JP2023510271A - 移植用組織の保存方法 - Google Patents

Abstract

移植用の組織を保存および輸送するためのシステムおよび方法を本明細書中に提供する。特に、移植すべき組織は、アルギン酸ゲル中にカプセル化されており、前述の組織は、長期貯蔵および輸送の間の細胞生存率を改善し、炎症性因子を抑制するための培養培地に曝露される。
【選択図】図４Ａ

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り ・第１３８回 北海道整形災害外科学会予稿集、第４頁（資料１） ・Ｔｈｅ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０２０ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ予稿集（資料２） ・第３３回日本軟骨代謝学会 プログラム・抄録集、第８７頁（資料３）

関連出願の相互参照

本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０２０年１月１３日に出願の米国仮特許出願第６２／９６０，２９８号（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）の優先権を主張する。

本開示は、一般に、同種移植片などの組織の分野、より具体的には、移植用組織の長期の貯蔵および保存に関する。

骨軟骨同種移植（ＯＣＡ）は、免疫抑制を必要とすることなく、欠損した軟骨の処置のために機能的な生存組織を移植できる。したがって、ＯＣＡは、中等度から大きな関節軟骨欠損の修復のために適用される、最も広く利用されている方法のうちの１つである（Ｍａｎｄｅｌｂａｕｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．１９９８；８５３）。最近の臨床結果では、ＯＣＡは術後１０年目の６０％～８０％の症例で成功していることが示された（Ｃａｖｅｎｄｉｓｈ，ｅｔ ａｌ．，ＪＢＪＳ Ｒｅｖ．２０１９；ｅ７）。これらの移植片は、臓器ドナーから入手し、患者に移植するために外科センターに輸送する前に安全性についてのウイルスおよび細菌の試験が可能なように貯蔵されなければならない。移植片中の細胞の生存率を調査する研究に基づいて、成功率を最大にするために、組織を採取後できるだけ早期に移植することが推奨されている。

満足できる臨床結果を得るための重要な要因の１つは、貯蔵されたＯＣＡの品質を改善することである（軟骨細胞生存率および軟骨基質含有量を最大にすることが挙げられる）。貯蔵条件を改善するために種々の研究が以前に行われてきたが、長期保存された移植片の品質は満足に維持されていない（Ｂａｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｓ．２００４：２４６；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．Ａｍ．２００３：２１１１；およびＰａｌｌａｎｔｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．２００９：２４Ｓ）。貯蔵条件が改善されると、ＯＣＡの貯蔵寿命およびその臨床的利用において臨床アウトカムが改善される可能性を向上させるであろう。

本開示は、移植すべき組織をアルギン酸ゲル中にカプセル化すると長期の貯蔵または輸送後、貯蔵および輸送の両方の後の組織の品質および生存率が改善されるという発見に基づく。

したがって、本開示は、骨軟骨組織の保存方法または他の組織（複数可）または臓器（複数可）（いかなる軟骨下骨も含まない関節軟骨、線維軟骨組織（半月板、例えば、内側半月もしくは外側半月またはその両方など）、腱（膝蓋腱またはアキレス腱など）、角膜、または硝子体を有する角膜など）の保存方法を提供する。種々の実施形態では、骨軟骨組織は、骨の軟骨に対する厚さの比約２０：１～約１：１０およびその間の範囲または比（例えば、約４：１）を有するようにトリミングされた骨軟骨コアを含むか、から本質的になるか、またはからなる。方法は、骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）をアルギン酸ゲル中にカプセル化し、ゲルカプセル化された骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）を培養培地に曝露する工程を含む（例えば、含む、から本質的になる、またはさらにからなる）。いくつかの実施形態では、ゲルカプセル化組織は、約２４時間～８週間、または少なくとも約２週間（少なくとも約４週間、少なくとも約６週間、またはそれより長期間、およびその間の範囲など）にわたり培養培地に入れられる。種々の実施形態では、次いで、培養培地中のゲルカプセル化組織を、移植のために使用する。種々の実施形態では、方法は、組織（複数可）または臓器（複数可）を半透膜中にカプセル化する工程をさらに含む。種々の実施形態では、半透膜は、孔径が少なくとも約２５０ｐｍ、孔径が約０．２２μｍ～約１０００μｍ、およびその間の範囲（約０．２２μｍ～約１００μｍまたは約０．２２μｍ～約１００μｍなど）のうちの１つ以上の特徴を有する。さらにまたはあるいは、半透膜は、約５０ｋＤａまたは約２００，０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）の特徴を有する。さらにまたはあるいは、半透膜は、メッシュ開口率約１％～約５０％およびその間の範囲または百分率（２％など）を有する。種々の実施形態では、組織は、半透膜中のカプセル化前、カプセル化中、またはカプセル化後にゲル中にカプセル化される。種々の実施形態では、アルギン酸ゲルは、高純度アルギン酸（ＵＰＡＬ）ゲルである。種々の実施形態では、ＵＰＡＬなどのアルギナートは、約０．５％～約２．０％およびその間の範囲または百分率（例えば、約１．２％）の濃度でゲル中に存在する。種々の実施形態では、培養培地は完全培地である。種々の実施形態では、培養培地は、ゲルカプセル化骨軟骨組織または他のゲルカプセル化組織（複数可）もしくは臓器（複数可）の培養培地への曝露後に補充されない。種々の実施形態では、方法は、組織（複数可）または臓器（複数可）を、約１０℃未満、例えば、約０℃から約４℃までの範囲の間、または約４℃に曝露する工程をさらに含む。種々の実施形態では、カプセル化組織（複数可）または臓器（複数可）は、人工的に制御されたＣＯ_２レベル、人工的に制御されたＯ_２レベル、または人工的に制御された湿度のうちの１つ以上を用いて貯蔵されていない。種々の実施形態では、方法は、培養培地との曝露後にアルギン酸ゲルを溶解する工程をさらに含む。さらなる実施形態では、アルギン酸ゲルを、カプセル化組織（複数可）または臓器（複数可）をキレート溶液に曝露する工程を含むか、から本質的になるか、またはからなる方法によって溶解する。なおさらなる実施形態では、キレート溶液は、クエン酸ナトリウム溶液またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液またはクエン酸ナトリウムおよびＥＤＴＡを含むか、から本質的になる溶液を含むか、から本質的になるか、またはさらにからなる。種々の実施形態では、方法は、例えば、機械的にかキレート溶液によって、培養培地との曝露後に半透膜を分解する工程をさらに含む。種々の実施形態では、カプセル化組織（複数可）または臓器（複数可）は、例えば、カプセル化を用いずに貯蔵された組織または臓器と比較して、炎症性因子（複数可）の放出を低下させる。さらなる実施形態では、炎症性因子（複数可）は、一酸化窒素、サイトカインのうちの１つ以上、または両方を含むか、から本質的になるか、またはさらにからなる。種々の実施形態では、移植前のカプセル化組織（複数可）または臓器（複数可）は、カプセル化工程前の細胞生存率の少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％またはそれより高い細胞生存率を維持する。種々の実施形態では、培養培地への曝露前に、カプセル化組織（複数可）または臓器（複数可）は、生理食塩水などの緩衝液で洗浄される。種々の実施形態では、カプセル化組織（複数可）または臓器（複数可）（例えば、角膜）は、少なくとも約２週間にわたり培養培地に入れられる。

別の態様では、本開示は、骨軟骨組織または他の組織（複数可）もしくは臓器（複数可）（いかなる軟骨下骨も含まない関節軟骨、線維軟骨組織（半月板、例えば、内側半月もしくは外側半月またはその両方など）、腱（膝蓋腱またはアキレス腱など）、角膜、または硝子体を有する角膜など）を、例えば、移植前に貯蔵する方法を提供する。種々の実施形態では、骨軟骨組織は、骨の軟骨に対する厚さの比約２０：１～約１：１０（例えば、約４：１）を有するようにトリミングされた骨軟骨コアを含むか、から本質的になるか、またはからなる。方法は、移植すべき骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）を必要に応じて得る工程、得られた骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）を、アルギン酸溶液を含む半透膜室に入れる工程、半透膜室を培養室に入れる工程、カルシウム溶液またはバリウム溶液またはその両方を培養室に添加する工程であって、それにより、骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）がアルギン酸ゲル中にカプセル化される、添加する工程、培養培地をアルギン酸ゲルまたは培養室中に注入するか、アルギン酸ゲルを培養室中に注入する工程、および培養室を貯蔵容器に入れる工程を含む（例えば、含む、またはから本質的になる、またはさらにからなる）。いくつかの実施形態では、カプセル化された骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）は、例えば、移植のために生存し続ける。さらにまたはあるいは、カプセル化された骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）は、例えば、得る工程の後に、少なくとも約２週間（少なくとも約４週間または少なくとも約６週間など）または８週間まで生存し続ける。種々の実施形態では、カルシウム溶液は、塩化カルシウム溶液を含むか、から本質的になるか、またはさらにからなる。種々の実施形態では、バリウム溶液は、塩化バリウム溶液を含むか、から本質的になるか、またはさらにからなる。種々の実施形態では、貯蔵容器は、温度センサをさらに含む。種々の実施形態では、組織（複数可）または臓器（複数可）は、半透膜室中にカプセル化される。種々の実施形態では、半透膜は、少なくとも約２５０ｐｍ；または約０．２２μｍ～約１０００μｍ；およびその間の範囲（約０．２２μｍ～約１００μｍまたは約１００μｍ～約１０００μｍなど）の孔径の１つ以上の特徴を有する。さらにまたはあるいは、半透膜は、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）約５０ｋＤａまたは約２００、０００ｋＤａの特徴を有する。種々の実施形態では、半透膜は、メッシュ開口率約１％～約５０％およびその間の範囲または百分率（例えば、約２％）を有する。種々の実施形態では、アルギン酸溶液は、高純度アルギン酸溶液である。種々の実施形態では、アルギン酸溶液は、約０．５％～約２．０％のアルギナートおよびその間の範囲または百分率、必要に応じて約１．２％アルギナートを含むか、またはから本質的になる。種々の実施形態では、培養培地は完全培地である。種々の実施形態では、方法は、一定期間の貯蔵後に貯蔵容器を病院に輸送する工程をさらに含む。種々の実施形態では、方法は、半透膜中、または培養室中、または貯蔵容器中の温度を１０℃未満（例えば、約０℃～約４℃、または約４℃）に維持する工程をさらに含む。種々の実施形態では、半透膜、または培養室、または貯蔵容器中のＣＯ_２レベル、またはＯ_２レベル、または湿度、またはこれらの任意の組み合わせは、人工的に制御されない。種々の実施形態では、方法は、アルギン酸ゲルを、例えば、移植前に、例えば、カプセル化組織（複数可）または臓器（複数可）をキレート溶液に曝露する工程を含むか、またはから本質的になるか、またはからなる方法によって溶解する工程をさらに含む。さらなる実施形態では、キレート溶液は、クエン酸ナトリウム溶液またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液またはクエン酸ナトリウムおよびＥＤＴＡを含むかまたはから本質的になる溶液を含むか、から本質的になるか、またはさらにからなる。種々の実施形態では、方法は、例えば、移植前に半透膜を分解する工程をさらに含む。種々の実施形態では、例えば、移植のために生存している組織（複数可）または臓器（複数可）は、例えば、ゲル中、半透膜中、またはゲル中および半透膜中の両方にカプセル化することなく貯蔵された組織または臓器と比較して、炎症性因子（複数可）の放出を低下させる。さらなる実施形態では、炎症性因子（複数可）は、一酸化窒素、またはサイトカインのうちの１つ以上、または一酸化窒素およびサイトカインのうちの１つ以上の両方を含むか、から本質的になるか、またはさらにからなる。種々の実施形態では、組織（複数可）または臓器（複数可）は、例えば、移植のために生存し続ける。さらにまたはあるいは、組織（複数可）または臓器（複数可）は、カプセル化工程前の細胞生存率の少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％またはそれより高い細胞生存率を維持する。種々の実施形態では、方法は、培養培地の注入前に、緩衝液（生理食塩水など）を、アルギン酸ゲルもしくは培養室または培養室中のアルギン酸ゲル中に注入する工程をさらに含む。さらなる実施形態では、緩衝液（生理食塩水など）によって可溶性のカルシウムまたはバリウムを軽減させるか除去する。種々の実施形態では、カプセル化組織（複数可）または臓器（複数可）（例えば、角膜）を、例えば、１つの態様では、移植前に少なくとも約２週間貯蔵する。

別の態様では、本開示は、組織輸送システムを提供する。このシステムは、部分的にまたは全体が半透膜から形成され、輸送すべき組織およびアルギン酸溶液を含むように構成された組織室；入口および必要に応じた出口を有する培養室であって、前述の培養室は、組織室を含むように構成されており、カルシウム溶液またはバリウム溶液またはその両方を入口を介して添加すると、アルギン酸溶液がゲル化し、組織をカプセル化する培養室、培養室を含むように構成された輸送ボックスまたは貯蔵容器；ならびに輸送ボックスまたは貯蔵容器中に配置され、培養室の温度を測定するように構成された必要に応じた温度センサを含む（例えば、含む、またはから本質的になる、またはさらにからなる）。種々の実施形態では、組織室は囲まれている。種々の実施形態では、培養室は囲まれている。種々の実施形態では、アルギン酸溶液は、高純度アルギン酸（ＵＰＡＬ）溶液である。種々の実施形態では、組織室は、半透膜によって組織がカプセル化されるように構成された囲まれた組織室である。種々の実施形態では、半透膜は、少なくとも約２５０ｐｍ、例えば、約０．２２μｍ～約１０００μｍおよびその間の範囲（０．２２μｍ～約１００μｍ、または約１００μｍ～約１０００μｍなど）の孔径を有する／含む。種々の実施形態では、半透膜は、メッシュ開口率約１％～約５０％およびその間の範囲または百分率（例えば、約２％）を有する。さらにまたはあるいは、半透膜は、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）約５０ｋＤａまたは約２００、０００ｋＤａを有する。種々の実施形態では、アルギン酸溶液は、約０．５％～約２．０％のアルギナートおよびその間の範囲または百分率、必要に応じて約１．２％アルギナートを含むか、またはから本質的になるか、またはさらにからなる。種々の実施形態では、輸送ボックスまたは貯蔵容器または培養室は、輸送ボックスまたは貯蔵容器または培養室中の温度を１０℃未満（例えば、約０℃～約４℃およびその間の範囲、または約４℃）に維持するように構成された断熱構成要素または冷却構成要素または熱絶縁構成要素と冷却構成要素（ｃｏｏｉｎｇ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）の両方をさらに含む。種々の実施形態では、システムは、半透膜または培養室または貯蔵容器中のＣＯ_２レベル、もしくはＯ_２レベル、もしくは湿度、またはこれらの任意の組み合わせのセンサまたはコントローラを含まない。種々の実施形態では、輸送ボックスまたは貯蔵容器は、気体または液体の連続流に対して密封されている。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、インレットであって、前述のインレットを通過する流体の流入を可能にするように構築されたインレット、およびアウトレットであって、前述のアウトレットを通過する流体の流出を可能にするように構築されたアウトレットを画定する外室であって、前述の外室が囲まれている、外室を含む（例えば、含む、またはから本質的になる、またはさらにからなる）。内室は少なくとも一部が外室内に配置されており、内室は半透膜から形成された少なくとも１つの壁を有し、内室は囲まれており、内室内に組織を保持するように構築されている。組織培養デバイスは、必要に応じて、囲まれた貯蔵容器、貯蔵容器によって確定された内部体積内に配置された外室およびその結果としての内室も含む（例えば、さらに含む）。種々の実施形態では、組織培養デバイスは、貯蔵容器に操作可能に連結されており、かつ貯蔵容器内の温度を測定するように構成された温度センサをさらに含む。種々の実施形態では、組織は、アルギン酸ゲルによってカプセル化されている。種々の実施形態では、流体は、アルギン酸溶液、カルシウム溶液、バリウム溶液、生理食塩水、培養培地、または貯蔵培地のうちの少なくとも１つを含むか、またはから本質的になるか、またはからなる。種々の実施形態では、半透膜は、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）約５０ｋＤａまたは約２００、０００ｋＤａを有する。種々の実施形態では、半透膜は、少なくとも約２５０ｐｍの孔径を有する。種々の実施形態では、半透膜は、約０．２２μｍ～約１００μｍの範囲およびその間の範囲（約１００μｍ～約１０００μｍ、または約０．２２μｍ～約１０００μｍなど）の孔径を有する。種々の実施形態では、半透膜は、メッシュ開口率約１％～約５０％およびその間の範囲または百分率（例えば、約２％）を有する。種々の実施形態では、組織培養デバイスは、貯蔵容器内に配置された断熱構成要素または冷却構成要素のうちの少なくとも１つをさらに含み、前述の断熱構成要素または冷却構成要素のうちの少なくとも１つが、前述の貯蔵容器および／または外室内の温度を１０℃未満に維持するように構成されている。

１つの態様では、本明細書中に開示の組織培養デバイスおよび必要に応じた使用説明書を含むか、またはから本質的になる本明細書中に開示のキットを提供する。種々の実施形態では、本明細書中に開示のキットは、以下のうちの１つ以上をさらに含む：アルギナートもしくは任意の他のヒドロゲル単量体の必要に応じた溶液、カルシウム溶液、バリウム溶液、カルシウム塩、バリウム塩、溶媒、洗浄液、または培養培地。

図１は、例示的な貯蔵条件のスキームを示す絵図である。

図２は、軟骨細胞の区域別生存率の結果を示す一連のグラフ図を提供する。

図３Ａは、代表的な組織画像を示す絵図（図３Ａ）および組織学的スコアの結果を示すグラフ図（図３Ｂ）を提供する。 図３Ｂは、代表的な組織画像を示す絵図（図３Ａ）および組織学的スコアの結果を示すグラフ図（図３Ｂ）を提供する。

図４Ａは、例示的な組織保存および輸送システムを示す絵図である。

図４Ｂは、実施形態にしたがった組織培養デバイスの種々の投影図である。 図４Ｃは、実施形態にしたがった組織培養デバイスの種々の投影図である。 図４Ｄは、実施形態にしたがった組織培養デバイスの種々の投影図である。 図４Ｆは、実施形態にしたがった組織培養デバイスの種々の投影図である。

図５は、例示的な貯蔵条件およびＵＰＡＬゲルコーティングされた試料を示す絵図である。

図６Ａは、貯蔵された関節軟骨（図６Ａ）、半月板（図６Ｂ）、膝蓋腱（図６Ｃ）、および角膜（図６Ｄ）中の生細胞の正規化された百分率を示す。 図６Ｂは、貯蔵された関節軟骨（図６Ａ）、半月板（図６Ｂ）、膝蓋腱（図６Ｃ）、および角膜（図６Ｄ）中の生細胞の正規化された百分率を示す。 図６Ｃは、貯蔵された関節軟骨（図６Ａ）、半月板（図６Ｂ）、膝蓋腱（図６Ｃ）、および角膜（図６Ｄ）中の生細胞の正規化された百分率を示す。 図６Ｄは、貯蔵された関節軟骨（図６Ａ）、半月板（図６Ｂ）、膝蓋腱（図６Ｃ）、および角膜（図６Ｄ）中の生細胞の正規化された百分率を示す。平均±ＳＥ、^＊＝ｐ＜０．０５、^＊＊＝ｐ＜０．０１。

図７は、アルギナートの部分構造の例を提供する。

発明の詳細な説明

本開示は、移植すべき組織をアルギン酸ゲル中にカプセル化すると長期の貯蔵もしくは輸送後、または貯蔵および輸送の両方の後の組織の品質および生存率が改善されるという発見に基づく。

（定義）
理解されるように、本明細書中で使用した節または小節の見出しは、体系化のみを目的とし、記載の発明の対象の制限もしくは分離または制限および分離の両方を目的とすると解釈されないものとする。

本発明の組成物および方法を記載する前に、この開示が記載の特定の組成物、方法、および実験条件に制限されず、そのようなものとして、組成物、方法、および条件が変動し得ると理解されるべきである。本開示の範囲が添付の特許請求の範囲のみに制限されるので、本明細書中で使用したテクノロジーが特定の実施形態の説明のみを目的とし、制限を意図しないとも理解されるべきである。

本テクノロジーの実施には、別段の指示がない限り、当業者の範囲内の組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来技術を使用するであろう。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｄｓ．（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．（２０１５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＰＣＲ １：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃｓ（Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ｅｄｓ．（１９９９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｄ．（２０１４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２０１０）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，６^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｇａｉｔ ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６８３，１９５；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ ｅｄ．（２００５）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｂｕｚｄｉｎ ａｎｄ Ｌｕｋｙａｎｏｖ ｅｄ．（２００７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６））；Ｇｒａｎｄｉ ｅｄ．（２００７）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２^ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｇｕｉｓａｎ ｅｄ．（２００６）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ；Ｐｅｒｂａｌ（１９８８）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２^ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ，（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｋｒｉｄｅｓ ｅｄ．（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ；Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｌｕｎｄｂｌａｄ ａｎｄ Ｍａｃｄｏｎａｌｄ ｅｄｓ．（２０１０）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ；およびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ（１９９６）Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ；および出願時点で利用可能な前述の各々のより最近の版を参照のこと。

本明細書および添付の特許請求の範囲中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他の意味を明確に示さない限り、複数形を含む。したがって、例えば、「ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ」という言及には、本明細書中に記載のタイプの１つ以上の方法、１つ以上の工程、ならびに１つ以上の方法および１つ以上の工程の両方が含まれ、これらは本開示などを読了した際に当業者に自明となるであろう。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、または「～を特徴とする」と互換的に使用され、包含的または非制限の用語であり、追加の引用されていない要素または方法の工程を排除しない。句「～からなる」は、クレーム中に特定されていないいかなる要素、工程、または成分も排除する。句「～から本質的になる」は、特定した材料または工程ならびにクレームに記載の発明の基本的および新規の特徴に実質的に影響を及ぼさないものにクレームの範囲を制限する。本開示は、これらの句の各々の範囲に対応する組成物および方法の実施形態を意図する。したがって、引用した要素または工程を含む組成物または方法は、組成物または方法が要素または工程から本質的になるか、またはからなる特定の実施形態を意図する。

「必要に応じた」または「必要に応じて」は、その後に記載の状況が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、したがって、この記載には、状況が起こる場合および状況が起こらない場合を含む。

本明細書中で使用される場合、「および／または」は、列挙した関連事項のうちの１つ以上のありとあらゆる可能な組み合わせを、さらに、選択肢と解釈する場合には組み合わせを欠くこと（「または」）を指し、これらを包含する。

範囲を含む全ての数字表示（例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量）は近似値であり、必要に応じて１．０または０．１の変化量で（＋）または（－）に変動し、あるいは＋／－１５％、あるいは１０％、あるいは５％、あるいは２％で変動する。常に明記しているわけではないが、全ての数字表示には用語「約」が先行していると理解すべきである。常に明記しているわけではないが、本明細書中に記載の試薬は単なる例示であり、かかる試薬の等価物が当該分野で公知であることも理解すべきである。

本明細書中で使用される用語「被験体」は、対象とされる方法を実施される任意の個体または患者を指す。一般に、被験体はヒトであるが、当業者に認識されるように、被験体は、動物であってよい。したがって、他の動物（げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットが挙げられる）、ネコ、イヌ、ウサギ、家畜（ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタが挙げられる）、競技用動物、ペットなど、および霊長類（サル、チンパンジー、オランウータン、およびゴリラが挙げられる）などの哺乳動物が挙げられる）が、被験体の定義の範囲内に含まれる。

本明細書中で使用される場合、用語「動物」は、生きている多細胞脊椎動物を指し、このカテゴリーには、例えば、哺乳動物および鳥類が含まれる。用語「哺乳動物」には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方が含まれる。

本明細書中で使用される場合、用語「試料」および「生物試料」は、本開示によって提供された方法に好適な任意の試料を指す。１つの実施形態では、本開示の生物試料は、組織試料（例えば、針生検に由来する試料（すなわち、生検試料）などの生検標本）である。

本明細書中で使用される場合、用語「低下する」および「阻害する」は、場合によっては、減少が、特定のアッセイの検出レベル未満（例えば、基準レベルの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％）低下し得ると認識されるので、共に使用される。そのようなものとして、発現レベルまたは活性がアッセイの検出レベル未満に「低下する」か、または完全に「阻害される」かどうかは常に明確ではない場合がある。そうは言っても、本方法に従った処置の後には明確に決定可能であろう。

軟骨細胞は、本明細書中で使用される場合、軟骨中の細胞を指す。罹患していない軟骨細胞は、主にコラーゲンおよびプロテオグリカン（ＰＧ）からなる軟骨性基質を生成し、維持する。間葉系幹細胞は、軟骨細胞の天然に存在する前駆体である。他の幹細胞は、好適な条件下で軟骨細胞を誘導する場合があり、その非限定的な例を実施例に提供する。

本明細書中で使用される場合、用語「組織」は、細胞と完全な臓器との間の細胞組織化レベルを指す。組織は、必要に応じて特異的な機能を共に果たす同一起源の一連の細胞（類似しているか、類似していない）、およびその細胞外基質を含むか、から本質的になるか、またはさらにからなる（上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織、骨軟骨組織、または線維軟骨組織など）。いくつかの実施形態では、本明細書中で使用される組織は、ヒト組織などの動物組織である。他の実施形態では、組織は、非ヒト動物組織である。

本明細書中で使用される場合、用語「臓器」は、特定の機能を果たすように特殊化された機能的単位を構造的に形成する組織の群を指す（腎臓、肝臓、心臓、肺、骨、または眼など）。いくつかの実施形態では、本明細書中で使用される臓器は、動物臓器（ヒト臓器など）である。他の実施形態では、組織は、非ヒト動物臓器である。

本明細書中で使用される場合、骨軟骨組織は、関節軟骨、および軟骨下骨領域を含むか、から本質的になるか、またはさらにからなる。いくつかの実施形態では、骨軟骨組織は、骨軟骨コアを含むか、から本質的になるか、またはさらにからなる。さらにまたはあるいは、骨軟骨組織を動物（ヒトまたは非ヒト）から得て、必要に応じてトリミングする。さらなる実施形態では、骨軟骨組織は、骨の軟骨に対する厚さの比が、約２０：１～約１：１０を有するか含む。なおさらなる実施形態では、例えば、骨軟骨組織は、骨の軟骨に対する厚さの比約４：１を有するか含む。

本明細書中で使用される場合、関節軟骨は、骨の関節面上の硝子軟骨を指し、滑膜関節の関節腔の内側にあり、関節腔の壁を裏打ちする滑膜によって産生される滑液で満たされている。

本明細書中で使用される場合、線維軟骨組織は、種々の比率での白色線維組織および軟骨組織の混合物を指す。（例えば、線維軟骨結合（恥骨結合、椎間板線維輪（ａｎｎｕｌｕｓ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ）、または胸骨柄体軟骨結合など））；肩関節の関節唇；股関節の寛骨臼唇；半月板（膝関節の内側半月および外側半月が挙げられるが、これらに限定されない）；または腱および靭帯が骨に付着している場所。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の線維軟骨組織は、半月板（例えば、内側半月または外側半月またはその両方）を指す。

本明細書中で使用される場合、腱は、筋肉を骨と連結し、張力に耐えることができる線維性結合組織を指す。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の腱は、膝蓋腱を指す。さらにまたはあるいは、本明細書中に開示の腱は、アキレス腱を指す。いくつかの実施形態では、本明細書中で使用される腱は、ヒト腱である。他の実施形態では、本明細書中で使用される腱は、非ヒト動物の腱である。

本明細書中で使用される場合、角膜は、虹彩、瞳孔、および前眼房を覆う透明な眼の前部を指す。いくつかの実施形態では、本明細書中で使用される角膜は、ヒトおよび他の脊椎動物の眼球のレンズと網膜との間の空間を満たす透明なゲルである硝子体を有する角膜を指す。いくつかの実施形態では、本明細書中で使用される角膜は、ヒト角膜である。他の実施形態では、本明細書中で使用される角膜は非ヒト動物の角膜である。

本明細書中で使用される場合、用語「カプセル化」、「包埋」、またはその文法上の異型は、少なくとも一部が（例えば、構造の表面の少なくとも９９％、または少なくとも９８％、または少なくとも９７％、または少なくとも９６％、または少なくとも９５％、または少なくとも９０％、または少なくとも８５％、または少なくとも８０％、または少なくとも７５％、または少なくとも７０％、または少なくとも６５％、または少なくとも６０％、または少なくとも５５％、または少なくとも５０％、または少なくとも４５％、または少なくとも４０％、または少なくとも３５％、または少なくとも３０％、または少なくとも２５％、または少なくとも２０％、または少なくとも１５％、または少なくとも１０％、または少なくとも５％）、いくつかの実施形態では、完全に（例えば、構造の表面の約１００％）、１つ以上の他の構造物または１つ以上の他の構成要素によって（直接または間接的に）取り囲まれるような、構造物または構成要素の方向または位置を指す。種々の実施形態では、用語「カプセル化」またはその文法上の異型は、１つ以上の他の構造物または１つ以上の他の構成要素によって完全に取り囲まれるような、構造物または構成要素の方向または位置を指す。いくつかの実施形態では、用語「カプセル化」は、少なくとも部分的にか完全に内部に配置されていることを指す。１つの制限されない例は、アルギン酸ゲル、またはアルギン酸ゲルおよび半透膜に取り囲まれた組織であり、本明細書中で、カプセル化組織と称される。

用語「曝露」またはその文法上の異型は、接触（２またはそれを超える構成要素の間の直接または間接的な相互作用を意味する）を指す。種々の実施形態では、用語「曝露」は、包み込みまたは浸漬を指す。本明細書中で使用される１つの非限定的な例は、組織の培養培地との接触（例えば、組織の培養培地中への包み込みまたは浸漬）を含むか、から本質的になるか、またはからなる方法を介した組織（アルギン酸ゲル中にカプセル化組織、またはアルギン酸ゲルおよび半透膜中にカプセル化組織、またはいかなるカプセル化も用いない組織など）の培養培地への曝露である。さらなる非限定的な例は、チャンバー中の組織（アルギン酸ゲル中にカプセル化組織、またはアルギン酸ゲルおよび半透膜中にカプセル化組織、またはいかなるカプセル化も用いない組織など）の培養培地への、組織を含むチャンバー中への培養培地の添加（例えば、存在する場合にチャンバー中に最初に存在する溶液の少なくとも一部（例えば、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれを超える）または完全な（すなわち、約１００％）置換）を含むか、から本質的になるか、またはからなる方法を介した曝露である。

本明細書中で使用される場合、保存という用語またはその文法上の異型は、ある特定の期間（少なくとも４８時間、少なくとも３日間、少なくとも５日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間またはそれより長い期間など）にわたって、貯蔵された細胞、組織、臓器、または他の構成要素の生存率を維持しながら（例えば、貯蔵前の生存率の約１００％、または少なくとも９９％、または少なくとも９８％、または少なくとも９７％、または少なくとも９６％、または少なくとも９５％、または少なくとも９０％、または少なくとも８５％、または少なくとも８０％、または少なくとも７５％、または少なくとも７０％、または少なくとも６５％、または少なくとも６０％、または少なくとも５５％、または少なくとも５０％、または少なくとも４５％、または少なくとも４０％、または少なくとも３５％、または少なくとも３０％、または少なくとも２５％、または少なくとも２０％、または少なくとも１５％、または少なくとも１０％、または少なくとも５％の生存率を有する）貯蔵することを指す。組織または臓器の生存率を評価する方法を、当業者は利用可能である（例えば、実施例に開示の方法を参照のこと）。

本明細書中で使用される場合、培養培地は、例えば、細胞の生育を支持するか、細胞の生存を保持するか、組織生存率を維持するための、細胞または組織または臓器の培養に使用される液体物質を指す。いくつかの実施形態では、培養培地は、以下を含むか、から本質的になるか、またはさらにからなる：アミノ酸（複数可）のうちの１つ以上、またはエネルギー源としての炭水化物（複数可）のうちの１つ以上、または微量元素のうちの１つ以上、またはビタミンのうちの１つ以上、または塩のうちの１つ以上、または考え得る追加の構成要素のうちの１つ以上（例えば、細胞の生育および／または生産性および／または製品の品質に影響を及ぼすため）、またはこれらのうちの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態では、培養培地は、ダルベッコ改変基本培地（ＤＭＥＭ）、またはハムＦ－１２培地（Ｆ１２）、またはロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地、またはこれらの任意の組み合わせを含むか、から本質的になるか、またはさらにからなる。さらなる実施形態では、培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＤＭＥＭとＦ１２の１：１混合物）を含むか、から本質的になるか、またはさらにからなる。

いくつかの実施形態では、完全培地は、細胞の生育に寄与し得る追加の構成要素のうちの１つ以上（成長因子のうちの１つ以上、ホルモンのうちの１つ以上、タンパク質のうちの１つ以上、血清のうちの１つ以上、血清代替物のうちの１つ以上など）をさらに含む培養培地を指す。さらなる実施形態では、完全培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの血清をさらに含む培養培地を指す。さらにまたはあるいは、完全培地は、約１％～約２０％（約１％、または約２％、または約３％、または約４％、または約５％、または約６％、または約７％、または約８％、または約９％、または約１０％、または約１１％、または約１２％、または約１３％、または約１５％、または約２０％など）の血清をさらに含む。

本明細書中で使用される場合、透析膜と称される半透膜は、ある特定の粒子（分子またはイオンなど）を、浸透によって、場合によっては拡散、受動輸送、もしくは能動輸送を容易にするより特殊化されたプロセスによって通過させ、それにより、サイズまたは分子量によって粒子を通過させるタイプの生物学的または合成の高分子膜を意味する。

例えば、半透膜は、種々の孔径を備えており、その孔径より小さな粒子を通過させることが可能である。いくつかの実施形態では、半透膜の孔径は、膜細孔の直径によって与えられる。さらなる実施形態では、半透膜の孔径は、膜細孔の平均直径によって与えられる。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の半透膜は、少なくとも約２５０ピコメートル（本明細書中で「ｐｍ」として示す）、少なくとも約３００ｐｍ、少なくとも約５００ｐｍ、少なくとも約７５０ｐｍ、少なくとも約１ｎｍ、少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約３００ｎｍ、少なくとも約４００ｎｍ、少なくとも約５００ｎｍ、少なくとも約６００ｎｍ、少なくとも約７００ｎｍ、少なくとも約８００ｎｍ、少なくとも約９００ｎｍ、少なくとも約１μｍ、少なくとも約２０μｍ、少なくとも約５０μｍ、少なくとも約１００μｍ、少なくとも約１５０μｍ、少なくとも約２００μｍ、少なくとも約３００μｍ、少なくとも約４００μｍ、少なくとも約５００μｍ、少なくとも約６００μｍ、少なくとも約７００μｍ、少なくとも約８００μｍ、少なくとも約９００μｍ、少なくとも約１０００μｍ、少なくとも約１１００μｍ、少なくとも約１２００μｍ、少なくとも約１３００μｍ、少なくとも約１４００μｍ、少なくとも約１５００μｍ、少なくとも約１６００μｍ、少なくとも約１７００μｍ、少なくとも約１８００μｍ、少なくとも約１９００μｍ、少なくとも約２０００μｍ、少なくとも約２１００μｍ、少なくとも約２２００μｍ、少なくとも約２３００μｍ、少なくとも約２４００μｍ、少なくとも約２５００μｍ、少なくとも約２６００μｍ、少なくとも約２７００μｍ、少なくとも約２８００μｍ、少なくとも約３９００μｍ、少なくとも約３０００μｍ、少なくとも約４０００μｍ、少なくとも約５０００μｍ、少なくとも約６０００μｍ、少なくとも約７０００μｍ、少なくとも約８０００μｍ、少なくとも約９０００μｍ、少なくとも約１０ｍｍ、またはそれを超える孔径およびその間の範囲の孔径を有する。さらにまたはあるいは、本明細書中に開示の半透膜は、約３００ｐｍまで、約５００ｐｍまで、約７５０ｐｍまで、約１ｎｍまで、約２０ｎｍまで、約５０ｎｍまで、約１００ｎｍまで、約１５０ｎｍまで、約２００ｎｍまで、約３００ｎｍまで、約４００ｎｍまで、約５００ｎｍまで、約６００ｎｍまで、約７００ｎｍまで、約８００ｎｍまで、約９００ｎｍまで、約１μｍまで、約２０μｍまで、約５０μｍまで、約１００μｍまで、約１５０μｍまで、約２００μｍまで、約３００μｍまで、約４００μｍまで、約５００μｍまで、約６００μｍまで、約７００μｍまで、約８００μｍまで、約９００μｍまで、約１０００μｍまで、約１１００μｍまで、約１２００μｍまで、約１３００μｍまで、約１４００μｍまで、約１５００μｍまで、約１６００μｍまで、約１７００μｍまで、約１８００μｍまで、約１９００μｍまで、約２０００μｍまで、約２１００μｍまで、約２２００μｍまで、約２３００μｍまで、約２４００μｍまで、約２５００μｍまで、約２６００μｍまで、約２７００μｍまで、約２８００μｍまで、約３９００μｍまで、約３０００μｍまで、約４０００μｍまで、約５０００μｍまで、約６０００μｍまで、約７０００μｍまで、約８０００μｍまで、約９０００μｍまで、約１０ｍｍまで、またはそれを超える孔径を有する。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の半透膜は、孔径約０．２２μｍ～約１０００μｍ、およびその間の範囲またはサイズ（約０．２２μｍ～約１００μｍおよびその間の範囲、または約１００μｍ～約１０００μｍおよびその間の範囲など）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の半透膜は、孔径約１００μｍ～約１０００μｍおよびその間の範囲（１００μｍ～約２００μｍ、１００μｍ～約３００μｍ、１００μｍ～約４００μｍ、１００μｍ～約５００μｍ、１００μｍ～約６００μｍ、１００μｍ～約７００μｍ、１００μｍ～約８００μｍ、または約１００μｍ～約９００μｍなど）を有する。種々の実施形態では、当業者は、培養培地（完全培地など）の構成要素（複数可）のうちの１つ以上が膜を通過することができるが、細胞、組織（例えば、カプセル化組織）、またはアルギン酸ゲルのうちの１つ以上は通過できないような本明細書中に開示の半透膜の孔径を選択する。

いくつかの実施形態では、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）は、半透膜の透過性を説明するために使用され、最も低い分子量を有する粒子の９０％超が膜によって保持される分子量（ダルトン（Ｄａ）またはキロダルトン（ｋＤａ）など）を指す。種々の実施形態では、半透膜のＭＷＣＯは、孔径を選択することによって選択または決定される。他の実施形態では、半透膜の孔径は、ＭＷＣＯを選択することによって選択または決定される。種々の実施形態では、ＭＷＣＯは、本明細書中で使用される溶液およびその濃度に基づいて選択される（カルシウム溶液、バリウム溶液、またはキレート溶液など）。種々の実施形態では、当業者は、培養培地（完全培地など）の構成要素（複数可）のうちの１つ以上が膜を通過することができるが、細胞、組織（例えば、カプセル化組織）、またはアルギン酸ゲルのうちの１つ以上は通過できないような本明細書中に開示の半透膜のＭＷＣＯを選択する。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の半透膜のＭＷＣＯは、約１ｋＤａ～約１０，０００，０００ｋＤａおよびその間の範囲（例えば、約１ｋＤａ～約２，０００，００ｋＤａ）である。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の半透膜のＭＷＣＯは、少なくとも約１ｋＤａ、少なくとも約１０ｋＤａ、少なくとも約５０ｋＤａ、少なくとも約１００ｋＤａ、少なくとも約２００ｋＤａ、少なくとも約３００ｋＤａ、少なくとも約４００ｋＤａ、少なくとも５００ｋＤａ、少なくとも約６００ｋＤａ、少なくとも約７００ｋＤａ、少なくとも約８００ｋＤａ、少なくとも約９００ｋＤａ、少なくとも約１，０００ｋＤａ、少なくとも約２，０００ｋＤａ、少なくとも約３，０００ｋＤａ、少なくとも約４，０００ｋＤａ、少なくとも約５，０００ｋＤａ、少なくとも約６，０００ｋＤａ、少なくとも約７，０００ｋＤａ、少なくとも約８，０００ｋＤａ、少なくとも約９，０００ｋＤａ、少なくとも約１０，０００ｋＤａ、少なくとも約２０，０００ｋＤａ、少なくとも約３０，０００ｋＤａ、少なくとも約４０，０００ｋＤａ、少なくとも約５０，０００ｋＤａ、少なくとも約６０，０００ｋＤａ、少なくとも約７０，０００ｋＤａ、少なくとも約８０，０００ｋＤａ、少なくとも約９０，０００ｋＤａ、少なくとも約１００，０００ｋＤａ、少なくとも約２００，０００ｋＤａ、少なくとも約３００，０００ｋＤａ、少なくとも約４００，０００ｋＤａ、少なくとも約５００，０００ｋＤａ、少なくとも約６００，０００ｋＤａ、少なくとも約７００，０００ｋＤａ、少なくとも約８００，０００ｋＤａ、少なくとも約９００，０００ｋＤａ、少なくとも約１，０００，０００ｋＤａ、少なくとも約２，０００，０００ｋＤａ、少なくとも約３，０００，０００ｋＤａ、少なくとも約４，０００，０００ｋＤａ、少なくとも約５，０００，０００ｋＤａ、少なくとも約６，０００，０００ｋＤａ、少なくとも約７，０００，０００ｋＤａ、少なくとも約８，０００，０００ｋＤａ、または少なくとも約９，０００，０００ｋＤａである。さらにまたはあるいは、本明細書中に開示の半透膜のＭＷＣＯは、約５０ｋＤａまで、約１００ｋＤａまで、約２００ｋＤａまで、約３００ｋＤａまで、約４００ｋＤａまで、５００ｋＤａまで、約６００ｋＤａまで、約７００ｋＤａまで、約８００ｋＤａまで、約９００ｋＤａまで、約１，０００ｋＤａまで、約２，０００ｋＤａまで、約３，０００ｋＤａまで、約４，０００ｋＤａまで、約５，０００ｋＤａまで、約６，０００ｋＤａまで、約７，０００ｋＤａまで、約８，０００ｋＤａまで、約９，０００ｋＤａまで、約１０，０００ｋＤａまで、約２０，０００ｋＤａまで、約３０，０００ｋＤａまで、約４０，０００ｋＤａまで、約５０，０００ｋＤａまで、約６０，０００ｋＤａまで、約７０，０００ｋＤａまで、約８０，０００ｋＤａまで、約９０，０００ｋＤａまで、約１００，０００ｋＤａまで、約２００，０００ｋＤａまで、約３００，０００ｋＤａまで、約４００，０００ｋＤａまで、約５００，０００ｋＤａまで、約６００，０００ｋＤａまで、約７００，０００ｋＤａまで、約８００，０００ｋＤａまで、約９００，０００ｋＤａまで、約１，０００，０００ｋＤａまで、約２，０００，０００ｋＤａまで、約３，０００，０００ｋＤａまで、約４，０００，０００ｋＤａまで、約５，０００，０００ｋＤａまで、約６，０００，０００ｋＤａまで、約７，０００，０００ｋＤａまで、約８，０００，０００ｋＤａまで、約９，０００，０００ｋＤａまで、約１０，０００，０００ｋＤａまで、またはそれを超える。いくつかの実施形態では、本明細書中に開示の半透膜のＭＷＣＯは、約１０ｋＤａ、または約２０ｋＤａ、または約３０ｋＤａ、または約４０ｋＤａ、または約５０ｋＤａ、または約６０ｋＤａ、または約７０ｋＤａ、または約８０ｋＤａ、または約９０ｋＤａ、または約１００ｋＤａ、または約２００，０００ｋＤａである。

いくつかの実施形態では、半透膜は、部分的半透膜または完全半透膜であってよい。例えば、部分的半透膜は、ある特定の流体を通過させて選択的に輸送することが可能であり得る。対照的に、完全半透膜は、無制限に流体を通過させて輸送し得るが、アルギン酸ゲルおよび組織の通過による輸送は防止し得る。かかる完全半透膜は、メッシュ（例えば、医療グレードのメッシュ）を含み得るか、から本質的になり得るか、あるいはからなり得る。したがって、いくつかの実施形態では、メッシュ開口サイズは、メッシュの孔径またはその平均を指し、膜孔径と交換可能に使用され得る。

いくつかの実施形態では、半透膜は、約１％～約５０％およびその間の範囲または百分率の開口率（本明細書中でメッシュ開口率とも称される）を有する。いくつかの実施形態では、半透膜は、メッシュ開口率少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、少なくとも約０．７％、少なくとも約０．８％、少なくとも約０．９％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、または少なくとも約４５％を有する。さらにまたはあるいは、半透膜は、開口率約５％未満、約１０％未満、約１５％未満、約２０％未満、約２５％未満、約３０％未満、約３５％未満、約４０％未満、約４５％未満、約５０％未満、約５５％未満、約６０％未満、約６５％未満、約７０％未満、約７５％未満、約８０％未満、約８５％未満、約９０％未満、または約９５％未満を有する。いくつかの実施形態では、半透膜は、メッシュ開口率約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％を有する。

いくつかの実施形態では、膜の開口率は、膜の全表面に対する開口領域の百分率または比を指す。

本明細書中で使用される場合、百分率（％）を、混合物（固体または液体）中の構成要素の濃度を示すために使用する。いくつかの実施形態では、百分率（％）は、質量比または重量比を指す。他の実施形態では、百分率（％）は、体積比を指す。さらに他の実施形態では、百分率（％）は、モル比を指す。いくつかの実施形態では、溶液中のｘ％の構成要素は、１００ｍＬの溶液中のｘグラムの構成要素を指す。

本明細書中で使用される場合、キレート溶液は、キレート剤を含む溶液（カルシウムキレート剤など）を指す。キレート剤の非限定的な例としては、エデト酸、クエン酸、エデト酸二ナトリウム無水物、エデト酸カルシウム二ナトリウム無水物、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、またはエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、キレート剤は、クエン酸ナトリウム、またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。いくつかの実施形態では、キレート溶液は、クエン酸ナトリウム溶液もしくはＥＤＴＡ溶液、またはこれらの混合物である。

いくつかの実施形態では、溶液は水溶液であり、溶液は追加の成分を含んでよい（生理食塩水など）。

本明細書中で炎症と交換可能に使用される炎症応答は、細菌、外傷、毒素、熱、または任意の他の原因（ｅｘ ｖｉｖｏでの保存など）によって組織が傷害を受けた場合に生じる免疫応答を指す。組織は、炎症応答中に炎症性因子（ヒスタミン、ブランジキニン、セロトニン、サイトカイン、一酸化窒素など）を放出する。本明細書中で使用される場合、サイトカイン（インターロイキン（ＩＬ）－１、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、および腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）など）は、免疫細胞（活性化マクロファージなど）、組織もしくは臓器、または軟骨細胞によって産生される。

本明細書中で使用される場合、用語「同種移植片」は、レシピエントと同種であるが、遺伝学的に同一ではないドナー由来の組織移植片を指す。同種移植片組織を、当該分野で公知の技術によってドナーから取り出すことができる。例えば、同種移植片の一般的な無菌の外科手技または他の物理的介入としては、摘出、切除、切断、移植、顕微手術、一般外科手術、レーザー手術、ロボット外科手術、または剖検などが挙げられ得るが、これらに限定されない。

別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示に属する当業者が一般的に理解している意味を有する。本明細書中に記載の方法および材料に類似するか等価な任意の方法および材料を本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料をここに記載する。
本開示の実施のための形態

組織または同種移植片の供給源は、全ての生物型（ヒト、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、およびウマなどが挙げられるが、これらに限定されない）由来の細胞、組織、または臓器であり得る。１つの実施形態では、組織または同種移植片の供給源はヒトである。潜在的な組織または同種移植片の供給源は、眼、脳、心臓、腎臓、肝臓、腸、骨、軟骨、皮膚、肺、甲状腺、胃、靭帯、腱の組織、または移植を必要とし得る任意の他の組織もしくは細胞の供給源が挙げられ得るが、これらに限定されない。種々の実施形態では、同種移植片または組織としては、脊椎、肩甲骨、上腕骨、橈骨、尺骨、骨盤、大腿骨、脛骨、腓骨、膝蓋骨、距骨、趾節骨、もしくは顎関節、またはこれらの任意の組み合わせの骨もしくは軟骨または半月板の組織が挙げられ得る。種々の実施形態では、同種移植片または組織は、骨軟骨組織であり得る。本明細書中の説明が同種移植片組織について言及し得るが、当業者は、本明細書中に記載の方法において他の組織が使用されることを認識する。

いくつかの実施形態では、ゲル、半透膜、またはゲルおよび半透膜の両方によってカプセル化組織は、組織のあらゆる方向の寸法が約１ミリメートル（ｍｍ）より長い（例えば、少なくとも約２ｍｍ、少なくとも約３ｍｍ、少なくとも約４ｍｍ、少なくとも約５ｍｍ、少なくとも約６ｍｍ、少なくとも約７ｍｍ、少なくとも約８ｍｍ、少なくとも約９ｍｍ、少なくとも約１センチメートル（ｃｍ）、またはそれより長い）。さらにまたはあるいは、ゲル、半透膜、またはゲルおよび半透膜の両方によってカプセル化組織は、組織のあらゆる方向の寸法が約２０ｃｍ以下である（例えば、約１５ｃｍ以下、約１０ｃｍ以下、約５ｃｍ以下、約４ｃｍ以下、約３ｃｍ以下、約２ｃｍ以下、約１ｃｍ以下、またはそれより短い）。

骨軟骨同種移植片（ＯＣＡ）は、現在、４℃で保存されており、ドナー採取から２８日以内に使用される。疾患試験プロトコールの実施に２週間を要するので、格好の移植機会は１４日間に制限され、それにより、潜在的なレシピエントが利用できる機会が著しく制限される。本研究を、ＯＣＡの貯蔵寿命およびその臨床的利用において臨床アウトカムが改善される可能性を向上させる改良された貯蔵条件を見出すために行った。

高純度アルギン酸（ＵＰＡＬ）は、高度に精製されており、内毒素による毒性が低い（従来のアルギナートと比較して１／１０，０００未満）。いくつかの実施形態では、ＵＰＡＬは、従来のアルギナートに酸を添加してアルギナートを沈殿させ、不溶性アルギナートを単離する工程を含むか、から本質的になるか、またはからなる方法によって従来のアルギナートから精製される。例えば、Ｉｇａｒａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ２０１２：７０を参照のこと。足場材料として、ＵＰＡＬは、動物モデルにおいて骨軟骨欠損の修復を強化し（Ｉｇａｒａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ２０１２：７０；およびＢａｂａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．２０１８；１９７０）、関節内に注入可能な材料として、骨関節炎の進行を遅延させる（Ｔｓｕｋｕｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ Ａ．２０１５：３４４１）ことが示されている。アルギナートは関節軟骨基質と類似しており、アルギン酸ビーズの形態で包埋材料として三次元培養に好ましいことから（Ｃｈｉｂａ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｉｎｅ Ｊ．２００７：６９４）、ＵＰＡＬがＯＣＡの分解を防止するための最適な貯蔵培地として作用すると予想することができることが示唆される。したがって、現在のＵＰＡＬを使用した貯蔵条件を修正すれば長期貯蔵後のＯＣＡの品質が改善されるという仮説が立てられた。この研究の具体的な目的は、ブタの膝から得たＯＣＡの４週間の貯蔵後の細胞生存率および軟骨基質の状態に及ぼすＵＰＡＬの影響を評価することである。

アルギンとも呼ばれるアルギン酸は、褐藻類の細胞壁中に広く分布する多糖であり、これは、親水性を示し、水和した場合に粘性ゴムを形成する。ナトリウムおよびカルシウムなどの金属とのその塩はアルギナートとして公知である。アルギナート中の糖は、グルロナート（Ｇ）、マンヌロナート（Ｍ）、またはグルロナート－マンヌロナートブロックからなり、糖の比率の相違によって形成されるゲルの強度が決定される。いくつかの実施形態では、使用されるアルギン酸および／またはその塩のＭ／Ｇ比は、通常、約０．２～約４．０から選択される範囲、約０．４～約３．０の範囲、および約０．５～約３．０の範囲、ならびにその間の範囲である。天然生成物由来のポリマー物質は、一般に、種々の分子量の分子の凝集体であるので、ある特定の範囲を有する分子量分布として測定される。アルギン酸の分子量を、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ（多角度光散乱検出器を備えたサイズ排除クロマトグラフィ）による標準的な計算方法（ＡＳＴＭ Ｆ２６０５－１６（２０１６），ＡＳＴＭ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ出版）によって測定することができる。いくつかの実施形態では、使用されるアルギン酸および／またはその塩の分子量は、通常、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ法によって測定した場合、約１０，０００～約２，０００，０００、約１５，０００～約１，５００，０００の範囲、約２０，０００～約１，０００，０００の範囲、または約２５，０００～約５００，０００の範囲、およびその間の範囲から選択された範囲である。

軟骨細胞の生存率が高いとｉｎ ｖｉｖｏで良好に作用することが周知である（Ｐａｌｌａｎｔｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．２０１２：１８１４）。ＵＰＡＬゲルによってＯＣＡをカプセル化すると、他の群と比較して、表面区分における軟骨細胞の生存率が有意に高くなった。ＵＰＡＬゲル群における中間区分の生存率および厚さの合計も、他の群より高い傾向を示した。これらの結果は、表面区分が脆弱であったという結果、および表面区分の細胞生存率がその貯蔵条件に影響を受けやすいという結果と一致する（Ｐａｌｌａｎｔｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．２００９：２４Ｓ）。ＵＰＡＬゲルでのカプセル化は、貯蔵期間中にその構造の変形は認められなかった。また、アルギン酸ゲルにおける細胞生存率および基質含有量の維持、ならびにポリグリカン（ＰＧ）合成は、貯蔵培地中の総一酸化窒素（ＮＯ）濃度の低さによって支えられている。また、アルギン酸ゲル中に包埋すると、臨床現場への組織の輸送中の機械的損傷から組織がいくらか保護され得る。ＵＰＡＬゲルによるカプセル化を使用することは、貯蔵２８日後のＯＣＡの品質の改善に有効であり得る。したがって、貯蔵中にＵＰＡＬゲルを使用すると、骨軟骨の同種移植後の臨床アウトカムが改善されて貯蔵期間中の細胞死が最小になる可能性がある。

本明細書中に開示の実施例に例示のように、ＵＰＡＬゲル中に骨軟骨同種移植片（ＯＣＡ）を包埋（すなわち、カプセル化）すると、貯蔵２８日後または貯蔵６週間後の細胞生存率および基質組成が改善される。基質合成は、他の対照方法で貯蔵されたＯＣＡと比較して保存される。さらに、アルギナートを用いた細胞生存率は、アルギナートを用いないもの（対照培養）より高かった。ＵＰＡＬゲルを用いて移植組織を貯蔵した場合の細胞生存率は、培地のみで貯蔵した組織の細胞生存率より有意に高かった。ＵＰＡＬゲルおよび半透膜に包埋した組織を有するＵＰＡＬ膜群は、全ての他の試験条件より細胞生存率が高かった。理論に拘束されることを望まないが、ＵＰＡＬ膜群における条件は、ＵＰＡＬゲルおよび膜を介した栄養素へのアクセスが優れており、また、貯蔵期間中に物理的な保護も行う。さらに、単一のアルギン酸ゲル中に包埋すると、貯蔵期間中に機械的損傷から組織がいくらか保護される。貯蔵期間の終了時に、アルギン酸ゲルを含む組織は、培地をキレート溶液と置換することによって装置またはシステムから取り出される。キレート溶液（ＥＤＴＡまたはクエン酸ナトリウムなど）への曝露によって組織周囲のいかなる残存するアルギン酸ゲルも溶解される；溶解は、移植直前に手術室で行ってよい。さらに、アルギン酸ゲル中に包埋すると、臨床現場への組織の輸送中の機械的損傷から組織がいくらか保護される。

軟骨組織の貯蔵に利用可能な方法はいくつか存在するが、本明細書中に開示の方法、装置、またはシステムは、例えば、輸送中に他の方法を超える利点（複数可）がある。例えば、液体貯蔵システムを超えるかかる利点としては、アルギン酸ゲル中への包埋によって組織保存条件が改良されること；病院への組織の輸送中の衝撃、振動、または揺れから組織が保護され、それにより、輸送による組織の損傷が防止されること；細胞生存率が改善され、炎症性因子（サイトカインおよび一酸化窒素など）が抑制されること；および１つの囲まれたシステムで貯蔵段階および輸送段階がまかなえることが挙げられ得るが、これらに限定されない。したがって、アルギン酸ゲルおよび必要に応じた半透膜中に包埋して同種移植片組織を保存すると、組織中の細胞の維持が改善される。いくつかの実施形態では、半透膜は、部分的半透膜または完全半透膜であってよい。例えば、部分的半透膜は、ある特定の流体を通過させて選択的に輸送することが可能であり得る。対照的に、完全半透膜は、無制限に流体を通過させて輸送し得るが、アルギン酸ゲルおよび組織の通過による輸送は防止し得る。かかる完全半透膜は、メッシュ（例えば、医療グレードのメッシュ）を含み得る（含み得るか、から本質的になり得るか、あるいはからなり得る）。かかる貯蔵条件の修正により、本明細書中に開示の組織（骨軟骨同種移植片など）の品質が改善される。

したがって、１つの態様では、本開示は、組織保存の方法、システム、または装置を提供する。方法は、ＵＰＡＬゲル中に組織をカプセル化する工程およびカプセル化組織を、例えば、移植前に約２４時間～約８週間貯蔵する工程を含む。種々の実施形態では、組織は骨軟骨組織である。種々の実施形態では、組織は、骨軟骨組織以外の本明細書中に開示の組織である。

任意の態様または実施形態における本明細書中に開示の手順の予想外の利点は、組織試料を、先行技術の方法と比較して長期間にわたって生存および無菌を維持することができることである。例えば、典型的には先行技術において、ドナーから同種移植片を摘出した際に、組織を氷上またはおよそ４℃で貯蔵していた。この方法にしたがって調製した組織は、およそ２１～２８日間好適に生存を維持する傾向があった。しかしながら、本明細書中に記載の手順は、同種移植片組織の生存率が驚異的かつ予想外に増加する。本明細書中に記載の手順にしたがって調製および貯蔵された組織は、４℃での貯蔵と比較して長期間生存し続ける。長期間とは、少なくとも約７～１００日間、少なくとも約２０～８０日間、または少なくとも約２９～７０、４０～７０、５０～７０、または６０～７０日間を意味する。種々の実施形態では、カプセル化組織は、使用（移植など）前に約１日間、２日間、７日間、１４日間、２８日間、４週間、６週間、または８週間貯蔵される。種々の実施形態では、０日目の組織の細胞の生存率と比較して、組織の細胞のうちの少なくとも約４０％が貯蔵後に生存し続ける。

別の態様では、本開示は、本明細書中に開示の骨軟骨組織または他の組織（複数可）もしくは臓器（複数可）を、例えば、移植前に貯蔵する方法を提供する。方法は、移植すべき骨軟骨組織または他の組織（複数可）もしくは臓器（複数可）を得る工程、得られた骨軟骨組織または他の組織（複数可）もしくは臓器（複数可）を、アルギン酸溶液を含む半透膜室に入れる工程、半透膜室を培養室に入れる工程、およびカルシウム溶液またはバリウム溶液またはその両方を培養室に添加し、それにより、骨軟骨組織または他の組織（複数可）もしくは臓器（複数可）をアルギン酸ゲル中にカプセル化する、添加する工程、培養培地を培養室に注入する工程、および必要に応じて培養室を貯蔵容器に入れる工程を含む（例えば、を含むか、から本質的になるか、あるいはからなる）。種々の実施形態では、カプセル化された骨軟骨組織は、得る工程後８週間まで移植のために生存し続ける。

組織中の細胞の維持を改善するアルギン酸ゲルおよび必要に応じた半透膜中に包埋された同種移植片組織の保存に関する方法、材料、配合物、システム、または装置を本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、方法、材料、配合物、システム、または装置はまた、臨床現場への輸送中の機械的損傷から組織をいくらか保護する。

１つの態様では、本開示は、骨軟骨組織の保存方法を提供する。別の態様では、本明細書中に開示の他の組織（複数可）または臓器（複数可）を保存する方法を提供する。いくつかの実施形態では、組織（複数可）または臓器（複数可）は、骨軟骨組織（骨の軟骨に対する厚さの比約２０：１～約１：１０およびその間の範囲、例えば、約４：１を有するようにトリミングされた骨軟骨コアなど）、いかなる軟骨下骨も含まない関節軟骨、線維軟骨組織（半月板、例えば、内側半月もしくは外側半月またはその両方など）、腱（膝蓋腱またはアキレス腱など）、角膜、または硝子体を有する角膜から選択される。

いくつかの実施形態では、方法は、骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）をアルギン酸ゲル中にカプセル化し、ゲルカプセル化された骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）を培養培地に曝露する工程を含む（例えば、含む、またはから本質的になる、またはさらにからなる）。いくつかの実施形態では、ゲルカプセル化組織は、移植前に約２４時間～約８週間から選択される期間、およびその間の範囲、約２８日間、少なくとも約６週間、例えば、約２４時間～８週間にわたり培養培地に入れられる。さらにまたはあるいは、方法は、骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）をアルギン酸ゲル中にカプセル化し、カプセル化された骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）を培養培地に少なくとも約２週間（少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、またはそれより長い期間など）曝露する工程を含む（例えば、含む、またはから本質的になる、またはさらにからなる）。いくつかの実施形態では、方法は、骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）をアルギン酸ゲル中にカプセル化し、カプセル化された骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）を培養培地に約２週間～約３週間、約２週間～約４週間、約２週間～約５週間、約２週間～約６週間、約２週間～約７週間、約２週間～約８週間、約２週間～約９週間、約２週間～約１０週間、約３週間～約４週間、約３週間～約５週間、約３週間～約６週間、約３週間～約７週間、約３週間～約８週間、約３週間～約９週間、約３週間～約１０週間、約４週間～約５週間、約４週間～約６週間、約４週間～約７週間、約４週間～約８週間、約４週間～約９週間、約４週間～約１０週間、約５週間～約６週間、約５週間～約７週間、約５週間～約８週間、約５週間～約９週間、約５週間～約１０週間、約６週間～約７週間、約６週間～約８週間、約６週間～約９週間、約６週間～約１０週間、または前述の各々の間の範囲の期間曝露する工程を含む（例えば、含む、またはから本質的になる、またはさらにからなる）。

種々の実施形態では、方法は、組織（複数可）または臓器（複数可）を半透膜中にカプセル化する工程をさらに含む。種々の実施形態では、半透膜は、少なくとも約２５０ｐｍ（約０．２２μｍ～約１００μｍおよびその間の範囲、約０．２２μｍ～約１０００μｍおよびその間の範囲、または約１００μｍ～約１０００μｍおよびその間の範囲など）の孔径を有する。さらにまたはあるいは、半透膜は、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）約５０ｋＤａまたは約２００、０００ｋＤａを有する。いくつかの実施形態では、半透膜は、メッシュ開口率約１％～約５０％およびその間の範囲または百分率（例えば、約２％）を有する。種々の実施形態では、組織は、半透膜中のカプセル化前、カプセル化中、またはカプセル化後にゲル中にカプセル化される。

種々の実施形態では、アルギン酸ゲルは、精製されたゲル、または高度に精製されたアルギン酸ゲル（ＵＰＡＬ）である。種々の実施形態では、アルギン酸ゲルは、約０．５％～約２．０％のアルギナートおよびその間の範囲または百分率（例えば、約１．２％アルギナート）を含むか、またはから本質的になる。種々の実施形態では、ＵＰＡＬは、約０．５％～約２．０％およびその間の範囲または百分率（例えば、約１．２％）の濃度でゲル中に存在する。

アルギナートは、３０～６０％の褐藻類（ケルプなど）を含む天然の多糖である。アルギナートは、Ｄ－マンヌロン酸（Ｍ）およびＬグルロン酸（Ｇ）を含むか、から本質的になるか、またはからなるヘテロポリマーの凝集体である。ＭおよびＧから構成されるカルボキシル基は、イオン交換能が高く、種々のカチオンに容易に結合する。図７中のアルギナート部分構造の例を参照のこと。アルギナートの物理的性質は、異なる種類のカチオンに応じた種々の方法で変化する。特に、カルシウムイオンによるアルギナートの架橋により、水不溶性水和ゲルが形成される。平均分子量が１０^４～１０^６Ｄａの範囲のアルギナートを利用できる。アルギナートの分子量が高いほど、溶液の粘度が高くなる。アルギン酸ナトリウムは、水溶性の白色の凍結乾燥粉末であり、一方、アルギン酸カルシウムは、水不溶性の白色粉末である。原材料からのアルギナートの精製プロセスは、以下を含むか、から本質的になるか、あるいはからなる：乾燥および粉砕；洗浄および膨潤；抽出；濾過；固化および沈殿；ならびにアルギナート（湿式）の乾燥。食品（例えば、増粘薬、ゲル化剤、乳化剤、麺品質改良剤、ペットフード、養殖魚の飼料、結合剤、および増粘薬などとして）、化粧品、織物の捺染ペーストなど、ならびに薬学分野（例えば、錠剤の崩壊薬、または胃壁保護剤として）などにおいて広範に適用されている。また、アルギナートは、産業で使用される印象材の主成分である。また、アルギナートは、優れた軟骨形成能を有する。

高純度のアルギン酸（ＵＰＡＬ）が開発された。従来のアルギナートは、内毒素レベルが高く、経口投与または創傷被覆材以外の臨床には使用することができない。内毒素レベルが高いとｉｎ ｖｉｖｏで炎症応答を引き起こす。この有害作用は、アルギナートベースの材料の臨床への適用の妨げとなる。Ｍｏｃｈｉｄａは、ＵＰＡＬと呼ばれる内毒素レベルが非常に低い高度に精製されたアルギナートを開発した。ＵＰＡＬは、内毒素に原因するｉｎ ｖｉｖｏでの炎症応答を排除し、アルギナートベースの材料の臨床適用が可能であった。例えば、ＵＰＡＬゲルは、骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）の細胞増殖を強化する。例えば、Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｉｗａｓａｋｉ，ｅｔ ａｌ．ＪＢＭＲ Ａ，２０１０を参照のこと。種々の試験から、ＵＰＡＬゲルがヒアリン様軟骨の再生を促進することが明らかとなった。再生医療または細胞医療の分野でアルギン酸ナトリウムの使用を望む志願者を用いた臨床研究が行われている。

種々の実施形態では、本明細書中で使用されるアルギナート（ＡＬＧ）は、種々の分子量（１０^４～１０^６Ｄａおよびその間のおよび数値など）である。アルギナートの分子量が高いほど、より硬く弾性のあるアルギン酸ゲルが形成される。当業者は、本明細書中に開示の方法の実施において、適切な分子量のアルギナートを選択する準備ができているであろう。

種々の実施形態では、培養培地は完全培地である。

種々の実施形態では、カプセル化された骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）は、移植前に約２８日間（約４週間）または移植前などに約６週間貯蔵される。いくつかの実施形態では、カプセル化組織（複数可）または臓器（複数可）は、例えば移植前に少なくとも約２週間（少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、またはそれより長期間など）貯蔵される。いくつかの実施形態では、カプセル化組織（複数可）または臓器（複数可）は、例えば、移植前に約２週間～約３週間、約２週間～約４週間、約２週間～約５週間、約２週間～約６週間、約２週間～約７週間、約２週間～約８週間、約２週間～約９週間、約２週間～約１０週間、約３週間～約４週間、約３週間～約５週間、約３週間～約６週間、約３週間～約７週間、約３週間～約８週間、約３週間～約９週間、約３週間～約１０週間、約４週間～約５週間、約４週間～約６週間、約４週間～約７週間、約４週間～約８週間、約４週間～約９週間、約４週間～約１０週間、約５週間～約６週間、約５週間～約７週間、約５週間～約８週間、約５週間～約９週間、約５週間～約１０週間、約６週間～約７週間、約６週間～約８週間、約６週間～約９週間、約６週間～約１０週間、または前述の各々の間の範囲の期間貯蔵される。種々の実施形態では、カプセル化された角膜は、移植前に少なくとも約２週間貯蔵される。

種々の実施形態では、培養培地は、ゲルカプセル化組織の培養培地への曝露後に補充されない。種々の実施形態では、培養培地は、ゲルカプセル化組織の培養培地への曝露後に１回以下、または２回以下、または３回以下、または４回以下、または５回以下のみ補充される。

種々の実施形態では、カプセル化組織（複数可）または臓器（複数可）を、１０℃未満、例えば、約０℃から約４℃までおよびその間の範囲、または約４℃で保存する。

種々の実施形態では、カプセル化組織（複数可）または臓器（複数可）は、人工的に制御されたＣＯ_２レベル、または人工的に制御されたＯ_２レベル、または人工的に制御された湿度、またはこれらの任意の組み合わせを用いて貯蔵されない。

種々の実施形態では、方法は、アルギン酸ゲルを、培養培地との曝露後、必要に応じて移植前に、例えば、カプセル化組織（複数可）または臓器（複数可）をキレート溶液に曝露することを含むか、またはから本質的になるか、またはからなる方法によって溶解する工程をさらに含む。さらなる実施形態では、キレート溶液は、クエン酸ナトリウム溶液またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液またはクエン酸ナトリウムおよびＥＤＴＡの両方を含む溶液を含むか、から本質的になるか、またはさらにからなる。

種々の実施形態では、方法は、培養培地との曝露後かつ移植前に半透膜を分解する工程をさらに含む。

種々の実施形態では、カプセル化組織（複数可）または臓器（複数可）は、例えば、アルギン酸ゲル中、または半透膜中、またはアルギン酸ゲル中および半透膜中の両方へのカプセル化を用いずに貯蔵された組織または臓器と比較して、炎症性因子（複数可）の放出を低下させる。さらなる実施形態では、炎症性因子（複数可）は、サイトカインのうちの１つ以上、または一酸化窒素、または一酸化窒素およびサイトカインのうちの１つ以上の両方を含むか、から本質的になるか、またはさらにからなる。

種々の実施形態では、移植前のカプセル化組織（複数可）または臓器（複数可）は、カプセル化工程前または得る工程（すなわち、被験体などから組織（複数可）または臓器（複数可）を得ることを含むか、から本質的になるか、またはからなる工程）後の細胞生存率の少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％またはそれより高い細胞生存率を維持する。

種々の実施形態では、培養培地への曝露前に、カプセル化組織（複数可）または臓器（複数可）は、生理食塩水または培養培地などの緩衝液で洗浄される。

１つの態様では、本開示は、骨軟骨組織を貯蔵する方法を提供する。別の態様では、本明細書中に開示の組織（複数可）または臓器（複数可）を貯蔵する方法を提供する。いくつかの実施形態では、組織（複数可）または臓器（複数可）は、移植前に、骨軟骨組織（骨の軟骨に対する厚さの比約２０：１～約１：１０、例えば、約４：１を有するようにトリミングされた骨軟骨コアなど）、いかなる軟骨下骨も含まない関節軟骨、線維軟骨組織（半月板、例えば、内側半月もしくは外側半月または内側半月および外側半月の両方など）、腱（膝蓋腱またはアキレス腱など）、角膜、または硝子体を有する角膜から選択される。

いくつかの実施形態では、方法は、移植すべき骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）を必要に応じて得る工程、得られた骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）を、アルギン酸溶液を含む半透膜室に入れる工程、半透膜室を培養室に入れる工程、およびカルシウム溶液またはバリウム溶液またはその両方を培養室に添加する工程であって、それにより、骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）がアルギン酸ゲル中にカプセル化される、添加する工程、培養培地をアルギン酸ゲル中または培養室中に注入するか、アルギン酸ゲルを培養室中に注入する工程、および必要に応じて培養室を貯蔵容器に入れる工程を含む（例えば、含む、またはから本質的になる、またはさらにからなる）。

いくつかの実施形態では、カプセル化された骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）は、少なくとも約２週間（少なくとも約４週間または少なくとも約６週間など）移植のために生存し続ける。いくつかの実施形態では、カプセル化された骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）は、得る工程後８週間まで移植のために生存し続ける。いくつかの実施形態では、カプセル化された骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）は、少なくとも約２週間（少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、またはそれを超える期間など）移植のために生存し続ける。いくつかの実施形態では、カプセル化された骨軟骨組織または他の好適な組織（複数可）もしくは臓器（複数可）は、約２週間～約３週間、約２週間～約４週間、約２週間～約５週間、約２週間～約６週間、約２週間～約７週間、約２週間～約８週間、約２週間～約９週間、約２週間～約１０週間、約３週間～約４週間、約３週間～約５週間、約３週間～約６週間、約３週間～約７週間、約３週間～約８週間、約３週間～約９週間、約３週間～約１０週間、約４週間～約５週間、約４週間～約６週間、約４週間～約７週間、約４週間～約８週間、約４週間～約９週間、約４週間～約１０週間、約５週間～約６週間、約５週間～約７週間、約５週間～約８週間、約５週間～約９週間、約５週間～約１０週間、約６週間～約７週間、約６週間～約８週間、約６週間～約９週間、または約６週間～約１０週間移植のために生存し続ける。種々の実施形態では、カプセル化された角膜は、少なくとも約２週間移植のために生存し続ける。

種々の実施形態では、カルシウム溶液は、塩化カルシウム溶液を含むか、から本質的になるか、またはさらにからなる。いくつかの実施形態では、本明細書中で使用されるカルシウム溶液は、バリウム溶液（例えば、塩化バリウム溶液）と置き換えてよい。さらなる実施形態では、本明細書中で使用されるカルシウム溶液は、カルシウム塩およびバリウム塩（塩化カルシウムおよび塩化バリウムなど）を含むか、またはから本質的になる溶液と置き換えてよい。

種々の実施形態では、貯蔵容器は、温度センサをさらに含む。

種々の実施形態では、組織（複数可）または臓器（複数可）は、半透膜室中にカプセル化される。種々の実施形態では、半透膜は、少なくとも約２５０ｐｍ（約０．２２μｍ～約１００μｍおよびその間の範囲、約０．２２μｍ～約１０００μｍおよびその間の範囲、または約１００μｍ～約１０００μｍおよびその間の範囲など）の孔径を有する。さらにまたはあるいは、半透膜は、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）約５０ｋＤａまたは約２００、０００ｋＤａを有する。いくつかの実施形態では、半透膜は、メッシュ開口率約１％～約５０％およびその間の範囲または百分率（例えば、約２％）を有する／含む。

種々の実施形態では、アルギン酸溶液は、高純度アルギン酸溶液である。種々の実施形態では、アルギン酸溶液は、約０．５％～約２．０％のアルギナートおよびその間の範囲または百分率、必要に応じて約１．２％アルギナートを含むか、またはから本質的になる。

種々の実施形態では、培養培地は完全培地である。

種々の実施形態では、方法は、一定期間の貯蔵後に貯蔵容器を病院に輸送する工程をさらに含む。かかる期間は、本明細書中に開示の期間であり得る。

種々の実施形態では、方法は、半透膜中、または培養室中、または貯蔵容器中の温度を１０℃未満（例えば、約０℃～約４℃およびその間の範囲、または約４℃）に維持する工程をさらに含む。

種々の実施形態では、半透膜、または培養室、または貯蔵容器中のＣＯ_２レベル、またはＯ_２レベル、または湿度、またはこれらの任意の組み合わせは、人工的に制御されない。

種々の実施形態では、方法は、例えば、カプセル化組織（複数可）または臓器（複数可）をキレート溶液に曝露する工程を含む方法によって、移植前にアルギン酸ゲルを溶解する工程をさらに含む。さらなる実施形態では、キレート溶液は、クエン酸ナトリウム溶液またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液またはクエン酸ナトリウムおよびＥＤＴＡの両方を含む溶液を含むか、から本質的になるか、またはさらにからなる。さらにまたはあるいは、アルギン酸ゲルは、手作業による摘出などによって機械的に取り出され得る。

種々の実施形態では、方法は、例えば、移植前に半透膜を分解する工程をさらに含む。

種々の実施形態では、本明細書中に開示の方法を使用して進められた組織（複数可）または臓器（複数可）（例えば、提供時に移植のために生存し続けているもの）は、例えば、アルギン酸ゲル中、または半透膜中、またはアルギン酸ゲル中および半透膜中の両方にカプセル化することなく貯蔵された組織または臓器と比較して、炎症性因子（複数可）の放出を低下させる。さらなる実施形態では、炎症性因子（複数可）は、一酸化窒素、またはサイトカインのうちの１つ以上、または一酸化窒素およびサイトカインのうちの１つ以上の両方を含むか、から本質的になるか、またはさらにからなる。

種々の実施形態では、本明細書中に開示の方法を使用して加工した組織（複数可）または臓器（複数可）（例えば、提供時に移植のために生存し続けているもの）は、カプセル化工程前または得る工程（すなわち、例えば、被験体から組織（複数可）または臓器（複数可）を得ることを含むか、から本質的になるか、またはからなる工程）後の細胞生存率の少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％またはそれより高い細胞生存率を維持する。

種々の実施形態では、方法は、培養培地の注入前に、緩衝液（生理食塩水など）を、アルギン酸ゲルもしくは培養室または培養室中のアルギン酸ゲル中に注入する工程をさらに含む。さらなる実施形態では、緩衝液（生理食塩水など）によって可溶性のカルシウムまたはバリウムを軽減させるか除去する。

本明細書中に開示の方法の非限定的な例では、組織を、半透膜室としての機能を果たす透析装置（Ｔｕｂｅ－Ｏ－ＤＩＡＬＹＺＥＲ（商標）、Ｇ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＭＯ，ＵＳＡなど）に入れ、アルギン酸溶液で満たす。さらなる実施形態では、アルギン酸溶液は、１．２％アルギナートを含むか、またはから本質的になる。さらにまたはあるいは、透析装置は、５０ｋＤａカットオフ半透膜を備えている。なおさらなる実施形態では、アルギン酸溶液は、カルシウム溶液またはバリウム溶液またはその両方によって架橋／ゲル化され、必要に応じて通常の生理食塩水で洗浄され、次いで、完全培地中で貯蔵される。

別の態様では、本開示は、組織運搬システムを提供する。例えば、図４Ａは、組織運搬システムの一部を形成することができる組織培養デバイスを示す。組織培養デバイスは、インレットであって、前述のインレットを通過する流体の流入を可能にするように構築されたインレット、およびアウトレットであって、前述のアウトレットを通過する流体の流出を可能にするように構築されたアウトレットを画定する外室（本明細書中で「培養室」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、個別の入口および出口を有する代わりに、外室は、外室の内外に流体を連通させるために選択的に使用することができる単一のポートを有し得る。いくつかの実施形態では、流体は、アルギン酸溶液、カルシウム溶液、バリウム溶液、生理食塩水、培養培地、または貯蔵培地のうちの少なくとも１つを含み得る。外室は囲まれている（すなわち、閉じた内部体積を画定する）。

また、組織培養デバイスは、外室内に配置された内室（本明細書中で「組織室」とも称される）を含む。内室は、半透膜から形成された少なくとも１つの壁（例えば、半透膜から形成された壁の一部、キャップ、または底部）を有する。種々の実施形態では、半透膜は、メッシュを含むか、またはから本質的になるか、あるいはからなる。いくつかの実施形態では、半透膜は、バッグストレーナ構造物または細胞ストレーナ様構造であり得る。例えば、内室は、組織がバッグ内に入れられ、次いで、バッグが外室内に配置されるように半透膜またはメッシュから形成されたバッグを含み得る。いくつかの実施形態では、内室は、非多孔質材料（例えば、プラスチック、ポリマー、または金属）から形成された壁を含んでよく、内室のキャップは、少なくとも一部が半透膜から形成され得る。内室は囲まれており（すなわち、閉じた内部体積を画定する）、内室内に組織を保持または含むように構成されており（例えば、組織の保存または輸送用）、組織または臓器を取り囲むかカプセル化するアルギン酸ゲルを含む。いくつかの実施形態では、保存／輸送すべき組織を内室に入れた後、アルギン酸溶液が内室に添加される。例えば、組織がアルギン酸溶液に浸漬されて内室に入れられ得るか、または組織を含む内室がアルギン酸溶液で満たされ得る。次いで、カルシウム溶液またはバリウム溶液またはその両方は、インレットを介して外室中に連通される。他の実施形態では、カルシウム溶液またはバリウム溶液の両方は、内室が外室中に配置される前に、（例えば、カルシウム溶液および／またはバリウム溶液で満たされた容器中に内室を浸漬することによって）内室中に連通され、組織をカプセル化するアルギナートまたは他のポリマー網が内室内に形成された時点で、内室が外室中に配置される。いくつかの実施形態では、内室内の組織は、アルギン酸溶液、カルシウム溶液、バリウム溶液、または培養培地のうちの１つ以上などの溶液に浸漬され得る。さらなる実施形態では、内室から組織が放出されることなく溶液が除去または置換され得る。

アルギン酸ゲルを本明細書中で一般的に記載しているが、組織が任意の他の架橋ゲル（例えば、ヒドロゲルまたは親水性ポリマー網、例えば、アガロース、メチルセルロース、ヒアルロナン、エラスチン様ポリペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリラート）（ＰＨＥＭＡ）、２－ヒドロキシエチルメタクリラート（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）、ＰＥＧ－ＰＥＧＭＡ、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アクリルアミド／アクリル酸コポリマー、直鎖カチオン性ポリアリル塩化アンモニウム、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）、キトサン、アクリラート修飾ＰＥＧおよびアクリラート修飾ヒアルロン酸、アミン末端官能化４アームスターＰＥＧ、任意の他の適切なヒドロゲルもしくはポリマーまたはこれらの組み合わせ）にカプセル化され得ることを認識すべきである。いくつかの実施形態では、本明細書中で使用されるゲルは、例えば、溶液との接触（キレート溶液へのアルギン酸ゲルの溶解など）によってｉｎ ｖｉｖｏで部分的または完全に脱重合する。さらにまたはあるいは、本明細書中で使用されるゲルは、ゲル中を培養培地、カルシウム溶液、バリウム溶液、またはキレート溶液が流れることが可能である。組織をカプセル化するゲル（例えば、本明細書中に記載のアルギン酸ゲルまたは任意の他のゲルもしくはポリマー）には、内室内に配置された組織を、組織が使用されるまで保護するという利点がある。さらに、内室の少なくとも一部を形成する半透膜またはメッシュは、流体（例えば、カルシウム溶液、バリウム溶液、生理食塩水、培養培地、または貯蔵培地）が内室の内部体積と連通するように流体が半透膜またはメッシュを通過して流れることを可能にしながら、組織をカプセル化するアルギン酸ゲルまたは任意の他のゲルもしくはポリマーが内室外に漏れ出すのを防止する。

種々の実施形態では、本明細書中に開示のゲル（アルギン酸ゲルなど）は、本明細書中に開示のキレート溶液（ＥＤＴＡ溶液またはクエン酸ナトリウム溶液など）にゲルを曝露する工程を含むか、から本質的になるか、あるいはからなる方法によって溶解され得る。さらにまたはあるいは、本明細書中に開示のゲルは、過剰量の生理食塩水にゲルを曝露する工程を含むか、から本質的になるか、あるいはからなる方法によって溶解され得る。

いくつかの実施形態では、半透膜は、流体を内室中に連通させながら内室からアルギン酸溶液またはアルギン酸ゲルが漏れるのを防止するように構築された多孔性（例えば、孔径が少なくとも約２５０ｐｍ、例えば、約０．２２μｍ～約１，０００μｍ、約０．２２μｍ～約１００μｍ、約１００μｍ～約１，０００μｍ、およびその間の任意の範囲）を有し得る。いくつかの実施形態では、内室は、透析カセット（例えば、ＳＩＧＭＡ ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標）から入手可能な商品名ＳＬＩＤＥ－Ａ－ＬＹＺＥＲの透析カセット）を含み得る。

外室内に既存ではない場合、内室は、その後に、入口および出口を有する外室に入れられる。アルギン酸溶液は、その後に、カルシウム溶液またはバリウム溶液またはその両方を培養室の入口に添加することによってゲル化され得る。ゲル化後、カルシウム溶液またはバリウム溶液またはその両方は、生理食塩水または培養培地を注入することによって（例えば、カルシウム溶液またはバリウム溶液またはその両方をアウトレットチャンバーのアウトレットから排出させることによって）洗浄される。

また、組織培養デバイスまたはシステムは、囲まれた貯蔵容器（本明細書中で「ボックス」とも称される）を含み、その内部では、外室、ひいては内室が貯蔵容器によって画定された内部体積内に配置されている。例えば、外室からアルギン酸ゲルを洗浄した後に、外室は、貯蔵容器に入れられる。いくつかの実施形態では、温度センサは、貯蔵容器に動作可能に連結され、例えば、確実に組織を輸送中に所望の温度（例えば、摂氏１０度未満）に維持するために貯蔵容器内の温度を測定するように構成されている。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、貯蔵容器内に配置された断熱構成要素または冷却構成要素のうちの少なくとも１つも含み得る。断熱構成要素または冷却構成要素は、貯蔵容器および／または外室内の温度を１０℃未満に維持するように構成されている。

貯蔵容器は、４～８週間まで貯蔵され得るか、移植のために病院に輸送され得るか、４～８週間まで貯蔵され、かつ移植のために病院に輸送され得る。手術室において、貯蔵培地は、溶解緩衝液と数分間置換される。その後に、内室が取り外され、アルギン酸ゲル中にカプセル化組織はＥＤＴＡまたはクエン酸ナトリウム溶液に移されてアルギン酸ゲルが溶解される。アルギン酸ゲルが溶解した時点で、被験体への移植の準備において組織が回収され、生理食塩水で洗浄される。

図４Ｂ～４Ｆは、別の実施形態の組織培養デバイス１００および組織培養デバイス１００の種々の構成要素の種々の絵図である。組織培養デバイス１００は、外室１１０または培養室および少なくとも一部が外室１１０の内側に配置された内室１２０または組織室を含む。

図４Ｄに示すように、外室１１０は、流体格納部１１１および流体格納部１１１の上端部に連結された外室キャップ１１２を含む。流体格納部１１１は、内室１２０の少なくとも一部を受け入れ、かつ流体（例えば、培地、生理食塩水、カルシウム溶液、洗浄液、キレート溶液など）を含むように構築された内部体積を画定する。図４Ｂ～４Ｄに示すように、流体格納部１１１は、円形断面を画定し得る。他の実施形態では、流体格納部１１１は、正方形、長方形、楕円形、長円形、多角形、または任意の他の好適な断面形状を有し得る。いくつかの実施形態では、流体格納部１１１は、透明または半透明の材料（例えば、アクリル、プラスチック、ガラスなど）から形成され得る。

外室キャップ１１２は、流体格納部１１１の上端部に取り外し可能にまたは固定して連結され得る。いくつかの実施形態では、外室キャップ１１２は、例えば、ねじ山、摩擦嵌合、スナップ嵌合、締まり嵌め、または任意の他の好適な連結機構によって格納部１１１に取り外し可能に連結され得る。外室キャップ１１２は、これを通り抜けて開口１１４を画定し、開口１１４は、これを通り抜けて内室１２０の少なくとも一部を受けるように構成されている。流体格納部１１１中に流体を連通するための入口１１５、および流体格納部１１１の外部に流体を連通するための出口１１７は、外室キャップ１１２を通り抜けて画定されている。いくつかの実施形態では、入口１１５および出口１１７は、開口１１４と外室キャップ１１２の外周との間に対向して画定され得る。本明細書中に記載のように、ねじ山１１６は、開口１１４の内壁に画定され、内室１２０上に画定された対応する嵌合ねじ山と嵌合するように構成され得る。

図４Ｅ～４Ｆに示すように、内室１２０は、組織格納部１２１および組織格納部１２１の上端部に連結された内室キャップ１２２を含む。組織格納部１２１は、この内部に組織（例えば、本明細書中に記載の組織のいずれか）を保持するように構築された内部体積を画定する。いくつかの実施形態では、組織格納部１２１の少なくとも一部は、半透膜（例えば、本明細書中に記載の半透膜または医療グレードのメッシュなどのメッシュのいずれか）から形成される。例えば、組織格納部１２１の底部のみが、完全にまたは少なくとも部分的に（少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またはそれを超えるなど）半透膜から形成され得るか、組織格納部１２１の壁のみが、完全にまたは少なくとも部分的に（少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またはそれを超えるなど）半透膜から形成され得るか、組織格納部１２１の壁および底部の両方が、完全にまたは少なくとも部分的に（少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またはそれを超えるなど）半透膜から形成され得る。いくつかの実施形態では、組織格納部１２１内に配置された組織は、アルギン酸ゲル中にカプセル化される。

内室キャップ１２４は、組織格納部１２１の上端部に連結している。例えば、第１の一連のねじ山１２３は、組織格納部１２１の上端部の内面上に画定され得る。内室キャップ１２４は、内室キャップ１２４の底部から組織格納部１２１に向かって突出した突出部１２６を含み得る。一連の嵌合ねじ山１２５は、突出部１２１の外面上に放射状に画定され、内室キャップ１２４が組織格納部１２１に連結するように第１の一連のねじ山１２３と嵌合し得る。

また、第２の一連のねじ山１２７は、組織格納部１２１の上端部の外面上に放射状に画定され得、開口１１４の内壁上に画定されたねじ山１１６と嵌合するように構成されている。組織格納部１２１は、内室１２０を外室１１０に固定するために第２の一連のねじ山１２７がねじ山１１６と嵌合するまで、外室キャップ１１２の開口１１４を通り抜けて流体格納部１１１に挿入されるように構成されている。いくつかの実施形態では、組織格納部１２１を流体格納部１１１の内側に配置した場合に、キャップ１２４が開口１１４を通り抜けて挿入できず、外室１１０の外側に配置されたままになるように、内室キャップ１２４の断面幅（例えば、直径）は、開口１１４の断面幅（例えば、直径）より大きい。いくつかの実施形態では、組織格納部１２１を外室キャップ１１２から抜き取る場合に組織格納部１２１から内室キャップ１２４が外れるのを防止するために、内室キャップ１２４の嵌合ねじ山１２５に連結した第１の一連のねじ山１２３は、開口１１４のねじ山１１６に連結した第２の一連のねじ山１２７と反対方向に向かい得る。操作時に、使用者は、内室１２０を外室１１０に連結するか、外室１１０から内室１２０を外すために、内室キャップ１２４によって内室１２０を保持し得る。組織培養デバイス１００は、本明細書中に記載のように、輸送のために貯蔵容器またはボックスに配置される。

１つの態様では、半透膜（本明細書中で組織室または半透膜室とも称される）を備えた内室を含む外室（本明細書中で培養室とも称される）を含むか、から本質的になるか、またはさらにからなるシステムを提供する。本明細書中に開示の任意の態様に関する種々の実施形態では、内室の壁は、完全にまたは少なくとも部分的に（少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またはそれを超えるなど）半透膜から形成され得る。

いくつかの実施形態では、半透膜は、少なくとも約２５０ｐｍ、例えば、約０．２２μｍ～約１００μｍおよびその間の範囲、約０．２２μｍ～約１０００μｍおよびその間の範囲、または約１００μｍ～約１０００μｍおよびその間の範囲の孔径を有する。

いくつかの実施形態では、半透膜は、メッシュ開口率約１％～約５０％およびその間の範囲または百分率（例えば、約２％）を有する。

いくつかの実施形態では、半透膜のＭＷＣＯは、約５０ｋＤａまたは約２００、０００ｋＤａである。

種々の実施形態では、内部容器（本明細書中で内室とも称される）を、アルギン酸溶液を満たした後に閉じ、外部容器（本明細書中で外室とも称される）中に固定することができる。さらにまたはあるいは、内部容器／内室を、移植のために手術室で組織を回収するために外部容器／外室から取り出すことができる。

種々の実施形態では、外部容器（本明細書中で外室とも称される）は、架橋溶液（すなわち、カルシウム溶液、バリウム溶液、またはその両方（例えば、塩化カルシウム溶液または塩化バリウム溶液）などのアルギン酸溶液をゲル化する溶液）または溶解溶液（すなわち、キレート溶液（例えば、ＥＤＴＡ溶液もしくはクエン酸ナトリウム溶液またはＥＤＴＡとクエン酸ナトリウムの両方を含む溶液）などのアルギン酸ゲルを溶解する溶液）を注入するための入口および出口を含む。したがって、内部容器（本明細書中で内室とも称される）を開けることなく、アルギナートのゲル化またはアルギナートの溶解を無菌的に行うことができる。

１つの態様では、アルギン酸ゲルおよび必要に応じた半透膜を備えた新規にデザインされた包埋型のシステムまたは装置を本明細書中に提供する。

いくつかの実施形態では、システムまたは装置は、臨床現場への組織の輸送中の機械的損傷から組織をいくらか保護する。いくつかの実施形態では、組織を、アルギナートを有する装置またはシステムに包埋する。

いくつかの実施形態では、システムまたは装置は、臨床現場への組織の輸送中の機械的損傷から組織をいくらか保護する。いくつかの実施形態では、組織は、アルギナートを用いて装置またはシステム中に包埋され、４℃で貯蔵され、第１の場所（臓器バンクなど）から第２の場所（病院など）に移される。

いくつかの実施形態では、単一の装置（すなわち、本明細書中に記載のシステム）を使用して包埋、貯蔵、および移動を行う。いくつかの実施形態では、組織を装置またはシステムに入れた後に、アルギン酸溶液およびカルシウム溶液を、装置またはシステムに添加して、組織を取り囲むかカプセル化する。いくつかの実施形態では、組織を半透膜室に入れ、アルギン酸溶液、およびカルシウム溶液（あるいは、バリウム溶液またはバリウム塩およびカルシウム塩を含むか、またはから本質的になる溶液）をチャンバーに添加する。いくつかの実施形態では、アルギナートは、カルシウム溶液もしくはバリウム溶液、またはその両方をチャンバーに添加することによってゲル化される。いくつかの実施形態では、ゲル化後、アルギン酸ゲルは、生理食塩水または培養培地を注入して過剰なカルシウムまたはバリウム（すなわち、可溶性のカルシウムまたはバリウム）を除去することによって洗浄される。

いくつかの実施形態では、半透膜室（すなわち、内室）は、培養室（すなわち、外室）中に閉じ込められているか、固定されている。いくつかの実施形態では、２つの二層チャンバーは、温度センサを備えた外側のボックス（すなわち、貯蔵容器またはボックス）中に入れられている。

いくつかの実施形態では、組織は、次いで、少なくとも約２週間（少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、またはそれより長期間など）貯蔵される。さらにまたはあるいは、組織は、４週間まで、または６週間まで、または８週間まで、または１０週間まで貯蔵される。いくつかの実施形態では、組織は、次いで、約２週間～約３週間、約２週間～約４週間、約２週間～約５週間、約２週間～約６週間、約２週間～約７週間、約２週間～約８週間、約２週間～約９週間、約２週間～約１０週間、約３週間～約４週間、約３週間～約５週間、約３週間～約６週間、約３週間～約７週間、約３週間～約８週間、約３週間～約９週間、約３週間～約１０週間、約４週間～約５週間、約４週間～約６週間、約４週間～約７週間、約４週間～約８週間、約４週間～約９週間、約４週間～約１０週間、約５週間～約６週間、約５週間～約７週間、約５週間～約８週間、約５週間～約９週間、約５週間～約１０週間、約６週間～約７週間、約６週間～約８週間、約６週間～約９週間、約６週間～約１０週間、または各々の間の任意の範囲で貯蔵される。いくつかの実施形態では、組織は、４～８週間まで保存される。

いくつかの実施形態では、２つのチャンバーを備えた外側のボックスは、病院に輸送される。いくつかの実施形態では、病院への到着後、アルギン酸ゲルは、手術室において装置またはシステム中でクエン酸ナトリウムまたはＥＤＴＡを用いて溶解される。いくつかの実施形態では、手術室において、貯蔵培地（例えば、培養培地）は、溶解緩衝液と数分間置換される。いくつかの実施形態では、半透膜室は解体され、アルギン酸ゲルを有する組織はＥＤＴＡ溶液に移されてアルギン酸ゲルが溶解される。いくつかの実施形態では、組織は、移植のためにアルギン酸ゲルから回収され、生理食塩水で洗浄される。

組織運搬システムは、標準的な液体ベースの組織貯蔵システムを超えるいくつかの利点を提供する。組織保存条件は、アルギン酸ゲルに包埋することによって改善される。組織は、病院への組織の輸送中の衝撃、振動、または揺れから保護される。そのようなものとして、輸送による組織の損傷を防止することができる。さらに、本明細書中に示すように、細胞生存率が改善され、炎症性因子（サイトカインおよび一酸化窒素など）が抑制される。１つの囲まれたシステムで貯蔵段階および輸送段階がまかなえる。

いくつかの実施形態では、組織運搬システムおよび／または組織培養デバイスは、キット中に提供され得る。例えば、キットは、外室（例えば、外室１１０または図４Ａに記載の内室）、および内室（例えば、内室１２０または図４Ａに記載の内室）を含む組織培養デバイスを含み得る（例えば、を含み得るか、から本質的になり得るか、あるいはからなり得る）。また、キットは、断熱および／または冷却構成要素、ならびに温度センサを有し得る貯蔵容器またはボックス（例えば、図４Ａに記載のもの）を含み得る（例えば、さらに含み得る）。また、キットは、アルギン酸溶液または任意の他のヒドロゲル溶液を含む容器またはバイアル、カルシウム溶液またはバリウム溶液またはその両方を含む容器またはバイアル、カルシウム塩またはバリウム塩またはその両方を含む容器またはバイアル、洗浄液（例えば、生理食塩水または本明細書中に記載の任意の他の溶液）および／もしくは培養培地（例えば、本明細書中に記載の培養培地のいずれか）で満たされた容器またはバイアルを含み得る（例えば、さらに含み得る）。また、キットは、本明細書中に記載の組織培養デバイスを使用するための書面での説明書またはダウンロード可能な説明書を含み得る。種々の実施形態では、本明細書中に開示のキットは、本明細書中に開示の組織培養デバイスおよび必要に応じた使用説明書を含むか、またはから本質的になる。種々の実施形態では、本明細書中に開示のキットは、以下のうちの１つ以上をさらに含む：アルギナートもしくは任意の他のヒドロゲル単量体の必要に応じた溶液、カルシウム溶液、バリウム溶液、カルシウム塩、バリウム塩、溶媒、洗浄液、または培養培地。

以下の実施例は、本開示の例示を意図するが、制限を意図しない。
実施例１
ブタ膝から採取した骨軟骨同種移植片の性能に対する高純度アルギン酸の効果についてのｉｎ ｖｉｔｒｏ評価

方法
移植片の調製および貯蔵条件－骨軟骨コア（ｎ＝２５）を、屠殺後４８時間以内に食肉処理場から入手した５頭の成熟した雌豚の１０の膝から採取した。無菌条件下で、骨軟骨コアを、特別注文の４．０ｍｍビットのドリルを用いたコアリングによって、内側または外側の大腿骨顆のいずれかから採取した。貯蔵前に、コアボーンを、骨の軟骨に対する厚さの比４：１になるようにトリミングした。軟骨下骨を、空気を用いたパルス洗浄に供して骨髄成分を除去し、その後に、通常の生理食塩水を用いて完全にリンスした。各骨軟骨コアを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を有するＤＭＥＭ／Ｆ１２中で一晩貯蔵し、次いで、個別の滅菌５ｍＬ培養管に入れて、各コアに割り当てた以下の条件にしたがって４℃で貯蔵した（図１）：（１）対照群－１．５ｍＬ完全培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ）中で貯蔵；（２）ＵＰＡＬ溶液（ｓｏｌ）群－完全培地に溶解した１．５ｍｌ ＵＰＡＬ溶液（１．２％）中で貯蔵；（３）ＵＰＡＬゲル群－通常の生理食塩水によって溶解した１．２％ＵＰＡＬゲルを用いてカプセル化し、１．５ｍｌ完全培地中で貯蔵。２８日間の貯蔵後、各試料を、３７℃で２４時間加温し、次いで、全層軟骨を骨から取り出して、下記の評価を行った。

軟骨細胞生存率－全ての全層軟骨の深さにわたる軟骨細胞生存率（ｎ＝４）を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤキットを使用して分析し、共焦点レーザー顕微鏡法を使用して画像化した。垂直方向のプロフィールについて、軟骨の厚さ全体および以下の軟骨の区域についての生存率を計算した：表面（上部１５％）、中間部（３５％）、および深部（５０％）。

プロテオグリカン（ＰＧ）含有量－各軟骨コアにおけるＰＧ含有量（ｎ＝６）を、ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）アッセイ（湿重量によって正規化）を使用して測定した。

ＰＧ合成－放射性標識した^３５Ｓ－硫酸塩の硫酸化ＰＧへの組み込み（ｎ＝６）を、ＰＧ合成の指標として高速アルシアンブルー濾過アッセイ（Ｍａｓｕｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４：１６７）によって測定した。

ＰＧ代謝回転－培地および軟骨消化物（ｎ＝６）中の^３５Ｓ－ＰＧの数／量を測定し、^３５Ｓ－ＰＧの総合成量に対する組織中の^３５Ｓ－ＰＧ残存量を、ＰＧ代謝回転として査定した（Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ．１９８６：１０１７）。

一酸化窒素（ＮＯ）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ－３（ＭＭＰ－３）濃度－２８日目に回収した貯蔵培地を、市販のアッセイキットを使用して総ＮＯ（ｎ＝６）およびＭＭＰ－３（ｎ＝４）濃度についてアッセイした。

組織学－各ＯＣＡ（ｎ＝７）の垂直方向の中間の切片（５μｍ）を、ヘマトキシリンおよびエオシンまたはサフラニン－Ｏのいずれかで染色した。この実験に関して盲検化された観察者が組織学的切片を分析し、修正したＯ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌ組織学的スコアリングシステム（Ａｏｔａ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｉｎｅ ２００５：７２２）を使用して切片を格付けした。

統計解析－全てのデータを、平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。データを、比較のために二元配置反復分散分析（ＡＮＯＶＡ）または一元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計的に解析した。０．０５未満のＰ値を、統計的に差があると見なす。

結果
軟骨細胞生存率－ＵＰＡＬゲル群の表面領域中の軟骨細胞の生存率（４５．４±２０．１％）は、対照群の生存率より有意に高かった（１８．６±１０．７％、ｐ＜０．０５；図２）。

プロテオグリカン（ＰＧ）含有量－２８日目のＰＧ含有量に有意差は認められなかった（対照：２７６．０±４０．５μｇ／ｍｇ、ＵＰＡＬ溶液：３２９．１±５４．０μｇ／ｍｇ、ＵＰＡＬゲル：３１４．２±４９．３μｇ／ｍｇ）。

ＰＧ合成－ＵＰＡＬゲル群（３３１９２．８±１５９０６．４ＣＰＭ／ｍｇ）におけるＰＧ合成は、２８日目に対照群（１２７４８±２６９９ＣＰＭ／ｍｇ、ｐ＜０．０５）より有意に高かった。２８日目の^３５Ｓ組み込みは、全ての群において１日目と比較して有意に減少した（２０７３８１１±４９６２５８ＣＰＭ／ｍｇ、ｐ＜０．０１）。

ＰＧ代謝回転－２８日目の組織中の^３５Ｓ－ＰＧ残存に有意差は認められなかった。

貯蔵培地中の一酸化窒素（ＮＯ）およびマトリックスメタロプロテイナーゼ－３（ＭＭＰ－３）の濃度－対照群における総ＮＯ産生（３．８±２．４μＭ／ｍｇ）は、２８日目のＵＰＡＬ溶液群（１．０±０．８μＭ／ｍｇ、ｐ＜０．０１）およびＵＰＡＬゲル群（１．５±０．８μＭ／ｍｇ、ｐ＜０．０１）より有意に高かった。２８日目の貯蔵培地における３つの条件の間でＭＭＰ－３レベルに有意差は認められなかった。

組織学－対照群における軟骨の基質のサフラニン－Ｏ染色は不十分であり、かつ細胞充実性が低かったのに対して、ＵＰＡＬゲル群におけるＯＣＡは十分に基質が染色され、細胞充実性がほぼ正常であった。ＵＰＡＬゲル群における総組織学的スコア（１３．９±１．１）は、対照群より有意に高かった（１２．０±１．３、ｐ＜０．０１；図３）。

実施例２
実施例１は、高純度アルギン酸（ＵＰＡＬ）ゲルカプセル化の使用が２８日間の貯蔵後の骨軟骨移植片の品質の改善に有効であることを示した。臨床における移植片の利用可能性を高めるためには、貯蔵期間を延長することが重要である。第１に、実施例２は、６週間までの軟骨の貯蔵期間の延長に成功したことを示した。さらに、本出願は、他の組織（半月板、腱、および角膜）にまで及んだ。第２に、ＵＰＡＬを用いて貯蔵条件を改善するために、延長した貯蔵期間中の細胞生存率に対するＵＰＡＬの異なるゲル化条件の効果を研究した。この実験のエンドポイントが現在の組織保存プロトコールのエンドポイントの１．５倍（６週間）であることに注目すべきである。重要なことに、生存組織貯蔵期間が延長されると、移植片組織の利用可能性がより高まる。組織貯蔵期間中のＵＰＡＬゲルの使用は、貯蔵期間中の細胞生存率および組織の構造維持に有利であり、また、輸送中の充填材料として物理的に保護する。

方法
移植片の調製および貯蔵条件－骨軟骨コア、半月板、膝蓋腱、および角膜を、幼若ミニブタ（６月齢）から採取した。無菌条件下で、骨軟骨コアを、特別注文の４．０ｍｍドリルビットを用いたコアリングによって、内側または外側の大腿骨顆のいずれかから採取した。軟骨下骨を、空気を用いたパルス洗浄に供して骨髄成分を除去し、その後に、通常の生理食塩水を用いて完全にリンスした。貯蔵前に、コアボーンを、骨の軟骨に対する厚さの比４：１になるようにトリミングした。内側半月板および外側半月板由来の組織を、スキンピンチ（４ｍｍ）を用いて打ち抜き、膝蓋腱を無菌的に切開し、５×１０ｍｍに刻んだ。また、硝子体を有する角膜組織を切開し、５×１０ｍｍの移植組織を調製した。各移植片組織を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を有するＤＭＥＭ／Ｆ１２中で一晩貯蔵し、次いで、個別の滅菌５ｍＬ培養管に入れて、各コアに割り当てた以下の条件にしたがって４℃で貯蔵した（図５）：（１）対照群－３ｍＬ完全培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ）中で貯蔵；（２）ＵＰＡＬ溶液（ｓｏｌ）群－完全培地に溶解した３ｍｌ ＵＰＡＬ溶液（１．２％）中で貯蔵；（３）ＵＰＡＬゲルコーティング群－１．２％ＵＰＡＬゲル（カルシウム溶液によって架橋し、通常の生理食塩水を用いて洗浄したおよそ１ｍｌのＵＰＡＬ）を用いてカプセル化し、３ｍｌ完全培地中で貯蔵；および（４）ＵＰＡＬ膜群：ＵＰＡＬゲルコーティング群に記載のように調製した組織を、５０ｋＤａカットオフ半透膜を備えた透析装置（Ｔｕｂｅ－Ｏ－ＤＩＡＬＹＺＥＲ（商標）、Ｇ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＭＯ，ＵＳＡ）に入れ、１．２％アルギン酸溶液で満たした。１つの移植片を含む管を、０．１Ｍ ＣａＣｌ_２溶液に３０分間浸漬してゲル化を促進した。次いで、管を生理食塩水で洗浄し、４０ｍｌ完全培地で満たした５０ｍｌ培養管に入れた。関節軟骨、半月板、およびアキレス腱を６週間貯蔵したのに対して、角膜組織を２週間貯蔵した（全て４℃）。

６週間の貯蔵後、各試料を、３７℃で２４時間加温し、次いで、組織を３０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液に５分間入れてアルギン酸ゲルを溶解した。細胞生存率を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤキットを使用して分析し、共焦点レーザー顕微鏡法を使用して画像化した。垂直方向のプロフィールについて、生存率を、大津の二値化法を使用し、その後にＩｍａｇｅ－Ｊプログラムの粒子解析機能を使用して計算した。生存率を、エンドポイントでの生存率／元の細胞生存率として表した。

統計解析－全てのデータを、平均±標準誤差（ＳＥ）として表す。データを、複数の検定のためのボンフェローニ補正によって調整した一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）またはクラスカル・ワリス検定を使用して統計的に解析した。０．０５未満のＰ値を、統計的に差があると見なす。

結果
関節軟骨－６週間目に、ＵＰＡＬ膜群の表面領域中の軟骨細胞の生存率は、培地群より有意に高かった（ｐ＜０．０５；図６Ａ）。６週間目に、ＵＰＡＬｓｏｌ群およびＵＰＡＬゲルコーティング群における軟骨細胞の生存率はより高い傾向を示したが、サンプルサイズに起因して統計的有意性は認められなかった。

半月板－半月板細胞の生存率は、６週間後の培地群において有意に低下した（図６Ｂ）。ＵＰＡＬｓｏｌ群、ＵＰＡＬゲルコーティング群、およびＵＰＡＬ膜群は、培地群より細胞生存率が有意に高かった。

膝蓋腱－半月板において認められるように、膝蓋腱内の細胞の生存率は、６週間後に培地群において有意に低下した。ＵＰＡＬゲルコーティング群およびＵＰＡＬ膜群における細胞生存率は、培地群よりも有意に高かった（図６Ｃ）。

角膜－２週間後、ＵＰＡＬ膜群における角膜組織の細胞生存率は、培地群より有意に高かった（図６Ｄ）。ＵＰＡＬ膜群の細胞生存率は、元の組織と有意差はなかった。

均等物
別段の定義がない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本テクノロジーに属する当業者が一般的に理解している意味を有する。

本明細書中に例示的に記載された本テクノロジーは、本明細書中に具体的に開示されていない任意の構成要素（または複数）、限度（または複数）の非存在下で適切に実施され得る。したがって、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などは、広義かつ無制限に解釈されるものとする。さらに、本明細書中で使用した用語および表現は、制限のためではなく説明のために使用されており、かかる用語および表現の使用が、表示および記載の特徴の任意の等価物またはその一部を排除することを意図しないが、特許請求の範囲に記載の本テクノロジーの範囲内で種々の修正が可能であることが認識される。

したがって、本明細書中に提供した材料、方法、および実施例は、好ましい態様の代表であり、例であり、本テクノロジーの範囲を制限することを意図しないと理解されるべきである。

本テクノロジーを、本明細書中に広義かつ包括的に記載している。包括的開示の範囲内にあるより狭義の種および包括未満の群の各々も、本テクノロジーの一部を形成する。これには、切り取った資料を本明細書中で具体的に引用するかどうかと無関係に、但し書きまたは属から任意の主題を除いた消極的限定を含む本テクノロジーの包括的説明を含む。

さらに、本テクノロジーの特徴または態様がマーカッシュ群で記載されている場合、当業者は、本テクノロジーがマーカッシュ群のメンバーの任意の個別のメンバーまたはメンバーの下位集団に関しても記載されると認識するであろう。

本明細書中で言及した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の文献は、各々が個別に参照として援用される場合と同程度に、その全体が参照として明確に援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。

他の態様を、以下の特許請求の範囲内で記載する。

本開示は上記の実施例を参照して説明されているが、修正形態および変形形態が本開示の意図および範囲内に含まれると理解されるであろう。したがって、本開示は、以下の特許請求の範囲のみよって制限される。

Claims (40)

1. 骨軟骨組織、いかなる軟骨下骨も含まない関節軟骨、線維軟骨組織、腱、または角膜から選択される組織を保存する方法であって、前記組織をアルギン酸ゲル中にカプセル化する工程、および前記ゲルカプセル化組織を培養培地に曝露する工程を含む、方法。
2. 前記ゲルカプセル化組織が、約２４時間～約８週間から選択される期間、約２８日間、少なくとも約６週間、およびその間の範囲の期間にわたり培養培地に入れられる、請求項１に記載の方法。
3. 前記組織を半透膜中にカプセル化する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記半透膜は、孔径が少なくとも約２５０ｐｍ、孔径が約１００μｍ～約１０００μｍ、孔径が約０．２２μｍ～約１０００μｍ、または孔径が約０．２２μｍ～約１００μｍ、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）が約５０ｋＤａまたは約２００，０００ｋＤａ、またはメッシュ開口率が約１％～約５０％のうちの１つ以上の特徴を有する、請求項３に記載の方法。
5. 前記組織を、前記半透膜中にカプセル化した後にゲル中にカプセル化する、請求項３または４に記載の方法。
6. 前記組織を、前記半透膜中にカプセル化する前にゲル中にカプセル化する、請求項３または４に記載の方法。
7. 前記骨軟骨組織が、骨の軟骨に対する厚さの比が約２０：１～約１：１０、または約４：１およびその間の範囲を有するようにトリミングされた骨軟骨コアを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記線維軟骨組織が半月板、内側半月、または外側半月を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記腱が膝蓋腱またはアキレス腱である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記角膜が硝子体を有する角膜である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記アルギン酸ゲルが高純度アルギン酸（ＵＰＡＬ）ゲルである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記ＵＰＡＬが、約０．５％～約２．０％または約１．２％およびその間の範囲の濃度で存在する、請求項１１に記載の方法。
13. 前記培養培地が完全培地である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記培養培地が、前記ゲルカプセル化組織の前記培養培地への曝露後に補充されない、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記組織を、約１０℃未満、約０℃～約４℃、または約４℃およびその間の範囲から選択される温度に曝露する工程をさらに含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記カプセル化組織を、人工的に制御されたＣＯ_２レベル、人工的に制御されたＯ_２レベル、または人工的に制御された湿度のうちの１つ以上を用いて貯蔵しない、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記培養培地との曝露後に前記アルギン酸ゲルを溶解する工程をさらに含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記アルギン酸ゲルを、前記カプセル化組織をクエン酸ナトリウム溶液またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液またはクエン酸ナトリウムとＥＤＴＡの両方を含む溶液から必要に応じて選択されるキレート溶液に曝露する工程を含む方法によって溶解する、請求項１７に記載の方法。
19. 前記培養培地との曝露後に半透膜を分解する工程をさらに含む、請求項２～１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記カプセル化組織は、前記カプセル化を用いずに貯蔵された組織と必要に応じて比較して、サイトカインまたは一酸化窒素から必要に応じて選択される炎症性因子の放出を低下させる、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記移植前のカプセル化組織は、前記カプセル化工程前の細胞生存率の少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％またはそれより高い細胞生存率を維持する、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 組織輸送システムであって、
    （ａ）部分的にまたは全体が半透膜から形成され、輸送すべき組織およびアルギン酸溶液を含むように構成された組織室であって、前記組織室は囲まれている、組織室と、
    （ｂ）入口および出口を有し、前記組織室を含むように構成された培養室であって、カルシウム溶液またはバリウム溶液またはその両方を前記入口を介して添加すると、前記アルギン酸溶液がゲル化し、前記組織をカプセル化し、前記培養室は囲まれている、培養室と、
    （ｃ）前記培養室を含むように構成された輸送ボックスまたは貯蔵容器と、
    （ｄ）必要に応じて、前記輸送ボックスまたは前記貯蔵容器中に配置され、前記培養室の温度を測定するように構成された温度センサと
    を含む、組織輸送システム。
23. 前記アルギン酸溶液が高純度アルギン酸溶液である、請求項２２に記載のシステム。
24. 前記組織室が、前記半透膜によって前記組織がカプセル化されるように構成された囲まれた組織室である、請求項２２または２３に記載のシステム。
25. 前記半透膜が、孔径が少なくとも約２５０ｐｍ、孔径が約１００μｍ～約１０００μｍ、孔径が約０．２２μｍ～約１０００μｍ、または約０．２２μｍ～約１００μｍ、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）が約５０ｋＤａまたは約２００，０００ｋＤａ、またはメッシュ開口率が約１％～約５０％のうちの１つ以上の特徴を有する、請求項２２～２４のいずれか１項に記載のシステム。
26. 前記アルギン酸溶液が、約０．５％～約２．０％アルギナート、必要に応じて約１．２％アルギナートおよびその間の範囲を含む、請求項２２～２５のいずれか１項に記載のシステム。
27. 前記輸送ボックスまたは前記貯蔵容器または前記培養室が、前記輸送ボックスまたは前記貯蔵容器または前記培養室内の温度を１０℃未満、必要に応じて約０℃～約４℃、さらに必要に応じて約４℃に維持するように構成された断熱構成要素または冷却構成要素または断熱構成要素と冷却構成要素の両方をさらに含む、請求項２２～２６のいずれか１項に記載のシステム。
28. 前記システムが、前記半透膜内または前記培養室内または前記貯蔵容器内の前記ＣＯ_２レベル、もしくは前記Ｏ_２レベル、もしくは前記湿度、またはこれらの任意の組み合わせのセンサまたはコントローラを含まない、請求項２２～２７のいずれか１項に記載のシステム。
29. 前記輸送ボックスまたは前記貯蔵容器が、気体または液体の連続流に対して密封されている、請求項２２～２８のいずれか１項に記載のシステム。
30. 組織培養デバイスであって、
    流体の流入を可能にするように構築されたインレット、および内部を通過する流体の流出を可能にするように構築されたアウトレットを画定する外室であって、前記外室は囲まれている、外室と、
    少なくとも一部が前記外室内に配置されている内室であって、前記内室が半透膜から形成された少なくとも１つの壁を有し、前記内室は囲まれており、前記内室内に組織を保持するように構築されている、内室と、
    必要に応じた囲まれた貯蔵容器であって、前記外室、ひいては前記内室が、前記貯蔵容器によって確定された内部体積内に配置されている、貯蔵容器と
    を含む、組織培養デバイス。
31. 前記貯蔵容器に操作可能に連結されており、かつ前記貯蔵容器内の温度を測定するように構成された温度センサをさらに含む、請求項３０に記載の組織培養デバイス。
32. 前記組織がアルギン酸ゲルによってカプセル化されている、請求項２６に記載の組織培養デバイス。
33. 前記流体が、アルギン酸溶液、カルシウム溶液、バリウム溶液、生理食塩水、培養培地、または貯蔵培地のうちの少なくとも１つを含む、請求項３０～３２のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
34. 前記半透膜が、約５０ｋＤａまたは約２００、０００ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
35. 前記半透膜が少なくとも約２５０ｐｍの孔径を有する、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
36. 前記半透膜が、約０．２２μｍ～約１００μｍ、または約１００μｍ～約１，０００μｍ、または約０．２２μｍ～約１，０００μｍの範囲の孔径を有する、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
37. 前記半透膜が約１％～約５０％のメッシュ開口率を有する、請求項３０～３６のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
38. 前記貯蔵容器内に配置された断熱構成要素または冷却構成要素のうちの少なくとも１つをさらに含み、前記断熱構成要素または冷却構成要素のうちの前記少なくとも１つが、前記貯蔵容器および／または前記外室内の温度を１０℃未満に維持するように構成されている、請求項３０～３７のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
39. 請求項３０～３８のいずれか１項に記載の組織培養デバイスと、必要に応じた使用説明書とを含むキット。
40. アルギナートもしくは任意の他のヒドロゲル単量体であって必要に応じて溶液になったもの、カルシウム溶液、バリウム溶液、カルシウム塩、バリウム塩、溶媒、洗浄液、または培養培地のうちの１つ以上をさらに含む、請求項３９に記載のキット。
    

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