KR20050021264A - 배양 조직의 보존방법 - Google Patents

배양 조직의 보존방법 Download PDF

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가또마사까즈
후꾸시마리까
이노이에마스까즈
니나가와요시히데
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가부시키가이샤 재팬 티슈 엔지니어링
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Abstract

(과제) 장기간에 걸쳐 배양 조직을 보존할 수 있는 데다, 배양 조직의 사용시에 세정조작을 배제할 수 있는 배양 조직의 보존방법을 제공한다.
(해결수단) 연골세포를 배양하여 얻어진 배양 연골 조직을, 동결보호재, 광물유래 미립상물, pH 판정시약 등의 비허용성 성분을 함유하지 않은 등장염류용액, 예컨대 인산 완충액, 링겔계 보존액 또는 생리식염수를 사용하여, 2 ~ 25℃ 에서 10일간에 걸친 수송기간에 걸쳐 보존한다.

Description

배양 조직의 보존방법{A METHOD OF PRESERVING CULTURE TISSUE}
본 발명은 배양 조직의 보존방법에 관한 것으로, 특히 세포를 배양함으로써 얻어지는 배양 조직의 보존방법에 관한 것이다.
최근, 세포를 인비트로 (생체외) 배양함으로써 배양 조직이 얻어지고 있다. 이와 같은 배양 조직은 환자의 결손부를 보전하기 위한 이식용 조직이나, 약제나 화장품의 효능을 조사하기 위한 시험용 조직으로서 이용될 수 있다.
종래 이들의 배양 조직은, 이식용 또는 시험용으로서 사용이 예정되어 있는 시설내에서 제작되었으나, 최근에는 외부 위탁 등에 의해 시설외에서 제작한 배양 조직을 이용하는 기회가 증가하고 있다. 시설외에서 제작된 배양 조직은, 사용시설까지의 거리와 시간이라는 과제를 그 품질을 유지한 상태에서 해결하지 않으면 안된다. 이 때문에 수송시에 배양 조직을 조금이라도 양호한 상태로 유지하기 위한 수단이 연구되고 있다.
예컨대 특허문헌 1 에서는, 동결보호제가 첨가된 보존액에, 배양 조직을 침지하여 동결 보존하는 기술이 개시되어 있다. 특허문헌 2 에서는 배양 상피 세포 시트를 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium : 덜베코 변법 이글 배지) 에 침지한 상태에서 8 ~ 19℃ 로 저온 보존하는 기술이 개시되어 있다. 또 특허문헌 3 에서는 항균성 제올라이트를 첨가한 생리식염수로 구성되는 장기보존액으로 장기를 냉장 보존하는 것이 기재되어 있다.
[특허문헌 1] 일본 특허공표공보 평09-505032호
[특허문헌 2] 특허 2693640호 공보
[특허문헌 3] 일본 공개특허공보 평02-129101호
그러나 디메틸술폭사이드 (DMSO) 등의 동결보호제를 함유하는 보존액이나 항균성 제올라이트 등의 미립상물 등을 함유하는 보존액, 그리고 페놀레드 등의 pH 판정시약을 함유하는 DMEM 등의 배지를 기초로 한 보존액은, 인체에 대한 직접적인 영향이 명확한 성분은 아니기 때문에, 높은 안전성 담보의 관점에서 사용시에 세정조작이 필요하다. 특히 배양 조직을 이식용 조직으로 사용하는 경우에는, 보다 높은 안전성을 담보하기 위해 충분히 세정하지 않으면 안된다. 이 때문에 이들 보존액의 구성에서는, 사용시의 세정공정과 같은 번거로움이 있어, 기술자 또는 작업자에게 부담이 되었다.
한편 장기이식 등에 있어서, 장기를 수송할 때에 사용되는 장기보존액이 알려져 있으나, 생체로부터 적출 또는 채취한 『장기 (organ)』는 인비트로 (in vitro) 로 세포 배양하여 얻어진 『배양 조직 (cultured tissue)』과는 세포나 세포외 매트릭스 (ECM) 등의 구성이 완전하게는 일치하지 않고, 그 특성도 반드시 일치하지 않기 때문에, 여러 장기보존액이, 그대로 배양 조직의 보존에 바람직하다고는 일률적으로 말할 수 없다. 또한 장기보존액에도 여러 성분이 함유되기 때문에 이식시에는 세정이 실행되고 있다.
본 발명은 상기 종래기술을 감안하여, 수송기간 등의 소정 기간에 걸쳐 배양 조직을 보존하는 것이 가능한 데다, 배양 조직의 사용시에서의 세정조작을 배제할 수 있는 배양 조직의 보존방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명의 배양 조직의 보존방법은 세포를 배양하여 얻어지는 배양 조직의 보존방법에 있어서, 상기 배양 조직을 배양 후에, 비허용성 성분을 함유하지 않은 등장염류 용액 (BSS : Balanced Salt Solution) 중에서 또한 소정 온도에서 보존하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서의 상기 등장염류 용액은, 완충액 또는 수액제(輸液劑)인 것이 바람직하다. 또한 상기 완충액은 인산 완충액이 바람직하고, 상기 수액제는 생리적 염류용액이 바람직하며, 또한 링겔계 보존액 또는 생리식염수인 것이 바람직하다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명의 배양 조직의 보존방법은, 세포를 배양하여 얻어지는 배양 조직을 배양 후에, 비허용성 성분을 함유하지 않은 등장염류 용액 중에서 또한 소정 온도로 보존하는 것이다. 통상 이들 용액은, 체액보급을 위한 수액제로서, 혹은 세포의 분산이나 세포, 조직, 장기의 세정 등에 각각 선택적으로 이용되고 있으나, 본 발명자들은 이들 용액이 지금까지 사용되지 않았던 배양 조직의 보존이라는 용도에서도 유효한 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.
본 발명에서 「보존」이란 생체내와 유사한 환경하에서 세포를 증식시키는 「배양」과는 달리, 수송기간이나 사용시까지의 일정 기간을 경과한 배양 조직이, 이 수송 및/또는 보존기간 후에 다시 「배양」또는 이식가능한 상태를 유지할 수 있도록 생세포가 유지되고, 소정 기간에 걸쳐 배양 조직을 유지하는 것을 의미한다. 또한 본 발명에서의 「보존」은, 장기 보존이 가능한 동결보존에 대해, 비교적 단기간에 상당하는 수송기간 (예컨대 수 시간에서 수 일간 정도) 등의 보존을 의미하고, 동결보호제가 필요하게 되는 동결상태에서의 수송 또는 보존 혹은, 처리액의 반응ㆍ세정과 같은 수 분 ~ 수 십분 등과 같은 매우 짧은 시간의 유지상태는 포함되지 않는다.
본 발명에서 등장염류 용액이란, 액체에 대해 거의 등장이고, 또한 무기염류를 주성분으로 하는 용액을 의미한다. 여기에서 「체액에 대해 거의 등장」이란 체액에 대해 1.5 ~ 0.8 의 침투압비를 갖는 것을 말한다. 침투압비는 바람직하게는 체액에 대해 0.9 ~ 1.1 이고, 보존대상이 되는 배양 조직의 종류에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 또한 체액은 세포외액 및 세포내액으로 분류되고, 양자의 조성은 주요한 양이온 성분이 다르다는 특징을 갖고, 세포 외액이 고 나트륨 (Na), 저 칼륨 (K) 이고, 세포내액이 저 나트륨 (Na), 고 칼륨 (K) 으로 되어 있다. 이에 대해 본 발명에서의 등장염류 용액은, 양이온 성분으로서 칼륨이온보다도 나트륨이온을 많이 함유하는 세포외액계 (고 Na, 저 K) 의 조직인 것이 바람직하다.
또 본 발명에서 등장염류 용액은 비허용성 성분을 함유하지 않는다. 이와 같은 비허용성 성분이란, 동물 유래의 혈청이나 단백질 등의 비인간 동물 유래 성분, 또는 인간 유래 성분이더라도 거절반응을 유발할 가능성이 있는 성분, 특히 과민성 쇼크의 가능성을 부정할 수 없는 젤라틴 등의 성분, 혹은 식물이나 광물 유래이고, 또한 생체에 대량으로 적용했을 때에 세포 또는 조직기능의 대폭적인 저하 등을 일으킬 가능성이 있는 성분, 그리고 인체로의 적용한도를 크게 초과한 양의 약물 등을 말하는 것으로, 예컨대 소 태아 혈청 (FBS), 동결보호제, 광물 유래 미립상물, pH 판정시약 등이 포함된다. 단, 의약품으로서 체내로의 섭취가 인정된 성분은 안전성이 담보되어 있기 때문에 함유되어도 된다. 이들 비허용성 성분, 특히 FBS 등은 배양 조직의 배지로서 사용되는 경우도 있으나, 자기 유래 성분과 달리, 생체내에 장기간 또는 고농도로 존재하는 것에 의한 리스크를 감안하면, 통상 생체로의 적용 전에 세정하여 배제되는 성분이다. 비허용성 성분을 함유하는 용액으로는 혈청성분 첨가 액체 배지, 혈청성분 첨가 장기보존액, 추출 단백질 (예컨대 알부민, 글로불린 등) 함유 배지 등을 들 수 있고, 이들은 본 발명에 관련되는 등장염류 용액에는 해당되지 않는다. 단, 이식 대상 자체에서 유래하는 성분은, 안전성을 이유로 배제될 필요는 없고, 따라서 본 발명에 관련된 등장염류 용액에 함유되어 있어도 된다.
등장염류 용액으로는 완충액이나 수액제 등을 들 수 있다.
수액제는 체액보급, 전해질 밸런스의 보정, 영양보급 등을 목적으로 비경구로 투여되는 전해질 수액이나 영양 수액으로, 통상 전해질 수액 등으로서 체액의 대체나 보전 등에 사용되고 있다.
또 수액제로는 무기염류를 주체로 하는 생리적 염류 용액인 것이 바람직하고, 글루코스 등도 첨가될 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 생리적 염류 용액으로는 생리식염수, 링겔액, 로크액, 아르액, 한크스액(Hanks' solution), 타이로드액 등을 들 수 있고, 이들 생리적 염류 용액은 종래, 전해질 수액을 위한 수액제로서 이용가능하게 되어 있다.
한편 본 발명에 사용 가능한 완충액은, 세포의 분산이나, 세포, 조직, 장기의 세정, 배지의 침투압이나 pH 의 조정 등에 이용될 수 있는 것이면 되고, 인산 완충액, 탄산 완충액 등을 들 수 있다. 또한 탄산 완충액에는 화학적으로 정의될 수 있는 화합물만으로 구성되는 기초적 배지도 포함된다. 이 기초적 배지는, 종래 세포증식을 예상할 수 없기 때문에, 단독으로 배양이나 보존에 사용되는 일은 없고, 혈청이나 단백질, 성장인자 (growth factor) 등의, 본 발명에서의 비허용성 물질을 첨가한 것이 증식용 배지로서 이용되고 있으나, 본 발명에서는 이와 같은 비허용성 물질을 함유하지 않은 상태에서 사용된다.
이 중에서도 본 발명에서는 완충액으로서는 인산 완충액이 바람직하고, 수액제로서는 생리적 염류 용액, 특히 링겔계 보존액 또는 생리식염수 중 어느 하나인 것이 바람직하다.
본 발명에서의 링겔계 보존액이란, 일반적으로 전해질 수액으로서 사용되는 링겔액, 락트산 링겔액, 아세트산 링겔액으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나를 기초로 하는 것이 바람직하다. 여기에서 「기초로 하는」이란 이들 링겔액 등에 각종 첨가성분을 첨가해도 되는 것을 의미하고, 이들 링겔액 등이 80% 이상인 것이 바람직하고, 90% 이상인 것이 더욱 바람직하며, 95% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 100% 인 것이 더욱 바람직하다. 따라서 이들 링겔계 보존액에 당류, 비타민 또는 아미노산이 첨가되어 있어도 된다. 당류로서는 글루코스 (포도당), 소르비톨, 트레할로스, 말토오스, 프룩토오스, 자일리톨 등을 들 수 있다, 비타민으로는 아스코르브산 등을 들 수 있다.
이들의 링겔계 보존액은, 수액제로서 통상 사용되고 있는 것을 그대로 적용할 수 있다. 각 수액제의 조성은 당업자에게 널러 알려져 있다. 예컨대 링겔액에서는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘으로 구성되고, 염소로서 0.53 ~ 0.58w/v% 및 염화칼슘 (CaCl2ㆍ2H2O) 으로서 0.030 ~ 0.036w/v%, pH5.0 ~ 7.5 로 되어 있다. 또 각종 수액제는 아스테마린 (등록상표 : 비브라운 모범약품사 제조), KN 보액 (오오츠카제약사 제조), 데노사린 (등록상표 : 테루모사 제조), 소르뎀 (등록상표 : 테루모사 제조), 소르리타 (등록상표 : 시미즈 제약사 제조), 아크티토 (등록상표 : 닛켄화학사 제조), 리플라스 (등록상표 : 후소약품공업사 제조), 쿄라이트 (등록상표 : 쿄린 제약사 제조), 프룩토라이트 (등록상표 : 오오츠카 제약사 제조), 소르락트 (등록상표 : 테루모사 제조), 니소리 (등록상표 : 비브라운 모범약품사 제조), 라크텍 (등록상표 : 오오츠카 제약사 제조) 등의 제품명으로 제공되고 있기 때문에, 목적으로 하는 배양 조직과의 적합성을 감안하여 선택적으로 결정하는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용되는 완충액으로는 여러가지 알려져 있는 것을 그대로 적용할 수 있고, 예컨대 인산 완충액은 염화칼륨이나 인산칼륨 등을 함유하고, pH7.0 ~ 7.2 로 사용되고 있는 것을 들 수 있고, 시그마사나 라이프테크놀로지사 등의 여러 회사에서 시판되고 있다. 또 생리식염수는 당업계에서 널리 알려진 액체로서, 염화나트륨 0.85 ~ 0.9g/100㎖ 물, pH4.5 ~ 8.0, 바람직하게는 pH6.0 ~ 8.0 인 것을 말한다.
이들 보존액에는, 필요에 따라 사용시에 세정을 필요로 하지 않는 다른 성분을 함유할 수 있다. 이와 같은 성분으로는 항생물질, 당류, 비타민, 아미노산 등을 들 수 있다. 또한 이들의 보존액에 세포외 매트릭스 (ECM) 를 첨가해도 되고, 특히 배양 조직을 구성하는 세포가 생산되는 세포외 매트릭스가 첨가되는 것이 바람직하다. 이와 같은 세포외 매트릭스로서는 글루코사미노글리칸 (GAG) 이나 콜라겐, 히알루론산 등을 들 수 있다.
각종 성분의 첨가량은, 보존하는 배양 조직의 상태에 따라 적절하게 선정하면 된다. 여기에서 말하는 배양 조직의 상태는, 세포종, 세포 밀도, 세포외 기질의 생산량 등을 들 수 있다. 아미노산, 비타민 및 당류의 첨가량에 관해서는, 보존액의 침투압이 거의 등장이 되도록 컨트롤하는 것이 중요하다. 실제로 첨가하는 양은 당업자이면 용이하게 결정할 수 있다.
또한 이들 보존액 중의 어느 것을 선택할지는 보존온도, 배양 조직의 종류에 따라 적절하게 선택된다. 예컨대 배양 연골 조직에는 링겔계 보존액이 보다 바람직하고, 배양 표피 조직에는 비타민 및 아미노산을 첨가한 링겔액이 보다 바람직하다.
또 본 발명의 보존기간에서의 온도, 즉 소정 온도는 세포가 증식할수록 높은 온도가 아니라, 또한 세포가 동결되지 않는 온도를 말한다. 즉 배양온도보다도 낮은 온도이고, 세포가 저활성인 상태로 된다. 바람직하게는 2℃ 이상, 보다 바람직하게는 4℃ 이상, 더욱 바람직하게는 8℃ 이상이고, 바람직하게는 25℃ 이하, 보다 바람직하게는 18℃ 이하, 더욱 바람직하게는 13℃ 이하이다. 이 범위내에서는 배양 조직을 비교적 긴 시간 동안, 양호하게 보존할 수 있다. 또 보존액이나 배양 조직의 종류에 따라 적절하게 보존온도를 변경할 수 있다. 예컨대 배양 연골의 경우, 인산 완충 보존액이면 4℃ ~ 25℃ 로 할 수 있고, 링겔계 보존액이면 2℃ ~ 18℃ 로 하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 적용가능한 배양 조직은 세포를 배양함으로써 구성된 배양 조직이면 어떠한 것이어도 적용할 수 있다. 표피세포, 상피세포, 내피세포, 선유아(線維芽)세포, 연골세포, 골아(骨芽)세포, 근세포, 지방세포, 간세포, 평활근세포, 신경세포, 췌장β세포, 또는 이들 세포의 전구세포, 간엽계(間葉系) 간세포, 배성간(胚性幹)세포 등을 들 수 있다.
배양세포는 배양 중에 세포의 증식이나 이식환경에 대한 적합성 등에 관여하는 세포외 매트릭스 (ECM : Extra Cellar Matrix) 를 생성한다. 이 세포외 매트릭스는, 배양 조직의 특성을 본래의 조직 상태에 근접시키기 때문에 중요하다. 본 발명의 보존액은, 배양처리 중에 생성된 세포외 매트릭스가 개개의 세포를 둘러싸듯이 위치한 상태의 배양 조직에서 효과가 높고, 특히 세포외 매트릭스의 생산능이 높은 세포를 배양하여 얻어지는 배양 조직에 대해 특히 효과가 높기 때문에, 이와 같은 세포, 예컨대 연골세포, 골아세포, 선유아세포, 각막 실질 세포, 간 실질 세포 등의 간질세포에 의한 배양 조직의 보존에 대해 사용되는 것이 특히 바람직하다.
예컨대 연골세포는, 생체내 또는 배양 조건하에서, 콘드로이틴 황산, 히알루론산, 케라탄황산 등의 글리코사미노글리칸이나 프로테오글리칸, 타입 II 콜라겐 등의 세포외 매트릭스를 생산한다. 세포외 매트릭스의 유무 및 양은, 예컨대 고속액체 크로마토그래피 (HPLC), RT-PCR 법 등을 통상적인 방법에 의해 측정할 수 있다.
세포의 배양에 사용되는 액체 배지 및 세포 파종 밀도는, 세포의 종류에 따라 통상 사용되고 있는 액체 배지 및 파종 밀도를 그대로 적용할 수 있다. 예컨대 연골세포의 경우에는, 덜베코 변법 이글 배지 (DMEM), 함 F-12 (HAM F-12) 등의 배지에 소 태아 혈청 (FBS) 이나 항생물질, 성장인자 (Growth Factor) 등이 첨가된 것이 사용된다. 단, 본 발명에 의한 보존방법을 행하기 전에, 본 발명에 관련되는 보존액 등으로 세정하여, 배지에 함유되는 비허용성 성분을 배양 조직에서 씻어 두는 것이 바람직하다.
배양 조직의 형태는, 스페로이드 (응집 덩어리) 나 세포 시트 등, 세포만으로 구성되어도 되고, 다공질체 (스펀지 형상) 나 겔형상의 스캐폴드 (기초체 또는 담체) 에 세포를 유지시켜 구성해도 된다. 이 어느 경우에서도 배양처리시에 생산되는 세포외 매트릭스 (ECM) 가 함유되어 있는 것이 바람직하다.
특히 연골세포와 같은 단층 배양에 의해 탈분화되는 세포의 경우에는, 겔형상의 스캐폴드에 둘러싸거나, 다공체 (스폰지형상) 의 스캐폴드에 파종하는 것에 의한 3차원 배양에 제공되는 것이, 세포가 탈분화되지 않고, 세포형태를 유지할 수 있기 때문에 바람직하다. 이와 같은 스캐폴드로서는 콜라겐, 히알루론산 등의 세포외 매트릭스나, 알긴산, 폴리락트산, 폴리글리콜락트산, 폴리로탁산 등의 생체 적합성 재료가 바람직하고, 특히 콜라겐인 것이 바람직하다.
콜라겐은 세포 증식의 기초체로서 인체에 안전한 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 예컨대 소 등의 피부로부터 얻어지는 I형 콜라겐이나 돼지, 닭 유래의 콜라겐을 들 수 있다. 또한 콜라겐 말단의 테로펩티드를 절단한 아테로콜라겐을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 이들 콜라겐은 어느 것이나 고순도의 제품을 입수할 수 있다.
본 발명에서의 배양 조직 제작시의 세포 파종 밀도, 배양온도, 사용하는 배양 용기 등의 배양조건은, 배양 대상이 되는 세포의 배양에서 통상 실행되는 배양조건이 그대로 적용된다.
배양후의 보존은, 배양액을 거의 완전히 제거한 후에, 본 발명에 관련되는 보존액을 충전한 용기 내에 배양 조직을 배치하는 것, 혹은 배양 조직이 배치된 용기 내에 보존액을 충전함으로써 실행된다. 여기에서 배양 조직의 보존은, 배양 조직이 용기에 접착된 채의 상태에서 이루어져도 되고, 보존액 중에서 부유된 상태에서 이루어져도 된다. 이 보존에 사용되는 용기에는, 배양 조직의 보존에 적합한 형태의 어느 것이나 사용할 수 있고, 통상 배양에 사용되는 배양용기가 그대로 사용된다. 또한 보존액은 적어도 배양 조직이 침지되는 양을 충전하는 것이 바람직하고, 예정하는 보존기간이나 배양 조직의 크기에 따라 적절하게 결정하면 된다.
또 제작되는 배양 조직의 상태는 세포종, 세포의 상태 (세포 밀도나 세포외 매트릭스의 생산량 등), 후술하는 보존온도, 예정하는 보존기간의 길이 및 사용 용도 등에 따라 적절하게 선택되고, 당업자는 용이하게 설정할 수 있다.
보존시에서의 보존온도는 전술한 소정 온도로 조정되어 유지된다. 이 보존온도의 조정은 전기적 혹은 화학적 등, 온도 유지로서 주지된 수단의 어느 것이나 사용할 수 있다. 예컨대 소정의 보존온도 범위로 설정ㆍ유지 가능한 항온기나 보온기 등을 들 수 있다. 이와 같은 항온기 (보온기) 중에서는, 배양 조직은 보존액을 채운 용기 내에서 보존된다. 여기에서 말하는 항온기 (보온기) 는 특정 온도를 일정하게 유지할 수 있을 뿐만 아니라, 수송 또는 보존 기간 동안만 온도를 소정 범위에서 유지할 수 있는 것이면 된다.
본 발명에 있어서 보존은, 배양 조직의 수송형태를 겸한 항온기에서 실행되는 것이 바람직하다. 본 발명에서 적용 가능한 수송형태에는, 배양 조직을 수송한 후에 배양 또는 이식 등에 사용 가능한 상태가 되도록 수송하는 모든 형태가 포함된다. 특히 상술한 보존온도를 수송기간에 걸쳐 안정되게 유지 가능한 항온기를 사용한 수송형태가 바람직하다. 이와 같은 항온기로는 내부에 서머스탯을 사용한 온도조절기구를 갖는 수송기를 들 수 있다.
또 내부에 축온재를 구비한 단열수송기를 사용하는 것이 바람직하다. 예컨대 축온재가 융점 t℃ 의 내용물을 갖고 있는 경우, 외부 기온이 t℃ 이상일 때에 축온재로 둘러쌓인 내부온도를 t℃ 로 유지하기 위해서는, 그 내용물이 고화된 축온재를 사용하면 된다. 이렇게 하면, 내용물이 전부 액화될 때까지의 기간 중, 내부온도는 t℃로 유지된다. 한편 외부 기온이 t℃ 이하일 때에 축온재로 둘러쌓인 내부온도를 t℃ 로 유지하기 위해서는, 그 내용물이 액화된 축온재를 사용하면 된다. 이렇게 하면, 내용물이 전부 고화될 때까지의 기간 중, 내부온도는 t℃ 로 유지할 수 있다. 또한 상이한 융점을 갖는 복수 종의 축온재를 병용하면, 각각의 융점에 의한 온도조절이 가능해진다.
본 발명에 의하면, 배양 조직을 적어도 2 일 이상, 바람직하게는 4 일, 더욱 바람직하게는 7 일 이상에 걸쳐 배양 조직을 보존할 수 있다. 이 때문에 배양 조직을 먼 곳으로 수송하는 경우라도 출하부터 도착까지의 수송기간 중에는 양호한 상태로 보존된 배양 조직을 제공할 수 있게 된다. 게다가 비허용성 성분을 함유하지 않은 등장염류 용액을 보존액으로 하므로, 세정공정을 거치지 않아, 사용시의 세정공정에 필요한 시간을 현저하게 단축하여 신속하게 사용 목적에 제공할 수 있다.
보다 구체적인 본 발명의 형태로는, 콜라겐 겔에 매몰된 연골세포를 배양하여 배양 연골을 얻은 후, 상기 배양 연골을 링겔계 보존액 중에 침지한 상태에서, 또한 2 ~ 18℃의 범위에서 보존하는 것이 바람직하다. 이와 같이 제작한 콜라겐 매몰형의 배양 연골을 링겔계 보존액, 특히 링겔액에 침지하여 보존할 경우, 매우 높은 수준으로 생세포를 유지할 수 있어 안정된 보존효과를 얻을 수 있다.
[실시예]
(배양 연골의 제작)
일본 백색 집토끼의 무릎, 대퇴, 어깨 관절로부터 관절세포를 채취하여, 트립신 EDTA 용액 및 콜라게나아제 용액으로 효소처리하여, 연골세포를 분리ㆍ회수하였다. 얻어진 연골세포를 세정한 후, 10% 소 태아 혈청 (FBS) 함유 DMEM 을 첨가하여, 세포 밀도가 1 ×107 개/㎖ 가 되도록 세포 현탁액을 조제하였다. 세포 현탁액과 3% 아테로콜라겐 임플란트 (다까껭사 제조) 가 1:4 의 비율이 되도록 혼합 (매몰) 하고, 이 혼합액 100㎕ 를 배양용기에 거의 돔형상이 되도록 마운트 (설치) 하였다. 이 공정에 의해 세포 밀도는 희석된다. 즉, 세포 현탁액을 1 ×107개/㎖ 의 농도로 조제한 경우, 콜라겐에 매몰했을 때의 농도는 2 ×106개/㎤ (2 ×105개/100㎕ 스캐폴드) 가 된다.
마운트한 혼합액은 5% CO2, 37℃ 의 조건하에서 0.5 ~ 1 시간, 정치하여 겔화시키고, 배지를 첨가하여 배양을 개시하였다. 배지에는 50㎍/㎖ 아스코르브산 (L-아스코르브산 인산에스테르 마그네슘염 n 수화물 : C6H6O9Pㆍ3/2MgㆍnH 2O;닛꼬우케미컬즈 주식회사 제조) 을 함유하도록 조정한 10% FBS 함유 DMEM 을 사용하여, 37℃, 5% CO2 의 조건하에서 3주간 또는 4주간 동안 배양하였다. 배양 후에는 직경이 약 10㎜, 두께가 약 2㎜ 인 배양 연골이 얻어졌다.
실시예 1
상술한 공정에서 제작한 배양 연골에 대해서, 인산 완충액 (PBS : Phosphate Buffered Saline) 을 보존액으로 하고, 4℃, 8℃, 13℃, 18℃, 25℃, 37℃ 의 여러 온도에서 보존실험을 하였다. PBS 보존액은 기부코사 제조의 것을 사용하였다. 보존실험은 배양용기로부터 배지를 제거한 후, PBS 로 배양 연골을 세정하여, 배양용기에 5㎖ 의 PBS 를 주입함으로써 배양 연골을 침지시켰다. 이 배양용기를 항온기 내에 정치하고, 각 실험온도에서 보존하였다. 보존개시시의 생세포 밀도는 대략 1.0 ~ 2.0 ×107개/㎤ 의 범위이었다. 배양 조직의 실험 샘플은 각 온도에 대해 3 종류의 로트로 제작하여, 보존기간마다 1개씩을 관찰하여 생세포 수를 세었다.
도 1 에 PBS 를 사용한 보존에 있어서, 각 온도조건에 의한 생세포 밀도의 시간변화를 나타낸다. 도 1 은 보존개시시의 생세포 밀도에 대한 소정 보존기간 경과후의 생세포 밀도의 비율을 나타낸다. 통상의 배양온도인 37℃ 에서는, 3일째에 급격하게 생세포 밀도가 감소되어 있는 것을 관찰할 수 있다. 이에 대해 4℃ ~ 25℃ 에서는, 3일째를 경과해도 어느 정도까지의 생세포 밀도를 유지할 수 있는 것으로 나타났다.
특히 8℃, 13℃, 18℃ 에서는 3일째 이후에도 비교적 생세포 밀도가 안정되어 있고, PBS 를 사용한 비교적 장기간의 보존이 가능한 것이 시사되고 있다. 또 4℃ 에서는, 적은 생세포 밀도이기는 하지만, 10일째까지 안정적으로 보존되어 있는 것을 관찰할 수 있었다.
실시예 2
다음에 기존의 장기보존액, 무혈청배지, 링겔계 보존액을 PBS 와 비교하였다.
실험에 사용한 기존의 장기보존액으로는 Via Span (NPBI International BV, Netherl and : NPBI 인터내셔널사 제조, 네델란드), Celsior (Sangstat Medical Corporation : 상스타트 메디컬사 제조) 의 2종류를 사용하였다. 또 무혈청 배지로서 Ex Cell 325 (JRH사 제조), Ex Cell 505 (JRH 사 제조), PFHM II (기부코사 제조) 의 3 종류를 사용하였다. 사용한 링겔계 보존액으로는 링겔액 (오오츠카 제약공장사 제조) 을 사용하였다. PBS 는 실시예 1 과 동일한 것을 사용하였다.
보존온도는 2 ~ 8℃ (온도의 진폭) 또는 13℃ 로 하고, 10일간의 보존기간에서 비교하였다 (도 2 참조). 배양 조직의 실험 샘플은, 동일 로트로 45개를 제작하고, 각 보존액 및 보존온도에서 6개씩을 실험에 제공하였다. 보존기간마다 배양 연골을 3개씩 관찰하여 생세포 수를 세었다. 또한 도면 중의 백색 원은, 배양 직후 (보존개시시) 의 생세포 밀도를 나타내고, 실험 샘플 중, 보존실험에 제공하지 않은 3개로부터 세었다 (2 ~ 8℃ 와 13℃ 는 동일 데이터).
도 2(a) 및 (b) 에 나타나는 바와 같이 10일간의 보존기간 경과후의 생세포 밀도는, PBS 를 사용한 보존 (백색 마름모형) 에서는, 2 ~ 8℃ 에서 다른 2종류의 장기보존액과 동등한 생세포 밀도를 유지하고, 링겔액을 사용한 보존 (+자) 에서는, 2 ~ 8℃ 및 13℃ 의 어느 온도에서나 장기보존액보다도 양호하게 생세포를 유지할 수 있는 것이 명확해졌다. 또한 링겔액을 사용한 보존은, 2 ~ 8℃ 에서의 20일간의 보존기간에서도 장기보존액과 동일 정도로 생세포를 유지할 수 있었다 (데이터 도시하지 않음). 또 장기보존액으로 보존한 배양 연골에서는 연화의 경향이 보이고, 배양 직후의 경도를 갖고 있지 않아, 기계적 특성이 변화되고 있는 것을 관찰할 수 있었다.
이들 결과로부터 PBS 및 링겔액은 배양 연골의 보존액으로서 유효하게 이용할 수 있고, 특히 링겔액은 배양 연골에 대한 높은 레벨의 보존효과를 갖는다고 할 수 있다.
실시예 3
다음에, 보존기간 내에서의 생세포 밀도의 변화를 PBS 및 링겔계 보존액과 장기보존액으로 비교하였다.
실험에는 PBS, 링겔계 보존액으로서 링겔액, 장기보존액으로서 실시예 2 에서 생세포 밀도가 양호하였던 Via Span 을 사용하였다. 이들 보존액은 전부 실시예 2 와 동일한 것을 사용하였다. 보존온도는 4℃, 13℃ 에서 실행하고, 보존기간은 2, 4, 7, 10일로 하였다 (도 3 참조). 배양 조직의 실험 샘플은 동일 로트로 75 개를 제작하고, 각 보존액 및 보존온도에서 12개씩을 실험에 제공하였다. 보존기간마다 배양 연골을 3개씩 관찰하여 생세포 수를 세었다. 보존액의 실험에 제공되지 않았던 3개는, 배양 직후 (보존 실험전) 의 생세포 밀도의 데이터로서 사용하였다. 또한 도면 중의 꺽임선은, 카운트한 3개의 생세포 밀도 데이터의 평균값을 배양 직후의 생세포 밀도의 평균값을 포함시켜, 각 보존액마다 직선으로 연결한 것을 나타낸다.
도 3 에 나타나는 바와 같이 4℃ 의 경우 (a) 및 13℃ 의 경우 (b) 의 어느 것에서나, 링겔액 (백색원, 파선), 이어서 PBS (백색 마름모형, 일점파선), 장기보존액 (백색 삼각, 실선) 의 순서로 생세포 밀도를 유지하였다. 이들 결과로부터, 링겔액 및 PBS 는 배양 연골의 보존액으로서 매우 유효한 것으로 나타났다.
실시예 4
배양 연골의 보존에 매우 유효한 링겔액과 동일하게, 수액제로서 이용되는 생리식염수 (0.9% NaCl 용액) 에 대해 보존액으로서의 효용을 조사하였다.
보존온도를 4℃ 로 하고, 보존기간을 4, 10일로 하여, 배양 연골의 생세포 밀도의 변화를 관찰하였다 (도 4 참조). 배양 조직의 실험 샘플은, 동일 로트로 21개를 제작하고, 각 보존액마다 6개씩을 실험에 제공하였다. 보존 4일째 및 10일째에서 각 보존액마다 3개의 배양 연골을 관찰하여 생세포 수를 세었다. 보존액의 실험에 제공되지 않았던 3개는 배양 직후 (보존실험 전) 의 생세포 밀도의 데이터로 사용하였다. 또한 도면 중의 꺽임선은 세었던 3개의 생세포 밀도 데이터의 평균값을, 배양 직후의 생세포 밀도의 평균값을 포함시켜, 각 보존액마다 직선으로 연결한 것을 나타낸다.
도 4(a) 및 (b) 에 나타나는 바와 같이 생리식염수 (백색 사각, 일점파선) 도 역시, 링겔액 (흑색 삼각, 파선) 및 PBS (흑색 원, 실선) 과 동일하도록 배양 연골의 보존액으로서 적합한 것이 증명되었다. 또 링겔액에 의한 보존에서는, 보존개시시가 되는 배양 직후 (백색 원) 와 비교해도 충분한 양의 생세포 밀도가 존재하는 것으로도 나타나 있다.
이와 같이 링겔액, 생리식염수, PBS 는 지금까지 수액이나 세정용 등으로 사용되어 왔으나, 이것과는 별도로 소정 기간에 걸쳐 배양 연골을 보존하는 것에도 적합한 것으로 나타났다. 이들 보존액은 직접 생체내에 주입되어도 해가 없기 때문에, 사용시에 세정공정을 거칠 필요가 없고, 특별한 기술을 갖지 않아도 번거롭지 않아 용이하게 사용할 수 있다.
실시예 5
이상의 실시예 1 ~ 4 에서는 토끼 유래의 연골세포로 제작한 배양 연골을 예로 들어 설명하였으나, 이하의 실시예 5 에서는, 인간 유래의 연골세포로 제작한 배양 연골의 예를 설명한다.
트립신 EDTA 용액 및 콜라게나아제 용액으로 인간 유래의 관절 연골을 효소처리하여 연골세포를 분리ㆍ회수하였다. 얻어진 연골세포를 세정한 후, 10% 소 태아 혈청 (FBS) 함유 DMEM 을 첨가하고, 세포 밀도가 7.19 ×106개/㎖ 가 되도록 세포 현탁액을 조제하였다. 세포 현탁액과 3% 아테로콜라겐 임플란트 (다까껭사 제조) 가 1:4 의 비율이 되도록 혼합 (매몰) 하고, 이 혼합액 100㎕ 을 배양용기에 마운트 (설치) 하였다. 이 공정에 의해 세포 밀도는 희석된다. 즉, 세포 현탁액을 7.19 ×106개/㎖ 의 농도로 조제한 경우, 콜라겐에 매몰했을 때의 농도는 1.44 ×106개/㎤ (1.44 ×105개/100㎕ 스캐폴드) 가 된다.
마운트한 혼합액은 5% CO2, 37℃ 의 조건하에서 1시간, 정치하여 겔화시키고 배지를 첨가하여 배양을 개시하였다. 배지에는 50㎍/㎖ 아스코르브산 (L-아스코르브산인산에스테르마그네슘염n수화물: C6H6O9Pㆍ3/2MgㆍnH2O;닛꼬우케미컬즈주식회사 제조) 을 함유하도록 조정한 10% FBS 함유 DMEM 을 사용하여, 37℃, 5% CO2 의 조건하에서 3주간 또는 4주간 배양하였다. 배양 후에는 직경이 약 8㎜, 두께가 약 2㎜ 인 배양 연골이 얻어졌다.
상술한 공정에서 제작한 인간 유래 연골세포에 의한 배양 연골에 대해, 링겔액 (오오츠카제약사 제조) 을 보존액으로 하고, 8℃, 13℃, 18℃ 의 여러 온도에서 보존실험하였다. 보존기간은 보존 2일째, 3일째, 4일째에 관찰하였다. 보존실험은 먼저 배양용기로부터 배지를 제거하고 링겔액으로 배양 연골을 세정한다. 이어서 배양 연골을 배양면으로부터 박리하여 다른 용기에 옮긴 후, 용기에 90㎖ 의 링겔액을 주입하여 배양 연골을 침지하였다. 이 용기를 항온기 내에 정치하여, 각 실험온도에서 보존하였다. 보존개시시의 생세포 밀도는 대략 3.19 ×106개/㎤ 이었다. 배양 직후의 실험 샘플은 동일 로트의 배양 연골을 10 개 제작하였다. 각 온도에서 3개씩을 보존실험에 제공하고, 남은 1개를 보존실험 전 (보존 0일째) 의 생세포 밀도의 데이터로 사용하였다. 각 온도에서 보존기간마다 1개씩을 관찰하여 셍세포 수를 세었다.
도 5 에 그 결과를 나타낸다. 보존 4일째까지 관찰하였으나, 생세포 밀도의 두드러진 감소도 보이지 않고 안정적으로 보존할 수 있었다. 이에 의해 토끼 배양 연골뿐만 아니라, 인간 배양 연골에서도 본 발명이 유효한 것으로 나타났다.
실시예 6
다음에 링겔액에, 아미노산 및 비타민을 첨가했을 때의 보존능에 대해 검토하였다. 또한 실시예 1 ~ 5 에서 나타낸 배양 연골에서는, 링겔액 단독으로도 충분한 보존능이 나타났기 때문에, 아미노산 및 비타민을 첨가했을 때의 보존능의 차이를 충분히 평가할 수 없는 가능성을 생각할 수 있다. 따라서 배양 연골과는 세포종과 형태가 다른 배양 표피를 예로 들어 실시예 6 및 실시예 7 에서 검토하였다.
도너로부터 피부조직을 채취한 후, 트립신 등의 효소처리에 의해 표피세포 (keratinocyte) 를 단리하여 세포 현탁액을 조제한다. 미리 활성화한 마우스 선유아세포를 부설한 배양용기 (바닥면적 25㎠) 에 표피세포의 현탁액을 7.5 ×103세포/㎠ 의 파종 밀도로 파종하였다.
표피세포를 파종한 후, 10% FBS 함유 DMEM 을 배지로서 주입하고, 37℃, 10% CO2 의 조건하에서 배양하였다.
융합된 (confluent) 표피 세포를 효소처리에 의해 시트형상의 상태로 배양용기로부터 박리한 후, 멸균시트에 매달아 각종 보존액에서 6℃ 에서 2일간 보존하였다. 보존액으로는 pH 조정용 HEPES 를 함유한 DMEM (이하 DMEM [인비트로젠사 제조]), 링겔액, 종합 아미노산 제제를 첨가한 링겔액, 종합 비타민 제제를 첨가한 링겔액, 종합 아미노산 제제 및 종합 비타민 제제를 첨가한 링겔액 (이하 시험보존액 A) 을 사용하였다. 보존 후의 박리 시트의 생세포율을 보존 전 박리시트와 비교하여, 그 결과를 도 6(a) 및 (b) 에 나타낸다. 또 각 보존액의 조성을 표 1 에 나타낸다.
링겔+아미노산 (중량%) 링겔+비타민 (중량%) 시험보존액A (중량%)
링겔액*1 93.8 99.56 93.4
포도당첨가 아미노산액*2 6.0 - 6.0
종합 비타민제*3 - 0.4 0.4
7% 탄산수소나트륨 0.2 0.04 0.2
0.5M 황산마그네슘 - - -
0.5M 인산2칼륨 - - -
*1 : 오오츠카제약사 제조*2 : 「플라스아미노(상품명)」, 오오츠카제약사 제조*3 : 경(經)중심정맥 영양 수액용 종합 비타민제 「오오츠카MV주 (상품명), 오오츠카제약사 제조
도면에 나타나는 바와 같이 링겔액+아미노산+비타민으로 구성된 시험보존액 A 에서는, DMEM 과 동일 정도의 생세포 수를 나타내었다. 이에 대해 링겔, 링겔+아미노산 및 링겔+비타민의 각 보존액은 DMEM 보다 20 ~ 30% 낮은 결과로 되었다.
실시예 7
다음에 비타민 농도 및 아미노산 농도가 상이한 시험보존액 B 및 C (표 2 참조) 를 제작하고, 시험보존액 A, 다른 보존액 (DMEM 및 링겔액) 과 함께, 13℃ 에서 2일간 보존할 때의 보존능을 검토하였다. 결과를 도 7 에 나타낸다.
시험보존액(중량%)
A B C
링겔액*1 93.4 91.0 93.2
포도당첨가 아미노산액*2 6.0 6.0 6.0
종합 비타민제*3 0.4 0.4 0.4
7% 탄산수소나트륨 0.2 2.6 0.14
0.5M 황산마그네슘 - - 0.08
0.5M 인산2칼륨 - - 0.18
*1 : 오오츠카제약사 제조*2 : 「플러스아미노(상품명)」, 오오츠카제약사 제조*3 : 경중심정맥 영양수액용 종합 비타민제 「오오츠카MV주 (상품명), 오오츠카제약사 제조
도 7 에 나타나는 바와 같이 각종 시험보존액 A ~ C 는 모두 시판되는 배지 DMEM 과 거의 동등한 세포보존능을 갖고 있는 것을 알 수 있다.
따라서 본 실시예에 관련되는 시험보존액 A ~ C 를 사용함으로써, 배양 조직을 소정 기간에 걸쳐 양호하게 보존할 수 있음과 동시에 배양 조직을 이식 등의 사용시에 세정공정을 거치지 않고 즉시 사용할 수 있다.
본 발명의 보존방법에 의하면, 수송기간에 걸쳐 배양 조직을 양호한 상태로 보존할 수 있음과 동시에, 사용에 앞서 세정조작을 필요로 하지 않고 즉시 사용할 수 있다.
도 1 은 본 발명의 실시예에 관련되는 PBS 를 사용한 보존에서 보존개시시의 생세포에 대한 소정 보존기간 경과 후의 생세포 밀도의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 2(a) 는 본 발명의 실시예에 관련되는 PBS, 각종 장기 보존액 및 링겔액을 사용한 보존에 있어서, 10일간 2 ~ 8℃ 에서 보존했을 때의 생세포 밀도변화를 나타내는 그래프이고, 도 2(b) 는 10일간 13℃ 에서 보존했을 때의 생세포 밀도변화를 나타내는 그래프이다.
도 3(a) 는 본 발명의 실시예에 관련되는 PBS, 장기보존액 및 링겔액을 사용한 4℃ 에서의 생세포 밀도의 변화를 나타내는 그래프이고, 도 3(b) 는 동일한 13℃의 보존에서의 생세포 밀도의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4 는 본 발명의 실시예에서의 PBS, 생리식염수 및 링겔액을 사용한 보존에 있어서, 보존 기간 경과시에 있어서의 생세포 밀도의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5 는 본 발명의 실시예에 관련되는 링겔약을 사용한 보존에 있어서, 각 보존기간에 있어서의 생세포 밀도의 시간 경과에 따른 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6 은 본 발명의 실시예에 관련되는 각종 보존액을 사용하여 6℃, 2일간의 보존에 있어서의 생세포율을 나타낸는 그래프이다.
도 7 은 본 발명의 실시예에 관련되는 각종 보존액에 의한 13℃, 2일간의 보존기간 후의 생세포율을 나타내는 그래프이다.

Claims (12)

  1. 세포를 배양하여 얻어지는 배양 조직의 보존방법에 있어서, 상기 배양 조직을 배양 후에, 비허용성 성분을 함유하지 않은 등장염류 용액 중에서 또한 소정 온도에서 보존하는 것을 특징으로 하는 배양 조직의 보존방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 등장염류 용액은, 완충액 또는 수액제(輸液劑)인 배양 조직의 보존방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 완충액은 인산 완충액 (PBS) 인 배양 조직의 보존방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 수액제는 생리적 염류용액인 배양 조직의 보존방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 생리적 염류 용액은 링겔계 보존액 또는 생리식염수인 배양 조직의 보존방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 링겔계 보존액은 링겔액, 락트산 링겔액, 아세트산 링겔액으로 이루어지는 군에서 선택된 1 이상을 기초로 하는 것을 특징으로 하는 배양 조직의 보존방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 링겔계 보존액 또는 생리식염수에는 당류, 비타민 또는 아미노산의 1 이상이 첨가되어 있는 것을 특징으로 하는 배양 조직의 보존방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 연골세포 또는 표피세포인 것을 특징으로 하는 배양 조직의 보존방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 조직은, 겔형상체 또는 다공체의 스캐폴드 및 배양세포로 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 배양 조직의 보존방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 스캐폴드는 콜라겐인 것을 특징으로 하는 배양 조직의 보존방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소정 온도는 2 ~ 25℃ 인 것을 특징으로 하는 배양 조직의 보존방법.
  12. 세포를 배양하여 얻어지는 배양 조직의 보존방법에 있어서, 콜라겐 겔에 매몰된 연골세포를 배양하여 배양 연골을 얻은 후, 상기 배양 연골을 링겔계 보존액 중에 침지한 상태에서, 또한 2 ~ 18℃의 범위에서 보존하는 것을 특징으로 하는 배양 조직의 보존방법.
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