KR20050013594A - 캐놀라단백질분리물의 색 감소 - Google Patents
캐놀라단백질분리물의 색 감소Info
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Abstract
캐놀라기름씨들로부터의 캐놀라단백질분리물의 회수 시에 착색(colouring)성분들의 형성을 억제하고 착색성분들의 형성하는 경향이 있는 재료들이 덜 존재하도록 하는 단계들이 채택되어, 더 옅고 덜 노란 캐놀라단백질분리물을 얻는다.
Description
본 출원의 양수인에게 양도되고 그것들의 개시내용들이 참조로써 여기에 통합된 미국특허들인 제5,844,086호 및 제6,005,076호("Murray II)에는, 상당한 지방함량을 갖는 캐놀라기름씨거친가루를 포함하여 이러한 상당한 지방함량을 갖는 기름씨거친가루로부터 단백질분리물들을 분리하는 공정이 기재되어 있다. 이 공정에 연루된 단계들은 기름씨거친가루로부터 단백질성(proteinaceous)재료를 용해하고 또 그 거치가루 속의 지방을 용해하기도 하는 단계와, 결과적인 단백질수용액으로부터 지방을 제거하는 단계를 포함한다. 지방제거단계 전이나 후에 단백질수용액은 잔류 기름씨거친가루로부터 분리되어도 좋다. 그 후 지방제거된 단백질용액은 이온강도를 실질적으로 일정하게 유지하면서도 단백질농도를 증가시킬 수 있도록 농축된 다음, 농축된 단백질용액은 추가의 지방제거단계를 거쳐도 좋다. 그 후 농축된 단백질용액은 미셀형태의 이산단백질방울들과 같은 강하게 결합된 단백질분자들의 구름형 덩어리이 형성을 일으키도록 희석된다. 단백질미셀들은 응집되며, 합체되며, 밀한 비정질, 점착성의 글루텐유사 단백질분리물덩어리를 형성하도록 침전될 수 있고, 이러한 단백질분리물덩어리는 "단백질미셀덩어리" 또는 PMM이라고 하며, 잔류 수상(water phase)으로부터 분리되고 건조된다.
단백질분리물은 적어도 약 90wt%의 단백질함량(켈달 질소 또는 다른 편리한 방법의 N x 6.25로 결정됨)을 가지며, 실질적으로 비변성(시차주사열계량법에 의해 결정됨)이고 낮은 잔류지방함량을 가진다. 여기서 사용되는 "단백질함량"이란 용어는 건조중량기준으로 표현되는 단백질분리불 내의 단백질의 량을 말한다. 이 방식을 이용하여 얻어진 단백질분리물의 수율은, 건조된 단백질분리물로서 회수되는 기름씨거친가루로부터 추출된 단백질의 비율의 표현으로, 일반적으로 40wt%미만, 바람직하게는 20wt%였다.
전술한 Murray II 특허에 기재된 방식은 미국특허 제4,208,324호(Murray IB)에 기재된 바와 같이 기름씨들을 포함한 다양한 단백질원료들로부터 단백질분리물을 형성하는 절차에 대한 변형과 개량으로서 개발되었다. 미국특허 제4,208,323호가 발행될 때인 1980년에 입수 가능한 기름씨거친가루들은 Murray II 특허들의 시기에 입수 가능한 캐놀라기름씨거친가루들의 지방오염수준을 가지지 않고, 결과적으로, Murray IB 특허의 방식은 그러한 기름씨거친가루들로부터 90wt%를 넘는 단백질함량을 가지는 단백질성 재료들을 생산할 수 없다. Murray IB 특허에는 출발물질로서 평지씨(캐놀라)를 사용하여 행해지는 어떠한 구체적인 설비들도 기재되어 있지 않다.
Murray IB 특허 자체는 희석 전에 농축단계를 도입하여 PMM을 형성함으로써미국특허 제4,169,090호 및 4,285,862호(Murray IA)에 기재된 공정에 대한 개량으로 설계되었다. Murray IA 특허들은 평지씨에 관계된 하나의 실험을 기재하지만 생성물의 순도에 관한 표시는 제공하지 않는다. Murray IB 특허에 기재된 농축단계는 Murray IA 공정에 대해 대략 20% 정도 단백질분리물의 수율을 개선하는데 소용되었다.
이러한 종래 방식의 공정에 의해 생산된 캐놀라단백질분리물들의 하나의 난제는 비교적 짙은 노란색이고 바람직하지 못한 맛이라는 것이다. 페놀성 화합물들이 거친가루를 포함한 캐놀라단백질생성물들의 이러한 문제들에 대한 원인이 되는 것이라고 보고되어 있다. 캐놀라는 콩에서 발견되는 것에 비해 대략 10배의 량의 페놀성 화합물들을 함유하고 시나핀(sinapine)과 응측된 타닌들을 포함할 수도 있다. 산화로써, 페놀성 화합물들은 짙은 색이 전개되게 할 수 있다. 이 문제는 강한 알칼리성 조건들이 페놀성 화합물들을 퀴논들로 즉각 산화되게 하여 퀴논이 단백질과 반응하여 단백질과 그 용액에 짙은 녹색 또는 갈색을 부여하는 등전(isoelectric) 침전에 의해 생성된 캐놀라단백질생성물들에서 특히 심각하다. 다른 화합물들과 반응들도 색형성에 기여할 수 있다.
본 발명은 캐놀라씨거친가루로부터의 캐놀라단백질분리물의 회수에 관한 것이다.
출원인은 캐놀라씨들이 캐놀라단백질거친가루를 형성하도록 가공되며, 캐놀라단백질거친가루는 단백질수용액을 형성하도록 추출되며, 단백질수용액은 농축되고 농축된 단백질수용액으로부터 캐놀라단백질분리물이 회수되는 캐놀라단백질분리물의 형성방법의 개량을 제공한다.
페놀성 화합물들은 추출단계에서 캐놀라거친가루로부터 추출되고 존재하는 유리페놀성분들(free phenolics)의 량은 330㎚(A330)에서의 UV흡수에 의해 추출될 수 있다. 이러한 페놀성분들은 퀴논들로 산화하기 쉽고 단백질들과 반응하여 더 높은 파장들을 흡수하는 경향이 있는 착색 화합물들을 형성한다. 420㎚(A420)에서의 흡수도의 결정은 분리물과 캐놀라단백질용액들의 실제 가시적인 녹색착색의 더욱 직접적인 측정을 제공한다. 본 발명에서는, 캐놀라단백질분리물을 얻는 처리 중에, 페놀성분들을 제거하여 그것들이 가시적인 색소성분들을 형성하지 않도록 하여, 페놀성분들이 가시적인 색소성분들로 산화되는 것을 억제하고 다른 가시적인 색소성분들을 제거하게 하는 단계들이 취해진다.
본 발명의 일 양태에 의해 제공된 개량은 전술한 공정 동안의 적어도 하나의 가공단계를 행하여 감소된 색을 갖는 캐놀라단백질분리물이 되게 하는 것을 포함한다. 출원인은 이 방식에 대해 다면적인(multifaceted) 접근법을 취하고 여러 단계들 중의 하나 이상이
- 캐놀라씨들의 가공
- 거친가루의 처리
- 캐놀라단백질거친가루의 구체적인 형상의 활용
- 추출물의 가공
- 회수된 캐놀라단백질분리물의 가공
을 포함하게 할 수 있다.
이러한 방식들 중의 2 이상이 채용되어도 좋고 이러한 방식들의 조합들이 종종 사용된다.
씨들의 가공이 행해지는 경우, 이 방식은 겉껍질이 벗겨진 채로 있는 씨앗들 중의 적어도 미로시나제(myrosinase)의 비활성을 포함한다. 미로시나제의 비활성에 의해, 글루코시놀레이트(glucosinolate)들의 반영양물(anti-nutrient)들인 유황성분들로의 분해에 대한 미로시나제의 촉매작용은 맛과 색에 기여한다. 이 방식은 본원의 양수인에게 양도되고 참조로써 여기에 통합된 일자 출원의 미국특허출원번호 제 호에 더 충분히 기재되어 있다.
거친가루의 처리는 에탄올과 같은 알코올들을 포함하여 물과 혼합될 수 있는 유기용매로 거친가루를 추출하여 페놀성분 및/또는 다른 색소성분들을 추출하는 것을 포함한다.
특정 형상의 캐놀라단백질분리물이 사용되는 경우, 이러한 거친가루는 약 50℃ 미만의 온도, 일반적으로는 약 15 내지 30℃의 주위온도에서 캐놀라기름씨거친가루의 용매추출로부터 잔류용매를 제거함으로써 준비된 공기탈용매화된(air-desloventized) 거친가루일 수 있다.
그에 더하여, 캐놀라단백질거친가루의 구체적인 형상은 약 100℃ 미만의 상승(elevated)온도에서 캐놀라기름씨거친가루의 용매추출로부터 잔류용매를 제거함으로써 준비된 저온 토스트된 캐놀라기름씨거친가루일 수 있다.
가공단계가 추출단계에 관계된 경우, 이 추출단계는 페놀성분의 산화와 가시적인 색의 형성을 억제하는 산화방지제의 존재 하에 행해져도 좋다. 대안 또는 조합으로는, 추출단계에 의해 형성된 단백질수용액은 적어도 하나의 색소성분흡수제로 처리되어도 좋다. 그밖에, 또는 대안으로, 적어도 하나의 색소성분흡수제를 이용한 처리는 농축단계에서 형성된 농축 캐놀라단백질용액에 대해 행해져도 좋다.
가공단계가 농축단계에 관계된 경우, 농축된 캐놀라단백질수용액은 농축된 캐놀라단백질용액으로부터 착색제를 세척하도록 투석여과된다. 투석여과(diafiltration)는 투석여과 동안에 페놀성분의 산화와 가시적인 색의 형성을 억제하도록 산화방지제를 함유한 수용액을 사용하여 행해져도 좋다.
가공단계가 회수된 캐놀라단백질분리물에 관계된 경우, 이 가공단계는 캐놀라단백질분리물로부터 페놀성분 및/또는 가시적인 착색제들을 추출하도록 수성 에탄올과 같은 알코올성 수용액을 사용한 캐놀라단백질분리물의 추출을 포함해도 좋다.
캐놀라단백질분리물은 농축된 단백질수용액을 냉수에 첨가하여 단백질미셀덩어리들을 형성하고 상층액(supernatant)으로부터 단백질미셀덩어리를 분리함으로써 농축된 단백질수용액으로부터 회수되어도 좋다.
상층액은 이 상층액을 농축하며 농축된 상층액을 투석여과하여 농축된 상층액으로부터 페놀성분 및/또는 시각적인 착색제들을 제거한 다음 투석여과된 상층액으로부터 캐놀라단백질분리물을 투석여과된 상층액을 건조시키는 것 등에 의해 회수함으로써 상층액으로부터 추가로 캐놀라단백질분리물을 회수하도록 처리되어도 좋다.
색의 형성을 방지함으로써 그리고 캐놀라단백질분리물의 색을 제거함으로써, 생성물은 광범위한 응용들에 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 착색제들을 제거하고그것들의 형성을 방지하는 것은 캐놀라단백질분리물들의 향미를 개선하는 것이라고 생각된다.
본원의 방법에 따라 생산된 단백질분리물은 단백질분리물들의 기존의 응용들, 이를테면, 가공된 식품의 단백질강화, 기름의 에멀션화, 구운 물건의 몸형성체 및 기체를 가두는 제품에서의 발포제에 사용될 수 있다. 그에 더하여, 단백질분리물은 고기유사물로 유용한 단백질섬유로 형성될 수 있으며, 달걀흰자가 결합제로서 사용되는 식품들에서의 달걀흰자대체물 또는 증량제로서 사용될 수 있다. 캐놀라단백질분리물은 영양보충제로서 사용될 수 있다. 캐놀라단백질분리물의 다른 용도들은 애완동물사료, 동물사료 그리고 산업적 및 화장적인 응용들과 개인돌봄(personal care)제품들을 들 수 있다.
본 발명의 하나의 구체적인 양태에 따라, (a) 산화방지제를 함유한 염 수용액을 사용하여 캐놀라기름씨거친가루를 추출하고 캐놀라기름씨거친가루 내의 단백질을 용해하여 약 5 내지 약 6.8의 pH를 갖는 단백질수용액을 형성하는 단계, (b) 잔류 기름씨거친가루로부터 단백질수용액을 분리하는 단계, (c) 선택막기법을 사용하여 상기 단백질수용액의 단백질농도를 증가시키면서 이온강도를 실질적으로 일정하게 유지하여 농축된 단백질용액을 제공하는 단계, (d) 상기 농축된 단백질용액을 약 15℃ 미만의 온도를 갖는 냉수로 희석하여 수상(water phase) 내에 이산단백질미셀들이 형성되게 하는 단계, (e) 단백질미셀들을 침전시켜 비정질, 점착성, 젤리비슷한, 글루텐형 단백질미셀덩어리를 형성하는 단계, 및 (f) 상층액으로부터 건조중량기준으로 적어도 약 90wt%(N x 6.25)의 단백질함량을 갖는 단백질미셀덩어리를회수하는 단계를 포함하는 캐놀라기름씨거친가루로부터 캐놀라단백질분리물을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 구체적인 양태에 따라, 캐놀라기름씨거친가루로부터 캐놀라단백질분리물을 제조하는 방법으로서, (a) 상기 캐놀라기름씨거친가루를 알코올로 세척하는 단계, (b) 세척된 캐놀라기름씨거친가루 내의 단백질의 용해를 일으키도록 세척된 캐놀라기름씨거친가루를 추출하여 약 5 내지 약 6.8의 pH를 갖는 단백질수용액을 형성하는 단계, (c) 잔류 기름씨거친가루로부터 단백질수용액을 분리하는 단계, (d) 선택막기법을 사용하여 상기 단백질수용액의 단백질농도를 증가시키면서 이온강도를 실질적으로 일정하게 유지하여 농축된 단백질용액을 제공하는 단계, (e) 상기 농축된 단백질용액을 약 15℃ 미만의 온도를 갖는 냉수로 희석하여 수상 내에 이산단백질미셀들이 형성되게 하는 단계, (f) 단백질미셀들을 침전시켜 비정질, 점착성, 젤리비슷한, 글루텐형 단백질미셀덩어리를 형성하는 단계, 및 (g) 상층액으로부터 건조중량기준으로 적어도 약 90wt%(N x 6.25)의 단백질함량을 갖는 단백질미셀덩어리를 회수하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 구체적인 양태에 따라, (a) 캐놀라기름씨거친가루 내의 단백질을 용해하도록 캐놀라기름씨거친가루를 추출하여 약 5 내지 약 6.8의 pH를 갖는 단백질수용액을 형성하는 단계, (b) 잔류 기름씨거친가루로부터 단백질수용액을 분리하는 단계, (c) 단백질수용액의 한외여과를 행함으로써 상기 단백질수용액의 단백질농도를 증가시키면서 이온강도를 실질적으로 일정하게 유지하여 농축된 단백질용액을 제공하는 단계, (d) 농축된 단백질용액을 투석여과시키는 단계, (e) 상기투석여과된 농축 단백질용액을 약 15℃ 미만의 온도를 갖는 냉수로 희석하여 수상 내에 이산단백질미셀들이 형성되게 하는 단계, (f) 단백질미셀들을 침전시켜 비정질, 점착성, 젤리비슷한, 글루텐형 단백질미셀덩어리를 형성하는 단계, 및 (g) 상층액으로부터 건조중량기준으로 적어도 약 90wt%(N x 6.25)의 단백질함량을 갖는 단백질미셀덩어리를 회수하는 단계를 포함하는 캐놀라기름씨거친가루로부터 캐놀라단백질분리물을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 추가의 양태에 따라, (a) 캐놀라기름씨거친가루 내의 단백질을 용해하도록 캐놀라기름씨거친가루를 추출하여 약 5 내지 약 6.8의 pH를 갖는 단백질수용액을 형성하는 단계, (b) 잔류 기름씨거친가루로부터 단백질수용액을 분리하는 단계, (c) 선택막기법을 이용하여 상기 단백질수용액의 단백질농도를 증가시키면서 이온강도를 실질적으로 일정하게 유지하여 농축된 단백질용액을 제공하는 단계, (d) 상기 농축된 단백질용액을 약 15℃ 미만의 온도를 갖는 냉수로 희석하여 수상 내에 이산단백질미셀들이 형성되게 하는 단계, (e) 단백질미셀들을 침전시켜 비정질, 점착성, 젤리비슷한, 글루텐형 단백질미셀덩어리를 형성하는 단계, (f) 상층액으로부터 단백질미셀덩어리를 분리하는 단계, (g) 단백질미셀덩어리를 건조하여 건조중량기준으로 적어도 약 90wt%(N x 6.25)의 단백질함량을 갖는 캐놀라단백질분리물을 제공하는 단계, 및 (h) 상기 캐놀라단백질분리물을 알코올수용액으로 추출하는 단계를 포함하는 캐놀라기름씨거친가루로부터 캐놀라단백질분리물을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 부가적인 양태에 따라, (a) 캐놀라기름씨거친가루 내의 단백질을용해하도록 캐놀라기름씨거친가루를 추출하여 약 5 내지 약 6.8의 pH를 갖는 단백질수용액을 형성하는 단계, (b) 잔류 기름씨거친가루로부터 단백질수용액을 분리하는 단계, (c) 선택막기법을 이용하여 상기 단백질수용액의 단백질농도를 증가시키면서 이온강도를 실질적으로 일정하게 유지하여 농축된 단백질용액을 제공하는 단계, (d) 농축된 단백질용액을 저온살균(pasteurization)하여 저온살균된 단백질용액을 형성하는 단계, (e) 저온살균된 단백질용액을 약 15℃ 미만의 온도를 갖는 냉수로 희석하여 수상 내에 이산단백질미셀들이 형성되게 하는 단계, (f) 단백질미셀들을 침전시켜 비정질, 점착성, 젤리비슷한, 글루텐형 단백질미셀덩어리를 형성하는 단계, 및 (g) 상층액으로부터 건조중량기준으로 적어도 약 90wt%(N x 6.25)의 단백질함량을 갖는 단백질미셀덩어리를 회수하는 단계를 포함하는 캐놀라기름씨거친가루로부터 캐놀라단백질분리물을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라, (a) 캐놀라기름씨들을 이 기름씨들에 함유된 미로시나제들을 비활성이 되도록 처리하여 처리된 기름씨들을 생성하는 단계, (b) 상기 기름씨들을 가공하여 그것들로부터 캐놀라기름씨를 제거하고 캐놀라기름씨거친가루를 생성하는 단계, (c) 캐놀라기름씨 내의 단백질의 용해를 일으키도록 캐놀라기름씨를 추출하여 약 5 내지 약 6.8의 pH를 갖는 단백질수용액을 형성하는 단계, (d) 잔류 기름씨거친가루로부터 단백질수용액을 분리하는 단계, (e) 선택막기법을 이용하여 상기 단백질수용액의 단백질농도를 증가시키면서 이온강도를 실질적으로 일정하게 유지하여 농축된 단백질용액을 제공하는 단계, (f) 농축된 단백질용액을 약 15℃ 미만의 온도를 갖는 냉수로 희석하여 수상 내에 이산단백질미셀들이 형성되게 하는 단계, (g) 단백질미셀들을 침전시켜 비정질, 점착성, 젤리비슷한, 글루텐형 단백질미셀덩어리를 형성하는 단계, 및 (h) 상층액으로부터 건조중량기준으로 적어도 약 90wt%(N x 6.25)의 단백질함량을 갖는 단백질미셀덩어리를 회수하는 단계를 포함하는 캐놀라기름씨거친가루로부터 캐놀라단백질분리물을 제조하는 방법이 제공된다.
캐놀라는 평지씨 또는 기름씨평지도 알려져 있다.
발명의 개관
색의 개선은 씨들을 가공함으로써 달성될 수 있다. 겉껍질을 벗긴 씨들은 수증기를 이용한 미로시나제의 가열비활성화를 겪는다. 그 후 비활성화된 씨들은 씨들로부터 기름을 회수하고 캐놀라기름씨거친가루를 형성하도록 기존의 방식으로 가공된다.
발명의 일 실시예에 따라, 약 100℃ 미만의 상승(elevated)온도에서의 토스팅에 의해 기름씨거친가루가 탈용매화되도록 하는 것이 바람직한데, 그 이유는 그러한 거친가루는 기존의 훨씬 높은 토스팅온도를 이용한 거친가루의 탈용매보다는 색의 전개(또는 발생)가 덜하기 때문이다. 이러한 거친가루로부터 적어도 약 90wt%(N x 6.25), 바람직하게는 적어도 약 100wt%의 단백질함량을 갖는 캐놀라단백질분리물의 형성은 본 출원의 양수인에게 양도되고 그 개시내용이 참조로써 여기에 통합된 함께 계류중인 출원일 2002년 12월 9일의 미국특허출원 제10/314,202호에 기재되어 있다.
더 바람직하게는, 기름씨거친가루는 약 50℃ 미만의 온도에서, 바람직하게는 약 15 내지 약 30℃의 주위온도에서 공기 중에서 탈용매화되는데, 그 이유는 토스트된 거친가루를 사용하는 경우보다는 훨씬 적은 색이 추출용액에 존재하기 때문이다. 이러한 거친가루로부터 적어도 약 90wt%(N x 6.25) 바람직하게는 적어도 약 100wt%의 단백질함량을 갖는 캐놀라단백질분리물의 형성은 본 출원의 양수인에게 양도되고 그것들의 개시내용들이 참조로써 여기에 통합된 미국특허출원들인 출원일 2002년 6월 21일의 제60/390,126호 및 출원일 2002년 8월 8일의 제60/401,712호 등에 기재되어 있다.
캐놀라단백질분리물들은 캐놀라기름씨거친가루로부터 형성될 수 있다. 함께 계류 중인 미국특허출원들인 2001년 5월 4일자 출원의 제60/288,415호, 2001년 10월 5일자 출원의 제60/326,987호, 2001년 11월 7일자 출원의 제60/331,066호, 2001년 11월26일자 출원의 제60/333,494호, 2002년 4월 24일자 출원의 제60/374,801호 및 2002년 5월 3일자 출원의 제10/137,391호(WO 02/089597호)는 모두가 본 출원의 양수인에게 양도되고 그것들의 개시내용들이 참조로써 여기에 통합된 것들로 그것들에는, 캐놀라기름씨거친가루로부터 적어도 약 100wt%의 단백질함량(N x 6.25)을 갖는 캐놀라단백질분리물들을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 그 방법은 염 용액을 사용하여 캐놀라기름씨거친가루를 추출하는 단계, 잔류 기름씨거친가루로부터 결과적인 단백질수용액을 분리하는 단계, 선택막기법을 이용하여 적어도 약 200g/L로 단백질수용액의 농도를 증가시키면서 이온강도를 실질적으로 일정하게 유지하는 단계, 결과적인 농축 단백질용액을 냉수로 희석하여 단백질미셀들이 형성되게 하는단계, 단백질미셀들을 침전시켜 비정질, 점착성, 젤리비슷한, 글루텐형 단백질미셀덩어리를 형성하는 단계, 및 상층액으로부터 적어도 약 100wt%(N x 6.25)의 단백질함량을 갖는 단백질미셀덩어리를 회수하는 단계를 포함하는 다중단계공정에 관계된다. 여기서 사용되는 단백질함량은 건조중량기준으로 결정된다. 회수된 PMM은 건조되어도 좋다.
위에 기재되고 미국특허출원 제60/326,987호, 제60/331,065호, 제60/333,494호, 제60/374,801호 및 제10/137,391호에 구체적으로는 기재된 바와 같은 방법의 일 실시예에서, PMM침전단계로부터의 상층액은 젖은 PMM과 상층액으로부터 건조된 단백질분리물을 포함한 단백질분리물을 회수하도록 가공된다. 그 과정은 초기에 한외여과막들을 사용하여 상층액을 농축하며, 농축된 상층액을 젖은 PMM과 혼합하고 그 혼합물을 건조함으로써 행해진다. 결과적인 캐놀라단백질분리물은 적어도 약 90wt%의 단백질(N x 6.25), 바람직하게는 적어도 약 100wt% 단백질(N x 6.25)의 높은 순도를 가진다.
위에 기재되고 미국특허출원 제60/333,494호, 제60/374,801호 및 제10/137,391호에 구체적으로는 기재된 바와 같은 방법의 다른 실시예에서, PMM침전단계로부터의 상층액은 상층액으로부터 단백질분리물을 회수하도록 가공된다. 그 과정은 초기에 한외여과막들을 사용하여 상층액을 농축하고 그 농축액을 건조시킴으로써 행해진다. 결과적인 캐놀라단백질분리물은 적어도 약 90wt%의 단백질(N x 6.25), 바람직하게는 적어도 약 100wt% 단백질(N x 6.25)의 높은 순도를 가진다.
전술한 미국특허출원들에 기재된 방식들은 본래 일괄처리(batch)방식이다.함께 계류중인 미국특허출원들이며 본 출원의 양수인에게 양도되고 그것들의 개시내용들이 참조로써 여기에 통합된 것들인 2001년 11월 20일자로 출원된 제60/331,646호, 2002년 5월 30일자로 출원된 제60/383,809호 및 2002년 11월 19일자로 출원된 제10/298,678호(WO 03/043439)에 기재된 방식들에는, 캐놀라단백질분리물들을 제조하는 연속공정이 기재되어 있다. 그것에 따라, 캐놀라기름씨거친가루는 염 용액과 연속적으로 혼합되며, 그 혼합물은 파이프를 통해 운반되면서 캐놀라기름씨거친가루로부터 단백질을 추출하여 단백질수용액을 형성하며, 단백질수용액은 잔류 캐놀라기름씨거친가루로부터 연속적으로 분리되며, 단백질수용액은 선택막작업을 통해 연속적으로 운반되어 단백질수용액의 단백질함량을 적어도 약 200g/L로 증가시키면서도 이온강도를 실질적으로 일정하게 유지하게 되며, 결과적인 농축된 단백질용액은 냉수와 연속적으로 혼합되어 단백질미셀들이 형성되게 하고, 단백질미셀들은 소망의 량의 PMM이 침전용기에 축적되기까지 상층액을 연속적으로 넘쳐흐르게 하면서 연속적으로 침전된다. PMM은 침전용기로부터 제거되고 건조되어도 좋다. PMM은 적어도 약 90wt%(N x 6.25) 바람직하게는 적어도 약 100wt%(N x 6.25)의 단백질함량을 가진다.
전술한 미국특허출원들인 제60/326,987호, 제60/331,066호, 제60/333,494호, 제60/374,801호 및 제10/137,391호에 기재된 바와 같이, 넘쳐흐른 상층액은 그것으로부터 캐놀라단백질분리물을 회수하도록 처리되어도 좋다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 기름씨거친가루는 초기에는 그것으로부터 페놀성분과 착색제를 제거하도록 용매추출되어도 좋다. 이러한 용매추출은 페놀성분 및/또는 가시적(visible) 착색제를 위한 수용성(water-soluble) 알코올, 바람직하게는 에탄올과 같은 수용성 유기용매를 사용하여 행해져도 좋다.
추출은 캐놀라기름씨거친가루를 용매 중에 약 1:3 내지 약 1:10, 바람직하게는 약 1:5의 w/v비율로 분산시킴으로써 행해져도 좋다. 슬러리는 약 5 내지 약 60분, 바람직하게는 약 15 내지 약 30분 동안 약 15 내지 약 45℃, 바람직하게는 약 30 내지 약 35℃의 온도에서 저어져도 좋다. 조건들의 적당한 세트는 35℃에서 30분의 추출이다. 이러한 추출은 부가적인 페놀성분 및/또는 가시적인 색의 추출이 없을 때까지 다수 회 행해져도 좋다.
본 발명의 방법에서, 단백질성(proteinaceous) 재료는 캐놀라기름씨거친가루로부터 용해된다. 단백질성 재료는 캐놀라씨로부터 자연적으로 발생하는 단백질일 수 있거나 단백질성 재료는 유전자조작에 의해 변형되었지만 자연 단백질의 특징적인 소수성 및 극성을 소유하는 것일 수 있다. 캐놀라거친가루는 캐놀라기름씨로부터 캐놀라기름을 가변하는 수준의 비변성단백질로 제거한 결과인, 예컨대, 열(hot)헥산추출 또는 냉(cold)기름분출법들의 결과인 임의의 캐놀라거친가루일 수 있다. 씨의 가공은 캐놀라기름씨로부터 캐놀라기름을 제거하기 위해 행해질 때 통상 여기에 기재된 본 발명의 단백질분리물 회수방식과는 별개의 작업으로서 행해진다.
염의 존재가 기름씨거친가루로부터 가용성 단백질의 제거를 향상시키므로 단백질 용해는 식품등급의 염 용액을 사용하여 가장 효율적으로 행해진다. 캐놀라단백질분리물이 비식품의 용도로 의도된 경우, 비식품등급의 화학약품들이 사용될 수 있다. 염은 통상 염화나트륨이지만, 다른 염들 이를테면 염화칼륨이 사용되어도 좋다. 염 용액은 적어도 약 0.10, 바람직하게는 적어도 약 0.15의 이온강도를 가져, 상당한 량의 단백질의 용해가 행해질 수 있게 한다. 염 용액의 이온강도가 증가함에 따라, 기름씨거친가루 내의 단백질의 용해정도는 초기에는 최대값이 달성될 때까지 증가한다. 이온강도의 어떠한 후속적인 증가도 전체 단백질의 용해를 증가시키지 않는다. 최대의 단백질용해를 일으키는 식품등급의 염 용액의 이온강도는 관련된 염과 선택된 기름씨거친가루에 따라 변한다. 식품등급의 염 용액은 약 0.25까지의 범위의 이온강도를 가질 수 있다.
이온강도를 증가시킬수록 단백질침전에 더 큰 희석정도가 필요하다는 점에서, 약 0.8미만 더 바람직하게는 약 0.15 내지 약 0.6의 이온강도값을 이용하는 것이 통상 바람직하다.
일괄처리공정에서, 단백질의 염 용해는 적어도 약 5℃이고 바람직하게는 약 35℃까지의 온도에서, 바람직하게는 통상 약 10 내지 약 60분인 용해시간을 감소시키도록 교반을 동반하여 행해진다. 전체적으로 높은 생산수율을 제공하기 위해서는, 기름씨거친가루로부터 실용적인 것보다는 훨씬 많은 단백질을 실질적으로 추출하도록 용해를 행하는 것이 바람직하다.
일괄처리모드에서는 약 5℃의 하한온도가 선택되는데 그 이유는 이 온도 미만에서는 용해가 비실용적이기 때문이고 약 35℃의 상한온도가 선택되는데 그 이유는 더 높은 온도레벨들에서는 공정이 비경제적이기 때문이다.
연속공정에서는, 캐놀라기름씨거친가루로부터의 단백질의 추출은 캐놀라기름씨거친가루로부터의 단백질의 연속추출을 행하는 것에 이리하는 임의의 방식으로행해진다. 일 실시예에서, 캐놀라기름씨거친가루는 식품등급의 염 용액과 연속적으로 혼합되며 그 혼합물은 여기에 기재된 매개변수들에 따라 소망의 추출을 행하기에 충분한 체류시간을 위한 길이 및 유속의 파이프 또는 도관을 통해 운반된다. 이러한 연속방식에서는, 염용해단계는 바람직하게는 캐놀라기름씨거친가루로부터 실질적으로 실용적인 정도의 단백질을 추출할 수 있는 용해를 행하기 위해 신속히 약 10분까지의 시간에 행해진다. 연속방식에서의 용해는 상승온도들, 바람직하게는 약 35℃를 넘는 일반적으로 약 65도 정도까지의 온도에서 행해진다.
식품등급의 염 수용액과 캐놀라기름씨거친가루는 이하에서 더 상세히 기재된 바와 같이 미셀경로(micellar route)에 의해 단백질분리물이 형성될 수 있도록 약 5 내지 약 6.8의 자연(natural)pH를 가진다.
pH범위의 한계들 및 그 근처에서, 단백질분리물의 형성은 미셀경로를 통해 부분적으로만 이 pH범위 내의 다른 값들에서보다 낮은 수율로 발생한다. 이런 이유로, 약 5.3 내지 약 6.2의 산성pH값들이 바람직하다.
염 용액의 pH는 임의의 편리한 산, 통상 염산, 또는 알칼리, 통상 수산화나트륨을 필요에 따라 사용함으로써 추출단계에 사용하기 위한 약 5 내지 약 6.8의 범위 내의 임의의 소망된 값으로 조절될 수 있다.
용해단계 동안 식품등급의 염 용액 내의 기름씨거친가루의 농도는 폭넓게 가변될 수 있다. 전형적인 농도값들은 약 5 내지 약 15% w/v이다.
발명의 일 실시예에 따라, 산화제는 캐놀라기름씨거친가루의 페놀성분들이 단백질과 반응하여 색이 어두워지게 하는 성분들로 산화하는 것을 억제하도록 식품등급의 염 용액 내에 존재한다. 아황산나트륨과 아스크로브산과 같은 임의의 소망의 식품등급의 산화제가 사용되어도 좋다. 식품등급의 염 수용액에 채용되는 산화제의 량은 채용되는 재료에 의존하고 약 0.01 내지 약 1wt%, 바람직하게는 약 0.05 내지 약 0.1wt%로 변할 수 있다. 산화제들을 사용하여 페놀성분들의 산화의 억제는 페놀성분의 농도를 크게 변화시키지 않고 유지하면서도 추출 색(420㎚에서의 흡수도)을 감소시킨다.
첨가된 아황산나트륨의 존재하에서는, 염 농도가 0.05M이하인 경우에도, pH 6.3에서의 추출물 내의 단백질농도는 아황산나트륨이 없는 경우의 0.15M의 염 농도를 갖는 것에 필적한다.
추출단계로부터 생긴 단백질용액은 일반적으로 약 5 내지 약 40g/L, 바람직하게는 약 10 내지 약 30g/L의 단백질농도를 가진다.
추출단계의 매개변수들의 선택 시에, 캐놀라기름씨거친가루로부터 가능한 것만큼 많은 단백질을 추출하려는 요구는 결과적인 추출용액의 색을 최소화하려는 요구와 균형을 이룬다. 여기에 제시된 데이터를 감안하여, 일반적으로 30분의 추출시간이면 유력한(prevailing) pH 및 염의 몰농도 하에서 추출하려는 모든 단백질을 추출하는데 충분하다. 더 높은 pH는 추출되는 단백질의 량을 증가시키고 단백질용액의 색(A420에서의 흡수도에 의해 측정됨)이 시각적으로 더 어둡게 한다.
pH 8.0의 0.1M 살린으로 10분 동안에는 pH 6.3의 0.15M 살린으로 30분 동안 추출하는 것과 같은 정도로 단백질을 추출하는 것이 가능하다. 더 낮은 pH를 이용한 추출과 비교해 볼 때 pH 9.8의 추출에서는 A330에 현저한 감소가 있지만, 그 색은 pH가 감소함에 따라 눈에 띄게 된다. 이 현상에 대한 설명은 아마도 페놀성분들이 반응하여 A330에서 흡수되지 않지만 A360과 A400 사이의 높은 값들에서는 흡수되는 노란색 착색제들을 형성한다는 것이다. 그러한 이유로, 캐놀라단백질거친가루의 추출은 8 미만의 pH에서 행해진다.
그 후 추출단계로부터 생긴 수상(aqueous phase)은 잔류 거친가루를 제거하도록 잔류캐놀라거친가루로부터 임의의 편리한 방식으로, 이를테면 진공여과와 이것에 후속하는 원심분리 및/또는 여과에 의해 분리될 수 있다. 분리된 잔류거친가루는 폐기를 위해 건조되어도 좋다.
거친캐놀라기름씨거친가루가 Murray II 특허들에 기재된 바와 같이 상당한 량의 지방을 함유하는 경우, 여기에 기재된 지방제거단계는 분리된 단백질수용액에 대해 그리고 이하에서 논의된 농축된 단백질수용액에 대해 행해져도 좋다.
염 수용액을 사용하여 캐놀라기름씨거친가루로부터 단백질을 추출하는 것의 대안으로서, 이러한 추출은 물(수)만을 사용하여 이루어질 수 있지만, 물 만의 이용은 염 수용액보다는 캐놀라기름씨거친가루로부터 적은 단백질을 추출하는 경향이 있다. 이러한 대안이 채용되는 경우, 위에서 논의된 농도들의 염이 아래에 기재된 농축단계 동안 용액 중에 단백질을 유지하기 위해 잔류기름씨거친가루로부터의 분리 후에 단백질용액에 첨가되어도 좋다. 제1지방제거단계가 행해지는 때에, 일반적으로 염은 이러한 작업의 완료 후에 첨가된다.
다른 대안이 되는 방식은 약 6.8을 넘는 일반적으로는 약 11까지의 비교적 높은 pH값의 식품등급의 염 용액으로 캐놀라기름씨거친가루를 추출하는 것이다. 그러나 위에서 지적한 바와 같이, 약 8보다 큰 pH에서의 추출은 일반적으로 피해지는데 그 이유는 현저히 가시적인 색의 형성이 이러한 pH값들에서 일어나기 때문이다. 식품등급의 염 용액의 pH는 임의의 편리한 식품등급의 알칼리, 이를테면 수산화나트륨용액을 사용하여 소망의 알칼리성으로 pH가 조절될 수도 있다. 다르게는, 단백질은 약 pH 5 미만, 일반적으로는 약 pH 3까지 내려가는 비교적 낮은 pH의 염 용액으로 캐놀라기름씨거친가루로부터 추출될 수 있다. 이러한 대안이 채용되는 경우, 캐놀라기름씨거친가루 추출단계로부터의 결과인 수상은 임의의 편리한 방식, 이를테면 진공여과와 이것에 뒤따르는 원심분리 및/또는 여과에 의해 잔류 거친가루를 제거하도록 잔류캐놀라거친가루로부터 분리된다. 분리된 잔류 캐놀라거친가루는 폐기를 위해 건조되어도 좋다.
그 후 높거나 낮은 pH 추출단계부터의 결과인 단백질수용액은, 아래에서 논의된 바와 같이 미셀경로에 의해 캐놀라단백질을 주로 회수하는 추가의 가공 전에, 위에서 논의된 것처럼 약 5 내지 약 8, 바람직하게는 약 5.3 내지 약 6.2의 범위로 pH 조절되어도 좋다. 이러한 pH조절은 염산과 같은 임의의 편리한 산 또는 수산화나트륨과 같은 알칼리를 적절히 사용하여 행해져도 좋다.
단백질의 추출 후에, 단백질용액은 본 발명의 다른 실시예에 따라, 한외여과/투석여과 및 색흡수제와의 접촉을 포함한 하나 이상의 색제거단계들을 거쳐도 좋다. 한외여과단계에서, 단백질수용액의 단백질함량은 염의 농도를 변화없이 유지하면서 증가된다. 한외여과는 단백질을 보유하면서 페놀성분과 착색제들이 투과물(permeate)과 함께 막을 통과하도록 하는 분획분자량을 갖는 막들, 전형적으로는막재료와 구성이 달라지는 것을 감안하여 약 3,000 내지 약 50,000달톤, 바람직하게는 5000 내지 약 10,000달톤의 분획분자량을 갖는 한외여과막을 사용하여 행해져도 좋다. 이 막들은 중공섬유(hollow-fibre)막들 또는 나선권선형(spiral-wound)막들일 수 있다. 연속작업의 경우, 막들은 단백질수용액이 이 막들을 통과할 때 소망하는 정도의 농도를 허용하는 치수로 된다.
단백질용액은 한외여과단계에 의해 약 4 내지 약 20배 농축되고 바람직하게는 적어도 약 200g/L, 더 바람직하게는 적어도 약 250g/L의 단백질농도를 갖는 농축된 단백질용액을 제공하도록 행해진다.
그 후 농축된 단백질용액은 추출용액과 동일한 몰농도 및 pH의 염 수용액을 사용한 투석여과단계를 거친다. 이러한 투석여과는 약 2 내지 약 20배의 체적의 투석여과용액, 바람직하게는 약 5 내지 약 10배 체적의 투석용액을 사용하여 행해져도 좋다. 투석여과작업 시, 투과물과 함께 막을 통과시킴으로써 단백질수용액으로부터 추가적인 양들의 페놀성분들과 가시적 색이 제거된다. 투석여과작업은 상당한 량들의 페놀성분과 가시적 색이 투과물에 더 이상 존재하지 않을 때까지 행해져도 좋다. 이러한 투석여과는 막의 재료들과 구성이 달라지는 것을 감안하여 약 3000 내지 약 50,000달톤, 바람직하게는 약 5,000 내지 약 10,000달톤의 범위 내의 분획분자량을 막을 사용하여 행해져도 좋다.
발명의 이 실시예의 양태에 따라, 투석여과단계의 적어도 부분을 이용하는 투석여과매질 내에 산화제가 존재할 수 있다. 이 산화제는 임의의 편리한 식품등급의 산화제, 이를테면 아황산나트륨 또는 아스크로브산일 수 있다. 투석여과매질 내에 채용되는 산화제의 량은 채용되는 재료들에 의존하고 약 0.01 내지 약 1wt%, 바람직하게는 약 0.05wt%로 변화할 수 있다. 산화제는 농축된 캐놀라단백질분리물 용액 내에 존재하는 페놀성분들의 산화를 억제하는데 소용된다.
농축단계와 투석여과단계는 임의의 편리한 온도, 일반적으로 약 20 내지 약 60℃에서 소망하는 정도의 농축을 행하도록 하는 기간 동안 행해져도 좋다. 이용되는 온도와 다른 조건들은 어느 정도는 농축을 행하는데 사용되는 막설비와 용액의 소망하는 단백질농도에 의존한다.
한외여과/투석여과작업들을 행함에 있어서, 그 조건들은 최고의 단백질농도와 최저의 색을 갖는 단백질용액을 제공하는 것을 소망하는 것을 염두에 두고서 선택된다. 아래에 보고된 실험들에 기초하여, 한외여과/투석여과(UF/DF)방식은, pH와 살린함량에 따라, 약 28% 내지 약 74%만큼 A330값들을 효과적으로 감소시킬 수 있다. 한외여과/투석요과작업들은 또한 반영양적 요소들의 효과를 가짐으로써, 캐놀라단백질분리물의 영양적인 질을 개선한다.
UF/DF투과물들은 pH 8.0과 6.3에서 최고의 A330 값들을 가졌다. 이러한 높은 투과물 A330 값들은 막을 통과할 수 있는 페놀성분들이 투과물에 합쳐지지 않기 때문인 듯 하고 한편 pH 9.8과 pH 11.0에서 페놀성분들은 착색제들을 형성하도록 반응하고 A330에서 강하게 흡수되지 않는다.
더 높은 pH 및 살린레벨에서 행해지는 추출들은 최고의 개시 A330 시도들(readings)을 가졌고 대부분의 경우들에서는 최저의 최종 미투과물(retentate) A330 시도들을 가졌다. 더 높은 pH와 살린 값들에서, 투과물들은 더 높은 레벨들의질소를 함유하였고 이는 단백질이 소실됨을 나타낸다.
최종 미투과물에 관한 A330 대 단백질의 비율들은 최선의 비율들이 pH 6.3과 8.0 사이의 pH값들에서 달성됨을 나타내고 이는 UF/DF방식들에 의해 단백질 당 A330 성분이 더 높은 pH의 시험들보다는 적고 더욱 효과적인 제거가 이루어짐을 나타낸다. 0M과 0.25M의 살린농도들을 제외한 모두에서, pH 6.3은 최선의 A330 대 단백질의 비율들을 가졌다. 이것을 감안하면, pH 6.3은 최고의 단백질레벨을 제공하기 위한 최선의 염 레벨인 0.25M 살린으로 단백질용액으로부터 색을 투석여과 하기 위해 시험된 최선의 pH레벨인 것으로 여겨진다.
한외여과/투석여과작업들 후에는 색소흡수제를 이용한 처리가 행해져도 좋다. 전술한 함께 계류중인 미국특허출원들인 제60/288,415호, 제60/326,987호, 제60/331,066호, 제60/333,494호, 제 60/374,801호 및 제10/137,391호(WO 02/089597호)에는, 분말형 활성탄을 이용하여 색의 감소를 행하는 것이 기재되어 있다.
이러한 출원들에 기재된 바와 같이, 이러한 색감소단계는 농축 전에 캐놀라단백질용액에 대해 행해지고 이러한 단계가 없을 경우에 비해 생산물인 캐놀라단백질분리물은 색이 더 옅고 노란색이 덜 강하다. 본 발명의 다른 실시예에 따라, 색성분흡수제들을 사용하는 것은 바람직하게는 농축되고 투석여과된 캐놀라단백질용액에 대해 행해진다. 분말형 활성탄 뿐 아니라 알갱이형(granulated) 활성탄(GAC)이 사용되어도 좋다. 색흡수제로서 사용될 수 있는 다른 재료는 폴리비닐피롤리돈이다. 다르게는, 본 발명의 다른 실시예에 따라, 색성분흡수제들을 사용하는 것은 한외여과와 선택적인(optional) 투석여과전에, 그리고/또는 추출단계에서 직접 캐놀라단백질용액에 대해 행해져도 좋다. 색흡수제가 한외여과단계 전에 채용되는 경우, 만약 이러한 투석여과가 임의의 부가적인 페놀성분들 및/또는 가시적인 색을 제거하지 않는 경우에는 투석여과는 생략될 수 있다.
아래에 기재된 실험들에서, 폴리비닐피롤리돈과 GAC는 pH 9.8과 11에서 보다는 pH 6.3과 8.0에서 A330을 더 잘 감소시키는데, 아마도 2가 더 높은 pH레벨에서 단백질에 대한 퀴논들의 결합 때문인 듯하다. 폴리비닐피롤리돈은 단백질의 손실 없이 A330에서의 양호한 감소를 이루었다. 시험된 다른 가능성 있는 재료들은 용인될 수 없는 단백질 손실 또는 용액의 A330을 감소시키지 못하는 능력 때문에 만족스럽지 못했다.
색흡수제 처리단계는 임의의 편리한 조건들, 일반적으로 캐놀라단백질용액의 주위온도에서 행해질 수 있다. 분말형 활성탄의 경우, 약 0.025 내지 약 5% w/v, 바람직하게는 약 0.05 내지 약 2% w/v의 량이 사용될 수 있다. 폴리비닐피롤리돈이 색흡수제로서 사용되는 경우, 약 0.5 owl dir 5% w/v, 바람직하게는 약 2 내지 약 3% w/v의 량이 사용될 수 있다. 색흡수제는 임의의 편리한 수단, 이를테면 여과에 의해 제거될 수 있다.
투석여과된 캐놀라단백질용액에 대한 색흡수제에 의해 처리의 완료 후에, 결과적인 단백질용액은 그것으로부터 캐놀라단백질분리물을 생산하기 위해 처리된다. 캐놀라단백질분리물의 회수는 단백질용액의 매개변수들에 의존하여 임의의 편리한 방식으로 행해질 수 있다.
예를 들어, 캐놀라단백질분리물은 알칼리용액으로부터의 등전(isoelectric)침전에 의해 또는 더 많은 중성용액들로부터의 단백질미셀덩어리 처리에 의해 회수되어도 좋다. 다르게는, 단백질은 염농도를 증가시킴으로써 침전될 수 있다.
바람직하게는 캐놀라단백질분리물을 회수하기 위한 캐놀라단백질의 가공은 전술한 미국특허출원과 아래에서 더 상세히 기재된 바와 같은 단백질미셀덩어리 처리를 이용하여 행해져도 좋은데, 그 이유는 추출 pH조건들이 등전침전기법들을 위해 채용된 조건들보다 색 형성이 덜하기 때문이다.
캐놀라단백질수용액에 대해 행해지는 색제거단계들에 채용된 온도에 따라, 농축된 단백질용액은 적어도 약 20℃이고 약 60℃까지, 바람직하게는 약 25 내지 약 40℃의 온도로 데워져, 농축되고 선택적으로는 투석여과된 단백질용액의 점성을 감소시킴으로써 후속하는 희석단계와 미셀형성의 수행을 용이하게 한다. 농축되고 선택적으로는 투석여과된 단백질용액은 농축되고 선택적으로는 투석여과된 단백질용액의 온도가 냉수에 의한 희석에 대해 미셀의 형성을 허용하지 않는 온도를 넘는 온도를 초과하여 가열되지는 않아야 한다. 농축되고 선택적으로는 투석여과된 단백질용액은 원한다면 Murray II 특허들에 기재된 바와 같이 추가의 지방제거작업을 거쳐도 좋다.
색제거단계들로부터의 결과인 농축된 단백질용액은 저장이나 그 밖의 이유로 원래의 거친가루에 존재하였을지도 모르고 추출단계에서 거친가루로부터 캐놀라단백질분리물의 용액 속에 추출된 어떠한 박테리아도 죽이기 위해 저온살균되어도 좋다. 이러한 저온살균은 임의의 소망된 저온살균조건들 하에서 행해질 수 있다. 일반적으로, 농축되고 선택적으로는 투석여과된 단백질용액은 약 55 내지 약 70℃,바람직하게는 약 60 내지 약 65℃의 온도로 약 10 내지 약 15분, 바람직하게는 약 10분 동안 가열된다. 그 후 저온살균된 농축 단백질용액은 아래에 기재된 바와 같은 추가의 가공을 위해 바람직하게는 약 25 내지 약 40℃로 냉각되어도 좋다.
색제거단계들과 선택적인 지방제거 및 저온살균제거 단계들의 결과인 농축된 단백질용액은 그 후 농축된 단백질용액과 소망의 희석정도를 달성하기 위해 요구된 체적을 갖는 냉수를 혼합함으로써 미셀의 형성을 행하도록 희석된다. 미셀경로에 의해 얻기를 원하는 캐놀라단백질의 비율과 상층액으로부터의 비율에 의존하여, 농축된 단백질용액의 희석정도는 변할 수 있다. 희석레벨을 높일수록, 일반적으로 더 높은 비율의 캐놀라단백질이 수상 내에 남아있다.
미셀경로에 의해 단백질의 최고 비율을 제공하기를 원하는 때에는, 농축된 단백질용액은 약 15배 이하, 바람직하게는 약 10배 이하로 희석된다.
농축된 단백질용액과 혼합되는 냉수는 약 15℃미만, 일반적으로 약 3 내지 약 15℃, 바람직하게는 약 10℃미만의 온도를 가지는데, 그 이유는 사용되는 희석율에서는 이러한 더 차가운 온도들에 의해 단백질미셀덩어리 형태의 단백질분리물의 수율이 개선되기 때문이다.
일괄처리작업 시, 농축된 단백질용액의 배치(batch)는 위에서 논의된 것처럼 소망의 체적을 갖는 정적인 냉수 속에 첨가된다. 농축된 단백질용액의 희석과 결과적인 이온강도의 감소는 이산단백질방울들의 형태의 강하게 결합된 단백질분자들이 구름같은 덩어리의 미셀형태로의 형성을 일으킨다. 일괄처리방식에서, 단백질미셀들은 냉수 속에 침전될 수 있어 응집되며, 합체되며, 밀하며, 비정질 점착성 글루텐형 단백질미셀덩어리(PMM)로 형성될 수 있다. 침전은 원심분리 등에 의해 보조를 받을 수 있다. 이렇게 유발된 침전은 단백질미셀덩어리의 액체함량을 감소시킴으로써, 약 70중량% 내지 약 95중량%의 수분함량을 일반적으로 총 미셀덩어리의 약 50중량% 내지 약 80중량%의 값으로 감소시킨다. 이런 식으로 미셀덩어리의 수분함량을 감소시키면 미셀덩어리의 흡장된(occluded) 염의 함량도 감소되고, 그래서 건조된 분리물의 염함량도 감소한다.
다르게는, 희석작업은 농축된 단백질용액을 T자형 파이프의 하나의 입구에 계속 통과시키면서 T자형 파이프의 다른 입구에 희석용 물(diluting water)을 공급하여 파이프 내에서 혼합되게 함으로써 연속적으로 행해질 수 있다. 희석용 물은 소망의 희석정도를 달성하기에 충분한 비율로 T자형 파이프에 공급된다.
농축된 단백질용액과 희석용 물을 파이프 내에서 혼합하는 것은 단백질미셀들의 형성이 시작되게 하고 그 혼합물은 T자형 파이프의 출구로부터 침전용기에 계속 공급되고, 침전용기로부터는 이것이 가득 찼을 때 상층액이 넘쳐흐르게 된다. 바람직하게는 혼합물은 침전용기 내의 액체 속에 액체 내의 난류를 최소화하는 방식으로 공급된다.
연속방식에서, 단백질미셀들은 침전용기 내에 응집되며, 합체되며, 밀하며, 비정질 점착성 글루텐형 단백질미셀덩어리(PMM)를 형성하도록 침전될 수 있고 이 방식은 소망의 량의 PMM이 침전용기의 바닥에 축적될 때까지 계속되고 그와 같이 되면 축적된 PMM이 침전용기로부터 제거된다.
단백질용액을 적어도 약 200g/L의 단백질함량으로 농축하는 공정매개변수들의 조합과 약 1.5미만의 희석율의 사용은, 전술한 미국특허들에서 논의된 공지의 종래기술의 단백질분리물형성방식들의 어느 것을 이용하여 달성될 수 있는 것보다는, 원래의 거친가루추출로부터 단백질미셀덩어리의 형태로 단백질을 회수하는 것에 관하여, 수율이 더 높아지게 하고 종종은 현저히 높아지게 하고, 단백질함량의 점에서도 분리물이 훨씬 더 순수하게 한다.
침전된 분리물은 잔류 수상 또는 상층액으로부터 이를테면 침전된 덩어리로부터 잔류 수상의 경사분리(decantation)에 의해 또는 원심분리에 의해 분리된다. PMM은 젖은 형태로 또는 임의의 편리한 기법, 이를테면 분무건조, 동결건조 또는 진공드럼건조에 의해 건조한 건조된 형태로 사용될 수 있다. 건조 PMM은 약 90wt%의 단백질을 초과하는, 바람직하게는 약 100wt% 단백질(N x 6.25로 계산됨)의 높은 단백질함량을 가지고, 실질적으로 비변성(시차주사열계량법에 의해 결정됨)이다. 또한 지방성 기름씨거친가루로부터 분리된 건조 PMM은 Murray II 특허의 방식들이 채용된 때에 약 1wt%미만일 것인 낮은 지방함량을 가진다.
PMM형성과 침전단계로부터의 상층액은 희석단계에서 침전되지 않은 상당한 량의 캐놀라단백질을 함유하고, 그것으로부터 캐놀라단백질분리물을 회수하기 위해 가공된다. PMM의 제거에 뒤따르는 희석단계로부터의 상층액은 그것의 단백질농도를 증가시키도록 농축된다. 이러한 농축은 단백질원료로부터 추출된 염과 비단백질성 저분자량 재료들을 포함한 저분자량의 종들(species)의 통과를 허용하는 적당한 분획분자량을 갖는 막들을 사용하는 임의의 편리한 선택막기법, 이를테면 한외여과를 이용하여 용액 중에 캐놀라단백질을 보존하면서 행해진다. 이런 식의 상층액의 농축은 또한 단백질을 회수하기 위해 건조될 필요가 있는 액체의 체적을 줄인다. 일반적으로 상층액은 건조 전에 약 100 내지 약 400g/L, 바람직하게는 약 200 내지 약 300g/L의 단백질농도로 농축된다. 이러한 농축작업은 단백질용액 농축단계에 관해 위에서 기재된 바와 같이 일괄처리모드로 또는 연속작업으로 행해질 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따라, 건조 전에, 농축된 상층액은 물(수)을 이용한 투석여과단계를 거친다. 이러한 투석여과는 약 2 내지 약 20배 체적의 투석여과용액, 바람직하게는 약 5 내지 약 10배 체적의 투석여과용액을 이용하여 행해져도 좋다. 투석여과작업 시, 추가적인 량들의 페놀성분들과 가시적인 색이 농축된 상층액으로부터 투과물과 함께 막을 통과시킴으로써 제거된다. 투석여과작업은 상당한 추가량의 페놀성분들과 가시적인 색이 투과물로부터 제거되기까지 행해질 수 있다. 이러한 투석여과는 막의 재료들과 구성들이 달라지는 것을 감안하여 약 3000 내지 약 50,000달톤, 바람직하게는 약 5000 내지 약 10,000달톤의 범위 내의 분획분자량을 갖는 막을 사용하여 행해질 수 있다.
본 발명의 이 실시예의 양태에 따라, 산화제는 투석여과매질 내에 존재할 수 있다. 산화제는 임의의 편리한 식품등급의 산화제, 이를테면 아황산나트륨 또는 아스크로브산일 수 있다. 투석여과매질에 채용되는 산화제의 량은 채용되는 재료들에 의존하고 약 0.01 내지 약 1wt%, 바람직하게는 약 0.05wt%로 변할 수 있다. 산화제는 농축된 캐놀라단백질분리물 용액 내에 패놀성분 산화가 나타나는 것을 억제하는데 소용된다.
농축된 상층액은 젖은 형태로 사용되거나 임의의 편리한 기법, 이를테면 분무건조, 동결건조 또는 진공드럼건조에 의해 건조된 형태로 건조되어 추가의 캐놀라단백질분리물을 제공하여도 좋다. 이러한 추가의 캐놀라단백질분리물은 약 90wt%을 초과하는 바람직하게는 적어도 약 100wt% 단백질(N x 6.25로 계산됨)의 높은 단백질함량을 가지고 실질적으로 비변성(시차주사열계랑법에 의해 결정됨)이다.
원한다면, 적어도 일부의 젖은 PMM은 농축된 상층액의 적어도 일부와는 본 발명의 일 실시예에 따른 조합된 캐놀라단백질분리조성물을 제공하도록 임의의 편리한 기법에 의해 조합된 다음 조합된 단백질스트림들을 건조하여 좋다. 함께 혼합된 단백질성 재료들의 상대적인 비율들은 2S/7S/12S단백질들의 소망의 프로파일을 갖는 결과적인 캐놀라단백질분리조성물을 제공하도록 선택될 수 있다. 다르게는, 건조된 단백질분리물들은 혼합물 내에 임의의 소망된 구체적인 2S/7S/12S단백질프로파일들을 제공하도록 임의의 소망된 비율들로 조합될 수 있다. 조합된 캐놀라단백질분리조성물은 약 90wt%를 초과하는, 바람직하게는 적어도 약 100wt%(N x 6.25로 계산됨)의 높은 단백질함량을 가지고 실질적으로 비변성(시차주사열계량법에 의해 결정됨)이다.
다른 대안적인 방식에서는, 농축된 상층액의 일부만이 PMM의 일부와만 혼합되고 결과적인 혼합물이 건조된 경우, 농축된 상층액의 나머지는 PMM의 나머지가 그런 것처럼 건조될 수 있다. 게다가, 건조된 PMM과 건조된 상층액은 또한 위에서 논의된 것처럼 임의의 소망된 상대비율들로 혼합되어도 좋다.
이런 식의 작업에 의해, 다수의 캐놀라단백질분리물들이 건조된 PMM, 건조된 상층액, 및 조성물들 내의 2S/7S/12S단백질들의 비율들이 달라짐에 기초하여 다른기능성 및 영양특성을 얻기 위해 요망될 것들인 일반적으로 약 5:95 내지 약 95:5의 각종 중량비들의 PMM유래 캐놀라단백질분리물 및 상층액유래 캐놀라단백질분리물의 건조된 혼합물의 형태로 회수될 수 있다.
발명의 다른 실시예에 따라, PMM유래 캐놀라단백질분리물와 상층액유래 캐놀라단백질분리물은 그것들의 색부여성분들을 제거도록 처리될 수 있다. 편리하게는 이러한 처리는 페놀성분 및/또는 가시적인 착색제들을 위해 물과 혼합될 수 있는 유기용매를 물과의 혼합물 내에 사용하여 행해진다.
물과 혼합될 수 있는 유기융매는 알코올 일 수 있다. 바람직한 것은 에탄올과 물을 일반적으로 약 2:1 내지 1:2, 바람직하게는 1:1의 체적비로 섞은 것이다. 캐놀라단백질분리물은 약 5 내지 약 25% w/v, 바람직하게는 약 8 내지 약 24% w/v의 양으로 섞인 약 용매 내에 일반적으로 주위온도에서 분산된다. 캐놀라단백질분리물의 슬러리는 약 30 내지 약 60분, 바람직하게는 약 30분 동안 혼합될 수 있다. 추출기간 후에, 슬러리는 원심분리 등에 의해 침전되고 캐놀라단백질분리물이 회수된다. 추출은 원한다면 페놀성분 및/또는 가시적 착색제들이 부가적으로 제거되는 것이 없을 때까지 반복될 수 있다. 캐놀라단백질분리물은 분리물로부터 물을 제거하도록 에탄올과 같은 알코올 중에 다시 분산되어도 좋고, 그 후 분리되고 건조되어도 좋다.
예들
예 1:
이 예는 각종 매개변수들의 단백질추출 및 단백질용액의 색에 대한 영향을보여준다.
37.5g의 상업작 캐놀라거친가루(AL-016)가 소망의 농도 및 소망의 pH의 NaCl을 함유한 물과 혼합되어 20℃에서 7.5% w/v의 농도로 된 일련의 실험 조업들(runs)이 수행되었다. 채용된 염화나트륨의 농도들은 0, 0.05, 0.10, 0.15 및 0.25M이었고 사용된 pH값들은 pH 6.3, 8.0, 9.8 및 11.0이었다. 약 30mL의 추출물의 시료가 60분의 추출기간 동안 매 10분마다 취해졌고 10,000xg으로 5분 동안 원심분리되었다. 각 시료의 상층액은 추출기간의 끝에 단백질농도에 관해 분석되었다. 전체 배치는 10,000xg로 15분 동안 원심분리되었고 상층액은 0.45㎛ 마이크로필터를 사용하여 진공 여과되었다. 여과된 상층액은 단백질함량에 관해 그리고 유리페놀성분농도(330㎚에서의 흡수도)에 관해 분석되었다.
100ml 분취액(aliqout)이 한외여과(UF)를 위해 정화된 상층액으로부터 10,000 분획분자량의 막을 가지는 아미콘(Amicon) 8400유닛을 사용하여 농축계수 4로 취해졌다. 25ml 미투과물과 괴어 있는(pooled) 투과물의 단백질농도와 A330 흡수도가 결정되었다. 한외여과된 용액은 추출을 위해 사용된 것과 동일한 염 농도와 동일한 pH를 갖는 용액 150ml를 사용하여 6의 투과체적만큼 투석여과(DF)되었다. 투석여과의 끝에 투석여과로부터의 미투과물과 괴어 있는 투과물 둘 다는 단백질농도와 A330에 관해 분석되었다.
그 후 최종 미투과물들의 분취액들은 5개의 다른 흡수제들 중의 하나를 담고 있는 칼럼들을 통과하였고 다시 단백질농도와 A330 색이 결과적인 단백질용액들에 대해 검사되었다. 흡수제들은 Amberlite XAD - 16 HP(중합(polymeric) 흡수제)Amberlite SF120NA(양이온 교환체), Polycar Super R(폴리비닐피롤리돈), 실리카겔(28 내지 200 메시), 및 알갱이형 활성탄(식품등급)이었다.
추출실험들로부터의 얻어진 데이터는 30분의 추출시간이면 거친가루로부터 모든 추출성 단백질들을 제거하기에 충분하다는 것을 나타내었다. 30분을 넘으면, 단백질의 추출에 현저한 증가는 없다는 것을 검사된 pH 또는 살린레벨들로부터 알 수 있다. 다음의 표 1은 각 pH 및 염레벨에서 얻어진 추출된 단백질의 량들을 보여준다.
| 0.0M | 0.05M | 0.10M | 0.15M | 0.25M | |
| pH 6.3 | 5.36 | 8.00 | 8.20 | 9.16 | 7.4 |
| pH 8.0 | 4.97 | 6.66 | 9.50 | 9.29 | 8.7 |
| pH 9.8 | 7.90 | 10.68 | 10.77 | 10.9 | 10.7 |
| pH 11.0 | 12.0 | 12.56 | 12.91 | 12.36 | 12.93 |
다음의 표 2 내지 표 6은 추출된 단백질(g/L의 량들)에 대한 염 농도의 영향을 각종 pH레벨들에서 시간의 함수로서 보여준다.
| 사용 살린:0.0M | pH6.3 | pH8.0 | pH9.8 | pH11.0 |
| T10 | 3.75 | 3.94 | 6.6 | 8.4 |
| T20 | 4.44 | 4.69 | 6.3 | 9.9 |
| T30 | 4.39 | 4.01 | 8.1 | 12.6 |
| T40 | 5.11 | 5.67 | 8.2 | 10.7 |
| T50 | 4.95 | 5.55 | 8.1 | 11.7 |
| T60 | 5.63 | 4.97 | 7.9 | 12 |
| 사용 살린:0.05M | pH6.3 | pH8.0 | pH9.8 | pH11.0 |
| T10 | 7.3 | 5.87 | 8 | 10.5 |
| T20 | 8.3 | 8.11 | 9.5 | 12.04 |
| T30 | 7.4 | 6.6 | 9.6 | 12.7 |
| T40 | 7.5 | 7.3 | 10 | 12 |
| T50 | 7.9 | 7.3 | 10.7 | 13 |
| T60 | 8 | 6.7 | 10.7 | 12.6 |
| 사용 살린:0.10M | pH6.3 | pH8.0 | pH9.8 | pH11.0 |
| T10 | 9.2 | 9.7 | 8.4 | 14.4 |
| T20 | 8.4 | 9.6 | 10.13 | 13.17 |
| T30 | 9.2 | 9 | 11.25 | 12.4 |
| T40 | 9.3 | 8.9 | 11.23 | 12.57 |
| T50 | 8.9 | 9.5 | 11.83 | 13.18 |
| T60 | 8.2 | 9.5 | 10.77 | 12.91 |
| 사용 살린:0.15M | pH6.3 | pH8.0 | pH9.8 | pH11.0 |
| T10 | 8.71 | 7.05 | 11.65 | 9.05 |
| T20 | 9.47 | 8.42 | 11.46 | 10.28 |
| T30 | 9.36 | 8.27 | 10.93 | 11.31 |
| T40 | 9.74 | 9.08 | 10.36 | 11.19 |
| T50 | 10.24 | 8.36 | 10.72 | 11.54 |
| T60 | 9.16 | 9.29 | 10.7 | 12.36 |
| 사용 살린:0.25M | pH6.3 | pH8.0 | pH9.8 | pH11.0 |
| T10 | 7.2 | 7.9 | 11.65 | 11.18 |
| T20 | 7.1 | 7.8 | 11.46 | 11.42 |
| T30 | 7.5 | 8.3 | 10.93 | 12.44 |
| T40 | 7.4 | 8.7 | 10.36 | 11.87 |
| T50 | 7.3 | 8.2 | 10.72 | 12.58 |
| T60 | 7.4 | 8.7 | 10.7 | 12.93 |
이 테이블들로부터 알 수 있는 바와 같이, 수행된 실험들에서는, 더 높은 pH 추출들은 각 염 레벨에서 단백질함량들이 더 높게 하였지만 염함량을 0.05M을 초과하게 증가시키면 단백질 용해성이 증가하지 않는다.
다음의 표 7은 각 pH 및 염레벨에서 단백질추출물의 330㎚에서의 흡수도를 보여준다.
| 0.0M | 0.05M | 0.10M | 0.15M | 0.25M | |
| pH 6.3 | 21.2 | 23.6 | 58.5 | 48.8 | 51.6 |
| pH 8.0 | 27.2 | 42.1 | 66.8 | 52 | 52.5 |
| pH 9.8 | 32.8 | 39.7 | 36.2 | 31.9 | 27.9 |
| pH 11.0 | 43.1 | 42.1 | 42.8 | 36.9 | 42.9 |
표 7로부터 알 수 있는 것처럼, 추출된 A330 색의 감소는 pH 9.8에서는 0.1M, 0.15M 및 0.25M의 추출들에서 발생한다. 이 pH에서, 색은 다른 pH값들보다 시각적으로 더 어둡게 보이고 상응하는 단백질함량의 강하는 없다. 위에서 지적된 바와 같이, 이러한 추출들의 단백질함량은 pH 9.8과 pH 11.0을 통해 계속 증가한다.
다음의 표 8은 한외여과 후이면서 투석여과 전에서의 단백질용액의 330㎚에서의 흡수도를 보여주며 표 9는 투석여과 후의 단백질용액의 A330을 보여준다. 이 표들로부터 알 수 있듯이, 각 조업에서, 미투과물의 A330은 투석여과된 후에 더 낮았다.
| 0.0M | 0.05M | 0.10M | 0.15M | 0.25M | |
| pH 6.3 | 41.7 | 49.3 | 71.4 | 63.5 | 67.6 |
| pH 8.0 | 59.8 | 52 | 77.4 | 63.4 | 66.2 |
| pH 9.8 | 39.9 | 61.6 | 59.1 | 45 | 38.5 |
| pH 11.0 | 50.9 | 70.4 | 56.4 | 55.4 | 60.1 |
| 0.0M | 0.05M | 0.10M | 0.15M | 0.25M | |
| pH 6.3 | 29.8 | 18.0 | 15.0 | 22.2 | 17.6 |
| pH 8.0 | 37.9 | 22.7 | 36.1 | 22.5 | 22.1 |
| pH 9.8 | 15.2 | 38.8 | 25.1 | 34.4 | 19.9 |
| pH 11.0 | 34.8 | 35.1 | 34.4 | 31 | 40.1 |
다음의 표 10은 투석여과를 이용하여 달성된 A330에서의 백분율감소를 보여준다.
| 0.0M | 0.05M | 0.10M | 0.15M | 0.25M | |
| pH 6.3 | 28.5 | 63.5 | 79.0 | 65.0 | 74.0 |
| pH 8.0 | 36.6 | 56.3 | 53.4 | 64.5 | 66.6 |
| pH 9.8 | 61.9 | 37 | 57.5 | 45.8 | 48.3 |
| pH 11.0 | 31.6 | 50.1 | 39.5 | 44.0 | 33.3 |
표 10으로부터 알 수 있듯이, A330 값의 최대의 감소는 pH 6.3에서 0.1M의 UF/DF를 행한 후에 달성된다. 검사된 5개의 다른 살린레벨들 가운데, 하나를 제외하고는 모든 것들에 대한 최저 A330값은 pH 6.3에서의 추출에 의해 달성되었다.
다음의 표 11은 최종 미투과물들의 다른 단백질농도들을 고려한 A330/g/L 단백질비율을 보여준다. 이 비율에서는, 낮은 결과의 항(member)에 의해 표시된 낮은 A330 및 높은 단백질함량이 가장 바람직하다.
| 0.0M | 0.05M | 0.10M | 0.15M | 0.25M | |
| pH 6.3 | 4.79 | 0.76 | 0.60 | 0.69 | 0.59 |
| pH 8.0 | 4.99 | 0.82 | 1.06 | 0.80 | 0.54 |
| pH 9.8 | 1.31 | 1.48 | 1.10 | 0.61 | n.a. |
| pH 11.0 | 0.69 | 0.80 | 0.96 | 0.83 | 0.67 |
표 11로부터 알 수 있듯이, A330 대 단백질의 비율이 고려되는 때에, 수행된 실험들에서, 최선의 결과들은 검사되는 각 pH레벨에 대해 0.25M 살린 시리즈(series)에서 나오고, 전체에서 최저의 A330/단백질 비율은 pH 0.8에서의 0.25M 추출에서 나온다.
한외여과 및 투석여과 둘 다로부터의 투과물 A330 데이터(미도시)의 시험은 더 많은 A330이 pH 9.8과 11.0에서보다 2가 낮은 pH레벨들에서 투과물을 통해 나타남을 시사한다.
흡수제들의 검사 시, 6.3과 8.0의 pH들에서, Polyclar는 미투과물들의 유리(free)페놀성분들(A330)을 감소시켰고 흡수단계 후에는 단백질의 감소를 보여주진 않았다. 그러나, pH 9.8 및 11.0의 Polyclar는 상당한 량의 유리페놀성분들을 회수하지 않는다. Amberlite XAD는 대부분의 경우에서 A330을 감소시켰고 높은 pH에서 행해졌으나, 단백질도 대략 매 경우에서 손실되었다.
검사된 다른 흡수제들 중, 실리카겔은 대부분의 경우들에서 A330을 감소시키는데 실패하였고 자주 시료를 구름모양으로 만들어, A330시도가 더 높아지게 하였다. Amberlite SF120은 낮은 pH레벨들에서 A330의 약간의 감소를 보여주었으나 높은 pH레벨들에서는 효과적인 것으로 보여지진 않았고 많은 경우들에서 단백질의 상당한 손실을 보여주었다. 이러한 시료들도 흡수제를 통과한 후 약간의 침전을 가졌다.
알갱이형 활성탄(GAC)은 낮은 pH레벨들에서는 미투과물들의 A330을 꽤 잘 감소시켰으나 pH 9.8과 11.0에서 A330을 효과적으로 감소시키지 않는다. GAC는 또한 검사들의 대부분에 대해 약간의 단백질의 손실을 나타내었다. GAC를 통과한 시료들은 잔류 탄소들의 존재로 인해 처리에 뒤이어서는 0.45μM 필터로 필터링되어야 했다.
예 2:
이 예는 추출단계에 대한 산화방지제 첨가의 효과를 예시한다.
용해된 산소의 99%를 제거하기 위해 아스크로브산의 첨가와 추출매질의 정화를 함께 하는 0.1M 살린으로 pH 8.0과 pH 6.3에서 추출들이 수행된 예 1의 절차가 반복되었다. A420 흡수는 가시적인 색의 측정으로서도 결정되었다.
다음의 표 12는 추출데이터를 보여준다
| 추출된 단백질g/L | 추출된 A330 | 추출된 A420 | |
| 0.1M, pH 8.0 | 11.07 | 38.3 | 11.29 |
| 0.1M, pH 8.0, 0.01% 아스크로브산 | 11.34 | 47.5 | 5.41 |
| 0.1M, pH 8.0, 0.05% 아스크로브산 | 12.18 | 47.2 | 4.96 |
표 12로부터 알 수 있듯이, 추출에 아스크로브산의 사용은 A420에 의해 보여진 것처럼 가시적인 색을 감소시킨다. 아스크로브산의 낮은 레벨들(0.05%)은 추출 A420, 또는 가시적인 색의 2배보다 큰 감소가 있게 한다.
다음의 표 13은 투석여과 미투과물 A330과 A420 시도들을 보여준다.
| UF미투과물A330 | DF미투과물A330 | DF미투과물A420 | DF미투과물g/L단백질 | 미투과물 A330/단백질비율 | |
| 0.1M, pH 8.0 | 44.1 | 14.8 | 4.3 | 27.6 | 0.54 |
| 0.1M, pH 8.0,0.01%아스크로브산 | 58.2 | 16.5 | 3.29 | 30.4 | 0.54 |
| 0.1M, pH 8.0,0.05% 아스크로브산 | 60.4 | 18.8 | 3.41 | 37.4 | 0.50 |
표 13으로부터 알 수 있듯이, 추출에서의 아스크로브산에 의한 A420의 감소는 투석여과 후에 여전히 반영된다. 아스크로브산을 이용한 추출들로부터 미투과물들의 A420은 추출에 아스크로브산을 가지지 않는 미투과물들보다 낮았다.
표 14는 미투과물들에서 A330 및 A420에 대한 Polyclar의 효과를 보여준다.
| 처리 전의 A330 | 처리 후의A330 | % A330감소 | 처리 전의 A420 | 처리 후의 A420 | % A420감소 | |
| 0.1M, pH 8.0 | 14.8 | 11.9 | 19.6 | 4.3 | 3.25 | 24.5 |
| 0.1M, pH 8.0,0.01%아스크로브산 | 16.5 | 10.1 | 38.8 | 3.29 | 2.41 | 26.8 |
| 0.1M, pH 8.0,0.05% 아스크로브산 | 18.8 | 13.5 | 28.2 | 3.41 | 2.78 | 18.5 |
표 14로부터 알 수 있듯이, 추출에 사용된 아스크로브산에 의한 감소된 A420은 흡수제로의 처리 후에도 여전히 존재한다. Polyclar는 각 시료의 A420을 감소시켰으나, 아스크로브산을 함유하는 2개의 시료들은 아스크로브산 없이 한 대조표준(control)보다 낮았다.
예 3:
이 예 또한 산화방지제를 이용한 추출에 대한 염 농도와 pH의 영향을 예시한다.
추출단계의 시작 전에 캐놀라기름씨거친가루 추출액에 0.5g(0.1%)의 아황산나트륨(Na2SO3)이 첨가되었다는 것을 제외하면 이 예는 예 1의 반복이다. 사용된 모든 다른 매개변수들은 투과체적값이 5였다는 것을 제외하면 예 1에서와 동일하였다.
다음의 표 15.1 내지 15.5는 각 pH 및 염 레벨에서 얻어진 단백질의 량들을 보여준다.
| 시간(분) | pH 6.3 | pH 8.0 | pH 9.8 | pH 11.0 |
| 10 | 4.5 | 11.0 | 11.4 | 12.2 |
| 20 | 5.6 | 6.1 | 8.8 | 14.3 |
| 30 | 6.2 | 6.0 | 10.0 | 14.2 |
| 40 | 6.6 | 6.1 | 11.0 | 14.1 |
| 50 | 7.8 | 6.4 | 10.9 | 14.5 |
| 60 | 6.2 | 6.8 | 11.1 | 13.7 |
표 15.2 0.05 NaCl 및 0.1% Na
2
SO
3
(g/L)로 행한 실험조업들의 추출비율
| 시간(분) | pH 6.3 | pH 8.0 | pH 9.8 | pH 11.0 |
| 10 | 9.2 | 8.9 | 8.9 | 11.1 |
| 20 | 8.7 | 8.7 | 9.9 | 11.1 |
| 30 | 9.2 | 8.5 | 9.0 | 12.2 |
| 40 | 9.1 | 8.4 | 10.6 | 12.4 |
| 50 | 9.5 | 8.5 | 10.1 | 13.0 |
| 60 | 10.5 | 7.3 | 10.9 | 13.8 |
표 15.3 0.10 NaCl 및 0.1% Na
2
SO
3
(g/L)로 행한 실험조업들의 추출비율
| 시간(분) | pH 6.3 | pH 8.0 | pH 9.8 | pH 11.0 |
| 10 | 8.4 | 8.3 | 9.2 | 11.3 |
| 20 | 9.7 | 9.1 | 10.3 | 11.5 |
| 30 | 140.1 | 9.0 | 10.3 | 11.3 |
| 40 | 9.2 | 9.0 | 9.8 | 11.4 |
| 50 | 10.4 | 9.4 | 10.0 | 12.3 |
| 60 | 10.1 | 9.1 | 10.8 | 11.3 |
표 15.4 0.15 NaCl 및 0.1% Na
2
SO
3
(g/L)로 행한 실험조업들의 추출비율
| 시간(분) | pH 6.3 | pH 8.0 | pH 9.8 | pH 11.0 |
| 10 | 8.8 | 11.0 | 11.2 | 13.0 |
| 20 | 9.5 | 10.6 | 12.5 | 13.7 |
| 30 | 8.3 | 11.4 | 12.6 | 14.0 |
| 40 | 8.8 | 10.8 | 12.4 | 14.4 |
| 50 | 9.6 | 10.5 | 12.7 | 13.6 |
| 60 | 9.8 | 10.6 | 12.5 | 14.1 |
표 15.5 0.25 NaCl 및 0.1% Na
2
SO
3
(g/L)로 행한 실험조업들의 추출비율
| 시간(분) | pH 6.3 | pH 8.0 | pH 9.8 | pH 11.0 |
| 10 | 11.5 | 10.7 | 12.7 | 12.3 |
| 20 | 11.0 | 12.8 | 14.0 | 13.0 |
| 30 | 12.1 | 13.4 | 14.8 | 13.4 |
| 40 | 11.8 | 18.4 | 14.6 | 13.1 |
| 50 | 12.3 | 12.4 | 14.7 | 14.1 |
| 60 | 12.2 | 13.4 | 15.2 | 14.4 |
이 표들로부터 알 수 있듯이, 추출들은 대부분의 실험조업들에서 약 30분에 평형에 도달하였다. 염이 첨가되지 않았을 때에, pH가 증가할수록 더 많은 단백질이 추출되었다. pH의 효과는 9.8을 넘는 높은 pH에서보다 8.0미만의 pH에서 덜 현저해 보였다(표 15.1.). 낮은 레벨들의 염의 첨가(0.01M 미만)는 pH 6.3 및 8.0에서 단백질추출능을 실질적으로 증가시킬 수 있었으나, 낮은 염 농축물들은 9.0 또는 11.0의 높은 pH레벨들에서는 단백질추출을 돕지 않는다(표 15.2와 15.3).
다음의 표 16은 단백질추출의 유리페놀함량(A330 흡수도)에 대한 pH 및 염화나트륨 농축용액의 효과를 보여준다.
| 0 NaCl | 0.05M NaCl | 0.10M NaCl | 0.15M NaCl | 0.25M NaCl | |
| pH 6.3 | 41.1 | 49.1 | 34.5 | 51.1 | 54.2 |
| pH 8.0 | 24.3 | 36 | 38.3 | 39.9 | 41.8 |
| pH 9.8 | 30 | 28.2 | 27.5 | 27.8 | 29 |
| pH 11.0 | 38.4 | 29.7 | 32.7 | 31.5 | 32.1 |
표 17로부터 알 수 있듯이, A330은 pH를 pH 9.8로 증가시키면 값이 감소하지만 단백질농도 역시 이 범위 내에서 증가함을 보여준다. 추출물의 색은 pH가 증가했을 때 시각적으로 더 어둡게 되었다. 염 농도는 색에 더 적은 영향을 가졌다.
다음의 표 17.1 내지 17.4는 한외여과로부터의 미투과물(표 17.1) 및 투과물(표 17.2)의 A330에 대한 그리고 투석여과로부터의 미투과물(표 17.3) 및 투과물(표 17.4)의 A330에 대한 pH 및 NaCl 농도의 효과를 보여준다.
| 0 NaCl | 0.05M NaCl | 0.10M NaCl | 0.15M NaCl | 0.25M NaCl | |
| pH 6.3 | 88.7 | 71.9 | 44.4 | 73.2 | 75.3 |
| pH 8.0 | 18.3 | 55.2 | 60.0 | 62.3 | 65.5 |
| pH 9.8 | 55.9 | 48.1 | 59.1 | 49.7 | 54.2 |
| pH 11.0 | 77.6 | 57.4 | 56.4 | 61.8 | 62.3 |
표 17.2 한외여과(Na
2
SO
3
이용)로부터의 미투과물의 A330에 대한 pH 및 NaCl 농도의 효과
| 0 NaCl | 0.05M NaCl | 0.10M NaCl | 0.15M NaCl | 0.25M NaCl | |
| pH 6.3 | 31.3 | 40.6 | 24.8 | 43.4 | 75.3 |
| pH 8.0 | 16.0 | 35.9 | 29.8 | 34.4 | 65.5 |
| pH 9.8 | 25.2 | 20.6 | 23.5 | 23.9 | 54.2 |
| pH 11.0 | 25.1 | 21.3 | 23.3 | 25.4 | 62.3 |
표 17.3 투석여과(Na
2
SO
3
이용)로부터의 미투과물의 A330에 대한 pH 및 NaCl 농도의 효과
| 0 NaCl | 0.05M NaCl | 0.10M NaCl | 0.15M NaCl | 0.25M NaCl | |
| pH 6.3 | 34.8 | 24.7 | 14.9 | 21.2 | 21.2 |
| pH 8.0 | 13.9 | 17.8 | 20.8 | 20.0 | 23.7 |
| pH 9.8 | 30.6 | 34.3 | 32.3 | 20.2 | 22.1 |
| pH 11.0 | 58.5 | 29.0 | 24.8 | 35.0 | 24.5 |
표 17.4 투석여과(Na
2
SO
3
이용)로부터의 미투과물의 A330에 대한 pH 및 NaCl 농도의 효과
| 0 NaCl | 0.05M NaCl | 0.10M NaCl | 0.15M NaCl | 0.25M NaCl | |
| pH 6.3 | 7.0 | 8.5 | 6.3 | 7.9 | 8.5 |
| pH 8.0 | 3.1 | 10.0 | 6.0 | 6.5 | 5.7 |
| pH 9.8 | 8.3 | 8.0 | 6.9 | 7.0 | 5.7 |
| pH 11.0 | 6.8 | 5.4 | 5.1 | 5.8 | 5.2 |
한외여과는 추출물의 단백질을 4배로 농축시키므로, 미투과물은 시각적으로훨씬 더 어두웠고 pH 8.0에서 0.0 NaCl을 제외한 추출물(표 17.1) 보다 A330 시도가 더 높았지만, 후자는 이례적인 결과인 듯하다. UF 전의 원 추출물과 마찬가지로, A330에서의 최소는 pH 9.8에서 발생하였고 이는 앞서 논의된 이유에 관한 실제 시각적인 색의 어두움에 의해 지지되지 않은 것이었다. A330에의 측정으로, UF는 투과물의 높은 A330 시도에 의해 보여진 것처럼 추출물로부터 실질적인 량의 페놀성분을 회수하였다(표 17.2 참조).
표 17.3으로부터, 투석여과 미투과물이 UF 미투과물(표 17.1)보다 훨씬 낮은 A330 시도를 가졌음을 알 수 있었다. DF투과물(표 17.4)이 UF투과물(표 17.4)의 그것만큼 높은 A330에서의 시도를 가지지 않았지만, 그럼에도 불구하고 DF는 남아있는 페놀성분의 상당한 량의 추가적인 제거를 하였다. 투석여과에 의한 이러한 추가적 페놀성분 제거는 A330이 UF미투과물(표 7.1)보다 DF미투과물(표 17.3)에서 훨씬 낮게 하였다.
다음의 표 18.1 내지 18.4는 미투과물의 A330에 대한 흡수제들과 pH의 영향을 보여준다.
| pH | 대조표준 | Polyclar | XAD | SF 120 | 실리카겔 |
| 6.3 | 24.7 | 14.8 | 21.7 | 19.5 | 20.8 |
| 8.0 | 17.8 | 13.8 | 15.8 | 18.8 | 19.9 |
| 9.8 | 34.3 | 30.3 | 32.4 | 38.6 | 41.2 |
| 11.0 | 29 | 28.7 | 25.1 | 29.8 | 30.5 |
표 18.2 미투과물(0.1%의 Na
2
SO
3
을 갖는 0.10M NaCl)의 A330에 대한 흡수제들 및 pH의 영향
| pH | 대조표준 | Polyclar | XAD | SF 120 | 실리카겔 | GAC |
| 6.3 | 14.9 | 10.9 | 9.5 | 14.6 | 12.6 | 11.8 |
| 8.0 | 20.8 | 15.8 | 16.6 | 19.9 | 22.7 | 19.1 |
| 9.8 | 32.3 | 22.7 | 32 | 31.1 | 36.2 | 26.4 |
| 11.0 | 24.8 | 23.3 | 23.3 | 26.5 | 28.2 | 26.6 |
표 18.3 미투과물(0.1%의 Na
2
SO
3
을 갖는 0.15M NaCl)의 A330에 대한 흡수제들 및 pH의 영향
| pH | 대조표준 | Polyclar | XAD | SF 120 | 실리카겔 | GAC |
| 6.3 | 21.2 | 13.5 | 15.7 | 18.3 | 18.7 | 19.4 |
| 8.0 | 20 | 16 | 16.3 | 17.9 | 19.5 | 19.5 |
| 9.8 | 20.2 | 18 | 16.1 | 21 | 29.8 | 20 |
| 11.0 | 35 | 28 | 31.6 | 33.6 | 35.2 | 34.2 |
표 18.4 미투과물(0.1%의 Na
2
SO
3
을 갖는 0.25M NaCl)의 A330에 대한 흡수제들 및 pH의 영향
| pH | 대조표준 | Polyclar | XAD | SF 120 | 실리카겔 | GAC |
| 6.3 | 21.2 | 15.9 | 16.6 | 21.4 | 20.4 | 21.4 |
| 8.0 | 23.7 | 16.1 | 21 | 24.5 | 25.7 | 24.5 |
| 9.8 | 22.1 | 19.1 | 21.1 | 22.9 | 26.5 | 22.7 |
| 11.0 | 24.5 | 22.8 | 21.1 | 24.2 | 27.5 | 25.1 |
표 18.1 내지 18.4로부터 알 수 있듯이, 낮은 pH(<9.8)에서, 검사된 모든 흡수제들 중의 Polyclar는 최종 미투과물의 A330시도를 감소시키는데 특히 효과적이었다. 표 18.1에 보인 것처럼, A330 값은 40%까지 만큼 감소되었다.
다른 흡수제들도 pH 및 염농도의 특정 조건들 하에서 A330시도들을 낮출 수 있었지만, 그것들의 효과는 Polyclar의 그것과 비교했을 때 약간 중요하지 않았다. 9.8의 pH가 사용되었을 때, Polyclar은 A330을 낮추는데 덜 유용하였다.
다음의 표 18.5 내지 18.8은 미투과물의 단백질농도(g/L)에 대한 흡수제들의효과를 보여준다.
표 18.5 미투과물(0.1%의 Na
2
SO
3
을 갖는 0.05M)의 단백질농도에 대한 흡수제들 및 pH의 영향
| pH | 대조표준 | Polyclar | XAD | SF 120 | 실리카겔 |
| 6.3 | 51.5 | 53.2 | 47.1 | 46.3 | 46.5 |
| 8.0 | 39 | 46 | 37.2 | 48.5 | 41.4 |
| 9.8 | 40.4 | 41.1 | 38.5 | 38.3 | 41.1 |
| 11.0 | 48.2 | 51.5 | 47.5 | 50.6 | 49.1 |
표 18.6 미투과물(0.1%의 Na
2
SO
3
을 갖는 0.10M)의 단백질농도에 대한 흡수제들 및 pH의 영향
| pH | 대조표준 | Polyclar | XAD | SF 120 | 실리카겔 | GAC |
| 6.3 | 43.6 | 46 | 41.4 | 43.9 | 45.7 | 44.3 |
| 8.0 | 50.5 | 55.1 | 51.7 | 50.3 | 52 | 52.8 |
| 9.8 | 42.3 | 47.3 | 43.9 | 44.2 | 45.4 | 46 |
| 11.0 | 38 | 42 | 36.3 | 38.2 | 39.4 | 39.8 |
표 18.7 미투과물(0.1%의 Na
2
SO
3
을 갖는 0.15M)의 단백질농도에 대한 흡수제들 및 pH의 영향
| pH | 대조표준 | Polyclar | XAD | SF 120 | 실리카겔 | GAC |
| 6.3 | 33.5 | 36.2 | 32.3 | 34.7 | 36.9 | 33.3 |
| 8.0 | 46.8 | 48.7 | 44.2 | 46.4 | 48.2 | 47.4 |
| 9.8 | 39.5 | 40.9 | 36.2 | 39.7 | 39.7 | 40.4 |
| 11.0 | 56.2 | 59.5 | 50.4 | 55.8 | 60.1 | 58.5 |
표 18.8 미투과물(0.1%의 Na
2
SO
3
을 갖는 0.25M)의 단백질농도에 대한 흡수제들 및 pH의 영향
| pH | 대조표준 | Polyclar | XAD | SF 120 | 실리카겔 | GAC |
| 6.3 | 38.8 | 41.7 | 36.2 | 38.4 | 40.7 | 39 |
| 8.0 | 44.7 | 46.4 | 41.4 | 43.5 | 45.8 | 45.8 |
| 9.8 | 50.3 | 54 | 48.8 | 50.5 | 52.2 | 51.7 |
| 11.0 | 41.9 | 47.2 | 28.6 | 41.4 | 44.6 | 42.7 |
표 18.5 내지 18.8로부터 알 수 있듯이, 단백질이 한외여과에 의해 많이 농축되었음에도 불구하고, 검사된 모든 흡수제들은 염과 pH의 모든 조합들에서 미투과물의 단백질농도에 대해 상당히 불활성이었다.
예 4:
이 예는 아황산나트륨의 정화된 추출의 낮은 레벨들을 이용한 효과를 설명한다.
예 3의 과정은 Polyclar를 흡수제로서 사용하여 pH 8.0에서 3번의 실험조업들에 대해 낮은 레벨의 아황산나트륨(0.05wt% Na2SO3)을 이용하여 반복되었다. A330 외에도 A420이 측정되었다.
다른 세트의 실험들에서, 0.05wt% Na2SO3을 함유한 추출용액도 추출 전과 추출 중에 헬륨으로 정화되었다.
다음의 표 19.1은 단백질추출물에 대한 이러한 변형들의 효과를 보여준다.
| 0.1% Na2SO3 | 0.05% Na2SO3 | He 정화 | |
| 0.05M NaCl | 8.9 | 11.8 | 11.5 |
| 0.10M NaCl | 9.0 | 12.7 | 12.0 |
| 0.15M NaCl | 11.4 | 14.3 | 14.5 |
표 19.1로부터 알 수 있듯이, 모든 3개의 염첨가레벨들에서, 추출물의 단백질농도는 감소된 량들의 아황산나트륨이 사용되었을 때 약 40wt%만큼 증가되었다. 염농도가 높을수록 단백질농도가 높았다. 헬륨 정화는 단백질추출물에 대해 필요하지 않았다.
표 19.2는 A330에서의 색에 대한 이러한 변형들의 효과를 보여준다.
표 19.2 330㎚에서의 흡수도
| 0.1% Na2SO3 | 0.05% Na2SO3 | He 정화 | |
| 0.05M NaCl | 36.0 | 40.5 | 35.9 |
| 0.10M NaCl | 38.3 | 36.6 | 42.3 |
| 0.15M NaCl | 39.9 | 43.4 | 42.7 |
표 19.2로부터 알 수 있듯이, Na2SO3의 감소는 추출물의 A330에 현저히 영향을 주지 않는다. 헬륨정화가 용해된 산소의 99%를 제거하였지만, 추출물의 흡수도는 330㎚ 또는 420㎚의 어느 것에서도 개선되지 않았다(아래의 표 19.3).
표 19.3 A420에서의 추출물의 흡수도
| 정화없음 | He 정화 | |
| 0.05M NaCl | 9.0 | 9.4 |
| 0.10M NaCl | 8.8 | 7.1 |
| 0.15M NaCl | 8.4 | 10.0 |
다음의 표 10은 미투과물의 A330 및 A420에 대한 막처리의 효과를 보여준다.
| 추출물 | UF미투과물 | DF미투과물 | ||||
| 염 | A330 | A420 | A330 | A420 | A330 | A420 |
| 0.05M | 40.5 | 9.0 | 57.9 | 10.9 | 20.7 | 4.1 |
| 0.10M | 36.6 | 8.8 | 55.9 | 10.9 | 15.1 | 3.5 |
| 0.15M | 43.4 | 8.4 | 69.9 | 11.4 | 20.2 | 5.4 |
| 0.05M w He* | 35.9 | 9.4 | 55.3 | 12.4 | 18.3 | 4.0 |
| 0.10M w He | 42.3 | 7.1 | 67.0 | 10.4 | 20.5 | 4.7 |
| 0.15M w He | 42.7 | 10.0 | 61.3 | 12.9 | 20.2 | 4.3 |
표 20에서 *는 헬륨정화임.
표 20에서 알 수 있듯이, 투석여과는 추출물에서의 색 성분들을 실질적으로 제거하였다. 최종 미투과물들에 대한 A330 및 A420 시도들 둘 다는 원 추출물의 그것들의 약 절반이었다. 헬륨 정화는 A330 또는 A420에 영향을 주지 않았다.
다음의 표 21은 미투과물의 A330 및 A420에 대한 Polyclar의 효과를 보여준다.
| 대조표준 | Polyclar* | |||
| A330* | A420* | A330 | A420 | |
| 염 | ||||
| 0.05M | 20.7 | 4.1 | 14.9(28%) | 3.6(12%) |
| 0.10M | 15.1 | 3.5 | 11.3(25%) | 2.7(23%) |
| 0.15M | 20.2 | 5.4 | 16.1(20%) | 4.6(15%) |
| 0.05M w He** | 18.3 | 4.0 | 12.5(32%) | 3.6(10%) |
| 0.10M w He | 20.5 | 4.7 | 18.5(10%) | 4.1(13%) |
| 0.15M w He | 20.2 | 4.3 | 13.9(31%) | 3.8(12%) |
표 21에서 *괄호속의 수는 감소 백분율이고 **는 헬륨정화된 것이다.
예 5:
이 예는 산화방지제 및 투석여과를 이용한 상업적 캐놀라거친가루로부터의 캐놀라단백질분리물의 제조를 예시한다.
150kg의 상업적 캐놀라거친가루(높은 온도에서 토스트된 거친가루)는 0.5kg(0.05wt%) 아스크로브산을 함유한 0.15M NaCl 1000L에 16℃에서 첨가되었고 30분 동안 저어져 20.2g/L의 단백질함량을 갖는 수용성단백질을 제공하였다. 잔류 캐놀라거친가루는 진공필터벨트 상에서 제거되었고 세척되었다. 결과적인 단백질용액은 원심분리 및 여과에 의해 정제되어 14.6g/L의 단백질함량을 갖는 정화된 단백질용액 1040L을 생산하였다.
단백질추출용액은 5000달톤의 분획분자량의 막을 사용하는 한외여과시스템에서 농축에 의해 45L로 체적이 감소되었다. 그 후 단백질추출용액은 투석여과시스템에서 5000달톤의 분획분자량 막들과 0.05wt% 아스크로브산을 함유한 45L의 0.15M NaCl용액을 사용하여 225g/L의 단백질함량의 44L의 최종체적으로 투석여과되었다.
30℃의 농축되고 투석여과된 용액은 1:15로 4℃의 물로 희석되었다. 단백질미셀들의 백색구름들이 즉시 형성되었고 침전될 수 있었다. 상부 희석용 물은 제거되었고 침전된 점성 점착성의 덩어리(PMM)가 용기의 바닥으로부터 회수되고 말려졌다. 건조된 단백질은 103.2wt%(N x 6.25) d.b의 단백질함량을 가짐을 확인할 수 있었다.
미셀형성으로부터의 620L의 상층액은 한외여과시스템에서 5000달톤 분획분자량의 막들을 사용한 농축에 의해 30L로 농축되었다. 농축된 상층액은 그 후 투석여과시스템에서 5000달톤의 분획분자량의 막들과 100L의 물을 사용하여 121.8g/L의 단백질함량을 갖는 27L의 최종 체적으로 투석여과되었다.
농축되고 투석여과된 용액은 건조되었다. 건조된 단백질은 100.8wt%(N x 6.25) d.b의 단백질함량을 가짐을 확인할 수 있었다.
PMM유래 캐놀라단백질분리물(CPI)과 상층액유래 캐놀라단백질분리물의 시료들은 밝기(L)와 색도(a 및 b)에 관해 미놀타(CR-310) 측색계(colorimeter)를 사용하여 평가되었다. 실험실공간에서, 그 값은 100을 백색 그리고 0을 흑색으로 하여 0에서부터 100으로 이동한다. 색도(chromaticity)좌표들인 a와 b 둘 다는 +a를 적색방향, -a를 녹색방향, +b를 노란색방향 그리고 -b를 청색방향으로 하여 +60 및 -60의 최대값들을 가진다.
다음의 표 22는 얻어진 결과들을 보여준다.
| 시료 | L | a | b |
| PMM유래 CPI | 83.08 | -1.58 | +27.89 |
| 상층액유래 CPI | 79.38 | -0.11 | +20.46 |
캐놀라단백질분리물들은 이 과정 후에 아스크로브산(산화방지제로서)의 첨가와 투석여과단계들(데이터는 미도시)을 생략하여 생산된 분리물들보다 더 밝고(L) 덜 노란(b) 색을 나타내었다.
예 6:
이 예는 저온 토스트된 거친가루 및 공기탈용매화된 거친가루로부터의 단백질추출물들의 색에 대한 온도의 효과를 예시한다.
(a) 저온 토스트된(100℃) 캐놀라기름씨거친가루(LT)와 (b) 공기탈용매화된(20℃) 캐놀라기름씨거친가르(마크(Marc))의 75g 시료들이 주위 또는 실온(RT), 55℃, 60℃ 및 65℃의 0.15M NaCl의 500ml시료들에 첨가되었고, 용액의 온도를 실질적으로 일정하게 유지하면서 30분 동안 교반되어 단백질수용액을 제공하였다. 단백질수용액의 시료들은 5, 10, 15, 20 및 30분들에서 분석을 위해 취해졌다. 소비된 거친가루는 10,000xg에서 5분 동안의 원심분리에 의해 분리되었고 동결건조되었다.
A330 및 A420에서의 흡수도들은 각종 단백질용액 시료들에 대해 결정되었다. 이에서 이미 지적된 바와 같이 A330에서의 UV흡수도는 용액 중의 페놀성분들의 농도를 나타내고 A420에서의 흡수도는 실제 색의 더 직접적인 측정이다. 각종 시료들의 데이터는 다음의 표 23 및 24에 기재되어 있다.
| 추출온도(분) | RT | 55℃ | 60℃ | 65℃ | ||||
| A330 | A420 | A330 | A420 | A330 | A420 | A330 | A420 | |
| 5 | 80.7 | 1.96 | 97.2 | 2.70 | 99.8 | 3.03 | 98.3 | 2.84 |
| 10 | 88.9 | 2.42 | 92.0 | 2.77 | 98.0 | 3.07 | 93.9 | 2.95 |
| 15 | 92.5 | 2.50 | 89.1 | 2.94 | 95.6 | 3.10 | 93.0 | 3.05 |
| 20 | 90.7 | 2.55 | 86.1 | 2.90 | 93.7 | 3.23 | 90.7 | 3.16 |
| 30 | 90.7 | 2.56 | 88.2 | 3.22 | 97.8 | 3.47 | 88.1 | 3.24 |
| 추출온도(분) | RT | 55℃ | 60℃ | 65℃ | ||||
| A330 | A420 | A330 | A420 | A330 | A420 | A330 | A420 | |
| 5 | 120.3 | 2.73 | 118.8 | 2.94 | 120.5 | 3.08 | 128.4 | 3.16 |
| 10 | 116.7 | 2.73 | 118.5 | 3.07 | 121.1 | 3.15 | 127.4 | 3.19 |
| 15 | 117.0 | 2.78 | 119.5 | 3.20 | 116.3 | 3.09 | 112.5 | 3.04 |
| 20 | 119.1 | 2.84 | 113.1 | 3.17 | 112.9 | 3.19 | 121.6 | 3.09 |
| 30 | 114.1 | 2.74 | 113.1 | 3.23 | 114.6 | 3.22 | 119.1 | 3.00 |
표 24와 25로부터 알 수 있듯이, 추출온도의 평가는 검사된 각 거친가루의 유형에 대해 추출된 단백질용액의 A330에 대한 상당한 영향은 없었으나 더 높은 온도들에서는 A420 시도들에서 약간의 증가가 있었다.
예 7:
이 예는 특정 캐놀라기름씨거친가루들로부터의 단백질추출물들의 색에 대한 특정 매개변수들의 효과들을 보여준다.
제1세트의 실험들에서, (a) 100℃에서 저온토스트된(LT 거친가루) 또는 (b) 20℃에서 공기탈용매화된(마크거친가루) 캐놀라기름씨거친가루의 50g 시료들이 실온(20℃)에서 0.05M 또는 0.10M NaCl용액의 500mL 시료들에 첨가되었고 15분 동안 교반되었다. 그 슬러리는 5000xg에서 10분 동안 소비된 거친가루를 제거하기 위해원심분리되었다.
제2세트의 실험들에서, 염이 첨가되지 않은 500mL의 물이 먼저 핫플레이트교반기에서 60℃로 가열되었다. 그 후 (a) 100℃에서 저온토스트된 또는 (b) 20℃에서 공기탈용매화된(마크거친가루) 50g의 캐놀라기름씨거친가루가 첨가되었고 그 온도를 유지하면서 15분 동안 교반되었다. 추출물은 소비된 거친가루로부터 5000xg에서 10분 동안의 원심분리에 의해 분리되었다.
A330 및 A420에서의 흡수도들 및 단백질농도들은 각종 단백질용액들에 대해 결정되었다. 얻어진 결과들은 다음의 표 25.1 및 25.2에 기재되어 있다.
| 0.05M 살린 | 0.01M 살린 | 60℃ 물 | ||||
| A330 | A420 | A330 | A420 | A330 | A420 | |
| LT거친가루 | 62.4 | 1.88 | 64.4 | 1.84 | 55.4 | 2.10 |
| 마크거친가루 | 77.7 | 1.82 | 85.5 | 2.10 | 78.0 | 2.13 |
표 25.2
| 0.05M 살린 | 0.01M 살린 | 60℃ 물 | |
| LT거친가루 | 1.11 | 1.44 | 0.98 |
| 마크거친가루 | 2.09 | 2.04 | 1.38 |
표 25.1 및 25.2에서 얻어진 결과들로부터 알 수 있듯이, A330값들은 단백질농도의 증가와 함께 증가되었으나 A420에 의해 표시된 것처럼 색의 세기는 단백질농도와 함께 현저히 변하지 않았고, 이는 시각적인 관측과 일치한다. 이러한 결과들은 높은 단백질수율과 함께 밝은 생성물이 저온토스트된 거친가루에 비해 공기탈용매화된 거친가루로부터 기대될 수 있다는 것을 보여준다.
예 8:
이 예는 생성물의 색에 대한 캐놀라단백질분리물의 용매추출의 효과를 보여준다.
PMM유래 캐놀라단백질분리물들의 혼합물이 3개의 분리과정들로부터, 이를테면 PMM유래 분리물들인 D29-02A C300(57.9wt%), D24-02A C300(34.7wt%) 및 D11-02A C300(7.4wt%)(복합물 6)로 형성되었다. 이에 더하여 상층액유래 캐놀라단백질분리물들의 혼합물이 3개의 분리과정들로부터 이를테면 상층액유래 분리물들인 E29-02A C200(18.7wt%), D29-02A C200(40.1wt%) 및 E14-02A C200(41.2wt%)(복합물 7)로 형성되었다.
개별 캐놀라단백질분리물들을 제조하는데 이용된 구체적인 절차들은 다음과 같다.
'a'kg의 상업적 캐놀라거친가루가 'b'L의 0.15M NaCl 용액에 주위온도에서 첨가되었고, 30분 동안 교반되어 'c'g/L의 단백질함량을 갖는 단백질수용액이 제공되었다. 잔류 캐놀라거친가루는 제거되었고 진공필터벨트에서 세척되었다. 결과적인 단백질용액은 원심분리 및 여과에 의해 정화되어 'e'g/L의 단백질함량을 갖는 정화된 'd'L의 단백질용액이 생성되었다.
'f'L 분취액의 단백질추출용액은 한외여과시스템에서 'h'달톤 분획분자량의 막들을 사용한 농축에 의해 'g'L로 체적이 감소되었다. 결과적인 농축 단백질용액은 'i'g/L의 단백질함량을 가졌다.
'j'℃의 농축된 용액은 'k'배 4℃의 물로 희석되었다. 백색구름이 즉시 형성되었고 침전될 수 있었다. 상부의 희석용 물은 제거되었고, 침전된 점성 점착성의덩어리(PMM)는 추출된 단백질의 'l'wt%의 수율로 용기의 바닥으로부터 회수되었다. 건조된 PMM유래 단백질은 'm'%(N x 6.25) d.b의 단백질함량을 가짐이 확인되었다. 생성물은 표시 'n'이 주어졌다.
다음의 표 26은 매개변수들인 'a' 내지 'm'의 값들을 제공한다.
| n | BW-AL017-D11-02A C300 | BW-AL017-D24-02A C300 | BW-AL017-D29-02A C300 | BW-AL017-E14-02A C300 | BW-AL018-E29-02A C300 |
| a | 1200 | 150 | 150 | 150 | 150 |
| b | 8000 | 1000 | 1000 | 999 | 1001 |
| c | 26.3 | 25.7 | 20.2 | 20 | 24.4 |
| d | 5882 | 1152 | 1040 | 1245 | 1075 |
| e | 17.7 | 16.6 | 14.6 | 10.2 | 17.8 |
| f | 5882 | 1080 | 1040 | 1194 | 820 |
| g | 92 | 53 | 44.25 | 39 | 24 |
| h | 5000 | 5000 | 5000 | 5000 | 5000 |
| i | 289 | 246.8 | 225 | 238 | 289 |
| j | 31 | 32 | 32 | 32 | 32 |
| k | 1:15 | 1:15 | 1:15 | 1:15 | 1:15 |
| l | 8.5 | 37.3 | 29.4 | 27.7 | 23.9 |
| m | 104.4 | 105.1 | 103.2 | 100.1 | 102.4 |
제거된 희석용 물은 'o'달톤 분획분자량 막을 사용한 한외여과에 의해 'p'g/L의 단백질농도로 체적이 감소되었다. 농축물은 건조되었다. 상층액으로부터 회수된 추가의 단백질로, 전체 단백질회수는 추출된 단백질의 'q'wt%였다. 형성된 건조 단백질은 'rwt%(N x 6.25) d.b의 단백질함량을 가졌다.
생성물은 표시 's'가 주어졌다. 다음의 표 27은 매개변수들인 'o' 내지 'r'에 대한 값들을 제공한다.
| s | BW-AL017-D11-02A C200 | BW-AL017-D24-02A C200 | BW-AL017-D29-02A C200 | BW-AL017-E14-02A C200 | BW-AL018-E29-02A C200 |
| o | 3000 | 5000 | 5000 | 5000 | 5000 |
| p | 237.6 | 194.4 | 121.8 | 115.8 | 100.1 |
| q | 15.5 | 55.4 | 45.7 | 44.4 | 35.2 |
| r | 98.7 | 97.8 | 100.8 | 98.7 | 97.5 |
1.4kg의 복합물 6은 3L의 알코올(변성: 85% 에탄올/15%나무알코올, VWR Canlab D 및 3L의 역삼투(RO) 정화수의 혼합물에 분산되었다. 이 혼합물은 오버헤드교반기를 사용하여 30분 동안 교반되었다. 고체 재료들은 8000g에서 5분 동안 배치들의 시료를 원심분리함으로써 덩어리액체로부터 분리되었다.
펠릿들은 그 후 재분산되었고 3L의 에탄올과 3L의 RO수의 추가의 혼합물에서 30분 동안 저어져서 분리되었다. 다시 원심분리(8000g/5분)가 고체 시료들을 수집하기 위해 사용되었다. 그 후 펠릿들은 시료로부터 물을 제거하기 위해 4L의 알코올에 분산되었다. 고체 재료는 원심분리(8000g/5분)에 의해 수집되었고 4L의 신선한 에탄올에 재분산되었다.
다시 원심분리(8000g/5분)가 고체들을 수집하기 위해 사용되었다. 펠릿들은 분쇄되었고 베이킹시트에 흩어지고 건조되도록 연기후드(fumehood)에 놓여졌다.
이 과정은 4.2L의 에탄올과 1.8L의 역삼투 정화수의 혼합액에 분산된 1.4kg의 복합물 7을 사용하여 반복되었다. 펠릿들은 4.2L의 에탄올과 1.8L의 RO수의 신선한 혼합액에 분산되었다.
얻어진 단백질분말들과 용매추출 시료들은 총 단백질함량에 관해 HPLC에 의해 분석되었다. 단백질분말들은 수분함량에 관해서도 분석되었다. 용매추출 시료들은 그것들의 페놀성분함량(330㎚에서의 흡수도)과 가시적인 색(420㎚에서의 흡수도)의 표시를 제공하기 위해 분광측광기(spectrophotometer)를 사용하여 검사되었다. 건조 단백질 생성물들의 색은 미놀타 CR-310 색계량기를 사용하여 평가되었다.
에탄올/물로 추출된 복합물 6의 회수는 86wt%였고 복합물 7의 경우 90wt%였다. 생성물 손실들은 추출용매의 용해도 때문이었고 다음의 표 28은 용매추출물의 단백질함량을 제공한다.
| 시료 | wt% 단백질 |
| 복합물 6 - 제1추출 | 1.12 |
| 복합물 6 - 제2추출 | 0.46 |
| 복합물 7 - 제1추출 | 1.55 |
| 복합물 7 - 제2추출 | 1.27 |
다른 손실들은 시료들의 취급으로 인한 재료손실이라 생각할 수 있다.
얻어진 색 시도들은 다음의 표 29에 기재되어 있다.
| 시료 | L | a | B |
| 추출전 복합물 6 | 81.49 | +0.12 | +24.37 |
| 추출후 복합물 6 | 83.53 | -0.56 | +14.18 |
| 추출전 복합물 7 | 79.68 | +0.20 | +19.69 |
| 추출후 복합물 7 | 80.67 | +0.13 | +14.72 |
표 29의 데이터로부터 알 수 있듯이, 양 복합물 6과 복합물 7의 경우, 캐놀라단백질분리물의 추출은 밝기(L)의 증가, "a"값의 감소 및 "b"값의 감소가 일어나게 하였다. L값의 증가는 생성물이 더 희고 덜 어둡다는 것을 의미한다. "a"값의 감소는 적색에서 녹색쪽으로의 색의 이동에 상응하고 "b"값의 감소는 노란색에서 청색쪽으로의 색의 이동에 상응한다. 시료들의 붉기(redness)의 노란기(yellowness)의 감소는 페놀성 화합물들 및/또는 그것들의 반응산물들의 제거를 나타낸다.
다음의 표 30은 용매추출물들에 관한 흡수도시도들을 제공한다.
| 시료 | A420 | A330 |
| 복합물 6 - 제1추출 | 3.19 | 21.60 |
| 복합물 6 - 제2추출 | 0.82 | 6.00 |
| 복합물 7 - 제1추출 | 3.20 | 11.40 |
| 복합물 7 - 제2추출 | 0.80 | 3.00 |
표 30으로부터 알 수 있듯이, 추출물들은 밝은 색이고, 이는 단백질분리물로부터의 착색제들의 추출을 의미한다.
표 31은 용매 추출된 단백질분리물들의 단백질함량(N x 6.25. 백분율 질소값들은 Leco FP52D 질소결정기를 사용하여 결정되었다)과 수분함량을 보여준다.
| 시료 | 단백질함량(wt% w.b.) | 수분함량(wt%) |
| 복합물 6 | 97.35 | 6.13 |
| 복합물 7 | 94.09 | 3.75 |
표 31로부터 알 수 있는 바와 같이, 용매추출된 생성물들은 수분이 낮았고 분리물들로서 분류하려는 생성물들에 대해 충분히 높은 단백질함량을 가졌다.
예 9:
이 예는 캐놀라단백질분리물의 생성 시의 산화방지제 및 흡수제의 사용을 예시한다.
저온(100℃)에서 탈용매화된 150kg의 상업적 캐놀라기름씨거친가루는 1000L의 0.15M NaCl에 첨가되었고 21℃의 실온에서 30분 동안 혼합되었다. 15분의 혼합 후에 0.05wt%(500g)의 아스크로브산이 산화방지제로서 슬러리에 첨가되었다.
잔류 캐놀라거친가루는 제거되었고 진공필터벨트에서 세척되어 23.9g/L의 단백질함량을 갖는 953.5L의 단백질용액이 얻어졌다. 이 용액의 UV흡수도는 61.2였다.
21.2kg(2.2wt%) Polyclar Super R이 953.5L의 단백질용액에 첨가되었고 1분 동안 실온에서 혼합되었다. 그 후, Polyclar는 단백질용액을 디슬러거(desludger)원심분리기를 통과시킨 다음 20 및 0.2 μM 필터패드들을 각각 담고 있는 필터프레스들을 통과시킴으로써 제거되었다. Polyclar의 제거 후, 19.9g/L의 단백질함량과 33.2의 A330흡수도를 가지는842L의 캐놀라단백질용액이 수집되었다. 그러므로 A330 흡수도의 현저한 저하가 매우 낮은 단백질손실과 함께 얻어졌다.
정화된 용액은 그 후 5000달톤 분획분자량의 막들을 사용하는 한외여과시스템에서 338.4g/L의 단백질함량 및 20.4의 A330을 갖는 30L의 체적으로 농축되었다. 농축된 단백질추출용액은 5000달톤 분획분자량의 막들을 사용하는 한외여과시스템에서 0.05wt%의 아스크로브산을 함유한 300L의 0.15 NaCl로써 투석여과되었다. 결과적인 29.0L의 농축되고 투석여과된 캐놀라단백질용액은 299.7g/L의 단백질함량과 25.6의 A330을 가졌다.
예 1 내지 3과 5에 보인 결과들과는 대조적으로, 투석여과는 A330에 대한 영향이 적었는데, 이는 Polyclar가 농축단계 전에 캐놀라단백질용액으로부터 많은 유리페놀성분을 미리 제거하였기 때문이다.
31℃의 농축되고 투석여과된 용액은 6.4℃의 온도를 갖는 15배 체적의 물로 희석되었다. 단백질미셀들의 백색구름이 즉시 형성되었고 4시간 동안 침전될 수 있게 하였다. 상부의 희석용 물은 제거되었고 침전된 점성 점착성의 덩어리(PMM)(40.6kg)가 용기의 바닥으로부터 회수되었고 분무건조되었다. 건조된 단백질분리물은 98.8wt%(N x 6.25) d.b의 단백질함량을 가졌다.
미셀형성에 유래하고 13.3g/L의 단백질함량을 갖는 440L의 상층액이 5,000달톤 분획분자량의 막들을 사용하는 한외여과시스템에서의 농축에 의해 30L로 농축되었다. 농축된 상층액은 그 후 투석여과시스템에서 5,000달톤 분획분자량의 막들과 5배 체적의 물을 사용하여 투석여과되었다. 결과적인 용액은 161.0g/L의 단백질함량과 10.8의 A330을 가졌다.
농축되고 투석여과된 용액은 건조되었고 건조된 단백질은 95.6wt%(N x 6.25) d.b의 단백질함량을 가짐이 확인되었다.
PMM유래 캐놀라단백질분리물(PCI)과 상층액유래 캐놀라단백질분리물의 시료들은 밝기(L)와 색도(a 및 b)에 관해 미놀타 CR-310 색계측기를 사용하여 분석되었다.
다음의 표 32는 얻어진 결과들을 보여준다.
| 시료 | L | a | b |
| PMM유래 CPI | 81.64 | -1.46 | 29.57 |
| 상층액유래 CPI | 81.24 | -0.76 | 21.15 |
예 10:
이 예는 추출단계에서의 산화방지제 및 흡수제의 사용을 예시한다.
작업대(bench)규모의 실험들이 행해져, 100℃에서 탈용매화된 상업적 캐놀라기름씨거친가루의 시료들이 0.15M NaCl로 15wt%의 농도에서 30분 동안 추출되었다. 추출들은 가변하는 레벨들, 즉, 0.5wt%, 1.0wt%, 1.5wt%, 2.0wt%, 2.5wt%, 3.0wt%, 4.0wt% 및 5.0wt%의 Polyclar Super R의 첨가와 첨가 없이 그리고 0.5wt% 아스크로브산의 첨가와 첨가 없이 행해졌다. 추출 후에, 그 용액들은 원심분리되었고 그 후 페놀성분함량(A330 흡수도), 가시적 색(A420 흡수도) 및 단백질함량에 관해 분석되었다.
아스크로브산을 사용하여 그리고 사용하지 않고 얻어진 결과들은 표 33 및 34에 각각 기재되어 있다.
| % w/v Polyclar | A330 | A420 | 단백질 g/L |
| 대조표준 | 96.2 | 2.8 | 24.6 |
| 1.0% Polyclar | 93.0 | 3.3 | 25.8 |
| 1.5% Polyclar | 71.7 | 2.65 | 26.1 |
| 2.0% Polyclar | 63.0 | 2.01 | 23.5 |
| 2.5% Polyclar | 72.4 | 2.54 | 26.4 |
| 3.0% Polyclar | 64.7 | 2.63 | 26.4 |
| 4.0% Polyclar | 63.0 | 2.41 | 28.0 |
| 5.0% Polyclar | 61.6 | 2.39 | 25.9 |
| % w/v Polyclar | A330 | A420 | 단백질 g/L |
| 대조표준 | 90.5 | 3.12 | 25.9 |
| 1.0% Polyclar | 82.7 | 2.22 | 28.4 |
| 1.5% Polyclar | 90.6 | 2.59 | 32.8 |
| 2.0% Polyclar | 83.5 | 2.32 | 26.8 |
| 2.5% Polyclar | 80.2 | 2.09 | 27.1 |
| 3.0% Polyclar | 68.1 | 2.25 | 26.5 |
| 4.0% Polyclar | 66.5 | 2.62 | 29.9 |
| 5.0% Polyclar | 52.4 | 1.73 | 26.0 |
표 33 및 34에 기재된 결과들로부터 알 수 있듯이, A330 및 A420 둘 다의 상당한 감소는 Polyclar의 존재 하에서 아스크로브산의 존재 유무에 따라 얻어졌다. 아스크로브산이 추출물에 첨가되지 않았을 때, 2.5% w/v 농도의 Polyclar는 대조표준에서는 A330에서의 25%의 감소와 A420에서의 11%의 감소를 달성하였다. 더 높은 레벨들의 Polyclar는 A330 및 A420 값들을 추가로 감소시켰다. 추출 중에 존재하는 아스크로브산 때문에, 2.5 w/v의 Polyclar이 사용되었을 때 A330의 12% 감소와 A420의 34% 감소가 보여졌다. 용액의 단백질함량은 Polyclar의 존재여부에 의해 영향받지 않았다.
예 11:
이 예는 캐놀라기름씨거친가루의 에탄올 세척의 색에 대한 효과를 예시한다.
겉껍질을 벗긴 캐놀라기름씨거친가루 10g 시료들이 100ml의 에탄올과 혼합되었고 45℃ 및 실온에서 30분 동안 혼합되었고, 순환수조와 재킷형 용기로 조절되었다.
30분의 혼합기간 후, 거친가루/용매슬러리는 추출물들로부터 거친가루를 분리하기 위해 필터에 따라졌다. 이 과정은 더 이상의 색이 제거되지 않을 때까지 또는 A330 및 A420 흡수시도들이 정체기에 들 때까지 반복되었다. 각 용매세척/추출단계로부터의 거친가루는 건조되었고 주위온도에서 30분 동안의 0.15M NaCl 단백질추출들이 수행되었다.
추출용액의 UV흡수도는 각 추출시료들에 대해 행해졌다. 표 35, 36 및 37은 실온, 40℃ 및 45℃에서 각각 행해진 추출에 관한 A330 및 A420값들을 보여준다.
| 실온 에탄올 추출 | A330 | A420 |
| 1차용매추출 | 34.3 | 0.494 |
| 2차용매추출 | 12.8 | 0.232 |
| 3차용매추출 | 6.1 | 0.100 |
| 4차용매추출 | 2.8 | 0.047 |
| 5차용매추출 | 2.3 | 0.045 |
| 6차용매추출 | 1.7 | 0.040 |
| 40℃ 에탄올 추출 | A330 | A420 |
| 1차용매추출 | 30.9 | 0.528 |
| 2차용매추출 | 20.1 | 0.257 |
| 3차용매추출 | 9.3 | 0.139 |
| 4차용매추출 | 7.01 | 0.108 |
| 5차용매추출 | 4.74 | 0.073 |
| 6차용매추출 | 6.66 | 0.063 |
| 7차용매추출 | 3.69 | 0.035 |
| 8차용매추출 | 2.57 | 0.031 |
| 9차용매추출 | 2.6 | 0.037 |
| 10차용매추출 | 2.4 | 0.033 |
| 45℃ 에탄올 추출 | A330 | A420 |
| 1차용매추출 | 43.0 | 0.610 |
| 2차용매추출 | 21.0 | 0.301 |
| 3차용매추출 | 14.6 | 0.191 |
| 4차용매추출 | 7.83 | 0.129 |
| 5차용매추출 | 7.65 | 0.105 |
| 6차용매추출 | 7.34 | 0.092 |
| 7차용매추출 | 5.76 | 0.086 |
| 8차용매추출 | 6.04 | 0.063 |
| 9차용매추출 | 4.89 | 0.065 |
| 10차용매추출 | 4.98 | 0.052 |
이 데이터로부터 알 수 있듯이, 저온에서의 용매추출은 40℃ 내지 45℃ 범의의 온도들만큼 많이 색과 페놀성 화합물들을 제거하지 못하였고, 실온 추출은 6번만의 추출들 후에는 오염물들을 제거하는 것을 중단하였고 더 높은 온도의 추출은 각각 10번째 추출까지 오염물들을 제거하였다.
다백질추출용액들의 단백질함량 및 330nm 및 420nm에서의 흡수도는 결정되었고 그 결과들은 다음의 표 38에 보여진다.
| A330 | A420 | % 단백질 | |
| 대조표준실험 | 97.8 | 2.84 | 1.92 |
| 실온 | 78.4 | 2.57 | 2.01 |
| 40℃ | 60.1 | 1.97 | 2.23 |
| 45℃ | 58.2 | 2.29 | 1.79 |
이 표로부터 알 수 있듯이, 40℃에서 에탄올로써 거친가루를 미리 추출함으로써 대략 40%의 페놀성 화합물들과 30%의 A420 흡수재료들이 제거되면서 단백질손실은 피해질 수 있다.
예 12:
이 예는 거친가루의 에탄올추출을 이용한 캐놀라단백질분리물의 제조를 예시한다.
겉껍질벗긴 기름씨거친가루의 11개의 600g 분취물들이 1:5의 거친가루 대 에탄올 w/v를 이용하여 4번의 3L에탄올추출들을 받았다. 그 추출들은 35℃에서 30분간 행해졌다.
30분의 혼합시간 후, 슬러리는 침전되었고 상층액 따라졌다. A330 및 A420에서의 UV흡수도들은 각 추출에 대해 결정되었고 단백질함량측정이 추출된 거친가루의 제1분취물로부터의 제1추출에 대해 행해졌다.
4번째 추출 후, 거친가루는 연기후드에서 얕은 팬(pan) 내에 흩어졌고 밤새 건조되었다. 세척된 거친가루의 전체 배치(batch)는 연기후드에서 하룻밤 이상 탈용매화되었고 그 후 5.4kg의 건조된 추출 거친가루가 50L 배치추출에 사용되었다.
시료의 각 추출로, 상층액의 색은 점차 밝아졌고 A330 및 A420은 감소하였다. 평균하면, A330에서는 5배의 감소가 그리고 A420에서는 6배의 감소가 보여졌다. 각종 추출들에 관한 A420 및 A330 각각의 흡수도값들은 다음의 표 39 및 40에기재되어 있다.
| 거친가루 분취액 | 추출물 1 | 추출물 2 | 추출물 3 | 추출물 4 |
| A | 1.688 | 0.606 | 0.276 | 0.181 |
| B | 0.87 | 0.379 | 0.124 | 0.103 |
| C | 0.891 | 0.432 | 0.206 | 0.129 |
| D | 0.182 | 0.334 | 0.218 | 0.116 |
| E | 0.8 | 0.366 | 0.159 | 0.093 |
| F | 0.896 | 0.469 | 0.215 | 0.114 |
| G | 0.8 | 0.398 | 0.194 | 0.122 |
| H | 0.821 | 0.376 | 0.203 | 0.117 |
| I | 0.836 | 0.398 | 0.189 | 0.111 |
| J | 0.827 | 0.375 | 0.203 | 0.131 |
| K | 0.833 | 0.402 | 0.265 | 0.115 |
| 거친가루 분취액 | 추출물 1 | 추출물 2 | 추출물 3 | 추출물 4 |
| A | 98.1 | 47.5 | 22.1 | 12.8 |
| B | 30.7 | 14.7 | 13.9 | 10.43 |
| C | 61.2 | 27.8 | 15.3 | 10.9 |
| D | 57.5 | 25.3 | 19.5 | 11.37 |
| E | 60.4 | 27.7 | 16.2 | 10.4 |
| F | 58.6 | 29.3 | 18.4 | 11.4 |
| G | 58.8 | 28.6 | 17.3 | 12 |
| H | 57.9 | 26.3 | 14.3 | 10.02 |
| I | 60.1 | 29.3 | 15.6 | 11.02 |
| J | 56.7 | 30.1 | 17.8 | 10.89 |
| K | 61.2 | 27.98 | 14.77 | 11.08 |
5kg의 에탄올 추출된 거친가루는 50L의 0.15M NaCl에 첨가되었고 20℃의 실온에서 30분간 혼합되었다.
잔류 캐놀라거친가루는 제거되었고 진공필터벨트에서 세척되었다. 결과적인 단백질용액은 20㎛ 백(bag)필터를 통한 여과와 그 후의 65000rpm에서 5분간의 원심분리에 의해 정화되어 23.7g/L의 단백질함량을 갖는 39.6L의 단백질용액이 생성되었다.
37.55L의 정화된 단백질용액은 10,000달톤 분획분자량의 막들을 이용하는 한외여과시스템을 사용하여 3L로 농축되었다. 농축된 단백질용액은 10,000달톤 분획분자량의 막들을 사용하는 투석여과시스템에서 0.05wt% 아스크로브산을 함유하는 24L(=8 미투과물체적들)의 0.15M NaCl을 이용하여 투석여과되었다.결과적인 3L의 농축되고 투석여과된 캐놀라단백질용액은 184g/L의 단백질함량을 가졌다.
30℃의 농축되고 투석여과된 용액은 4℃의 온도를 갖는 30L의 물로 희석되었다. 단백질미셀들의 백색구름이 즉시 형성되었고 침전될 수 있었다. 상층액은 제거되었고 침전된 점성 점착성의 덩어리(PMM)(5.78kg)가 용기의 바닥으로부터 제거되었고 분무건조되었다. 건조된 단백질분리물은 101.2wt%(N x 6.25)d.b의 단백질함량을 가졌다.
미셀형성으로부터의 26L의 상층액은 한외여과시스템에서 10,000달톤 분획분자량의 막들을 사용한 원심분리에 의해 3L로 농축되었다. 농축된 상층액은 그 후 투석여과시스템에서 10.000달톤 분획분자량의 막들과 6L의 물을 사용하여 투석여과되었다.
농축되고 투석여과된 용액은 건조되었고 건조된 단백질은 101.3wt%(N x 6.25)d.b의 단백질함량을 가짐이 확인되었다.
PMM유래 캐놀라단백질분리물(PCI) 및 상층액유래 캐놀라단백질분리물의 시료들은 밝기(L)와 색도(a 및 b)에 관해 미놀타 R-310색계측기를 사용하여 분석되었다. 다음의 표 41은 얻어진 결과들을 보여준다.
| 시료 | L | a | b |
| PMM유래 CPI | 84.32 | -1.84 | 23.85 |
| 상층액유래 CPI | 81.92 | -0.5 | 14.18 |
이러한 생성물들은 'a' 및 'b'값들로 매우 밝았고 비교적 낮은 레벨들의 적색 및 녹색 로트들(rotes)을 시사하였다.
개시내용의 요약
이 개시내용을 요약하면, 본 발명은, 분리물제조 동안에 착색제유발성분들을 제거하며, 착색제유발성분들의 산화를 방지하고 착색제들을 제거하도록 설계된 하나 이상의 작업들을 행함으로써, 감소된 색을 갖는 캐놀라단백질분리물들의 회수를 제공한다. 변형들은 이 발명의 범위 내에서 가능하다.
Claims (64)
- 캐놀라씨들은 캐놀라단백질거친가루를 형성하도록 가공되며,캐놀라단백질거친가루는 단백질수용액을 형성하도록 추출되며,단백질수용액은 농축되고,캐놀라단백질분리물은 농축된 수용액으로부터 회수되며,상기 공정 중의 적어도 하나의 공정단계를 행하여 캐놀라단백질분리물이 감소된 색을 가지도록 하는 것을 특징으로 하는 캐놀라단백질분리물 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 공정단계는 상기 씨들의 가공에 관련된 캐놀라단백질분리물 제조방법.
- 제2항에 있어서, 씨들의 상기 가공은 상기 씨들의 미로시나제의 비활성화를 포함하는 캐놀라단백질분리물 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 공정단계는 추출단계에 관계된 캐놀라단백질분리물 제조방법.
- 제4항에 있어서, 상기 추출단계는 산하방지제의 존재 하의 캐놀라단백질거친가루의 추출, 저온탈용매화된 거친가루의 추출, 공기탈용매화된 거친가루의 추출,및 적어도 하나의 착색성분흡수제를 이용한 캐놀라단백질용액의 처리 중의 적어도 하나를 이용하여 행해지는 캐놀라단백질분리물 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 공정단계는 농축단계에 관계된 캐놀라단백질분리물 제조방법.
- 제6항에 있어서, 농축단계에는 농축된 단백질수용액의 투석여과가 뒤따르는 캐놀라단백질분리물 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 공정단계는 거친가루에 관계된 캐놀라단백질분리물 제조방법.
- 제8항에 있어서, 상기 캐놀라단백질거친가루 용매추출된 것인 캐놀라단백질분리물 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 공정단계는 회수된 캐놀라단백질분리물에 관계된 캐놀라단백질분리물 제조방법.
- 제10항에 있어서, 상기 캐놀라단백질분리물은 용매 추출된 것인 캐놀라단백질분리물 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 캐놀라단백질분리물은 농축된 단백질수용액을 냉수에 첨가하여 단백질미셀덩어리를 형성하고, 단백질미셀덩어리를 상층액으로부터 분리함으로써 농축된 단백질수용액으로부터 회수되는 캐놀라단백질분리물 제조방법.
- 제12항에 있어서, 상기 상층액은 상층액을 농축하며 농축된 상층액을 투석여과시키고 투석여과된 상층액으로부터 캐놀라단백질분리물을 회수함으로써 상층액으로부터 추가로 캐놀라단백질분리물을 회수하도록 가공되는 캐놀라단백질분리물 제조방법.
- 캐놀라기름씨거친가루로부터 캐놀라단백질분리물을 제조하는 방법에 있어서,(a) 캐놀라기름씨거친가루를 추출하고 산화방지제를 함유한 염 수용액을 사용하여 캐놀라기름씨거친가루 내의 단백질을 용해하여 약 5 내지 약 6.8의 pH를 갖는 단백질수용액을 형성하는 단계,(b) 잔류 기름씨거친가루로부터 단백질수용액을 분리하는 단계,(c) 선택막기법을 사용하여 상기 단백질수용액의 단백질농도를 증가시키면서 이온강도를 실질적으로 일정하게 유지하여 농축된 단백질용액을 제공하는 단계,(d) 상기 농축된 단백질용액을 약 15℃ 미만의 온도를 갖는 냉수로 희석하여 수상(water phase) 내에 이산단백질미셀들이 형성되게 하는 단계,(e) 단백질미셀들을 침전시켜 비정질, 점착성, 젤리비슷한, 글루텐형 단백질미셀덩어리를 형성하는 단계, 및(f) 상층액으로부터 건조중량기준으로 적어도 약 90wt%(N x 6.25)의 단백질함량을 갖는 단백질미셀덩어리를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 산화방지제는 아황산나트륨 또는 아스크로브산인 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 산화방지제는 상기 염 수용액 중에 약 0.01 내지 약 1wt%의 량으로 존재하는 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 캐놀라기름씨거친가루는 약 50℃ 미만의 온도에서 공기탈용매화되어 잔류 기름추출용매를 제거한 캐놀라기름씨거친가루인 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 캐놀라기름씨거친가루는 약 100℃ 미만의 상승온도에서 공기탈용매화되어 잔류 기름추출용매를 제거한 캐놀라기름씨거친가루인 방법.
- 캐놀라기름씨거친가루로부터 캐놀라단백질용액을 제조하는 방법에 있어서,(a) 상기 캐놀라기름씨거친가루를 알코올로 세척하는 단계,(b) 세척된 캐놀라기름씨거친가루를 추출하여 세척된 캐놀라기름씨거친가루내의 단백질의 용해를 일으킴으로써 약 5 내지 약 6.8의 pH를 갖는 단백질수용액을 형성하는 단계,(c) 잔류 기름씨거친가루로부터 단백질수용액을 분리하는 단계,(d) 선택막기법을 사용하여 상기 단백질수용액의 단백질농도를 증가시키면서 이온강도를 실질적으로 일정하게 유지하여 농축된 단백질용액을 제공하는 단계,(e) 상기 농축된 단백질용액을 약 15℃ 미만의 온도를 갖는 냉수로 희석하여 수상 내에 이산단백질미셀들이 형성되게 하는 단계,(f) 단백질미셀들을 침전시켜 비정질, 점착성, 젤리비슷한, 글루텐형 단백질미셀덩어리를 형성하는 단계, 및(g) 상층액으로부터 건조중량기준으로 적어도 약 90wt%(N x 6.25)의 단백질함량을 갖는 단백질미셀덩어리를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
- 제16항에 있어서, 알코올은 에탄올인 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 세척단계는 캐놀라기름씨거친가루를 용매 중에 약 1:3 내지 약 1:10의 w/v비율로 분산시키며, 결과적인 슬러리를 약 5 내지 약 60분 동안 약 15 내지 약 45℃의 온도에서 교반하고, 세척된 캐놀라기름씨거친가루를 슬러리로부터 분리함으로써 행해지는 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 슬러리는 약 15 내지 약 30분 동안 약 30 내지 약 75℃의 온도에서 교반되는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 세척은 페놀성분 및/또는 가시적인 색의 추가 회수가 없을 때까지 다수회 행해지는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 캐놀라기름씨거친가루는 약 50℃ 미만의 온도에서 탈용매화되어 잔류 기름추출용매를 제거한 캐놀라기름씨거친가루인 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 캐놀라기름씨거친가루는 약 100℃ 미만의 온도에서 탈용매화되어 잔류 기름추출용매를 제거한 캐놀라기름씨거친가루인 방법.
- 캐놀라기름씨거친가루로부터 캐놀라단백질분리물을 제조하는 방법에 있어서,(a) 캐놀라기름씨거친가루를 추출하여 캐놀라기름씨거친가루 내의 단백질을 용해시킴으로써 약 5 내지 약 6.8의 pH를 갖는 단백질수용액을 형성하는 단계,(b) 잔류 기름씨거친가루로부터 단백질수용액을 분리하는 단계,(c) 단백질수용액의 한외여과를 행함으로써 상기 단백질수용액의 단백질농도를 증가시키면서 이온강도를 실질적으로 일정하게 유지하여 농축된 단백질용액을 제공하는 단계,(d) 농축된 단백질용액을 투석여과시키는 단계,(e) 상기 투석여과된 농축 단백질용액을 약 15℃ 미만의 온도를 갖는 냉수로희석하여 수상 내에 이산단백질미셀들이 형성되게 하는 단계,(f) 단백질미셀들을 침전시켜 비정질, 점착성, 젤리비슷한, 글루텐형 단백질미셀덩어리를 형성하는 단계, 및(g) 상층액으로부터 건조중량기준으로 적어도 약 90wt%(N x 6.25)의 단백질함량을 갖는 단백질미셀덩어리를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 투석여과는 약 2 내지 약 20배 체적의 투석여과용액을 사용하여 행해지는 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 투석여과는 약 5 내지 약 10배 체적의 투석여과용액을 사용하여 행해지는 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 추출단계는 약 5 내지 약 6.8의 범위 내의 pH를 갖는 염 수용액을 사용하여 행해지고 상기 투석여과용액은 상기 추출단계에서 사용된 용액과 동일한 농도 및 pH를 갖는 염 수용액인 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 투석여과는 약 3000 내지 약 50,000달톤의 범위 내의 분획분자량을 갖는 막들 사용하여 행해지는 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 막은 약 5000 내지 약 10,000달톤의 분획분자량을 갖는 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 투석여과용액은 상기 투석여과단계의 적어도 일부를 위한 산화방지제를 담고 있는 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 산화방지제는 아황산나트륨 또는 아스크로브산인 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 산화방지제는 약 0.01 내지 약 1wt%의 량이 사용되는 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 추출단계는 약 5 내지 약 6.8의 pH를 가지고 산화방지제를 함유한 염 수용액을 사용하여 행해지는 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 캐놀라기름씨거친가루는 알코올로 세척되는 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 단백질미셀덩어리는 건조되고 건조된 캐놀라단백질분리물은 알코올성 수용액으로 추출되는 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 상층액은 상층액의 한외여과를 행함으로써 농축되어농축된 상층액을 제공하고 농축된 상층액은 투석여과를 거치는 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 투석여과는 약 2 내지 약 20배 체적의 투석여과용액을 사용하여 행해지는 방법.
- 제39항에 있어서, 상기 투석여과는 약 5 내지 약 10배 체적의 물을 사용하여 행해지는 방법.
- 제39항에 있어서, 상기 투석여과는 약 3000 내지 약 50,000달톤의 범위 내의 분획분자량을 갖는 막을 사용하여 행해지는 방법.
- 제39항에 있어서, 상기 막은 약 5000 내지 약 10,000달톤의 분획분자량을 갖는 방법.
- 제39항에 있어서, 상기 투석여과용액은 상기 투석여과단계의 적어도 일부를 위한 산화방지제를 담고있는 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 산화방지제는 아황산나트륨 또는 아스크로브산인 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 산화방지제는 약 0.01 내지 약 1wt%의 량으로 사용되는 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 투석여과된 단백질용액은 상기 희석단계 전에 색흡수제와 접촉되는 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 색흡수제는 폴리비닐피롤리돈인 방법.
- 제47항에 있어서, 상기 폴리비닐피롤리돈은 약 0.5 내지 약 6wt%의 량으로 사용되는 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 폴리비닐피롤리돈은 약 2 내지 약 3wt%의 량으로 사용되는 방법.
- 제26항에 있어서, 캐놀라기름씨거친가루는 캐놀라기름씨들 중의 미로시나제들을 비활성화시키고 처리된 기름씨들로부터 캐놀라씨들을 회수하여 캐놀라기름씨거친가루를 형성함으로써 준비되는 방법.
- 제40항에 있어서, 캐놀라기름씨거친가루는 잔류기름추출용매를 제거하도록 약 50℃ 미만의 온도에서 공기탈용매화되는 방법.
- 제50항에 있어서, 캐놀라기름씨거친가루는 잔류 기름추출용매를 제거하도록 약 100℃ 미만의 상승온도에서 탈용매화되는 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 투석여과된 단백질용액은 상기 희석단계 전에 저온살균단계를 거치는 방법.
- 제53항에 있어서, 상기 저온살균단계는 투석여과된 단백질용액을 약 55 내지 약 70℃의 온도에서 약 10 내지 약 15분간 가열함으로써 행해지는 방법.
- 캐놀라기름씨거친가루로부터 캐놀라단백질분리물을 제조하는 방법에 있어서,(a) 캐놀라기름씨거친가루를 추출하여 캐놀라기름씨거친가루 내의 단백질을 용해시킴으로써 약 5 내지 약 6.8의 pH를 갖는 단백질수용액을 형성하는 단계,(b) 잔류 기름씨거친가루로부터 단백질수용액을 분리하는 단계,(c) 선택막기법을 이용하여 상기 단백질수용액의 단백질농도를 증가시키면서 이온강도를 실질적으로 일정하게 유지하여 농축된 단백질용액을 제공하는 단계,(d) 상기 농축된 단백질용액을 약 15℃ 미만의 온도를 갖는 냉수로 희석하여 수상 내에 이산단백질미셀들이 형성되게 하는 단계,(e) 단백질미셀들을 침전시켜 비정질, 점착성, 젤리비슷한, 글루텐형 단백질미셀덩어리를 형성하는 단계,(f) 상층액으로부터 단백질미셀덩어리를 분리하는 단계,(g) 단백질미셀덩어리를 건조하여 건조중량기준으로 적어도 약 90wt%(N x 6.25)의 단백질함량을 갖는 캐놀라단백질분리물을 제공하는 단계, 및(h) 상기 캐놀라단백질분리물을 알코올수용액으로 추출하는 단계를 포함하는 방법.
- 제55항에 있어서, 상기 알코올수용액은 약 2:1 내지 약 1:2의 에탄올:물의 체적비를 갖는 에탄올수용액인 방법.
- 제55항에 있어서, 상기 추출단계는 캐놀라단백질분리물을 알코올수용액 내에 약 5 내지 약 25wt%의 량으로 분산시키며 결과적인 슬러리를 약 30 내지 약 60분 동안 혼합하고 추출된 캐놀라단백질분리물을 슬러리러부터 분리함으로써 행해지는 방법.
- 제55항에 있어서, 상기 추출단계는 캐놀라단백질분리물로부터 페놀성분 및/또는 가시적 착색제들이 더 이상 제거되지 않을 때까지 반복되는 방법.
- 캐놀라기름씨거친가루로부터 캐놀라단백질분리물을 제조하는 방법에 있어서,(a) 캐놀라기름씨거친가루를 추출하여 캐놀라기름씨거친가루 내의 단백질을 용해시킴으로써약 5 내지 약 6.8의 pH를 갖는 단백질수용액을 형성하는 단계,(b) 잔류 기름씨거친가루로부터 단백질수용액을 분리하는 단계,(c) 선택막기법을 이용하여 상기 단백질수용액의 단백질농도를 증가시키면서 이온강도를 실질적으로 일정하게 유지하여 농축된 단백질용액을 제공하는 단계,(d) 농축된 단백질용액을 저온살균하여 저온살균된 단백질용액을 형성하는 단계,(e) 저온살균된 단백질용액을 약 15℃ 미만의 온도를 갖는 냉수로 희석하여 수상 내에 이산단백질미셀들이 형성되게 하는 단계,(f) 단백질미셀들을 침전시켜 비정질, 점착성, 젤리비슷한, 글루텐형 단백질미셀덩어리를 형성하는 단계, 및(g) 상층액으로부터 건조중량기준으로 적어도 약 90wt%(N x 6.25)의 단백질함량을 갖는 단백질미셀덩어리를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
- 제59항에 있어서, 상기 저온살균은 농축된 단백질용액을 약 55 내지 약 70℃의 온도에서 약 10 내지 약 15분간 가열함으로써 행해지는 방법.
- 제60항에 있어서, 상기 농축된 단백질용액은 약 60 내지 약 65℃에서 약 10분간 가열되는 방법.
- 캐놀라기름씨거친가루로부터 캐놀라단백질분리물을 제조하는 방법에 있어서,(a) 캐놀라기름씨들을 이 기름씨들에 함유된 미로시나제들을 비활성이 되도록 처리하여 처리된 기름씨들을 생성하는 단계,(b) 상기 기름씨들을 가공하여 그것들로부터 캐놀라기름씨를 제거하고 캐놀라기름씨거친가루를 생성하는 단계,(c) 캐놀라기름씨를 추출하여 캐놀라기름씨 내의 단백질의 용해를 일으킴으로써 약 5 내지 약 6.8의 pH를 갖는 단백질수용액을 형성하는 단계,(d) 잔류 기름씨거친가루로부터 단백질수용액을 분리하는 단계,(e) 선택막기법을 이용하여 상기 단백질수용액의 단백질농도를 증가시키면서 이온강도를 실질적으로 일정하게 유지하여 농축된 단백질용액을 제공하는 단계,(f) 농축된 단백질용액을 약 15℃ 미만의 온도를 갖는 냉수로 희석하여 수상 내에 이산단백질미셀들이 형성되게 하는 단계,(g) 단백질미셀들을 침전시켜 비정질, 점착성, 젤리비슷한, 글루텐형 단백질미셀덩어리를 형성하는 단계, 및(h) 상층액으로부터 건조중량기준으로 적어도 약 90wt%(N x 6.25)의 단백질함량을 갖는 단백질미셀덩어리를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
- 제62항에 있어서, 캐놀라기름씨거친가루는 상기 추출단계 전에 잔류 기름추출용매를 제거하도록 약 50℃ 미만의 온도에서 공기탈용매화되는 방법.
- 제62항에 있어서, 캐놀라기름씨는 상기 추출단계 전에 잔류 기름추출용매를 제거하도록 약 100℃ 미만의 온도에서 공기탈용매화되는 방법.
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