KR101267395B1

KR101267395B1 - 카놀라 단백질의 생산

Info

Publication number: KR101267395B1
Application number: KR1020077030520A
Authority: KR
Inventors: 브랜디 고스넬; 케빈 아이. 세갈; 마틴 슈바이처
Original assignee: 버콘 뉴트라사이언스 (엠비) 코포레이션
Priority date: 2005-07-01
Filing date: 2006-06-30
Publication date: 2013-06-10
Also published as: KR101310640B1; ZA200800899B; KR101321360B1; AU2006265723A1; US8075925B2; EP1906753A4; JP4913806B2; US7618659B2; EP2674036A1; EP1906753A1; EP2674036B1; RU2410895C2; AU2006265723B2; KR20130008650A; EP2674035A1; MX2008000132A; CN101272697B; ZA200900888B; BRPI0612565A2; US20090203880A1

Abstract

최소한 약 90 중량%(Nx6.25), 바람직하게는 최소한 약 100 중량%의 단백질 함량을 갖고, 주로 2S 카놀라 단백질로 구성되고, 실질적으로 7S 및 12S 단백질이 없는 카놀라 단백질 분리물이 제조된다. 한 양상에서, 상승된 온도에서 수성염 용액으로 카놀라 오일 씨 가루을 추출하여 밀로부터 선택적으로 2S 카놀라 단백질을 추출하여 2S 단백질을 주로 함유한 카놀라 단백질 추출 용액을 생성한다. 2S 카놀라 단백질은 분리물로서 회수된다. 또다른 양상에서, 카놀라 오일 씨 가루은 초기에 물로 추출되어 7S 및 12S 카놀라 단백질을 우선적으로 추출하고, 이후 카놀라 오일 씨 가루을 수성염 용액으로 추출하여 밀로부터 2S 단백질을 추출한다. 2S 카놀라 단백질 분리물은 염추출물로부터 얻어진다. 또다른 양상에서, 카놀라 오일 씨 가루은 수성염 용액으로부터 추출되어 밀로부터 2S, 7S 및 12S 단백질들을 추출한다. 수성 단백질 추출 용액은 상승된 온도에서 열처리되어 7S 및 12S 단백질들을 침전시키고 2S 단백질 용액을 남기고, 이로부터 분리물이 회수될 수 있다. 또다른 양상에서, 수성 단백질 용액은 열처리 이전에 농축된다.

카놀라 단백질

Description

카놀라 단백질의 생산{PRODUCTION OF CANOLA PROTEIN}

본출원은 2005년 7월 1일에 출원된 미국 가특허출원 제 60/695,535호로부터 35 USC 119(e) 하에서 우선권을 주장한다.

본발명은 실질적으로 카놀라의 7S 및 12S 단백질이 없는, 카놀라의 2S 단백질의 제조를 위한 신규한 공정에 관한 것이다.

카놀라 단백질 분리물은 카놀라 오일 씨 가루로부터 형성될 수 있다. 2002년 5월 3일에 출원된 동시 계류중인 미국특허출원 제 10/137,391호(미국특허공개 제 20030125526A1), 및 2004년 6월 9일에 출원된 제 10/476,230호(미국특허공개 제 20040254353A1) 및 대응 PCT 공개 출원 제 WO 02/089597호는 모두 본출원인에게 양도되고, 그 내용은 참조문헌으로서 본명세서에 포함되는데, 거기에는 최소한 100 중량% 단백질 함량(Nx6.25)을 갖는, 카놀라 오일 씨 가루로부터 카놀라 단백질 분리물을 제조하는 방법이 기술되어 있다. 이 방법은 염 용액을 사용하여 카놀라 오일 씨 가루를 추출하는 것, 남은 오일 씨 가루로부터 얻어진 수성 단백질 용액을 분리하는 것, 선택적 막 기술을 사용하여 이온 강도를 실질적으로 일정하게 유지시키면서 수성 용액의 단백질 농도를 최소 약 200 g/l까지 증가시키는 것, 얻어진 농축된 단백질 용액을 차가운 물 내로 희석하여 단백질 미셀의 형성을 유발하는 것, 단백질 미셀이 무정형, 점성, 젤라틴성 글루텐형 단백질 미셀 집합체 (PMM)를 형성하도록 침전하는 것, 상청액으로부터 단백질 미셀 집합체를 회수하는 것을 포함하는 다단계 공정을 수반하고, 여기서 PMM은 킬달 (Kjeldahl) 질소 (N) x 6.25에 의해 결정되는 최소 약 100 중량%의 단백질 함량을 갖는다. 여기서, 단백질 함량은 건조 중량 기준으로 결정된다. 회수된 PMM은 건조될 수 있다.

상기에서 기술된 공정의 한 구체예에서, PMM 침전 단계로부터의 상청액을 더욱 처리하여 습윤 PMM 및 상청액으로부터 건조 단백질을 포함하는 단백질 분리물을 회수한다. 이 공정은 먼저 한외여과 막을 사용하여 상청액을 농축하고, 농축된 상청액을 습윤 PMM과 혼합하고 혼합물을 건조하는 것에 의해 수행될 수 있다. 얻어진 카놀라 단백질 분리물은 최소한 약 90 중량% 단백질 (N x 6.25), 바람직하게는 최소한 약 100 중량% 단백질 (N x 6.25)의 높은 순도를 갖는다.

상기에서 기술된 공정의 또다른 구체예에서, PMM 침전 단계로부터의 상청액을 처리하여 상청액으로부터 단백질 분리물을 회수한다. 이 공정은 먼저 원심분리 막을 사용하여 상청액을 농축하고, 농축물을 건조하는 것에 의해 수행될 수 있다. 얻어진 카놀라 단백질 분리물은 최소한 약 90 중량% 단백질 (N x 6.25), 바람직하게는 최소한 약 100 중량% 단백질 (N x 6.25)의 높은 순도를 갖는다.

상기한 미국 특허 출원들에서 기술된 공정들은 본질적으로 배치 (batch) 공정이다. 동일한 출원인에 의한, 본명세서에 참고문헌으로 포함된, 2002년 11월 19일에 출원된 동시계류 중인 미국특허 출원 번호 제 10/298,678호 (미국특허공개 제 20040039174A1) 및 대응하는 공개국제출원 제 WO 03/043439호에는 카놀라 단백질 분리물을 제조하기 위한 연속 공정이 기술되어 있다. 이 방법에 따르면, 카놀라 오일 씨 가루는 염 용액과 연속적으로 혼합되고, 카놀라 오일 씨 가루로부터 단백질을 추출하여 수성 단백질 용액을 형성하면서 이 혼합물을 파이프를 통해 수송하고, 이 수성 단백질 용액은 선택적 막 조작을 통해 연속적으로 수송되어, 이온 강도를 실질적으로 일정하게 유지시키면서 수성 단백질 용액의 단백질 함량을 최소 약 200 g/l까지 증가시키고, 얻어진 농축된 단백질 용액을 차가운 물과 연속적으로 혼합하여 단백질 미셀의 형성을 유발하고, 상청액을 연속적으로 유출시키면서 단백질 미셀을 계속적으로 침전시켜 소정량의 PMM이 침전 용기 내에 축적한다. PMM은 침전 용기로부터 제거되고 건조될 수 있다. PMM은 킬달 (Kjeldahl) 질소 (N x 6.25)에 의해 결정되는 최소 약 90 중량%, 바람직하게는 최소 약 100 중량%의 단백질 함량을 갖는다.

상기한 미국특허 출원 번호 제 10/137,391호 및 10/471,230호에서 기술된 바와 같이, 유출된 상청액을 처리하여 이로부터 카놀라 단백질 분리물을 회수할 수 있다.

카놀라 씨는 약 10 내지 약 30 중량% 단백질을 함유한 것으로 공지되어 있고 몇가지 다른 단백질 구성성분이 확인되었다. 이들 단백질들은 서로 다른 침강 계수(S)에 의해 구별된다. 이들 공지되고 확인된 단백질들은 크루시페린(cruciferin)으로 알려진 12S 글로불린, 및 나핀(napin)으로 알려진 2S 저장 단백질을 포함한다.

카놀라는 또한 평지씨 또는 오일 씨 평지로서도 알려져 있다.

동일한 출원인에 의한, 본명세서에 참고문헌으로 포함된, 2003년 8월 25일에 출원된 동시계류중인 미국특허 출원 번호 제 10/413,371호(미국특허공개 제 20040034204A1) 및 2003년 4월 15일에 출원된 제 10/510,766호 및 대응하는 PCT 공개 번호 제 WO 03/08876호에서, PMM 카놀라 단백질 분리물 및 상청액-유래 카놀라 단백질 분리물의 조성물이 기술되어 있다. 상청액-유래 카놀라 단백질 분리물은 주로 2S 단백질로 구성되고 소량의 7S 단백질 및 미량의 12S 단백질을 포함한다. 2S 단백질은 저분자량 알부민이다. 생성된 PMM은 비교적 부수적인 구성성분인 2S 단백질 및 12S 단백질과 함께 주로 7S 단백질로 구성된다. 7S 및 12S 단백질은 고분자량 글로불린이고, 7S 분자는 12S 단백질의 절반 분자량이다.

상기한 바와 같이, 상청액-유래 카놀라 단백질 분리물은 다음의 단백질 프로필을 나타낸다:

약 60 내지 약 95 중량%의 2S 단백질,

약 5 내지 약 40 중량%의 7S 단백질, 및

0 내지 약 5 중량%의 12S 단백질, 바람직하게는

약 70 내지 약 95 중량%의 2S 단백질,

약 5 내지 약 30 중량%의 7S 단백질, 및

0 내지 약 2 중량%의 12S 단백질.

PMM 카놀라 단백질 분리물은 다음의 단백질 프로필을 나타낸다:

약 60 내지 약 98 중량%의 7S 단백질,

약 1 내지 약 15 중량%의 12S 단백질, 및

0 내지 약 25 중량%의 2S 단백질, 바람직하게는

약 88 내지 약 98 중량%의 7S 단백질,

약 1 내지 약 10 중량%의 17S 단백질, 및

0 내지 약 6 중량%의 2S 단백질.

2S 단백질로 주로 구성된 상청액-유래 카놀라 단백질 분리물은 7S 단백질로 주로 구성된 PMM-유래 카놀라 단백질 분리물보다 특정 응용용도에 대해 더 우수한 기능적 특성을 나타낸다는 것이 발견되었다. 상기 선행 출원에서 기술된 공정들에서, 상청액-유래 카놀라 단백질 분리물을 생산하기 위해, 카놀라 단백질 분리물을 효율적으로 분획화하기 위해, PMM 형성 및 상청액 공급의 단계들을 거치는 것이 필요했다.

동일한 출원인에 의한, 본명세서에 참고문헌으로 포함된, 2005년 7월 21일에 출원된 미국특허 출원 번호 제 11/038,086호(미국특허공개 제 2005-0181112A1)(WO2005/067729)에서, PMM 침전으로부터의 상청액은, 막 공정에 뒤이어 열처리에 처해져서 7S 단백질을 침전시키고 2S 단백질이 풍부한 단백질 용액이 남겨지는 공정이 기술되어 있다. 남은 용액은 분무 건조될 수 있다.

최소 비율의 7S 및 12S 단백질을 갖는 2S 단백질은 산 pH 값에서 비처리된 2S 단백질보다 증가된 용해도를 나타내고, 용액 내에서 및 탄산 음료에서 향상된 투명성을 제공하고, 투명한 단백질 강화 음료를 제공할 수 있다.

발명의 요약

본발명의 한 양상에 따르면, 만약 카놀라 오일 씨 가루의 추출이 상대적으로 주변온도에서보다는, 상승된 온도에서 수행된다면, 2S 단백질은 7S 및 12S 단백질보다 우선적으로 추출되고, 얻어진 추출 용액 내 카놀라 단백질은 주로 2S 단백질로 구성되고, 이후 추출 용액으로부터 비교적 순수한 형태로 얻어질 수 있다는 것이 놀랍게도 발견되었다.

어떠한 이론에 얽매일 필요없이, 상승된 추출 온도에서 7S 및/또는 12S 단백질보다 우선하여 선택적으로 2S 카놀라 단백질을 추출하는 능력은 추출 단계 도중 카놀라 오일 씨 가루 내 7S 및 12S 단백질의 분해 및 침전으로 인한 것이라고 생각된다.

따라서, 본발명의 한 양상에서, 다음을 포함하는, 주로 2S 단백질로 구성된 카놀라 단백질 분리물을 제조하기 위한 방법이 제공된다: 상승된 온도에서 수성염 용액으로 카놀라 오일 씨 가루을 추출하여 7S 및 12S 단백질보다 우선하여 선택적으로 2S 카놀라 단백질을 추출하고 2S 단백질을 주로 함유한 카놀라 단백질 추출 용액을 얻는 것, 남은 카놀라 오일 씨 가루로부터 카놀라 단백질 추출 용액을 분리하는 것, 및 상기 카놀라 단백질 추출 용액으로부터, 최소한 약 90 중량%(Nx6.25)의 함량을 갖고 주로 2S 단백질로 구성된 카놀라 단백질 분리물을 회수하는 것.

본발명의 다른 양상에 따르면, 만약 카놀라 오일 씨 가루 추출이 2 단계, 즉 물을 사용하여 수행되는 제 1 추출 및 수성염 용액을 사용하는 제 2 추출로 실행되면, 제 1 추출단계로부터는 주로 7S 단백질인 수성 카놀라 단백질 용액이 얻어지고, 제 2 추출단계로부터는 주로 2S 단백질인 수성 카놀라 단백질 용액이 얻어진다.

물을 사용하는 카놀라 오일 씨 가루의 최초 추출 단계는 상당한 비율의 7S 및 12S 단백질들, 낮은 비율의 2S 단백질 및 주요 비율의 가용성 불순물들을 가용화화한다. 수성염 용액을 사용한 제 2 추출은 대다수의 2S 단백질, 소량의 7S 및 2S 단백질 및 낮은 농도의 가용성 불순물들을 함유하는 수성 카놀라 단백질 용액을 유도한다.

수성염 카놀라 단백질 추출물은 농축되고, 미국특허출원 제 11/038,086호에 기재된 공정에 따라서 정용여과되어 염함량을 감소시키고 이후 열처리되어 잔류하는 7S 및 12S 단백질을 침전시킨다.

본발명의 제 1 양상에 따르면, 다음을 포함하는, 주로 2S 단백질로 구성된 카놀라 단백질 분리물을 제조하기 위한 방법이 제공된다: 물로 카놀라 오일 씨 가루을 추출하여 2S 카놀라 단백질보다 우선하여 7S 및 12S 단백질들 및 가용성 불순물들을 선택적으로 추출하여 제 1 카놀라 단백질 추출 용액을 얻는 것, 남은 카놀라 오일 씨 가루로부터 제 1 카놀라 단백질 추출 용액을 분리하는 것, 수성염 용액으로 잔여 오일 씨 가루을 추출하여 잔여 오일 씨 가루로부터 2S, 7S 및 12S 단백질들을 가용화하여 제 2 카놀라 단백질 추출 용액을 형성하는 것, 및 상기 제 2 카놀라 단백질 추출 용액으로부터, 최소한 약 90 중량%(Nx6.25)의 함량을 갖고 주로 2S 단백질로 구성된 카놀라 단백질 분리물을 회수하는 것.

본발명의 또다른 양상에 따라, 상기한 미국특허출원 제 10/137,391호에 기술된 농축 단계로부터의 농축된 카놀라 단백질 용액은 상기한 미국특허출원 제 11/038,586호의 공정에 따라 열처리되어 그 안에 함유된 대다수의 7S 및 12S 단백질들을 침전시켜, 실질적으로 2S 단백질로 구성된 농축된 수성 카놀라 단백질 용액을 남긴다는 것이 놀랍게도 발견되었다.

본발명의 추가적 양상에 따르면, 다음을 포함하는, 주로 2S 단백질로 구성된 카놀라 단백질 분리물을 제조하기 위한 방법이 제공된다: 수성염 용액으로 카놀라 오일 씨 가루을 추출하여 카놀라 오일 씨 가루로부터 카놀라 단백질들을 추출하고 카놀라 단백질 용액을 얻는 것, 남은 카놀라 오일 씨 가루로부터 카놀라 단백질 용액을 분리하는 것, 상기 카놀라 단백질 용액을 농축하여 잔류물로서 농축된 단백질 용액을 제공하는 것, 상기 농축된 단백질 용액을 가열 처리하여 상기 농축된 단백질 용액으로부터 2S 카놀라 단백질보다 우선하여 7S 및 12S 카놀라 단백질들을 선택적으로 침전시켜 주로 2S 단백질을 함유하는 열-처리된 카놀라 단백질 용액을 형성하는 것, 상기 침전 단백질로부터 열-처리된 카놀라 단백질 용액을 분리하는 것, 및 상기 분리된 열-처리된 단백질 추출 용액으로부터, 최소한 약 90 중량%(Nx6.25)의 단백질 함량을 갖고 주로 2S 단백질로 구성된 카놀라 단백질 분리물을 회수하는 것.

본발명의 추가적 양상에 따라서, 상기한 미국특허출원 제 10/137,391호의 공정에 따라 카놀라 단백질 분리물의 염 추출에 의해 얻어진 수성 카놀라 단백질 용액은 상기한 미국특허출원 제 11/038,586호의 공정에 따라서 열처리되어 그 안에 함유된 대다수의 7S 및 12S 단백질을 침전시키고, 실질적으로 2S 단백질로 구성된 수성 카놀라 단백질 용액을 남긴다는 것이 놀랍게도 발견되었다.

본발명의 추가적 양상에 따르면, 다음을 포함하는, 주로 2S 단백질로 구성된 카놀라 단백질 분리물을 제조하기 위한 방법이 제공된다: 수성염 용액으로 카놀라 오일 씨 가루을 추출하여 카놀라 오일 씨 가루로부터 카놀라 단백질들을 추출하고 카놀라 단백질 용액을 얻는 것, 남은 카놀라 오일 씨 가루로부터 카놀라 단백질 용액을 분리하는 것, 상기 농축된 단백질 용액을 가열 처리하여 2S 카놀라 단백질보다 우선하여 상기 농축된 단백질 용액으로부터 7S 및 12S 카놀라 단백질들을 선택적으로 침전시켜 주로 2S 단백질을 함유하는 열-처리된 카놀라 단백질 용액을 형성하는 것, 상기 침전 단백질로부터 열-처리된 카놀라 단백질 용액을 분리하는 것, 및 상기 분리된 열-처리된 단백질 추출 용액으로부터, 최소한 약 90 중량%(Nx6.25)의 단백질 함량을 갖고 주로 2S 단백질로 구성된 카놀라 단백질 분리물을 회수하는 것.

본발명의 공정은 PMM-침전 분획 단계를 사용할 필요없이, 주로 2S 단백질로 구성된 카놀라 단백질 분리물이 얻어지는 것을 가능하게 하고, 이에 의해 공정을 크게 간편화시키고, 주로 2S 단백질인 카놀라 단백질 분리물이 더욱 경제적으로 얻어지는 것을 가능하게 한다.

본명세서에서의 공정에 따라 생산된 카놀라 단백질 분리물들은 가공 식품의 단백질 강화, 오일의 유화, 구운 제품에서의 바디 포머(body former), 및 가스를 포집하는 제품에서 발포제와 같은 단백질 분리물의 종래 용도에 사용될 수 있다. 또한, 카놀라 단백질 분리물은 단백질 섬유 내로 형성될 수 있고, 육류 유사물에 유용하고, 난백이 결합제로서 사용되는 식품에서 난백 대체물 또는 증량제로서 사용될 수 있다. 카놀라 단백질 분리물은 영양학적 보충제로서도 사용될 수 있다. 카놀라 단백질 분리물의 다른 용도는 단백질 강화 음료, 동물 사료, 애완동물 사료, 산업적 및 화장품용 응용 용도 및 개인관리용품에 사용되는 것이다.

본발명의 일반적 설명

상기한 바와 같이, 본발명은 주로 2S 단백질로 구성되고, 7S 및 12S 단백질들로 실질적으로 없는 카놀라 단백질 용액을 제조하기 위한 공정의 네가지 양상을 제공한다.

(a) 카놀라 오일 씨 가루의 고온 추출을 이용하는 양상

본발명의 이 양상에 따른 카놀라 단백질 분리물을 제공하는 공정의 개시 단계는 카놀라 오일 씨 가루로부터 단백질성 물질의 가용화를 수반한다. 카놀라 씨 가루로부터 회수된 단백질성 물질은 카놀라 시드 내에 자연적으로 발생하는 단백질이거나 또는 이 단백질성 물질은 유전자 조작에 의해 변조되었지만 자연적 단백질의 특징적 소수성 및 극성을 갖는 단백질일 수 있다. 카놀라 가루는 예를 들면 고온 헥산 추출 또는 냉 오일 압출 방법으로 제조한 비-변성 단백질의 다양한 수준을 갖는 카놀라 오일 씨로부터의 카놀라 오일의 제거로부터 유래된 어떠한 카놀라 가루일 수 있다. 카놀라 오일 씨로부터의 카놀라 오일의 제거는 통상 여기서 기술된 단백질 분리물 회수 공정과는 별도의 조작으로서 수행될 수 있다.

본발명의 한 양상에서, 단백질 가용화는 식품 등급 염 용액을 사용하여 더욱 효과적으로 수행되는데, 염의 존재는 오일 씨 가루로부터 가용성 단백질의 제거를 향상시키기 때문이다. 카놀라 단백질 분리물이 비식품 용도로 사용되는 곳에서는, 비식품 등급 화학물질들이 사용될 수 있다. 통상 염은 염화나트륨이지만, 염화 칼륨과 같은 다른 염들도 사용될 수 있다. 염용액은 최소 약 0.05, 바람직하게는 최소 약 0.1이면서 0.2까지의 이온 강도를 가져서 단백질의 상당량의 가용화를 수행하는 것을 가능하게 한다. 염 용액의 이온강도가 증가함에 따라서, 오일 씨 가루 내의 단백질의 용해도는 최대치가 실현될 때까지 증가한다. 이온강도를 더욱 연이어 증가시켜도 가용화된 총 단백질을 증가시키지 않는다. 최대 단백질 가용화를 유발하는 식품 등급 염 용액의 이온 강도는 관여된 염 및 선택된 오일 씨 가루에 따라 다르다.

카놀라 오일 씨 가루의 추출은, 본발명의 이 양상에서, 상승된 온도, 일반적으로 약 70° 내지 약 100℃, 바람직하게는 약 80° 내지 약 95℃의 온도에서 수행되어, 7S 및 12S 단백질보다 우선하여, 오일 씨 가루로부터 단백질 추출 용액 내로 2S 카놀라 단백질의 우선적인 추출을 유발한다.

수성 식품 등급 염 용액은 일반적으로 약 5 내지 약 6.8, 바람직하게는 약 5.3 내지 약 6.2의 pH를 갖는다. 염용액의 pH는 필요에 따라 추출 단계에서 사용되기 위해 어떠한 편리한 산, 통상 염산, 또는 알칼리, 통상 수산화나트륨을 사용함으로써 약 5.3 내지 약 6.2의 범위 이내의 어떠한 바람직한 값으로 조정될 수 있다.

가용화 단계 도중 식품 등급 염 용액 내 카놀라 오일 씨 가루의 농도는 다양하게 변할 수 있다. 대표적인 농도 값은 약 5 내지 약 15 % w/v이다.

추출 단계로부터의 얻어지는 단백질 용액은 일반적으로 약 1 내지 약 40 g/l, 바람직하게는 약 10 내지 약 20 g/l의 단백질 농도를 갖는다.

단백질 용액은 일반적으로 다음의 카놀라 단백질 프로필을 갖는다:

약 80 내지 약 100 중량%의 2S 단백질,

0 내지 약 10 중량%의 7S 단백질, 및

0 내지 약 10 중량%의 12S 단백질, 바람직하게는

약 85 내지 약 100 중량%의 2S 단백질,

0 내지 약 15 중량%의 7S 단백질, 및

0 내지 약 5 중량%의 12S 단백질.

수성 염용액은 항산화제를 함유할 수 있다. 항산화제는 아황산 나트륨 또는 아스코르브산과 같은 어떠한 편리한 항산화제일 수 있다. 사용되는 항산화제의 양은 0.01 내지 약 1 중량%에서 변하고, 바람직하게는 약 0.05 중량%이다. 항산화제는 단백질 용액 내의 페놀류의 산화를 저해하는 역할을 한다.

추출 단계로부터 얻은 수상은 이후 데칸터 원심분리 및 연이어 디스크 원심분리 및/또는 여과에 의해 잔류 가루를 제거하는 것과 같은 어떠한 편리한 방법으로, 잔류하는 카놀라 가루로부터 분리될 수 있다. 분리된 잔류 가루는 폐기를 위해 건조될 수 있다.

최종 카놀라 단백질 분리물의 색상은 분말 활성 탄소 또는 다른 색소 흡착제를 분리된 수성 단백질 용액과 혼합시키고, 연이어, 편리하게는 여과에 의해 흡착제를 제거하여 단백질 용액을 제공함으로써 밝은 색상 및 옅은 노랑색의 관점에서 향상될 수 있다. 정용여과 (diafiltration)가 염료 제거를 위해 사용될 수 있다.

그러한 염료 제거 공정은 어떠한 편리한 조건, 일반적으로 어떠한 적절한 염료 흡착제를 사용하여, 분리된 수성 단백질 용액의 주변온도에서 일반적으로 수행될 수 있다. 분말 활성 탄소에 대해, 약 0.025% 내지 약 5% w/v, 바람직하게는 약 0.05% 내지 약 2% w/v의 양이 사용된다.

카놀라 씨 가루가 동일한 출원인에 의한, 본명세서에 참고문헌으로 포함된 미국 특허 출원 번호 5,844,086호 및 6,005,076호에 기술된 바와 같은 상당한 지방량을 함유할 때, 거기에 기술된 탈지방 공정을 분리된 수성 단백질 용액 및 아래에서 논의되는 농축된 수성 단백질 용액에 대해 수행될 수 있다. 색상 향상 단계가 수행될 때, 그러한 단계는 최초 탈지방 공정 이후에 수행될 수 있다.

수성 단백질 추출 용액은 그로부터 카놀라 단백질 분리물을 회수하도록 처리된다. 여기서 생산되는 카놀라 단백질 분리물은 최소한 90 중량%(Nx6.25), 바람직하게는 최소한 100 중량%의 단백질 함량을 갖고 주로 2S 단백질로 구성된다.

그러한 공정에서, 단백질 추출 용액은 그의 단백질 농도를 증가시키도록 농축될 수 있다. 그러한 농축은 한외여과와 같은 어떠한 편리한 선택적 막 기술을 사용하여, 단백질 소스 물질로부터 추출된 염 및 다른 비-단백질성 저분자량 물질을 포함하는 저분자량 종들을 막을 통과하는 것을 허용하는 적절한 분자량 컷-오프를 갖는 막을 사용하여 수행되고, 반면 용액 내에 카놀라 단백질은 유지한다. 약 3,000 내지 약 100,000 달톤, 바람직하게는 약 5,000 내지 약 10,000 달톤 같은 분자량 컷오프를 갖고, 서로 다른 막 재질 및 구성을 갖는 한외여과 막들이 사용될 수 있다. 이런 식으로 단백질 추출 용액의 농축은 건조되어 단백질을 회수하는데 요구되는 단백질의 부피를 또한 감소시킨다. 일반적으로 단백질 추출 용액은 최소한 약 50 g/l, 바람직하게는 약 100 내지 약 400 g/l, 더욱 바람직하게는 약 200 내지 약 300 g/l의 단백질 농도로 농축된다. 그러한 농축 조작은 배치(batch) 모드 또는 연속 조작으로 수행될 수 있다.

널리 공지된 바와 같이, 한외여과 및 유사한 선택적 막 기술은 고분자량 종류의 통과를 저지하면서 저분자량 종류가 통과하는 것을 허용한다. 저분자량 종류는 식품등급 염의 이온 종뿐만 아니라, 탄수화물, 염료 및 항-영양 인자와 같은 소스 물질로부터 추출된 저분자량 물질도 포함한다. 막의 분자량 컷오프는 서로 다른 막 재료 및 구성에 대해 오염물질이 통과하는 것을 허용하면서, 단백질의 상당 부분이 용액 내에 잔류하는 것을 보장하도록 통상 선택된다.

농축된 단백질 추출 용액은 이후 물을 사용하여 정용여과 단계에 처해진다. 그러한 정용여과는 약 2 내지 약 20 부피의 정용여과 용액, 바람직하게는 약 5 내지 약 10 부피의 정용여과 용액을 사용하여 수행될 수 있다. 정용여과 조작에서, 오염물의 양은 투과물을 막을 통해 통과시킴으로써 수성 단백질 용액으로부터 제거된다. 정용여과 조작은 페놀류 및 가시 염료의 상당한 추가적 양이 투과물 내에 존재하지 않을 때까지 수행될 수 있다. 그러한 정용여과는 농축 단계에서와 같은 막을 사용하여 수행될 수 있다. 그렇지만, 필요에 따라, 예를 들면 약 3,000 내지 약 100,000 달톤, 바람직하게는 약 5,000 내지 약 10,000 달톤 같은 분자량 컷오프를 갖고, 서로 다른 막 재질 및 구성을 갖는 별도의 막을 사용하여 수행될 수 있다.

항산화제는 최소한 정용여과 단계 부분 도중 정용여과 매체 내에 존재할 수 있다. 항산화제는 아황산 나트륨 또는 아스코르브산과 같은 어떠한 편리한 항산화제일 수 있다. 정용여과 용매 내에서 사용되는 항산화제의 양은 사용된 재료에 의존하고 0.01 내지 약 1 중량%에서 변하고, 바람직하게는 약 0.05 중량%이다. 항산화제는 수성 단백질 용액 내에 존재하는 페놀류의 산화를 저해하는 역할을 한다.

농축 단계 및 정용여과 단계는 어떠한 편리한 온도, 일반적으로 약 20 내지 60℃, 바람직하게는 약 20 내지 약 30℃의 온도에서, 소망하는 정도의 농축을 수행하기 위한 시간 동안 수행될 수 있다. 사용된 온도 및 기타 조건들은 농축을 수행하는데 사용된 막 장치 및 용액의 바람직한 단백질 농도에 어느 정도 의존한다.

농축되고 임의로 정용여과된 단백질 용액은, 필요한 경우, 미국 특허 제 5,844,086호 및 6,005,076호에 개시된 바와 같이, 추가적인 탈지방 조작에 처해질 수 있다.

농축되고 임의로 정용여과된 단백질 용액은, 상술한 색상 제거 조작에 대해 택일적으로 색상 제거 조작에 처해질 수 있다. 분말 활성 탄소는 과립화된 활성 탄소 (GAC)와 함께 이 조작에서 사용될 수 있다. 색상 흡착제로서 사용될 수 있는 또다른 물질은 폴리비닐 피롤리돈이다.

색상 흡착제 처리 단계는 어떠한 편리한 조건에서, 일반적으로 카놀라 단백질 용액의 주변 온도에서 수행될 수 있다. 분말화된 활성 탄소에 대해, 약 0.025% 내지 약 5% w/v, 바람직하게는 약 0.05% 내지 약 2% w/v의 양이 사용된다. 폴리비닐피롤리돈이 색상 흡착제로서 사용될 때, 약 0.5% 내지 약 5% w/v, 바람직하게는 약 2% 내지 약 3% w/v의 양이 사용된다. 색상 흡착제는 여과와 같은 어떠한 편리한 수단에 의해 카놀라 단백질 용액으로부터 제거될 수 있다.

필요하다면, 농축되고 임의로 정용여과된 단백질 용액은 열처리 단계에 처해져서 용액 내에 존재하는 7S 및 12S 단백질들의 양을 감소시킨다. 그러한 열처리는 용액 내에 존재하는 7S 및 12S 단백질들의 비율을 감소시키고, 바람직하게는 상당한 양으로 7S 및 12S 단백질들의 비율을 감소시키기에 충분한 온도 및 시간 프로필을 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 용액의 7S 및 12S 단백질의 함량은 열처리에 의해 최소한 약 50 중량%, 바람직하게는 최소한 약 75 중량% 만큼 감소된다. 일반적으로, 열처리는 약 70° 내지 약 100℃, 바람직하게는 약 75 내지 약 95℃의 온도에서 약 2 내지 약 30분, 바람직하게는 약 5 내지 약 15분 동안 수행될 수 있다. 침전된 7S 및 12S 단백질들은 원심분리 또는 여과에 같은 어떠한 편리한 방법으로 제거되고 회수될 수 있다.

농축되고 임의로 정용여과되고 임의로 열처리된 수성 단백질 용액은 분무 건조 또는 동결 건조와 같은 어떠한 편리한 기술에 의해 건조 형태로 건조되어 주로 2S 단백질로 구성되고, 최소한 약 90 중량%(Nx6.25), 바람직하게는 최소한 약 100 중량%의 단백질 함량을 갖는 건조 카놀라 단백질 분리물을 제공한다.

(b) 카놀라 오일 시드밀의 다단계 추출을 이용하는 양상

카놀라 단백질 분리물을 제공하는 공정의 초기 단계는 카놀라 오일 시드밀로부터 단백질성 물질의 가용화를 수반한다. 카놀라 시드밀로부터 회수된 단백질성 물질은 카놀라 시드 내에 자연적으로 발생하는 단백질이거나 또는 이 단백질성 물질은 유전자 조작에 의해 변조되었지만 자연적 단백질의 특징적 소수성 및 극성을 갖는 단백질일 수 있다. 카놀라 가루는 예를 들면 고온 헥산 추출 또는 냉 기름 압출 방법으로 제조한 비-변성 단백질의 다양한 수준을 갖는 카놀라 기름 씨로부터의 카놀라 제거로부터 유래된, 어떠한 카놀라 가루일 수 있다. 카놀라 기름 씨로부터의 카놀라 기름의 제거는 통상 여기서 기술된 단백질 분리물 회수 공정과는 별도의 조작으로서 수행될 수 있다.

본발명의 이 양상에서 단백질 가용화는 다단계로 수행된다. 제 1 단계에서, 물이 추출 용매로서 사용되고, 2S 카놀라 단백질보다 우선하여 카놀라 오일 시드밀로부터 상당 비율의 가용성 불순물과 더불어 7S 및 12S 카놀라 단백질을 우선적으로 추출한다. 물 추출 단계는 카놀라 오일 시드밀의 단일 수추출, 또는 약 2 내지 약 25번 추출, 바람직하게는 약 2 내지 약 4번 추출과 같은 카놀라 오일 시드밀의 다중 수추출로서 수행될 수 있다.

7S 및 12S 단백질들의 수성 용액은 어떠한 바람직한 방법으로 처리되어 카놀라 단백질 분리물로서 7S 및 12S 단백질들을 회수한다. 예를 들면, 수성 단백질 용액은, 염의 부가후, 상기한 미국특허 출원 번호 제 10/137,391호에서 기술된 바와 같이 농축 및 미셀 형성 단계에 처해질 수 있다.

물을 사용한 카놀라 오일 시드밀의 추출은 약 10℃ 내지 약 70℃, 바람직하게는 약 55℃ 내지 약 65℃의 온도에서 수행될 수 있다. 가용화 단계 동안 수 내 카놀라 오일 시드밀의 농도는 다양할 수 있다. 대표적인 농도 값은 약 5 내지 약 15%w/v이다.

수성 추출 단계로부터 얻어지는 단백질 용액은 약 10 내지 약 40 g/l, 바람직하게는 약 10 내지 약 25 g/l의 단백질 농도를 갖는다.

제 2 단계 가용화에서, 수 추출로부터의 잔여 카놀라 오일 시드밀은 수성 염 용액으로 추출되어, 대다수의 2S 카놀라 단백질, 소량의 7S 및 12S 카놀라 단백질 및 낮은 수준의 불순물을 함유하는 수성 카놀라 단백질 추출 용액이 얻어진다. 통상 염은 염화나트륨이지만, 염화 칼륨과 같은 다른 염들도 사용될 수 있다. 식품 등급 염 용액이 일반적으로 사용되지만, 카놀라 단백질 분리물이 비식품 용도로 사용되는 곳에서는, 비식품 등급 화학물질들이 사용될 수 있다.

제 2단계 가용화에서 사용되는 수성 염용액은 일반적으로 최소 약 0.05, 바람직하게는 최소 약 0.1, 일반적으로 0.5까지의 이온 강도를 가진다.

수성 식품 등급 염 용액은 일반적으로 약 5 내지 약 6.8, 바람직하게는 약 5.3 내지 약 6.2의 pH를 갖는다. 염용액의 pH는 필요에 따라 추출 단계에서 사용되기 위해 어떠한 편리한 산, 통상 염산, 또는 알칼리, 통상 수산화나트륨을 사용함으로써 약 5 내지 약 6.8의 범위 이내의 어떠한 바람직한 값으로 조정될 수 있다.

식품 등급 염 용액을 사용한 상기한 카놀라 오일 시드밀의 추출은 약 5℃ 내지 약 65℃, 바람직하게는 약 20℃ 내지 약 30℃의 온도에서 일반적으로 수행된다. 가용화 단계 도중 식품 등급 염 용액 내 카놀라 오일 시드밀의 농도는 다양하게 변할 수 있고, 대표적으로 약 5 내지 약 15 % w/v이다.

염 추출 단계로부터의 얻어지는 단백질 용액은 일반적으로 약 1 내지 약 40 g/l, 바람직하게는 약 10 내지 약 20 g/l의 단백질 농도를 갖는다.

오일 시드밀의 염 가용화로부터 얻어지는 수성 단백질 용액은 일반적으로 다음의 카놀라 단백질 프로필을 갖는다:

약 80 내지 약 100 중량%의 2S 단백질,

0 내지 약 10 중량%의 7S 단백질, 및

0 내지 약 10 중량%의 12S 단백질, 바람직하게는

약 85 내지 약 100 중량%의 2S 단백질,

0 내지 약 15 중량%의 7S 단백질, 및

0 내지 약 5 중량%의 12S 단백질.

수성 염용액은 항산화제를 함유할 수 있다. 항산화제는 아황산 나트륨 또는 아스코르브산과 같은 어떠한 편리한 항산화제일 수 있다. 사용되는 항산화제의 양은 0.01 내지 약 1 중량%에서 변하고, 바람직하게는 약 0.05 중량%이다. 항산화제는 단백질 용액 내에 존재하는 페놀류의 산화를 저해하는 역할을 한다.

수성 카놀라 단백질 용액은 최소한 90 중량%(Nx6.25), 바람직하게는 최소한 100 중량%의 단백질 함량을 갖고 주로 2S 단백질로 구성된 카놀라 단백질 분리물을 회수하도록 처리될 수 있다.

그러한 공정에서, 단백질 추출 용액은 그의 단백질 농도를 증가시키도록 농축될 수 있다. 그러한 농축은 한외여과와 같은 어떠한 편리한 선택적 막 기술을 사용하여, 단백질 소스 물질로부터 추출된 염 및 다른 비-단백질성 저분자량 물질을 포함하는 저분자량 종들을 막을 통과하는 것을 허용하는 적절한 분자량 컷-오프를 갖는 막을 사용하여 수행되고, 반면 용액 내에 카놀라 단백질은 유지한다. 약 3,000 내지 약 100,000 달톤, 바람직하게는 약 5,000 내지 약 10,000 달톤 같은 적절한 분자량 한계를 갖고, 서로 다른 막 재질 및 구성을 갖는 한외여과 막들이 사용될 수 있다. 이런 식으로 단백질 추출 용액의 농축은 건조되어 단백질을 회수하는데 요구되는 단백질의 부피를 또한 감소시킨다. 일반적으로 단백질 추출 용액은 최소한 약 50 g/l, 바람직하게는 약 100 내지 약 400 g/l, 더욱 바람직하게는 약 200 내지 약 300 g/l의 단백질 농도로 농축된다. 그러한 농축 조작은 배치(batch) 모드 또는 연속 조작으로 수행될 수 있다.

농축된 단백질 추출 용액은 이후 물을 사용하는 정용여과 단계에 처해진다. 그러한 정용여과는 약 2 내지 약 20 부피의 정용여과 용액, 바람직하게는 약 5 내지 약 10 부피의 정용여과 용액을 사용하여 수행될 수 있다. 정용여과 조작에서, 오염물의 양은 투과물을 막을 통해 통과시킴으로써 수성 단백질 용액으로부터 제거된다. 정용여과 조작은 페놀류 및 가시 염료의 상당한 추가적 양이 투과물 내에 존재하지 않을 때까지 수행될 수 있다. 그러한 정용여과는 농축 단계에서와 같은 막을 사용하여 수행될 수 있다. 그렇지만, 필요에 따라, 예를 들면 약 3,000 내지 약 100,000 달톤, 바람직하게는 약 5,000 내지 약 10,000 달톤 같은 적절한 분자량 한계를 갖고, 서로 다른 막 재질 및 구성을 갖는 별도의 막을 사용하여 수행될 수 있다.

필요하다면, 농축되고 임의로 정용여과된 단백질 용액은 열처리되어 용액 내에 존재하는 7S 및 12S 단백질들의 양을 감소시킨다. 그러한 열처리는 용액 내에 존재하는 7S 및 12S 단백질들의 비율을 감소시키고, 바람직하게는 상당한 양으로 7S 및 12S 단백질들의 비율을 감소시키기에 충분한 온도 및 시간 프로필을 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 용액의 7S 단백질의 함량은 열처리에 의해 최소한 약 50 중량%, 바람직하게는 최소한 약 75 중량% 만큼 감소된다. 일반적으로, 열처리는 약 70° 내지 약 100℃, 바람직하게는 약 75 내지 약 95℃의 온도에서 약 2 내지 약 30분, 바람직하게는 약 5 내지 약 15분 동안 수행될 수 있다. 침전된 7S 및 12S 단백질들은 원심분리 또는 여과에 같은 어떠한 편리한 방법으로 제거되고 회수될 수 있다.

(c) 한외여과 잔류물의 열처리를 이용하는 양상

단백질 가용화는 식품 등급 염 용액을 사용하여 더욱 효과적으로 수행되는데, 염의 존재는 오일 시드밀로부터 가용성 단백질의 제거를 향상시키기 때문이다. 카놀라 단백질 분리물이 비식품 용도로 사용되는 곳에서는, 비식품 등급 화학물질들이 사용될 수 있다. 통상 염은 염화나트륨이지만, 염화 칼륨과 같은 다른 염들도 사용될 수 있다. 염용액은 최소 약 0.05, 바람직하게는 최소 약 0.1이면서 0.2까지의 이온 강도를 가져서 단백질의 상당량의 가용화를 수행하는 것을 가능하게 한다. 염 용액의 이온강도가 증가함에 따라서, 오일 씨 가루 내의 단백질의 용해도는 최대치가 실현될 때까지 증가한다. 이온강도를 더욱 연이어 증가시켜도 가용화된 총 단백질을 증가시키지 않는다. 최대 단백질 가용화를 유발하는 식품 등급 염 용액의 이온 강도는 관여된 염 및 선택된 오일 씨 가루에 따라 다르다.

배치(batch) 공정에서, 단백질의 염 가용화는 최소한 약 5℃, 바람직하게는 약 35℃까지의 온도에서, 바람직하게는 가용화 시간을 감소시키기 위한 교반을 동반하여 수행되고, 통상 약 10 내지 약 60분간이다. 가능한 한 오일 시드밀로부터 실질적으로 더 많은 단백질을 추출하여, 전체적으로 높은 생산 수율을 제공하는 것이 바람직하다.

약 5℃의 온도 하한이 선택되는데, 가용화는 이 온도 이하에서는 불가능하게 느리기 때문이고, 반면, 약 35℃의 바람직한 온도 상한이 선택되는데, 배치 모드에서 더 높은 온도 수준에서는 공정이 비경제적으로 되기 때문이다.

연속 공정에서, 카놀라 오일 시드밀로부터의 단백질의 추출은 카놀라 오일 시드밀로부터의 단백질의 연속 추출을 수행하기 위한 어떠한 방법으로 수행된다. 한 구체예에서, 카놀라 오일 시드밀은 염 용액과 연속적으로 혼합되고, 혼합물은 여기에 기술된 파라미터에 따른 바람직한 추출을 수행하기에 충분한 길이를 갖는 파이프 또는 도관을 통해 그러한 체류시간 동안 및 유속에서 운반된다. 그러한 연속 공정에서, 염 가용화 단계는 약 10분까지의 시간 내에 신속히 수행되어, 바람직하게는 가능한한 카놀라 오일 시드밀로부터 실질적으로 많은 단백질을 추출하도록 가용화를 수행한다. 연속 공정에서 가용화는 상승된 온도, 바람직하게는 약 35℃ 이상, 일반적으로 약 65℃까지의 온도에서 수행된다.

수성 염용액 및 카놀라 오일 시드밀은 일반적으로 약 5 내지 약 6.8, 바람직하게는 약 5.3 내지 약 6.2의 pH를 갖는다.

염용액의 pH는 필요에 따라 추출 단계에서 사용되기 위해 어떠한 편리한 산, 통상 염산, 또는 알칼리, 통상 수산화나트륨을 사용함으로써 약 5 내지 약 6.8의 범위 이내의 어떠한 바람직한 값으로 조정될 수 있다. 카놀라 단백질 분리물이 비식품 용도로 사용되는 곳에서는, 비식품 등급 화학물질들이 사용될 수 있다.

가용화 단계 도중 식품 등급 염 용액 내 카놀라 오일 시드밀의 농도는 다양하게 변할 수 있다. 대표적인 농도 값은 약 5 내지 약 15 % w/v이다.

수성 염용액을 이용한 단백질 추출단계는 카놀라 밀 내에 존재할 수 있는 지방의 가용화라는 추가적 효과를 가질 수 있는데, 이는 다시 수상 내에 존재하는 지방을 유도한다.

염 추출 단계로부터의 얻어지는 단백질 용액은 일반적으로 약 5 내지 약 40 g/l, 바람직하게는 약 10 내지 약 30 g/l의 단백질 농도를 갖는다.

최종 카놀라 단백질 분리물의 색상은 분말 활성 탄소 또는 다른 색소 흡착제를 분리된 수성 단백질 용액과 혼합시키고, 연이어, 편리하게는 여과에 의해 흡착제를 제거하여 단백질 용액을 제공함으로써 밝은 색상 및 옅은 노랑색의 관점에서 향상될 수 있다. 아래에서 기술되는 바와 같이, 농축 이전 또는 이후에, 분리된 수성 단백질 용액의 정용여과 (diafiltration)가 염료 제거를 위해 또한 사용될 수 있다.

동일한 출원인에 의한, 본명세서에 참고문헌으로 포함된 미국 특허 출원 번호 5,844,086호 및 6,005,076호에 기술된 바와 같이, 카놀라 씨 가루가 상당한 지방량을 함유할 때, 거기에 기술된 탈지방 공정을 분리된 수성 단백질 용액 및 아래에서 논의되는 농축된 수성 단백질 용액에 대해 수행될 수 있다. 색상 향상 단계가 수행될 때, 그러한 단계는 최초 탈지방 공정 이후에 수행될 수 있다.

수성 염용액으로 오일 시드밀을 추출하는 것에 대한 대안으로서, 그러한 추출은 비록 물 단독 사용이 수성 염용액보다 오일 시드밀로부터 더 적은 단백질을 추출하는 경향이 있기는 하지만, 물 단독만을 사용하여 행해질 수 있다. 그러한 대안이 사용될 때, 상기한 농도에서의 염은 하기한 농축 단계 도중 용액 내 단백질을 유지하기 위해 잔류 오일 시드밀로부터 분리 이후 단백질 용액에 부가될 수 있다. 색상 제거 단계 및/또는 제 1 지방 제거 단계가 수행될 때, 일반적으로 염은 그러한 조작의 완료 이후에 부가된다.

단백질 추출 용액은 농축되어 그 단백질 농도를 증가시킨다. 그러한 농축은 한외여과와 같은 어떠한 편리한 선택적 막 기술을 사용하여, 단백질 소스 물질로부터 추출된 염 및 다른 비-단백질성 저분자량 물질을 포함하는 저분자량 종들을 막을 통과하는 것을 허용하는 적절한 분자량 컷-오프를 갖는 막을 사용하여 수행되고, 반면 용액 내에 카놀라 단백질은 유지한다. 약 3,000 내지 약 100,000 달톤, 바람직하게는 약 5,000 내지 약 10,000 달톤 같은 적절한 분자량 한계를 갖고, 서로 다른 막 재질 및 구성을 갖는 한외여과 막들이 사용될 수 있다. 이런 식으로 단백질 추출 용액의 농축은 건조되어 단백질을 회수하는데 요구되는 단백질의 부피를 또한 감소시킨다. 일반적으로 단백질 추출 용액은 최소한 약 50 g/l, 바람직하게는 약 100 내지 약 400 g/l, 더욱 바람직하게는 약 200 내지 약 300 g/l의 단백질 농도로 농축된다. 그러한 농축 조작은 배치(batch) 모드 또는 연속 조작으로 수행될 수 있다.

농축된 단백질 추출 용액은 이후 물을 사용하여 정용여과 단계에 처해진다. 그러한 정용여과는 약 2 내지 약 20 부피의 정용여과 용액, 바람직하게는 약 5 내지 약 10 부피의 정용여과 용액을 사용하여 수행될 수 있다. 정용여과 조작에서, 오염물의 양은 투과물을 막을 통해 통과시킴으로써 수성 단백질 용액으로부터 제거된다. 정용여과 조작은 페놀류 및 가시 염료의 상당한 추가적 양이 투과물 내에 존재하지 않을 때까지 수행될 수 있다. 그러한 정용여과는 농축 단계에서와 같은 막을 사용하여 수행될 수 있다. 그렇지만, 필요에 따라, 예를 들면 약 3,000 내지 약 100,000 달톤, 바람직하게는 약 5,000 내지 약 10,000 달톤 같은 적절한 분자량 한계를 갖고, 서로 다른 막 재질 및 구성을 갖는 별도의 막을 사용하여 수행될 수 있다.

항산화제는 최소한 정용여과 단계 부분 도중 정용여과 매체 내에 존재할 수 있다. 항산화제는 아황산 나트륨 또는 아스코르브산과 같은 어떠한 편리한 항산화제일 수 있다. 정용여과 용매 내에서 사용되는 항산화제의 양은 사용된 재료에 의존하고 0.01 내지 약 1 중량%에서 변하고, 바람직하게는 약 0.05 중량%이다. 항산화제는 농축된 단백질 추출 용액 내에 존재하는 페놀류의 산화를 저해하는 역할을 한다.

본발명의 이 양상에서, 한외여과되고 임의로 정용여과된 카놀라 단백질 용액은 열처리되어 용액 내에 존재하는 7S 및 12S 단백질들을 침전시키고, 주로 2S 단백질로 구성된 카놀라 단백질 용액이 남는다. 그러한 열처리는 상기한 미국특허 출원 제 11/038,086호에 기술된 조건 하에서 수행될 수 있다.

그러한 열처리는 농축된 용액 내에 존재하는 7S 및 12S 단백질들의 비율을 감소시키고, 바람직하게는 상당한 양으로 7S 및 12S 단백질들의 비율을 감소시키기에 충분한 온도 및 시간 프로필을 사용하여 수행될 수 있다. 일반적으로, 용액의 7S 및 12S 단백질의 함량은 열처리에 의해 최소한 약 50 중량%, 바람직하게는 최소한 약 75 중량% 만큼 감소된다. 일반적으로, 열처리는 약 70° 내지 약 100℃, 바람직하게는 약 75 내지 약 95℃의 온도에서 약 2 내지 약 30분, 바람직하게는 약 5 내지 약 15분 동안 수행될 수 있다. 침전된 7S 및 12S 단백질들은 원심분리 또는 여과에 같은 어떠한 편리한 방법으로 제거되고 회수될 수 있다.

얻어진 카놀라 단백질 용액은 이후 주로 2S인 카놀라 단백질 분리물을 회수하도록 처리될 수 있다.

농축되고 열처리된 상청액은, 예를 들면 원심분리에 의해, 침전된 7S 및 12S 단백질들의 제거 후, 분무 건조 또는 동결 건조와 같은 어떠한 편리한 기술에 의해 건조 형태로 건조되어 주로 2S 단백질로 구성된 카놀라 단백질 분리물을 제공한다. 그러한 카놀라 단백질 분리물은 약 90 중량%, 바람직하게는 약 100 중량%(Kjeldahl Nx6.25로서 계산됨)를 초과하는 높은 단백질 함량을 갖고, 실질적으로 비변성된다(시차 주사 열량계에 의해 결정됨).

(d) 수성 카놀라 단백질 용액의 열처리를 이용하는 양상

카놀라 단백질 분리물을 제공하는 공정의 초기 단계는 카놀라 오일 씨 가루로부터 단백질성 물질의 가용화를 수반한다. 카놀라 씨 가루로부터 회수된 단백질성 물질은 카놀라 시드 내에 자연적으로 발생하는 단백질이거나 또는 이 단백질성 물질은 유전자 조작에 의해 변조되었지만 자연적 단백질의 특징적 소수성 및 극성을 갖는 단백질일 수 있다. 카놀라 가루는 예를 들면 고온 헥산 추출 또는 냉 오일 압출 방법으로 제조한 비-변성 단백질의 다양한 수준을 갖는 카놀라 오일 씨로부터의 카놀라 제거로부터 유래된, 어떠한 카놀라 가루일 수 있다. 카놀라 오일 씨로부터의 카놀라 오일의 제거는 통상 여기서 기술된 단백질 분리물 회수 공정과는 별도의 조작으로서 수행된다.

단백질 가용화는 식품 등급 염 용액을 사용하여 더욱 효과적으로 수행되는데, 염의 존재는 오일 씨 가루로부터 가용성 단백질의 제거를 향상시키기 때문이다. 카놀라 단백질 분리물이 비식품 용도로 사용되는 곳에서는, 비식품 등급 화학물질들이 사용될 수 있다. 통상 염은 염화나트륨이지만, 염화 칼륨과 같은 다른 염들도 사용될 수 있다. 염용액은 최소 약 0.05, 바람직하게는 최소 약 0.1이면서 0.2까지의 이온 강도를 가져서 단백질의 상당량의 가용화를 수행하는 것을 가능하게 한다. 염 용액의 이온강도가 증가함에 따라서, 오일 씨 가루 내의 단백질의 용해도는 최대치가 실현될 때까지 증가한다. 이온강도를 더욱 연이어 증가시켜도 가용화된 총 단백질을 증가시키지 않는다. 최대 단백질 가용화를 유발하는 식품 등급 염 용액의 이온 강도는 관여된 염 및 선택된 오일 씨 가루에 따라 다르다.

배치(batch) 공정에서, 단백질의 염 가용화는 최소한 약 5℃, 바람직하게는 약 35℃까지의 온도에서, 바람직하게는 가용화 시간을 감소시키기 위한 교반을 동반하여 수행되고, 통상 약 10 내지 약 60분간이다. 가능한 한 오일 씨 가루로부터 실질적으로 더 많은 단백질을 추출하여, 전체적으로 높은 생산 수율을 제공하는 것이 바람직하다.

연속 공정에서, 카놀라 오일 씨 가루로부터의 단백질의 추출은 카놀라 오일 씨 가루로부터의 단백질의 연속 추출을 수행하기 위한 어떠한 방법으로 수행된다. 한 구체예에서, 카놀라 오일 씨 가루은 염 용액과 연속적으로 혼합되고, 혼합물은 여기에 기술된 파라미터에 따른 바람직한 추출을 수행하기에 충분한 길이를 갖는 파이프 또는 도관을 통해 그러한 체류시간 동안 및 유속에서 운반된다. 그러한 연속 공정에서, 염 가용화 단계는 약 10분까지의 시간 내에 신속히 수행되어, 바람직하게는 가능한한 카놀라 오일 씨 가루로부터 실질적으로 많은 단백질을 추출하도록 가용화를 수행한다. 연속 공정에서 가용화는 상승된 온도, 바람직하게는 약 35℃ 이상, 일반적으로 약 65℃까지의 온도에서 수행된다.

수성 염용액 및 카놀라 오일 씨 가루은 일반적으로 약 5 내지 약 6.8, 바람직하게는 약 5.3 내지 약 6.2의 pH를 갖는다.

염용액의 pH는 필요에 따라 어떠한 편리한 산, 통상 염산, 또는 알칼리, 통상 수산화나트륨을 사용함으로써 추출 단계에서 사용되기 위해 약 5 내지 약 6.8의 범위 이내의 어떠한 바람직한 값으로 조정될 수 있다. 카놀라 단백질 분리물이 비식품 용도로 사용되는 곳에서는, 비식품 등급 화학물질들이 사용될 수 있다.

수성 염용액으로 오일 씨 가루을 추출하는 것에 대한 대안으로서, 그러한 추출은 비록 물 단독 사용이 수성 염용액보다 오일 씨 가루로부터 더 적은 단백질을 추출하는 경향이 있기는 하지만, 물 단독만을 사용하여 행해질 수 있다. 그러한 대안이 사용될 때, 상기한 농도에서의 염은 하기한 농축 단계 도중 용액 내 단백질을 유지하기 위해 잔류 오일 씨 가루로부터 분리 이후 단백질 용액에 부가될 수 있다. 색상 제거 단계 및/또는 제 1 지방 제거 단계가 수행될 때, 일반적으로 염은 그러한 조작 이후에 부가된다.

본발명의 이 양상에 따른 수성 카놀라 단백질 용액은 열처리되어 용액 내에 존재하는 7S 및 12S 단백질들을 침전시키고, 주로 2S 단백질로 구성된 카놀라 단백질 용액이 남는다. 그러한 열처리는 상기한 미국특허 출원 제 11/038,086호에 기술된 조건 하에서 수행될 수 있다.

열처리된 카놀라 단백질 용액은, 예를 들면 원심분리에 의해, 침전된 7S 및 12S 단백질들의 제거 후, 분무 건조 또는 동결 건조와 같은 어떠한 편리한 기술에 의해 건조 형태로 건조되어 주로 2S 단백질로 구성된 카놀라 단백질 분리물을 제공한다.

택일적으로, 열처리된 카놀라 단백질 용액은 건조 이전에, (a) 양상에 대해 상기에서 기술된 농축, 정용여과 및 색상 제거 단계들에 처해질 수 있다.

그러한 카놀라 단백질 분리물은 약 90 중량%, 바람직하게는 약 95 중량%(Kjeldahl Nx6.25로서 계산됨)를 초과하는 높은 단백질 함량을 갖고, 실질적으로 비변성된다(시차 주사 열량계에 의해 결정됨).

여기서 제공되는 카놀라 단백질 분리물은 분리물 내에 카놀라 단백질의 함량이 높은 2S 단백질 비율, 바람직하게는 최소한 약 90 중량%, 더욱 바람직하게는 최소한 약 100 중량%의 비율을 갖고, 실질적으로 7S 및 12S 단백질이 없다.

실시예 1

이 실시예는 추출 용액 내 카놀라 단백질의 프로필에 대한 카놀라 오일 씨 가루로부터의 단백질 추출의 상승된 온도의 효과를 설명한다.

15g의 진공 탈용매화된 카놀라 오일 씨 가루(37.15% 단백질)의 샘플을, 역삼투압(reverse osmosis, RO)수, 0.1M NaCl 수용액, 0.15M NaCl 수용액, 0.2M NaCl 수용액, 0.25M NaCl 수용액, 및 0.5M NaCl 수용액의 150ml 샘플 각각에 85℃의 온도에서 부가시켰다. 이 온도를 유지시키면서 혼합물을 교반기/핫 플레이트를 사용하여 5분간 교반시켰다.

추출물을 10,000 rpm에서 10분간 원심분리시키고, 이후 25㎛ 세로홈 여과지를 통해 여과시켰다. 여과물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 더욱 여과시켰다.

여과된 추출물을 단백질 함량(LECO FP528 질소 결정기를 사용하여), 색상 및 단백질 프로필(분석 HPLC SEC BioSep 2000 및 S3000 칼럼을 사용하여)에 대해 분석 시켰다.

주변온도에서 대조 목적으로 대조구로서 0.1M NaCl 용액에 의한 추출을 사용하여 실험을 반복하였다. 얻어진 결과는 다음 표 1 및 2에 나타낸다:

표 1: 주변온도 추출물과 비교되는 85℃에서의 밀 추출물

추출	A330	A390	LECO 단백질(%)	겉보기 추출능(%)
85℃ RO수 추출물	89.9	4.34	0.48	12.93
85℃ 0.1M NaCl 추출물	91.1	4.52	1.09	29.35
85℃ 0.15M NaCl 추출물	94.8	4.51	1.11	29.88
85℃ 0.2M NaCl 추출물	114.0	5.15	1.24	33.38
85℃ 0.25M NaCl 추출물	110.7	5.51	1.26	33.92
85℃ 0.5M NaCl 추출물	130.3	13.99	1.46	39.30
대조구:주변온도추출물 0.1M NaCl	96.7	5.25	1.83	49.00

표 2: 추출물의 단백질 프로필

샘플:	%2S	%7S	%12S
85℃ RO수 추출물	83.8%	12.5%	3.8%
85℃ 0.1M NaCl 추출물	93.9%	3.9%	2.1%
85℃ 0.15M NaCl 추출물	98.2%	0.9%	0.9%
85℃ 0.2M NaCl 추출물	88.2%	5.5%	6.2%
85℃ 0.25M NaCl 추출물	86.9%	7.2%	5.9%
85℃ 0.5M NaCl 추출물	64.8%	35.2%	0.0%
주변온도추출물	42.4%	55.9%	1.7%

표 1에 나타낸 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 상승된 추출 온도의 사용은 A330(페놀류) 및 A390(색상)에서 결정된 색상에 어떠한 영향을 주지 않는 것으로 보여, 상승된 온도에서 추가적인 페놀류의 산화가 일어나지 않았음을 나타낸다.

85℃에서 RO수의 겉보기 추출능은 식염수 추출물보다 실질적으로 낮았는데, 이는 추출 단계 동안의 염의 존재는 상승된 온도에서도 추출능을 유리하게 향상시킴을 나타낸다.

고온 식염수 추출에 대한 겉보기 추출능은 평균 약 32%이어서, 주변온도에서 수행된 추출보다 낮지만, 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 상승된 온도에서 추출된 단백질의 대다수는 2S 단백질이다.

실시예 2

이 실시예는 이중 추출 공정을 사용한 카놀라 오일 씨 가루의 처리에 대한 공정의 일련의 시험을 규정한다.

수성 카놀라 오일 씨 가루을 먼저 물로 추출하고 연이어 수성 식염수 용액으로 추출하는 한 세트의 시험을 수행하였다. 그러한 일련의 시험의 결과는 여기에서 나타낸다.

(a) 시험 1

15g의 카놀라 오일 씨 가루(배치 A)을 65℃까지 예열되어 씨에 부가된 150 ml 물로 60℃에서 10%w/v 추출시켰다. 이 추출물을 10,000g에서 10분간 원심분리에 의해 소모된 밀로부터 분리하고, 상청액의 분리 이후, 팰릿 내 습윤 밀(37g) 및 결합수(22g)의 중량을 결정하였다. 충분한(128 ml) 0.25M NaCl을 이후 부가시켜 농도를 다시 10% w/v로 만들고, 이 샘플을 오버헤드 교반기를 사용하여 220 rpm에서 실온에서 30분간 혼합시켰다. 식염수 추출물을 10,000g에서 10분간 원심분리에 의해 소모된 밀로부터 분리하였다. 정제된 물 추출물 및 식염수 추출물의 샘플을 0.45 ㎛ 포어 크기 필터를 사용하여 여과시키고, 이 샘플을 유리 페놀류(A330), 가시 색상(A 390), 단백질 함량(LECO) 및 단백질 프로필(SEC HPLC)에 대해 분석시켰다. 물 추출물의 단백질 프로필을 7S 단백질을 침전시키기 위해 냉장고 내에서 밤새 저 장후 다시 분석하였다.

비록 단백질 함량이 낮지만, 2차 식염수 추출물은 최초 수추출물에 비해 명백히 더 깨끗하고, 옅은 색상이었다(표 3).

표 3: 물 및 식염수 추출물들에 대한 분석 결과

샘플	A330	A390	%단백질	%HPLC 비-단백질 피트 영역
60℃ 수추출물	133.9	5.51	1.79	80.47
식염수 추출물	35.3	1.80	1.12	71.25

초기 수추출은 7S 단백질의 가용화에 유리하였고, 반면 2차 식염수 추출은 대다수의 2S 단백질을 가용화시켰다(표 4). 밤새 추출물을 냉각시키는 것은 큰 비율의 7S 및 12S 단백질이 침전하는 것을 유발하였다.

표 4: 다양한 샘플들의 단백질 프로필들

샘플	12S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)	7S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)	2S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)
60℃ 수추출물	2.4	74.3	23.0
식염수 추출물	2.9	32.3	65.0
수 냉각 상청액	1.5	42.1	56.4

(b) 시험 2

150g의 카놀라 오일 씨 가루(배치 A)을 1500 ml 물로 오버헤드 교반기를 사용하여 60℃에서 10%w/v 추출시켰다. 이 추출물을 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 소모된 밀로부터 분리하고, 팰릿 내 습윤 밀(392g) 및 결합수(242g)의 중량을 결정하였다. 충분한(1258 ml) 0.2M NaCl을 이후 부가시켜 농도를 다시 10% w/v로 만들고, 이 샘플을 오버헤드 교반기를 사용하여 실온에서 30분간 혼합시켰다. 식염수 추출물을 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 소모된 밀로부터 분리하고, 이후 #3 필터 패드를 통해 두 번 통과시켜 여과시켰다. 정제된 식염수 추출물을 이후 병 렬로 결합된 두 개의 10,000 MWCO Vivaflow HY 막 유닛(안정화제 셀룰로오스)를 사용하여 처리시켰다. 추출물을 농축시키고, 이후 5배의 역삼투(RO) 정제수로 정용여과시켰다. 정용여과수의 부가는 침전물의 발생을 유발시켰고, 이는 재농축 이전 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 제거되었다. 정용여과 잔류물을 85℃에서 10분간 열처리시켜 7S 및 12S를 침전시키고, 이는 8000g에서 15분간 원심분리에 의해 제거되었다. 농축물은 이후 동결건조시켜 'C200H'로 명명하였다.

수추출물을 4℃에서 밤새 냉각시키고, 7100g에서 15분간 5℃에서 원심분리에 의해 침전물을 수집하였다. 수집된 고체를 이후 동결 건조시켰다.

다양한 샘플들을 유리 페놀류(A330), 가시 색상(A 390), 단백질 함량(LECO) 및 단백질 프로필(SEC HPLC)에 대해 분석시켰다. 최종 생성물을 Minolta 비색계를 사용하여 건조 색상에 대해 분석하고, 습윤 색상 분석용으로 용액을 또한 제조하였다. 단백질 분말(0.7g)을 보텍스 혼합기를 사용하여 0.1M NaCl 또는 물(10 ml)과 혼합시켰다. 샘플을 이후 8000g에서 10분간 원심분리하고, 상청액의 단백질 함량을 LECO에 의해 결정하였다. 상청액의 분취량(8 ml)을 작은 비커에 옮기고, 충분한 식염수 또는 물을 부가시켜 단백질 함량을 5%로 조정하였다.

시험 1에서와 같이, 2차 식염수 추출물이 최초 수추출물에 비해 명백히 더 깨끗하고, 옅은 색상이었다(표 5). 최초 수추출물을 냉각은 총 단백질의 절반을 약간 넘는 양이 침전하는 것을 유발하였다.

표 5: 물 및 식염수 추출물들에 대한 분석 결과

샘플	A330	A390	%단백질	%HPLC 비-단백질 피트 영역
60℃ 수추출물	128.9	5.45	2.06	80.46
식염수 추출물	21.3	1.24	0.90	70.84
수 냉각 상청액	136.0	4.66	1.02	91.30

역시, 초기 수추출은 7S 단백질의 가용화에 유리하였고, 반면 2차 식염수 추출은 대다수의 2S 단백질을 가용화시켰다(표 6). 정용여과(DF) 잔류물의 열처리는 다량의 잔류 7S 및 12S 단백질을 성공적으로 제거시켰다. 밤새 추출물을 냉각시켜 큰 비율의 7S 및 12S 단백질이 침전하는 것을 유발하였다.

표 6: 다양한 샘플들의 단백질 프로필들

샘플	12S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)	7S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)	2S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)
60℃ 수추출물	2.3	75.2	22.5
식염수 추출물	1.2	30.8	68.0
가열된 DF 잔류물 원심분리물	0.8	1.5	97.7
수 냉각 상청액	1.4	43.5	55.1

이 시험에서 형성된 'C200H'는 우수한 건조 색상 및 허용가능한 습윤 색상을 가졌다(표 7). 분말 단백질 함량(습윤 기준)은 93.90 중량%여서, 샘플이 분리물임을 확인시켜주었다. 냉 침전물 7S/12S는 상당히 어두운 노란색 분말이었지만 허용가능한 습윤 색상을 가졌다. 침전된 7S/12S 생성물의 비교적 어두운 색상에도 불구하고, 생성물의 순도는 LECO에 의해 시험했을 때 매우 높았다. 이 샘플(습윤 기준)의 단백질 함량은 103.49 중량%로 결정되었다. 7S/12S 침전물 수분 색상 샘플의 크로마토그래피 분석은 2S 단백질로 인한 4% 미만의 단백질 피크 면적과 약 25%의 비-단백질 피크 면적을 갖는 오염을 나타내었다. 이는 침전 외의 어떠한 정제 단계도 수행되지 않은 것을 고려하면 상당히 낮은 농도의 오염물이다.

표 7: 시험 2의 최종 생성물의 건조 색상

샘플	L	a	b
'C200H'	88.52	-2.81	19.36
냉침전물 7S/12S	66.79	0.25	35.15

(c) 시험 3:

150g의 카놀라 오일 씨 가루(배치 A)을 1500 ml 물로 오버헤드 교반기를 사용하여 주변온도에서 30분간 10%w/v 추출시켰다. 이 수추출물을 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 소모된 밀로부터 분리하고, 팰릿 내 습윤 밀(366g) 및 결합수(216g)의 중량을 결정하였다. 충분한(1284 ml) 0.2M NaCl을 이후 부가시켜 농도를 다시 10% w/v로 만들고, 이 샘플을 오버헤드 교반기를 사용하여 실온에서 30분간 혼합시켰다. 식염수 추출물을 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 소모된 밀로부터 분리하고, 이후 #3 필터 패드를 통해 두 번 통과시켜 여과시켰다. 정제된 식염수 추출물을 이후 병렬로 결합된 두 개의 10,000 MWCO Vivaflow HY 막 유닛을 사용하여 처리시켰다. 추출물을 농축시키고, 이후 5배의 역삼투(RO) 정제수로 정용여과시켰다. 정용여과수의 부가는 침전물의 발생을 유발시켰고, 이는 재농축 이전 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 제거되었다. 정용여과 잔류물을 85℃에서 10분간 열처리시켜 7S 및 12S를 침전시키고, 이는 8000g에서 15분간 원심분리에 의해 제거되었다. 원심분리물 이후 동결건조시켜 'C200H-식염수'로 명명하였다.

수추출물을 4℃에서 밤새 냉각시키고, 7100g에서 15분간 5℃에서 원심분리에 의해 침전물을 수집하였다. 수집된 고체를 이후 동결 건조시켰다. 상청액을 #3 필터 패드를 사용하여 여과하고, 이후 병렬로 결합된 두 개의 10,000 MWCO Vivaflow HY 막 유닛을 사용하여 처리시켰다. 추출물을 농축시키고, 이후 5배의 역삼투(RO) 정제수로 정용여과시켰다. 정용여과수의 부가는 침전물의 발생을 유발시켰고, 이는 재농축 이전 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 제거되었다. 정용여과 잔류물을 85℃에서 10분간 열처리시켜 7S 및 12S를 침전시키고, 이는 8000g에서 15분간 원심분리에 의해 제거되었다. 원심분리물 이후 동결건조시켜 'C200H-물'로 명명하였다. 다양한 샘플을 시험 2에 대해 기술된 바와 같이 분석하였다.

이전의 시험에서와 같이, 2차 식염수 추출물이 최초 수추출물에 비해 더 깨끗하고, 옅은 색상이었다(표 8). 그렇지만, 고온수 대신 주변온도 물의 사용은 더 적은 질소를 가용화시키고 약간 더 적은 오염물을 가용화시켰다. 이 수추출물은 A390 해석에 따르면, 고온수 추출물보다 더욱 짙은 색상이었다. 수추출물 냉각은 시험 2에서 60℃ 추출물이 냉각되었을 때보다 더 적은 단백질을 침전시켰다.

표 8: 물 및 식염수 추출물들에 대한 분석 결과

샘플	A330	A390	%단백질	%HPLC 비-단백질 피트 영역
주변온도 수추출물	123.3	6.00	1.66	80.18
식염수 추출물	27.1	1.73	0.86	71.76
수 냉각 상청액	90.2	3.73	0.98	89.47

밀의 주변온도 수추출은 고온 수추출만큼 많은 7S 단백질을 가용화시키지 않았다. 결과적으로, 더 높은 비율의 7S 및 12S 단백질들이 식염수 추출에서 나왔다(표 9). 그렇지만, 7S 및 12S 단백질들은 정용여과 잔류물의 열처리에서 성공적으로 제거되었다. 주변온도 수추출물의 냉각은 7S 및 12S 단백질들을 침전시켰지만, 고온 수추출이 냉각되었을 때만큼 많지는 않았다. 놀랍게도, 열처리는 수 공정 스트림으로부터 제조된 정용여과된 잔류물로부터의 7S 및 12S 단백질들을 제거함에 있어서 덜 효과적이었다.

표 9: 다양한 샘플들의 단백질 프로필들

샘플	12S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)	7S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)	2S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)
주변온도 수추출물	1.9	72.4	25.7
식염수 추출물	2.4	78.1	59.5
가열된 DF 잔류물 원심분리물-식염수	0.8	0.7	98.5
수 냉각 상청액	1.3	48.3	50.4
가열된 DF 잔류물 원심분리물-물	0.8	9.6	89.6

식염수 스트림으로부터 생산된 'C200H'의 색상은 수 스트림으로부터의 'C200H'의 색상보다 단지 약간 밝았다(표 9). 고온수가 초기 추출에서 사용된 때에는 어떠한 샘플도 그런 좋은 색상을 가지지 못했다(시험 2). 수 스트림으로부터생성된 'C200H'의 순도(72.78% 단백질 습윤 기준)는 식염수 스트림으로부터 생산된 'C200H'보다 훨씬 나빴다. 식염수 유래 생성물에 대한 HPLC 크로마토그램(16.4% 비-단백질 피크 영역)은 또한 수-유래 생성물에 대한 크로마토그램(27.9% 비-단백질 피크 영역)보다 또한 더 깨끗하였다. 따라서, 수 추출물 내 오염물의 수준은 식염수 추출물보다 높았다. 따라서, 수추출은 정제를 위해 더욱 광범위한 정용여과를 필요로 하였다. 이 시험에서 얻어진 냉각 침전된 7S 및 12S 단백질은 이전 시험에서 얻어진 것보다 약간 가벼웠는데, 아마도 주변온도 수추출이 고온 수추출보다 더 적은 불순물을 가용화시켰기 때문이다. 생성물의 순도는 다시 107.72%(습윤 기준)로서 역시 매우 높았다.

표 10: 시험 3의 최종 생성물의 건조 색상

샘플	L	a	b
'C200H'-식염수	86.04	-2.96	22.91
'C200H'-물	85.89	-2.79	24.60
냉침전 7S	68.92	-0.16	38.34

(d) 시험 4:

200g의 카놀라 오일 씨 가루(배치 B)을 2000 ml 물로 오버헤드 교반기를 사용하여 주변온도에서 30분간 10%w/v 추출시켰다. 이 수추출물을 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 소모된 밀로부터 분리하고, 팰릿 내 습윤 밀(639g) 및 결합수(439g)의 중량을 결정하였다. 충분한(1561 ml) 0.25M NaCl을 이후 부가시켜 농도를 다시 10% w/v로 만들고, 이 샘플을 오버헤드 교반기를 사용하여 실온에서 30분간 혼합시켰다. 식염수 추출물을 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 소모된 밀로부터 분리하고, 이후 #3 필터 패드를 통해 두 번 통과시켜 여과시켰다. 정제된 식염수 추출물을 이후 병렬로 결합된 두 개의 10,000 MWCO Vivaflow HY 막 유닛을 사용하여 처리시켰다. 추출물을 농축시키고, 이후 5배의 역삼투(RO) 정제수로 정용여과시켰다. 정용여과수의 부가는 침전물의 발생을 유발시켰고, 이는 재농축 이전 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 제거되었다. 정용여과 잔류물을 85℃에서 10분간 열처리시켜 7S 및 12S를 침전시키고, 이는 8000g에서 15분간 원심분리에 의해 제거되었다. 원심분리물을 이후 동결건조시켜 2개의 부분으로 나누어, 하나는 1중량% 분말 활성 탄소와 함께 30분간 교반하고, 샘플의 나머지 반은 비처리하였다. 두 샘플 모두 8000g에서 10분간 원심분리시키고, 0.45㎛ 포어 크기 시린지 필터로 여과시키고 이후 동결건조시켜 'C200H'(비 탄소) 및 'C200HC'(탄소 처리됨)으로 명명하였다. 초기 수추출물은 이 시험에서 처리되지 않았다. 다양한 샘플을 시험 2에 대해 기술된 바와 같이 분석하였다.

다른 시험에서와 같이, 2차 식염수 추출물은 초기 수추출물보다 더 깨끗하고 색상이 옅었다(표 11).

표 11: 물 및 식염수 추출물들에 대한 분석 결과

샘플	A330	A390	%단백질	%HPLC 비-단백질 피트 영역
주변온도 수추출물	104.5	4.93	1.02	85.37
식염수 추출물	32.1	1.35	0.72	69.32

역시, 초기 수추출은 7S 단백질의 가용화에 유리하였지만, 2차 식염수 추출은 유사한 비율로 두 단백질 부류를 가용화시켰다. 수추출은 다른 시험에서만큼 단백질을 제거하지 않았는데, 이는 서로 다른 밀 배치의 반영인 것 같았다. 정용여과 추출물의 열처리는 다량의 잔여 7S 및 12S 단백질들을 제거하였다. 얻어진 원심분리물의 탄소 처리는 단백질 프로필을 변경시키지 않았다. 탄소 처리는 HPLC 비-단백질 피크 영역을 15.76%로부터 4.82%로 감소시켰다.

표 12: 다양한 샘플들의 단백질 프로필들

샘플	12S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)	7S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)	2S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)
주변온도 수추출물	2.0	77.9	20.1
식염수 추출물	4.2	44.7	51.1
가열된 DF 잔류물 원심분리물	1.9	0.5	97.6
가열된 DF 잔류물 원심분리물-탄소	1.9	0.5	97.6

열처리된 정용여과 잔류물 원심분리물의 탄소 처리는 얻어진 생성물의 색상을 향상시켰다(표 13). 'C200HC'의 건조 색상은 'C200H'보다 약간 밝았고 눈에 띄게 옅어진 노란색이었다. 습윤 색상 샘플에서도 향상이 인정되었다.

표 13: 시험 4의 최종 생성물의 건조 색상

샘플	L	a	b
'C200H'	86.64	-1.61	22.69
'C200HC'	84.76	-1.64	17.64

(e) 시험 5:

200g의 체질한 카놀라 오일 씨 가루(배치 B)을 2000 ml 물로 오버헤드 교반기를 사용하여 주변온도에서 30분간 10%w/v 추출시켰다. 이 수추출물을 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 소모된 밀로부터 분리하고, 팰릿 내 습윤 밀(648g) 및 결합수(448g)의 중량을 결정하였다. 충분한(1552 ml) 0.25M NaCl을 이후 부가시켜 농도를 다시 10% w/v로 만들고, 이 샘플을 오버헤드 교반기를 사용하여 실온에서 30분간 혼합시켰다. 식염수 추출물을 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 소모된 밀로부터 분리하고, 이후 #2 및 #3 필터 패드를 통해 통과시켜 여과시켰다. 정제된 식염수 추출물을 이후 병렬로 결합된 두 개의 10,000 MWCO Vivaflow HY 막 유닛을 사용하여 처리시켰다. 추출물을 농축시키고, 이후 5배의 역삼투(RO) 정제수로 정용여과시켰다. 정용여과수의 부가는 침전물의 발생을 유발시켰고, 이는 재농축 이전 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 제거되었다. 정용여과 잔류물을 85℃에서 10분간 열처리시켜 7S 및 12S를 침전시키고, 이는 8000g에서 15분간 원심분리에 의해 제거되었다. 원심분리물을 이후 2개의 부분으로 나누어, 하나는 1중량% 분말 활성 탄소와 함께 30분간 교반하고, 샘플의 나머지 반은 비처리하였다. 두 샘플 모두 8000g에서 10분간 원심분리시키고, 0.45㎛ 포어 크기 시린지 필터로 여과시키고 이후 동결건조시켜 'C200H'(비 탄소) 및 'C200HC'(탄소 처리됨)으로 명명하였다. 초기 수추출물은 이 시험에서 처리되지 않았다. 다양한 샘플을 시험 2에 대해 기술된 바와 같이 분석하였다.

다른 시험에서와 같이, 2차 식염수 추출물은 초기 수추출물보다 더 깨끗하고 색상이 옅었다(표 14). 높은 겉껍질 함량을 갖는 보통 밀 대신 채질한 밀의 사용은 더 많은 단백질, 색상 및 패놀류가 추출되는 것을 유발하였다.

표 14: 물 및 식염수 추출물들에 대한 분석 결과

샘플	A330	A390	%단백질	%HPLC 비-단백질 피트 영역
주변온도 추출물	111.1	6.11	1.27	85.12
식염수 추출물	41.1	1.74	0.89	70.59

역시, 초기 수추출은 7S 단백질의 가용화에 비례적으로 유리하였지만, 한정된 추출능으로, 2차 식염수 추출은 유사한 비율로 두 단백질 부류를 가용화시켰다(표 15). 정용여과 잔류물의 열처리는 다량의 잔여 7S 및 단백질을 성공적으로 제거하였다. 얻어진 원심분리물의 탄소 처리는 단백질 프로필을 변경시키지 않았다. 탄소 처리는 HPLC 비-단백질 피크 영역을 10.94%로부터 1.58%로 감소시켰다.

표 15: 다양한 샘플들의 단백질 프로필들

샘플	12S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)	7S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)	2S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)
주변온도 수추출물	2.2	73.5	24.2
식염수 추출물	4.7	42.3	53.0
가열된 DF 잔류물 원심분리물	1.1	0.5	98.4
가열된 DF 잔류물 원심분리물-탄소	1.1	0.5	98.4

열처리된 정용여과 잔류물 원심분리물의 탄소 처리는 얻어진 생성물의 색상을 향상시켰지만, 이전의 시험에서만큼 좋은 것은 아니었다(표 16). 이 시험에서, 'C200HC'의 건조 색상은 'C200H'보다 옅은 노란색이었지만, 탄소 처리된 생성물은 비처리된 샘플보다 약간 더 적색이었고, 더 짙었다. 탄소 처리는 습윤 색상을 향상시켰지만, 역시 시험 4에서 더욱 큰 향상이 보였다.

표 16: 시험 5의 최종 생성물의 건조 색상

샘플	L	a	b
'C200H'	84.31	-1.61	22.17
'C200HC'	83.29	-1.32	18.39

(f) 시험 6:

150g의 카놀라 오일 씨 가루(배치 B)을 1500 ml 물로 오버헤드 교반기를 사용하여 60℃에서 15분간 10%w/v 추출시켰다. 이 수추출물을 5200g에서 10분간 원심분리에 의해 소모된 밀로부터 분리하고, 팰릿 내 습윤 밀(458g) 및 결합수(308g)의 중량을 결정하였다. 충분한(1192 ml) 0.25M NaCl을 이후 부가시켜 농도를 다시 10% w/v로 만들고, 이 샘플을 오버헤드 교반기를 사용하여 실온에서 30분간 혼합시켰다. 식염수 추출물을 5200g에서 10분간 원심분리에 의해 소모된 밀로부터 분리하고, 이후 #3 필터 패드를 통해 통과시켜 여과시켰다. 정제된 식염수 추출물을 이후 병렬로 결합된 두 개의 10,000 MWCO Vivaflow HY 막(안정화제 셀룰로오스)을 사용하여 처리시켰다. 추출물을 농축시키고, 이후 5배의 역삼투(RO) 정제수로 정용여과시켰다. 정용여과수의 부가는 침전물의 발생을 유발시켰고, 이는 재농축 이전 5200g에서 10분간 원심분리에 의해 제거되었다. 정용여과 잔류물을 85℃에서 10분간 열처리시켜 7S 및 12S를 침전시키고, 이는 8000g에서 15분간 원심분리에 의해 제거되었다. 원심분리물을 이후 동결건조시켜 'C200H'로 명명하였다. 초기 수추출물은 이 시험에서 처리되지 않았다. 다양한 샘플들을 시험 2에서 기술된 바와 같이 분석하였다.

다른 시험들에서와 같이, 2차 식염수 추출물이 최초 수추출물에 비해 더 깨끗하고, 옅은 색상이었다(표 17). 더 길게 60℃ 수추출하면 식염수 추출물의 품질을 약간 더 향상시켰을 것이나, 그 효과는 상당한 것으로 보이지 않았다.

표 17: 물 및 식염수 추출물들에 대한 분석 결과

샘플	A330	A390	%단백질	%HPLC 비-단백질 피트 영역
60℃ 수추출물	89.1	4.44	1.32	83.97
식염수 추출물	19.1	1.07	0.75	70.57

다양한 샘플의 단백질 프로필을 표 18에 나타내었다. 60℃에서 더 길게 추출하면 동일한 밀 배치의 이전 추출들보다 더 많은 7S 및 12S 단백질들을 가용화시키는 것으로 보였다. 이는 바람직한데, 식염수 추출액의 7S/12S 함량을 감소시켜, 정제된 2S 단백질의 샘플 제조를 용이하게 하기 때문이다.

표 18: 다양한 샘플들의 단백질 프로필들

샘플	12S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)	7S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)	2S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)
60℃ 수추출물	3.5	81.1	15.5
식염수 추출물	2.0	27.7	70.3
가열된 DF 잔류물 원심분리물	1.5	0.4	98.1

이 샘플의 건조 색상은 평균이었고(표 9) 습윤 색상은 좋았지만, 탄소처리된 샘플에 대해 이전에 보여진 것만큼 좋지는 않았다.

표 19: 시험 6의 최종 생성물의 건조 색상

샘플	L	a	b
'C200H'	83.32	-1.12	21.56

(g) 시험 7:

1 중량% 분말 활성탄소(16g)와 함께 160g의 카놀라 오일 씨 가루(배치 B)을 1600 ml 물로 오버헤드 교반기를 사용하여 60℃에서 5분간 10%w/v 추출시켰다. 이 수추출물을 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 소모된 밀로부터 분리하고, 팰릿 내 습윤 밀/탄소(533g) 및 결합수(357g)의 중량을 결정하였다. 충분한(1243 ml) 0.2M NaCl을 이후 부가시켜 농도를 다시 10% w/v로 만들었다. 또다른 16g의 신선한 분말 활성탄소를 또한 시스템에 부가하고, 이 샘플을 오버헤드 교반기를 사용하여 실온에서 30분간 혼합시켰다. 식염수 추출물을 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 소모된 밀로부터 분리하고, 이후 #3 필터 패드를 사용하여 여과시켰다. 정제된 식염수 추출물을 이후 병렬로 결합된 두 개의 10,000 MWCO Vivaflow HY 막 유닛을 사용하여 처리시켰다. 추출물을 농축시키고, 이후 5배의 역삼투(RO) 정제수로 정용여과시켰다. 정용여과수의 부가는 침전물의 발생을 유발시켰고, 이는 재농축 이전 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 제거되었다. 정용여과 잔류물을 85℃에서 10분간 열처리시켜 7S 및 12S를 침전시키고, 이는 8000g에서 15분간 원심분리에 의해 제거되었다. 원심분리물을 이후 동결건조시켜 'C200H'로 명명하였다. 초기 수추출물은 이 시험에서 처리되지 않았다. 다양한 샘플들을 시험 2에서 기술된 바와 같이 분석하였다.

추출 단계에서의 탄소 포함은 공정 스트림의 색상 및 순도 함량을 크게 감소시켰다(표 20).

표 20: 물 및 식염수 추출물들에 대한 분석 결과

샘플	A330	A390	%단백질	%HPLC 비-단백질 피트 영역
60℃ 수추출물	7.86	0.55	1.07	45.18
식염수 추출물	0.29	0.10	0.44	2.35

다양한 샘플의 단백질 프로필을 표 21에 나타내었다. 수추출물 내 단백질의 비율은 시험 6에서 나타난 것과 매우 비슷하였다. 그렇지만, 식염수 추출물 내 단백질의 함량은 2S 단백질이 명백히 유리했던 시험 6보다도 더 많았다. 이에 대한 설명으로는 이 시험에서 수상에 의한 단백질 추출능의 수준 저하 및 아마도 탄소에 대한 2S 단백질의 손실일 수 있다. 그렇지만, 단백질은 시험 4 및 5에서 적용된 때의 단백질 프로필을 변경시키지 않았다.

표 21: 다양한 샘플들의 단백질 프로필들

샘플	12S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)	7S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)	2S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)
60℃ 수추출물	3.5	83.0	13.5
식염수 추출물	3.3	42.9	53.8
'C200H'	3.2	0.1	96.7

이 샘플은 우수한 건조 및 습윤 색상을 가졌다(표 22). 'C200H'에 대한 LECO 결과는 단지 89.3% (습윤 기준)였지만, 건조 기준으로는 이 샘플은 분리물같았다. 최종 생성물에 대한 HPLC에 따른 비-단백질 불순물의 농도는 단지 1.1%이었다. 그러므로, 샘플 내에 존재하는 비-단백질 종의 대다수는 280 nm에서 흡수하지 않았다. 이들 화합물들의 염일 가능성이 가장 컸다. 물을 사용한 부가적인 정용여과가 사용되어 이 염을 제거하고 최종 생성물의 단백질 함량을 향상시킬 수 있다.

표 22: 시험 7의 최종 생성물의 건조 색상

샘플	L	a	b
'C200H'	89.67	-1.87	15.47

시험 1 내지 7의 결과는 카놀라 오일 씨 가루에 대해 행해진 이중 추출 공정은 7S 단백질-풍부 및 2S 단백질 풍부 스트림들을 생성하였음을 보여준다.

실시예 3:

이 실시예는 식염수 추출 이전에 다수의 수추출이 행해진 실시예 2의 이중 추출 공정의 일련의 시험들을 규정한다.

이 일련의 시험의 결과를 여기에 나타낸다. 산업적으로, 씨 가루의 수추출은 역류 추출기를 사용하여 수행됨에 주목해야 한다. 그러한 공정은 밀을 대량의 개별적 세척에 노출시킨다.

시험 1:

15g의 카놀라 씨 가루(배치 B)을 150 ml 물로 60℃에서 5분간 추출시켰다. 이 물을 65℃까지 예열시키고, 이후 220 rpm에서 작동하는 오비탈 쉐이커를 사용하여 밀과 함께 혼합시켰다. 추출물을 10,000g에서 10분간 원심분리에 의해 소모된 밀로부터 분리하였다. 추출물을 따라버리고, 습윤 밀을 회수하고 중량을 재고 모은 물의 부피를 계산하였다. 부피를 150ml로 다시 만드는데 충분한 65℃물을 소모된 밀에 부가시키고, 상기한 바와 같이 추출을 반복하였다. 이 공정을 네 번의 수추출이 행해질 때까지 반복하였다. 5번째 추출은 이후 실온 0.5M NaCl로 수행하였다. 부피를 150ml로 다시 만드는데 충분한 식염수를 부가시키고, 이후 이 샘플을 220 rpm에서 30분간 실온에서 흔듦으로써 추출을 수행하였다. 표 23은 각 추출에 대해 부가된 물 또는 식염수의 부피를 나타낸다. 2차 및 3차 추출 이후 원심분리시 응집된 펠릿이 얻어지지 않았음을 주목하라. 따라서, 샘플을 데칸트할 때, 밀을 손실시키기 않도록 더 많은 용매가 남아있었다. 이론적으로, 만약 최대량의 소모된 물이 제거될 수 있고 신선한 물로 대체될 수 있었다면 더 많은 오염물들이 추출될 수 있었다.

표 23: 추출 분획의 부피

추출 번호	밀 중량(g)	포집된 물 부피(ml)	부가된 용매 부피(ml)
1	15	0	150
2	40	25	125
3	57	42	108
4	78	63	87
5	40	25	125

추출 샘플의 pH, 전도성 및 브릭스를 측정하고 이후 샘플을 0.45 um 포어 크기 시린지 필터로 여과하고 유리 페놀류(A330), 가시 색상(A390), 단백질 함량(LECO), 및 단백질 프로필(SEC HPLC)에 대해 시험하였다.

연속적인 수추출은 상당한 양의 단백질 및 불순물을 제거하였다(표 24). 이 시험에서 생성된 식염수 추출물은 실시예 2에서 보고된 단일 수추출 시험에서 생성된 식염수 추출물보다 훨씬 깨끗하였다. 그러한 시험들에서, 식염수 추출은 HPLC에 의해 대략 70% 비-단백질 피크 영역을 함유하는 것으로 확인되었다. 그렇지만, 둘다 탄소 처리를 수반하고, 한번의 수추출 및 이후의 식염수 추출을 사용한 시험으로부터의 식염수 추출은 현재의 시험보다 훨씬 낮은 A330(0.29), A390(0.10) 및 % HPLC 비-단백질 피크 영역(2.34%)를 가졌다. 이들 차이는 다수의 수추출이 원하는 제품 색상을 얻는데 충분히 깨끗한 식염수 추출물을 생성하지 않음을 시사한다.

표 24: 시험 1 추출물에 대한 분석 결과

샘플	pH	조건(mS)	브릭스	A330	A390	%단백질	%HPLC 비-단백질 피트 영역
수추출물#1	5.86	2.50	3.3	106.6	4.73	1.21	84.42
수추출물#2	6.06	0.825	0.7	23.1	1.53	0.26	91.61
수추출물#3	6.16	0.415	0.4	9.80	0.811	0.08	91.73
수추출물#4	6.26	0.269	0.3	5.73	0.518	0.03	91.89
0.5M NaCl 추출물	6.01	33.5		7.37	0.513	0.62	23.62

7S 단백질은 2S 단백질보다 고온수로 더욱 쉽게 추출되었다(표 25). 예상되는 바와 같이, 식염수 추출은 2S 단백질이 풍부하였다. 총 추출 2S 단백질의 대략 1/3이 대다수의 7S/12S 단백질들 및 불순물들과 함께 낮은 순도 수 스트림으로 갔다고 추정된다. 고순도 스트림에서 가능한 한 많은 2S 단백질을 보존하는 것이 바람직하다. 수상(낮은 품질 셍성물로서 회수됨)에서 2S 단백질의 손실에 대한 허용가능성의 한계 및 사실 전체 다수 추출 계획 값은 식염수 스트림으로부터 오는 2S 단백질의 품질 및 값에 의존한다.

표 25: 시험 1 추출물의 단백질 프로필

샘플	12S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)	7S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)	2S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)
수추출물#1	2.4	80.6	17.0
수추출물#2	3.3	86.6	10.1
수추출물#3	8.3	83.3	8.4
수추출물#4	8.7	81.0	10.3
0.5M NaCl 추출물	5.1	20.0	74.9

시험 2:

150g의 카놀라 씨 가루(배치 B)을 1500 ml 물로 60℃에서 5분간 추출시켰다. 이 물을 65℃까지 예열시키고, 이후 오버헤드 교반기를 사용하여 밀과 함께 혼합시켰다. 추출물을 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 소모된 밀로부터 분리하였다. 추출물을 따라버리고, 습윤 밀을 회수하고 중량을 재고 모은 물의 부피를 계산하였다. 부피를 1500ml로 다시 만드는데 충분한 65℃물을 소모된 밀에 부가시키고, 상기한 바와 같이 추출을 반복하였다. 이 공정을 네 번의 수추출이 행해질 때까지 반복하였다. 5번째 추출은 이후 실온 0.2M NaCl로 수행하였다. 염을 정용여과에 의해 제거해야만 하기 때문에 시험 1보다 낮은 염 농도가 선택되었고, 시간이 단지 다섯 번의 정용여과를 처리하는 것만 허용하였다. 부피를 1500ml로 다시 만드는데 충분한 0.2M NaCl을 부가시키고, 이후 이 샘플을 오버헤드 교반기로 30분간 실온에서 혼합시킴으로써 추출을 수행하였다. 표 26은 각 추출에 대해 부가된 물 또는 식염수의 부피를 나타낸다.

표 26: 추출 분획의 부피

추출 번호	가루 중량(g)	포집된 물 부피(ml)	부가된 용매 부피(ml)
1	150	0	1500
2	430	280	1220
3	459	309	1191
4	466	316	1184
5	426	276	1224

식염수 추출물을 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 소모된 밀로부터 분리하고, 이후 #3 필터 패드를 통해 통과시켜 여과시켰다. 정제된 식염수 추출물을 이후 병렬로 결합된 두 개의 10,000 MWCO Vivaflow HY 막 유닛을 사용하여 처리시켰다. 추출물을 농축시키고, 이후 5배의 역삼투(RO) 정제수로 정용여과시켰다. 정용여과수의 부가는 침전물의 발생을 유발시켰고, 이는 재농축 이전 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 제거되었다. 정용여과 잔류물을 85℃에서 10분간 열처리시켜 7S 및 12S를 침전시키고, 이는 8000g에서 15분간 원심분리에 의해 제거되었다. 원심분리물을 이후 동결건조시켜 'C200H'로 명명하였다.

다양한 샘플들을 유리 페놀류(A330), 가시 색상(A390), 단백질 함량(LECO), 및 단백질 프로필(SEC HPLC)에 대해 시험하였다. 최종 생성물을 Minolta 비색계를 사용하여 건조 색상에 대해 분석하고, 습윤 색상 분석용으로 용액을 또한 제조하였다. 단백질 분말(0.7g)을 보텍스 혼합기를 사용하여 0.1M NaCl과 혼합시켰다. 샘플 을 이후 8000g에서 10분간 원심분리하고, 상청액의 단백질 함량을 LECO에 의해 결정하였다. 상청액의 분취량(8 ml)을 작은 비커에 옮기고, 충분한 식염수를 부가시켜 단백질 함량을 5%로 조정하였다. 샘플을 이후 사진찍었다.

이 시험에서 수추출물들은 시험 1과 비교하여 대략 동일한 양의 단백질, 색상 및 불순물을 제거하는 것으로 보였다. 식염수 추출물의 품질은 이 시험의 추출물에서 발견된 더 적은 단백질, 유리 페놀류, 불순물 및 가시 색상을 약간 다르게 나타났다. 수추출물에 대한 분석 데이터가 그렇게 유사하게 나타났기 때문에, 식염수 추출물에서의 차이는 서로 다른 염 농도로 인한 것인 것 같았다.

표 27: 시험 2 추출물에 대한 분석 결과

샘플	pH	조건(mS)	브릭스	A330	A390	%단백질	%HPLC 비-단백질 피트 영역
수추출물#1	6.02	2.53	3.2	97.7	4.96	1.11	84.36
수추출물#2	6.24	0.906	1.0	22.8	1.63	0.22	91.12
수추출물#3	6.39	0.400	0.4	9.48	0.756	0.14	90.27
수추출물#4	6.49	0.222	0.2	4.36	0.437	0.12	84.19
0.2M NaCl 추출물	6.18	15.88		1.99	0.202	0.40	14.19

이 시험에서 수추출물의 단백질 프로필(표 28)은 시험 1에서와 유사하였지만, 식염수 추출물은 더 높은 비율의 2S 단백질을 갖는 것으로 나타났다. 이는 다소 놀라운 것인데, 더 적은 염이 이 시험에서 사용되었고, 증가된 염분은 7S 단백질보다는 2S 단백질의 추출에 유리할 것으로 생각되었기 때문이다.

표 28: 시험 2 추출물의 단백질 프로필

샘플	12S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)	7S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)	2S에 할당된 단백질 피크면적의 비율(%)
수추출물#1	2.2	81.5	16.3
수추출물#2	4.6	86.3	9.1
수추출물#3	11.7	83.4	4.9
수추출물#4	18.9	73.1	8.0
0.2M NaCl 추출물	2.2	8.1	89.7

식염수 추출물의 막 처리는 이를 더욱 정제시켰는데, 정용여과 잔류물에 대한 HPLC 비-단백질 피크 면적%가 단지 2.3%로 나타났다. 이는 단일 수추출 시험에 대해 통상 나타나는 것보다 낮았다(실시예 2 참조).

이 시험에서 생성된 'C200H'의 건조 색상은 표 29에 나타내어진다. 이 색상은 동일한 밀을 이용한 다른 이중 추출 시험에서 나타난 것과 매우 유사하다. 이중 추출과 더불어 분말 탄소의 사용은 거의 90인 밝기값 및 이 시험의 생성물에서보다 더 적은 적색 및 황색 값을 갖는 'C200H'를 생성하였다.

표 29: 시험 2의 생성물의 건조 색상

샘플	L	a	b
'C200H'-시험 2	83.53	-1.07	19.20

시험 2에서 생성된 'C200H'의 습윤 색상은 흡착제 없는 다른 이중 추출 시험(60℃ 물)에서 보여진 것보다 역시 좋지 못했고, 흡착제를 사용하여 생성된 샘플보다 확실히 짙었다.

실시예 2와 비교되는 이들 시험의 결과는 식염수 추출 이전의 밀의 다수 수추출은 부가적인 불순물(흡착제 없음)을 제거시키는 것으로 보였지만, 최종 제품 품질에는 큰 영향이 없었다.

실시예 4

이 실시예는 한외여과 잔류물로부터 분리된 2S 단백질 생성물의 제조를 예시한다.

40 kg의 카놀라 밀을 주변온도에서 400L의 0.15M NaCl 용액에 부가시키고, 30분간 교반시켜 수성 단백질 용액을 제공하였다. 남은 카놀라 밀을 제거시키고, 얻어진 단백질 용액을 원심분리 및 여과에 의해 정제하여 1.87 중량%의 단백질 함량을 갖는 139L의 여과된 단백질 용액을 생산하였다.

139L 분취량의 단백질 추출 용액을 30,000 달톤의 분자량 컷오프를 갖는 PVDF 막 상에서 농축에 의해 8.9L로 부피를 감소시켰다. 5L 분취량의 농축된 단백질 용액을 이후 100,000 달톤의 분자량 컷오프를 갖는 PES 막 상에서 24.8L의 0.15M NaCl 용액으로 정용여과시켰다. 정용여과된 잔류물을 이후 60℃에서 10분간 저온살균시켰다.

정용여과되고 저온살균된 한외여과(UF1) 잔류물의 샘플이 얻어졌다. 이 잔류물의 단백질 함량은 18.30 중량%이었다. UF1 잔류물 내에 존재하는 높은 비율의 7S와 조합되는 높은 단백질 농도는 가열에 의한 단순 침전보다는 겔화를 유발한다고 생각되었다. 결과로서, 샘플의 단백질 농도를 100 ml 잔류물과 100 ml 0.1M NaCl과의 조합에 의해 열처리 이전에 조정시켰다.

희석된 샘플을 85℃에서 10분간 열처리시키고, 이후 30℃ 아래로 냉수로 급속 냉각시켰다. 샘플을 이후 10200g에서 15분간 원심분리시켰다. 원심분리후, 부유 침전 입자와 더불어 펠릿이 얻어졌다. 상청액을 데칸트시키고, 부유 입자를 25 um 포어 크기 여과지를 통해 여과에 의해 제거시켰다. 회수된 상청액(120 ml)을 Vivaflow 10000 HY 막 유닛 상에서 농축시키고, 이후 10배의 역삼투(RO) 정제수로 정용여과시켜 염을 제거하였다. 정용여과 잔류물을 이후 동결건조시켜 'C500H'로 명명하였다.

다양한 샘플들을 유리 페놀류(A330), 가시 색상(A390), 단백질 함량(LECO), 및 단백질 프로필(SEC HPLC)에 대해 시험하였다. 최종 생성물을 오븐 건조법을 사용하여 수분 함량에 대해, Minolta 비색계를 사용하여 건조 색상에 대해 분석하고, 습윤 색상 분석용으로 용액을 또한 제조하였다. 단백질 분말(0.7g)을 보텍스 혼합기를 사용하여 물(10 ml)과 혼합시켰다. 샘플을 이후 7800g에서 10분간 원심분리하고, 상청액의 단백질 함량을 LECO에 의해 결정하였다. 상청액의 분취량(8 ml)을 작은 비커에 옮기고, 충분한 식염수를 부가시켜 단백질 함량을 5%로 조정하였다. 샘플을 이후 사진찍었다.

UF1 잔류물의 열처리는 다량의 7S 및 12s 단백질들을 샘플로부터 성공적으로 제거하였다. 초기 잔류물 내 7S 및 12S로 인한 LPLC 단백질 피크 영역의 비율은 각각 61.4% 및 2%이었다. 이는 열처리된 샘플의 상청액 내에서 4.4% 7S 및 0.4% 12S로 감소되었다. 얻어진 최종 생성물은 90.32% 단백질 함량(습윤 기준) 및 4.82% 수분 함량을 갖는 분리물이어서, 94.89%의 단백질 함량(건조 기준)이 얻어졌다.생성물의 건조 색상은 C200H 생성물에 대해 이전에 보여진 것보다 약간 더 짙었다(표 30).

표 30: UF1 잔류물로부터 생성된 C500H에 대한 건조 색상

샘플	L	a	b
C500H	80.84	-1.12	22.32

아마도 C200H에 대해 보여진 것보다 약간 더 짙었지만, 생성물의 습윤 색상은 꽤 좋았다. 샘플은 약간 탁했다.

여기에 나타낸 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 2S 단백질을 필수로 하여 구성된 카놀라 단백질 분리물은 UF1 잔류물로부터 성공적으로 발생되었다.

실시예 5

이 실시예는 카놀라 오일 씨 가루로부터 형성된 카놀라 단백질 추출 용액의 열처리를 예시한다.

150g의 카놀라 오일 씨 가루(SB062)을 오버헤드 교반기를 사용하여 실온에서 30분간 1500 ml의 0.1M NaCl로 추출시켰다. 혼합물을 7100g에서 10분간 원심분리시켜 추출물을 소모된 밀로부터 분리시켰다. 수집된 추출물을 85℃에서 10분간 더블 보일러 포트 내에서 열처리시켜 7S/12S를 침전시켰다. 열처리 이후, 샘플을 냉수 배스 내에 담금으로써 30℃ 이하로 즉시 냉각시켰다. 침전된 고체를 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 제거시키고, 이후 원심분리물을 #3 필터 패드로 닦았다. 정제된 원심분리물을 이후 Vivaflow 10000 HY 한외여과 유닛 상에서 농축시키고, 10배의 역삼투(RO) 정제수로 정용여과시켰다. 정용여과수의 부가는 침전물의 발생을 유발시켰고, 이는 재농축 이전 7100g에서 10분간 원심분리에 의해 제거되었다. 정용여과된 잔류물을 이후 동결건조시켜 최종 생성물을 형성하였다.

다양한 샘플들을 유리 페놀류(A330), 가시 색상(A390), 단백질 함량(LECO), 및 단백질 프로필(SEC HPLC)에 대해 시험하였다. 최종 생성물을 오븐건조법을 사용하여 수분함량에 대해, Minolta 비색계를 사용하여 건조 색상에 대해 분석하고, 습윤 색상 분석용으로 용액을 또한 제조하였다. 단백질 분말(0.8g)을 보텍스 혼합기를 사용하여 물(10 ml)과 혼합시켰다. 샘플을 이후 7800g에서 10분간 원심분리하 고, 상청액의 단백질 함량을 LECO에 의해 결정하였다. 상청액의 분취량(8 ml)을 작은 비커에 옮기고, 충분한 물을 부가시켜 단백질 함량을 5%로 조정하였다. 샘플을 이후 사진찍었다.

추출물의 열처리는 다량의 7S 및 12s 단백질들을 샘플로부터 성공적으로 제거하였다. 초기 추출물 내 7S 및 12S로 인한 HPLC 단백질 피크 영역의 비율은 각각 63.8% 및 3.8%이었다. 이는 열처리된 샘플의 원심분리물 내에서 2.0% 7S 및 0.8% 12S로 감소되었다. 추출물을 열처리하여 형성된 침전물은 원심분리에 의해 쉽게 제거되었다. 얻어진 최종 생성물은 84.15% 단백질 함량(습윤 기준) 및 7.22% 수분 함량을 갖는 분리물이어서, 90.70%의 단백질 함량(건조 기준)이 얻어졌다. 생성물의 건조 색상은 대다수의 분리된 2S 생성물에 대해 이전에 보여진 것보다 약간 더 짙고 더 적색이었다(표 31).

표 31: 열처리 추출물로부터 생성된 분리된 2S에 대한 건조 색상

샘플	L	a	b
열처리 추출물로부터의 2S	80.60	-0.57	22.34

상세한 설명의 요약

이 상세한 설명의 요약에서, 2S 카놀라 단백질을 필수로 하여 구성되고 실질적으로 7S 및 12S 단백질이 없는 카놀라 단백질 분리물을 제조하기 위한 공정들이 제공된다. 본발명의 범위 이내에서 변형이 가능하다.

Claims

다음을 포함하는, 2S 카놀라 단백질이 우세하게 구성된 카놀라 단백질 분리물을 제조하기 위한 방법:

70℃ 내지 100℃의 온도에서 수성염 용액으로 카놀라 오일 씨 가루를 추출하여 7S 및 12S 단백질보다 우선하여 선택적으로 2S 카놀라 단백질을 추출하고 2S 단백질이 우세하게 함유된 카놀라 단백질 추출 용액을 얻는 것,

남은 카놀라 오일 씨 가루로부터 카놀라 단백질 추출 용액을 분리하는 것, 및

상기 카놀라 단백질 추출 용액으로부터, 최소한 90 중량%(Nx6.25)의 함량을 갖고 2S 카놀라 단백질이 우세하게 구성된 카놀라 단백질 분리물을 회수하는 것.
제 1항에 있어서, 상기 수성염 용액은 최소한 0.05의 이온강도, 및 5 내지 6.8의 pH를 갖는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 이온강도는 최소한 0.1이고, pH는 5.3 내지 6.2인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 온도는 80℃ 내지 90℃인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 카놀라 단백질 추출 용액은 다음의 카놀라 단백질 프로필을 갖는 방법:

80 내지 100 중량%의 2S 단백질,

0 내지 10 중량%의 7S 단백질, 및

0 내지 10 중량%의 12S 단백질.
제 1항에 있어서, 상기 2S 단백질이 우세하게 구성된 카놀라 단백질 분리물을 회수하기 위한 회수 단계는 카놀라 단백질 추출 용액을 최소한 50 g/l의 농도로 농축시키고, 얻어진 농축 수성 카놀라 단백질 추출 용액을 건조시킴으로써 수행되는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 수성 카놀라 단백질 추출 용액은 100 g/l 내지 400 g/l의 단백질 농도로 농축되는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 수성 카놀라 단백질 추출 용액은 200 g/l 내지 300 g/l의 단백질 농도로 농축되는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 농축 수성 카놀라 단백질 추출 용액은 2 내지 20배의 정용여과 용매를 사용하는 정용여과에 처해지는 방법.
제 9항에 있어서, 상기 정용여과는 5 내지 10배의 정용여과 용매를 사용하여 수행되는 방법.
제 9항에 있어서, 최소한 정용여과 단계의 부분 동안에 항산화제가 존재하는 방법.
제 6항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 농축 수성 카놀라 단백질 추출 용액은 상기 건조 단계 이전에 70℃ 내지 100℃의 온도에서 2 내지 30분간 열처리 단계에 처해져서 상기 용액 내 7S 및 12S 단백질의 비율을 침전에 의해 용액으로부터 최소한 50중량% 만큼 감소시키는 방법.
제 12항에 있어서, 상기 열처리 단계는 75℃ 내지 95℃의 온도에서 5 내지 15분간 수행되어 상기 용액 내 7S 및 12S 단백질의 비율을 침전에 의해 용액으로부터 최소한 75중량% 만큼 감소시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 2S 단백질이 우세하게 구성된 카놀라 단백질 분리물은 최소한 100 중량%의 단백질 함량을 갖는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 2S 단백질이 우세하게 구성된 카놀라 단백질 분리물은 존재하는 카놀라 단백질의 최소한 90 중량%의 2S 단백질을 함유하는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 2S 단백질이 우세하게 구성된 카놀라 단백질 분리물은 존재하는 카놀라 단백질의 최소한 95중량%의 2S 단백질을 함유하는 방법.
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