 절곡 형상으로 할 수 있다.
또한, 상기 전극의 다른 일단은 측정 장치에 내장되는 전위 주사부에 연결되는 단자가 되고, 일반적으로 측정 장치에 착탈이 자유롭게 되어 있을 수 있다.
또한, 전극부(2)의 일단에 설치되는 반응부(4)는 마스크 시트(3)에 설치된 반응부용 셀(31) 안에 후술의 3성분 혼합액을 도포해서 형성된다. 반응부(4)는 반응부용 셀(31) 안에 있어서, 작용전극(21)과 대전극(22)을 함께 피복하도록 설치되어, 상기 3성분 혼합액이 타부분으로 새지 않도록 형성된다.
참고로, 이상의 신호 변환 부위의 구조를 개략적으로 도 1로 도해해 둔다. 도 1에 있어서, 전기절연 기판(1) 위에 평행하게 근접해서 설치된 스트라이프상의 작용전극(21)과 대전극(22)을 가지고, 상기 양 전극의 상면에 마스크 시트(3), 전기 절연성의 스페이서 시트(5) 및 커버 시트(6)가 순서대로 적층되어 있다. 마스크 시트(3)에는 반응부용 셀(31)이 설치되고, 여기에 후술하는 3성분을 포함하는 반응부(4)가 형성된다. 상기 스페이서 시트(5)에는 센서의 선단(R커브)의 가장자리의 한 쪽에 돌출부(51)가 설치되고, 그 근본에 입우부(52)가 설치되어 있다. 그리고, 상기 스페이서 시트(5) 위에 전기 절연성의 커버 시트(6)가 피복되어 있다. 이것에 의해 반응부(4)로 통하는 시료 흡입부(15)가 형성된다.
시료의 흡입량과 흡입의 용이성은 시료 흡입구의 형상, 단면적 등에 의해 좌우된다. 그리고 반응부(4)의 용적은 마스크 시트(3)의 두께와 반응부용 셀(31)의 면적에 의해 결정된다. 각각 적절히 바꿔서 최적 조건을 정할 수 있다.
다음으로, 반응부(4)에 대해서 설명한다.
상기 반응부(4)는 상기와 같이 산화 환원 효소, 전자 수용체 및 미세 결정 셀룰로오스 3성분을 주성분으로 해서 형성되는 막(또는 층)을 포함한다
이하 개개의 성분부터 설명한다.
우선 산화 환원 효소는 액체 시료와 접하여 그 중의 어떤 검사 성분과 선택적으로 산화 환원적으로 반응하고, 그것을 인식하는 중추 성분이다. 따라서 적어도 이 산화 환원 효소는 없으면 안되는 것이다. 여기에서 상기 효소와 선택적으로 산화 환원 반응하는 성분으로서는 예를 들면 글루코오스 성분, 알코올 성분, 락트산 성분, 요산 성분이다. 물론, 이들 성분의 전부가 일종의 효소에 의해 행하여지는 것이 아니라 이들 성분과 선택적으로 반응하는 각종 효소가 사용된다.
예를 들면 글루코오스는 글루코오스 옥시다제와 선택적으로 반응하는데, 실제의 반응은 물과 산소의 공존하에서 행하여져 글루콘산과 과산화수소가 생성된다. 또한, 알코올 값을 측정하는 경우에는 알코올 옥시다제 또는 알코올 디히드로게나제를 사용한다. 또한, 락트산을 측정하는 경우에는 락트산 옥시다제 또는 락트산 디히드로게나제를 사용한다. 또한 요산을 측정하는 경우에는 우리카제를 사용한다.
그렇지만, 일반적으로는 상기 효소만으로는 인식응답이 늦고 측정 정밀도도 좋지 않으므로, 이것을 보충하기 위해서 전자 수용체(전자 매개체라고도 부른다)를 공존시키는 것이 행하여지고 있다. 이 전자 수용체를 공존시켜 이용되는 대표예가 글루코오스 센서이며, 예를 들면 혈액을 검체로 하는 혈당값의 측정이다.
전자 수용체는 일반적으로는 효소의 환원산화를 촉진시키는 무기 또는 유기의 미세 분말상 화합물이다. 구체적으로는 예를 들면 페리시안화 알칼리 금속염(특히 칼륨 금속염이 바람직하다), 페로센 또는 그의 알킬 치환체, p-벤조퀴논, 메틸렌 블루, β-나프토퀴논 4-술폰산 칼륨, 페나진메토술페이트, 2,6-디클로로페놀인도페놀 등을 들 수 있다. 그 중에서도 특히 페리시안화 알칼리 금속염, 페로센계가 유효하게 작용한다. 이는 전자 이동 매체로서의 활동이 안정되어 있고, 물, 알코올류, 또는 이들 혼합 용매 등의 수성 용매에 잘 녹기 때문이다.
또한, 이 전자 수용체 분말의 사이즈는 약 5 내지 100 ㎛이다.
상기 2성분을 포함하는 반응부에서도 실용 수준의 센서는 얻을 수 있지만, 양 성분의 수용액을 상기 전극부에 도포해서 얻어지는 바이오센서에서는 그 사용 환경 등에 따라 측정 정밀도에 편차가 생기기 쉽다. 즉, 항상 일정 성능을 가지는 바이오센서를 얻기 어렵다. 이 원인은 잘 알 수 없지만, 도포 후에 석출 형성되는 결정 구조에 기인하는 것으로 생각된다.
제3성분으로서의 미세 결정 셀룰로오스는 상기의 측정 정밀도의 편차를 개선하는 성분으로서 첨가된다. 이 편차의 개선 인자는 여러가지를 생각할 수 있다. 예를 들면 전자 수용체의 전극에의 직접 접촉의 기회를 적게 하는 등의 요인으로 전극과 전자 수용체간에서의 전기 화학적 반응을 억제하는 것이라든가, 효소 입자와 전자 수용체 입자를 보다 미세하고 균일하게 분산되게 하는 것이라든가, 또한, 예를 들면 혈액을 검체로 하는 경우에 혈장 중에 미량의 혈구가 혼입되어 있어도 이것을 상기 셀룰로오스가 흡착해 주는 것이라든가, 상기 셀룰로오스가 네트워크를 형성함으로써 상기 2성분의 계외로의 비산이 방지되는 등의 인자를 들 수 있다. 이들 작용인자가 상승적으로 작용하고, 그 결과 측정 정밀도의 편차가 억제되는 것으로 생각된다.
여기서 미세 결정 셀룰로오스는 식물 섬유 중의 결정 부분을 추출해서 얻은 미세립으로, 그 크기는 일반적으로 직경 약 10 ㎛ 이하, 길이 300 ㎛ 이하이다. 물론 이 미세 결정 셀룰로오스가 주체가 되지만, 여기에 동시적으로 취득할 수 있는 비정질 셀룰로오스 미분말이 혼입될 수 있다.
제1발명 바이오센서의 제조 방법
제1발명 바이오센서의 제조 방법은 다음 (A1) 내지 (C1)에 기재된 각 공정을 순차적으로 행하는 것을 특징으로 한다:
(A1) 전기절연 기판(1) 위에 작용전극(21)과 대전극(22)을 평행 근접시켜서 설치하는 전극부(2) 형성 공정,
(B1) 미리 산화 환원 효소, 전자 수용체 및 미세 결정 셀룰로오스 3성분과 양용매를 포함하는 혼합액 A를, 빈용매에 교반하면서 적하해서 분산액 B를 조제하는 반응부용 도포액의 조제 공정, 및
(C1) 상기 (A1)공정에서 얻어진 전기절연 기판(1) 위의 전극부(2)의 일단에, 상기 (B1)공정에서 얻어진 반응부용 도포액을 도포·건조시켜서 반응부(4)를 형성하는 반응부 형성 공정.
상기의 제조 방법은 바이오센서의 반응부(4)의 형성 과정(B1)에 있어서, 안료화 기술을 응용한 석출법을 이용하고 있는 점에 특징을 가지고, 이것에 의해 균일한 미세 결정의 반응부를 구축할 수 있고, 반응부의 시료액에 대한 높은 분산 용해성이 달성된다.
우선, (A1)의 전극부 형성 공정에 대해서 설명한다. 전기절연 기판(1) 위에, 작용전극(21)과 대전극(22)이 평행 근접해서 설치되어 전극부(2)가 형성된다.
전기절연 기판(1) 위에 전극부(2)를 형성하는 방법은 여러가지 방법을 채용할 수 있지만, 예를 들면 상기 기판(1) 위에 핫 스탬핑, 직접 진공증착, 스퍼터링 등에 의해 전극 패턴을 형성하는 방법, 포토 에칭법에 의해 전극 패턴을 형성하는 방법, 또는 도전성 재료를 가지는 전극 테이프를 상기 기판(1)에 접착하는 방법 등을 들 수 있다.
도전성 재료를 가지는 전극 테이프를 상기 기판(1)에 접착하는 방법의 구체예를 하기에 나타낸다. 얇고 지지성이 있으며 내열성이 뛰어난 폴리이미드나 방향족 폴리이미드 등의 플라스틱 전기 절연성 재료 시트 위에, 백금, 금, 팔라듐, 인듐-주석 산화물 등의 도전성 재료를 증착 또는 스퍼터링하고, 그 상기 전기 절연성 재료 시트의 이면에 에틸렌아세트산 비닐 등의 열융착 재료를 코팅한다. 이 다층 시트를 세단해서 테이프상으로 한 것을 전극 테이프로 한다. 그리고, 상기 절연성 기판(1)에 이 전극 테이프를 열접착함으로써 전극부(2)가 형성된다.
또한, 스퍼터링 등에 의해 전극 패턴을 형성하는 방법으로서는 소망하는 양 전극 형상이 스프라이프상인 경우는 우선 스퍼터링용의 마스킹재로서 2개의 스트라이프상의 평행 구멍이 뚫어진 마스크용 판을 사용하고, 이것을 폴리이미드 필름의 상면에 틈없이 접하는 상태로 고정 설치한다. 상기 필름에 스퍼터링을 행하고, 스트라이프상의 창 구멍으로 스퍼터링 백금이 투사되어 연속한 2개의 스트라이프상 전극이 폴리이미드 필름 위에 밀착 형성된다. 전극의 형성된 폴리이미드 필름을 접착제로 PET 필름에 라미네이트함으로써 전극부(2)가 형성된다.
또는 전기절연 기판(1)(예를 들면 PET 필름) 위에 직접 도전성 재료를 스퍼터링해서 전극부(2)를 형성할 수 있다.
다음으로, (B1)의 반응부용 도포액의 조제 공정에 대해서 설명한다.
본 발명의 반응부용 도포액은 산화 환원 효소, 전자 수용체 및 미세 결정 셀룰로오스 분체 3성분을 포함하는 반응 시약계를 포함한다. 반응 시약계가 미세 결정 셀룰로오스 분체를 포함하므로, 반응부 작성에 있어서의 성막성이 뛰어나다. 상기의 3성분은 전술한 것을 이용할 수 있다.
본 발명의 양용매란 산화 환원 효소 및 전자 수용체에 대해서 용해도가 높은 용매일 수 있고, 물 또는 함수 용매인 수성 양용매가 바람직하다. 함수 용매는 물과 상용성이 있는 것, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 디옥산, 이소프로필알코올 등과 물의 혼합 용액이다.
본 발명의 반응 시약계에 대한 빈용매란, 물에 녹으면서도 산화 환원 효소 및 전자 수용체의 용해도를 낮추는 용매일 수 있고, 알킬렌글리콜모노알킬에테르, 알킬렌글리콜, 프로필렌알코올, 부탄올 등을 들 수 있고, 에틸렌글리콜모노에틸에테르(셀로솔브)가 바람직하다.
상기 공정(B1)에서 생성하는 분산액 B 중에는 상기 3성분의 반응 시약계가 일부 녹아 있을 수 있다. 구체적으로는 산화 환원 효소 및 전자 수용체 2성분은 실질적으로 용해되어 있을 수 있고, 미세 결정 셀룰로오스 분체는 분산 또는 현탁 상태일 수 있다.
상기 양용매와 빈용매의 조합으로서 물-에틸렌글리콜모노에틸에테르가 바람직하다. 또한, 양용매와 빈용매의 양의 비교는 1:0.5 내지 1O 정도, 바람직하게는 1:1 내지 3 정도이다.
(B1)의 전극 형성 공정의 구체예를 나타낸다. 미세 결정 셀룰로오스의 수현탁액을 호모지나이저로 교반하고, 여기에 산화 환원 효소(글루코오스 옥시다제 등) 및 전자 수용체(페리시안화칼륨 등)를 가하여 교반해서 혼합액 A를 얻는다. 본 발명의 한 실시양태로서, 예를 들면 100％의 물 100 mL에 대해서, 글루코오스 옥시다제 0.1 내지 10 g, 페리시안화칼륨 5 내지 70 g, 미세 결정 셀룰로오스 1 내지 10 g의 비율로 상기 혼합액 A가 제조된다. 빈용매(에틸렌글리콜모노에틸에테르 등)를 교반하면서 여기에 상기 혼합액 A를 적하함으로써 분산액 B가 조정된다. 이것을 반응부용 도포액으로 한다.
상기의 이른바 석출법에 의한 분산액 B의 조정은 그 석출되는 속도가 빠를수록 보다 미세한 결정을 얻을 수 있다. 또한, 상기 반응부(4)에 있어서의 건조 공정의 간편함을 고려하면, 양용매 및 빈용매의 비점이 서로 가까운 것을 선택하는 것이 바람직하다.
마지막으로, (C1)의 반응부 형성 공정에 대해서 설명한다. 상기 (A1)공정에서 얻어진 전극 형성판의 전극부(2)의 일단에, 반응부용 도포액의 소정량을 적하해서 도포하고 건조시켜 막이 형성된다.
구체적으로는, 평행하게 근접해서 설치된 작용전극(21)과 대전극(22)을 가지는 전기절연 기판(1) 위에 마스크 시트(3)를 열접착한다. 상기 마스크 시트(3)는 열융착성 시트를 포함하고, 센서 칩 반응부의 전극 면적을 규제하는 반응부용 셀(31)이 설치되어 있다. 즉, 센서의 일단에 상기 작용전극(21)과 대전극(22)의 일부가 보이는 창이 생기도록 반응부용 셀(31)이 설치되어 있다.
상기 (B1)공정에서 얻어진 3성분을 포함하는 반응부용 도포액을 도포하는 부분은 전기절연 기판(1) 위의 마스크 시트(3)에 설치된 반응부용 셀(31) 안이다. 상기 반응부용 셀(31) 안의 작용전극(21) 및 대전극(22)의 쌍방을 덮도록 반응부용 도포액이 도포된다. 상기 도포액은 피펫, 노즐 등을 이용해서 도포되어, 오븐 등에 일정 시간 넣어 건조시킴으로써 막이 형성된다. 이 막은 작용전극(1)과 대전극(2)에 걸쳐 고착되어 반응부(4)로서 기능한다.
또한, 이 마스크 시트(3) 위에 전기 절연성의 스페이서 시트(5) 및 커버 시트(6)가 순서대로 적층되어 있다. 상기 스페이서 시트(5)는 센서의 선단(R 커브)의 가장자리의 한 쪽으로 돌출부(51)가 설치되고, 필요에 따라 그 근본에 입우부(52)가 설치되어 있다. 이 돌출부(51)를 설치함으로써, 본 발명의 센서가 시료액과 접했을 때, 모세관 현상을 이용해서 보류공간부에 기포를 남기지 않고 원활하게 시료액을 도입할 수 있다. 스페이서 시트(5)는 일정한 두께를 가지는 양면접착 시트일 수 있다.
그리고, 상기 스페이서 시트(5) 위에 전기 절연성의 커버 시트(6)가 피복되어 있다. 이것에 의해 반응부(4)로 통하는 시료 흡입부(15)가 형성된다.
검체 흡입량과 흡입의 용이함은 시료 흡입구의 형상, 단면적 등에 의해 좌우된다. 그리고 반응부(4)의 용적은 마스크 시트(3)의 두께와 반응부용 셀(31)의 면적에 의해 결정된다. 각각, 적절히 바꿔서 최적 조건을 정할 수 있다.
또한, 상기 반응부는 작용전극(21)과 대전극(22)에 걸쳐 고착되어 있는 것이 좋지만, 작용전극(21)과 대전극(22)은 반드시 동등한 형상이나 배치로 설치되어 있지 않을 수도 있다.
이상의 (A1) 내지 (C1)의 공정을 거쳐서 소망하는 바이오센서를 얻을 수 있는데, 마지막에는 바이오센서 칩으로서 컷 가공해서 전공정이 종료된다.
II. 제2발명 바이오센서
제2발명 바이오센서
본 발명의 제2발명 바이오센서에 대해서 그 일 실시양태인 도 7 내지 9를 이용하여 상세하게 설명한다. 제2발명 바이오센서는 전기절연 기판(1), 상기 기판 위에 설치된 작용전극(21)과 대전극(22)을 가지는 전극, 및 상기 전극의 일단에 고착되는 반응부(4)를 구비한 바이오센서로서, 상기 반응부가 산화 환원 효소, 전자 수용체, 미세 결정 셀룰로오스 분체, 및 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트로 구성되어 있는 친수성 폴리머를 주성분으로 하여 이루어지는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명의 하드 부위를 구성하는 신호 변환 부위의 전극부(2)에 대해서는 상기의 「I. 제1발명 바이오센서」의 「전극부(2)」의 기재와 같다.
다음으로, 반응부(4)에 대해서 설명한다.
상기 반응부(4)는 상기와 같이 산화 환원 효소와 전자 수용체와 미세 결정 셀룰로오스와 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트에 의해 구성되어 있는 친수성 폴리머 4성분을 주성분으로 하여 형성되는 막(또는 층)이다.
상기 반응부(4)를 구성하는 산화 환원 효소, 전자 수용체 및 미세 결정 셀룰로오스 3성분에 대해서는 상기의 「I. 제1발명 바이오센서」의 「반응부(4)」의 기재와 같다.
제1발명 바이오센서에서는 상기 3성분에 의한 반응부를 채용하고 있고, 편차도 크게 개선되어 높은 정밀도로 시료 중의 성분을 측정할 수 있다. 그러나, 실제로 사용하는 단계에 이르러서는 또다른 여러가지 사전 체크가 행하여지기 때문에, 그 중에서 다음과 같은 점에서 더 한층 개량의 여지가 있었다.
그것은 제조 직후는 높은 정밀도로 측정이 가능하지만, 제조하고 나서 사용자가 실용할 때까지의 기간이 긴 경우, 측정값이 저하하는 경향을 보여 정확한 측정에 난점이 있었다. 즉, 반응부의 반응성에 경시적인 열화가 보여지기 때문에, 장기간의 보존 안정성에 대해서 새로운 개선의 여지가 있었다. 또한, 검체 중에 가지는 성분량(절대치)과 실측값의 차이를 더욱 근접시켜 측정 정밀도를 더욱 높일 필요성도 있었다.
이러한 제1발명 바이오센서에 남겨진 과제를 해결하기 위해서, 제1발명 바이오센서의 반응부에 제4성분으로서, 상기의 「친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트로서 구성되어 있는 친수성 폴리머」를 첨가하는 것이 유효한 것이 발견되었다. 따라서, 상기 폴리머는 상기 3성분과 상기 친수성 폴리머의 조합으로만 큰 작용 효과를 초래하는 것으로서, 상기 3성분 중의 예를 들면 미세 결정 셀룰로오스가 빠지거나 다른 성분으로 치환되어도 본 발명에서 말하는 과제는 해결되는 것이 아니다.
상기 3성분 중에, 상기 폴리머를 혼재시키는 것이 더욱 유효한 이유는 명확하지 않지만, 다음과 같은 작용 효과에 의한 것으로 추측된다.
즉, 이 4성분에 의해 상기 3성분에 의한 반응부(4)보다도 균일한 미세한 입자가 형성되고, 더욱이 상기 폴리머가 3성분을 서로 치밀하게 연결한 상태의 반응부(4)가 형성되기 때문이라고 생각된다. 이것에 의해 이후의 반응부 내부의 상태의 변화가 작아져서 외부 환경(특히 건조 환경)에 대한 영향도 더욱 작아지기 때문에, 본 발명의 바이오센서는 높은 경시적 안정성을 발휘한다. 또한, 반응부(4)의 입자가 미세하고 성분 상호가 치밀하게 연결되어 있기 때문에, 검체 성분과의 반응이 보다 신속하면서도 정량적으로 진행되어 높은 측정 정밀도가 발휘된다.
본 제2발명 바이오센서는 기본적으로는 제1발명 바이오센서의 구조를 가지고 있고, 반응부(4)에 있어서 상기의 4성분계를 채용하는 점에서 상위하다.
상기 친수성 폴리머로서는 예를 들면 다음 내용의 폴리머이다. 우선 친수성이라고 하는 의미는 물 또는 물에 용해하는 적어도 수산기 결합의 지방족 알코올 또는 이것들의 혼합 용매에 대해서 용해 또는 수화해서 팽윤하는 성질을 말한다.
구체적으로는 예를 들면 폴리아크릴산계의 알칼리 금속염 또는 폴리아크릴산계의 알칸올아민염이라든가, 폴리옥시알킬렌계 등을 들 수 있다. 그 중에서도 특히 폴리옥시알킬렌계가 바람직하다. 이것으로서는 예를 들면 고급 지방족 기(소수성)를 한 말단에 가지는 폴리옥시에틸렌알킬(친수성)에테르, 폴리에틸렌글리콜(친수성)의 고급 지방산 에스테르(소수성), 직쇄 옥시알킬렌 세그먼트(친수성)와 알킬기 분지 옥시알킬렌 세그먼트(소수성)를 포함하는 폴리머 등을 들 수 있는데, 그 중에서도 특히 후자인 직쇄 옥시알킬렌 세그먼트와 알킬기 분지 옥시알킬렌 세그먼트를 포함하는 친수성 폴리머(이하 이것을 「A 폴리머」라고 부른다)가 보다 바람직하다.
이들 친수성 폴리머를 채용함으로써, 상기의 친수성 폴리머 혼재의 작용 효과 (높은 경시적 안정성, 높은 측정 정밀도 등)를 더 한층 큰 것으로 한다. 또한, 친수성 폴리머가 보다 명확한 양성을 가짐으로써, 예를 들면 제9항에 기재하는 바이오센서의 제조 중, 특히 (B2)의 반응부용 도포액의 조제 공정을 유효하게 행할 수 있기 때문에 상기의 작용 효과를 촉진할 수 있다. 또한, 상기 전극기판과 반응부용 도포액 사이가 친화적으로 되기 때문에 코팅하기도 쉽고, 각 시트의 밀착성도 향상된다.
따라서, 친수성 폴리머 중, 완전한 친수성 세그먼트만인 경우나, 소수성 세그먼트만인 경우에서는 높은 수준에서의 상기의 장기간 보존 안정성 등의 효과는 얻기 어렵다.
상기 A 폴리머에 있어서 친수성을 발현하는 직쇄 옥시알킬렌 세그먼트와 소수성을 발현하는 알킬기 분지 옥시알킬렌 세그먼트의 결합은 예를 들면 랜덤이거나, 교대로 규칙적으로 결합(블록 구조)하고 있을 수 있는데, 후자인 블록 구조의 것이 보다 바람직하다. 이것은 상기 유닛간의 분자량의 컨트롤이 용이하고, 그것에 의한 친수성과 소수성의 정도도 명확하면서도 용이하게 변경할 수 있기 때문이다.
이 A 폴리머의 양성의 균형은 각 프래그먼트의 분자량과 함유량으로 제어할 수도 있고, 본 발명에서는 제7항에서 규정하는 것이 바람직하다. 즉, 이 친수성 폴리머 중의 알킬기 분지 옥시알킬렌 세그먼트를 평균 분자량으로 말하고, 직쇄 옥시알킬렌 세그먼트를 중량％로 말한다. 구체적으로는, 전자는 바람직하게는 1500 내지 4000, 보다 바람직하게는 2000 내지 3000, 후자는 바람직하게는 30 내지 80중량％, 보다 바람직하게는 40 내지 70중량％이다.
이러한 친수성 폴리머를 이용하면, 형성되는 반응부(4)의 표면이 끈적거리는 느낌이 없는 상태로 형성되는 동시에, 건조 환경에 놓여져도 그 반응부가 매우 건조한 상태로 변화되거나, 그 결과 반응부의 작용에 악영향을 초래한다고 하는 위험성도 없어진다. 즉, 더욱 뛰어난 보존 안정성능이 부여된다.
또한, 상기 직쇄 옥시알킬렌 세그먼트를 형성하는 모노머 성분은 예를 들면 에틸렌옥사이드, 1,3-프로필렌옥사이드, 1,4-부틸렌옥사이드 등의 직쇄 알킬렌옥사이드의 개환 중합 폴리머 유닛이고, 그리고 소수성을 발현하는 알킬기 분지 옥시알킬렌 세그먼트를 형성하는 모노머 성분은 메틸에틸렌옥사이드, 에틸에틸렌옥사이드 등의 알킬기가 분지(측쇄)되어 있는 알킬렌옥사이드의 개환 중합 폴리머 유닛이다.
기본적으로는 상기 4성분을 주로 해서 조성할 수 있는데, 그 경우 각각의 조성 비율을 다음과 같이 하는 것이 보다 유효하다. 산화 환원 효소 0.1 내지 10 중량％, 바람직하게는 0.3 내지 6 중량％, 전자 수용체 20 내지 90 중량％, 바람직하게는 35 내지 86 중량％, 미세 결정 셀룰로오스 1 내지 30 중량％, 바람직하게는 3 내지 20 중량％, 친수성 폴리머 2 내지 40 중량％, 바람직하게는 5 내지 30 중량％이다.
제2발명 바이오센서의 제조 방법
본 발명의 바이오센서는 상기 4성분을 주성분으로 하는 반응부(4)를 가지는 것을 특징으로 하고 있고, 상기 반응부(4)와 다른 구성이 상승적으로 작용해서 비로소 상기의 큰 개선 효과(높은 경시적 안정성, 높은 측정 정밀도 등)가 있다. 이것도 어떠한 제조 수단을 택하더라도 완전히 동일한 수준으로 얻을 수 있다고는 할 수 없다. 특히, 일정 이상의 높은 성능을 가지는 상기 바이오센서를 효율적으로 제조할 수 있는 방법으로서, 제9항에서 제공되는 제조 방법을 들 수 있다.
구체적으로는, 다음의 (A2) 내지 (C2)에 기재된 각 공정을 순차적으로 행하는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제조 방법이다.
(A2) 전기절연 기판(1) 위에 작용전극(21)과 대전극(22)을 평행 근접시켜서 설치하는 전극부(2) 형성 공정,
(B2) 미리 산화 환원 효소, 전자 수용체 및 미세 결정 셀룰로오스 3성분과 양용매를 포함하는 혼합액 Ma를, 상기 3성분에 대해서는 빈용매이지만 상기 친수성 폴리머에 대해서는 양용매인 수성 용매에 용해시킨 상기 친수성 폴리머 용액 Pa 중에 교반하면서 적하하여 분산액을 조제하는 반응부용 도포액의 조제 공정, 및
(C2) 상기 (A2)공정에서 얻어진 전기절연 기판(1) 위의 전극부의 일단에, 상기 (B2)공정에서 얻어진 반응부용 도포액을 도포·건조시켜서 반응부(4)를 형성하는 반응부 형성 공정.
상기의 제조 방법은 각종 생각할 수 있는 방법 중에서, 특히 제8항에서 제공하는 반응부를 형성하기 위해서 코팅하는 도포액이 분산액(또는 현탁액)의 상태에 있는 점에 특징을 가지고 있다.
우선, (A2)의 전극 형성 공정은 전기절연 기판(1) 위에 작용전극(21)과 대전극(22)을 평행 근접시켜서 설치하는 공정이다. 전기절연 기판(1) 위에 전극부(2)를 형성하는 방법은 여러가지 방법을 채용할 수 있지만, 예를 들면 상기 기판(1) 위에 핫 스탬핑, 직접 진공증착, 스퍼터링 등에 의해 전극 패턴을 형성하는 방법, 포토 에칭법에 의해 전극 패턴을 형성하는 방법, 또는 도전성 재료를 가지는 전극 테이프를 상기 기판(1)에 접착하는 방법 등을 들 수 있다.
도전성 재료를 가지는 전극 테이프를 상기 기판(1)에 접착하는 방법의 구체예를 하기에 나타낸다. 얇고 지지성이 있어 내열성이 뛰어난 폴리이미드나 방향족 폴리이미드 등의 플라스틱 전기 절연성 재료 시트 위에, 백금, 금, 팔라듐, 인듐-주석 산화물 등의 도전성 재료를 증착 또는 스퍼터링하고, 그 상기 전기 절연성 재료 시트의 이면에 에틸렌아세트산 비닐 등의 열융착 재료를 코팅한다. 이 다층 시트를 세단해서 테이프상으로 한 것을 전극 테이프로 한다. 그리고, 상기 절연성 기판(1)에 이 전극 테이프를 열접착함으로써 전극부(2)가 형성된다.
또한, 기판(1)으로서 2층 기판을 채용하고 그 위에 전극부(2)를 설치하는 것도 바람직한 양태로서 예시할 수 있다. 상기 기판으로서 바람직한 것은 상기 예시하는 중에서 폴리에스테르계 수지 필름과 폴리이미드 필름을 라미네이트한 2층 기판이다. 이 경우에 대해서 설명하기로 한다.
폴리에스테르계 수지 필름으로서는 예를 들면 PET 필름을 들 수 있고, 그 두께로서는 일반적으로 70 내지 150 ㎛정도이다. 또한, 상기 폴리에스테르계 수지 필름은 그 자체로 기체(基體)로서 사용할 수도 있다. 본 발명에서는 폴리에스테르계 수지 필름에 적층하는 폴리이미드 필름으로서는 일반적으로 두께 20 내지 50 ㎛정도의 (얇은) 방향족 폴리이미드 필름(이하 PI 필름)을 이용할 수 있다.
이 방법에 따르면, 미리 PI 필름 위에 상기 양 전극을 형성해 두고, 접착제로 상기 PI 필름의 이면과 PET 필름을 라미네이트한다. 이것에 의해 일거에 2층 기판과 함께 전극의 형성도 종료한다. 그리고 내열, 내약품성, 각종 물성에 탁월한 전극판으로도 된다고 하는 것이다.
미리 PI 필름에 상기 전극을 형성해 두고, 이것을 PET 필름에 라미네이트하는 이유는 다음에 의한다. PI 필름은 강인하고 고내열성이 있어서 보다 얇은 필름을 대량으로 롤 감음으로 사용할 수 있고, 또한 형성되는 전극의 밀착성도 뛰어남으로써, 스퍼터링법에 의한 전극 형성에 바람직하게 이용할 수 있다. 즉, 보다 장척의 상기 필름이, 롤 대 롤로 보다 장시간 연속 공급할 수 있고, 생산성이 높은, 고품질의 전극판을 쉽게 얻을 수 있기 때문이다.
상기 스퍼터링법으로 사용하는 양전도체로서는 고순도의 백금이 바람직하게 사용된다. 이 경우의 스퍼터링 조건은 아르곤 분위기하, 진공도 1.3 내지 1.3 × 10-2 Pa 정도, 투입전력 0.2 내지 3 kW 정도, 스퍼터링 속도 0.2 내지 3.0 m/분 정도이다.
마스킹에 의한 전극 형성은 다음과 같이 해서 행한다. 예를 들면 소망하는 양 전극 형상이 스트라이프상인 경우는 우선 마스킹재로서 2개의 스트라이프상의 평행 구멍이 뚫어진 마스크용 판을 사용하고, 이것을 연속 공급되는 PI 필름의 상면에 틈없이 접하는 상태로 고정 설치해 둔다. 상기의 속도로 상기 필름의 공급과 동시적으로 스퍼터링을 시작한다. 뚫은 스트라이프상의 창 구멍으로 스퍼터링 백금이 투사되어 연속한 2개의 스트라이프상 전극이 밀착 형성된다. 롤 대 롤로 공급되어 감긴다.
또한, 1회의 스퍼터링으로는 소정 두께의 전극을 얻을 수 없는 경우는 되감으면서 다시 스퍼터링을 반복할 수 있다.
상기 전극의 형성된 PI 필름은 PET 필름에 접착제로 라미네이트한다. 그리고, 도 7에서 설명하는 시료 흡입부(15)와 반응부(4)가 형성되도록, 돌출부(51)를 설치한 스페이서 시트(5)와 외면 커버 시트(6)를 순차 접착제로 접착 적층한다. 물론, 이 외면 커버 시트(6)는 (C2)공정을 거친 후에, 바이오센서의 타단에 설치된 단자부분은 남기고 피복된다.
다음에, (B2)공정의 반응부용 도포액이 조제된다. 상기 공정에서는 우선 산화 환원 효소, 전자 수용체 및 미세 결정 셀룰로오스의 3성분을 상기 조성비 이내에서 양용매 중에 첨가하여 혼합액 Ma가 조제된다.
여기서 양용매란, 상기 3성분이 용해 또는 분산(현탁)되는 물을 포함하는 용매를 말하는데, 구체적으로는 물 또는 물과 혼화하는 저급 1가 지방족 알코올(C3 이하의 알코올 등)의 혼합액을 예시할 수 있다. 또한, 상기 3성분 중, 산화 환원 효소 및 전자 수용체는 상기 양용매에 실질적으로 용해되어 있지만, 미세 결정 셀룰로오스는 분산 상태 또는 현탁 상태일 수 있다.
혼합액 Ma의 조제 방법은 3성분을 상기 양용매에 동시에 첨가하고, 상온에서 교반할 수 있다. 또는, 우선 미세 결정 셀룰로오스를 물(증류수)에 현탁시켜 두고(약 4 내지 7 중량％ 정도의 저농도로 하고 호모지나이저를 사용해서 현탁하는 것이 좋다), 이 중에 나머지 2성분을 첨가해서 교반한다고 하는 순차적 방법도 채용할 수 있다.
한편, 별도 친수성 폴리머의 용액 Pa가 조제된다. 용액 Pa에 사용하는 용매는 친수성 폴리머 자신에 대해서는 거의 완전히 용해되는 용매(양용매)이지만, 상기 3성분에 대해서는 난용 내지 실질적으로 불용성인 용매(빈용매)인 용매(이하, 「특정 용매」라고도 부른다)이다.
이 「특정 용매」로서는 예를 들면 C4 이상의 1가 지방족 알코올, 2 내지 3가의 고급 지방족 다가 알코올 또는 상기 다가 알코올의 수산기의 1개 이상이 알킬기 치환된 다가 알코올을 들 수 있다. 이 중에서도 1개의 수산기를 알킬기 치환한 2가의 지방족 알코올이 바람직하고, 구체적으로는 예를 들면 에틸렌글리콜의 모노 메틸 또는 모노에틸에테르이다. 물론, 용해성이나 분산성을 컨트롤하는 의미로 이들 유기용매 중에서 2종 이상을 혼합해서 조정할 수도 있다.
그리고, 상기 3성분 용해의 수성 혼합액 Ma가, 상기 친수성 폴리머 용액 Pa 중에 교반하에서 적하된다. 이 교반도 그다지 격렬하게 하는 것이 아니라 조용히 행하고, 그리고 적하도 일정량을 일정 시간 요해서 천천히 적하하도록 하는 것이 좋다. 이것에 의해 입경이 균일하고 미세한 결정 입자의 생성이 가능해진다. 이러한 특별한 혼합 수단은 특히 반응부용 도포액을 조제하는데 유효하다.
또는 수성 혼합액 Ma 중에, 미리 3성분에 가해서 친수성 폴리머도 혼합시켜 두고, 상기의 「특정 용매」만을 적하 혼합할 수 있다. 또는 상기 수성 용액 Ma 중에 친수성 폴리머 용액 Pa를 적하 혼합한다고 하는 수순을 택할 수 있다. 그렇지만 상기 (B2)공정의 수순쪽이 보다 바람직한 반응부(4)를 형성할 수 있다.
본 발명에서는 4성분을 포함하는 반응부용 도포액이 분산액인 점에 특징을 가지고 있다. 본래 상기 3성분은 결정성의 미분체이기 때문에, 도포 후 건조시켜 막을 형성한 시점에서는 각각 원래의 결정 입자가 되어 혼합 분산되어 있다. 그러나, 각 입자의 크기는 대소 다양하고 불균일하게 혼합 분산되어 있기 때문에, 이것이 각 성분의 상호간의 연결을 나쁘게 하여 경시적 안정성이 떨어지는 원인이 되고 있다.
그렇지만, 4성분을 포함하는 반응부용 도포액은 「수성 용매」를 포함하는 친수성 폴리머 중에서 석출시킨 분산액(현탁액)의 상태이다. 게다가, 이 분산(현탁)상태에 있는 입자가 동일한 입경으로 초미세립이 되어 있다. 이러한 도포액이 도포·건조되어 반응부(4)로서 형성되면, 이 입자는 친수성 폴리머를 통해서 분산 상태가 유지된다. 이러한 상태로 형성되는 상기 반응부에서는 검체와의 반응도 신속하고, 또한 주위의 환경 등에도 영향을 받지 않고 장기간 안정을 계속해서 유지한다.
다음의 (C2)의 반응부 형성 공정에서는 상기 (B2)공정에서 얻어진 전극 형성판의 전극부(2)의 일단에, 반응부용 도포액의 소정량을 적하해서 도포하고 건조시켜 막이 형성된다. 이 막은 작용전극(21)과 대전극(22)에 걸쳐서 고착되어 반응부(4)로서 기능한다.
구체적으로는, 상기 「I. 제1발명 바이오센서」의 「(C1)의 반응부 형성 공정」과 동일하게 해서 실시된다.
이상의 (A2) 내지 (C2)의 공정을 거쳐서 소망하는 바이오센서를 얻을 수 있는데, 마지막에는 바이오센서 칩으로서 컷 가공해서 전공정이 종료된다.
이렇게 해서 얻어지는 본 발명의 제1발명 바이오센서 및 제2발명 바이오센서는 각종 시료액 중의 특정 성분의 정량에 이용된다. 구체적으로는, 시료액 중의 글루코오스 성분, 알코올 성분, 락트산 성분 또는 요산 성분 등이 편차 없이 고정밀도로 측정된다. 어느 것이나 공지의 바이오센서의 측정 방법을 이용할 수 있다. 특히, 시료액 중의 글루코오스 성분을 측정하는 경우는 실시예 3에 기재된 방법을 이용해서 바람직하게 측정된다.
III. 제3발명 바이오센서
상기에 있어서 바이오센서의 반응부(4)에 특징을 가지는 제1발명 및 제2발명 바이오센서에 대해서 상술했다. 다음으로, 도 7 내지 도 9를 참조하면서 바이오센서의 액체 시료 흡입부의 형상에 특징을 가지는 제3발명 바이오센서에 대해서 상세하게 설명한다. 또한, 제3발명 바이오센서의 반응부(4)는 상기의 제1발명 바이오센서 또는 제2발명 바이오센서에서 기재한 조성을 채용할 수 있다.
도 7 및 도 8에 있어서, 본 실시형태의 전기절연 기판(1)은 장판(長板) 형상으로 형성되고, 그 선단부는 거의 반원형상으로 형성되어 있다. 상기 기판(1) 위에 배치된 전극부(2)는 기판(1)의 길이방향에 따라 거의 평행하게 배치된 작용전극(21)과 대전극(22)으로 구성되어 있다. 본 실시형태에서는 소정의 폴리이미드 필름에 백금막을 스퍼터링 증착한 2개의 전극 필름을 0.5 mm정도의 간격으로 기판(1) 위에 접착제로 점착해서 전극부(2)를 구성하고 있다.
상기 전극부(2)를 부분적으로 피복하기 위해서 기판(1) 위에 적층된 전기 절연성의 마스크 시트(3)가 있다. 이 마스크 시트(3)는 거의 반원형상을 이루는 선단부측에 거의 타원형상(또는 직사각형상)의 반응부용 셀(창)(31)을 구비하고, 이 반응부용 셀(31)에 의해 전극부(2)의 선단측을 노출시키고 있다. 또한, 마스크 시트(3)는 기판(1)의 후단측에는 적층되어 있지 않고, 전극부(2)의 후단측을 노출시키고 있다. 이렇게 해서 전극부(2)의 선단측의 노출 부분이 다음에 기술하는 반응부(4)와 액체 시료의 효소 반응에 의한 전기화학 변화를 검출하기 위한 검출부가 되고, 또한, 전극부(2)의 후단측의 노출 부분이 측정 장치에 접속하기 위한 접속 단자가 되어 있다. 본 실시형태에서는 선단부가 거의 반원형상을 이루는 핫멜트 필름을 마스크 시트(3)로서 기판(1) 위에 열압착해서 적층하고 있다.
상기 마스크 시트(3)의 반응부용 셀(31) 안에 있어서 전극부(2)의 검출부 위에 배치된 반응부(4)는 측정해야 할 액체 시료의 특정 성분과 반응하는 효소와, 효소반응시의 전자를 수여하는 전자 수여체로 구성되어 있다. 반응부(4)의 구성은 전술한 대로이다.
상기 마스크 시트(3)의 선단의 거의 반원형상 부분을 제외하고 마스크 시트(3) 위에 배치된 전기 절연성 스페이서 시트(5)의 선단 가장자리에는 그 폭방향의 한 쪽에 센서 선단측으로 돌출되는 돌출부(51)가 형성되오 있고, 돌출부(51)의 근본 부분에 입우부(52)가 형성되어 있다. 본 실시형태에서는 양면에 점착층을 구비한 PET계 필름을 스페이서 시트(5)로서 마스크 시트(3) 위에 적층하고 있다.
상기 스페이서 시트(5) 위에 배치된 전기 절연성 커버 시트(6)의 선단부는 상기 기판(1)의 선단부보다도 약간 작은 거의 반원형상으로 형성되어 있다. 이 커버 시트(6)의 반원형상 부분에 있어서 커버 시트(6)와 기판(1)이 스페이서 시트(5)에 의해 소정 간격을 두고 대향 배치되어 있다. 이것에 의해 센서 선단측에 있어서 기판(1) 위의 마스크 시트(3) 및 반응부(4)의 상면과, 커버 시트(6)의 하면과, 스페이서 시트(5)의 선단 가장자리에 의해 둘러싸인 보류공간부(S)가 형성되어 있다. 본 실시형태에서는 투명한 PET계 필름을 커버 시트(6)로서 스페이서 시트(5)의 상면에 적층하고 있다.
이상과 같이 구성된 바이오센서(10)를 이용해서 액체 시료를 측정할 때는 우선 바이오센서(10)를 그 후단부에서 측정 장치에 부착한 후, 측정해야 할 액체 시료를 바이오센서(10)의 선단의 시료 흡입부(15)에 접촉시키고, 액체 시료를 모세관 현상을 이용해서 보류공간부(S) 내로 도입한다. 그리고, 보류공간부(S) 내에서 액체 시료의 특정 성분과 반응부(4)를 효소반응시키고, 그 때의 전기화학 변화를 전극부(2)에서 검출해서 액체 시료 중의 특정 성분을 측정 장치로 측정한다.
이 바이오센서(10)는 스페이서 시트(5)의 선단 가장자리의 한 쪽에 돌출부(51)를 형성하고 있으므로, 모세관 현상에 의해 센서 선단의 시료 흡입부(15)로 유입된 액체 시료를 최초로 돌출부(51)에 접촉시킬 수 있다. 그리고, 돌출부(51)의 젖음성을 이용해서 돌출부(51)에서 모세관 현상에 의한 액체 시료의 도입을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 도 9에 나타내는 바와 같이 센서 선단의 시료 흡입부(15)측으로 유입된 액체 시료의 앞 가장자리(F)가 돌출부(51)에 접촉한 후에는, 이 액체 시료를 돌출부(51)의 측면을 따라 한 쪽에서 우선적으로 유입시킬 수 있고, 보류공간부(S)의 기체를 돌출부(51)의 반대측으로 배출하면서(도 3 중의 화살표 C 참조), 액체 시료를 보류공간부(S)의 전체에 원활하게 도입할 수 있다.
더욱이, 기체가 돌출부(51)의 반대측으로 배출될 때에는 이 배출 기류(C)에 의해 액체 시료가 돌출부(51) 이외의 부분에 있어서도 스페이서 시트(5)와 접촉하여 기포를 만들어 버리는 것을 막을 수 있고, 보류공간부(S)에 절대로 기포를 남기지 않고서 액체 시료를 도입할 수 있는 것이다.
또한, 바이오센서(10)는 돌출부(51)의 도입 촉진 작용에 의해 돌출부(51)를 따라 한 쪽에서 액체 시료를 도입할 수 있으므로, 보류공간부(S) 안쪽의 스페이서 시트(5)에 입우부(52)가 형성되어 있어도 이 입우부(52)에 기포를 남기지 않는다. 따라서, 바이오센서(10)에 따르면 종래와 같이 기포 잔존 때문에 입우부의 형성이 제한되지 않고, 입우부의 형성에 의해 용이하게 보류공간부(S)의 용량 확대를 꾀할 수 있다.
또한, 바이오센서(10)는 센서 선단의 시료 흡입부(15)측으로 돌출하는 돌출부(51)에 의해 커버 시트(6)를 지지할 수 있으므로, 기판(1)과 커버 시트(6)의 설정 간격을 안정적으로 유지할 수 있다. 따라서, 예를 들면 온도 변화나 외력 등에 의해 커버 시트(6) 등이 변형되어 버리는 것을 막을 수 있고, 액체 시료를 규정량대로 보류공간부(S)로 도입할 수 있어 측정 오차가 적은 정확한 측정이 가능해진다.
이하, 비교예와 함께 실시예를 이용해서 본 발명을 보다 상세하게 설명하는 데, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것이 아니다.
I. 제1발명 바이오센서
우선, 실시예에 있어서의 측정 원리를 설명한다.
실시예에 있어서의 측정계는 1회용의 센서 칩과 측정기 본체로 구성되고, 효소 전극법을 이용했다.
본 측정의 반응은 하기의 식으로 나타내어진다.
혈액 중의 글루코오스가 글루코오스 산화효소(GOD)에 의해 산화되어 글루코노락톤이 생성된다. 이 때 수용체인 헥사시아노철(III)칼륨(페리시안화칼륨)은 환원되고, 헥사시아노철(II)(페로시안화) 이온이 생성된다. 페로시안화 이온은 통전된 백금 전극 근방에서 페리시안화 이온으로 산화되어 전자가 발생한다. 이 발생 전자를 전류값으로 하여 글루코오스 농도로 환산한다.
실시예 1
(a) 센서 구조부재의 준비
폴리이미드 시트 위에 백금을 스퍼터링했다. 상기 폴리이미드 시트의 이면에 열융착 재료인 에틸렌아세트산 비닐(EVA)을 코팅했다. 상기 다층 시트를 세단해서 테이프상으로 했다. 이것을 백금 전극 테이프로 한다. 폴리에스테르계의 핫멜트 접착제 시트에, 센서 칩 반응부의 전극 면적을 규제하는 빈 구멍(반응부용 셀)을 뚫어서 마스크 시트로 했다. 절연성 재료인 백색 PET 시트에 백금 전극 테이프, 마스크 시트를 열접착했다. PET 층(두께 100 ㎛)의 양면에 아크릴계 점착제층(두께 25 ㎛)을 가지는 양면 점착성 시트에 시료 흡입실을 설치하도록 하는 빈 구멍을 뚫어서 스페이서 시트를 만들었다.
(b) 반응부용 도포액의 조제
세오라스 크림(아사히화성제 세오라스 크림 FP-03, 결정 셀룰로오스 10 중량％) 100 g을 증류수 150 g에 가하고, 호모지나이저로 10000 rpm, 15분간 교반했다. 이것을 세오라스 크림 희석액으로 한다.
글루코오스 옥시다제(도요방적제, 활성 165 유닛(u)/㎎) 2.44 g 및 페리시안화칼륨(나카라이테스크제, 특급) 40 g을 상기 세오라스 크림 희석액에 가하고, 마그네틱 스터러로 500 rpm, 15분간 교반했다. 이것을 A 액으로 한다.
에틸렌글리콜모노에틸에테르(나카라이테스크제, 특급) 100 mL를 마그네틱 스터러로 500 rpm으로 교반하면서, 상기 A 액 100 mL를 조용히 적하한다. A 액 전량을 적하하고 나서 5분간 교반했다. 이것을 B 액으로 한다. 이렇게 해서 얻어진 B 액을 반응부용 도포액으로 한다.
(c) 반응부용 도포액의 도포건조
(a)의 전극 테이프 및 마스크 시트를 접합한 베이스 시트 위의 마스크 시트 반응부용 셀에 피펫을 이용하여 (b)에서 얻어진 반응부용 도포액을 1 μL 도포했다.
상기 베이스 시트를 1O분간 오븐에 넣어 건조시킨다. 건조 후 반응부가 형성되었다.
(d) 센서 칩 형성
(c)에서 얻어진 베이스 시트 위에, (a)에서 얻어진 스페이서 시트, 커버 시트의 순서로 접합했다. 센서 칩 형상으로 구멍을 뚫고, 센서 칩을 10개 형성했다. 그 반응부 표면 상태의 전자 현미경 사진을 도 4에 나타낸다. 또한, 도 4로 나타내어지는 반응부 단면의 모식도를 도 2(b)에 나타낸다.
(e) 측정
상기 (d)에서 얻어진 센서 칩을 이용해서 다음과 같은 측정을 했다.
센서 칩의 반응부가 샘플액에 용해되었을 때 흐르는 유도 전류를 측정하여 센서 칩의 용해성을 평가했다. 즉, 10개의 센서 칩에 대해서 패러데이 전류값을 측정하여 용해성을 평가한 바, 평균 160.1이었다(표 1, 도 5).
또한, 센서 출력을 조사한 바, 측정 시간(20초)에서의 글루코오스 농도 100 ㎎/dL에 있어서의 출력 감도는 154.7이었다(표 2, 도 6).
센서 칩 개체간의 출력 편차에 대해서 측정한 바, CV 값은 3％였다(표 2, 도 6). 여기에서 말하는 CY 값은 (센서 출력의 표준 편차값/센서 출력의 평균치)×100의 값이다.
비교예 1
실시예 1과 같이 용액 A를 만들었다. 이 용액 A를 반응부 도포액으로 하는 것 이외에는 실시예 1과 같이 센서 칩을 10개 형성했다. 그 반응부 표면 상태의 전자 현미경 사진을 도 3에 나타낸다. 또한, 도 3으로 나타내어지는 반응부 단면의 모식도를 도 2(a)에 나타낸다.
실시예 1과 같이 패러데이 전류값을 측정함으로써, 10개의 센서 칩에 대해서 용해성을 평가한 바, 평균 17.6이었다(표 1, 도 5).
측정 시간 30초에서의 글루코오스 농도 100 ㎎/dL에 있어서의 출력 감도는 99.2였다(표 2, 도 6).
센서 칩 개체간의 출력 편차에 대해서 측정한 바, CY 값은 10％였다(표 2, 도 6).
도 5에서 알 수 있는 바와 같이 실시예 1의 센서 칩은 비교예 1의 센서 칩에 비해서 반응부의 용해도가 대단히 크다.
또한, 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1에 있어서의 센서 칩은 비교예 1의 것에 비해서 센서 출력이 더욱 크고, 보다 신뢰성이 높은 센서 칩인 것을 알 수 있다. 또한, 실시예 1에 있어서의 센서 칩에 있어서의 출력의 편차는 비교예 1의 것보다도 작았다.
패러데이 전류값의 비교
실시예 1 비교예 1
12345678910 156155159168152155166170162158 12192518152016181716
평균값CV 값(％)표준 편차MAXMIN 160.103.836.14170152 17.6019.723.472512
최대-평균평균-최소 9.908.10 7.405.60
센서 출력의 비교
실시예 1 비교예 1
12345678910 156149159151152155148160162155 94114100891041011059283110
평균값CV 값(％)표준 편차MAXMIN 154.703.054.72162148 99.209.759.6711483
최대-평균평균-최소 7.306.70 14.8016.20
II. 제2발명 바이오센서
여기서의 실시예는 본 바이오센서의 제조 방법의 바람직한 형태로서 제공하는, 제9항의 기재에 따라 구체적으로 설명하기로 한다.
실시예 2
우선 (A2)의 전극 형성 공정은 다음 내용으로 실시했다.
다음과 같은 사양으로 도 7에 나타내는 구조의 100개의 효소 센서를 제작했다.
즉, 두께 25 ㎛의 폴리이미드 필름 위에, 두꺼운 0.06 ㎛, 크기 1×35 mm, 간격 1 mm로, 작용전극(21)과 대전극(22)을 백금의 스퍼터링에 의해 형성하고, 이것을 두께 250 ㎛의 백색 PET 필름(1)에 접착제로 라미네이트해서 적층했다. 다음에 이 양 전극 형성면에 일단은 단자(21a, 22a)로서 남기고, 다른 일단은 양극에 걸치는 크기의 직사각형의 창(반응부용 셀(31))(1.5×5 mm)(반응부(4)가 되는 방) 및 이 창에 통하는 검체 흡입로용의 시료 흡입부(15)를 설치한, 두께 100 ㎛의 PET 필름(전기 절연 스페이서 시트(5))을 접착제로 적층했다.
한편, (B2)의 반응부용 도포액의 조제 공정은 다음 내용으로 실시했다.
우선 사용한 4 주성분은 다음의 것이었다.
● 산화 환원 효소: 글루코오스 옥시다제(도요방적주식회사제 활성 165 유닛(u)/mg) 2.44 g(이하 실험 효소라고 부른다)
● 전자 수용체: 순 페리시안화칼륨(주식회사 나카라이테스크제) 40 g(이하 실험 전수체라고 부른다)
● 미세 결정 셀룰로오스 현탁액: 세오라스 크림(아사히화성공업 주식회사제 FP-03으로 결정 셀룰로오스 10 중량％) 100 g과 150 ㎖의 증류수의 현탁액(이하 실험 셀룰로오스 액이라고 부른다)
● 친수성 폴리머 용액: 산화 에틸렌과 산화 프로필렌에 의한 블록 폴리머로, 옥시프로필렌글리콜 유닛의 평균 분자량 약 2050, 전체 분자 중의 산화 에틸렌 함량 약 50 중량％를 포함하고, 외관(20℃)은 페이스트상. 상기 폴리머의 7.5 g을 100 ㎖의 에틸렌글리콜모노에틸에테르에 균일 용해시킨 것(이하 실험 친수성 폴리머 용액 Pa라고 부른다)
그리고 상기의 실험 효소와 실험 전수체를 실험 셀룰로오스 액에 첨가해서 3성분의 혼합액을 얻었다. 이것을 혼합액 Ma라고 부른다.
다음에, 교반 상태에 있는 상기 실험 친수성 폴리머 용액 Pa중에, 혼합액 Ma를 조용히 적하하고, 전량 적하종료하면 그대로 5분간 교반을 계속해서 정지했다. 전체는 미립자의 석출로 현탁상의 수성액으로 변화되었다. 이하 이것을 반응부용 도포액으로 한다.
마지막으로 (C2)의 반응부 형성 공정으로 옮겨 반응부(4)를 형성하고 소망하는 100개의 바이오센서로 마무리했다.
즉, 상기 (A2)공정에서 얻은 백금 전극 형성판에 설치한 직사각형의 반응부용 셀(31)에, 상기의 반응부용 도포액을 피펫으로 1 μL를 천천히 적하하고 건조시켜 반응부막(상기 막면은 끈적거림은 없다)을 고착시켰다. 마지막으로, 이 위를 PET 필름으로 상기 단자(21a, 22a)를 남기고, 접착제(반응부와 시약 흡입부에 상당하는 부분에는 사용하지 않음)로 외면 커버 시트(6)를 점착 적층하고, 칩상으로 잘라서 소망하는 100개의 효소 센서 칩을 얻었다.
비교예 2
실시예 2에 있어서 친수성 폴리머를 사용하지 않는 것 이외에는 완전히 동일조건으로 실시했다. 즉, 우선 비교용의 반응부용 도포액(외관상은 실시예 2와 같은 상태의 수성액)을 조제하고, 이것을 백금 전극 형성판의 반응부용 셀(31)에 도포해서 반응부막으로 만들어 100개의 비교용의 효소 센서 칩을 얻었다.
실시예 3
실시예 2, 비교예 2에서 얻은 각 효소 센서 칩 20개(랜덤 발취)를 이용하여, 그 양 단자(21a, 22a)를 효소 센서 측정기에 연결하고, 다음 조건으로 각 주사전위에 대한 전류를 측정했다.
우선, 검체로서 농도 100 mg/dL의 글루코오스 수용액을 사용했다. 각 효소 센서 칩은 5일간 보존한 10개와 40일간 보존한 10개를 사용했다. 그리고 각 10개의 상기 칩의 흡입구로 상기 검체 5 μL를 주입하고 8초 경과하면, 즉시 주사속도 50 mv/s로 0 v → -0.2 v → +0.2 v의 경위로 전위를 연속적으로 바꾸면서 인가하고, 그 때 발생하는 전류를 측정했다. 각각의 경우의 인가전위에 대한 전류에 기초하는 출력 감도를 구했다. 각 10개의 상기 감도를 평균해서 구하여 표 3에 나타냈다.
또한, 상기 출력 감도는 인가전위 -0.2 v → +0.2 v간에서의 전류값의 적분값(적산전류값)이다. 이 수치는 반응부에서의 검체의 반응변위가 신속하고 확실하게 전극에 받아들여지는 효율을 아는 지표가 되고, 따라서 클수록 반응변위의 전부가 받아들여지게 된다. 일반적으로 검체 성분과 반응부의 반응성도 그럴 만하지만, 가능한 한 반응변위의 전부가 전극에 받아들여지는 것도, 측정 정밀도상에서 극히 중요해진다.
5일 40일
실시예 2 128 127
비교예 2 92 81
다음에, 남는 상기 효소 센서 칩 중에서 35개를 뽑아서(랜덤) 상기 검체를 사용하여 다음 조건으로 측정하고, 각 경과일에 대한 발생 출력을 측정하고 출력 변화를 구해서 그것을 도 10의 그래프로 나타냈다.
우선, 35개의 상기 센서 칩을 건조제가 든 상온의 보존 용기 중에, 1일 내지 60일간 방치했다. 이 용기 중에서 각 경과일째에 5개씩 꺼내어 그 각 5개에 상기 검체 5 μL를 주입하고, 상기 실시예 1과 같은 측정 조건으로 발생 출력을 측정했다. 그리고, 각 경과일의 상기 센서 칩의 발생 출력(5개의 발생 출력값의 평균치)을, 1일 경과한 상기 센서 칩의 발생 출력(5개의 출력 평균)으로 나누어 출력 변화로 했다.
상기 도에서 실 2가 실시예 2, 비 2가 비교예 2이며, 실 2에서는 출력의 변화가 작은 것을 알 수 있다. 또한, 비교예 2에 대해서는 실시예 2와의 사이에서 현저한 차이가 나타났으므로 36일까지로 했다.
또한, 상기 각 경과일에서 측정한 상기 센서 칩 5개의 출력의 편차로부터 CV 값(％)을 구하고, 각 경과일에 대한 CV 값도 도 8의 그래프에 나타냈다. 상기 도에서 실 cv가 실시예 2에, 비 cv가 비교예 2에 대응하고 있다.
또한 CV 값은 각 경과일에서 측정한 5개의 센서 칩의 편차로부터 표준 편차값을 구하고, 이것을 평균값 전류로 나눈 값에 100을 곱한 것이다.
이상의 실험 결과에서도 증명되는 바와 같이 실시예 2는 비교예 2에 비해서 제품간 편차도 더 작고, 장기간의 보존 안정성이 뛰어난 것을 알 수 있다.
제1발명 바이오센서에 따르면 석출법에 의해 제조되는 현탁상의 반응용 도포액을 이용해서 반응부가 형성되기 때문에, 센서 칩 반응부의 시료에의 용해성이 현격히 커지고, 상기 석출법을 이용하지 않고 만든 종래의 바이오센서에 비해서 바이오센서간의 편차가 없고 측정 정밀도가 대폭 향상되었다. 또한, 시료에의 용해성향상에 의해 측정 시간을 단축할 수 있다.
제2발명 바이오센서에 따르면 바이오센서의 보존이 더 장기간에 이르더라도, 거의 검체 성분과의 반응성에 변화가 없고, 보다 높은 정밀도로 측정할 수도 있게 되었다. 이것에 의해 바이오센서의 생산 관리, 재고 관리도 하기 쉽고, 또 사용자의 취급도 용이해졌다. 또한, 검체와의 반응에 의한 결과를 더욱 확실하고 효율적으로 측정할 수 있으므로, 보다 정밀도가 높은 바이오센서를 제조할 수 있게 되었다.
또한, 본 발명에 따른 바이오센서는 그 시료 흡입부의 구조에도 특징을 가지고, 보류공간부 안쪽의 한 쪽에 형성된 돌출부에 의해 모세관 현상에 의한 액체 시료의 도입을 보류공간부의 한 쪽에서 촉진시킬 수 있으므로, 종래와 같이 보류공간부 내의 안쪽에 기체를 빼내기 위한 배기구를 설치할 필요가 없고, 대단히 간소한 구성으로 보류공간부에 기포를 남기지 않고 원활하게 액체 시료를 도입할 수 있다.

Claims (11)

  1. (A1) 전기절연 기판(1) 위에 작용전극(1)과 대전극(2)을 평행 근접시켜서 설치하는 전극부(2) 형성 공정,
    (B1) 미리 산화 환원 효소, 전자 수용체 및 미세 결정 셀룰로오스 3성분과 양용매를 포함하는 혼합액 A를, 빈용매에 교반하면서 적하하여 분산액 B를 조제하는 반응부용 도포액의 조제 공정, 및
    (C1) 상기 (A1)공정에서 얻어진 전기절연 기판(1) 위의 전극부(2)의 일단에 상기 (B1)공정에서 얻어진 반응부용 도포액을 도포·건조시켜서 반응부(4)를 형성하는 반응부 형성 공정을 순차적으로 행하는 것을 특징으로 하는, 전기절연 기판(1), 상기 기판 위에 설치된 작용전극(21)과 대전극(22)을 가지는 전극부(2), 및 상기 전극부(2)의 일단에 고착되는 산화 환원 효소, 전자 수용체 및 미세 결정 셀룰로오스 분체를 포함하는 반응부(4)를 구비한 바이오센서의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 전극이 백금, 금, 팔라듐, 및 인듐-주석 산화물로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상으로 이루어지는 것인 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 기재된 제조 방법에 의해 제조된 바이오센서.
  4. 제3항에 기재된 바이오센서를 이용하여 시료액 중의 글루코오스 성분, 알코올 성분, 락트산 성분 또는 요산 성분을 측정하는 방법.
  5. 전기절연 기판(1), 상기 기판 위에 설치된 작용전극(21)과 대전극(22)을 가지는 전극부(2), 및 상기 전극부(2)의 일단에 고착되는 반응부(4)를 구비한 바이오센서로서, 상기 반응부(4)가 산화 환원 효소, 전자 수용체, 미세 결정 셀룰로오스 분체, 및 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트로 구성되어 있는 친수성 폴리머를 주성분으로 하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  6. 제5항에 있어서, 상기 친수성 폴리머가 직쇄 옥시알킬렌 세그먼트와 알킬기 분지 옥시알킬렌 세그먼트로 이루어지는 것인 바이오센서.
  7. 제6항에 있어서, 상기 친수성 폴리머 중의 알킬기 분지 옥시알킬렌 세그먼트의 평균 분자량이 1500 내지 4000이고, 전체 분자 중의 직쇄 옥시알킬렌 세그먼트가 30 내지 80 중량％인 바이오센서.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응부(4)가 산화 환원 효소, 전자 수용체, 미세 결정 셀룰로오스, 및 친수성 세그먼트와 소수성 세그먼트로 구성되어 있는 친수성 폴리머를 포함하는 분산액의 코팅에 의해 형성되는 것인 바이오센서.
  9. (A2) 전기절연 기판(1) 위에 작용전극(21)과 대전극(22)을 평행 근접시켜서 설치하는 전극부(2) 형성 공정,
    (B2) 미리 산화 환원 효소, 전자 수용체 및 미세 결정 셀룰로오스 3성분과 양용매를 포함하는 혼합액 Ma를, 상기 3성분에 대해서는 빈용매이지만 상기 친수성 폴리머에 대해서는 양용매인 용매에 용해시킨 상기 친수성 폴리머 용액 Pa 중에 교반하면서 적하하여 분산액을 조제하는 반응부용 도포액의 조제 공정, 및
    (C2) 상기 (A2)공정에서 얻어진 전기절연 기판(1) 위의 전극부의 일단에, 상기 (B2)공정에서 얻어진 반응부용 도포액을 도포·건조시켜서 반응부(4)를 형성하는 반응부 형성 공정을 순차적으로 행하는 것을 특징으로 하는, 제8항에 기재된 바이오센서의 제조 방법.
  10. 선단부에 있어서 전기절연 기판(1)과 커버 시트(6)가 스페이서 시트(5)에 의해 간격을 두고 대향 배치되어, 상기 기판과 상기 커버 시트와 상기 스페이서 시트의 선단 가장자리에 의해 형성된 보류공간부(S)에, 산화 환원 효소를 포함하는 반응부(4)를 구비하고,
    액체 시료를 센서 선단측에서 상기 보류공간부 내로 모세관 현상을 이용하여 도입하고, 상기 액체 시료와 상기 반응부(4)의 효소반응에 의한 전기화학 변화를 작용전극(21)과 대전극(22)을 포함하는 전극부(2)에서 검출하며,
    상기 보류공간부(S)에 있어서, 상기 스페이서 시트의 선단 가장자리의 한 쪽에 센서 선단측으로 돌출되는 돌출부(51)를 형성한 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  11. 제10항에 있어서, 상기 스페이서 시트의 선단 가장자리에 입우부(入隅部)(52)가 형성되는 바이오센서.
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