KR20050049467A - 응답 세포, 조직 및 기관을 보호, 회복 및 향상시키기위한 조직 보호 사이토카인 - Google Patents

응답 세포, 조직 및 기관을 보호, 회복 및 향상시키기위한 조직 보호 사이토카인 Download PDF

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세라미안토니
세라미칼라
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Abstract

조직 보호 사이토카인을 포함하는 조성물의 전신 또는 국부 투여에 의해, 염증을 나타내거나 염증에 관련된 응답 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위를 보호하거나 향상시킴으로써, 염증을 갖는 포유동물을 치료하는 방법 및 조성물이 제공된다. 본 발명은 또한 본 발명의 조직 보호 사이토카인을 포함하는 조성물을 투여하고, 하나 이상의 소염제 또는 하나 이상의 면역조절제를 투여함을 포함하는 조합 치료도 포함한다.

Description

응답 세포, 조직 및 기관을 보호, 회복 및 향상시키기 위한 조직 보호 사이토카인{TISSUE PROTECTIVE CYTOKINES FOR THE PROTECTION, RESTORATION, AND ENHANCEMENT OF RESPONSIVE CELLS, TISSUES, AND ORGANS}
수년동안, 에리트로포이에틴(erythropoietin)의 유일한 명백한 생리학적 역할은 적혈구 세포의 생성을 조절하는 것이었다. 최근, 몇 가지 계열의 증거에 의해, 사이토카인 상과(superfamily)의 일원으로서의 에리트로포이에틴이 에리트로포이에틴 수용체(에리트로포이에틴-R)와의 상호작용을 통해 매개될 수 있는 다른 중요한 생리 기능을 수행함이 암시되고 있다. 이러한 작용은 마이토지네시스(mitogenesis), 평활근 세포 및 신경 세포로의 칼슘 유입 조절, 적혈구 생성, 혈소판의 과활성화, 혈소판 생성 및 중간 대사에 대한 효과를 포함한다. 에리트로포이에틴이 세포의 저산소성 환경을 개선시킬뿐만 아니라 대사 스트레스에 의해 야기되는 프로그래밍된 세포 사멸을 조절하는 역할을 하는 보상 반응(compensatory response)을 제공하는 것으로 생각된다. 연구 결과, 두개내로 주사된 에리트로포이에틴이 저산소성 신경 손상으로부터 신경 세포를 보호하는 것으로 밝혀졌지만, 두개내 투여는 치료 용도의 경우, 특히 보통의 환자에게는 비현실적이고 허용불가능한 투여 경로이다. 뿐만 아니라, 에리트로포이에틴을 투여받은 빈혈 환자에 대한 이전의 연구에서는 말초 혈관에 투여된 에리트로포이에틴이 뇌로 수송되지 않는 것으로 결론을 내렸다(마티(Marti) 등, 1997, Kidney Int. 51:416-8; 쥴(Juul) 둥, 1999, Pediatr. Res. 46:543-547; 부에미(Buemi) 등, 2000, Nephrol. Dial. Transplant. 15:422-433).
미국 특허 제 5,457,089 호 및 제 4,835,260 호에 기재되어 있는 카복시 말단에 변화된 아미노산을 갖는 것; 미국 특허 제 5,856,298 호에 기재되어 있는 것과 같은 분자 1개당 다양한 수의 시알산 잔기를 갖는 에리트로포이에틴 이소폼(isoform); 미국 특허 제 4,703,008 호에 기재되어 있는 폴리펩타이드; 미국 특허 제 5,767,078 호에 기재되어 있는 작용제; 미국 특허 제 5,773,569 호 및 제 5,830,851 호에 기재되어 있는, 에리트로포이에틴 수용체에 결합하는 펩타이드; 및 미국 특허 제 5,835,382 호에 기재되어 있는 소분자 의사 화합물(small molecule mimetic) 등의, 분자의 적혈구 조혈 활성을 개선시키고자 하는 활성을 갖는 에리트로포이에틴의 다양한 개질된 형태가 기재되어 있다.
본 발명은 에리트로포이에틴의 화학적 개질에 의해 생성된 조직 보호 사이토카인, 및 에리트로포이에틴-응답 세포 및 이에 결합된 세포, 조직 및 기관을 원위치에서(in situ) 및 생체 외에서 보호, 유지, 향상 또는 회복시키거나, 혈관으로부터 먼 에리트로포이에틴-응답 세포 및 이에 결합된 세포, 조직 및 기관을 보호 및 향상시킬 목적으로 내피 세포 장벽을 가로질러 조직 보호 사이토카인을 전달하거나, 또는 내피 세포 장벽을 가로질러 결합된 분자를 옮기기 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 본원에 참고로 인용된, 2002년 7월 3일자로 출원된 미국 특허원 제 10/188,905 호에 기초한 우선권을 주장한다.
발명의 개요
한 요지에서, 본 발명은 응답 포유동물 세포 및 이들에 결합된 세포, 조직 및 기관의 기능 또는 생존을 보호, 유지, 향상 또는 회복시키는 약학 조성물을 제조하기 위한, 골수에 대한 에리트로포이에틴의 효과중 하나 이상을 갖지 않는 조직 보호 사이토카인, 즉 화학적으로 개질된 에리트로포이에틴의 용도에 관한 것이다. 한 가지 구체적인 요지에서, 응답 포유동물 세포 및 이들에 결합된 세포, 조직 또는 기관은 치밀 내피 세포 장벽으로 인해 혈관으로부터 멀다. 다른 구체적인 요지에서, 이식 또는 재부착을 위한 것과 같은 세포, 조직, 기관 또는 다른 신체부위는 포유동물 신체로부터 단리된다. 비제한적인 예로서, 응답 세포 또는 조직은 신경, 망막, 근육, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신피질, 부신수질, 모세혈관 내피, 고환, 난소, 췌장, 뼈, 피부 또는 자궁내막 세포 또는 조직일 수 있다. 또한, 응답 세포의 비제한적인 예는 광수용체(막대 및 원뿔) 세포, 신경절 세포, 양극 세포, 수평 세포, 무축삭 세포, 뮐러(Mueller) 세포, 심근 세포, 박동 조율 세포, 굴심방결절 세포, 굴 결절 세포, 결합 조직 세포, 방실결절 세포, 방실 다발 세포, 간세포, 별세포, 쿠퍼(Kupffer) 세포, 혈관사이 세포, 신장 상피 세포, 요세관 사이질 세포, 술잔 세포, 창자샘(움) 세포, 소화관 내분비 세포, 사구체 세포, 다발 세포, 그물 세포, 크롬 친화 세포, 혈관주위세포, 레이디히(Leydig) 세포, 서톨리(Sertoli) 세포, 정자 세포, 그라피안(Graffian) 난포 세포, 원시 난포 세포, 랑게르한스섬 세포, α-세포, β-세포, γ-세포, F-세포, 골원세포(osteoprogenitor), 파골세포, 조골세포, 자궁내막 버팀질 세포, 자궁내막 세포, 줄기 세포 및 내피 세포를 포함한다. 이들 응답 세포의 예는 예시하기 위한 것이다. 한 양태에서, 응답 세포 또는 이들에 결합된 세포, 조직, 또는 기관은 흥분성 세포, 조직 또는 기관이 아니거나 또는 흥분성 세포 또는 조직을 주로 포함하지 않는다. 구체적인 실시태양에서, 전술한 조직 보호 사이토카인이 사용되는 포유동물 세포, 조직 또는 기관은 소진된 것이거나 또는 세포, 조직 또는 기관의 생존에 불리한 하나 이상의 조건하에서 시간에 따라 소진되게 된다. 이러한 조건은 원위치에서의 외상성 저산소증 또는 대사 기능장애, 수술에 의해 유도된 원위치에서의 저산소증 또는 대사 기능장애, 또는 원위치에서의 독소 노출을 포함하며, 원위치에서의 독소 노출은 화학요법 또는 방사선 요법에 수반될 수 있다. 한 실시태양에서, 불리한 조건은 특정 수술 절차를 위해 이용되는 심폐 회로술(인공 심폐기)의 결과이다.
본원의 조직 보호 사이토카인은 주로 신경 또는 정신 증상을 갖는 인간의 CNS 또는 말초신경계 질환, 및 안질환, 심혈관 질환, 심폐 질환, 호흡기 질환, 신장, 비뇨생식기 질환, 위장관 질환, 내분비 및 대사 이상, 및 염증을 치료 또는 예방하는데 유용하다.
본 발명은 또한 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여하기 위한 특정의 조직 보호 사이토카인을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 이러한 약학 조성물은 경구, 비강내 또는 비경구 투여를 위해, 또는 생체 외에서 세포, 조직 또는 기관의 생존을 유지하기 위한 관류 용액의 형태로 제형화될 수 있다.
전술한 목적 및 약학 조성물에 유용한 조직 보호 사이토카인은 천연 에리트로포이에틴, 바람직하게는 인간의 천연 에리트로포이에틴과 비교하여 하나 이상의 개질에 의해 변화된 에리트로포이에틴을 포함한다. 하나 이상의 개질은 에리트로포이에틴 분자의 하나 이상의 아미노산의 개질, 또는 에리트로포이에틴 분자의 하나 이상의 탄수화물의 개질일 수 있다. 물론, 본원의 목적에 유용한 조직 보호 사이토카인 분자에서는 분자의 아미노산 부분의 다수의 개질, 분자의 탄수화물 부분의 다수의 개질, 또는 분자의 아미노산 부분의 하나 이상의 개질과 분자의 탄수화물 부분의 하나 이상의 개질 같은, 천연 분자와 비교하여 다수의 개질이 이루어질 수 있다. 조직 보호 사이토카인 분자는 응답 포유동물 세포의 기능 또는 생존을 보호, 유지, 향상 또는 회복시키는 그의 능력을 보유하지만, 천연 분자와 비교하여 전술한 바람직한 특징과 무관한 에리트로포이에틴 분자의 하나 이상의 특성을 갖지 않을 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 에리트로포이에틴의 골수에 대한 효과, 즉 증가되는 적혈구용적율(적혈구 생성), 혈관 수축(높은 혈압), 증가되는 혈압, 혈소판의 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성은 갖지 않는다. 더욱 바람직하게는, 조직 보호 사이토카인이 적혈구 조혈 활성을 갖지 않고; 가장 바람직하게는 조직 보호사이토카인은 골수에 대한 에리트로포이에틴의 효과를 모두 갖지 않는다.
비제한적인 예로서, 본 발명의 조직 보호 사이토카인은 무-시알산 에리트로포이에틴(asialoerythropoietin)일 수 있다. 다른 예에서, 본 발명의 조직 보호 사이토카인은 천연 에리트로포이에틴 또는 무-시알산 에리트로포이에틴의 아미노산 잔기의 하나 이상의 아미노기를 개질시키는 하나 이상의 시약과 반응시킨 에리트로포이에틴 또는 무-시알산 에리트로포이에틴일 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 적혈구 조혈성이 아니다.
한 실시태양에서, 본 발명의 조직 보호 사이토카인은 시알산 잔기를 갖지 않는다. 바람직한 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 무-시알산 에리트로포이에틴이고, 가장 바람직하게는 인간의 무-시알산 에리트로포이에틴이다. 다른 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 시알산 잔기를 갖는다. 이러한 부분적으로 시알산 제거된 에리트로포이에틴을 본원에서는 하이포시알로에리트로포이에틴이라고 한다. 이들은 천연 에리트로포이에틴의 화학적 개질 또는 효소에 의한 개질에 의해 제조될 수 있거나, 또는 분자를 전혀 시알릴화시키지 않거나 에리트로포이에틴을 부분적으로만 시알릴화시키는 시스템에서 발현시킴으로써 수득될 수 있다. 본 발명의 무시알산-에리트로포이에틴 및 하이포시알로에리트로포이에틴은 분자가 제조되는 수단과는 무관하게 포함된다.
다른 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 개질된 리신 잔기를 갖거나 또는 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기가 개질되는데, 이러한 개질은 리신 엡실론 아미노기 또는 N-말단 아미노기와 아미노기-개질제(들)의 반응에 의해 이루어진 것이다. 개질된 리신 잔기 또는 개질된 N-말단 아미노기는 추가로 화학적으로 환원될 수 있다. 한 가지 바람직한 실시태양에서, 에리트로포이에틴은 하나 이상의 리신기에서 또는 N-말단에서 바이오틴일화, 카밤일화, 석신일화 또는 아세틸화된다. 다른 바람직한 실시태양에서, 리신은 알데하이드 또는 환원당과 반응하여 이민을 형성하고, 이를 임의적으로 소듐 사이아노보로하이드라이드에 의해 화학적으로 환원시켜 글루시톨릴 리신과 같은 N-알킬화된 리신을 형성함으로써 안정화시킬 수 있거나, 또는 환원당의 경우, 아마도리(Amadori) 또는 헤인즈(Heyns) 전위에 의해 알파-데옥시-알파-프럭토실리신과 같은 알파-데옥시 알파-아미노 당을 형성함으로써 안정화시킬 수 있다. 다른 바람직한 실시태양에서는, 리신 또는 N-말단 아미노기를 예컨대 사이아네이트 이온과 반응시킴에 의해 카밤일화(카밤오일화)시키거나; 각각 알킬-아이소사이아네이트, 아릴-아이소사이아네이트 또는 아릴-아이소티오사이아네이트와의 반응에 의해 알킬-카밤일화, 아릴-카밤일화 또는 아릴-티오카밤일화시키거나, 또는 이를 반응성 알킬카복실산 또는 아릴카복실산 유도체에 의해 아실화시킬 수 있다(예컨대, 아세트산 무수물, 석신산 무수물 또는 프탈산 무수물과의 반응에 의해). 하나 이상의 리신기 또는 N-말단 아미노기는 또한 트라이나이트로벤젠설폰산 또는 바람직하게는 그의 염중 하나와의 반응에 의해 트라이나이트로페닐 개질될 수 있다. 다른 실시태양에서는, 리신 잔기를 글라이옥살(예컨대, 글라이옥살, 메틸글라이옥살 또는 3-데옥시글루코손)과 반응시켜 상응하는 알파-카복시알킬 유도체를 생성시킴으로써 개질시킬 수 있다.
다른 실시태양에서는, 예컨대 질화 또는 요오드화에서와 같은(이들로 한정되지는 않음) 친전자성 시약에 의해 에리트로포이에틴의 하나 이상의 티로신 잔기를 개질시켜, 방향족 고리 위치를 변화시킴으로써, 조직 보호 사이토카인을 생성시킬 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 본원의 목적에 유용한 조직 보호제는 전술한 유형중 하나 이상으로 개질될 수 있으나, 그보다 많이 개질될 수도 있다. 분자의 아미노산 부분에서 1회 개질되고 분자의 탄수화물 부분에서 임의적으로 개질된 조직 보호 사이토카인의 예로서, 조직 보호 사이토카인은 카밤일에리트로포이에틴, 카밤일아시알로에리트로포이에틴, 카밤일하이포시알로에리트로포이에틴, 아세틸에리트로포이에틴, 아세틸아시알로에리트로포이에틴, 아세틸하이포아시아로에리트로포이에틴, 석신일에리트로포이에틴, 석신일아시알로에리트로포이에틴, 석신일하이포아시알로에리트로포이에틴, 바이오틴일에리트로포이에틴, 바이오틴일아시알로에리트로포이에틴, 바이오틴일하이포시알로에리트로포이에틴, 아이오도에리트로포이에틴, 아이오도아시알로에리트로포이에틴, 아이오도하이포시알로에리트로포이에틴, N-엡실론-카복시메틸에리트로포이에틴, N-엡실론-카복시메틸에리트로포이에틴, N-엡실론-카복시메틸하이포시알로에리트로포이에틴 및 글루시톨릴에리트로포이에틴, 글루시톨릴아시알로에리트로포이에틴, 글루시톨릴아시알로하이포에리트로포이에틴이다. 이들 화합물은 단순히 본 발명의 개질된 에리트로포이에틴의 예이다. 전술한 통속적인 명칭은 단순히 천연 에리트로포이에틴 분자의 대표적인 개질체를 나타낸 것이며, 아래 기재되는 바와 같이, 아미노산의 개질은 리신 잔기 또는 N-말단 아미노기의 하나 이상의 엡실론 아미노기상에서 이루어질 수 있거나, 또는 나이트로- 또는 아이오도-개질된 에리트로포이에틴의 경우에는 하나 이상의 티로신 잔기의 하나 이상의 엡실론 아미노기상에서 이루어질 수 있다. 상기의 임의의 조합도 본원에 포함된다. 본 발명은 또한 전술한 조직 보호 사이토카인중 하나 이상을 포함하는 약학 조성물을 비롯한 조성물을 포함한다, 이러한 임의의 조성물은 또한 천연 에리트로포이에틴도 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 요지에서는, 전술한 조직 보호 사이토카인중 하나 이상을 효과량으로 투여함으로써, 응답 포유동물 세포, 및 이들에 결합된 세포, 조직 및 기관의 기능 또는 생존을 보호, 유지, 향상 또는 회복시키는 방법이 제공된다. 본 발명의 한 가지 특정 요지에서, 응답 포유동물 세포 및 이들에 결합된 세포, 조직 또는 기관은 치밀 내피 세포 장벽으로 인해 혈관으로부터 멀다. 다른 구체적인 요지에서, 이식 또는 재부착을 위한 것과 같이 세포, 조직, 기관 또는 다른 신체부위는 포유동물 신체로부터 단리된다. 비제한적인 예로서, 응답 세포 또는 조직은 신경, 망막, 근육, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신피질, 부신수질, 모세혈관 내피, 고환, 난소, 췌장, 뼈, 피부 또는 자궁내막 세포 또는 조직일 수 있다. 응답 세포의 이들 예는 단지 예시하기 위한 것이다. 한 특정 실시태양에서, 응답 세포 또는 이들에 결합된 세포, 조직, 또는 기관은 흥분성 세포, 조직 또는 기관이 아니거나 또는 흥분성 세포 또는 조직을 주로 포함하지 않는다. 다른 구체적인 실시태양에서, 전술한 조직 보호 사이토카인이 투여되는 포유동물 세포, 조직 또는 기관은 소진된 것이거나 또는 세포, 조직 또는 기관의 생존에 불리한 하나 이상의 조건하에서 시간에 따라 소진되게 된다. 이러한 조건은 원위치에서의 외상성 저산소증 또는 대사 기능장애, 수술에 의해 유도된 원위치에서의 저산소증 또는 대사 기능장애, 또는 원위치에서의 독소 노출을 포함할 수 있으며, 원위치에서의 독소 노출은 화학요법 또는 방사선 요법에 수반될 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명은 심폐 회로술로부터 야기되는 불리한 조건에 대해 보호한다.
본 발명의 다른 요지에서는, 포유동물 세포 및 이에 결합된 세포, 조직 및 기관의 기능 또는 생존을 보호, 유지, 향상 또는 회복시키고자 하는 목적으로 세포, 조직 또는 기관을 생체 외에서 처리하기 위한 약학 조성물을 제조하는데, 전술한 임의의 조직 보호 사이토카인을 사용할 수 있다. 이러한 생체외 처리는 예를 들어 이식(자가 이식 또는 외래 이식(xenotransplant))을 위한 세포, 조직 또는 기관의 보존에 유용하다. 세포, 조직 또는 기관이 공여자 또는 수령자의 혈관과 결합되지 않은 기간동안 세포 기능을 유지하기 위하여, 혈관 또는 다른 수단을 통해 기관 내로 스며들게 하는 관류액 또는 조직 보호 사이토카인을 함유하는 용액에 세포, 조직 또는 기관을 침지시킬 수 있다. 기관을 떼어내기 전의 공여자, 및 떼어낸 기관 및 수령자에게 관류액을 투여할 수 있다. 또한, 임의의 조직 보호 사이토카인의 전술한 용도는 세포, 조직 또는 기관이 개인의 혈관으로부터 단리되어 일정 기간동안 본질적으로 생체 외에서 존재할 경우에 유용하며, 이 때 용어 단리된이란 구체적으로 심폐 회로술과 같은 수술 동안 수행될 수 있는 것처럼, 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위의 혈관 또는 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위로의 혈관을 제한시키거나 클램프로 죄거나; 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위의 혈관을 우회시키거나; 포유동물 신체로부터 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위를 제거(이는 외래 이식에 앞서 또는 자가이식 전에 또한 자가이식 동안 수행될 수 있음)하거나; 또는 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위가 외상에 의해 절단됨을 의미한다. 따라서, 본 발명의 이 양태는 원위치에서 또한 생체 외에서 조직 보호 사이토카인을 사용한 관류에 적합하다. 생체 외에서, 에리트로포이에틴은 세포, 조직 또는 기관 보존 용액에 제공될 수 있다. 어느 요지에서나, 노출은 연속 관류, 박동성 관류, 주입, 침지, 주사 또는 카테터 삽입에 의해 이루어질 수 있다.
또 다른 요지에서, 본 발명은 포유동물 신체로부터 단리된 포유동물 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위(응답 세포 또는 조직 포함)의 생존을 보호, 유지, 향상 또는 회복시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 전술한 생존을 보호, 유지, 향상 또는 복원시키는데 효과적인 기간동안 소정량의 상기 언급된 조직 보호 사이토카인을 단리된 포유동물 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위에 적어도 노출시킴을 포함한다. 비제한적인 예에서, 단리된이란 구체적으로 심폐 회로술과 같은 수술 동안 수행될 수 있는 것처럼, 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위의 혈관 또는 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위로의 혈관을 제한시키거나 클램프로 죄거나; 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위의 혈관을 우회시키거나; 포유동물 신체로부터 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위를 제거(이는 외래 이식에 앞서 또는 자가이식 전에 또한 자가이식 동안 수행될 수 있음)하거나; 또는 세포, 조직, 기관 또는 신체 부위가 외상에 의해 절단됨을 의미한다. 따라서, 본 발명의 이 양태는 원위치에서 또한 생체 외에서 조직 보호 사이토카인을 사용한 관류에 적합하다. 생체 외에서, 조직 보호 사이토카인은 세포, 조직 또는 기관 보존 용액에 제공될 수 있다. 어느 양태에서나, 노출은 연속 관류, 박동성 관류, 주입, 침지, 주사 또는 카테터 삽입에 의해 이루어질 수 있다.
비제한적인 예로서, 전술한 생체외 응답 세포 또는 조직은 신경, 망막, 근육, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신피질, 부신수질, 모세혈관 내피, 고환, 난소, 췌장, 피부, 뼈, 골수, 제대혈 또는 자궁내막 세포 또는 조직일 수 있다. 응답 세포의 이들 예는 단지 예시하기 위한 것이다.
전술한 모든 방법 및 용도는 인간에게 바람직하게 적용될 수 있으나, 애완동물, 집안에서 키우는 동물, 가축 및 동물원 동물과 같은(그러나 이들로 국한되지는 않음) 임의의 동물에도 마찬가지로 유용하다. 전술한 약학 조성물의 투여 경로는 경구, 정맥내, 비강내, 국부, 관강내, 흡입 또는 비경구 투여를 포함하며, 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 근육내, 복강내, 점막하 또는 피내 투여를 포함한다. 생체외 용도의 경우, 관류액 또는 침지 용액이 바람직하다. 이는 혈관의 단리된 부분을 원위치에서 관류시킴을 포함한다.
본 발명의 또 다른 요지에서, 전술한 임의의 조직 보호 사이토카인은, 기능장애에 책임이 있는 질환 또는 증상의 개시 후에 투여될 때, 기능장애 세포, 조직 또는 기관을 회복시키는 약학 조성물을 제조하는데 유용하다. 비제한적인 예로서, 조직 보호 사이토카인을 포함하는 약학 조성물을 투여하면, 외상이 진정된지 한참(예컨대 3일, 5일, 1주일, 한 달 이상) 지난 뒤에 투여될 때에도, 이미 뇌 외상을 받은 동물의 인지 기능이 회복된다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명은 기능장애에 책임이 있는 질환 또는 증상이 개시된 후에 투여될 때 기능장애 세포, 조직 또는 기관을 회복시키기 위해 전술한 조직 보호 사이토카인을 사용하는 방법을 제공한다. 비제한적인 예로서, 조직 보호 사이토카인을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 방법은, 외상이 진정된지 한참(예컨대, 3일, 5일, 1주일, 한 달 이상) 후에 투여될 때에도, 이미 뇌 외상을 가진 동물의 인지 기능을 회복시킨다. 이 방법에 유용한 조직 보호 사이토카인은 전술한 임의의 개질된 에리트로포이에틴을 포함한다.
본 발명의 다른 요지에서는, 본원에서 이전에 기재된 조직 보호 사이토카인과 결합된 분자의 조성물을 투여함으로써, 포유동물의 내피 세포 장벽을 가로지르는 분자의 세포간 수송을 촉진시키는 방법이 제공된다. 수송될 분자와 조직 보호 사이토카인 사이의 결합은 예를 들어 불안정한 공유 결합, 안정한 공유 결합, 또는 분자의 결합 부위와의 비-공유 결합일 수 있다. 내피 세포 장벽은 혈액-뇌 장벽, 혈액-눈 장벽, 혈액-고환 장벽, 혈액-난소 장벽 및 혈액-자궁 장벽일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 수송하는데 적합한 분자는 성장 호르몬 같은 호르몬, 신경 성장 인자(NGF), 뇌-유도된 향신경성 인자(BDNF), 섬모 향신경성 인자(CNTF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 전환 성장 인자 β1(TGFβ1), 전환 성장 인자 β2(TGFβ2), 전환 성장 인자 β3(TGFβ3), 인터류킨-1, 인터류킨-2, 인터류킨-3, 인터류킨-6, AZT, 종양 괴사 인자에 대한 항체, 항바이러스제 및 사이클로스포린 같은 면역억제제를 포함한다. 또한, 진단 목적으로 뇌 및 다른 차단된 기관 내의 세포, 조직 또는 기관을 가시화시키기 위하여, 염료 또는 마커를 에리트로포이에틴 또는 본 발명의 조직 보호 사이토카인중 하나에 부착할 수 있다.
본 발명의 다른 요지는, 본원에서 이전에 기재된 조직 보호 사이토카인과 결합된 분자를 포함하는, 포유동물의 내피 세포 장벽을 가로지르는 분자의 세포간 수송을 촉진시키는 조성물을 제공하는 것이다. 결합은 예를 들어 불안정한 공유 결합, 안정한 공유 결합, 또는 분자의 결합 부위와의 비-공유 결합일 수 있다. 내피 세포 장벽은 혈액-뇌 장벽, 혈액-눈 장벽, 혈액-고환 장벽, 혈액-난소 장벽 및 혈액-자궁 장벽일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 수송하는데 적합한 분자는 성장 호르몬 같은 호르몬, 신경 성장 인자(NGF), 뇌-유도된 향신경성 인자(BDNF), 섬모 향신경성 인자(CNTF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 전환 성장 인자 β1(TGFβ1), 전환 성장 인자 β2(TGFβ2), 전환 성장 인자 β3(TGFβ3), 인터류킨-1, 인터류킨-2, 인터류킨-3, 인터류킨-6, AZT, 종양 괴사 인자에 대한 항체, 항바이러스제 및 사이클로스포린 같은 면역억제제를 포함한다. 또한, 진단 목적으로 뇌 및 다른 차단된 기관 내의 세포, 조직 또는 기관을 가시화시키기 위하여, 염료 또는 마커를 에리트로포이에틴 또는 본 발명의 조직 보호 사이토카인중 하나에 부착할 수 있다.
본 발명의 다른 요지에서, 전술한 임의의 조직 보호 사이토카인은 포유동물의 내피 세포 장벽을 가로지르는 분자의 세포간 수송을 촉진시키는 약학 조성물을 제조하는데 유용하다. 결합은 예를 들어 불안정한 공유 결합, 안정한 공유 결합, 또는 분자의 결합 부위와의 비-공유 결합일 수 있다. 내피 세포 장벽은 혈액-뇌 장벽, 혈액-눈 장벽, 혈액-고환 장벽, 혈액-난소 장벽 및 혈액-자궁 장벽일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 수송하기 적합한 분자는 몇몇 비한정적인 예를 열거해보자면 성장 호르몬 같은 호르몬, 항생제, 항바이러스제, 염료, 마커 및 항암제를 포함한다.
한 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물은 치료 효과량의 조직 보호 사이토카인, 하나 이상의 소염제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 관련 실시태양에서, 소염제는 코르티코스테로이드, 글루코코르티코이드, 스테로이드, 비-스테로이드성 소염제, 베타-작용제, 항콜린제, 메틸 잔틴, 금 주입물, 설파살라진, 페니실라민, 항-혈관형성제, 답손, 소랄렌, 항-말라리아제, 항바이러스제 및 항생제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시태양에서, 본 발명은 치료 효과량의 조직 보호 사이토카인, 하나 이상의 소염제 및/또는 하나 이상의 면역조절제, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하나, 단 소염제 또는 면역조절제가 αMSH 또는 항-TNF가 아닌 약학 조성물을 제공한다. 관련 실시태양에서, 소염제 또는 면역조절제는 항체가 아니다.
한 실시태양에서, 본 발명은 치료 효과량의 조직 보호 사이토카인, 하나 이상의 소염제 및/또는 하나 이상의 면역조절제, 및 약학적으로 허용가능한 염으로 본질적으로 이루어진 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 치료 효과량의 조직 보호 사이토카인, 하나 이상의 면역조절제, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 관련 실시태양에서, 소염제는 메토트렉세이트, 레플루노마이드, 사이클로포스파마이드, 사이톡산, 이뮤란, 사이클로스포린 A, 미노사이클린, 아자티오프린, 항생제, 메틸프레드니솔론, 코르티코스테로이드, 스테로이드, 마이코페놀레이트 모페틸, 라파마이신, 미조리빈, 데옥시스퍼구알린, 브레퀴나르, 말로노니트릴로아민데스, T 세포 수용체 조절제 및 사이토카인 수용체 조절제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 상기 조직 보호 사이토카인이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 본원에 기재된 약학 조성물을 제공한다: i) 시알산 잔기를 갖지 않는 에리트로포이에틴; ii) N-결합된 탄수화물 또는 O-결합된 탄수화물을 갖지 않는 에리트로포이에틴; iii) 하나 이상의 글라이코시다제로 천연 에리트로포이에틴을 처리함으로써 탄수화물 함량이 감소된 에리트로포이에틴; iv) 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴; v) 화학적으로 환원되는 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴; vi) 하나 이상의 개질된 아르기닌 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; vii) 하나 이상의 개질된 리신 잔기를 갖거나 또는 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기가 개질된 에리트로포이에틴; viii) 하나 이상의 개질된 티로신 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; ix) 하나 이상의 개질된 아스파트산 또는 글루탐산 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; x) 하나 이상의 개질된 트립토판 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; xi) 하나 이상의 아미노기가 제거된 에리트로포이에틴; xii) 에리트로포이에틴 분자의 하나 이상의 시스틴 결합이 결손된 에리트로포이에틴; 및 xiii) 말단 절단된(truncated) 에리트로포이에틴.
한 실시태양에서, 응답 세포, 조직 및/또는 기관을 포함하는 포유동물에서 염증을 치료하는 방법은, 치료 효과량의 조직 보호 사이토카인 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 포유동물에게 투여함을 포함한다. 관련 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 증가되는 적혈구용적율, 혈관 수축, 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 적혈구 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 갖지 않는다.
다른 실시태양에서, 응답 제포, 조직 및/또는 기관을 포함하는 포유동물에서 염증을 치료하는 방법은, 예방 또는 치료 효과량의 조직 보호 사이토카인 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 염증 치료가 필요한 포유동물에게 투여하고, 예방 또는 치료 효과량의 하나 이상의 소염제 또는 면역조절제를 상기 포유동물에게 투여함을 포함한다. 한 실시태양에서, 소염제는 코르티코스테로이드, 글루코코르티코이드, 스테로이드, 비-스테로이드성 소염제, 베타-작용제, 항콜린제, 메틸 잔틴, 금 주입물, 설파살라진, 페니실라민, 항-혈관형성제, 답손, 소랄렌, 항-말라리아제, 항바이러스제 및 항생제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시태양에서, 본 발명은 예방 또는 치료 효과량의 조직 보호 사이토카인 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 염증 치료가 필요한 포유동물에게 투여하고, 예방 또는 치료 효과량의 하나 이상의 소염제 또는 면역조절제를 상기 포유동물에게 투여함을 포함하나, 단 소염제 또는 면역조절제가 αMSH 또는 항-TNF가 아닌, 응답 제포, 조직 및/또는 기관을 포함하는 포유동물에서 염증을 치료하는 방법이 제공된다.
다른 실시태양에서, 면역조절제는 단백질 제제, 펩타이드 의사 화합물, 항체, 핵산 분자, 소분자, 유기 화합물, 무기 화합물, 메토트렉세이트, 레플루노마이드, 사이클로포스파마이드, 사이톡산, 이뮤란, 사이클로스포린 A, 미노사이클린, 아자티오프린, 항생제, 메틸프레드니솔론(MP), 코르티코스테로이드, 스테로이드, 마이코페놀레이트 모페틸, 라파마이신, 미조리빈, 데옥시스퍼구알린, 브레퀴나르, 말로노니트릴로아민데, T 세포 수용체 조절제 및 사이토카인 수용체 조절제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 상기 조직 보호 사이토카인이 i) 시알산 잔기를 갖지 않는 에리트로포이에틴; ii) N-결합된 탄수화물 또는 O-결합된 탄수화물을 갖지 않는 에리트로포이에틴; iii) 하나 이상의 글라이코시다제로 천연 에리트로포이에틴을 처리함으로써 탄수화물 함량이 감소된 에리트로포이에틴; iv) 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴; v) 화학적으로 환원되는 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴; vi) 하나 이상의 개질된 아르기닌 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; vii) 하나 이상의 개질된 리신 잔기를 갖거나 또는 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기가 개질된 에리트로포이에틴; viii) 하나 이상의 개질된 티로신 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; ix) 하나 이상의 개질된 아스파트산 또는 글루탐산 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; x) 하나 이상의 개질된 트립토판 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; xi) 하나 이상의 아미노기가 제거된 에리트로포이에틴; xii) 에리트로포이에틴 분자의 하나 이상의 시스틴 결합이 결손된 에리트로포이에틴; 및 xiii) 말단 절단된 에리트로포이에틴인 상기 본원에 기재된 방법을 제공한다.
한 실시태양에서, 상기 본원에 기재된 조성물 및 방법의 조직 보호 사이토카인은 무-시알산 에리트로포이에틴 또는 페닐글라이옥살-에리트로포이에틴이다. 다른 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 내피 세포 장벽을 횡단할 수 있다. 내피 세포 장벽은 혈액-뇌 장벽, 혈액-눈 장벽, 혈액-고환 장벽, 혈액-난소 장벽 및 혈액-자궁 장벽으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물 및 방법의 표적이 되는 포유동물의 응답 세포, 조직 및/또는 기관은 신경 세포, 근육 세포, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신피질, 부신수질, 모세혈관 세포, 내피 세포, 고환, 난소, 자궁내막 세포 및 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시태양에서, 응답 포유동물 세포는 광수용체 세포, 신경절 세포, 양극 세포, 수평 세포, 무축삭 세포, 뮐러 세포, 심근 세포, 박동 조율 세포, 굴심방결절 세포, 굴 결절 세포, 방실결절 세포, 방실 다발 세포, 간세포, 별세포, 쿠퍼 세포, 혈관사이 세포, 술잔 세포, 창자샘 세포, 소화관 내분비 세포, 사구체 세포, 다발 세포, 그물 세포, 크롬 친화 세포, 혈관주위세포, 레이디히 세포, 서톨리 세포, 정자 세포, 그라피안 난포 세포, 원시 난포 세포, 자궁내막 버팀질 세포 및 자궁내막 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 상기 조직 보호 사이토카인이 무-시알산 에리트로포이에틴인, 상기 본원에 기재된 포유동물의 염증을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 무-시알산 에리트로포이에틴은 인간의 무-시알산 에리트로포이에틴이다. 조직 보호 사이토카인은 바람직하게는 N-결합된 탄수화물을 갖지 않는 에리트로포이에틴이다. 조직 보호 사이토카인은 바람직하게는 O-결합된 탄수화물을 갖지 않는 에리트로포이에틴이다. 한 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 글라이코시다제로 처리된 에리트로포이에틴이다. 다른 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 퍼아이오데이트-산화된 에리트로포이에틴이다. 퍼아이오데이트-산화된 에리트로포이에틴은 소듐 사이아노보로하이드라이드로 바람직하게 화학적으로 환원된다. 한 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 아르기닌 잔기 상에 R-글라이옥살 잔기(여기에서, R은 아릴 또는 알킬 잔기임)를 포함하는 에리트로포이에틴이다. 에리트로포이에틴은 바람직하게 페닐글라이옥살-에리트로포이에틴이다. 다른 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 아르기닌 잔기가 2,3-뷰테인다이온 또는 사이클로헥세인다이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인접한 다이케톤과 반응함으로써 개질된 에리트로포이에틴이다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 아르기닌 잔기가 3-데옥시글루코손과 반응된 에리트로포이에틴이다. 또 다른 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 바이오틴일화 리신 또는 N-말단 아미노기를 포함하는 에리트로포이에틴이다. 에리트로포이에틴 분자는 바이오틴일화된 에리트로포이에틴일 수 있다.
본 발명은 또한 글루시톨릴 리신 에리트로포이에틴 또는 프럭토실 리신 에리트로포이에틴인 조직 보호 사이토카인을 포함하는, 포유동물에서 염증을 치료하기 위한 약학 조성물 및 방법을 제공한다.
한 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물 및 방법의 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 카밤일화된 리신 잔기를 갖는 에리트로포이에틴이다. 다른 실시태양에서, 카밤일화된 에리트로포이에틴은 알파-N-카밤오일에리트로포이에틴; N-엡실론-카밤오일에리트로포이에틴; 알파-N-카밤오일, N-엡실론-카밤오일에리트로포이에틴; 알파-N-카밤오일아시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-카밤오일아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-카밤오일, N-엡실론-카밤오일아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-카밤오일하이포시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-카밤오일하이포시알로에리트로포이에틴; 및 알파-N-카밤오일, N-엡실론-카밤오일하이포시알로에리트로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물 및 방법의 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 리신 잔기가 아실화된 에리트로포이에틴이다. 다른 실시태양에서, 상기 에리트로포이에틴의 리신 잔기는 아세틸화된다. 또 다른 실시태양에서, 아세틸화된 에리트로포이에틴은 알파-N-아세틸에리트로포이에틴; N-엡실론-아세틸에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸, N-엡실론-아세틸에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸아시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-아세틸아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸, N-엡실론-아세틸아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸하이포시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-아세틸하이포시알로에리트로포이에틴; 및 알파-N-아세틸, N-엡실론-아세틸하이포시알로에리트로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물 및 방법의 조직 보호 사이토카인은 석신일화된 리신 잔기를 포함하는 에리트로포이에틴이다. 한 실시태양에서, 에리트로포이에틴은 알파-N-석신일에리트로포이에틴; N-엡실론-석신일에리트로포이에틴; 알파-N-석신일, N-엡실론-석신일에리트로포이에틴; 알파-N-석신일아시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-석신일아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-석신일, N-엡실론-석신일아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-석신일하이포시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-석신일하이포시알로에리트로포이에틴; 및 알파-N-석신일, N-엡실론-석신일하이포시알로에리트로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물 및 방법의 조직 보호 사이토카인은 2,4,6-트라이나이트로벤젠설폰산 염에 의해 개질된 하나 이상의 리신 잔기를 갖는 에리트로포이에틴이다. 본 발명의 한 요지에서, 염은 2,4,6-트라이나이트로벤젠설폰에이트 소듐이다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물 및 방법의 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 티로신 잔기가 질화 및/또는 요오드화된 에리트로포이에틴이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물 및 방법의 조직 보호 사이토카인은 아스파트산 및/또는 글루탐산 잔기가 카보다이이미드와 반응된 후 아민과 반응된 에리트로포이에틴이다. 본 발명의 한 요지에서, 아민은 글라이신아마이드이다.
한 실시태양에서, 상기 본원에 기재된 본 발명의 약학 조성물 및 방법의 조직 보호 사이토카인은 질환 상태 또는 외상으로부터 발생되는 염증을 치료하는데 사용된다. 한 실시태양에서, 외상은 관염, 만성 기관지염, 췌장염, 골수염, 류마티스성 관절염, 사구체신염, 시신경염, 관자동맥염, 뇌염, 수막염, 횡단 척수염, 피부근육염, 다발근육염, 괴사 근막염, 간염 및 괴사 신장결장염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물 및 방법의 조직 보호 사이토카인은 신경아교세포에 의해 생성된 사이토카인으로부터 발생되는 염증을 억제한다. 다른 실시태양에서, 염증은 세포자멸사에 의해 촉발된다.
본 발명의 한 요지에 따라, 응답 세포, 조직 및/또는 기관을 포함하는 포유동물에서 염증을 치료하는 약학 조성물을 제조하기 위하여 조직 보호 사이토카인을 사용할 수 있다. 특정 요지에 따르면, 조직 보호 사이토카인은 증가되는 적혈구용적율, 혈관 수축, 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 갖지 않는다. 한 실시태양에서는, 질환 상태 또는 외상으로부터 염증이 발생된다.
다른 실시태양에서, 외상은 발작 질환, 다발성 경화증, 중풍, 저혈압, 심장정지, 허혈, 심근 경색, 염증, 연령 관련 인지 기능 상실, 방사선 손상, 뇌성마비, 신경변성 질환, 알쯔하이머(Alzheimer's)병, 파킨슨(Parkinson's)병, 레이(Leigh's)병, AIDS 치매, 기억 상실, 근위축성 측삭 경화증, 알콜 중독, 기분 장애, 불안 장애, 주의력 결핍 장애, 자폐증, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병, 뇌 외상, 척수 외상, 대뇌 허혈, 척수 허혈, 심폐회로술, 만성 심장 부전, 황반 변성, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 망막병증, 녹내장, 망막 허혈 또는 망막 외상에 의해 야기된다.
본 발명은 응답 세포, 조직 및/또는 기관을 포함하는 포유동물에서 염증을 치료하는 약학 조성물을 제조하기 위한 조직 보호 사이토카인의 용도를 제공하며, 이 때 약학 조성물은 치료 효과량의 조직 보호 사이토카인; 하나 이상의 소염제 또는 면역조절제; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 한 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 i) 시알산 잔기를 갖지 않는 에리트로포이에틴; ii) N-결합된 탄수화물 또는 O-결합된 탄수화물을 갖지 않는 에리트로포이에틴; iii) 하나 이상의 글라이코시다제로 천연 에리트로포이에틴을 처리함으로써 탄수화물 함량이 감소된 에리트로포이에틴; iv) 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴; v) 화학적으로 환원되는 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴; vi) 하나 이상의 개질된 아르기닌 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; vii) 하나 이상의 개질된 리신 잔기를 갖거나 또는 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기가 개질된 에리트로포이에틴; viii) 하나 이상의 개질된 티로신 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; ix) 하나 이상의 개질된 아스파트산 또는 글루탐산 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; x) 하나 이상의 개질된 트립토판 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; xi) 하나 이상의 아미노기가 제거된 에리트로포이에틴; xii) 에리트로포이에틴 분자의 하나 이상의 시스틴 결합이 결손된 에리트로포이에틴; 및 xiii) 말단 절단된 에리트로포이에틴이다.
본 발명의 이러한 요지 및 다른 요지는 하기 도면 및 상세한 설명을 참조하여 더욱 잘 이해할 수 있다.
도 1은 항-에리트로포이에틴 항체로 염색된 얇은 박편에서, 정상적인 인간의 뇌에서의 에리트로포이에틴 수용체의 분포를 도시한다.
도 2는 도 1의 고배율 확대도이다.
도 3은 금-라벨링된 2차 항체를 사용한, 에리트로포이에틴 수용체의 한외현미경에 의한 분포를 도시한다.
도 4는 도 3과 유사하게 제작되었으며, 인간의 뇌 모세혈관의 관 표면 및 항-관 표면에서의 고밀도 에리트로포이에틴 수용체를 보여준다.
도 5는 혈청-결핍된 P19 세포의 생존에 대한 에리트로포이에틴 및 무-시알산 에리트로포이에틴의 시험관내 효능을 비교한다.
도 6은 혈청-결핍된 P19 세포의 생존에 대한 에리트로포이에틴 및 무-시알산 에리트로포이에틴의 시험관내 효능을 비교하는 다른 실험이다.
도 7는 래트의 국소성 대뇌 허혈 모델에서의 에리트로포이에틴 및 무-시알산 에리트로포이에틴의 보호능을 도시한다.
도 8은 허혈 발작 모델에서 중대뇌 동맥 폐색시 인간의 에리트로포이에틴 및 인간의 무-시알산 에리트로포이에틴의 효능을 비교하는 투여량 반응을 도시한다.
도 9는 P19 분석에서 요오드화된 에리트로포이에틴의 활성을 도시한다.
도 10은 P19 분석에서 바이오틴일화 에리트로포이에틴 및 무-시알산 에리트로포이에틴의 효과를 도시한다.
도 11은 혈청-결핍된 P19 세포의 생존에 대한 페닐글라이옥살-개질된 에리트로포이에틴의 시험관내 효능을 에리트로포이에틴의 시험관내 효능과 비교한다.
도 12는 물 중독 시험에서 조직 보호 사이토카인의 효과를 도시한다.
도 13은 비경구-투여된 에리트로포이에틴의 뇌척수액 내로의 이동을 도시한다.
도 14는 에리트로포이에틴에 의한, 이식을 위해 준비된 심장 기능의 유지를 도시한다.
도 15는 일시적인 혈관 폐색 후 에리트로포이에틴에 의해 심근이 허혈 손상을 받지 않도록 보호됨을 보여준다.
도 16A 내지 도 16D는 래트 녹내장 모델에서 에리트로포이에틴 치료의 효과를 보여준다.
도 17은 래트 녹내장 모델에서 에리트로포이에틴에 의한 망막 기능 보존 정도를 도시한다.
도 18은 외상을 입은지 5일 후에 시작되는 에리트로포이에틴의 투여에 의한, 뇌 외상 후 인지 기능의 회복을 도시한다.
도 19는 외상을 입은지 30일 후에 시작되는 에리트로포이에틴의 투여에 의한, 뇌 외상 후 인지 기능의 회복을 도시한다.
도 20은 대뇌 독성의 카이네이트(kainate) 모델에서 인간의 무-시알산 에리트로포이에틴의 효능을 도시한다.
도 21은 래트 척수 손상 모델에서 조직 보호 사이토카인의 효능을 도시한다.
도 22는 래빗 척수 손상 모델 내에서 조직 보호 사이토카인의 효능을 도시한다.
도 23A 내지 도 23C는 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 대뇌 피질 층의 관상 박편을 도시한다.
도 24A 내지 도 24C는 GFAP 항체에 의해 염색된 경색 영역에 인접한 전방 피질의 관상 박편을 도시한다.
도 25A 및 도 25B는 OX-42 항체에 의해 염색된 대뇌 피질 층의 관상 박편을 도시한다.
도 26A 및 도 26B는 OX-42 항체에 의해 염색된 경색 영역에 인접한 대뇌 피질 층의 관상 박편을 도시한다.
도 27은 EAE 모델에서 염증에 대한 에리트로포이에틴의 효능을 도시한다.
도 28는 EAE 모델에서 염증에 대한 덱사메타손의 효과와 에리트로포이에틴의 효과를 비교한다.
도 29A 및 도 29B는 에리트로포이에틴이 신경세포 사멸에 관련된 염증을 억제함을 보여준다.
본 발명의 방법은 다양한 정상 조건 또는 유해 조건하에서 포유동물 신체 내의 세포, 조직 및 기관을 국부적으로 또는 전신에 걸쳐 보호 또는 향상시키거나, 또는 다른 포유동물 신체로의 이전이 예정된 세포, 조직 또는 기관을 보호한다. 또한, 기능 장애를 회복 또는 복원시킨다. 상기 언급된 바와 같이, 치밀 내피 세포 장벽을 가로지르고 혈관으로부터 먼 응답 세포(및 다른 유형의 세포)에 긍정적인 효과를 나타내는 에리트로포이에틴의 능력으로 인해, 인간을 비롯한 동물에 상당한 세포 및 조직 손상을 야기하게 되는 다양한 증상 및 질환을 예방 및 치료할 수 있는 가능성이 생기고, 더욱이 전통적으로 위험이 이점보다 커서 이전에는 시도할 수 없었던 수술 절차가 앞으로는 성공할 수 있게 되었다.
에리트로포이에틴은 인간에 있어서 분자량이 약 34kDa인 당단백 호르몬이다. 성숙 단백질은 165개의 아미노산을 포함하고, 글라이코실 잔기가 분자의 약 40중량%를 구성한다. 에리트로포이에틴은 뉴저지주 래리턴 소재의 오르토 바이오테크 인코포레이티드(Ortho Biotech Inc.)에서 상표명 프로크릿(PROCRIT)으로, 또한 캘리포니아주 싸우전드 오크스 소재의 암젠, 인코포레이티드(Amgen, Inc.)에서 상표명 에포젠(EPOGEN)으로 구입할 수 있다. 또한, 세균, 효모, 곤충, 식물 및 인간을 비롯한 포유동물의 세포 시스템을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 다양한 숙주 시스템을 재조합 에리트로포이에틴의 발현 및 제조에 이용할 수 있다. 예를 들어, 생성물을 당화시키거나 시알릴화시키지 않는 세균 내에서 생성된 재조합 에리트로포이에틴을 사용하여 에리트로포이에틴의 당화되지 않은 형태를 생성시킬 수 있다. 다르게는, 재조합 에리트로포이에틴은 당화되지 않는 다른 시스템, 예컨대 인간 세포를 포함하는 식물에서 생성될 수 있다. 본 발명을 실행하는데 유용한 에리트로포이에틴의 형태는 인간 또는 다른 포유동물의 에리트로포이에틴의 천연-발생, 합성 및 재조합 형태의 화학적 개질체 및/또는 발현-시스템-매개되는 당화 개질체를 포함한다.
"응답 세포"는 에리트로포이에틴에 노출됨으로써 그의 기능 또는 생존이 유지, 촉진, 향상, 재생 또는 다른 방식으로 유리해질 수 있는 포유동물 세포를 일컫는다. 이러한 세포의 비제한적인 예는 신경, 망막, 근육, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신피질, 부신수질, 모세혈관 내피, 고환, 난소, 췌장, 피부, 뼈 및 자궁내막 세포를 포함한다. 특히, 응답 세포는 신경 세포; 망막 세포; 광수용체(막대 및 원뿔) 세포, 신경절 세포, 양극 세포, 수평 세포, 무축삭 세포, 뮐러 세포; 근육 세포; 심장 세포; 심근세포, 박동 조율 세포, 굴심방결절 세포, 굴 결절 세포 및 결합 조직 세포(방실결절, 방실 다발); 폐 세포; 간 세포; 간세포, 별세포 및 쿠퍼 세포; 신장 세포; 혈관사이 세포, 신장 상피 세포, 및 요세관 사이질 세포; 소장 세포; 술잔 세포, 창자샘(움) 세포 및 소화관 내분비 세포; 부신피질 세포; 사구체 세포, 다발 세포 및 그물 세포; 부신수질 세포; 크롬 친화 세포; 모세혈관 세포; 혈관주위세포; 고환 세포; 레이디히 세포, 서톨리 세포 및 정자 세포 및 이들의 전구체; 난소 세포; 그라피안 난포 세포 및 원시 난포 세포; 자궁내막 세포; 자궁내막 버팀질 세포 및 자궁내막 세포; 췌장 세포; 랑게르한스섬, α-세포, β-세포, γ-세포, F-세포; 피부 세포; 골 세포; 골원세포, 파골세포 및 조골세포; 및 상기 나열된 기관에 존재하는 줄기 세포 및 내피 세포를 포함하지만, 이들로 국한되는 것은 아니다. 또한, 이러한 응답 세포 및 에리트로포이에틴에 의해 이들에게 주어지는 이점은, 직접 응답성이지는 않은 다른 세포 또는 이러한 응답세포가 아닌 세포를 함유하는 조직 또는 기관을 간접적으로 보호 또는 향상시키도록 확장될 수 있다. 응답 세포의 향상에 의해 간접적으로 이점을 갖는 이들 다른 세포, 조직 또는 기관은 "결합된" 세포, 조직 및 기관으로서 상기 세포, 조직 또는 기관의 일부로 존재한다. 따라서, 본원에 기재된 에리트로포이에틴의 이점은 조직 또는 기관의 소수 또는 소량의 응답 세포, 예를 들어 이들 조직에 존재하는 흥분성 조직 또는 신경 조직, 또는 테스토스테론을 생성시키는 고환의 레이디히 세포가 존재함으로써 제공될 수 있다. 한 요지에서, 응답 세포 또는 이들에 결합된 세포, 조직 또는 기관은 흥분성 세포, 조직 또는 기관이 아니거나, 또는 흥분성 세포 또는 조직을 주로 포함하지 않는다.
높은 투여량의 화학요법, 방사선 요법, 장기간의 생체외 이식 생존 및 장기간의 수술로 인해 유도되는 허혈과 같은, 궁극적으로 이점을 달성하기 위해 유도되는 소정 지속기간 및 소정 정도의 의도적인 불리한 조건이 본원 발명의 이점을 취함으로써 수행될 수 있다. 그러나, 본 발명은 이로 한정되는 것은 아니며, 하나의 요지로서 내피-세포 장벽 또는 내피의 치밀 이음부로 인해 표적 응답 세포가 혈관으로부터 먼 방법 또는 조성물을 포함한다. 일반적으로, 본 발명은 에리트로포이에틴에 노출됨으로써 이점을 취할 수 있는 임의의 응답 세포 및 이에 결합된 세포, 조직 및 기관에 관한 것이다. 또한, 단기간의 불리한 사건(예컨대, 외상) 후 에리트로포이에틴에 노출시킴으로써 세포, 조직 또는 기관 기능장애를 회복 또는 재생시킬 수 있다.
본 발명은 일반적으로 세포 기능을 유지, 촉진, 향상, 재생시키거나 또는 다른 방식으로 세포 기능에 유리하게 작용하는 전술한 목적을 위한 약학 조성물을 제조하기 위한, 에리트로포이에틴의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 에리트로포이에틴 효과량을 포유동물에게 투여함으로써 세포 기능을 유지, 향상, 촉진 또는 재생시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 에리트로포이에틴에 세포, 조직 또는 기관을 노출시킴으로써 생체 외에서 세포 기능을 유지, 촉진, 향상 또는 재생시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 기관 또는 조직 보존에 사용하기 위한, 에리트로포이에틴을 포함하는 관류 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다양한 방법은 포유동물 신체 내의 또는 포유동물 신체로부터 제거된 응답 세포에 긍정적인 효과 또는 이점을 주기 위하여 적어도 에리트로포이에틴을 효과적인 양으로 포함하는 약학 조성물을 특정 경로 및 노출 지속기간으로 이용한다. 의도되는 요법의 표적 세포, 조직 또는 기관이, 에리트로포이에틴이 내피 세포 장벽을 가로질러야 할 것으로 요구하는 경우, 약학 조성물은 내피 세포 장벽을 가로지른 후 응답 세포에 그의 목적하는 효과를 줄 수 있는 농도로 에리트로포이에틴을 포함한다. 에리트로포이에틴 수용체와 상호작용할 수 있고 수용체 활성을 조절할 수 있는 분자(이는 본원에서 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴 수용체 활성 조절제로 일컬어짐)가 본 발명에서 유용하다. 이들 분자는 예를 들어 전술한 에리트로포이에틴 분자의 천연-발생, 합성 또는 재조합 형태, 또는 본원에 기재된 바와 같이 에리트로포이에틴 응답 세포 활성을 조절하는 것을 제외하고는 어떤 방식으로든 반드시 에리트로포이에틴과 유사할 필요는 없는 다른 분자일 수 있다.
상기 확인된 조직 보호 속성에 덧붙여, 에리트로포이에틴은 골수에 대한 그의 효과, 즉 증가되는 적혈구용적율(적혈구 조혈), 혈관 수축(높은 혈압), 혈소판의 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성에 더욱 통상적으로 관련되어 있다. 그러나, 골수에 대한 이들 효과는 상기 논의된 세포, 조직 또는 기관 기능 장애를 치료하기 위한 에리트로포이에틴의 장기 및 단기 투여에 위험을 부여할 수 있다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 골수에 대한 에리트로포이에틴의 효과중 하나 이상을 바람직하게 갖지 않는 화학적으로 개질된 에리트로포이에틴으로 이루어진 조직 보호 사이토카인의 용도에 관한 것이다. 더욱 바람직하게는, 조직 보호 사이토카인은 적혈구 조혈 활성을 갖지 않으며; 가장 바람직하게는, 조직 보호 사이토카인은 골수에 대한 에리트로포이에틴의 효과를 모두 갖지 않는다. 다른 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 전술한 효과중 임의의 두 가지 또는 전술한 효과중 임의의 세 가지를 갖지 않는다.
또한, 본원에 기재된 용도에 바람직한 조직 보호 사이토카인은 다른 절차(예: 제한된 단백질 분해, 아미노기 제거 및/또는 분자생물학 기법에 의한 에리트로포이에틴의 아르기닌, 리신, 티로신, 트립토판 또는 시스테인 잔기의 변이 형성 치환)중에서도 특히 구아니딘화, 아마이드화, 카밤일화(카밤오일화), 트라이나이트로페닐화, 아세틸화, 석신일화, 질화, 또는 아르기닌, 리신, 티로신, 트립토판 또는 시스테인 잔기 또는 카복실기의 개질에 의해 생성될 수 있다. 바람직하게는, 이들 화학적 개질은 네 가지의 인정된 수용체 영역(VLQRY(서열 번호: 1), TKVNFYAW(서열 번호: 2), SGIRSLTTL(서열 번호: 3) 또는 SNFLRG(서열 번호: 4))에 영향을 끼친다. 더욱 바람직하게는, 본질상 염기성인 이들 수용체 영역을 이들 영역 내에서의 염기성 아미노산, 아르기닌 및 리신의 화학적 개질에 의해 변화시킨다. 또한, 이들 수용체 영역을 둘러싸는 분자의 구역을 마찬가지로 화학적으로 개질시켜, 분자의 동역학 또는 수용체 결합 특성에 영향을 끼칠 수 있다. 이에 의해, 특정 기관 및 조직에 대해서는 적절한 수준의 활성을 유지하지만 적혈구 같은 다른 기관 및 조직에 대해서는 그렇지 않은 조직 보호 사이토카인을 생성시킨다(예를 들어, 사타케(Satake) 등; 1990, Biochim. Biophys. Acta 1038:125-9; 본원에 참고로 인용됨). 아래에 기재되는 한 가지 비한정적인 예는 페닐글라이옥살 같은 글라이옥살과 반응시킴으로써 에리트로포이에틴의 아르기닌 잔기를 개질시키는 것이다(다카하시(Takahashi)의 문헌[1977, J. Biochem. 81:395-402]에 기재된 방법에 따름). 아래에서 볼 수 있는 바와 같이, 이러한 조직 보호 사이토카인 분자는 그의 향신경성 효과를 완전히 보유한다. 이러한 조직 보호 사이토카인 분자는 본원에 기재된 다양한 용도 및 조성물에 포함된다.
에리트로포이에틴 및 에리트로포이에틴-유사 분자의 활성(U)은 전통적으로 설치류 모델에서 적혈구 생산을 촉진시키는 그의 효율에 기초하여(또한 에리트로포이에틴의 국제 기준에 의해 유도된 바와 같이) 정의된다. 통상적인 에리트로포이에틴(MW ∼34,000) 1단위(U)는 단백질 약 8ng이다(1mg 단백질은 약 125,000U이다). 그러나, 적혈구 조혈에 대한 효과가 본원에서 목적하는 활성에 부수적으로 일어나고 반드시 본 발명의 특정 조직 보호 사이토카인의 검출가능한 특성이 아닐 수도 있기 때문에, 적혈구 조혈 활성에 기초한 본 발명의 특정 조직 보호 사이토카인의 활성 정의는 적절하지 않다. 따라서, 본원에서는, 동일한 시스템에서 WHO 국제 기준 에리트로포이에틴에 의해 도출된 것과 같이, 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인의 활성 단위는 신경 세포 시스템 또는 다른 응답 세포 시스템에서 동일한 활성을 이끌어내는데 필요한 단백질의 양으로서 정의된다. 당해 분야의 숙련자는 본원에 기재된 지침에 따라 적혈구 조혈성이 아닌 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인의 단위를 용이하게 결정한다.
전술한 조직 보호 사이토카인에 이어, 하기 논의는 본 발명의 다양한 조직 보호 사이토카인에 대한 것으로 확장된다.
본 발명의 조직 보호 사이토카인은 무-시알산 에리트로포이에틴으로 칭해지는, 시알산 잔기를 갖지 않는 에리트로포이에틴으로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조직 보호 사이토카인은 인간의 무-시알산 에리트로포이에틴이다. 프로자임 인코포레이티드(ProZyme Inc.)(캘리포니아주 산 린드로 소재) 제품인 시알리다제 A에 대한 제조업체의 패키지에 기재되어 있는 바와 같이, 시알리다제를 사용하여 에리트로포이에틴에서 시알산을 제거함으로써, 이를 제조할 수 있다. 전형적으로는, 프로자임(PROZYME), 글라이코프로(GLYCOPRO) 서열 결정 등급 시알리다제 A(SIALYDASE ATM)(N-아세틸뉴라미네이트 글라이코하이드롤라제, EC 3.2.1.18)를 사용하여 에리트로포이에틴 같은 복합 탄수화물 및 당단백으로부터 비-환원성 말단 시알산 잔기를 모두 절단한다. 이는 (내부 잔기에 연결된) 분지된 시알산도 절단한다. 시알리다제 A는 아트로박터 우레아파시엔스(Arthrobacter ureafaciens)의 클론으로부터 단리된다.
전술한 절차의 비한정적인 예에서는, 37℃에서 시알리다제(0.025U/mg EPO)에 의해 에리트로포이에틴으로부터 3시간동안 시알산을 제거한 후, 에리트로포이에틴을 탈염 및 농축시킬 수 있다. 악타프라임(AKTAPRIMETM) 시스템(애머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech)의 이온 교환 칼럼 상으로 통과시킨 후, 선택된 완충액으로 용리시키고, 면역전기영동에 의해 확인된 상부 2개의 밴드(IEF 겔 상에서 pI ∼8.5 및 ∼7.9에서 이동함)만을 함유하는 분획을 선택한다. 이 조직 보호 사이토카인 제조법에서는 유의한 양의 시알산이 검출되지 않아야 한다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 조직 보호 사이토카인은 전술한 방법에 의해 부분적으로 시알산을 제거함으로써 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상 또는 13개 이상의 시알산 잔기를 갖는 에리트로포이에틴일 수 있다. 에리트로포이에틴의 부분적인 시알산 제거에 의해 생성된 이들 조직 보호 사이토카인을 본원에서는 또한 하이포시알로에리트로포이에틴이라고도 할 수 있으며, 에리트로포이에틴 분자당 시알산을 2개만 갖는 동종 조성물일 수 있거나, 또는 다양한 상이한 시알릴화도의 이종 혼합물, 또는 에리트로포이에틴당 평균 약 1 내지 약 4개 같은 적은 수의 시알산 분자를 갖거나 또는 다른 예에서 에리트로포이에틴 분자당 평균 약 10 내지 약 13개 같은 보다 많은 수의 시알산을 갖는 이종 혼합물일 수 있다. 이러한 혼합물은 무-시알산 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴을 포함할 수 있다.
전술한 용도를 위한 에리트로포이에틴은 하나 이상의 개질된 아르기닌 잔기를 가질 수 있다. 예를 들어, 개질된 에리트로포이에틴은 하나 이상의 아르기닌 잔기 상에 R-글라이옥살(이때, R은 아릴, 헤테로아릴, 저급 알킬, 저급 알콕시 또는 사이클로알킬기, 또는 알파-데옥시글리시톨릴기일 수 있음) 잔기를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 용어 저급 "알킬"은 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 포화 지방족 탄화수소기를 의미한다. 이들 대표적인 기는 메틸, 에틸, 아이소프로필, 아이소뷰틸, 뷰틸, 펜틸, 헥실 등이다. 용어 "알콕시"는 산소에 의해 분자의 나머지 부분에 결합된 상기 정의된 저급 알킬기를 의미한다. 알콕시의 예로는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 아이소프로폭시 등이 있다. 용어 "사이클로알킬"은 3 내지 약 8개의 탄소를 갖는 환상 알킬기를 일컬으며, 예로는 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로헥실 등이 있다. 용어 아릴은 페닐 및 나프틸기를 나타낸다. 용어 헤테로아릴은 4 내지 10개의 고리원 및 산소, 질소 및 황으로 구성된 군에서 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 헤테로환상 기를 일컫는다. 예로는 아이속사졸릴, 페닐아이속사졸릴, 퓨릴, 피리미딘일, 퀴놀릴, 테트라하이드로퀴놀릴, 피리딜, 이미다졸릴, 피롤리딘일, 1,2,4-트라이아조일릴, 티아졸릴, 티에닐 등이 있으나 이들로 한정되지는 않는다. R 기는 예컨대 3-데옥시글루코손의 2,3,4-트라이하이드록시뷰틸기에서와 같이 치환될 수 있다. R-글라이옥살 화합물의 전형적인 예는 글라이옥살, 메틸글라이옥살, 3-데옥시글루코손 및 페닐글라이옥살이다. 바람직한 R-글라이옥살 화합물은 메틸글라이옥살 또는 페닐글라이옥살이다. 페닐글라이옥살을 사용하는 이러한 개질 방법의 예는 워버(Werber) 등의 문헌[1975, Isr. J. Med. Sci. 11(11): 1169-70]에서 찾아볼 수 있다.
다른 예에서는, pH 8 내지 9의 보레이트 완충액 약 50밀리몰 중에서 2,3-뷰테인다이온 또는 사이클로헥세인다이온 같은 인접한 다이케톤과 반응시킴으로써 하나 이상의 아르기닌 잔기를 개질시킬 수 있다. 2,3-뷰테인다이온을 사용한 개질 절차는 리올단(Riordan)의 문헌[1973, Biochemistry 12(20): 3915-3923]에 따라 수행될 수 있으며; 사이클로헥산온을 사용한 개질 절차는 패티(Patthy) 등의 문헌[1975, J. Biol. Chem 250(2):565-9]에 따라 수행될 수 있다.
본 발명의 조직 보호 사이토카인은 하나 이상의 개질된 리신 잔기를 포함할 수 있거나, 또는 리신 잔기를 아미노기-개질제와 반응시킴으로써 개질시키는 것과 같이 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기가 개질될 수 있다. 예를 들어, 아미노기를 개질시키는 다른 방법 중에서도 특히 아세틸화, 카밤일화, 석신일화, 산화 및 후속 카복시메틸리신화에 의해 에리트로포이에틴 또는 전술한 무-시알산 에리트로포이에틴 또는 하이포시알로에리트로포이에틴을 개질시킬 수 있다.
비제한적인 예에서는, 에리트로포이에틴 또는 무-시알산 에리트로포이에틴 같은 시알산 제거된 에리트로포이에틴을 보레이트 완충액 중에서 재결정화된 시안산칼륨으로 카밤일화시킨 후 완전히 투석시킴으로써, 조직 보호 사이토카인을 제조할 수 있다.
마찬가지로, 석신산 무수물과 반응시킴으로써 전술한 에리트로포이에틴을 석신일화시킨 후 투석시킴으로써, 본 발명의 조직 보호 사이토카인을 형성시킬 수 있다.
또 다른 실시태양에서는, 포스페이트 완충액 중에서 에리트로포이에틴을 아세트산 무수물과 반응시켜 에리트로포이에틴을 아세틸화시킴으로써 조직 보호 사이토카인을 제조할 수 있다. 물에 대해 투석함으로써 이 반응을 중지시킬 수 있다. 이 방법은 사타케 등의 문헌[(1990), Chemical Modification of erythropoietin: an increase in in-vitro activity by guanidination, Biochimica et Biophysica Acta. 1038:125-129]에 기재되어 있다.
다른 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 인산나트륨 완충액에서 글라이옥실산 및 NaBH3CN과의 반응 후 투석에 의해 제조된 에리트로포이에틴 또는 무-시알산 에리트로포이에틴으로부터의 Nε-(카복시메틸)리신(CML) 부가물이다. 액타(Akhtar) 등의 문헌[(1999) Conformational study of Nε-(carboxymethyl)lysine adducts of recombinant a-crystallins. Current Eye Research, 18:270-276].
다른 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 에리트로포이에틴의 리신 잔기를 글라이옥살, 메틸글라이옥살 및 3-데옥시글루코손과 같은 글라이옥살 유도체와 반응시켜 알파-카복시알킬 유도체를 형성함에 의해 개질시킴으로써 제조된다. 예로는, 글롬(Glomb) 및 모니에르(Monnier)의 문헌[1995, J. Biol. Chem. 270(17):10017-26]에서와 같이 글라이옥살과 반응시켜 카복시메틸리신 잔기를 제조하는 것, 또는 데겐하르트(Degenhardt) 등의 문헌[1998, Cell. Mol. Biol.(Noisy-le-grand) 44(7):1139-45]에서와 같이 메틸글라이옥살과 반응시켜 (1-카복시에틸)리신 잔기를 제조하는 것이 있다. 개질된 리신 잔기는 추가로 화학적으로 환원될 수 있다. 예를 들어, 워초우스키(Wojchowski) 및 카슬레이크(Caslake)의 문헌[1989, Blood 74(3):952-8]에 기재되어 있는 바와 같이, D-바이오틴일-ε-아미노카프로산-N-하이드록시석신이미드 에스터를 에리트로포이에틴과 반응시킨 후 센트리콘(Centricon) 10 칼럼에서 겔 투과에 의해 미반응 바이오틴을 제거하는 실시예 2에 기재되어 있는 방법에 따라, 에리트로포이에틴을 리신기를 통해 바이오틴일화시킬 수 있다. 상기 문헌에서, 저자는 에리트로포이에틴을 바이오틴일화시키는 3가지 상이한 방법을 이용하는데, 이들중 임의의 방법을 이용하여 본원에 사용하기 위한 조직 보호 사이토카인을 제조할 수 있다. 바이오틴을 (1) 시알산 잔기, (2) 카복실레이트기 또는 (3) 아미노기에 첨가할 수 있다.
다른 바람직한 실시태양에서는, 리신을 알데하이드 또는 환원당과 반응시켜 아민을 제조할 수 있고, 이를 소듐 사이아노보로하이드라이드로 환원시켜 글루시톨릴 리신과 같은 N-알킬화된 리신을 제조함으로써 안정화시킬 수 있거나, 또는 환원당의 경우, 아마도리 또는 헤인즈 전위에 의해 알파-데옥시-알파-프럭토실리신과 같은 알파-데옥시 알파-아미노 당을 형성함으로써 안정화시킬 수 있다. 예로서, pH 7.4의 인산나트륨 완충액 중에서 0.5M 글루코즈를 사용하여 60일간 항온처리함으로써 프럭토실리신-개질된 단백질을 제조함이 마키타(Makita) 등의 문헌[1992, J. Biol. Chem. 267:5133-5138]에 기재되어 있다. 다른 예에서는, 리신을 예컨대 사이아네이트 이온과 반응시켜 카밤일화시킬 수 있거나, 또는 알킬- 또는 아릴-아이소사이아네이트 또는 -아이소티오사이아네이트로 알킬- 또는 아릴-카밤일화 또는 -티오카밤일화시킬 수 있거나, 또는 이를 예컨대 아세트산 무수물, 석신산 무수물 또는 프탈산 무수물과 반응시키는 것과 같은 반응성 알킬- 또는 아릴카복실산 유도체에 의해 아실화시킬 수 있다. 예로는, 4-설포페닐아이소티오사이아네이트 또는 아세트산 무수물을 사용하는 리신기의 개질이 있다(이들 방법은 둘다 가오(Gao) 등의 문헌[1994, Proc Natl Acad Sci USA 91(25):12027-30]에 기재되어 있다). 리신기는 또한 트라이나이트로벤젠설폰산 또는 바람직하게는 그의 염과 반응시킴으로써 트라이나이트로페닐 개질될 수 있다. 이러한 방법은 아래 실시예 2에 기재되어 있다.
예컨대 질화 또는 요오드화에서와 같은 친전자성 시약에 의해 에리트로포이에틴의 하나 이상의 티로신 잔기를 방향족 고리 위치에서 개질시킬 수 있다. 비제한적인 예로서, 에리트로포이에틴을 테트라나이트로메테인과 반응시키거나(네슬러(Nestler) 등, 1985, J. Biol. Chem. 260(12):7316-21) 또는 실시예 3에 기재되어 있는 바와 같이 요오드화시킬 수 있다. 예를 들어, 인산나트륨 완충액 중에서 에리트로포이에틴 또는 무-시알산 에리트로포이에틴을 사용하여 NaI 및 아이오도-젠 예비 코팅된 요오드화 관(IODO-GEN Pre-Coated Iodination Tube)(피어스(Pierce), 28601)으로 요오드화를 수행할 수 있다.
예컨대 카보다이이미드와 반응시킨 후 글라이신아마이드와 같은(그러나 이에 국한되지는 않음) 아민과 반응시킴으로써, 적어도 에리트리포이에틴의 아스파트산 또는 글루탐산 잔기를 개질시킬 수 있다.
다른 예에서는, 예컨대 요스(Josse) 등의 문헌[Chem Biol Interact 1999년 5월 14일;119-120]에 기재되어 있는 방법에 따라 n-브로모석신이미드 또는 n-클로로석신이미드와 반응시킴으로써 에리트로포이에틴의 트립토판 잔기를 개질시킬 수 있다.
또 다른 예에서는, 닌하이드린과 반응시킨 후, 보로하이드라이드와 반응시켜 카본일기를 후속 환원시킴으로써 획득할 수 있는 것과 같이, 천연 에리트로포이에틴의 하나 이상의 아미노기를 제거함으로써 조직 보호 사이토카인을 제조할 수 있다.
여전히 다른 예에서는, 다이티오트레이톨과 같은 환원제와 반응시킨 후 아이오도아세트아마이드, 아이오도아세트산 또는 다른 친전자체와 후속 설프하이드릴을 반응시켜 다이설파이드 결합의 재형성을 방해함으로써, 에리트로포이에틴 분자의 하나 이상의 시스틴 결합이 적어도 결손된 조직 보호 사이토카인이 제공된다. 상기 지적된 바와 같이, 다르게는 또한 함께, 실제 가교결합에 참여하는 시스테인 분자를 변화시키거나 또는 천연 분자에 존재하는 다이설파이드 결합중 하나 이상을 형성하는 에리트로포이에틴을 무력하게 만드는 하나 이상의 다른 아미노산 잔기를 변화시킴으로써, 다이설파이드 결합을 없앨 수 있다.
에리트로포이에틴에 대해, 특정 잔기를 표적으로 하는, 예를 들어 트립토판 잔기 뒤를 절단하는 제한된 화학적 단백질 분해를 수행함으로써 조직 보호 사이토카인을 제조할 수 있다. 이렇게 생성된 에리트로포이에틴 분절은 본원에 포함된다.
상기 나타낸 바와 같이, 본원의 목적에 유용한 조직 보호 사이토카인은 전술한 바와 같이 하나 이상 개질될 수 있으나, 그보다 많이 개질될 수도 있다. 분자의 탄수화물 부분이 개질되고 아미노산 부분이 또한 개질된 조직 보호 사이토카인의 예로서, 조직 보호 사이토카인은 무-시알산 에리트로포이에틴일 수 있으며, 바이오틴일화 및 카밤일화된 그의 리신 잔기를 갖는다.
뿐만 아니라, 에리트로포이에틴의 하나 이상의 아미노산을 변이시킴으로써 화학적으로 개질된 에리트로포이에틴을 추가로 개질시킬 수 있다. 이러한 변이는 치환, 내부 결실을 비롯한 결실, 융합 단백질을 생성시키는 첨가를 비롯한 첨가, 또는 아미노산 서열 내의 및/또는 아미노산 서열에 인접한 아미노산 잔기의 보수적인 치환을 함유할 수 있지만, 이러한 변화가 기능면에서 동일한 에리트로포이에틴을 생성시킨다는 점에서 "표시나지 않는" 변화를 야기한다. 보수적인 아미노산 치환은 관련된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽성에서의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 아이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하며; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파트산 및 글루탐산을 포함한다. 다르게는, 보수적이지 않은 아미노산 변화 및 보다 큰 삽입 및 결실을 이용하여 기능면에서 변화된 에리트로포이에틴을 생성시킬 수 있다. 이러한 변이체는 에리트로포이에틴 특성을 목적하는 방식으로 변화시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 본 발명을 실행하는데 유용한 에리트로포이에틴은 수용체 결합에 영향을 끼치는 에리트로포이에틴의 네가지 기능 도메인(VLQRY(서열 번호: 1) 및/또는 TKVNFYAW(서열 번호: 2) 및/또는 SGLRSLTTL(서열 번호: 3) 및/또는 SNFLRG(서열 번호: 4)) 내의 하나 이상의 아미노산이 변화될 수 있다. 다른 실시태양에서는, 분자의 동역학 또는 수용체-결합 특성에 영향을 끼치는 분자의 주변 영역에서의 변이를 함유하는 에리트로포이에틴을 사용할 수 있다.
이들 추가적인 개질을 이용하여 조직 보호 사이토카인의 효과를 향상시키거나 골수 효과를 억제하거나 조직 보호 사이토카인의 전하 같은 물리적 특성을 변화시킬 수 있다.
본 발명의 조직 보호 사이토카인을 제조하는 상기 예시적인 방법은 단순히 예를 든 것으로 한정적인 의미가 아니며, 이들 방법 또는 다른 방법을 이용하여 본 발명의 화합물을 제조할 수 있다. 제조 방법이 명칭 내에 포함되어 있는 상기 명칭(예: "아세틸화" 또는 "바이오틴일화")은 단순히 화합물이 어떻게 제조되었는지를 이해하는 수단으로서 제공되며, 본 발명은 전술한 반응의 생성물인 화합물에 관한 것이다. 당해 분야의 숙련자는 상기 언급된 반응의 생성물인 화합물을 쉽게 알 수 있을 것이다. 이제까지는 본 발명의 개질의 영역 및 에리트로포이에틴 또는 개질된 에리트로포이에틴 분자상의 하나 이상의 부위에서 이들이 발생될 수 있음을 전달하기 위하여 본 발명의 화합물을 비공식적이거나 통속적인 명칭으로 지칭하였다. 비제한적인 예로서, 하기 특정 화합물은 본원에 포함되는 화합물 군의 일원이다.
1. 카밤일화된 에리트로포이에틴: 하기 화합물은 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기상에("알파-N-카밤오일-") 또는 에리트로포이에틴의 리신 잔기의 하나(이상)의 엡실론 아미노기상에("N-엡실론-카밤오일-") 카밤오일 잔기를 나타낸다. 물론, 알파-N-개질과 함께 또는 없이 다수의 N-엡실론 개질이 존재할 수 있다.
i. 알파-N-카밤오일에리트로포이에틴;
ii. N-엡실론-카밤오일에리트로포이에틴;
iii. 알파-N-카밤오일, N-엡실론-카밤오일에리트로포이에틴;
iv. 알파-N-카밤오일아시알로에리트로포이에틴;
v. N-엡실론-카밤오일아시알로에리트로포이에틴;
vi. 알파-N-카밤오일, N-엡실론-카밤오일아시알로에리트로포이에틴;
vii. 알파-N-카밤오일하이포시알로에리트로포이에틴;
viii. N-엡실론-카밤오일하이포시알로에리트로포이에틴; 및
ix. 알파-N-카밤오일, N-엡실론-카밤오일하이포시알로에리트로포이에틴.
2. 석신일화된 에리트로포이에틴: 하기 화합물은 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기상에("알파-N-석신일-") 또는 에리트로포이에틴의 리실 잔기의 하나(이상)의 엡실론 아미노기상에("N-엡실론-석신일-") 석신일 잔기를 나타낸다. 물론, 알파-N-개질과 함께 또는 없이 다수의 N-엡실론 개질이 존재할 수 있다.
i. 알파-N-석신일에리트로포이에틴;
ii. N-엡실론-석신일에리트로포이에틴;
iii. 알파-N-석신일, N-엡실론-석신일에리트로포이에틴;
iv. 알파-N-석신일아시알로에리트로포이에틴;
v. N-엡실론-석신일아시알로에리트로포이에틴;
vi. 알파-N-석신일, N-엡실론-석신일아시알로에리트로포이에틴;
vii. 알파-N-석신일하이포시알로에리트로포이에틴;
viii. N-엡실론-석신일하이포시알로에리트로포이에틴; 및
ix. 알파-N-석신일, N-엡실론-석신일하이포시알로에리트로포이에틴.
3. 아세틸화된 에리트로포이에틴: 하기 화합물은 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기상에("알파-N-아세틸-") 또는 에리트로포이에틴의 리실 잔기의 하나(이상)의 엡실론 아미노기상에("N-엡실론-아세틸-") 아세틸 잔기를 나타낸다. 물론, 알파-N-개질과 함께 또는 없이 다수의 N-엡실론 개질이 존재할 수 있다.
i. 알파-N-아세틸에리트로포이에틴;
ii. N-엡실론-아세틸에리트로포이에틴;
iii. 알파-N-아세틸, N-엡실론-아세틸에리트로포이에틴;
iv. 알파-N-아세틸아시알로에리트로포이에틴;
v. N-엡실론-아세틸아시알로에리트로포이에틴;
vi. 알파-N-아세틸, N-엡실론-아세틸아시알로에리트로포이에틴;
vii. 알파-N-아세틸하이포시알로에리트로포이에틴;
viii. N-엡실론-아세틸하이포시알로에리트로포이에틴; 및
ix. 알파-N-아세틸, N-엡실론-아세틸하이포시알로에리트로포이에틴.
4. 바이오틴일화된 에리트로포이에틴: 하기 화합물은 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기상에("알파-N-바이오틴일-") 또는 에리트로포이에틴의 리실 잔기의 하나(이상)의 엡실론 아미노기상에("N-엡실론-바이오틴일-") 바이오틴일 잔기를 나타낸다. 물론, 알파-N-개질과 함께 또는 없이 다수의 N-엡실론 개질이 존재할 수 있다.
i. 알파-N-바이오틴일에리트로포이에틴;
ii. N-엡실론-바이오틴일에리트로포이에틴;
iii. 알파-N-바이오틴일, N-엡실론-바이오틴일에리트로포이에틴;
iv. 알파-N-바이오틴일아시알로에리트로포이에틴;
v. N-엡실론-바이오틴일아시알로에리트로포이에틴;
vi. 알파-N-바이오틴일, N-엡실론-바이오틴일아시알로에리트로포이에틴;
vii. 알파-N-바이오틴일하이포시알로에리트로포이에틴;
viii. N-엡실론-바이오틴일하이포시알로에리트로포이에틴; 및
ix. 알파-N-바이오틴일, N-엡실론-바이오틴일하이포시알로에리트로포이에틴.
5. 요오드화된 에리트로포이에틴: 물론, 당해 분야의 숙련자는 에리트로포이에틴 내의 수개의 상이한 티로신 잔기 및 티로신 잔기의 조합을 요오드화시킬 수 있고, 이래 제공된 것이 단순히 예시적인 것임을 알 것이다.
i. 아이오도에리트로포이에틴;
ii. 아이오도아시알로에리트로포이에틴; 및
iii. 아이오도하이포시알로에리트로포이에틴.
6. 카복시메틸리실-에리트로포이에틴: 하기 화합물은 에리트로포이에틴의 리실 잔기의 하나(이상)의 엡실론 아미노기상에 카복시메틸 잔기를 나타낸다("N-엡실론-카복시메틸-"). 물론, 다수의 N-엡실론 개질이 존재할 수 있다.
i. N-엡실론-카복시메틸에리트로포이에틴;
ii. N-엡실론-카복시메틸아시알로에리트로포이에틴; 및
iii. N-엡실론-카복시메틸하이포시알로에리트로포이에틴.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 사용하여 본 발명의 에리트로포이에틴 및 에리트로포이에틴-관련 분자를 제조할 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 흥미 있는 에리트로포이에틴을 제조한 다음 정제할 수 있는 비히클을 제공하지만, 또한 적절한 뉴클레오타이드 코딩 서열로 형질전환 또는 형질감염될 때 원위치에서 개질된 에리트로포이에틴 유전자 생성물을 나타낼 수 있는 세포도 제공한다. 이들은, 개질된 에리트로포이에틴 생성물 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예: 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 에리트로포이에틴-관련 분자 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예: 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나, 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예: Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터(예: 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유도된 프로모터(예: 아데노바이러스 말기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구조물을 갖는 인간 세포 시스템을 비롯한 포유동물 세포 시스템(예: HT1080, COS, CHO, BHK, 293, 3T3)과 같은(그러나, 이들로 한정되지는 않음) 세균, 곤충, 식물, 인간을 비롯한 포유동물 숙주 시스템을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 목적하는 특정 방식으로 유전자 생성물을 개질 및 처리하는 숙주 세포주를 선택할 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 개질(예: 당화) 및 처리(예: 절단)는 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역 후 처리 및 개질에 특이적인 특징적 메카니즘을 갖는다. 발현된 외래 단백질을 확실히 올바르게 개질 및 처리하는데 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 이를 위해, 유전자 생성물의 1차 전사, 당화 및 포스포릴화의 적절한 처리를 위한 세포 기관을 갖는 진핵 숙주 세포를 이용할 수 있다. 이러한 인간 숙주 세포를 비롯한 포유동물 숙주 세포는 HT1080, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3 및 WI38을 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다.
재조합 단백질의 장기 고수율 생산을 위해서는 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 에리트로포이에틴-관련 분자 유전자 생성물을 안정하게 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 바이러스성 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다는 적절한 발현 제어 요소(예: 프로모터, 증진인자, 서열, 전사 종결제, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택가능한 마커에 의해 조절되는 DNA로 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA를 도입한 후, 조작된 세포를 풍부한 배지에서 1 내지 2일간 생육시킨 다음 선택적인 배지에 바꿔넣는다. 재조합 플라스미드 내의 선택가능한 마커는 선택에 대한 저항성을 부여하며, 세포가 플라스미드를 염색체로 안정되게 통합하고 생육하도록 함으로써 다시 클로닝되어 세포주 내로 전개시킬 수 있는 포커스를 형성하도록 한다. 에리트로포이에틴-관련 분자 유전자 생성물을 발현하는 세포주를 조작하는데 이 방법을 유리하게 사용할 수 있다. 이러한 조작된 세포주는 에리트로포이에틴-관련 분자 유전자 생성물의 내인성 활성에 영향을 끼치는 화합물의 선별 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
다르게는, 삽입된 조절 요소가 내인성 에리트로포이에틴 유전자와 작동가능하게 연결되도록, 안정한 세포주 또는 클로닝된 미생물의 게놈내로 이종 DNA 조절 요소를 삽입함으로써, 세포주 또는 미생물 내에서 내인성 에리트로포이에틴 유전자의 발현 특징을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 통상 "전사 면에서 표시나지 않는" 내인성 에리트로포이에틴 유전자, 즉 통상 발현되지 않거나 또는 세포주에서 매우 낮은 수준으로만 발현되는 에리트로포이에틴 유전자는, 그 세포주 또는 미생물에서 통상적으로 발현되는 유전자 생성물의 발현을 촉진시킬 수 있는 조절 요소를 삽입함으로써 활성화될 수 있다. 다르게는, 세포 유형에 관계없이 작용하는 혼잡스러운 조절 요소를 삽입함으로써, 내인성 에리트로포이에틴 유전자를 활성화시킬 수 있다.
당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어 각각 본원에 참고로 인용되어 있는 인스티튜트 파스퇴르(Institut Pasteur)의 프랑스 특허 제 2646438 호; 채펠(Chappel)의 미국 특허 제 4,215,051 호; 셔윈(Sherwin) 등의 미국 특허 제 5,578,461 호; 셀던(Selden) 등의 국제 특허원 제 PCT/US92/09627 호(WO 93/09222 호); 및 스콜치(Skoultchi) 등의 국제 특허원 제 PCT/US90/06436 호(WO 91/06667 호)에 기재되어 있는 표적화된 동종 재조합 같은 기법을 이용하여, 이종 조절 요소가 내인성 에리트로포이에틴 유전자와 작동가능하게 연결되도록 이 조절 요소를 안정한 세포주 또는 클로닝된 미생물 내로 삽입할 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인은 시알산 잔기가 부족하거나 시알산 잔기를 전혀 갖지 않는 화학적으로 개질된 에리트로포이에틴 분자이고, 인간 세포를 비롯한 포유동물 세포에서 생성될 수 있다. 이러한 세포를 조작하여 시알산을 첨가시키는 효소, 즉 β-갈락토사이드 α 2,3 시알릴트랜스퍼라제("α 2,3 시알릴트랜스퍼라제") 및 β-갈락토사이드 α 2,6 시알릴트랜스퍼라제("α 2,6 시알릴트랜스퍼라제") 활성이 부족해지도록 하거나 이들 활성을 갖지 않게 할 수 있다. 한 실시태양에서는, α 2,3 시알릴트랜스퍼라제 유전자 및/또는 α 2,6 시알릴트랜스퍼라제 유전자중 하나 또는 둘 모두가 결실된 포유동물 세포를 이용한다. 당해 분야에 널리 공지되어 있는 유전자 결실(knock-out) 기법을 이용하여 이렇게 결실시킬 수 있다. 다른 실시태양에서는, 재조합 에리트로포이에틴-관련 분자를 생성시키기 위한 숙주 세포로서 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)가 결핍된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 이용한다. CHO 세포는 α 2,6 시알릴트랜스퍼라제를 발현시키지 않으며, 따라서 이들 세포에서 생성된 당단백의 N-결합된 올리고사카라이드로의 2,6 결합에 시알산을 첨가하지 않는다. 그 결과, CHO 세포에서 생성된 재조합 단백질은 갈락토즈로의 2,6-결합에 시알산을 갖지 않는다(사사키(Sasaki) 등(1987); 다케우치(Takeuchi) 등, 상기 문헌; 무차스(Mutsaers) 등, Eur. J. Biochem. 156, 651 (1986); 다케우치 등, J. Chromotgr. 400, 207 (1987)). 한 실시태양에서는, 무-시알산 에리트로포이에틴을 생성시키기 위한 숙주 세포를 생성시키기 위해, CHO 세포의 α 2,3-시알릴트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 결실시킨다. 이러한 α2,3 시알릴트랜스퍼라제가 결실된 CHO 세포는 시알릴트랜스퍼라제 활성을 완전히 상실하고, 그 결과 무-시알산 에리트로포이에틴으로 이루어진 조직 보호 사이토카인의 재조합 발현 및 생성에 유용하다.
다른 실시태양에서는, 골지(Golgi) 장치 내로의 시알산 수송을 방해함으로써 무-시알산 당당백을 생성시킬 수 있다(예컨대, 에크하르트 등, 1998, J. Biol. Chem. 273:20189-95). 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있는 방법(예를 들어, 올만(Oelmann) 등, 2001, J. Biol. Chem. 276:26291-300)을 이용하여, 뉴클레오타이드 당 CMP-시알산 수송인자의 변이를 유발시켜 차이니즈 햄스터 난소 세포의 변이체를 생성시킬 수 있다. 이들 세포는 에리트로포이에틴과 같은 당단백에 시알산 잔기를 첨가할 수 없으며, 무-시알산 에리트로포이에틴만을 생성시킨다.
에리트로포이에틴을 생성시키는 형질감염된 포유동물 세포는 또한 세포질 시알리다제를 생성시키는데, 이 효소는 배지 내로 흘러들어갈 경우 시알로에리트로포이에틴을 높은 효율로 분해시킨다(예를 들어, 그래머 등, 1995 Biotechnology 13:692-698). 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있는 방법(예컨대, 페라리(Ferrari) 등의 문헌[1994, Glycobiology 4:367-373]에 기재되어 있는 정보)을 이용하여, 구조적으로 시알리다제를 생성시키도록 세포주를 형질감염시키거나 변이시키거나 또는 다른 방식으로 유도할 수 있다. 이러한 방식으로, 무-시알산 에리트로포이에틴의 제조동안 무-시알산 에리트로포이에틴을 생성시킬 수 있다.
본 발명의 조직 보호 사이토카인은 분자의 당화 상태에 관계없이 에리트로포이에틴의 아미노산 잔기가 하나 이상의 개질된다. 상기 언급된 바와 같이, 화학적 개질은 하나 이상의 아미노산(예: 리신 잔기)의 하나 이상의 아미노기, 또는 N-말단 아미노기의 개질, 또는 하나 이상의 티로신 잔기의 요오드화일 수 있다.
본 발명의 재조합 조직 보호 사이토카인 및 화학적으로 개질된 재조합 조직 보호 사이토카인의 제조 후, 당해 분야의 숙련자는 널리 공지되어 있는 분석을 이용하여 사이토카인의 조직 보호 속성 및 골수에 대한 효과의 부재를 입증할 수 있다.
예를 들어, TF-1 분석의 사용을 통해 재조합 조직 보호 사이토카인의 적혈구 조혈 효과의 부재를 입증할 수 있다. 이 분석에서는, CO2 배양기에서 GM-CSF 5ng/ml 및 10% FCS가 보충된 완전 RPMI 배지에서 TF-1 세포를 37℃에서 하룻동안 생육시킨다. 이어 세포를 기아 배지(GM-CSF 없이 5% FCS)에서 세척한 다음, 16시간동안 상기 기아 배지에 106개 세포/ml의 밀도로 현탁시킨다. (1) 외부 웰에 멸균수 100㎕를 첨가하여 수분을 유지시키고; (2) 배지(세포 또는 GM-CSF 없이 10% FCS)만 5개 웰에 첨가하고; (3) 10% FCS를 함유하는 배지 및 재조합 조직 보호 사이토카인으로 나머지 웰에 25,000개 세포/웰을 접종함으로써(시험되는 사이토카인당 5개의 웰), 96개 웰 플레이트를 준비한다. 세포가 증식되면, 재조합 조직 보호 사이토카인이 적혈구 조혈성일 수 있다. 재조합 조직 보호 사이토카인으로 인한 적혈구용적율의 증가를 모니터링하는 생체내 분석으로 화합물의 생체내 효과를 시험해야 한다. 음성 결과-시험관내 분석에서 TF-1에서 세포가 증식하지 않거나 생체내 분석에서 적혈구용적율이 증가하지 않음-는 재조합 조직 보호 사이토카인이 적혈구 조혈성이 아님을 의미한다.
아래에 더욱 상세하게 그 개요가 기재되어 있는 P-19 시험관내 분석 또는 래트에서의 물 중독 생체내 분석을 이용하여, 재조합 조직 보호 사이토카인의 조직 보호 특성을 입증할 수 있다. 상기 분석은 예로서 제공된 것이며, 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 사이토카인의 골수 및 조직 보호에 대한 효과를 결정하는 다른 적합한 분석도 또한 본 발명에서 고려된다.
본 발명의 한 요지를 실시하는데 있어서, 조직 보호 사이토카인을 함유하는 상기 기재된 약학 조성물은, 내피 세포 장벽을 가로질러 이동하고 응답 세포에 유리한 효과를 제공하기에 충분한 수준의 조직 보호 사이토카인을 혈관에 제공하는 임의의 경로에 의해 포유동물에게 투여될 수 있다. 조직 또는 기관에 관류시키기 위해 사용될 때에도 유사한 결과가 요구된다. 조직 보호 사이토카인을 생체외 관류에 사용하는 경우, 조직 보호 사이토카인은 임의의 전술한 화학적으로 개질된 에리트로포이에틴일 수 있다. 세포 또는 조직이 혈관을 포함하지 않고/않거나 세포 또는 조직을 본 발명의 조성물에 침지시킴으로써 투여하는 경우, 약학 조성물은 응답 세포에 유리한 양의 조직 보호 사이토카인을 제공한다. 조직 보호 사이토카인이 가로질러 이동할 수 있는 내피 세포 장벽은 치밀 이음부, 관통된 이음부, 작은 구멍이 있는 이음부 및 포유동물에 존재하는 내피 장벽의 임의의 다른 유형을 포함한다. 바람직한 장벽은 내피 세포 치밀 이음부이지만, 본 발명은 그것으로만 한정되지는 않는다.
전술한 조직 보호 사이토카인은 일반적으로 주로 신경 또는 정신 증상을 갖는 인간의 중추신경계 또는 말초신경계의 질환, 안질환, 심혈관 질환, 심폐 질환, 호흡기 질환, 신장 질환, 비뇨생식기 질환, 뼈 질환, 피부 질환, 위장관 질환 및 내분비 및 대사 이상을 치료 또는 예방하는데 유용하다. 특히, 이러한 증상 및 질병은 흥분성 조직, 예를 들어 뇌, 심장 또는 망막/눈과 같은 중추신경계 조직, 말초신경계 조직, 또는 심조직 또는 망막 조직의 흥분성 조직에 불리한 영향을 끼치는 저산소증을 포함한다. 따라서, 다양한 조건 및 환경에서의 저산소 조건으로부터 야기되는 흥분성 조직의 손상을 치료 또는 예방하는데 본 발명을 이용할 수 있다. 이러한 조건 및 환경의 비제한적인 예가 하기 표에 기재되어 있다.
본 발명에 따라 치료될 수 있는 신경조직 병증의 보호의 예에서, 이러한 병증은 신경 조직의 산소화 감소로 인해 야기된 것을 포함한다. 신경 조직의 산소 이용효율을 감소시키는 임의의 증상(이로 인해, 스트레스, 손상이 생기고, 최종적으로는 신경 세포가 사멸함)을 본 발명의 방법에 의해 치료할 수 있다. 일반적으로 저산소증 및/또는 허혈로 일컬어지는 이들 증상은 중풍, 혈관 폐색, 출산 전 또는 출산 후 산소 차단, 질식, 기도폐색, 거의 익사할 뻔한 상태, 일산화탄소 중독, 연기 흡입, 수술 및 방사선치료를 비롯한 외상, 질식, 간질, 저혈당증, 만성 폐색성 폐 질환, 폐기종, 성인 호흡곤란 증후군, 저혈압 쇼크, 패혈증 쇼크, 아나필락시스 쇼크, 인슐린 쇼크, 낫적혈구 뇌졸중, 심장정지, 율동장애, 질소 마취, 및 심폐 회로술에 의해 야기된 신경 결핍으로부터 일어나거나 이러한 질환을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.
한 실시태양에서는, 예를 들어 종양 절제 또는 동맥류 치유와 같은 수술 과정동안의 손상 또는 조직 손상 위험으로부터 야기되는 손상 또는 조직 손상을 방지하기 위해, 특정 조직 보호 사이토카인 조성물을 투여할 수 있다. 본원에 기재된 방법에 의해 치료될 수 있는 저혈당증에 의해 야기되거나 발병되는 다른 병증은 원인불명 고인슐린혈증으로도 불리는 인슐린 과다투여, 인슐린종, 성장 호르몬 결핍, 저코티솔혈증, 약물 과다투여 및 특정 암을 포함한다.
흥분성 신경 조직 손상으로부터 발병되는 다른 병증은 간질, 경련 또는 만성 발작 장애와 같은 발작 장애를 포함한다. 다른 치료가능한 증상 및 질환은 중풍, 다발성 경화증, 저혈압, 심장정지, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 뇌성마비, 뇌 또는 척수 외상, AIDS 치매, 연령-관련 인지 기능 상실, 기억 상실, 근위축성 측삭 경화증, 발작 장애, 알콜 중독, 망막 허혈, 녹내장으로 인한 시신경 손상 및 신경 세포 손상과 같은 질환을 포함한다.
본 발명의 특정 조성물 및 방법을 사용하여 질병 상태 또는 다양한 외상으로부터 야기된 염증(예컨대, 물리적으로 또는 화학적으로 유도된 염증)을 치료할 수 있다. 이러한 외상은 관염, 만성 기관지염, 췌장염, 골수염, 류마티스성 관절염, 사구체신염, 시신경염, 관자동맥염, 뇌염, 수막염, 횡단 척수염, 피부근육염, 다발근육염, 괴사 근막염, 간염 및 괴사 신장결장염을 포함할 수 있다.
증거에 의해, 활성화된 별아교세포가 신경독소를 생성시킴으로써 신경세포에 대해 세포독성 작용을 할 수 있는 것으로 입증되었다. 대뇌 허혈에 응답하여 신경아교세포로부터 산화질소, 반응성 산소 부류 및 사이토카인이 방출된다(벡커(Becker, K.J.)의 문헌[2001, Targeting the central nervous system inflammatory response in ischemic stroke. Curr Opinion Neurol 14:349-353] 및 매트슨(Mattson, M.P.), 컴시(Culmsee, C.) 및 유(Yu, Z.F)의 문헌[2000, Apoptotic and Antiapoptotic mechanisms in stroke. Cell Tissue Res 301:173-187] 참조). 연구가 진행됨에 따라, 신경 변성 모델에서, 신경아교세포 활성화 및 염증성 사이토카인의 후속 생성이 1차 신경세포 손상에 달려있음이 추가로 임증되었다(비비아니(Viviani, B.), 콜시니(Corsini, E.), 갈리(Galli, C.L.), 파도바니(Padovani, A.), 시우사니(Ciusani, E.) 및 마리노비치(Marinovich, M.)의 문헌[2000, Dying neural cells activate glia through the release of a protease product, Glia 32:84-90] 및 라부페티(Rabuffetti, M.), 시오라티(Scioratti, C.), 타로조(Tarozzo, G.), 클레멘티(Clementi, E.), 만프레디(Manfredi, A.A.) 및 벨트라모(Beltramo, M.)의 문헌[2000, Inhibition of caspase-1-like activity by Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-chloromethyl ketone includes long lasting neuroprotection in cerebral ischemia through apoptosis reduction and decrease of proinflammatory cytokines, J Neurosci 20:4398-4404] 참조). 염증 및 신경아교세포 활성화는 에리트로포이에틴이 세포 보호 작용을 하는 대뇌 허혈, 뇌 외상 및 실험에 의한 알러지성 뇌척수염을 비롯한 신경 변성 질환의 상이한 형태에 공통적이다. 에리트로포이에틴에 의한 사이토카인 생성 억제가 적어도 부분적으로는 그의 보호 작용을 매개할 수 있다. 그러나, 종양 괴사 인자 생성을 직접적으로 억제하는 IL-10 및 IL-13 같은 "전통적인" 소염 사이토카인과는 달리, 에리트로포이에틴은 신경세포 사멸의 존재하에서만 활성인 것으로 보인다.
임의의 특정 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 몇 가지 비한정적인 이론에 의해 이 소염 활성을 가설적으로 설명할 수 있다. 먼저, 에리트로포이에틴이 세포자멸사를 방지하기 때문에, 세포자멸사에 의해 촉발되는 염증이 방지된다. 또한, 에리트로포이에틴이 죽어가는 신경세포로부터의 분자 신호(이는 신경아교세포를 자극하거나 신경아교세포 상에 직접 작용하여 이들 생성물로의 반응을 감소시킴) 방출을 방지할 수 있다. 다른 가능성은 에리트로포이에틴이 세포자멸사 및 염증을 둘 다 촉발시키는 일련의 염증 반응의 보다 가까운 일원(예컨대, 카스파제 1, 반응성 산소 또는 질소 중간체)을 표적으로 한다는 것이다.
또한, 에리트로포이에틴은 덱사메타손 같은 다른 소염 화합물에는 전형적으로 수반되는 반발 효과 없이 소염 보호를 제공하는 것으로 보인다. 다시 한 번 임의의 특정 이론에 얽매이고자 하지 않으면서, 이는 산화질소(NO) 같은 다목적 신경독소에 대한 에리트로포이에틴의 효과에 기인할 수 있는 것으로 보인다. 활성화된 별아교세포 및 미소신경아교세포가 다양한 외상에 응답하여 신경 독성량의 NO를 생성시킴에도 불구하고, NO는 본질적인 생리적 기능의 조종을 비롯하여 신체 내에서 여러 목적을 수행한다. 따라서, 소염제의 사용이 NO 또는 다른 신경독소를 억제함으로써 염증을 경감시킬 수는 있지만, 소염제가 지나치게 긴 반감기를 갖는 경우에는 염증으로 이어지는 외상에서 야기되는 손상을 회복함에 있어서의 이러한 화학적 역할을 방해할 수도 있다. 본 발명의 조직 보호 사이토카인은 NO 같은 신경독소의 회복능을 방해하지 않으면서 염증을 경감시킬 수 있는 것으로 생각된다.
본 발명은 하나 이상의 조직 보호 사이토카인 및 조직 보호 사이토카인이 아닌 하나 이상의 예방제 또는 치료제(즉, 활성 약제)를 포함하는 조성물, 및 포유동물에게 상기 조성물중 하나 이상을 투여함을 포함하는, 응답 포유동물 세포 및 이들에 결합된 포유동물 세포, 조직 및 기관의 염증에 수반되는 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 경감시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 조직 보호 사이토카인 사이토카인을 포함하는 조성물, 및 상기 조성물중 하나 이상을 포유동물에게 투여함을 포함하는, 응답 포유동물 세포 및 이들에 결합된 포유동물의 세포, 조직 및 기관의 염증에 수반되는 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 경감시키는 방법을 제공하며, 이 때 조성물은 조직 보호 사이토카인이 아닌 하나 이상의 예방제 또는 치료제와 함께 투여된다. 염증은 천식, 뇌염, 염증성 장 질환, 만성 폐색성 폐 질환(COPD), 관절염 또는 알러지 장애 같은(이들로 한정되지는 않음) 손상 또는 질환에 의해 야기될 수 있다. 치료제 또는 예방제는 펩타이드, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 핵산 분자, 소분자, 의사화합물 약제, 합성 약물, 무기 분자 및 유기 분자를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 염증에 수반되는 하나 이상의 증상의 예방, 치료 또는 경감에 유용한 것으로 알려져 있거나 이를 위해 사용되었거나 현재 사용되고 있는 임의의 약제를 본원에 기재되어 있는 본 발명에 따른 조직 보호 사이토카인과 함께 사용할 수 있다. 이러한 약제는 발진 및 종창용 피부과 약제(예컨대, 광선요법(즉, 자외선 B 조사), 광선화학요법(예: PUVA), 및 피부연화제, 살리실산, 콜타르, 국부용 스테로이드, 국부용 코르티코스테로이드, 국부용 비타민 D3 유사체(예: 칼시포트라이엔), 타자로텐 및 국부용 레티노이드 같은 국부용 약제), 소염제(예: 코르티코스테로이드(예: 프레드니손 및 하이드로코르티손), 글루코코르티코이드, 스테로이드, 비-스테오이드성 소염제(예: 아스피린, 이부프로펜, 디클로페낙 및 COX-2 저해제), 베타-작용제, 항콜린제 및 메틸 잔틴), 면역조절제(예: 작은 유기 분자, T 세포 수용체 조절제, 사이토카인 수용체 조절제, T-세포 결핍제, 사이토카인 길항제, 모노카인 길항제, 림프구 저해제 또는 항암제), 금 주입제, 설파살라진, 페니실라민, 항-혈관형성제(예: 안지오스타틴, TNF-α 길항제(예: 항-TNFα 항체), 및 엔도스타틴), 답손, 소랄렌즈(예: 메톡살렌 및 트라이옥살렌), 항-말라리아제(예: 하이드록시클로로퀸), 항바이러스제 및 항생제(예: 에리트로마이신 및 페니실린)를 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다.
당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 임의의 면역조절제를 본 발명의 방법 및 조성물에 사용할 수 있다. 면역조절제는 환자의 면역 반응의 하나 이상의 양상 또는 모든 양상에 영향을 줄 수 있다. 면역 반응의 양상은 염증 반응을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 환자에게 면역조절제를 투여하면 환자의 면역 반응능의 하나 이상의 양상을 억제 또는 감소시킨다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 면역조절제는 환자의 면역 반응을 저해 또는 억제한다. 한 실시태양에서는, 본 발명의 조직 보호 사이토카인을 하나 이상의 면역 조절제와 함께 투여하여 염증을 치료(즉, 염증 증상을 경감)한다.
면역조절제의 예는 사이토카인, 펩타이드 의사 화합물 및 항체(예: 인간, 인간화, 키메릭, 단클론, 다클론, Fvs, ScFvs, Fab 또는 F(ab)2 분절 또는 항원결정기 결합 분절) 같은 단백질 제제, 핵산 분자(예: 안티센스 핵산 분자 및 삼중 나선), 소분자, 유기 화합물 및 무기 화합물을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 면역조절제는 메토트렉세이트, 레플루노마이드, 사이클로포스파마이드, 사이톡산, 이뮤란, 사이클로스포린 A, 미노사이클린, 아자티오프린, 항체(예: FK506(타크롤리무스)), 메틸프레드니솔론(MP), 코르티코스테로이드, 스테로이드, 마이코페놀레이트 모페틸, 라파마이신(시롤리무스), 미조리빈, 데옥시스퍼구알린, 브레퀴나르, 말로노니트릴로아민데스(예: 레플루나마이드), T 세포 수용체 조절제 및 사이토카인 수용체 조절제를 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다. T 세포 수용체 조절제의 예는 항-T 세포 수용체 항체(예: 항-CD4 항체(예: cM-T412(베링거(Boeringer)), IDEC-CE9.1(등록상표)(IDEC 및 SKB), mAB 4162W94, 오르토클론 및 OKTcdr4a(얀센-실락(Janssen-Cilag)), 항-CD3 항체, 항-CD5 항체(예: 항-CD5 리신-연결된 면역 접합체), 항-CD7 항체(예: CHH-380(노바티스(Novartis))), 항-CD8 항체, 항-CD40 리간드 단클론 항체, 항-CD52 항체(예: CAMPATH 1H(Ilex)), 항-CD2 단클론 항체) 및 CTLA4-면역글로불린을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
사이토카인 수용체 조절제의 예는 가용성 사이토카인 수용체(예: TNF-α 수용체의 세포외 도메인 또는 그의 분절, IL-1β 수용체의 세포외 도메인 또는 그의 분절, 및 IL-6 수용체의 세포외 도메인 또는 그의 분절), 사이토카인 또는 그의 분절(예: 인터류킨(IL)-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, TNF-α, TNF-β, 인터페론(IFN)-α, IFN-β, IFN-γ 및 GM-CSF), 항-사이토카인 수용체 항체(예: 항-IL-2 수용체 항체, 항-IL-4 수용체 항체, 항-IL-6 수용체 항체, 항-IL-10 수용체 항체 및 항-IL-12 수용체 항체), 항-사이토카인 항체(예: 항-IFN 수용체 항체, 항-TNF-α 항체, 항-IL-1β 항체, 항-IL-6 항체 및 항-IL-12 항체)를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 특정 실시태양에서, 사이토카인 수용체 조절제는 IL-4, IL-10 또는 이들의 분절이다. 다른 실시태양에서, 사이토카인 수용체 조절제는 항-IL-1β 항체, 항-IL-6 항체, 항-IL-12 항체, 항-TNF-α 항체이다. 다른 실시태양에서, 사이토카인 수용체 조절제는 TNF-α 수용체의 세포외 도메인 또는 그의 분절이다. 특정 실시태양에서, 사이토카인 수용체 조절제는 TNF-α 길항제가 아니다.
바람직한 실시태양에서, 면역조절제로서 사용되는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드(항체 포함)는, 이들 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 대한 면역 반응의 가능성을 감소시키기 위하여, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 수령자와 동일한 종으로부터 유도된다. 다른 바람직한 실시태양에서, 환자가 인간인 경우, 면역조절제로서 사용되는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 인간의 것이거나 또는 인간화된 것이다.
본 발명에 따라, 하나 이상의 면역조절제를 본 발명의 치료제 및/또는 예방제의 투여 전에, 투여 후에 또는 투여와 동시에 염증 환자에게 투여한다. 바람직하게는, 염증 환자에게 하나 이상의 면역조절제를 투여하여, 면역 반응의 하나 이상의 양상을 필요한만큼 감소시키거나 억제한다. 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있는 임의의 기법을 이용하여 특정 환자의 면역 반응의 하나 이상의 양상을 측정함으로써, 상기 환자에게 면역조절제를 투여할 필요가 있는 시점을 결정할 수 있다.
바람직한 실시태양에서는, 면역 반응의 하나 이상의 양상을 일시적으로 감소시키거나 억제하기 위하여, 염증 환자에게 하나 이상의 면역조절제를 투여한다. 이러한 면역 시스템의 하나 이상의 양상의 일시적인 억제 또는 감소는 수시간, 수일, 수주일 또는 수개월간 지속될 수 있다. 바람직하게는, 면역 반응의 하나 이상의 양상의 일시적인 억제 또는 감소가 수시간(예컨대, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 24시간, 36시간 또는 48시간), 수일(예를 들어, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 14일) 또는 수주일(예컨대, 3주, 4주, 5주 또는 6주)동안 지속된다. 면역 반응의 하나 이상의 양상의 일시적인 감소 또는 억제에 의해, 조직 보호 사이토카인의 예방능 및/또는 치료능이 향상된다.
본 발명의 한 실시태양에서는, 본 발명의 방법에 따라 T 세포, 바람직하게는 기억 T 세포를 감소시키거나 결핍시키는 면역조절제를 염증 환자에게 투여한다. 예를 들어 미국 특허 제 4,658,019 호 참조. 본 발명의 다른 실시태양에서는, CD8+ T 세포를 불활성화시키는 면역조절제를 본 발명의 방법에 따라 염증 환자에게 투여한다. 특정 실시태양에서는, 항-CD8 항체를 사용하여 CD8+ T 세포를 감소시키거나 결핍시킨다.
CD40 리간드(CD40L)-CD40 상호작용은, T 헬퍼 세포 활성화 및 기능에서의 그의 넓은 활성 및 그의 신호화 경로에서의 반복의 부재 때문에, 면역 반응을 차단하기에 바람직한 지점이다. 따라서, 본 발명의 특정 실시태양에서는, 하나 이상의 면역조절제를 투여할 때 CD40L과 CD40의 상호작용을 일시적으로 차단한다. TH 세포 상에서 CD40 리간드를 차단하고 T 헬퍼 세포상의 CD40 리간드의 B 세포상의 CD40 항원과의 정상적인 결합을 방해하는 약제로 처리함으로써 이를 달성할 수 있다. CD40 리간드에 대한 항체(항-CD40L)(브리스톨-마이어스 스큅 캄파니(Bristol-Myers Squibb Co)에서 구입가능함; 예컨대 1993년 8월 18일자로 공개된 유럽 특허원 제 555,880 호 참조) 또는 가용성 CD40 분자를 본 발명의 방법에 따른 면역조절제로서 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 면역조절제의 다른 예는 코르티코스테로이드, 아자티오프린, 마이코페놀레이트 모페틸, 사이클로스포린 A, 하이드로코르티손, FK506, 메토트렉세이트, 레플루노마이드 및 사이클로포스파마이드를 포함하지만, 이들로 국한되지는 않는다. 사이클로포스파마이드의 짧은 경로는 아데노바이러스 캡시드 단백질로의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 활성화를 성공적으로 차단하는 것으로 입증되었다(쥬스(Jooss) 등, 1996, Hum. Gene Ther. 7:1555-1566). 사이토카인(이들중 몇몇은 세균 감염 및 염증의 제거에 관련되어 있을 수 있음)의 유도를 감소시키는데 하이드로코르티손 또는 사이클로스포린 A 처리를 성공적으로 사용하였다.
본 발명의 방법에 따라, 면역조절 활성을 갖는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자, 또는 면역조절 활성을 갖는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 염증 환자에게 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 따라, 면역조절 활성을 갖는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 유도체, 유사체, 분절 또는 변형체를 코딩하는 핵산 분자, 또는 면역조절 활성을 갖는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 유도체, 유사체, 분절 또는 변형체를 염증 환자에게 투여할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 유도체, 유사체, 변형체 및 분절은 완전한 길이의 야생형 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 면역조절 활성을 보유한다.
당해 분야에 널리 공지되어 있거나 본원에 기재되어 있는 임의의 기법에 의해, 면역조절제로서 사용될 수 있는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 제조할 수 있다. 예컨대 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 제조하는 방법을 기재하고 있는 오스벨 등의 문헌[1999, Short Protocols in Molecular Biology, 제14판, John Wiley & Sons, NY](본원에 참고로 인용되어 있음) 참조. 예를 들어 본원에 참고로 인용되어 있는 미국 특허 제 6,245,527 호 및 할로우(Harlow) 및 레인(Lane)의 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 뉴욕주 콜드 스프링 하버, 1988]에 기재되어 있는 방법에 의해, 면역조절제로서 사용될 수 있는 항체를 제조할 수 있다. 바람직하게는, 면역조절제로서 작용하는 것으로 공지되어 있는 시판중인 약제를 본 발명의 조성물 및 방법에 사용한다. 예를 들어, CTL 분석, 증식 분석 및 동시-자극 분자 및 사이토카인 같은 특정 단백질의 발현에 대한 면역 분석(예: ELISA)을 비롯하여 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 임의의 기법에 의해 시험관내에서 및/또는 생체 내에서 약제의 면역조절 활성을 결정할 수 있다.
본 발명의 특정 조성물 및 방법을 이용하여 망막 조직의 질환 및 손상을 치료할 수 있다. 이러한 질병은 망막 허혈, 황반 변성, 망막 박리, 망막 색소변성, 동맥경화성 망막병증, 고혈압 망막병증, 망막 동맥 폐색, 망막 정맥 폐색, 저혈압 및 당뇨성 망막병증을 포함하지만 이들로 국한되지는 않는다.
다른 실시태양에서는, 본 발명의 방법 및 원리를 이용하여 흥분성 조직의 방사선 손상으로부터 야기되는 손상을 보호하거나 치료할 수 있다. 본 발명의 방법은 도모산 조개 중독, 신경 갯완두중독 및 괌(Guam)병과 같은 신경독 중독, 근위축성 측삭 경화증 및 파킨슨병을 치료하는 데에도 이용될 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명은 또한 전술한 조직 보호 사이토카인을 말초혈관에 투여함으로써 포유동물에서 흥분성 조직 기능을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 다양한 질환 및 증상에 대해 이 방법을 이용하여 치료하고, 또한, 이 방법은 임의의 증상 또는 질환이 없는 경우 인지 기능을 향상시키는데 유용한다. 본 발명의 이들 용도는 아래에 더욱 상세하게 기재되며, 인간 및 인간이 아닌 포유동물의 학습 및 훈련 향상을 포함한다.
중추신경계에 관련된 본 발명의 이러한 요지의 방법에 의해 치료될 수 있는 증상 및 질환은 기분 장애, 불안 장애, 우울증, 자폐증, 주의력 결핍 과다운동 장애 및 인지 장애를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 신경세포 기능을 향상시키면 이들 증상에 유리하다. 본 발명의 교시에 따라 치료될 수 있는 다른 질환은 수면 방해, 예컨대 수면 무호흡증 및 여행-관련 질환; 거미막밑 및 동맥류 출혈, 저혈압 쇼크, 진탕 손상, 패혈증 쇼크, 아나필락시스 쇼크, 다양한 뇌염 및 수막염의 후유증 속발증, 예를 들면 루푸스와 같은 결합조직-관련 수막뇌염을 포함한다. 다른 용도는 신경 독소에 의한 중독(예컨대 도모산 조개 중독, 신경 갯완두중독 및 괌병), 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병; 수술후 색전 또는 허혈 손상 치료; 전뇌 조사; 낫적혈구 발작; 및 자간의 예방 또는 보호를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 다른 질병 군은 미토콘드리아 기능장애(선천성 또는 후천성)를 포함하며, 이는 신경세포 손상 및 사멸에 의해 대표되는 다양한 신경 질환의 원인이다. 예를 들어, 라이(Leigh)병(아급성 괴사 뇌병증)은 신경 결실로 인한 점진적인 시력 상실 및 뇌병증, 및 근육병증을 그 특징으로 한다. 이들 경우, 불완전한 미토콘드리아 대사는 흥분성 세포의 대사에 연료를 공급하기에 충분히 높은 에너지 기질을 공급하지 못한다. 에리트로포이에틴 수용체 활성 조절제는 다양한 미토콘드리아 질병의 기능 상실을 최적화시킨다. 상기 언급한 바와 같이, 저산소증은 흥분성 조직에 불리한 영향을 끼친다. 흥분성 조직은 중추신경계 조직, 말초신경계 조직 및 심장 조직을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 상기 기재된 증상에 덧붙여, 본 발명의 방법은 일산화탄소 및 연기 흡입과 같은 흡입 중독, 중증 천식, 성인 호흡 곤란 증후군, 기도 폐색 및 거의 익사할 뻔한 상태를 치료하는데 유용하다. 저산소 상태를 발생시키거나 또는 흥분성 조직 손상을 유도하는 다른 수단에 의한 다른 질병은 인슐린을 적절하게 투여하지 못할 경우 또는 인슐린-생성 종양(인슐린종)과 함께 발생될 수 있는 저혈당증을 포함한다.
흥분성 조직 손상으로부터 유래되는 것으로 생각되는 다양한 신경정신 질환을 본 방법에 의해 치료할 수 있다. 신경세포 손상이 포함되고 본 발명에 의해 치료되는 만성 질환은 연령-관련 인지 기능 상실 및 노인성 치매, 만성 발작 장애, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 치매, 기억상실, 근위축성 측삭 경화증, 다발성 경화증, 결절 경화증, 윌슨(Wilson's)병, 뇌성마비, 진행성 핵상마비, 괌병, 루이 소체(Lewy body) 치매, 해면 뇌병증과 같은 프리온 질환, 예컨대 크로이츠펠트-야콥병, 헌팅톤병, 근육긴장퇴행위축, 프리드리히(Freidrich's) 조화운동불능 및 다른 조화운동불능, 및 길 드 라 토렛(Gilles de la Tourette's) 증후군, 간질 및 만성 발작 장애와 같은 발작 장애, 중풍, 뇌 또는 척수 외상, AIDS 치매, 알콜 중독, 자폐증, 망막 허혈, 녹내장, 고혈압 및 수면 장애와 같은 자율 기능 장애; 및 정신분열증, 정신분열정동장애, 주의력 결핍 장애, 기분저하 장애, 주요 우울 장애, 조증, 강박 장애, 정신작용 물질 사용 장애, 불안증, 공황 장애, 및 단극성 및 양극성 정동장애를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 신경정신병을 비롯한 중추신경계 및/또는 말초신경계에 관련된 질환을 포함한다. 추가의 신경정신병 및 신경퇴행성 질환은 예를 들어 미국 정신과 협회의 정신 질환 진단 통계 매뉴얼(DSM)에 나열된 것을 포함하며, 이들 매뉴얼의 가장 최근 버전이 본원에 참고로 인용된다.
다른 실시태양에서는, 암과 같은 증식성 질환, 또는 아급성 경화 범뇌염과 같은 바이러스성 질환을 치료하기 위한 독소의 치료용 전달에 에리트로포이에틴을 포함하는 재조합 키메라 독소 분자를 사용할 수 있다.
하기 표는 전술한 조직 보호 사이토카인에 의해 치료될 수 있는 다양한 질병 및 질환에 대한 추가의 예시적이고 비제한적인 목록이다.
상기 언급한 바와 같이, 이들 질환, 장애 또는 증상은 본 발명의 조직 보호 사이토카인에 의해 이점을 취할 수 있는 예시적인 범위일 뿐이다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 기계적 외상의 결과 또는 인간 질환의 치료 또는 예방을 제공한다. CNS 및/또는 말초신경계의 질환, 장애 또는 증상을 치료 또는 예방하는 것이 바람직하다. 정신병적 요소가 있는 질환, 장애 또는 증상을 치료 또는 예방한다. 눈, 심혈관, 심폐, 호흡기, 신장, 비뇨기, 생식기, 소화관, 내분비 또는 대사적 요소가 있는 질환, 장애 또는 증상(이들로 한정되지는 않음)을 치료 또는 예방한다.
당해 분야의 숙련자는 본 발명의 조직 보호 사이토카인 및 에리트로포이에틴의 혼합물로 본 발명의 약학 조성물을 제조할 수 있음을 알 것이다.
한 실시태양에서, 이들 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인의 약학 조성물은 전신 투여되어 표적 세포, 조직 또는 기관을 보호 또는 향상시킬 수 있다. 이러한 투여는 비경구, 흡입 또는 경점막 투여, 예를 들어 경구, 비강, 직장, 질내, 설하, 점막하 또는 경피 투여일 수 있다. 바람직하게는, 투여는 비경구, 예를 들어 정맥내 또는 복강내 주사이고, 또한 동맥내, 근육내, 피내 및 피하 투여도 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
관류액 사용, 기관 내로의 주사 또는 다른 국부 투여와 같은 다른 투여 경로의 경우, 유사한 수준의 전술한 조직 보호 사이토카인을 투여하는 약학 조성물이 제공된다. 약 15pM 내지 30nM의 양이 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물은 치료 효과량의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 용어 "약학적으로 허용가능한"이란, 동물, 더욱 특히 인간에 사용하는 것으로 연방정부 또는 주정부의 규제국에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 통상적으로 인정되는 외국 약전에 기재되어 있음을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 일컫는다. 이러한 약학 담체는 석유, 동물유, 식물유 또는 합성유를 비롯한 오일(예: 땅콩유, 대두유, 광유, 호마유 등) 및 물중 염수 용액과 같은 멸균 액체일 수 있다. 약학 조성물이 정맥내 투여되는 경우에는, 염수 용액이 바람직한 담체이다. 염수 용액, 및 덱스트로즈 및 글라이세롤 수용액도 특히 주사 용액용 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코즈, 락토즈, 슈크로즈, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글라이세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조된 탈지유, 글라이세롤, 프로필렌, 글라이콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 필요한 경우, 조성물은 미량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제도 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 유화액, 정제, 환약, 캡슐, 분말, 서방성 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 트라이글라이세라이드와 같은 담체를 사용하여 좌약으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 화합물은 중성 형태 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타타르산 등으로부터 유도된 것과 같은 유리 아미노기로 형성된 것, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화철, 아이소프로필아민, 트라이에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도되는 것과 같은 유리 카복실기로 형성된 것을 포함한다. 적합한 약학 담체의 예는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences", 마틴(E.W. Martin)]에 기재되어 있다. 이러한 조성물은 환자에게 적절하게 투여하기에 적합한 양의 담체와 함께 바람직하게는 정제된 형태의 화합물 치료 효과량을 함유한다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
경구 투여에 적합한 약학 조성물은 캡슐 또는 정제로서; 분말 또는 과립으로서; 용액, 시럽 또는 현탁액(수성 또는 비수성 액체중)으로서; 식용 포움 또는 휩(whip)으로서; 또는 유화액으로서 제공될 수 있다. 정제 또는 경질 젤라틴 캡슐은 락토즈, 전분 또는 그의 유도체, 스테아르산마그네슘, 소듐 사카린, 셀룰로즈, 탄산마그네슘, 스테아르산 또는 그의 염을 포함할 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐은 식물유, 왁스, 지방, 반고체 또는 액체 폴리올 등을 포함할 수 있다. 용액 및 시럽은 물, 폴리올 및 당을 포함할 수 있다.
경구 투여에 의도되는 활성 약제는 위장관에서 활성 약제의 붕해 및/또는 흡수를 지연시키는 물질(예컨대, 글라이세릴 모노스테아레이트 또는 글라이세릴 다이스테아레이트를 사용할 수 있음)로 코팅되거나 상기 물질과 혼합될 수 있다. 이렇게 하여, 활성 약제가 수시간에 걸쳐 서서히 방출될 수 있고, 필요한 경우 활성 약제를 위 내에서 분해되지 않도록 보호할 수 있다. 경구 투여용 약학 조성물은 특정 pH 또는 효소 조건으로 인해 위장관의 특정 위치에서 활성 약제의 방출이 촉진되도록 제형화될 수 있다.
경피 투여에 적합한 약학 조성물은 장기간동안 수령자의 피부와 긴밀하게 접촉되어 유지되는 별도의 패치로서 제공될 수 있다. 국부 투여에 적합한 약학 조성물은 연고, 크림, 현탁액, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어로졸 또는 오일로서 제공될 수 있다. 피부, 입, 눈 또는 다른 외부 조직으로의 국부 투여의 경우에는, 국부 연고 또는 크림을 바람직하게 사용한다. 연고로 제형화되는 경우에는, 활성성분을 파라핀 또는 수혼화성 연고 기제와 함께 사용할 수 있다. 다르게는, 활성성분을 수중유적형 기제 또는 유중수적형 기제와 함께 크림으로 제형화시킬 수 있다. 눈으로의 국부 투여에 적합한 약학 조성물은 점안액을 포함한다. 이들 조성물에서는, 활성성분이 적합한 담체, 예를 들어 수성 용매에 용해 또는 현탁될 수 있다. 구강내로의 국부 투여에 적합한 약학 조성물은 로젠지, 향내나는 알약(pastille) 및 구강세정제를 포함한다.
비강 투여 및 폐로의 투여에 적합한 약학 조성물은 분말(바람직하게는 20 내지 500μ의 입자 크기를 가짐)과 같은 고체 담체를 포함할 수 있다. 코 가까이에 둔 분말의 용기로부터 코를 통해 빨리 흡입함으로써, 코로 들이마시는 방식으로 분말을 투여할 수 있다. 다르게는, 비강 투여에 적합한 조성물은 액체 담체를 포함할 수 있다(예컨대, 비강 스프레이 또는 비강 점적약제). 다르게는, 깊이 흡입하거나 또는 마우스피스를 통해 입인두 내로 넣음으로써 화합물을 직접 폐 내로 흡입할 수 있다. 이들 조성물은 활성성분의 수용액 또는 오일 용액을 포함할 수 있다. 흡입에 의해 투여하기 위한 조성물은 소정 투여량의 활성성분을 제공하기 위하여 제작될 수 있는 가압된 에어로졸, 연무기 또는 취입기를 비롯한(이들로 한정되지는 않음) 특별하게 맞춤한 장치에 공급할 수 있다. 바람직한 실시태양에서는, 본 발명의 약학 조성물을 비강내로 바로 또는 비강 또는 입인두를 통해 폐 내로 투여할 수 있다.
직장 투여에 적합한 약학 조성물은 좌약 또는 관장약으로서 제공될 수 있다. 질강 투여에 적합한 약학 조성물은 질좌제, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포움 또는 스프레이 제형으로서 제공될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 약학 조성물은, 산화방지제, 완충액, 정균제 및 고려되는 수령자의 혈액과 혼합될 때 조성물을 실질적으로 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액 또는 현탁액을 포함한다. 이러한 조성물에 존재할 수 있는 다른 성분은 예컨대 물, 알콜, 폴리올, 글라이세린 및 식물유를 포함한다. 비경구 투여에 적합한 조성물은 단위 투여량 용기 또는 다회 투여량 용기, 예컨대 밀봉된 앰풀 및 바이알에 제공될 수 있으며, 동결건조 조건에서 저장될 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체(예: 주사용 멸균 염수 용액)만 첨가하면 된다. 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 임시처방 주사 용액 및 현탁액을 제조할 수 있다. 한 실시태양에서는, 앰뷸런스, 응급실 및 전쟁상황에서 응급용으로, 또한 심지어는 집에서, 특히 잔디 깎는 기계를 부주의하게 사용함으로써 외상성 절단이 일어날 수 있는 경우 자가 투여용으로, 에리트로포이에틴의 주사 용액을 포함하는 자동주사기가 제공될 수 있다. 가능한 한 빨리, 심지어는 의료진이 사고 장소에 도착하거나 다친 사람이 절단된 발가락을 끌면서 응급실에 도착하기 전에, 절단된 부분의 여러 부위에 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인을 투여하면, 재부착 후 절단된 발 또는 발가락의 세포 및 조직이 생존할 가능성이 높아질 수 있다.
바람직한 실시태양에서는, 통상적인 절차에 따라 조성물을 인간으로의 정맥내 투여에 적합한 약학 조성물로서 제형화시킨다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액중 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 주사 부위에서의 통증을 경감하기 위하여 리도카인과 같은 국부 마취제 및 가용화제를 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분을 별도로 공급하거나, 또는 단위 투여 형태로, 예를 들어 활성 약제의 양을 나타내는 앰풀 또는 사쉐(sachette)와 같은 밀폐된 용기 내의 동결건조된 분말 또는 무수 농축제로서 함께 혼합하여 공급한다. 주입에 의해 조성물을 투여해야 하는 경우에는, 멸균 약제 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입용 병을 사용하여 분배할 수 있다. 조성물을 주사에 의해 투여하는 경우, 투여 전에 성분들을 혼합할 수 있도록 멸균 염수의 앰풀을 제공할 수 있다.
좌약은 일반적으로 0.5 내지 10중량%의 활성성분을 함유하고; 경구 제제는 바람직하게는 10 내지 95중량%의 활성성분을 함유한다.
이식 기관 욕에 사용하기 위해서, 원위치에서 관류시키기 위해서, 또는 기관을 떼어내기 전에 기관 공여자의 혈관에 투여하기 위해서 관류 조성물을 제공할 수 있다. 이러한 약학 조성물은 소정량의 에리트로포이에틴, 조직 보호 사이토카인 또는 개별 환자로의 단기 또는 장기, 국부 또는 전신 투여에 적합하지 않은 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인의 형태를 포함할 수 있으나, 처리된 기관 또는 조직을 일상적인 순환에 복귀시키거나 노출시키기 전에 이에 함유된 에리트로포이에틴의 양이 없어지거나 감소되기 전에 사체, 기관 침지액, 기관 관류액 또는 원위치에서의 관류액에서 본원에서 의도한 기능을 나타낸다. 본 발명의 이 요지의 에리트로포이에틴은 비한정적인 예로서 인간의 에리트로포이에틴 같은 천연-발생 형태 등의 임의의 에리트로포이에틴, 또는 무-시알산 에리트로포이에틴 및 페닐글라이옥살-에리트로포이에틴 등의 상기 기재된 임의의 조직 보호 사이토카인일 수 있다.
본 발명은 염증에 수반되는 하나 이상의 증상을 치료, 예방 및 경감시키기 위한 약학 조성물을 제공한다. 특정 실시태양에서, 조성물은 하나 이상의 조직 보호 사이토카인을 포함한다. 다른 실시태양에서, 조성물은 하나 이상의 조직 보호 사이토카인 및 조직 보호 사이토카인이 아닌 하나 이상의 예방제 또는 치료제를 포함하며, 이 때 상기 예방제 또는 치료제는 염증에 수반되는 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 경감시키는데 유용한 것으로 공지되어 있거나 또는 본 발명에 사용되었거나 현재 사용되고 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 약학 조성물이다. 이러한 조성물은 예방 효과량 또는 치료 효과량의 하나 이상의 예방제 또는 치료제(예를 들어, 조직 보호 사이토카인 또는 다른 예방제 또는 치료제), 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 한 실시태양에서, "치료 효과량"이란 용어는 약제가 단독으로 투여될 때에는 반드시 효과적이지는 않으나 다른 약제와 동시 투여될 때에는 효과적인 약제의 양을 포함함을 의미한다.
본 발명은 또한 본 발명의 약학 조성물의 하나 이상의 성분으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 약제 팩 또는 키트를 제공한다. 이러한 용기(들)에는 임의적으로 약학 제품 또는 생물학적 제품의 제조, 용도 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 규정한 고지문이 부착될 수 있으며, 이러한 고지문은 인간 투여용으로 제조, 사용 또는 판매함에 대한 정부 기관의 승인을 반영한다.
특히, 예방제 또는 치료제 또는 본 발명의 약학 조성물중 하나 이상은 약제의 양이 표시된 앰풀 또는 사쉐 같은 밀봉된 용기에 포장된다. 한 실시태양에서는, 예방제 또는 치료제 또는 본 발명의 약학 조성물중 하나 이상이 밀봉된 용기 내에 건조 멸균된 동결건조 분말 또는 무수 농축제로서 공급되고, 환자에게 투여하기 위하여 적절한 농도로 예컨대 물 또는 염수로 재구성시킬 수 있다. 바람직하게는, 예방제 또는 치료제, 또는 본 발명의 약학 조성물중 하나 이상이 밀봉 용기에 무수 멸균 동결건조 분말로서 5mg 이상, 더욱 바람직하게는 10mg 이상, 15mg 이상, 25mg 이상, 35mg 이상, 45mg 이상, 50mg 이상, 75mg 이상 또는 100mg 이상의 단위 투여량으로 공급된다. 동결건조된 예방제, 치료제 또는 본 발명의 약학 조성물은 원래의 용기에서 2 내지 8℃에서 저장되어야 하며, 예방제, 치료제 또는 본 발명의 약학 조성물은 재구성된지 1주일 내에, 바람직하게는 5일 내에, 72시간 내에, 48시간 내에, 24시간 내에, 12시간 내에, 6시간 내에, 5시간 내에, 3시간 내에 또는 1시간 내에 투여되어야 한다. 다른 실시태양에서, 예방제, 치료제 또는 본 발명의 약학 조성물중 하나 이상은 약제의 양 및 농도가 표시된 밀봉 용기에 액체 형태로 공급된다. 바람직하게는, 투여되는 조성물의 액체 형태를 0.25mg/ml 이상, 더욱 바람직하게는 0.5mg/ml 이상, 1mg/ml 이상, 2.5mg/ml 이상, 5mg/ml 이상, 8mg/ml 이상, 10mg/ml 이상, 15mg/ml 이상, 25mg/ml 이상, 50mg/ml 이상, 75mg/ml 이상, 100mg/ml 이상으로 밀봉 용기에 공급한다. 액체 형태는 원래 용기에서 2 내지 8℃에서 저장되어야 한다.
조성물은 필요한 경우 활성성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여형을 포함할 수 있는 팩 또는 분배 장치에 제공될 수 있다. 팩은 예컨대 블리스터 포장 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 팩 또는 분배 장치에는 투여 안내문이 동봉될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 조성물의 성분은 이 조성물의 수령자와 동일한 종 기원 또는 종 반응성을 갖는 개체로부터 유도된다. 따라서, 바람직한 실시태양에서, 치료 또는 예방을 위해 인간 또는 인간화된 항체를 인간에게 투여한다.
다른 실시태양에서는, 예컨대 조직 보호 사이토카인을 조절된-방출 시스템으로 전달할 수 있다. 예를 들어, 정맥내 주입, 이식가능한 삼투압 펌프, 경피 패치, 리포좀 또는 다른 투여 방식을 이용하여 이 폴리펩티드를 투여할 수 있다. 한 실시태양에서는, 펌프를 사용할 수 있다(랑거(Langer), 상기 문헌; 세프톤(Sefton)의 문헌[1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201]; 부흐발트(Buchwald) 등의 문헌[1980, Surgery 88:507]; 소덱(Saudek) 등의 문헌[1989, N. Engl. J. Med. 321:574] 참조). 다른 실시태양에서는, 화합물을 소포, 특히 리포좀에 전달할 수 있다(랑거의 문헌[Science 249:1527-1533 (1990)]; 트리트(Treat) 등의 문헌[Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, 로페즈-베레스타인 및 피들러(편집), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)]; WO 91/04014 호; 미국 특허 제 4,704,355 호; 로페즈-베레스타인(Lopez-Berestein)의 동일 문헌, pp. 317-327 참조; 일반적으로는 동일 문헌 참조). 다른 실시태양에서는, 중합체 물질을 사용할 수 있다(Medical Applications of Controlled Release, 랑거 및 와이즈(Wise)(편집), CRC Press: 플로리다주 보카 레이튼, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, 스몰렌(Smolen) 및 볼(Ball)(편집), Wiley: New York (1984); 랑거 및 페파스(Peppas), J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61, 1953; 레비(Levy) 등, 1985, Science 228:190; 듀링(During) 등, 1989, Ann. Neurol. 25:351; 하워드(Howard) 등, 1989, J. Neurosurg. 71:105 참조).
또 다른 실시태양에서는, 조절된 방출 시스템을 치료 표적, 즉 표적 세포, 조직 또는 기관 근처에 위치시켜 전신 투여량의 일부만 필요로 할 수 있다(예컨대 굿선(Goodson), pp. 115-138, Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, 상기 문헌, 1984 참조). 다른 조절된 방출 시스템이 랑거의 개설에 논의되어 있다(1990, Science 249:1527-1533).
다른 실시태양에서는, 적절하게 제형화된 조직 보호 사이토카인을 비강, 경구, 직장, 질강 또는 설하 투여할 수 있다.
특정 실시태양에서는, 본 발명의 에리트로포이에틴 및/또는 조직 보호 사이토카인 조성물을 치료가 필요한 부분에만 국부적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이는 예컨대(한정하지는 않음) 수술시 국부 주입, 예를 들어 수술 후 상처 드레싱과 함께 국부 투여, 주사, 카테터, 좌약 또는 이식물에 의해 달성될 수 있으며, 상기 이식물은 막, 예컨대 실라스틱(silastic) 막, 또는 섬유를 비롯한 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 물질이다.
바람직한 유효 투여량의 선택은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 몇가지 인자에 기초하여 숙련자가 용이하게 결정한다. 이러한 인자는 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인의 특정 형태, 및 생체내이용효율, 대사, 반감기 등과 같은 그의 약동학적 변수(이는 약제 화합물의 규제 승인을 받는데 전형적으로 이용되는 통상적인 개발 과정동안 얻어짐)를 포함한다. 투여량을 고려하는데 있어서의 다른 인자는 치료되는 증상 또는 질환 또는 정상적인 개인에게서 얻어지는 이점, 환자의 체질량, 투여 경로, 투여가 단기 투여인지 장기 투여인지의 여부, 동시 투약 여부, 및 투여되는 약제의 효능에 영향을 끼치는 것으로 잘 알려져 있는 다른 인자를 포함한다. 따라서, 정확한 투여량은 표준 임상 기법에 따라, 개별 환자의 증상 및 면역 상태에 의존하는 각 환자의 환경 및 담당 의사의 판단에 따라 결정되어야 한다.
본 발명의 다른 양태에서는, 관류 및 이식용 기관의 저장을 위해 관류액 또는 관류 용액을 제공하며, 이 때 관류 용액은 응답 세포 및 이에 결합된 세포, 조직 또는 기관을 보호하는데 효과적인 양의 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인을 포함한다. 이식물은, 한 공여자로부터 기관(세포, 조직 또는 다른 신체 부위 포함)을 떼어내고 상이한 수령자에게 이식하는 외래 이식; 및 신체의 한 부분으로부터 기관을 제거하여 다른 부분에 대체하는 자가이식(기관을 제거하고, 생체 외에서 예컨대 종양 제거를 위해 절제, 치료 또는 달리 조작한 다음 원래 위치에 되돌려놓는 벤치 수술 절차 포함)을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 한 실시태양에서, 관류 용액은 약 1 내지 약 25U/ml의 에리트로포이에틴, 5% 하이드록시에틸 전분(약 200,000 내지 약 300,000의 분자량을 갖고, 에틸렌 글라이콜, 에틸렌 클로로하이드린, 염화나트륨 및 아세톤을 실질적으로 함유하지 않음), 25mM KH2PO4, 3mM 글루타티온, 5mM 아데노신, 10mM 글루코즈, 10mM HEPES 완충액, 5mM 글루콘산마그네슘, 1.5mM CaCl2, 105mM 글루콘산나트륨, 200,000단위 페니실린, 40단위 인슐린, 16mg 덱사메타손, 12mg 페놀 레드를 함유하고, 7.4 내지 7.5의 pH 및 약 320mOsm/l의 삼투압을 갖는 위스콘신 대학(UW) 용액(미국 특허 제 4,798,824 호)이다. 이 용액을 사용하여 이식하기 전에 사체의 신장 및 췌장을 유지시킨다. 이 용액을 사용하여, 사체 신장 보존을 위해 권장되는 30시간 한계를 넘어 보존을 연장시킬 수 있다. 이 특정 관류액은 에리트로포이에틴 및/또는 조직 보호 사이토카인 효과량을 포함시킴으로써 현재 사용하는데 적합화시킬 수 있는 다수의 용액의 예일 뿐이다. 다른 실시태양에서, 관류 용액은 에리트로포이에틴 약 1 내지 약 500ng/ml, 또는 에리트로포이에틴 약 40 내지 약 300ng/ml를 함유한다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 이 요지에 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인의 임의의 형태를 사용할 수 있다.
본원 전반에 걸쳐 조직 보호 사이토카인의 바람직한 수령자는 인간이지만, 본원의 방법은 다른 포유동물, 특히 집안에서 키우는 동물, 가축, 애완동물 및 동물원 동물에도 똑같이 적용된다. 그러나, 본 발명은 이들로 한정되지 않으며, 본 발명의 이점은 어느 포유동물에게나 적용될 수 있다.
본 발명의 다른 생체외 요지에서는, 상기 기재된 것과 같은(이들로 한정되지는 않음) 에리트로포이에틴 및 임의의 조직 보호 사이토카인을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 요지에서는, 내피 세포 장벽에 의해 혈관으로부터 단리되지 않은 세포, 조직 또는 기관을 직접 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인을 포함하는 약학 조성물에 노출시키거나, 또는 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인-함유 약학 조성물을 조직 또는 기관의 혈관에 투여하거나 접촉시킴으로써, 상기 세포, 조직 또는 기관의 생존을 향상시키는 방법 및 조성물이 제공된다. 처리된 조직 또는 기관에서의 응답 세포의 향상된 활성이 긍정적인 효과를 나타내도록 한다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 부분적으로는 에리트로포이에틴 분자가 내피 세포 치밀 이음부를 갖는 기관(예컨대 뇌, 망막 및 고환 포함)의 모세혈관의 내피 세포의 관 표면으로부터 기저막 표면으로 수송될 수 있다는 발견에 기초를 두고 있다. 따라서, 장벽을 가로지르는 응답 세포는 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인의 유리한 효과에 대해 감수성인 표적이고, 완전히 또는 부분적으로 응답 세포를 함유하여 의존하는 다른 세포 유형 또는 조직 또는 기관은 본 발명의 방법의 표적이다. 특정 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인의 세포간 수송 후, 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인은 응답 세포, 예컨대 신경, 망막, 근육, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신피질, 부신수질, 모세혈관 내피, 고환, 난소 또는 자궁내막 세포 상에서 에리트로포이에틴 수용체와 상호작용할 수 있고, 수용체 결합이 일련의 신호 변환을 개시시켜 응답 세포 또는 조직 내에서 유전자 발현 프로그램을 활성화시킴으로써 예컨대 독소, 화학요법에 사용되는 약제, 방사선 요법, 저산소증 등에 의한 손상으로부터 세포 또는 조직 또는 기관을 보호할 수 있다. 따라서, 응답 세포-함유 조직을 손상 또는 저산소성 스트레스로부터 보호하고 이러한 조직의 기능을 향상시키는 방법을 아래에 상세히 기재한다.
본 발명의 한 실시태양을 실행함에 있어서, 포유동물 환자는 암 치료를 위한 전신 화학요법(방사선 요법 포함)을 받게 되는데, 이는 통상 신경, 폐, 심장, 난소 또는 고환 손상과 같은 역효과를 갖는다. 전술한 바와 같은 에리트로포이에틴 및/또는 조직 보호 사이토카인을 포함하는 약학 조성물은 화학요법 및/또는 방사선요법 전에 또한 상기 요법 동안에 투여되어, 화학요법에 사용되는 약제에 의한 손상으로부터 다양한 조직 및 기관을 보호한다(예를 들어, 고환을 보호한다). 화학요법의 약제의 순환 수준이 포유동물 신체에 위험을 야기할 수 있는 수준 미만으로 떨어질 때까지 계속 치료할 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양을 실행함에 있어서는, 자동차 사고로 사망한 인간으로부터 다수의 수령자에게 이식하기 위해 다양한 기관을 떼어낼 예정이었으며, 이중 일부에서는 먼 거리 및 장시간동안의 수송이 필요하였다. 기관을 떼어내기 전에, 사망자에게 전술한 에리트로포이에틴 및/또는 조직 보호 사이토카인을 포함하는 약학 조성물을 주입하였다. 선적을 위해 떼어낸 기관을 전술한 바와 같은 에리트로포이에틴 및/또는 조직 보호 사이토카인을 함유하는 관류액으로 관류시키고 에리트로포이에틴 및/또는 조직 보호 사이토카인을 포함하는 침지액에 저장하였다. 본 발명에 따라 에리트로포이에틴 및/또는 조직 보호 사이토카인을 함유하는 관류액을 사용하여 박동형 관류 장치로 특정 기관을 연속적으로 관류시켰다. 수송하는 동안, 이식할 때 또한 원위치에서 기관을 재관류시키는 동안 기관 기능의 열화는 최소한으로만 일어났다.
본 발명의 다른 실시태양에서는, 심장 판막을 치료하는 수술에서 일시적인 심장마비 및 동맥 폐색이 필요하였다. 수술하기 전에, 환자에게 조직 보호 사이토카인, 즉 체중 1kg당 4㎍의 카밤일화된 무-시알산 에리트로포이에틴을 주입하였다. 이러한 처치로 인해, 특히 재관류 후 저산소성 허혈에 의한 세포 손상이 방지되었다.
본 발명의 다른 실시태양에서는, 심폐 회로술과 같은 임의의 수술 절차에 천연-발생 에리트로포이에틴 또는 본 발명의 조직 보호 사이토카인을 사용할 수 있다. 한 실시태양에서는, 회로술 전에, 회로술 동안 및/또는 그 후에 전술한 에리트로포이에틴 및/또는 조직 보호 사이토카인을 함유하는 약학 조성물을 투여하여, 뇌, 심장 및 다른 기관의 기능을 보호한다.
생체외 용도로 또는 신경 조직, 망막 조직, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신피질, 부신수질, 모세혈관 내피, 고환, 난소 또는 자궁내막 세포 또는 조직과 같은 응답 세포를 처리하는데 천연-발생 에리트로포이에틴 및/또는 본 발명의 조직 보호 사이토카인을 사용하는 전술한 예에서, 본 발명은 혈관으로부터 먼 응답 세포, 조직 또는 기관을 보호 또는 향상시키는데 적합화된 단위 투여 형태의 약학 조성물을 제공하며, 이 약학 조성물은 약 1pg 내지 5mg, 500pg 내지 5mg, 1ng 내지 5mg, 500ng 내지 5mg, 1㎍ 내지 5mg, 500㎍ 내지 5mg 또는 1mg 내지 5mg의 조직 보호 사이토카인 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 조직 보호 사이토카인의 양은 약 1pg 내지 1mg이다. 바람직한 실시태양에서, 조성물은 적혈구 조혈성이 아닌 조직 보호 사이토카인을 함유한다.
본 발명의 다른 양태에서는, 조직 보호 사이토카인의 투여가 뇌 외상을 입은 동물의 인지 기능을 회복시키는 것으로 밝혀졌다. 5일 또는 30일간 지연시킨 후, 에리트로포이에틴의 투여는 모의시험-치료된 동물과 비교하여 여전히 기능을 회복시킬 수 있었던 바, 뇌 활성을 재생 또는 회복시키는 에리트로포이에틴의 활성을 보여주었다. 따라서, 본 발명은 또한 뇌 외상 및 다른 인지 기능장애를 치료(손상받은지 상당한 시간(예를 들어 3일, 5일, 1주일, 한달 이상)이 지난 뒤에 이루어지는 치료 포함)하는 약학 조성물을 제조하기 위한, 에리트로포이에틴 및/또는 조직 보호 사이토카인의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 에리트로포이에틴 및/또는 조직 보호 사이토카인 효과량을 투여함으로써 손상 후 인지 기능장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본원에 기재되어 있는 임의의 에리트로포이에틴 및/또는 조직 보호 사이토카인을 본 발명의 이 요지에 사용할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 이러한 회복 요지는 기능장애를 유발한 최초의 손상을 받은 후에, 또한 그로부터 상당한 시간이 지난 후에 치료를 시작하는, 세포, 조직 또는 기관 기능장애를 회복시키는 약학 조성물을 제조하기 위한, 본원의 임의의 에리트로포이에틴 및/또는 조직 보호 사이토카인의 용도에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 본 발명의 에리트로포이에틴 및/또는 조직 보호 사이토카인을 사용하는 치료는 질환 또는 증상이 급성 상태일 때와 만성 상태일 때의 사이에 걸쳐질 수 있다.
본 발명의 에리트로포이에틴이 적혈구 조혈 활성을 갖는 경우, 바람직한 실시태양에서는, 1회 투여당 체중 1kg당 약 1㎍ 내지 약 100㎍, 바람직하게는 약 5 내지 50㎍, 가장 바람직하게는 약 10 내지 30㎍의 투여량으로 에리트로포이에틴을 전신 투여할 수 있다. 이러한 유효 투여량은 에리트로포이에틴 투여 후 혈정 1ml당 약 10,000 이상, 15,000 이상 또는 20,000mU(80, 120 또는 160ng/ml) 이상의 혈중 에리트로포이에틴 수준을 획득하기에 충분해야 한다. 이러한 혈중 농도는 투여 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10시간 후에 달성될 수 있다. 필요한 경우, 이러한 투여량을 반복할 수 있다. 예를 들어, 임상적으로 필요하다면, 매일 반복해서 투여할 수 있거나, 또는 적절한 간격 후, 예를 들어 매 1 내지 12주마다, 바람직하게는 매 1 내지 3주마다 반복해서 투여할 수 있다. 한 실시태양에서는, 효과량의 에리트로포이에틴 및 약학적으로 허용가능한 담체를 단일 투여 바이알 또는 다른 용기에 포장할 수 있다. 다른 실시태양에서는, 본원에 기재된 활성을 나타낼 수는 하지만 헤모글로빈 농도 또는 적혈구용적율을 증가시키지는 않는 조직 보호 사이토카인을 사용한다. 이러한 조직 보호 사이토카인은 본 발명의 방법을 장기간 이용해야 하는 경우에 바람직하다. 다른 실시태양에서는, 적혈구 조혈 작용을 최대한으로 촉진하기 위해 필요한 것보다 더 많은 투여량으로 에리트로포이에틴을 투여한다. 상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 조직 보호 사이토카인은 반드시 적혈구 조혈 활성을 가질 필요는 없으며, 따라서 적혈구 조혈 활성 단위로 표현된 상기 투여량은 적혈구 조혈성인 에리트로포이에틴에 대한 예로서 기재한 것일 뿐이며; 조직 보호 사이토카인에 적용될 수 있는 상기 투여량에 상응하는 중량을 제공한다.
한 실시태양에서, 염증에 수반되는 하나 이상의 증상을 치료, 예방 또는 경감시키는데 효과적인 본 발명의 조성물의 양은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 제형화에 사용되는 정확한 투여량은 또한 투여 경로 및 상태의 심각성에 따라 달라지며, 담당 의사의 판단 및 각 포유동물의 상황에 따라 결정되어야 한다. 시험관내 시험 시스템 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 투여량-반응 곡선으로부터 효과적인 투여량을 추정할 수도 있다.
특정 실시태양에서, 포유동물의 염증성 질환에 수반되는 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 경감시키기 위하여 투여되는 본 발명의 조성물, 예방제 또는 치료제의 투여량은 포유동물의 체중 1kg당 150㎍ 이하, 바람직하게는 125㎍ 이하, 100㎍ 이하, 95㎍ 이하, 90㎍ 이하, 85㎍ 이하, 80㎍ 이하, 75㎍ 이하, 70㎍ 이하, 65㎍ 이하, 60㎍ 이하, 55㎍ 이하, 50㎍ 이하, 45㎍ 이하, 40㎍ 이하, 35㎍ 이하, 30㎍ 이하, 25㎍ 이하, 20㎍ 이하, 15㎍ 이하, 10㎍ 이하, 5㎍ 이하, 2.5㎍ 이하, 2㎍ 이하, 1.5㎍ 이하, 1㎍ 이하, 0.5㎍ 이하이다. 다른 실시태양에서, 포유동물의 염증에 수반되는 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 경감시키기 위해 투여되는 본 발명의 조성물, 예방제 또는 치료제의 투여량은 0.1mg 내지 20mg, 0.1mg 내지 15mg, 0.1mg 내지 12mg, 0.1mg 내지 10mg, 0.1mg 내지 8mg, 0.1mg 내지 7mg, 0.1mg 내지 5mg, 0.1mg 내지 2.5mg, 0.25mg 내지 20mg, 0.25mg 내지 15mg, 0.25mg 내지 12mg, 0.25mg 내지 10mg, 0.25mg 내지 8mg, 0.25mg 내지 7mg, 0.25mg 내지 5mg, 0.5mg 내지 2.5mg, 1mg 내지 20mg, 1mg 내지 15mg, 1mg 내지 12mg, 1mg 내지 10mg, 1mg 내지 8mg, 1mg 내지 7mg, 1mg 내지 5mg, 1mg 내지 2.5mg의 단위 투여량이다.
또 다른 실시태양에서는, 예방 또는 치료 효과량의 하나 이상의 면역조절제의 1회 이상의 투여량을 환자에게 투여하며, 이 때 상기 환자에게 투여되는 상기 약제(들)의 예방 또는 치료 효과량의 투여는 환자에서 약 500개 세포/mm3 내지 1500개 세포/mm3 미만, 바람직하게는 1400개 세포/mm3 미만, 1300개 세포/mm3 미만, 1250개 세포/mm3 미만, 1200개 세포/mm3 미만, 1100개 세포/mm3 미만, 1000개 세포/mm3 미만의 평균 절대 림프구 계수를 달성한다.
본 발명은 또한 전술한 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인과 결합된 특정 분자를 함유하는 조성물을 투여함으로써 포유동물의 내피 세포 장벽을 가로지르는 분자의 수송을 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 상기 기재된 바와 같이, 신체의 특정 기관의 내피 세포 사이에 있는 치밀 이음부는 특정 분자가 들어가지 못하게 하는 장벽이 된다. 장벽이 있는 기관 내의 다양한 증상을 치료하기 위해서는, 약제의 통과를 용이하게 하는 수단이 필요하다. 본 발명의 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인은 혈액-뇌 장벽 및 다른 유사한 장벽을 가로질러 다른 분자를 전달하는 담체로서 유용하다. 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인과 함께 장벽을 가로질러야 하는 분자를 포함하는 조성물을 제조하고, 이 조성물을 말초혈관에 투여하면 조성물이 장벽을 가로질러 세포간 수송을 달성한다. 장벽을 가로질러 수송될 분자와 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인 사이의 결합은 불안정한 공유 결합일 수 있고, 이 경우 분자는 장벽을 가로지른 후 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인과의 결합으로부터 유리된다. 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인과의 결합에 의해 분자의 목적하는 약리학적 활성이 유지되거나 영향을 받지 않는다면, 이러한 복합체를 투여할 수 있다.
당해 분야의 숙련자는 공유 결합, 비-공유 결합 및 다른 수단에 의해 분자를 본 발명의 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인 및 전술한 다른 약제와 결합시키는 다양한 수단을 알 것이다. 뿐만 아니라, 조성물은 효능은 실험 시스템에서 용이하게 평가될 수 있다. 불안정한 공유 결합, 가교결합 등을 비롯한 다수의 수단에 의해 분자를 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인과 결합시킬 수 있다. 바이오틴/아비딘 상호작용을 이용할 수 있으며, 예를 들어, 본 발명의 바이오틴일화된 에리트로포이에틴을 아비딘과 바람직하게 수송되어야 하는 분자의 불안정한 접합체와 착화시킬 수 있다. 전술한 바와 같이, 재조합 또는 합성 수단에 의해, 예컨대 목적하는 약리학적 활성을 갖는 분자의 도메인과 에리트로포이에틴 수용체 활성 조절을 담당하는 도메인을 둘 다 포함하는 혼성 분자, 예를 들어 융합 또는 키메라 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 분자에는 프로테아제 절단 부위가 포함될 수 있다.
다작용성 분자, 즉 다작용성 가교결합제를 통해 분자를 본 발명의 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인에 접합시킬 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "다작용성 분자"는 2회 이상 연속해서 반응할 수 있는 작용기 하나(예: 폼알데하이드)를 갖는 분자, 및 하나보다 많은 반응기를 갖는 분자를 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "반응기"는 가교결합제와 분자 사이에 공유 결합을 형성하기 위해 분자(예: 내피 세포 장벽을 가로질러 전달되어야 하는 펩타이드, 단백질, 탄수화물, 핵산, 특히 호르몬, 항생제, 또는 항암제)상의 작용기와 반응하는 가교결합제상의 작용기를 일컫는다. 용어 "작용기"는 유기 화학에서의 그의 표준적인 의미를 갖는다. 사용될 수 있는 다작용성 분자는 바람직하게는 생체적합성 결합기이다. 즉, 이들은 생체내에서 발암성이 아니고 독성이 없으며 실질적으로 면역원성이 아니다. 당해 분야에 공지되어 있고 본원에 기재되어 있는 것과 같은 다작용성 가교결합제의 생체적합성을 결정하기 위해 상기 가교결합제를 동물 모델에서 용이하게 시험할 수 있다. 다작용성 분자는 바람직하게는 이작용성이다. 본원에 사용되는 용어 "이작용성 분자"란 2개의 반응기를 갖는 분자를 일컫는다. 이작용성 분자는 이종 이작용성 또는 동종 이작용성일 수 있다. 이종 이작용성 가교결합제는 벡터같은 접합을 허용한다. pH 6 내지 8로 완충된 수용액과 같은 수용액에서 가교-결합 반응이 이루어지도록 다작용성 분자가 충분히 수용성이고, 또한 보다 효과적인 생체내 분배를 위해 생성된 접합체를 수용성으로 유지하는 것이 특히 바람직하다. 전형적으로, 다작용성 분자는 아미노 또는 설프하이드릴 작용기와 공유 결합한다. 그러나, 다른 작용기(예: 카복실산 또는 하이드록실기)와 반응성인 다작용성 분자도 본 발명에서 고려된다.
동종 이작용성 분자는 둘 이상의 동일한 반응성 작용기를 갖는다. 동종 이작용성 분자상의 반응성 작용기는 예컨대 알데하이드기 및 활성 에스터기를 포함한다. 알데하이드기를 갖는 동종 이작용성 분자는 예를 들어 글루타르알데하이드 및 수바르알데하이드를 포함한다. 가교결합제로서의 글루타르알데하이드의 용도는 포즈난스키(Poznansky) 등의 문헌[Science 223, 1304-1306 (1984)]에 개시되어 있다. 둘 이상의 활성 에스터 단위를 갖는 동종 이작용성 분자는 다이카복실산과 N-하이드록시석신이미드의 에스터를 포함한다. 이러한 N-석신이미딜 에스터의 몇몇 예는 다이석신이미딜 수베레이트 및 다이티오-비스-(석신이미딜 프로피온에이트), 및 이들의 가용성 비스-설폰산 및 비스-설폰에이트 염(예: 이들의 나트륨 및 칼륨 염)을 포함한다. 이들 동종 이작용성 시약은 일리노이주 록포드 소재의 피어스에서 구입할 수 있다.
이종 이작용성 분자는 둘 이상의 상이한 반응기를 갖는다. 반응기는 예컨대 에리트로포이에틴 및 분자상에 존재하는 상이한 작용기와 반응한다. 이종 이작용성 가교결합제상의 반응기와 반응하는 이들 두 상이한 작용기는 통상 아미노기, 예를 들어 리신의 엡실론 아미노기; 설프하이드릴기, 예를 들어 시스테인의 티올기; 카복실산, 예컨대 아스파트산의 카복실레이트; 또는 하이드록실기, 예컨대 세린의 하이드록실기이다.
물론, 본 발명의 다양한 조직 보호 사이토카인 분자 및 에리트로포이에틴이 특정 가교결합제와 함께 사용할 수 있는 적합한 반응기를 가질 수는 없지만, 당해 분야의 숙련자는 본 발명의 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인의 가교결합에 이용될 수 있는 기에 기초하여 가교결합제를 충분히 선택할 수 있을 것이다.
이종 이작용성 분자의 반응기가 아미노기와 공유 결합을 형성하는 경우, 공유 결합은 통상 아미도 또는 이미도 결합이다. 아미노기와 공유 결합을 형성하는 반응기는 예컨대 활성화된 카복실레이트기, 할로카본일기 또는 에스터기일 수 있다. 바람직한 할로카본일기는 클로로카본일기이다. 에스터기는 바람직하게는 N-하이드록시-석신이미드 에스터기와 같은 반응성 에스터기이다.
다른 작용기는 전형적으로 티올기, 티올기로 전환될 수 있는 기, 또는 티올기와 공유 결합을 형성하는 기이다. 공유 결합은 통상 티오에터 결합 또는 다이설파이드이다. 티올기와 공유 결합을 형성하는 반응기는 예를 들어 티올기와 반응하는 이중결합 또는 활성화된 다이설파이드일 수 있다. 티올기와 반응할 수 있는 이중결합을 함유하는 반응기는 말레이미도기이지만, 아크릴로나이트릴과 같은 다른 기도 가능하다. 반응성 다이설파이드 기는 예컨대 2-피리딜다이티오기 또는 5,5'-다이티오-비스-(2-나이트로벤조산)기일 수 있다. 반응성 다이설파이드 결합을 함유하는 이종 이작용성 시약의 몇몇 예는 N-석신이미딜 3-(2-피리딜-다이티오)프로피온에이트(칼슨(Carlsson) 등, 1978, Biochem J., 173:723-737), 소듐 S-4-석신이미딜옥시카본일-알파-메틸벤질티오설페이트 및 4-석신이미딜옥시카본일-알파-메틸-(2-피리딜다이티오)톨루엔을 포함한다. N-석신이미딜 3-(2-피리딜다이티오)프로피온에이트가 바람직하다. 티올기와 반응하는 이중결합을 갖는 반응기를 포함하는 이종 이작용성 시약의 몇몇 예는 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥세인-1-카복실레이트 및 석신이미딜 m-말레이미도벤조에이트를 포함한다.
다른 이종 이작용성 분자는 석신이미딜 3-(말레이미도)프로피온에이트, 설포석신이미딜 4-(p-말레이미도-페닐)뷰티레이트, 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸-사이클로헥세인)-1-카복실레이트, 말레이미도벤조일-N-하이드록시-석신이미드 에스터를 포함한다. 석신이미딜 m-말레이미도벤조에이트의 설폰산나트륨 염이 바람직하다. 상기 언급된 이종 이작용성 시약 및 이들의 설폰에이트 염중 다수는 미국 일리노이주 록포드 소재의 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Co.)에서 구입할 수 있다.
가역적이거나 불안정한 상기 기재된 접합의 필요성은 당해 분야의 숙련자가 용이하게 결정할 수 있다. 에리트로포이에틴 활성 및 목적하는 약리학적 활성에 대해 시험관내에서 접합체를 시험할 수 있다. 접합체가 두 특성을 모두 보유하는 경우, 그의 적합성을 생체내에서 시험할 수 있다. 접합 분자가 활성을 위해 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인으로부터 분리될 필요가 있는 경우에는, 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인과의 불안정한 결합 또는 가역적인 결합이 바람직하다. 생체내 시험 전에 표준 시험관내 절차를 이용하여 불안정성을 시험할 수 있다.
이들 다작용성 시약 및 다른 다작용성 시약을 제조 및 사용하는 방법에 대한 추가적인 정보는 하기 문헌 또는 당해 분야에서 입수할 수 있는 다른 문헌으로부터 얻을 수 있다:
1. 칼슨 등, 1978, Biochem. J. 173:723-737.
2. 컴버(Cumber, J.A.) 등, 1985, Methods in Enzymology 112:207-224.
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7. 율(Youle, R.J.) 및 네빌(Neville, D.M. Jr.), 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:5483-5486.
8. 러너(Lerner, R.A.) 등, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3403-3407.
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또한, 가교결합 방법은 민즈(Means) 및 피니(Feeney)의 문헌[1990, Bioconjugate Chem. 1:2-12]에 개괄되어 있다.
본 발명의 전술한 방법 및 조성물에 의해 횡단되는 장벽은 혈액-뇌 장벽, 혈액-눈 장벽, 혈액-고환 장벽, 혈액-난소 장벽 및 혈액-자궁 장벽을 포함하지만 이들로 한정되는 것은 아니다.
내피 세포 장벽을 가로질러 수송하고자 하는 분자는 예를 들어 호르몬(예: 성장 호르몬), 향신경성 인자, 항생제, 항바이러스제 또는 항진균제(예: 뇌 및 다른 장벽을 갖는 기관으로부터 통상 배제되는 것), 펩타이드 방사성 의약품, 안티센스 약물, 생물학적으로 활성인 약제에 대한 항체 및 항바이러스제, 의약, 및 항암제를 포함한다. 이러한 분자의 비제한적인 예는 성장 호르몬 같은 호르몬, 신경성장인자(NGF), 뇌-유도된 향신경성 인자(BDNF), 섬모체 향신경성 인자(CNTF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 형질전환 성장 인자 β1(TGFβ1), 형질전환 성장 인자 β2(TGFβ2), 형질전환 성장 인자 β3(TGFβ3), 인터류킨 1, 인터류킨 2, 인터류킨 3 및 인터류킨 6, AZT, 종양괴사인자에 대한 항체, 및 사이클로스포린과 같은 면역억제제를 포함한다. 또한, 진단 목적으로 뇌 및 다른 차단된 기관 내의 세포, 조직 또는 기관을 가시화시키기 위하여, 에리트로포이에틴 또는 본 발명의 조직 보호 사이토카인중 하나에 염료 또는 마커를 부착시킬 수 있다. 예로서, 환자에서 알쯔하이머 질병의 진행을 결정하기 위하여, 뇌 내에서 플라크를 가시화시키는데 사용되는 마커를 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인에 부착할 수 있다.
본 발명은 또한 내피 세포 치밀 이음부 장벽을 가로지르는 세포간 수송을 통해 수송되는 분자 및 상기 기재된 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전술한 장벽을 가로질러 분자를 전달하는 약학 조성물을 제조하기 위한, 상기 기재된 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인과 분자 사이의 접합체의 용도에 관한 것이다.
하기 실시예에는, 본 발명의 조직 보호 사이토카인의 효율을 입증하기 위하여 신경 보호 및 세포간 수송의 다양한 동물 모델 및 시험관내 시험이 제공된다. 이러한 모델은 조직 보호 사이토카인의 신경 보호 효과를 결정하기 위하여 P-19 세포를 사용하는 시험관내 모델, 및 본 발명의 조직 보호 사이토카인의 생체내 신경 보호 효과를 결정하기 위한 마우스에서의 생체내 물 중독 모델을 포함한다. 세포간 수송의 경우, 본 발명의 에리트로포이에틴에 접합된 모델 단백질을 비경구 투여 후 뇌로의 수송에 대해 평가한다. 시험관내 모델 및 동물 모델에서의 이러한 시험은 인간을 비롯한 다른 포유동물 종에서의 본 발명 화합물의 효능을 예언한다. 또한, 실시예 1은 에리트로포이에틴 수용체가 인간의 뇌에 풍부하게 존재하며, 이 것이 에리트로포이에틴 및 조직 보호 사이토카인의 세포간 수송의 메카니즘을 제공함을 보여준다.
본 발명은, 본 발명의 예로서 제공되는 하기 비제한적인 실시예를 참조함으로써 더욱 잘 이해될 수 있다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시태양을 더욱 자세히 예시하기 위해 제공된다. 그러나, 이들은 어떠한 방식으로도 본 발명의 넓은 영역을 한정하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예 1
인간 뇌에서 에리트로포이에틴 수용체의 분포
수술 과정 동안 제거된(예컨대, 종양 절제시 종양이 없는 여분을 제공하기 위하여) 통상적인 인간의 뇌를 0.1M 포스페이트 완충액(pH 7.4)중 5% 아크롤레인중에서 즉시 고착시켰다. 진동 마이크로톰으로 40㎛ 두께의 박편을 절단해내었다. 자유-부유 박편, 및 에리트로포이에틴 수용체 항혈청(산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)에서 수득함)의 1:500 희석액을 사용하는 간접적인 항체 퍼옥시다제-항퍼옥시다제 방법을 이용하여 면역 조직 화학 염색을 수행하였다. 조직 박편을 과산화수소(메탄올중 3%, 30분간)로 전처리함으로써, 내인성 퍼옥시다제 활성을 정지시켰다. 1차 항체는 누락시키고 적절한 차단 펩타이드(산타 크루즈 바이오테크놀로지에서 수득함)를 사용함으로써 조직 대조용을 수행하여, 염색이 에리트로포이에틴(EPO) 수용체에 특이적이었음을 확인하였다.
도 1은 특이적인 항-EPO 수용체 항체를 사용하는 면역 조직 화학에 의해 결정될 때 인간의 뇌의 모세혈관이 매우 높은 수준의 EPO 수용체를 나타냄을 보여준다. 이는 혈액 뇌 장벽에도 불구하고 EPO가 전신 순환계로부터 뇌 내로 침투할 수 있는 메카니즘을 제공한다.
도 2는 EPO 수용체가 인간 뇌에서 혈액 뇌 장벽을 형성하는 모세혈관 내에 또한 모세혈관 둘레에 밀집되어 편재되어 있음을 보여준다.
10㎛ 박편을 파라핀으로부터 절단해내고, 매립된 박편을 4% 파라폼알데하이드에 침지시킴으로써 고착시킨 것을 제외하고는, 도 1 및 도 2에서와 유사한 방법을 도 3에 대해서 수행하였다. 도 3은 인간 뇌 모세혈관의 관내강 표면 및 항-관내강 표면에 고밀도의 EPO 수용체가 있어서, 순환계로부터 뇌 내로 EPO를 수송하기 위한 해부학적 기초를 형성함을 보여준다.
전자현미경용 울트라마이크로톰 상에서 조직을 절개하고 콜로이드성 금 입자로 2차 항체를 라벨링한 것을 제외하고는, 도 3에서와 유사한 방법을 수행하여 도 4를 수득하였다. 이 도면은 EPO 수용체가 인간 뇌의 내피 표면(*) 상에서, 세포질 소포(화살표) 내에서 또한 아교세포 말단(+) 상에서 관찰되어, 순환계 내로부터 뇌로 EPO를 수송하기 위한 해부학적 기초를 제공함을 보여준다.
실시예 2
조직 보호 사이토카인
본원에 기재된 용도에 바람직한 조직 보호 사이토카인은 상기 본원에 언급된 다른 절차 중에서 특히 구아니딘화, 카밤일화, 아마이드화, 트라이나이트로페닐화, 아세틸화, 석신일화, 질화 또는 아르기닌 잔기 또는 카복실기의 개질에 의해 제조될 수 있다. 이들 개질에 의해, 특정 기관 및 조직에 대한 활성은 유지하지만 적혈구 같은 다른 조직에 대한 활성은 그렇지 않은 조직 보호 사이토카인이 생성된다. 에리트로포이에틴에 대해 상기 반응을 수행하면, 일반적으로 생성된 분자가 생체내 및 시험관내 적혈구 조혈 활성을 갖지 않음을 발견하였다(예컨대, 사타케 등의 문헌[1990, Biochim. Biophys. Acta 1038:125-9). 조직 보호 사이토카인의 제조의 몇몇 예가 아래에 기재되어 있다. 아래 실시예에서는 출발 물질로서 에리트로포이에틴을 사용하지만, 당해 분야의 숙련자는 시알산 제거, 구아니딘화, 카밤일화, 아마이드화, 트라이나이트로페닐화, 아세틸화, 석신일화 및 질화된 에리트로포이에틴 같은 에리트로포이에틴 유도체도 마찬가지로 사용할 수 있음을 알 것이다.
A. 에리트로포이에틴의 시알산 제거에 의한 조직 보호 사이토카인의 제조
하기 예시적인 절차에 의해 에리트로포이에틴에서 시알산을 제거할 수 있다. 세이카가쿠 아메리카(SEIKAGAKU AMERICA)(코드 번호 120050)에서 시알리다제(스트렙토코커스 종 6646K로부터 단리함)를 수득한다. 37℃에서 3시간동안 에리트로포이에틴을 시알리다제(0.05U/mg EPO)로 시알산 제거시킨다. 울트라프리 원심 필터 장치(Ultrafree Centrifugal Filter Unit)에 의해 반응 혼합물을 탈염 및 농축시킨다. 악타프라임(AKTAprimeTM) 시스템의 이온 교환 칼럼에 샘플을 가한다. 선택된 완충액으로 단백질을 용리시킨다. 상당량의 단백질을 함유하는 용리된 분획의 IEF 겔 분석을 수행한다. 상부 2개의 밴드(IEF 겔 상에서 pI ∼8.5 및 ∼7.9에서 이동함)만을 함유하는 분획을 모은다. 모아진 분획의 단백질 함량을 결정하고, 10×염 용액(1M NaCl, 0.2M 시트르산나트륨, 3mM 시트르산) 1/9부피를 첨가하였다. 용액의 시알산 함량을 결정하였다. 유의한 시알산 함량이 검출되어서는 안된다.
도 5 및 도 6에 도시된 바와 같이, 무-시알산 에리트로포이에틴 및 페닐글라이옥살에리트로포이에틴은 시험관 내에서 신경세포에 대해 천연 에리트로포이에틴만큼 효과적이었다. 혈청 회수시 세포자멸사하는 신경-유사 배아 육종 세포(P19)를 사용하여 시험관내 시험을 수행하였다. 혈청을 제거하기 24시간 전에, 에리트로포이에틴 또는 개질된 에리트로포이에틴 1 내지 1000ng/ml를 배양액에 첨가하였다. 그 다음 날, 배지를 제거하고, 혈청을 함유하지 않는 새로운 배지로 세포를 세척하고, 시험 성분을 함유하는 배지(혈청 없음)를 다시 48시간동안 배양액에 첨가하였다. 살아있는 세포의 수를 결정하기 위하여, 테트라졸륨 환원 분석을 수행하였다(셀타이터(CellTiter) 96; 프로메가, 인코포레이티드(Promega, Inc.)). 도 5 및 도 6에 도시되어 있듯이, 무-시알산 에리트로포이에틴은 세포 사멸을 방지함에 있어서 에리트로포이에틴 자체와 동일한 효능을 나타내는 것으로 보인다.
상기 기재된 바와 같이(브린즈(Brines) 등, 2000, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97:10526-31) 중간대뇌동맥의 분포의 가역적인 손상을 수행하는 래트 국소 허혈 모델을 사용하여 생체내에서 신경 보호 활성을 보유함을 확인하였다. 동맥 폐색 개시시에 다 큰 수컷 스프라그-돌리 래트에게 무-시알산 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴(5000U(40㎍)/kgBW, 복강내) 또는 비히클을 투여하였다. 24시간 후, 동물을 죽이고 그의 뇌를 연구하기 위해 제거하였다. 연속 박편을 절단해내고 테트라졸륨 염으로 염색하여 뇌의 생존 영역을 확인하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, 무-시알산 에리트로포이에틴은 1시간동안의 허혈로부터 신경을 보호하는데 있어서 천연 에리트로포이에틴만큼 효과적이었다. 도 8은 에리트로포이에틴과 무-시알산 에리트로포이에틴을 사용하여 투여량-반응을 비교한 다른 국소 허혈 모델의 결과를 나타낸다. 250U(2㎍)/kg의 가장 낮은 투여량에서, 개질되지 않은 에리트로포이에틴은 보호를 나타내지 않은 반면, 무-시알산 에리트로포이에틴은 보호 효과를 제공하였다.
B. 에리트로포이에틴의 카밤일화에 의한 조직 보호 사이토카인의 제조
진 젱(Jin Zeng)의 문헌[(1991) Lysine modification of metallothionein by carbamylation and guanidination, Methods in Enzymology 205:433-437]에 기재된 바와 같은 하기 절차에 따라, 천연 에리트로포이에틴을 사용하여 개별적인 카밤일화 분자를 제조할 수 있다. 시안산칼륨을 재결정시켰다. 1M 보레이트 완충액(pH 8.8)을 제조하였다. 에리트로포이에틴 용액을 동부피의 보레이트 완충액과 혼합하였다. 시안산칼륨을 직접 반응 관에 0.5M의 최종 농도로 첨가하였다. 용액을 잘 혼합하고 37℃에서 6시간동안 항온처리하였다. 증류수를 이용하여 용액을 완전히 투석시켰다. 투석 관으로부터 생성물을 제거하고, 새 관에 수거하였다. 부피를 측정하고, 10×염 용액(1M NaCl, 0.2M 시트르산나트륨, 3mM 시트르산) 1/9부피를 용액에 첨가한다. 단백질 함량을 결정하고 생성물 회수율을 계산한다. IEF 겔에 의해, 이어 TF-1 세포를 사용하는 시험관내 시험에 의해 생성물을 분석한다.
C. 에리트로포이에틴의 석신일화에 의한 조직 보호 사이토카인의 제조
알칼드(Alcalde) 등의 문헌[(2001), Succinylation of cyclodextrin glycosyltransferase from Thermoanaerobacter sp. 501 enhances its transferase activity using starch as donor, J. Biotechnology 86:71-80]에 기재되어 있는 바와 같이, 하기 절차에 따라, 개별적인 석신일화 분자를 제조하는데 천연 에리트로포이에틴을 사용할 수 있다. 0.5M NaHCO3(pH 8.0)중 에리트로포이에틴(100ug)을 석신산 무수물 15몰 과량으로 15℃에서 1시간동안 항온처리하였다. 증류수에 대해 투석시킴으로써 반응을 중단시켰다.
에리트로포이에틴을 석신일화시키는 다른 방법은 석신산 무수물을 무수 아세톤에 27mg/ml로 용해시키는 것이다. 에펜도르프 관에서 10mM 인산나트륨 완충액(pH 8.0)에서 반응시킨다. 에리트로포이에틴 및 석신산 무수물 50배 몰을 관에 첨가한다. 용액을 잘 혼합하고, 4℃에서 1시간동안 관을 회전시킨다. 투석 카셋트(Slide-A-Laze 7K, Pierce 66373)를 사용하여, 10mM 인산나트륨 완충액에 대해 투석시킴으로써 반응을 중단시킨다. 생성물을 투석 카셋트로부터 제거하고 새 관에 수집한다. 부피를 측정하고 10×염 용액(1M NaCl, 0.2M 시트르산나트륨, 3mM 시트르산) 1/9부피를 첨가한다. 단백질 함량을 결정하고, 생성물 회수율을 계산한다. IEF 겔에 의해, 이어 TF-1 세포를 사용하는 시험관내 시험에 의해 생성물을 분석하였다.
D. 에리트로포이에틴의 아세틸화에 의한 조직 보호 사이토카인의 제조
사타케(Satake) 등의 문헌[(1990) Chemical modification of erythropoietin: an increase in in-vitro activity by guanidination. Biochimica et Biophysica Acta. 1038:125-129]에 기재되어 있는 바와 같이, 하기 절차에 따라 천연 에리트로포이에틴을 사용하여 개별적인 아세틸화 분자를 제조할 수 있다.
에펜도르프 관에서 80mM 인산나트륨 완충액(pH 7.2)에서 반응을 수행하였다. 에리트로포이에틴 및 동몰의 아세트산 무수물을 첨가하였다. 잘 혼합한 후, 얼음상에서 1시간동안 용액을 항온처리시켰다. 투석 카셋트(Slide-A-Laze 7K, Pierce 66373)를 사용하여, 물에 대해 투석시킴으로써 반응을 중단시켰다. 생성물을 투석 카셋트로부터 제거하고 새 관에 수집하였다. 생성물의 부피를 측정한 다음, 10×염 용액(1M NaCl, 0.2M 시트르산나트륨, 3mM 시트르산) 1/9부피를 첨가하였다. 단백질 함량을 결정하고, 생성물 회수율을 계산하였다. IEF 겔에 의해, 이어 TF-1 세포를 사용하는 시험관내 시험에 의해 생성물을 분석하였다.
E. 에리트로포이에틴의 리신의 카복시메틸화에 의한 조직 보호 사이토카인의 제조
액타(Akhtar) 등의 문헌[(1999) Conformational study of Nε-(carboxymethyl)lysine adducts of recombinant a-crystallins. Current Eye Research, 18:270-276]에 기재되어 있는 바와 같이, 하기 절차에 따라 천연 에리트로포이에틴을 사용하여 개별적인 Nε-(카복시메틸)리신(CML) 개질된 분자(여기에서는, 에리트로포이에틴의 하나 이상의 리실 잔기가 개질됨)를 제조할 수 있다.
글라이옥실산(200mM) 및 NaBH3CN(120mM)을 인산나트륨 완충액(50mM, pH 7.5)중에서 제조하였다. 에펜도르프 관에서, 에리트로포이에틴(포스페이트 완충액중)을 첨가하였다. 용액중 리신 당량을 계산하였다(약 8개 리신 잔기/몰). 이어, 3배 더 큰 NaBH3CN 및 5 또는 10배 더 큰 글라이옥실산을 관에 첨가하였다. 각 관을 진탕시키고 37℃에서 5시간동안 항온처리시켰다. 샘플을 4℃에서 하룻밤동안 포스페이트 완충액에 대해 투석시켰다. 투석 후 각 생성물의 부피를 측정하였다. 단백질 농도를 결정하고 생성물 회수율을 계산하였다. IEF 겔에 의해, 이어 TF-1 세포를 사용하는 시험관내 시험에 의해 생성물을 분석하였다.
F. 에리트로포이에틴의 요오드화에 의한 조직 보호 사이토카인의 제조
아이오도-젠 예비 코팅된 요오드화 관(제품 #28601)에 대한 피어스 케미칼 캄파니(일리노이주 록포드 소재)의 지침에 기재되어 있는 바와 같이 하기 절차에 따라, 천연 에리트로포이에틴을 사용하여 개별적인 요오드화 분자를 제조할 수 있다.
첫번째 방법으로는, NaI 0.1M을 제조하고, 인산나트륨 완충액(40mM, pH 7.4)에서 0.1ml/관의 총 반응 부피로 아이오도-젠 예비 코팅된 요오드화 관(피어스, 28601)에서 요오드화를 수행하였다. 인산나트륨 완충액과 단백질 기질(에리트로포이에틴)을 혼합하고, 이어 아이오도-젠 예비 코팅된 요오드화 관으로 옮겼다. NaI를 1 내지 2mM의 최종 농도로 첨가하여, 14 내지 20의 NaI/단백질 몰비를 만들었다. 용액을 잘 혼합하고 온화하게 교반하면서 15분간 실온에서 항온처리하였다. 반응 혼합물을 제거함으로써 반응을 중단시키고, 인산나트륨 완충액 3.9ml를 함유하는 관에 첨가하였다(즉, 40배 희석). 예비-습윤 울트라프리 원심 필터 장치에 의해 생성물을 농축시켰다. 농축액의 부피를 측정하고, 10×염 용액(1M NaCl, 0.2M 시트르산나트륨, 3mM 시트르산) 1/9부피를 첨가하였다. 단백질 농도를 결정하고 생성물 회수율을 계산하였다. IEF 겔에 의해, 이어 TF-1 세포를 사용하는 시험관내 시험에 의해 생성물을 분석하였다.
2. 에리트로포이에틴을 요오드화시키는 다른 방법은 1mCi의 유리 Na125I를 함유하는 100ul PBS(20mM 인산나트륨, 0.15M NaCl, pH 7.5) 중에서 아이오도 비이드(피어스, 일리노이주 록포드 소재) 하나를 5분간 항온처리함을 포함한다. 이어, 100ul PBS중 에리트로포이에틴(100ug)을 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 10분간 항온처리한 후, 반응 용기로부터 200ul 용액을 제거함으로써(아이오도 비이드는 남겨둠) 반응을 중단시켰다. 센트리콘 10 칼럼상에서 겔 여과시킴으로써 과량의 요오드를 제거하였다. 도 9에 도시되어 있는 바와 같이, 이러한 방식으로 제조된 아이오도-에리트로포이에틴은 혈청 회수로부터 P19 세포를 보호하는데 효율적이다.
3. 클로라민 T를 사용하여 에리트로포이에틴을 요오드화시킬 수도 있다. 100ul PBS중 에리트로포이에틴(100ug)을 500uCi Na125I에 첨가하고 에펜도르프 관에서 혼합물을 함께 혼합하였다. 클로라민 T(2mg/ml) 25ul를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1분동안 항온처리하였다. 클로라민 T 중지 완충액(PBS 중 2.4mg/ml 소듐 메타바이설파이트, 10mg/ml 티로신, 10% 글라이세롤, 0.1% 자일렌) 50ul를 첨가하였다. 이어, 센트리콘 10 칼럼 상에서 겔 여과시킴으로써 아이오도티로신 및 요오드화된 에리트로포이에틴을 분리하였다.
G. 에리트로포이에틴의 바이오틴일화에 의한 조직 보호 사이토카인의 제조
1. 워초우스키 등의 문헌["Biotinylated recombinant human erythropoietins: Bioactivity and Utility as a receptor ligand", Blood, 1989, 74(3):952-8]에서, 저자들은 에리트로포이에틴을 바이오틴일화시키는 3가지 상이한 방법을 이용한다. 바이오틴을 (1) 시알산 잔기; (2) 카복실레이트기; 및 (3) 아미노기에 첨가한다. 저자들은 마우스 비장 세포 증식 분석을 이용하여, (1) 시알산 잔기에 바이오틴을 첨가하면 에리트로포이에틴의 생물학적 활성을 불활성화시키지 않고; (2) 카복실레이트기에 바이오틴을 첨가하면 에리트로포이에틴의 생물학적 활성을 실질적으로 불활성화시키며; (3) 아미노기에 바이오틴을 첨가하면 에리트로포이에틴이 생물학적으로 완전히 불활성화됨을 입증한다. 이들 방법 및 개질체는 본원에 완전히 포함된다. 도 10은 혈청-결핍된 P19 분석에서 바이오틴일화 에리트로포이에틴 및 무-시알산 에리트로포이에틴의 활성을 보여준다.
2. 또한, EZ-링크 NHS-LC-바이오틴(제품 #21336)에 대한 피어스 케미칼 캄파니(일리노이주 록포드 소재)의 지침에 기재되어 있는 바와 같이 하기 절차에 따라, 천연 에리트로포이에틴을 사용하여 개별적인 바이오틴일화 분자를 제조할 수 있다.
반응 직전에, EZ-링크 NHS-LC-바이오틴(피어스, 21336)을 DMSO에 2mg/ml로 용해시켰다. 50mM 중탄산나트륨(pH 8.3)을 함유하는 총 1ml 부피로 관(17×100mm)에서 반응을 수행하였다. 에리트로포이에틴 및 <10%의 EZ-링크 NHS-LC-바이오틴을 첨가하여 ∼20의 바이오틴/단백질 몰비를 갖는 용액을 생성시켰다. 용액을 잘 혼합하고 얼음상에서 2시간동안 항온처리하였다. 울트라프리 원심 필터 장치를 이용하여 용액을 탈염 및 농축시켰다. 생성물을 새 관에 모았다. 생성물의 부피를 측정하고, 10×염 용액(1M NaCl, 0.2M 시트르산나트륨, 3mM 시트르산) 1/9부피를 생성물에 첨가하였다. 생성물의 단백질 함량을 결정하고 생성물 회수율을 계산하였다. IEF 겔에 의해, 이어 TF-1 세포를 사용하는 생체내 시험에 의해 생성물을 분석하였다.
3. 하기 방법을 이용하여 에리트로포이에틴의 유리 아미노기를 바이오틴일화시킬 수 있다. 먼저, D-바이오틴오일-e-아미노카프로산-N-하이드록시석신이미드 에스터(베링거 만하임(Boehringer Mannheim) #1418165) 0.2mg을 100ul DMSO에 용해시켰다. 호일로 덮인 관에서 약 0.2mg 에리트로포이에틴을 함유하는 400ul PBS와 이 용액을 합하였다. 실온에서 4시간동안 항온처리한 후, 센트리콘 10 칼럼 상에서의 겔 여과에 의해 미반응 바이오틴을 분리하였다.
조직 보호 사이토카인을 수득하기 위하여, 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴 유도체 상에서 이들 개질을 수행할 수 있을 것으로 생각된다. 예를 들어, 에리트로포이에틴을 상기 실시예 2(A)에 기재되어 있는 절차에 따라 시알산 제거하고, 상기 실시예 2(B)에 기재되어 있는 절차에 따라 카밤일화시켜, 아시알로카밤오일에리트로포이에틴을 생성시킬 수 있다.
실시예 3
다른 방법에 의한 조직 보호 사이토카인의 제조
1. 트라이나이트로페닐화: 플랩 등의 문헌["Activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease A with modified amino groups", 1971, J. Biol. Chem. 246, 939-845]에 기재되어 있는 바와 같이 2,4,6-트라이나트로벤젠설폰에이트로 에리트로포이에틴(100ug)을 개질시켰다.
2. 아르기닌 개질: 리올단의 문헌["Functional arginyl residues in carboxypeptidase A. Modification with butanedione", Riordan JF, Biochemistry 1973, 12(20):3915-3923]에 기재된 바와 같이 2,3-부테인다이온으로 에리트로포이에틴을 개질시켰다.
3. 패티 등의 문헌["Identification of functional arginine residues in ribonuclease A and lysozyme", Patthy, L, Smith EL, J. Biol. Chem 1975, 250(2):565-9]에 기재된 바와 같이 사이클로헥산온으로 에리트로포이에틴을 개질시켰다.
4. 워버 등의 문헌["Proceedings: Carboxypeptidase B: modification of functional arginyl residues" Werber, MM, Sokolovsky M, Isr. J. Med. Sci. 1975 11(11):1169-70]에 기재되어 있는 바와 같이 페닐글라이옥살로 에리트로포이에틴을 개질시켰다. 상기 기재된 신경-유사 P19 세포 분석을 이용하여 페닐글라이옥살-개질된 에리트로포이에틴을 시험하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, 이 화학적으로 개질된 에리트로포이에틴은 그의 신경 보호 효과를 충분히 보유한다.
5. 티로신 개질: 네슬러(Nestler) 등의 문헌["Stimulation of rat ovarian cell steroidogenesis by high density lipoproteins modified with tetranitromethane", Nestler JE, Chacko GK, Strauss JF 3rd., J. Biol. Chem. 1985년 6월 25일; 260(12):7316-21]에 기재되어 있는 바와 같이 테트라나이트로메테인을 사용하여 에리트로포이에틴(100ug)을 항온처리하였다.
6. 글루탐산(및 아스파트산) 개질: 카복실기를 개질시키기 위하여, 캐러웨이(Carraway) 등의 문헌["Carboxyl group modification in chymotrypsin and chymotrypsinogen." Carraway KL, Spoerl P, Koshland DE Jr., J. Mol. Biol. 1969년 5월 28일; 42(1):133-7]에 기재되어 있는 바와 같이 1M 글라이신아마이드중 0.02M EDC를 사용하여 pH 4.5 및 실온에서 에리트로포이에틴(100ug)을 60분간 항온처리하였다.
7. 트립토판 잔기 개질: 알리(Ali) 등의 문헌[J. Biol. Chem. 1995년 3월 3일; 270(9):4570-4]에 기재되어 있는 바와 같이 20mM 인산칼륨 완충액(pH 6.5)중 20uM n-브로모석신이미드를 사용하여 실온에서 에리트로포이에틴(100ug)을 항온처리하였다. 코로치키나(Korotchkina)의 문헌[Korotchkina, LG 등, Protein Expr Purif. 1995년 2월; 6(1):79-90]에 기재되어 있는 방법에 의해 산화된 트립토판 잔기의 수를 결정하였다.
8. 아미노기의 제거: 아미노기를 제거하기 위하여, 코키니(Kokkini, G.) 등의 문헌["Modification of hemoglobin by ninhydrin", Blood, Vol. 556, No. 4 1980:701-705]에서와 같이, 20mM 닌하이드린(일리노이주 록포드 소재의 피어스 케미칼 제품)을 함유하는 PBS(pH 7.4) 중에서 37℃에서 에리트로포이에틴(100ug)을 2시간동안 항온처리시켰다. 생성물을 소듐 보로하이드라이드 또는 리튬 알루미늄 하이드라이드와 반응시킴으로써, 생성된 알데하이드를 환원시켰다. 구체적으로는, 실온에서 PBS중 0.1M 소듐 보로하이드라이드를 사용하여 에리트로포이에틴(100ug)을 30분간 항온처리시켰다. 샘플을 얼음상에서 10분간 냉각시키고, 이를 PBS에 대해 하룻밤동안 3회 투석시킴으로써 환원을 종결시켰다. (코키니, Blood, Vol. 556, No. 4, 1980:701-705). PBS중 0.1M 리튬 알루미늄 하이드라이드를 사용하여 실온에서 30분간 에리트로포이에틴(100ug)을 항온처리시킴으로써 리튬 알루미늄 하이드라이드에 의해 환원시켰다. 샘플을 얼음상에서 10분간 냉각시키고 샘플을 PBS에 대해 하룻밤동안 3회 투석시킴으로써 환원을 종결시켰다.
9. 다이설파이드 환원 및 안정화: 500mM DTT를 사용하여 에리트로포이에틴(100ug)을 60℃에서 15분간 항온처리하였다. 이어, 물중 20mM 아이오도아세트아마이드를 혼합물에 첨가하고, 어두운 곳에서 실온에서 25분간 항온처리하였다.
10. 제한된 단백질 분해: 에리트로포이에틴에 대해 특정 잔기를 표적으로 하는 제한된 화학적 단백질 분해를 실시할 수 있다. 질소 압력하에 뚜껑을 막은 관에서, 50% 아세트산중 50배 과량의, 트립토판 잔기 뒤를 특이적으로 절단하는 2-(2-나이트로페닐설페닐)-3-메틸-3'-브로모인돌레닌과 에리트로포이에틴을 어두운 곳에서 실온에서 48시간동안 반응시켰다. 트립토판으로 급냉시키고 탈염시킴으로써 반응을 종결시켰다.
상기 나타낸 바와 같이, 에리트로포이에틴 또는 무-시알산 에리트로포이에틴은 개질될 수 있으며, 본 발명의 원리로부터 벗어나지 않으면서 에리트로포이에틴 분자의 여러 개질 및 추가적인 개질을 수행할 수 있다. 아래 기재되는 바와 같이 제조될 수 있는 부분적으로 시알산 제거된 에리트로포이에틴을 사용하여 상기 임의의 실시예를 수행할 수 있다. 예를 들어, 다카하시(1977, J. Biochem. 81:395-402)의 방법(이는 실온에서 0.5 내지 3시간의 변화되는 시간동안 수행될 수 있음)에 따라 예컨대 페닐글라이옥살을 사용함으로써, 하나 이상의 아르기닌 잔기에서 상기 개질된 임의의 에리트로포이에틴을 개질시킬 수 있다. 반응 혼합물을 물에 대해 투석함으로써 반응을 종결시켰다. 에리트로포이에틴의 이러한 개질된 형태의 사용은 본원에 충분히 포함된다.
실시예 4
신경 보호 효과를 갖는 조직 보호 사이토카인
맨리(Manley) 등의 문헌[2000, Aquaporin-4 deletion in mice reduces brain edema after acute water intoxication and ischemic stroke, Nat Med 2000년 2월; 6(2):159-63]에 따라 물 중독 분석을 이용하여, 본 발명의 조직 보호 사이토카인의 신경 보호 효과를 평가하였다. 암컷 C3H/HEN 마우스를 사용하였다. 마우스에게 400ng/kg bw DDAVP(데스모프레신)와 함께 물을 체중의 20%로 복강내 투여하였다. 마우스에게 에리트로포이에틴(A) 또는 조직 보호 사이토카인:무-시알산 에리트로포이에틴(B), 카밤일화 무-시알산 에리트로포이에틴(C), 석신일화 무-시알산 에리트로포이에틴(D), 아세틸화 무-시알산 에리트로포이에틴(E), 요오드화 무-시알산 에리트로포이에틴(F), 카복시메틸화 무-시알산 에리트로포이에틴(G), 카밤일화 에리트로포이에틴(H), 아세틸화 에리트로포이에틴(I), 요오드화 에리트로포이에틴(J) 또는 Nε-카복시 메틸 에리트로포이에틴(K)을 투여하였다. 물을 투여하기 24시간 전에 또한 물 투여시에 다시 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인 100㎍/kg을 마우스에게 투여하였다. 맨리 등으로부터의 변형된 등급을 사용하여 마우스를 평가하였다. 변형된 등급은 아래 기재되어 있다:
1. 우리/테이블을 돌아다님
예 0
아니오 1
2. 눈으로 물체를 쫓음
예 0
아니오 1
3. 수염 움직임
있음 0
없음 1
4. 다리-꼬리 움직임
정상 0
경직 1
마비 2
5. 통증 움츠림(발끝 쑤시기)
예 0
아니오 1
6. 이동의 협조
정상 0
비정상 1
7. 테이블 가장자리에서 멈춤
예 0
아니오 1
가능한 총 등급 8
15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150 및 180분에 마우스의 점수를 매겼다. 플롯팅된 점수는 염수만 투여받은 동물의 %로서 전체 시간 곡선 아래의 면적이다. 도 12는 대조용 마우스에 의해 수득된 점수의 백분율로서, 본 발명의 에리트로포이에틴 또는 조직 보호 사이토카인을 투여받은 마우스의 점수를 도시한다. 본 발명의 조직 보호 사이토카인을 투여받은 마우스는 신경 손상이 적음을 나타내었고, 따라서 변형된 등급에서 더욱 우수한 점수를 나타내었다. 도 12는 본 발명의 조직 보호 사이토카인이 신경 조직을 보호함을 보여준다.
실시예 5
혈액-뇌척수액 치밀 장벽을 가로지르는 에리트로포이에틴
다 큰 수컷 스프라그-돌리 래트를 마취시키고 재조합 인간 에리트로포이에틴을 복강내 투여하였다. 뇌척수액 샘플을 4시간까지 30분 간격으로 소뇌숨뇌수조로부터 채취하고, 민감성의 특이적 효소-결합 면역분석법을 이용하여 에리트로포이에틴 농도를 결정하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, CSF에서의 기준 에리트로포이에틴 농도는 8mU/ml이다. 수시간 지연시킨 후, CSF에서 측정한 에리트로포이에틴의 농도가 증가하기 시작하여, 2.5시간 이후부터는 p<0.01 수준에서 기준 농도로부터 크게 다르다. 약 100mU/ml의 피크 수준은 시험관 내에서 보호 효과를 나타내는 것으로 알려진 범위(0.1 내지 100mU/ml) 내에 있다. 피크까지의 시간은 약 3.5시간이며, 이는 피크 혈청 수준(1시간 미만)으로부터 상당히 지연된 것이다. 이 실험의 결과는 에리트로포이에틴을 적절한 농도로 알약 비경구 투여함으로써 상당한 농도의 에리트로포이에틴이 치밀한 세포 이음부를 가로질렀음을 설명한다. 당해 분야의 숙련자는 본 발명의 조직 보호 사이토카인으로부터도 유사한 결과가 예상됨을 알 것이다.
실시예 6
이식을 위해 준비된 심장의 기능 유지
델케이어(Delcayre) 등의 방법(1992, Amer. J. Physiol. 263:H1537-45)에 따라 수행되는 생체외 연구를 위하여 심장을 제거하기 24시간 전에, 체중 300 내지 330g의 위스타(Wistar) 수컷 래트에게 에리트로포이에틴(체중 1kg당 5000U) 또는 비히클을 투여한다. 펜토바비탈(0.3mL)로 동물을 죽이고, 정맥내로 헤파린(0.2mL)을 주사한다. 처음에는, 심장을 15분간 평형화시킨다. 이어, 8mmHg의 확장말기압을 나타내는 부피까지 좌심실 풍선을 팽창시킨다. 좌심실 풍선 부피를 0.02mL 분량만큼 증가시키면서 팽창시킴으로써 좌심실 압력-부피 곡선을 만든다. 부피가 0일 때를 좌심실의 확장말기압이 0인 시점으로 정의한다. 압력-부피 곡선을 완성한 후, 좌심실 풍선을 수축시켜 확장말기압을 다시 8mmHg로 만들고, 관상동맥의 흐름을 점검한 후 15분동안 조절기간을 둔다. 이어, 50mL 셀시어(Celsior)+분자로 심장을 정지시켜, 60cm H2O의 압력하에 4℃에 둔다. 이어, 심장을 제거하고 동일한 용액으로 채워지고 얼음 조각으로 둘러싸인 플라스틱 용기에 넣어 4℃에서 5시간동안 저장한다.
저장기간이 끝난 후, 심장을 랑겐도르프(Langendorff) 장치로 옮긴다. 풍선 카테터를 좌심실에 다시 삽입하고 허혈전 기간동안과 동일한 부피로 다시 팽창시킨다. 심장을 37℃에서 2시간 이상동안 재관류시킨다. 15분동안의 재유동동안 재관류 압력을 50cm H2O로 설정한 다음, 이후 2시간동안 100cm H2O로 되돌린다. 다시 박동시킨다(1분당 320회 박동). 재관류시킨지 25, 45, 60 및 120분 후에 수축지수 및 확장기압을 3회씩 등용적 측정한다. 이 시점에서, 압력 부피 곡선을 만들고, 45분 재관류동안의 관상 동맥 유출물을 수거하여 크레아틴 키나제 누출을 측정한다. 쌍을 이루지 않은 t-시험을 이용하여 두 처리 군을 비교하고, 확장말기압 데이터를 사용하는 선형 복귀를 이용하여 순응성 곡선을 디자인한다. 도 14에 도시된 바와 같이, 에리트로포이에틴으로 처리한 후 좌심실 압력이 상당히 개선되었고, 부피-압력 곡선이 개선되었으며, 좌심실 확장기압의 감소 및 크레아틴 키나제 누출의 감소가 일어났다. 본 발명의 조직 보호 사이토카인으로 처리함으로써 유사한 결과가 예상된다.
실시예 7
허혈성 손상으로부터 심근육을 보호하는 에리트로포이에틴
24시간 전에 미리 재조합 인간 에리트로포이에틴(체중 1kg당 5000U)을 투여한 다 큰 수컷 래트를 마취시키고, 관상 동맥 폐색을 위해 준비한다. 절차의 개시시 추가적으로 에리트로포이에틴을 투여하고, 좌측 주 관상 동맥을 30분간 폐색시켰다가 푼다. 처리한 후 1주일동안 매일 동일한 투여량의 에리트로포이에틴을 투여한다. 이어, 동물의 심장 기능에 대해 연구한다. 도 15에 도시되어 있는 바와 같이, 모의시험 주사(염수)를 맞은 동물은 좌측 확장말기압의 큰 증가를 보여 심근 경색에 수반되는 확장된 강직 심장을 나타낸다. 대조적으로, 에리트로포이에틴을 투여한 동물은 모의시험 처리된 대조용과 비교하여 심장 기능의 저하를 나타내지 않는다(p<0.01 수준에서 유의한 차이). 본 발명의 조직 보호 사이토카인으로 처리할 때에도 유사한 결과가 예상된다.
실시예 8
말초혈관에 투여된 에리트로포이에틴에 의한 망막 허혈의 보호
허혈 스트레스를 받은 지 30분 후에 다수의 세포가 사멸할 정도로 망막 세포는 허혈에 대해 매우 민감하다. 또한, 당뇨병, 녹내장 및 황반 변성과 같은 다수의 통상적인 인간 질환에 수반되는 시력 저하에는 아급성 또는 만성 허혈이 잠재되어 있다. 현재, 허혈로부터 세포를 보호하는 효과적인 치료법이 없는 상태이다. 혈액과 망막 사이에는 대부분의 큰 분자를 차단하는 치밀 내피 세포 장벽이 존재한다. 말초 혈관을 통해 투여된 에리트로포이에틴이 허혈에 민감한 세포를 보호할 것인지의 여부를 시험하기 위하여, 로젠바움 등의 문헌[1997; Vis. Res. 37:3443-51]에 기재되어 있는 바와 같이 급성 가역성 녹내장 래트 모델을 이용하였다. 구체적으로, 다 큰 수컷 래트의 눈의 전실에 전신 동맥 혈압보다 높은 압력까지 염수를 주입한 다음 60분간 유지시켰다. 허혈을 유도하기 24시간 전에 동물에게 염수 또는 체중 1kg당 5000U(40㎍)의 에리트로포이에틴을 복강내 투여하고, 3일간 더 매일 계속 투여하였다. 처리한지 1주일 후에 어둠에 익숙해진 래트에 대해 망막전위도검사를 수행하였다. 도 16 및 도 17은 염수로만 처리된 동물(패널 C)(기능이 거의 유지되지 않음)과는 대조적으로, 에리트로포이에틴을 투여한 동물에서는 망막전위도(ERG)가 양호하게 보존됨을 보여준다(패널 D). 도 16에서는 에리트로포이에틴으로 치료된 군과 염수로 처리한 군에 있어서 망막전위도 a-파 및 b-파 진폭을 비교하고, 에리트로포이에틴에 의해 상당한 보호가 제공되었음을 보여준다. 본 발명의 조직 보호 사이토카인으로 처리함에 의해서도 유사한 결과가 얻어질 수 있다.
실시예 9
뇌 손상으로부터 야기되는 감소된 인지 기능에 대한 에리트로포이에틴의 회복 효과
뇌 외상을 입은 마우스의 감소된 인지 기능을 회복시키는 에리트로포이에틴의 능력을 입증하는 연구에서는, 브린즈 등의 문헌[PNAS 2000, 97:10295-10672]에 기재된 바와 같이 암컷 Balb/c 마우스에게 둔기 뇌 외상을 입히고, 5일 후에 체중 1kg당 5000U(40㎍)의 에리트로포이에틴을 매일 복강내로 투여하기 시작하였다. 손상을 받은 지 12일 후에, 매일 4회씩 모리스(Morris) 물 미로에서 동물의 인지 기능을 시험하였다. 치료된 동물과 치료되지 않은 동물이 모두 이 시험에서 불량하게 행동하지만(가능한 90초 동안 약 80초간 수영함), 도 18은 에리트로포이에틴-치료된 동물이 더욱 우수한 수행능력을 보였음을 도시한다(이 도면에서는, 음의 값이 더욱 우수한 것임). 에리트로포이에틴 치료가 외상을 입은 지 30일 후까지 지연되는 경우에도(도 19), 인지 기능의 회복이 보인다. 본 발명의 조직 보호 사이토카인으로 처리함으로써도 유사한 결과가 예상된다.
실시예 10
카이네이트 모델
카이네이트 신경독성 모델에서는, 브린즈 등의 문헌[Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 2000, 97;10295-10672]에 기재된 방법에 따라, 25mg/kg 카이네이트를 투여하기 24시간 전에 체중 1kg당 5000U(40㎍)의 투여량으로 복강내 투여된 무-시알산 에리트로포이에틴이 사멸까지의 시간에서 볼 수 있듯이 에리트로포이에틴만큼 효과적임을 보여준다(도 20). 본 발명의 조직 보호 사이토카인으로 처리하는 경우에도 유사한 결과를 얻을 수 있다.
실시예 11
척수 손상 모델
1. 래트 척수 압박 시험 에리트로포이에틴 및 조직 보호 사이토카인
이 연구에서는 체중 180 내지 300g의 위스타 래트(암컷)를 사용하였다. 수술하기 전 12시간동안 동물을 절식시키고, 인도적으로 감금한 후 티오펜탈 소듐을 복강내 주사(40mg/kg-bw)하여 마취시켰다. 피부 침투(부피바케인 0.25%) 후, 절개 현미경을 사용하여 2cm 절개함으로써, 완벽한 1회 수준(T-3)의 척추후궁절제술을 수행하였다. 척수에 0.6뉴튼(65g)의 폐쇄력을 가하는 일시적인 동맥류 클립을 1분동안 경막 외에서 가함으로써, 외상성 척수 손상을 유도하였다. 클립을 제거한 후, 피부 절개부를 닫고 동물을 마취에서 완전히 회복시킨 다음 우리로 돌려보냈다. 저절로 배뇨가 다시 시작될 때까지 매일 2회 이상 방광 촉진을 병행하면서 래트를 계속 모니터링하였다.
40마리의 동물을 무작위적으로 5개의 군으로 나누었다. 대조용 군(I)(n=8)의 동물은 절개부를 닫은 직후 통상적인 염수를 투여받았다(정맥내 주사를 통해). 군(II)(n=8)은 rhEPO를 16㎍/kg-bw로 정맥내 투여받았고; 군(III)은 본 발명의 무-시알산 조직 보호 사이토카인(무-시알산 에리트로포이에틴)을 16㎍/kg-bw로 정맥내 투여받았고; 군(IV)는 무-시알산 조직 보호 사이토카인을 30㎍/kg-bw로 정맥내 투여받았고; 군(V)는 본 발명의 무-시알산 조직 보호 사이토카인(무-시알산 에리트로포이에틴)을 30㎍/kg-bw로 투여받았으며; 이들 투여는 모두 정맥류 클립을 제거한 직후 단일 알약의 정맥내 주사로서 제공되었다.
바소(Basso) 등의 운동 등급을 사용하여 래트의 운동 신경 기능을 평가한다. 이 등급에서는, 동물에게 0(뒷발 움직임이 관찰되지 않음) 내지 21(정상적인 보행)의 점수를 부여한다. 각 동물이 받은 처리에 대해 모르는 동일한 시험관에 의해, 손상된지 1, 12, 24, 48 및 72시간 후 및 1주일 후에 래트를 기능 결손에 대해 시험한다.
도 21은 30일간의 기간에 걸쳐 척수 외상으로부터 회복되는 래트의 운동 등급을 보여주는 그래프이다. 이 그래프로부터 볼 수 있는 바와 같이, 에리트로포이에틴(군 II) 또는 조직 보호 사이토카인(군 III 내지 V)을 투여받은 래트는 더욱 용이하게 손상으로부터 회복되었으며, 대조용 래트보다 손상으로부터 전반적으로 우수하게 회복됨을 보여주었다. 본 발명의 조직 보호 사이토카인으로 치료함으로써도 유사한 결과가 예상된다.
2. 래빗 척수 허혈 시험 에리트로포이에틴 및 조직 보호 사이토카인
체중 1.5 내지 2.5kg의 뉴질랜드 화이트 래빗(8 내지 12월령, 수컷) 36마리를 이 연구에 사용하였다. 동물을 12시간동안 절식시킨 후 인도적으로 감금하였다. 100% 산소중 3% 할로테인을 통해 마취를 유도하고, 50% 산소 및 50% 공기의 혼합물중 0.5 내지 1.5% 할로테인으로 마취를 유지시켰다. 정맥내 카테터(22게이지)를 왼쪽 귀 정맥에 넣었다. 수술 절차 동안 링거 락테이트를 시간당 4ml/kg 체중(bw)의 속도로 주입시켰다. 감염을 예방하기 위하여, 수술 전에 세파졸린 10mg/kg-bw를 정맥내 투여하였다. 동물을 오른쪽 측면으로 누운 자세로 위치시키고, 피부를 포비돈 요오드로 준비한 다음, 부피바케인(0.25%)을 침투시키고, 12번째 갈비뼈 높이에서 척추에 평행하게 옆구리 피부를 절개하였다. 피부 및 피하 등허리 근막을 절개한 후, 가장 긴 허리근 및 엉덩갈비 허리근을 수축시켰다. 좌측 복막 뒤로 접근하여 복부 대동맥을 노출시키고, 좌측 신장 동맥보다 덜 움직이도록 하였다. PE-60 관으로 좌측 신장 동맥으로부터 멀리 대동맥 주위에서 고리를 매고 양 말단을 보다 큰 고무관을 통해 통과시켰다. PE 관을 잡아당김으로써, 대동맥을 20분간 비-외상 방식으로 폐색시켰다. 대동맥 폐색 전에 헤파린(400IU)을 정맥내 알약으로서 투여하였다. 폐색시킨지 20분 후, 관 및 카테터를 제거하고, 절개부를 닫은 다음, 완전히 회복될 때까지 동물을 모니터링하고 신경 기능에 대해 연속적으로 평가하였다.
36마리의 동물을 무작위로 6개의 군으로 나누었다. 대조용 군(I)에서, 동물(n=6)은 대동맥 폐색을 푼 직후에 통상적인 염수를 정맥내 투여받았다. 군(II)는 rhEPO를 6.5㎍/kg-bw로 투여받았고; 군(III)은 조직 보호 사이토카인(카밤일화 에리트로포이에틴)을 6.5㎍/kg-bw로 투여받았으며; 군(IV)는 다른 조직 보호 사이토카인(무-시알산 에리트로포이에틴)을 6.5㎍/kg-bw로 투여받았고; 군(V)는 군(IV)와 동일한 조직 보호 사이토카인을 20㎍/kg-bw로 투여받았으며; 군(VI)은 또 다른 조직 보호 사이토카인(무-시알산 카밤일화 에리트로포이에틴)을 20㎍/kg-bw로 투여받았는데, 이들 투여는 모두 재관류 직후 정맥내로 제공되었다(각 군에 대해 n=6).
재관류한지 1, 24 및 48시간 후에 처리에 대해 알지 못하는 연구자가 드러몬드(Drummond) 및 무어(Moore)의 기준에 따라 운동 기능을 평가하였다. 다음과 같이 각 동물에게 0 내지 4의 점수를 부여했다: 0=뚜렷한 다리 운동 기능 없이 하반신 마비; 1=불량한 다리 운동 기능, 약한 반중력 움직임만; 2=적당한 다리 기능, 우수한 반중력 강도, 몸체 아래로 다리를 펼 수 없음; 3=탁월한 운동 기능, 몸체 아래로 다리를 펼 수 있고 정상적이지는 않지만 깡총 뛸 수 있음; 4=정상적인 운동 기능. 하반신 마비 동물의 경우 하루에 2회 수작업으로 방광을 비워주었다.
도 22는 회복하는 래빗의 운동 기능을 플롯팅하는 그래프이다. 그래프는 단 2일간의 기간에 걸쳐서도 에리트로포이에틴 및 본 발명의 조직 보호 사이토카인이 래빗을 척수 손상으로부터 더욱 완전하게 회복시킴을 보여준다. 본 발명의 조직 보호 사이토카인으로 치료할 때에도 유사한 결과가 예상된다.
실시예 12
에리트로포이에틴의 소염 효과
생체내 연구:
1. 래트에서의 중간 대뇌 동맥 폐색(MCAO) 시험
이탈리아 칼코 소재의 챨스 리버(Charles River)로부터 체중 250 내지 280g의 수컷 Crl:CD(SD)BR 래트를 수득하였다. 브린즈, 게지(Ghezzi, P.), 키난(Keenan, S.), 아그넬로(Agnello, D.), 데라네롤(de Lanerolle, N.C.), 세라미(Cerami, C.), 이트리(Itri, L.M.) 및 세라미(Cerami, A.)의 문헌[2000 Erythropoietin crosses the blood-brain barrier to protect against experimental brain injury, Proc Natl Acad Sci USA 97:10526-10531]의 교시내용에 따라, 이들 래트에서 수술을 수행하였다. 간단히, 래트를 클로랄 수화물(400mg/kg-bw, 복강내)로 마취시키고, 목동맥을 보이게 한 다음, 2회 봉합 및 절단에 의해 우측 목동맥을 폐색시켰다. 우측 안와에 인접하고 입쪽에 있는 천공 구멍에 의해 MCA를 볼 수 있었으며, 코동맥으로부터 멀리 소작(cauterization)하였다. 이 고정된 MCA 환부를 둘러싸는 반음영(경계구역)을 만들기 위하여, 미세한 겸자에 의해 끌어당김으로써 1시간동안 반대쪽 목동맥을 폐색시켰다가 풀어주었다. PBS 또는 rhEPO(5,000U/kg-bw, 복강내; 이 모델 (1)에서 보호성인 것으로 이미 밝혀짐)를 MCAO 직후 투여하였다. 지시가 있는 경우에는, 앞서 기재된 바와 같이(8) 대뇌 피질 균질물에서 TNF 및 IL-6을 정량하였다. 시판중인 ELISA 키트(캘리포니아주 카마릴로 소재의 바이오소스(biosource))를 사용하여 균질물에서 MCP-1을 측정하였다.
MCAO한지 24시간 후에, 래트를 상기 기재된 바와 같이 마취시키고, 염수 100ml, 이어 인산나트륨 완충된 4% 파라폼알데하이드 용액 250ml로 심장 통과 방식으로 관류시켰다. 뇌를 신속하게 제거하고, 인산나트륨 완충된 4% 파라폼알데하이드 용액에 2시간동안 고착시킨 다음, PBS중 20% 슈크로즈 용액으로 옮겨 하룻밤동안 둔 다음, 가라앉을 때까지 30% 슈크로즈 용액으로 옮겨 두었다가, -45℃에서 2-메틸뷰테인 중에서 냉동시켰다. -20℃의 냉동미세절단기(HM 500 OM, 마이크롬)에서 뇌의 횡단면에서 박편(30㎛)을 절단하고, 상이한 항원 또는 헤마톡실린-에오신 염색에 대한 조직 화학을 위해 각 15개의 박편을 선택하였다. 각각 하우저 등의 문헌에 기재된 방법 및 제조업체의 방법에 따라, 면역 반응성을 측정하기 위하여 항-아교세포 세동 산 단백질(GFAP) 마우스 단클론 항체(1:250, 베링거 만하임, 이탈리아 몬자 소재) 및 항-cd11b(MRC OX-42) 마우스 단클론 항체(1:50, 세로텍(Serotec), 영국)로 자유 부유 절편을 처리하였다. 절편을 모두 광현미경용의 코팅된 슬라이드 상에서 염수에 놓고, 등급이 매겨진 알콜을 통해 탈수시키고, 자일렌 중에 고착시킨 후, DPX 마운트앤트(BDH, 영국 풀 소재)를 사용하여 커버글래스로 덮었다. (10)에 기재된 바와 같이 인접 절편을 헤마톡실린-에오신으로 염색하였다.
도 23은 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 대뇌 피질 층의 관상 절편을 도시한다. 대조용 래트(A), PBS로 처리된 허혈 래트(B), rhEPO(5,000U/kg-bw, 복강내, MCAO 직후)로 처리된 허혈 래트(C). 절편(B)는 대조용(A)과 비교하여 신경 세포 성분의 손실에 수반되는 염증에 일치되는 조직 염색의 현저한 감소를 보인다. rhEPO 전신 투여는 허혈 손상을 크게 감소시켜, 세포 사멸 또는 손상을 제한된 구역에 편재화시킨다(C). (배율 2.5×. 크기 바=800㎛).
도 24는 GFAP 항체에 의해 염색된 경색 영역에 인접한 전방 피질의 관상 절편을 도시한다. 대조용 래트(A), PBS로 처리한 허혈 래트(B), rhEPO로 처리한 허혈 래트(C). GFAP-양성 공정에 의해 활성화된 별아교세포를 가시화시킨다(패널 B). 대표적인 rhEPO-처리된 동물에서 현저한 수 감소 및 염색 강도 감소가 일어났다(패널 C). (배율 10×. 크기 바=200㎛).
도 25는 OX-42 항체로 염색된 대뇌 피질 층의 관상 절편을 도시한다. PBS로 처리된 허혈 래트(A) 및 rhEPO로 처리된 허혈 래트(B). 허혈 대뇌 반구에서는, 두 처리 군 모두에서 경색된 조직 둘레의 세포 염색이 특히 현저하지만, 염수 처리된 군에서 훨씬 더 진하고 더 넓다. (배율 20×; 크기 바=100㎛).
도 26은 OX-42 항체로 염색된 경색 영역에 인접한 대뇌 피질 층의 관상 절편을 도시한다. rhEPO로 처리된 허혈 래트(B)에 비해 PBS로 처리된 허혈 래트(A)로부터 훨씬 더 높은 밀도의 단핵 염증 세포가 관찰된다. 전형적인 둥근 형상을 갖는 침투 백혈구가 경색의 부피를 확장시킬 것이다. (배율 10×; 크기 바=200㎛).
본 발명의 조직 보호 사이토카인으로 치료할 때에도 유사한 결과가 예상된다.
2. 루이스(Lewis) 래트에서의 급성 실험 알러지성 뇌척수염(EAE)
6 내지 8주령의 암컷 루이스 래트를 챨스 리버로부터 구입하였다(이탈리아 칼코 소재). 열에 의해 죽인 엠. 투버쿨로시스(M. tuberculosis) H37Ra(디프코(Difco), 미시간주 디트로이트 소재) 7mg/ml가 첨가된 동 부피의 완전 프로인트(Freund's) 보조제(CFA, 시그마(Sigma))에 유화된 물중 기니아피그 MBP(시그마, 미주리주 세이트 루이스 소재) 50㎍을 100μ의 최종 부피로 약한 에터 마취하에 두 뒷발바닥에 주사함으로써, EAE를 래트에 유발시켰다. EAE의 징후에 대해 무작위적인 방식으로 래트를 조사하고, 다음과 같이 점수를 매겼다: 0, 질병이 없음; 1, 이완된 꼬리; 2, 조화운동불능; 3, 뇨실금과 함께 완전한 뒷다리 마비. 면역화시킨지 3일 후로부터 시작하여, 래트에게 r-Hu-EPO(EPOetin alfa, Procrit, 올쏘 바이오테크(Ortho Biotech), 뉴저지주 라리탄 소재)를 PBS중 지시된 투여량으로 1일 1회 복강내(i.p.) 투여하였다. 임상-등급 EPO가 인간의 혈청 알부민을 함유하였기 때문에, 대조용 동물에게도 항상 동량의 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS를 투여하였다. EPO 5,000U/kg-bw를 매일 투여하면, 적혈구용적율이 30%까지 증가하였다(데이터는 도시하지 않았음). 지시될 때, PBS에 용해된, 덱사메타손(DEX) 1mg/kg-bw에 상응하는 1.3mg/kg-bw DEX 포스페이트 다이소듐 염(시그마)을 3일째부터 18일째까지 1일 1회 래트에게 피하 주사하였다. 지시가 있는 경우, 이미 기재된 바와 같이[아그넬로, 2000 #10] 뇌 및 척수 균질물에서 TNF 및 IL-6을 정량하였다.
도 27은 MBP로 면역화시킨지 3일 후부터 18일째까지 투여한, 상이한 투여량의 EPO의 EAE의 임상 징후에 대한 보호 효과를 도시한다. EPO는 투여량-의존 방식으로 질병의 개시를 지연시키고 질병의 심각도를 감소시켰다. 그러나, EPO는 최대 심각도까지의 시간을 지연시키지는 못하였다.
질병이 수그러진 후 EPO 치료를 중단하고 래트를 2개월까지 모니터링하는 실험에서는, 투여 중단 후 질병 악화가 나타나는 DEX와는 대조적으로, 재발이 발견되지 않았다(도 28). 본 발명의 조직 보호 사이토카인을 사용하여 치료함으로써도 유사한 결과가 예측된다.
시험관내 연구:
1 내지 2일령의 신생 스프라그-돌리 래트로부터 신경아교세포의 1차 배양액을 준비하였다. 대뇌 반구의 수막을 제거하고 기계적으로 파괴시켰다. 세포를 트립신 2.5%와 DNA아제 1%의 용액에 분산시키고, 100㎛ 나일론 메쉬를 통해 여과한 다음 10% 태아 송아지 혈청, 0.6% 글루코즈, 스트렙토마이신(0.1mg/ml) 및 페니실린(100Ul/ml)이 보충된 이글(Eagle's) 최소 필수 배지에 평판 배양시켰다(35mm 디쉬 1개당 140,000개 세포). 5% CO2가 있는 습윤화 배양기에 신경아교세포 배양액을 1주일에 2회 공급하고 37℃에서 생육시켰다. GFAP 및 그리포니아 심플리시폴리아(Griffonia simplicifolia) 아이소렉틴 B4의 면역 화학에 의해 평가되는 바와 같이, 97% 별아교세포 및 3% 미세아교세포를 갖는 2 내지 3주일 된 아교세포 배양액 상에서 모든 실험을 수행하였다. 18일된 래트 태아의 해마로부터 신경세포 배양액을 수득하였다. 뇌를 제거하고 수막을 제거한 다음, 해마를 단리하였다. 2.5% 트립신 용액 중에서 37℃에서 15 내지 20분간 배양함으로써 세포를 분산시킨 후 적정하였다. 신경아교세포에 사용되는 배지에 세포 현탁액을 희석시키고, 폴리오르니틴-코팅된 커버글래스 상에 160,000개 세포/커버글래스의 밀도로 평판 배양시켰다. 배양한 다음날, 사이토신 아라비노사이드 5μM로 보충된 신경세포 유지 배지(5㎍/ml 인슐린, 100㎍/ml 트랜스페린, 100㎍/ml 퍼트레신, 30nM Na 셀레나이트, 20nM 프로게스테론 및 페니실린 100U/ml로 보충된 덜베코(Dulbecco's) 변형 이글 배지 및 햄(Ham's) 영양 믹스)중에 신경아교세포 단일층을 함유하는 접시로 커버글래스를 옮겼다. 해마 신경 세포가 신경아교세포 단일층에 대향하도록 커버글래스를 뒤집었다. 커버글래스에 부착되는 파라핀 점이 커버글래스를 신경아교세포 위로 지지하여, 두 세포 유형이 서로 접촉하지 않도록 하면서 가용성 성분은 확산될 수 있도록 하는 좁은 틈을 형성시켰다. 이러한 배양 조건에 의해, 미세관-결합된 단백질 2 및 GFAP의 면역 화학에 의해 평가되는 바와 같이, 분화된 신경 세포 배양액이 >98%의 동질성을 가지면서 생육할 수 있었다. rhEPO(10U(80ng)/ml)의 존재 또는 부재하에 1μM 트라이메틸 틴(TMT)으로 세포를 24시간동안 처리하고, 상청액을 TNF 분석에 사용하였으며, 아래 기재된 바와 같이 세포 생존을 평가하였다. 지시될 때에는, 신경아교세포를 LPS의 존재하에 rhEPO와 함께 또는 없이 24시간동안 배양하고, 배양된 상청액에서 TNF를 측정하였다. 3-(4,5-다이메틸-티아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석에 의해 세포 생존을 측정하였다(데니조트(Denizot, F.) 및 랑(Lang, R.)의 문헌[1986, Rapid colorimetric assay for cell growth and survival]). 테트라졸륨 염료 절차를 변형시켜 민감성 및 신뢰성을 개선시켰다(J. Immunol Methods 89:271-277). 간단하게, MTT 테트라졸륨 염을 무혈청 배지에 0.75mg/ml의 최종 농도로 용해시킨 다음, 37℃에서 3시간동안 처리한 후 세포에 첨가하였다. 이어, 배지를 제거하고 1N HCl:아이소프로판올(1:24)로 포마잔을 추출하였다. 560nm에서의 흡광도를 미소평판 판독기에서 판독하였다.
도 29는 rhEPO가 혼합된 신경세포-신경아교세포 배양액에서 신경세포 사멸-유도되는 TNF 생성을 방지함을 보여준다. 패널 A: rhEPO(10U/ml)로 처리되거나 처리되지 않은, TMT 1μM에 의해 유도된 신경세포 사멸의 백분율. 패널 B: rhEPO(10U/ml)와 함께 또는 없이 신경세포의 존재(빗금친 막대) 또는 부재(검게 칠한 막대)하에 TMT 1μM에 노출된 신경아교세포로부터의 TNF-α 방출. 본 발명의 조직 보호 사이토카인으로 치료함에 의해서도 유사한 결과가 예상된다.
본 발명은 본 발명의 개별 양태의 일례로서 기재된 특정 실시태양에 의해 그 범위가 한정되지 않으며, 기능적으로 동등한 방법 및 성분은 본 발명의 영역에 속한다. 실제로, 당해 분야의 숙련자는 상기 상세한 설명 및 첨부 도면으로부터 본원에 기재되고 도시된 것에 덧붙여 본 발명을 다양하게 변형시킬 수 있음을 명확히 알 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구의 범위의 영역에 속한다.
본원에 인용된 모든 참조문헌은 본원에 참고로 인용되어 있다.
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Claims (52)

  1. 치료 효과량의 조직 보호 사이토카인; 하나 이상의 소염제; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    소염제가 코르티코스테로이드, 글루코코르티코이드, 스테로이드, 비-스테로이드성 소염제, 베타-작용제, 항콜린제, 메틸 잔틴, 금 주입물, 설파살라진, 페니실라민, 항-혈관형성제, 답손, 소랄렌, 항-말라리아제, 항바이러스제 및 항생제로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학 조성물.
  3. 치료 효과량의 조직 보호 사이토카인; 하나 이상의 면역조절제; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    소염제가 메토트렉세이트, 레플루노마이드, 사이클로포스파마이드, 사이톡산, 이뮤란, 사이클로스포린 A, 미노사이클린, 아자티오프린, 항생제, 메틸프레드니솔론, 코르티코스테로이드, 스테로이드, 마이코페놀레이트 모페틸, 라파마이신, 미조리빈, 데옥시스퍼구알린, 브레퀴나르, 말로노니트릴로아민데스, T 세포 수용체 조절제 및 사이토카인 수용체 조절제로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학 조성물.
  5. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 조직 보호 사이토카인이 i) 시알산 잔기를 갖지 않는 에리트로포이에틴; ii) N-결합된 탄수화물 또는 O-결합된 탄수화물을 갖지 않는 에리트로포이에틴; iii) 하나 이상의 글라이코시다제로 천연 에리트로포이에틴을 처리함으로써 탄수화물 함량이 감소된 에리트로포이에틴; iv) 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴; v) 화학적으로 환원되는 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴; vi) 하나 이상의 개질된 아르기닌 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; vii) 하나 이상의 개질된 리신 잔기를 갖거나 또는 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기가 개질된 에리트로포이에틴; viii) 하나 이상의 개질된 티로신 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; ix) 하나 이상의 개질된 아스파트산 또는 글루탐산 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; x) 하나 이상의 개질된 트립토판 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; xi) 하나 이상의 아미노기가 제거된 에리트로포이에틴; xii) 에리트로포이에틴 분자의 하나 이상의 시스틴 결합이 결손된 에리트로포이에틴; 및 xiii) 말단 절단된(truncated) 에리트로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학 조성물.
  6. 치료 효과량의 조직 보호 사이토카인 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 포유동물에게 투여함을 포함하는, 응답 세포, 조직 및/또는 기관을 포함하는 포유동물의 염증을 치료하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    조직 보호 사이토카인이 증가되는 적혈구용적율, 혈관 수축, 혈소판의 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 갖지 않는 방법.
  8. 예방 또는 치료 효과량의 조직 보호 사이토카인 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 염증 치료가 필요한 포유동물에게 투여하고, 예방 또는 치료 효과량의 하나 이상의 소염제 또는 면역조절제를 상기 포유동물에게 투여함을 포함하는, 응답 세포, 조직 및/또는 기관을 포함하는 포유동물의 염증을 치료하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    소염제가 코르티코스테로이드, 글루코코르티코이드, 스테로이드, 비-스테로이드성 소염제, 베타-작용제, 항콜린제, 메틸 잔틴, 금 주입물, 설파살라진, 페니실라민, 항-혈관형성제, 답손, 소랄렌, 항-말라리아제, 항바이러스제 및 항생제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    면역조절제가 단백질 제제, 펩타이드 의사 화합물, 항체, 핵산 분자, 소분자(small molecule), 유기 화합물, 무기 화합물, 메토트렉세이트, 레플루노마이드, 사이클로포스파마이드, 사이톡산, 이뮤란, 사이클로스포린 A, 미노사이클린, 아자티오프린, 항생제, 메틸프레드니솔론(MP), 코르티코스테로이드, 스테로이드, 마이코페놀레이트 모페틸, 라파마이신, 미조리빈, 데옥시스퍼구알린, 브레퀴나르, 말로노니트릴로아민데, T 세포 수용체 조절제 및 사이토카인 수용체 조절제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  11. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 조직 보호 사이토카인이 i) 시알산 잔기를 갖지 않는 에리트로포이에틴; ii) N-결합된 탄수화물 또는 O-결합된 탄수화물을 갖지 않는 에리트로포이에틴; iii) 하나 이상의 글라이코시다제로 천연 에리트로포이에틴을 처리함으로써 탄수화물 함량이 감소된 에리트로포이에틴; iv) 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴; v) 화학적으로 환원되는 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴; vi) 하나 이상의 개질된 아르기닌 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; vii) 하나 이상의 개질된 리신 잔기를 갖거나 또는 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기가 개질된 에리트로포이에틴; viii) 하나 이상의 개질된 티로신 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; ix) 하나 이상의 개질된 아스파트산 또는 글루탐산 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; x) 하나 이상의 개질된 트립토판 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; xi) 하나 이상의 아미노기가 제거된 에리트로포이에틴; xii) 에리트로포이에틴 분자의 하나 이상의 시스틴 결합이 결손된 에리트로포이에틴; 및 xiii) 말단 절단된 에리트로포이에틴인 방법.
  12. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 조직 보호 사이토카인이 무-시알산 에리트로포이에틴 또는 페닐글라이옥살-에리트로포이에틴인 방법.
  13. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    조직 보호 사이토카인이 내피 세포 장벽을 횡단할 수 있는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    내피 세포 장벽이 혈액-뇌 장벽, 혈액-눈 장벽, 혈액-고환 장벽, 혈액-난소 장벽 및 혈액-자궁 장벽으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  15. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    포유동물의 응답 세포, 조직 및/또는 기관이 신경 세포, 근육 세포, 심장, 폐, 간, 신장, 소장, 부신피질, 부신수질, 모세혈관 세포, 내피 세포, 고환, 난소, 자궁내막 세포 및 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  16. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    응답 포유동물 세포가 광수용체 세포, 신경절 세포, 양극 세포, 수평 세포, 무축삭 세포, 뮐러(Mueller) 세포, 심근 세포, 박동 조율 세포, 굴심방결절 세포, 굴 결절 세포, 방실결절 세포, 방실 다발 세포, 간세포, 별세포, 쿠퍼(Kupffer) 세포, 혈관사이 세포, 술잔 세포, 창자샘 세포, 소화관 내분비 세포, 사구체 세포, 다발 세포, 그물 세포, 크롬 친화 세포, 혈관주위세포, 레이디히(Leydig) 세포, 서톨리(Sertoli) 세포, 정자 세포, 그라피안(Graffian) 난포 세포, 원시 난포 세포, 자궁내막 버팀질 세포 및 자궁내막 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 조직 보호 사이토카인이 무-시알산 에리트로포이에틴인 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 무-시알산 에리트로포이에틴이 인간의 무-시알산 에리트로포이에틴인 방법.
  19. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 조직 보호 사이토카인이 N-결합된 탄수화물을 갖지 않는 에리트로포이에틴인 방법.
  20. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 조직 보호 사이토카인이 O-결합된 탄수화물을 갖지 않는 에리트로포이에틴인 방법.
  21. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 조직 보호 사이토카인이 하나 이상의 글라이코시다제로 처리된 에리트로포이에틴인 방법.
  22. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 조직 보호 사이토카인이 퍼아이오데이트(periodate)-산화된 에리트로포이에틴인 방법.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 퍼아이오데이트-산화된 에리트로포이에틴이 소듐 사이아노보로하이드라이드로 화학적으로 환원되는 방법.
  24. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 조직 보호 사이토카인이 하나 이상의 아르기닌 잔기 상에 R-글라이옥살 잔기(여기에서, R은 아릴 또는 알킬 잔기임)를 포함하는 에리트로포이에틴인 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 에리트로포이에틴이 페닐글라이옥살-에리트로포이에틴인 방법.
  26. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 조직 보호 사이토카인이, 하나 이상의 아르기닌 잔기가 2,3-뷰테인다이온 및 사이클로헥세인다이온으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인접 다이케톤과의 반응에 의해 개질된 에리트로포이에틴인 방법.
  27. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 조직 보호 사이토카인이, 하나 이상의 아르기닌 잔기가 3-데옥시글루코손과 반응된 에리트로포이에틴인 방법.
  28. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 조직 보호 사이토카인이 하나 이상의 바이오틴일화된 리신 또는 N-말단 아미노기를 포함하는 에리트로포이에틴 분자인 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 에리트로포이에틴 분자가 바이오틴일화된 에리트로포이에틴인 방법.
  30. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 조직 보호 사이토카인이 글루시톨릴 리신 에리트로포이에틴 또는 프럭토실 리신 에리트로포이에틴인 방법.
  31. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 조직 보호 사이토카인이 하나 이상의 카밤일화된 리신 잔기를 갖는 에리트로포이에틴인 방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    상기 카밤일화된 에리트로포이에틴이 알파-N-카밤오일에리트로포이에틴; N-엡실론-카밤오일에리트로포이에틴; 알파-N-카밤오일, N-엡실론-카밤오일에리트로포이에틴; 알파-N-카밤오일아시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-카밤오일아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-카밤오일, N-엡실론-카밤오일아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-카밤오일하이포(hypo)시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-카밤오일하이포시알로에리트로포이에틴; 및 알파-N-카밤오일, N-엡실론-카밤오일하이포시알로에리트로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  33. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 조직 보호 사이토카인이, 하나 이상의 리신 잔기가 아실화된 에리트로포이에틴인 방법.
  34. 제 33 항에 있어서,
    상기 에리트로포이에틴의 리신 잔기가 아세틸화된 방법.
  35. 제 34 항에 있어서,
    상기 아세틸화된 에리트로포이에틴이 알파-N-아세틸에리트로포이에틴; N-엡실론-아세틸에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸, N-엡실론-아세틸에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸아시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-아세틸아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸, N-엡실론-아세틸아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-아세틸하이포시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-아세틸하이포시알로에리트로포이에틴; 및 알파-N-아세틸, N-엡실론-아세틸하이포시알로에리트로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  36. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 조직 보호 사이토카인이 석신일화된 리신 잔기를 포함하는 에리트로포이에틴인 방법.
  37. 제 36 항에 있어서,
    상기 에리트로포이에틴이 알파-N-석신일에리트로포이에틴; N-엡실론-석신일에리트로포이에틴; 알파-N-석신일, N-엡실론-석신일에리트로포이에틴; 알파-N-석신일아시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-석신일아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-석신일, N-엡실론-석신일아시알로에리트로포이에틴; 알파-N-석신일하이포시알로에리트로포이에틴; N-엡실론-석신일하이포시알로에리트로포이에틴; 및 알파-N-석신일, N-엡실론-석신일하이포시알로에리트로포이에틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  38. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 조직 보호 사이토카인이 2,4,6-트라이나이트로벤젠설폰산 염에 의해 개질된 하나 이상의 리신 잔기를 갖는 에리트로포이에틴인 방법.
  39. 제 38 항에 있어서,
    상기 염이 2,4,6-트라이나이트로벤젠설폰에이트 소듐인 방법.
  40. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 조직 보호 사이토카인이, 하나 이상의 티로신 잔기가 질화 및/또는 요오드화된 에리트로포이에틴인 방법.
  41. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 조직 보호 사이토카인이, 아스파트산 및/또는 글루탐산 잔기가 카보다이이미드와 반응된 후 아민과 반응된 에리트로포이에틴인 방법.
  42. 제 41 항에 있어서,
    상기 아민이 글라이신아마이드인 방법.
  43. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    염증이 질환 상태 또는 외상으로부터 야기되는 방법.
  44. 제 43 항에 있어서,
    외상이 관염, 만성 기관지염, 췌장염, 골수염, 류마티스성 관절염, 사구체신염, 시신경염, 관자동맥염, 뇌염, 수막염, 횡단 척수염, 피부근육염, 다발근육염, 괴사 근막염, 간염 및 괴사 신장결장염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  45. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    조직 보호 사이토카인이 신경아교세포에 의해 생성된 사이토카인으로부터 야기되는 염증을 억제하는 방법.
  46. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서,
    염증이 세포자멸사에 의해 촉발되는 방법.
  47. 응답 세포, 조직 및/또는 기관을 포함하는 포유동물에서 염증을 치료하는 약학 조성물을 제조하기 위한, 조직 보호 사이토카인의 용도.
  48. 제 47 항에 있어서,
    조직 보호 사이토카인이 증가되는 적혈구용적율, 혈관 수축, 혈소판 과활성화, 전응고 활성 및 증가되는 혈소판 생성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 갖지 않는 용도.
  49. 제 47 항에 있어서,
    염증이 질환 상태 또는 외상으로부터 야기되는 용도.
  50. 제 49 항에 있어서,
    외상이 발작 질환, 다발성 경화증, 중풍, 저혈압, 심장정지, 허혈, 심근 경색, 연령-관련 인지 기능 상실, 방사선 손상, 뇌성마비, 신경변성 질환, 알쯔하이머(Alzheimer's)병, 파킨슨(Parkinson's)병, 레이(Leigh's)병, AIDS 치매, 기억 상실, 근위축성 측삭 경화증, 알콜 중독, 기분 장애, 불안 장애, 주의력 결핍 장애, 자폐증, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병, 뇌 외상, 척수 외상, 대뇌 허혈, 척수 허혈, 심폐회로술, 만성 심장 부전, 황반 변성, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 망막병증, 녹내장, 망막 허혈 또는 망막 외상에 의해 야기되는 용도.
  51. 치료 효과량의 조직 보호 사이토카인; 하나 이상의 소염제 또는 면역조절제; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 응답 세포, 조직 및/또는 기관을 포함하는 포유동물에서 염증을 치료하는 약학 조성물을 제조하기 위한, 조직 보호 사이토카인의 용도.
  52. 제 47 항에 있어서,
    상기 조직 보호 사이토카인이 i) 시알산 잔기를 갖지 않는 에리트로포이에틴; ii) N-결합된 탄수화물 또는 O-결합된 탄수화물을 갖지 않는 에리트로포이에틴; iii) 하나 이상의 글라이코시다제로 천연 에리트로포이에틴을 처리함으로써 탄수화물 함량이 감소된 에리트로포이에틴; iv) 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴; v) 화학적으로 환원되는 하나 이상의 산화된 탄수화물을 갖는 에리트로포이에틴; vi) 하나 이상의 개질된 아르기닌 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; vii) 하나 이상의 개질된 리신 잔기를 갖거나 또는 에리트로포이에틴 분자의 N-말단 아미노기가 개질된 에리트로포이에틴; viii) 하나 이상의 개질된 티로신 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; ix) 하나 이상의 개질된 아스파트산 또는 글루탐산 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; x) 하나 이상의 개질된 트립토판 잔기를 갖는 에리트로포이에틴; xi) 하나 이상의 아미노기가 제거된 에리트로포이에틴; xii) 에리트로포이에틴 분자의 하나 이상의 시스틴 결합이 결손된 에리트로포이에틴; 및 xiii) 말단 절단된 에리트로포이에틴인 용도.
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