CZ2018116A3

CZ2018116A3 - Způsob uchování živočišných buněk

Info

Publication number: CZ2018116A3
Application number: CZ2018-116A
Authority: CZ
Inventors: Jitka Čejková; Čestmír Čejka; Šárka Kubinová; Irena Vacková
Original assignee: Ústav experimentální medicíny AV ČR, v. v. i.
Priority date: 2018-03-09
Filing date: 2018-03-09
Publication date: 2019-09-18

Abstract

Popisuje se způsob uchování živočišných buněk, zejména kmenových buněk, za účelem jejich skladování nebo transportu, při kterém se připraví zvolený farmaceutický roztok, zavádí se do něho plynný molekulární vodík Hdo dosažení koncentrace alespoň 0,3 mg/l, v takto upraveném roztoku obsahujícím molekulární vodík Hse suspendují kmenové buňky, takto připravená suspenze se převede do nádoby nepropustné pro molekulární vodík H, a nádoby obsahující kmenové buňky v roztoku obsahujícím molekulární vodík Hse uchovají při chladničkové teplotě, zejména při teplotě v rozmezí +2 až +8 °C.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu uchování živočišných buněk, zejména kmenových buněk, při chladničkové teplotě, zejména při teplotě v rozmezí +2 až +8 °C, za účelem jejich skladování nebo transportu.

Dosavadní stav techniky

Kmenové buňky, zejména mezenchymální kmenové buňky (MSCs, Mesenchymal Stem Cells) jsou využívány v moderní medicíně k léčení různých onemocnění. Při léčbě je využíváno jejich imunomodulačních, protizánětlivých, antioxidačních, sekrečních, chemotaktických a diferenciačních vlastností. MSCs jsou rovněž využívány ve vědecké sféře k různým in vitro a in vivo pokusům a k preklinickým studiím na modelových zvířatech.

Před aplikací MSCs určených k terapeutickým účelům v humánní medicíně je třeba jejich důkladná charakterizace a testování. Je nutné potvrdit jejich bezpečnost (testy sterility, přítomnost endotoxinů a mykoplazmat), jejich identitu (povrchové znaky) a fúnkčnost. MSCs je dále třeba transportovat z místa výroby do místa podání buněk pacientovi nebo do místa jejich dalšího využití (testování, vědecké účely, preklinické testy). Všechny tyto procedury prodlužují dobu uskladnění buněčného přípravku a zvyšují nároky na prodlouženou životnost buněk. Jak uvádí Sohn a kolektiv

- 1 CZ2018 -116 A3 (Cytotherapy, 2013), viabilita MSCs uchovaných v solném roztoku klesá již po dvou hodinách.

Pro uchování buněk se využívá většinou modifikovaných roztoků primárně vyvinutých pro transport orgánů (US 7951590, US 6045990, WO 2010064054 AI).

Použití různých roztoků pro dlouhodobé uchování mezenchymálních kmenových buněk je popsáno také v následujících publikacích.

Ginis a kolektiv (Tissue Eng Part C Methods, 2012) testovali uchování adherentních mezenchymálních kmenových buněk v roztoku Hypothermosol® FRS (roztok obsahující kationty Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺ a anionty Cl, H2PO4·, HCOs' a laktobionát, sacharózu, mannitol, glukózu, dextran-40, adenosin, glutathion, HEPES, Trolox) při 4 °C. Viabilita takto uchovaných buněk se pohybovala mezi 70-80 % po 2-4 denním skladování.

Chen a kolektiv (Cell Transplant, 2013) testovali uchování buněk v roztoku Plasmalyte (roztok obsahující kationty Na⁺, K⁺, Mg²⁺ a anionty Cl, CThCOO a CřHuO?) a 5 % dextrózy po dobu šesti hodin a zjistili pokles viability o 17-20 %.

Další komerčně dostupná média a roztoky HBSS (Hank's Balanced Salt Solution, Hanksův pufrovaný solný roztok obsahující KC1, KH2PO4, NaCl, NaHCOs, NaíHPCfi a D-glukózu) a ViaSpan® (roztok obsahující KH2PO4, MgSO4, laktobionát draselný, raffinózu, adenosin, glutathion, allopurinol, hydroxyethylškrob) testovali autoři Corwin a kolektiv (Cryobiology, 2014). Viabilita MSCs po 48-hodinovém uložení při 4 °C byla 45 %.

-2CZ2018 -116 A3

Z patentu CZ 306800 je znám prostředek pro uchování, transport a aplikaci kmenových buněk tvořený pufřovaným vodným roztokem trehalózy (KH2PO4, NajHPCL, CaCh, MgSCL, trehalóza a H2O). MSCs uchované v tomto prostředku po dobu 72 hodin si zachovaly 84-90% životnost.

Podstata vynálezu

Vynález je založen na myšlence použít pro chladové uchování živočišných buněk, zejména kmenových buněk, při takzvané chladničkové teplotě, zejména při teplotě +2 až +8 °C, jako složku roztoku molekulární vodík H2. Molekulární vodík díky své malé velikosti snadno difunduje do cytoplazmy, mitochondrií, případně i jader buněk, kde působí antioxidačně, antiapoptoticky, protizánětlivě a cytoprotektivně.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že molekulárním vodíkem je obohacován, v množství alespoň 0,3 mg/1, vhodný roztok, s výhodou farmaceutický roztok, ve kterém jsou buňky uchovávány a zároveň podávány pacientovi. Jako vhodný farmaceutický roztok lze využít např. infuzní roztoky (např. Ringerův roztok, Hartmannův roztok, fyziologický roztok, Plasmalyte), případně PBS (phosphate buffered šalině - fyziologický roztok s fosfátovým pufirem), HBSS, EBSS (Earfs balanced salt solution - Earlův balancovaný solný roztok) nebo pufřovaný vodný roztok trehalózy (patent CZ 306800). Roztok po saturaci vodíkem by měl mít hodnotu pH v rozmezí 6,3 - 7,8; ideálně 6,9 - 7,4; hodnotu celkové osmolarity v rozmezí 270 - 350 mOsm/1; ideálně 290 310 mOsm/1.

Roztoky lze sytit molekulárním vodíkem buď komerčně dostupnými prostředky uvolňujícími vodík, jako jsou chemické patrony (Dr.

-3 CZ2018 -116 A3

H. Hayashfs originál HydrogenRich Water Stick™), tyčinky (Doctor SUISOSUI®, Friendear, Tokyo, Japan) nebo tablety na bázi hořčíku (US 20160113865 AI), přídavkem obecného kovu s jedlou organickou kyselinou (US 20150258136 AI) nebo probubláváním vodných roztoků plynným vodíkem.

Výhodně se do zvoleného roztoku zavádí molekulární vodík probubláváním plynným vodíkem z tlakové lahve.

Roztok může být obohacován vodíkem na libovolný obsah vodíku, který poskytuje pozorovatelný účinek, s výhodou však až do jeho saturace za daných podmínek. Roztok by měl obsahovat 0,3 až 1,6 mg/1 molekulárního vodíku; ideálně 0,5 až 1,5 mg/L

Způsob uchování za využití molekulárního vodíku je určen pro chladové uchování bez nutnosti zamrazení suspenzí různých typů buněk, zejména živočišných, například buněčných linií, například fibroblastů z pojivové tkáně, zejména však mezenchymálních kmenových buněk získaných například z kostní dřeně, tukové tkáně, periferní krve, zubní pulpy, z extraembryonálních tkání (placenta, pupečník, pupečníková krev), ale i embryonálních, nervových, indukovaných nebo limbálních kmenových buněk savců včetně člověka. Může sloužit také k uchování kmenových buněk uchycených na biologickém nosiči nebo zabudovaných uvnitř nosiče.

Kmenové buňky uchované způsobem podle vynálezu mohou být aplikovány přímo pacientovi bez nutnosti další manipulace, a to zejména intravenózně, intraarteriálně, intramuskulámě, subkutánně, subkunjunktiviálně nebo intratekálně, a to buď samostatně, nebo v kombinaci, např. s nosičem.

-4CZ2018 -116 A3

Nosičem kmenových buněk mohou být funkční biomateriály. Může se jednat o syntetické biokompatibilní polymery (kyselina polylaktidová PLA, kyselina polyglykolová PGA, polyethylenglykol PEG, polykaprolakton PCL, polyhydroxybutyrát PHB a další), přírodní polymery a polysacharidy (kolagen typu I, hyaluronová kyselina, fibrin, chitosan, celulóza, škrob a další) nebo extracelulámí matrice (ECM) ve formě hydrogelu, nanovláken nebo mikrovláken. Nosičem může být biodegradabilní i nedegradabilní materiál.

Alternativně se pro aplikace, které počítají s nosičem, mohou kultivace kmenových buněk provádět v přítomnosti těchto nosičů a společně uchovávat způsobem podle vynálezu.

Alternativně se mohou kmenové buňky uchovávat způsobem podle vynálezu a před aplikací pacientovi smíchat s biokompatibilními nosiči a podávat pacientovi společně.

Přehled obrázků

Na připojených vyobrazeních jsou mikrofotografie adherovaných mezenchymálních kmenových buněk z pupečníkové tkáně vysazených na kultivační plast po 6-denním skladování v chladových podmínkách způsobem podle vynálezu za využití molekulárního vodíku.

Obrázky ilustrují:

obr. lAAdherované MSCs, které byly 6 dní uchovávány v chladových podmínkách v roztoku PBS a poté vysazeny na kultivační plast, po 24-hodinové kultivaci v kompletním médiu,

-5 CZ2018 -116 A3 obr. 1B Adherované MSCs, které byly 6 dní uchovávány v chladových podmínkách v roztoku PBS s koncentrací molekulárního vodíku 0,68 mg/L a poté vysazeny na kultivační plast, po 24hodinové kultivaci v kompletním médiu

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Způsob izolace pupečníkových MSCs

Lidský pupečník byl získán od zdravých novorozenců ihned po porodu. Pupečníkové arterie a véna byly odstraněny a pupečníková tkáň byla nakrájena na malé kousky (asi 1-2 mm³). MSCs z umbilikální tkáně byly izolovány explantátovou metodou, kdy byly kousky tkáně vysazeny do kultivační lahve o ploše 25 cm². Kultivace probíhala ve 4 ml kompletního kultivačního média (médium Alpha MEM Eagle obsahující 5 % obj. lidského destičkového lyzátu a gentamicin). Po 10 dnech byly kousky tkáně odmyty a buňky, které vycestovaly z pupečníkové tkáně a přisedly na plast, byly dále kultivovány v kompletním kultivačním mediu při teplotě 37 °C s 5 % CO2. V průběhu kultivace buněk probíhala 3x týdně výměna média. Dle množství rostoucích buněk probíhalo jejich pasážování, tedy řízené enzymatické odloučení adherujících buněk a jejich přenesení na větší kultivační plochu. Tento proces vždy začal optickou kontrolou kultury pod mikroskopem; optimální pro růst kultury bylo dosažení 80-90% pokrytí buněk kultivačního dna. Pro pasážování bylo nutné odsátí kultivačního média, oplach kultury 4 ml pufřu PBS a přidání 1 ml roztoku enzymu Trypsin/EDTA. Kultivační lahve byly cca 4 minuty inkubovány při 37 °C. Správný průběh enzymatické reakce byl kontrolován pod mikroskopem. Pokud se buňky pohybovaly s proudící kapalinou po poklepání kultivační lahve, byl do každé lahve

-6CZ2018 -116 A3 přidán 1 ml fetálního bovinního séra a 2 ml pufru PBS. Tato směs byla promíchána jemným nasátím a vysátím z pipety a byla převedena do centrifůgační zkumavky a centrifůgována (230 g, 5 minut). Peleta buněk byla resuspendována v kompletním kultivačním médiu a suspenze buněk znovu vysazena do nových kultivačních lahví o ploše 75 cm² v poměru 4000 buněk/1 cm² plochy. Třetím pasážováním buněk bylo dosaženo finální suspenze buněk.

Příklad 2: Způsob sycení roztoků molekulárním vodíkem

Roztoky zvolené pro příklady sycení vodíkem byly fosfátový pufir PBS o složení NaCl, KC1, NajHPCL, KH2PO4 a H2O a pufirovaný vodný roztok s trehalózou podle patentu CZ 306800 o složení KH2PO4, Na2HPO4, CaCL, MgSCk, trehalóza a H2O. Sycení roztoků vodíkem bylo prováděno probubláváním roztoků vodíkem z tlakové láhve (průtok 1 1/min, 10 min, za stálého míchání), pomocí komerčně dostupné patrony Dr. H. Hayashfs originál HydrogenRich Water Stick™ nebo rozpuštěním tablety pro produkci molekulárního vodíku Active H2, Purative. Koncentrace rozpuštěného molekulárního vodíku v roztoku byla měřena pomocí přístroje Trustlex ENH-1000 a dosahovala hodnot 0,5 - 1,5 mg/L

Lze použít také systém MiZ Co., Ltd. Japan. Tento systém používá vak z hliníkové fólie, do kterého se umístí tableta (agens uvolňující H2) a pro H2 propustný vak z polyethylénu nebo polystyrénu, obsahující pufir s uchovávanými buňkami. Po přidání vody se hliníkový vak zavaří. Vyvíjející se H2 proniká do pufiru v polyethylénovém nebo polystyrénovém vaku. Kromě H2 žádná jiná látka do vaku s pufirem a buňkami neproniká.

-7 CZ2018 -116 A3

Příklad 3: Způsob uchování kmenových buněk v roztocích obohacených molekulárním vodíkem

Suspenze kmenových buněk, jejichž získávání je popsáno v příkladu 1, vždy v množství 5-10 mil/ml byla resuspendována v roztoku obohaceném o molekulární vodík podle příkladu 2 a uzavřena v nádobkách z borosilikátového skla hydrolytické třídy 1 se šroubovacím magnetickým uzávěrem s těsněním ze silikonu a teflonu schopných zadržet molekulární vodík po dobu skladování. Nádobky se suspenzí buněk byly skladovány při teplotě cca 4 °C po dobu 6 dnů. Po 3 dnech byla odebrána poměrná část nádobek pro zjištění průběhu příkladu.

Alternativně lze uchovávat buňky ve vacích prostupných pro H2 v zatavených hliníkových vacích s agens produkujícím kontinuálně molekulární vodík.

Příklad 3 a: Srovnávací příklad k příkladu 3

Jako srovnávací příklad k příkladu 3 bylo stejné množství pupečníkových MSCs (5-10 mil/ml) uchováno ve stejném typu nádobek jako v příkladu 3 a ve stejných roztocích jako v příkladu 2, ale bez sycení molekulárním vodíkem a skladováno při teplotě cca 4 °C po dobu 6 dnů. Po 3 dnech byla odebrána poměrná část nádobek pro zjištění průběhu příkladu.

Příklad 4: Viabilita pupečníkových MSCs po 3 a 6-denním skladování

Byla hodnocena viabilita MSCs izolovaných z pupečníkové tkáně uchovaných po dobu 3 resp. 6 dní při teplotě okolo 4 °C. MSCs z lidské pupečníkové tkáně byly vyrobeny podle příkladu 1 a

-8CZ2018 -116 A3 uskladněny podle příkladu 3 a 3a. Po 3 resp. 6 dnech byla stanovena viabilita buněk na základě dvou nezávislých metod.

Nejprve byla suspenze buněk obarvena roztokem trypanové modři a počítán poměr živých a mrtvých buněk pomocí Bíirkerovy počítací komůrky. Živé a mrtvé buňky je možno rozlišit barvením. U buněk s narušenou plazmatickou membránou dochází k průniku barviva a tím k obarvení buňky, nepoškozené živé buňky zůstávají neobarvené. Viabilita stanovená barvením trypanovou modří odráží životnost jednotlivých buněk v suspenzi.

Viabilita pupečníkových MSCs byla dále hodnocena pomocí Amalar blue® testu, který vypovídá o metabolické aktivitě kultivovaných buněk. Aktivní složka Amalar blue® testu je sloučenina resazurin, která proniká do všech buněk. Životaschopné, metabolicky aktivní buňky jsou schopny tuto modrou sloučeninu přeměnit na jasně červené fluorescenční barvivo resofůrin. Množství fluorescence je přímo úměrné počtu živých buněk a koresponduje s metabolickou aktivitu buněk. Pro tento účel bylo vysazeno stejné objemové množství buněk odpovídající počtu 100 000 buněk v čerstvém stavu na 24 jamkovou kultivační destičku a buňky byly kultivovány po dobu 24 hodin. Následně byl přidán objemově 10% roztok Alamar blue® v kompletním kultivačním médiu a MSCs byly inkubovány další 4 hodiny při teplotě 37 °C. Intenzita fluorescence byla hodnocena při vlnové délce excitace 535 nm a vlnové délce emise 550 nm na spektrofotometru (Tecan). Metabolická aktivita buněk byla prezentována jako poměr mezi intenzitou fluorescence MSCs po 3 a 6 dnech skladování v chladovém prostředí podle příkladu 3 a buněk ze stejné skupiny před uskladněním (po sklizni v čase 0). Výsledky byly porovnány s výsledky ze srovnávacího příkladu 3 a (buňky uchované ve stejném typu nádobek v pufrovacích roztocích nesycených

-9CZ2018 -116 A3 molekulárním vodíkem a skladované při teplotě asi 4 °C po dobu 3 a 6 dnů).

V tabulce 1 jsou uvedeny hodnoty vždy z několika měření, zjištěné s koncentracemi vodíku v rozmezí 0,3 až 1,6 mg/1 (koncentrace vodíku na začátku pokusu).

Tabulka 1

	Viabilita; barvení trypanovou modří; % živých (negativních) buněk	Metabolická aktivita adherovaných buněk; barvení pomocí Alamar blue®; vyjádřeno v %; vztaženo k času 0 hodin
	3 dny	6 dní	3 dny	6 dní
PBS	75,71 ±3,8	55,46 ±2,8	82,3 ± 3,6	63,4 ±2,5
TR-200	87,5 ± 5,7	79,4 ± 4,8	88,2 ±2,7	73,5 ±2,4
PBS + H₂	89,51 ±2,3	80,7 ±3,6	91,8 ±5,2	72,9 ± 3,7
TR-200 + H₂	90,35 ±4,1	82,14 ±3,1	92,1 ±4,2	77,1 ±5,7

PBS - fyziologický roztok s fosfátovým pufrem

TR-200 - pufrovaný vodný roztok s trehalózou obsahující 200mM trehalózu;

PBS + H2 - vodíkem sycený fyziologický roztok s fosfátovým pufrem TR-200 + H2 - vodíkem sycený pufrovaný vodný roztok s trehalózou obsahující 200mM trehalózu

Z tabulky č. 1 vyplývá, že sycení roztoku vodíkem zlepšuje životnost a přežitelnost buněk v chladových podmínkách podle způsobu provedení vynálezu. Přídavkem trehalózy, která je známa svými antioxidačními účinky a zvýšením odolnosti vůči nízkým teplotám, se účinek vodíku na životnost buněk ještě zvyšuje.

Kromě toho byla životnost pupečníkových MSCs po chladovém skladování posouzena pomocí hodnocení jejich adheze na kultivační plast během kultivace po dobu 24 hodin v kompletním médiu (podle příkladu 1). Adheze na kultivační plast je jedním ze základních znaků kmenových buněk. Adheze odráží životnost buněk, protože adherovat mohou pouze živé, chladové skladování přeživší buňky. Pro posouzení buněčné adheze byly pořízeny mikroskopické fotografie pupečníkových MSCs adherovaných na

- 10CZ2018 -116 A3 kultivační plast po 6-denním uchování v chladových podmínkách podle způsobu provedení vynálezu (obr. 1). Z obr. 1 je patrné, že buňky uchované v roztocích sycených vodíkem vykazují výrazně lepší adhezi.

Byla provedena řada pokusů v roztocích s obsahem vodíku v rozmezí 0,3 až 1,6 mg/1. Obsah vodíku v celém tomto rozmezí poskytoval pozorovatelné zlepšení. Nejvýraznější zlepšení viability kmenových buněk po 6-denním skladování při teplotě 4 °C bylo pozorováno při obsahu vodíku 0,5 až 1,5 mg/L

Hodnoty pH roztoků ve všech pokusech byly 6,9 až 7,4, přijatelné však jsou hodnoty pH v širším rozmezí pH 6,3 až 7,8. Celková osmolarita byla ve všech případech v rozmezí 290 až 310 mOsm/1, při použití jiných vhodných farmaceutických roztoků však může celková osmolarita nabývat nižších hodnot než 290 mOsm/1 i vyšších hodnot než 310 mOsm/1, může tedy být v rozmezí 270 až 350 mOsm/1.

Příklad 5: Uchování lidských dermálních fibroblastů v roztocích obohacených molekulárním vodíkem

Pro ověření možnosti uchování jiných buněk než kmenových buněk byly provedeny pokusy s uchováním fibroblastů v roztoku PBS, ve kterém byla koncentrace molekulárního vodíku na začátku pokusu 0,68 mg/L Viabilita fibroblastů po šesti dnech byla posuzována kvalitativně. Byla vždy zřetelně vyšší než u kontrolních vzorků bez vodíku.

Příklad 6: Zachování fenotypu pupečníkových MSCs po 6-denním chladovém uchování podle způsobu vynálezu - analýza povrchových znaků

- 11 CZ2018 -116 A3

Dalším znakem charakterizujícím MSCs je kromě adheze k plastu exprese povrchových CD markérů. Pupečníkové MSCs značené protilátkami konjugovanými s fluorescenční značkou byly po 6-denním uchování v chladových podmínkách v roztoku PBS syceného molekulárním vodíkem způsobem podle vynálezu analyzovány na průtokovém cytometru za použití excitačních laserů o vlnové délce 405 nm, 488 nm a 633 nm. Byly testovány znaky CD105, CD90, CD73, CD45, CD34, CD 14, CD 19 a HLA-DR. Analýza prokázala pozitivitu znaků (>90% buněk) CD105, CD90 a CD73, zatímco negativitu znaků (< 10 % buněk) HLA-DR, CD45, CD34, CD14 a CD 19. Tyto výsledky odpovídají správnému fenotypu mezenchymálních kmenových buněk a splňují minimální kritéria pro jejich identifikaci podle ISCT (Mezinárodní společnost pro buněčnou terapii).

Příklad 7: Zachování diferenciačního potenciálu pupečníkových MSCs po 6-denním uchování v chladových podmínkách podle způsobu vynálezu

Pupečníkové MSCs, které byly skladovány po dobu 6 dnů způsobem podle vynálezu v roztoku PBS syceném molekulárním vodíkem při cca 4 °C, si zachovaly svou schopnost diferencovat do buněk adipocytů, osteocytů a chondrocytů. Schopnost diferenciace do těchto tří typů buněk je dalším z minimálních kritérií, které musí podle ISCT mezenchymální kmenové buňky splňovat. Buňky získané podle příkladu 1 byly po 6-denním skladování v chladových podmínkách podle příkladu 2 v roztoku PBS syceným molekulárním vodíkem podle příkladu 3 vysazeny na kultivační plast a kultivovány s vhodnými diferenciačními médii. Po 21 dnech byly buňky zafixovány 4% paraformaldehydem v PBS a obarveny olejovou červení, alciánovou modří a alizarinovou červení pro důkaz adipogenní, chondrogenní a osteogenní diferenciace.

- 12CZ2018 -116 A3

Příklad 8: Životnost pupečníkových MSCs uchycených na biologickém nosiči po 6-denním uchování v chladových podmínkách podle způsobu vynálezu

Pupečníkové MSCs byly vysazeny na biologický nosič na bázi PCL nanovláken v hustotě 150 000 buněk/cm². Po dvoudenní kultivaci byl biologický nosič s buňkami vyjmut z kultivační nádoby, opláchnut roztokem PBS a uložen v prostředku podle příkladu 3 a 3a při teplotě okolo 4 °C. Počet uchycených buněk na biologickém nosiči bylo stanoveno na základě fluorescenčního barvení mikrofilament pomocí phaloidinu a buněčných jader pomocí DAPI. Mikroskopické vyhodnocení obarvených preparátů prokázalo, že po 6-denním skladování v roztoku PBS syceným molekulárním vodíkem bylo na nosiči uchycen o cca 28 % vyšší počet buněk než u nosiče s buňkami skladovaného pouze v roztoku PBS. Předpokládáme, že mrtvé buňky, které ztrácejí schopnost adheze a mění svůj tvar z protáhlého na kulovitý, byly z materiálu vyplaveny během barvicího procesu.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Způsob uchování a transportu živočišných buněk, vyznačující se tím, že se připraví zvolený farmaceutický roztok, zavádí se do něho plynný molekulární vodík H2 do dosažení koncentrace alespoň 0,3 mg/1, v takto upraveném roztoku obsahujícím molekulární vodík H2 se suspendují buňky, takto připravená suspenze se převede do nádoby nepropustné pro molekulární vodík H2, a nádoby obsahující buňky v roztoku obsahujícím molekulární vodík H2 se uchovají v chladu.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že buňky jsou kmenové buňky.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se plynný molekulární vodík H2 zavádí do roztoku do dosažení koncentrace 0,3 až 1,6 mg/L

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se plynný molekulární vodík H2 zavádí do roztoku do dosažení koncentrace 0,5 až 1,5 mg/L

5. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že prostřednictvím volby farmaceutického roztoku a volby metody zavádění plynného molekulárního vodíku H2 se nastavuje pH roztoku obsahujícího molekulární vodík H2 v rozmezí 6,3 až 7,8 a celková osmolarita v rozmezí 270 až 350 mOsm/L

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se nastavuje pH roztoku obsahujícího molekulární vodík H2

- 13 CZ2018 -116 A3 v rozmezí 6,9 až 7,4 a celková osmolarita v rozmezí 290 až 310 mOsm/1.

7. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že nádoby obsahující kmenové buňky v roztoku obsahujícím molekulární vodík H2 se uchovají při teplotě 2 až 5 8 °C po dobu až 6 dnů.

8. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že v roztoku obsahujícím molekulární vodík H2 se suspendují kmenové buňky získané z pupečníkové tkáně v množství 5 000 000 až 10 000 000 buněk na mililitr roztoku.

o

9. Způsob podle některého z nároků 2 až 8, vyznačující se tím, že kmenové buňky se uchovají v chladu v roztoku obsahujícím molekulární vodík v přítomnosti nosiče.