CN101272697B - 芥花籽蛋白质的生产 - Google Patents

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Abstract

制备了具有至少约90wt％(N×6.25)，优选至少约100wt％蛋白质含量和主要由2S蛋白质构成并且基本上无7S和12S蛋白质的芥花籽蛋白质分离物。在一个方面中，用蛋白质水溶液在升高的温度提取芥花籽油种子粉，从粉中优先提取2S蛋白质来产生主要含有2S蛋白质的芥花籽蛋白质溶液。作为分离物回收2S芥花籽蛋白质。在另一个方面中，最初用水提取芥花籽油种子粉，优先提取7S和12S蛋白质，接着用盐水溶液提取芥花籽油种子粉，从粉中提取出2S蛋白质。从盐水提取物中回收2S芥花籽蛋白质分离物。在另一个方面中，用盐水溶液提取芥花籽油种子粉，从粉中提取2S，7S和12S蛋白质。在升高的温度热处理蛋白质提取物水溶液来沉淀7S和12S蛋白质并留下可以从其回收分离物的2S蛋白质溶液。在再一个方面中，在热处理之前将蛋白质水溶液浓缩。

Description

芥花籽蛋白质的生产
相关申请的参照
依据35 USC 119(e)，本申请要求2005年7月1日提交的U.S.临时专利申请No.60/695,535的优先权。
发明领域
本发明涉及用于制备基本上无芥花籽(canola)7S和12S蛋白质的芥花籽2S蛋白质的新方法。
发明背景
可以从芥花籽油种子粉形成芥花籽蛋白质分离物。2002年5月3日提交的共同未决美国专利申请No.10/137,391(US专利申请公开号20030125526A1)，2004年6月9日提交的10/476,230(US专利申请公开号20040254353A1)和相应的PCT公开No.WO02/089597，都转让于本受让人并在此将其公开内容引入作为参考，其描述了从芥花籽油种子粉制备芥花籽蛋白质分离物的方法，该分离物具有至少100wt％蛋白质含量(N×6.25)。该方法涉及多步骤过程，包括使用盐溶液提取芥花籽油种子粉，分离所得到的含水蛋白质溶液和残余的油种子粉，使用选择性膜技术将水溶液的蛋白质浓度提高至至少约200g/L同时保持离子强度基本不变，将所得到的浓缩蛋白质溶液稀释至冷却水中来形成蛋白质胶束，使蛋白质胶束沉淀来形成无定形、粘性、胶状谷蛋白质样蛋白质胶束团(PMM)，并从上清液中收集具有至少约100wt％蛋白质含量的蛋白质胶束团，如通过凯氏氮(N×6.25)所测定的。如在此所用的，基于干重来测定蛋白质含量。可以将回收的PMM干燥。
在上述方法的一个实施方案中，处理来自PMM沉淀步骤的上清液来回收蛋白质分离物，该分离物包括来自湿PMM和上清液的干燥蛋白质。可以通过最初使用超滤膜浓缩上清液，混合浓缩的上清液和湿PMM并干燥混合物来实现该方法。所得到的芥花籽蛋白质分离物具有至少约90wt％蛋白质的高纯度(N×6.25)，优选至少约100wt％(N×6.25)。
在上述方法的另一个实施方案中，处理来自PMM沉淀步骤的上清液来回收来自上清液的蛋白质。可以通过最初使用超滤膜浓缩上清液并干燥浓缩物来实现该方法。所得到的芥花籽蛋白质分离物具有至少约90wt％蛋白质的高纯度(N×6.25)，优选至少约100wt％(N×6.25)。
上述US专利申请中所述的方法实质上是间歇法。2002年11月19日提交的共同未决美国专利申请No.10/298,678(US专利公开No.20040039174A1)和相应公开的国际申请No.WO03/043439，转让于本受让人并在此将其公开内容引入作为参考，描述了制备芥花籽蛋白质分离物的连续方法。根据其，将芥花籽油种子粉与盐溶液连续混合，通过管道传送混合物，同时从芥花籽油种子粉中提取蛋白质来形成含水蛋白质溶液，将含水蛋白质溶液与残余的芥花籽油种子粉连续分离，将含水蛋白质溶液连续传送通过选择性膜操作，以将含水蛋白质溶液的蛋白质浓度提高至至少约200g/L，同时保持离子强度基本不变，将所得到的浓缩蛋白质溶液与冷却水连续混合来形成蛋白质胶束，并使蛋白质胶束连续沉淀，同时使上清液连续溢出，直至沉淀罐中累积所需量的PMM。从沉淀罐中取出PMM并可以将其干燥。PMM具有至少约90wt％蛋白质含量，通过凯氏氮所测定(N×6.25)，优选至少约100wt％(N×6.25)。
如上述US专利申请No.10/137,391和10/471,230中所述的，可以处理溢出的上清液，以从其回收芥花籽蛋白质分离物。
已知芥花籽种子含有约10至约30wt％的蛋白质，并且已经鉴定了几种不同的蛋白质成分。通过不同的沉降系数(S)来区分这些蛋白质。这些已知并鉴定的蛋白质包括12S球蛋白质，称为cruciferin，和2S储存蛋白质，称为napin。
芥花籽也称为油菜籽或油菜(oil seed rape)。
2003年8月25日提交的共同未决美国专利申请No.10/413,371(US专利申请公开No.20040034204)和2003年4月15日提交的10/510,766,以及相应公开的PCT公开No.WO03/08876，转让于本受让人并在此将其公开内容引入作为参考，描述了PMM芥花籽蛋白质分离物和源自上清液的芥花籽蛋白质分离物的组成。源自上清液的芥花籽蛋白质分离物主要由2S蛋白质构成，含有较少量的7S蛋白质和痕量的12S蛋白质。2S蛋白质是低分子量白蛋白。产生的PMM主要由7S蛋白质构成，2S蛋白质和12S蛋白质是相对少量的成分。7S和12S蛋白质是较高分子量的球蛋白质，7S分子是12S蛋白质分子的一半。
如在此所述的，源自上清液的芥花籽蛋白质分离物呈现出如下的蛋白质分布：
约60至约95％wt％的2S蛋白质，
约5至约40wt％的7S蛋白质，和
0至约5wt％的12S蛋白质，优选
约70至约95wt％的2S蛋白质，
约5至约30wt％的7S蛋白质，和
0至约2wt％的12S蛋白质。
PMM芥花籽蛋白质分离物呈现出如下的蛋白质分布：
约60至约98wt％的7S蛋白质，
约1至约15wt％的12S蛋白质，和
0至约25wt％的2S蛋白质，优选
约88至约98wt％的7S蛋白质，
约1至约10wt％的12S蛋白质，和
0至约6wt％的2S蛋白质。
已经发现源自上清液的主要由2S蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物对于某些应用呈现出比源自PMM的主要由7S蛋白质构成的蛋白质分离物更好的功能特性。在在先申请中描述的方法中，为了产生源自上清液的芥花籽蛋白质分离物，需要依次进行PMM形成并提供上清液的步骤，以有效地分离芥花籽蛋白质。
2005年7月21日提交的U.S.专利申请No.11/038,086(U.S.专利申请公开No.US2005-0181112A1)，转让于本受让人并在此将其公开内容引入作为参考(WO2005/067729)，描述了一种方法，其中将来自PMM沉淀的上清液在膜处理后进行热处理来沉淀7S蛋白质并留下富含2S蛋白质的蛋白质溶液。可以将剩余的溶液喷雾干燥。
具有最小比例7S和12S蛋白质的2S蛋白质证明了在酸性pH值的溶解性超过未处理的2S蛋白质并能够提供提高的溶液清澈度以及用于软饮料时，提供了清澈的蛋白质强化饮料。
发明概述
已经令人惊讶地发现，根据本发明的一个方面，如果在升高的温度而不是在相对环境温度实现芥花籽油种子粉的提取，那么2S蛋白质的提取优先于7S和12S蛋白质并且所得到提取溶液中的芥花籽蛋白质主要由2S蛋白质构成，然后可以从提取溶液以相对纯的形式获得2S蛋白质。
尽管不希望受到任何理论的束缚，但是认为在升高的提取温度优先于7S和/或12S蛋白质而选择性提取2S芥花籽蛋白质的能力是由于芥花籽油种子粉中的7S和12S蛋白质在提取步骤过程中的降解和沉淀。
因此，在本发明的一个方面中，提供了生产主要由2S芥花籽蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物的方法，其包括：用盐水溶液在升高的温度提取芥花籽油种子粉，优先于7S和12S蛋白质从芥花籽油种子粉中优先提取2S蛋白质并获得主要含有2S蛋白质的芥花籽油蛋白质提取溶液，从残余的芥花籽油种子粉中分离出芥花籽蛋白质提取溶液，并从芥花籽蛋白质提取溶液中回收具有至少约90wt％(N×6.25)蛋白质含量并主要由2S芥花籽蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物。
进一步令人惊讶地发现，根据本发明的再一方面，如果以两个阶段来实现芥花籽油种子粉提取，使用水实现第一个提取和使用盐水溶液实现第二个提取，从第一个提取步骤获得主要是7S蛋白质的含水芥花籽蛋白质溶液，从第二个提取步骤获得主要是2S蛋白质的含水芥花籽蛋白质提取溶液。
最初用水的芥花籽油种子粉的提取步骤溶解了显著部分的7S和12S蛋白质，较少部分的2S蛋白质和大部分的可溶性杂质。用盐水溶液的第二个提取，形成含有大部分2S蛋白质，少量7S和12S蛋白质以及低浓度可溶性杂质的芥花籽蛋白质水溶液。
根据上述U.S.专利申请No.11/038,086中所述的方法，将盐水芥花籽蛋白质提取物浓缩，渗滤(diafilter)来降低盐含量，然后热处理来沉淀剩余的7S和12S蛋白质。
根据本发明的再一方面，提供了制备主要由2S芥花籽蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物的方法，其包括：用水提取芥花籽油种子粉，优先于2S蛋白质来优先提取7S和12S芥花籽蛋白质和可溶性杂质，形成第一个芥花籽蛋白质提取溶液，将第一个芥花籽蛋白质提取溶液与残余的油种子粉分离，用盐水溶液提取残余的油种子粉来溶解残余油种子粉的2S，7S和12S蛋白质，形成第二个芥花籽蛋白质提取溶液，并从第二个芥花籽蛋白质提取溶液回收具有至少约90wt％(N×6.25)蛋白质含量并主要由2S蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物。
进一步令人惊讶地发现，根据本发明的另一个方面，可以根据上述U.S.专利申请No.11/038,586的方法将上述U.S.专利申请No.10/137,391中所述的浓缩步骤获得的浓缩芥花籽蛋白质溶液热处理来沉淀其中所含的大部分7S和12S蛋白质，留下基本上由2S蛋白质构成的浓缩芥花籽蛋白质水溶液。
根据本发明的再一方面，提供了生产主要由2S芥花籽蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物的方法，其包括：用盐水溶液提取芥花籽油种子粉，以从芥花籽油种子粉中提取芥花籽蛋白质和获得芥花籽蛋白质溶液，将芥花籽蛋白质溶液与残余的油种子粉分离，浓缩所述的芥花籽蛋白质溶液，作为滞留物来提供浓缩的蛋白质溶液，热处理浓缩的蛋白质溶液，以优先于2S芥花籽蛋白质从浓缩的芥花籽蛋白质溶液选择性地沉淀7S和12S芥花籽蛋白质，形成主要含有2S芥花籽蛋白质的热处理过的芥花籽蛋白质溶液，将热处理过的芥花籽蛋白质溶液与沉淀的蛋白质分离，并从分离的热处理过的芥花籽蛋白质溶液回收具有至少约90wt％(N×6.25)蛋白质含量和主要由2S芥花籽蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物。
进一步令人惊讶地发现，根据本发明进一步的方面，可以根据上述U.S.专利申请No.11/038,586的方法将按照上述U.S.专利申请No.10/137,391的方法通过芥花籽油种子粉的盐提取获得的芥花籽蛋白质水溶液热处理，来沉淀其中所含的大部分7S和12S蛋白质，留下基本上由2S蛋白质构成的芥花籽蛋白质水溶液。
根据本发明的再一方面，提供了生产主要由2S芥花籽蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物的方法，其包括：用盐水溶液提取芥花籽油种子粉，以从芥花籽油种子粉中提取芥花籽蛋白质和获得芥花籽蛋白质溶液，将芥花籽蛋白质溶液与残余的油种子粉分离，热处理浓缩的蛋白质溶液，优先于2S芥花籽蛋白质从芥花籽蛋白质溶液选择性地沉淀7S和12S芥花籽蛋白质，形成主要含有2S芥花籽蛋白质的热处理过的芥花籽蛋白质溶液，将热处理过的芥花籽蛋白质溶液与沉淀的蛋白质分离，并从分离的热处理过的芥花籽蛋白质溶液回收具有至少约90wt％(N×6.25)蛋白质含量和主要由2S芥花籽蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物。
本发明的方法能够获得主要由2S芥花籽蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物，不需要使用PMM沉淀分级步骤，因此很大程度上简化了程序并且能够更经济地获得主要为2S蛋白质的芥花籽蛋白质分离物。
根据在此的方法产生的芥花籽蛋白质分离物可以用于蛋白质分离物的适宜应用中，如加工食品的蛋白质强化，油的乳化，焙烤商品中的成形剂(body former)和截留气体的产品中的发泡剂。此外，芥花籽蛋白质分离物可以形成蛋白质纤维，用于肉类似物中，可以用作蛋清替代物或将蛋清用作粘合剂的食品中的增量剂(extender)。芥花籽蛋白质分离物可以用作营养补充剂。芥花籽蛋白质分离物的其他用途是在蛋白质强化饮料，宠物食品，动物饲料以及工业和化妆品应用和个人护理产品中。
发明总述
如上所述，本发明提供了生产主要由2S蛋白质构成的基本上无7S和12S蛋白质的芥花籽蛋白质溶液的方法的四个方面。
(a)利用高温提取芥花籽油种子粉的方面
根据本发明的这个方面，提供芥花籽蛋白质分离物方法的最初步骤包括从芥花籽油种子粉溶解蛋白质材料。从芥花籽种子粉回收的蛋白质材料可以是芥花籽种子中天然产生的蛋白质或者蛋白质材料可以是通过基因操作修饰但具有天然蛋白质特征性疏水和极性特征的蛋白质。芥花籽粉可以是从含有不同水平的非变性蛋白质的芥花籽油种子除去芥花籽油得到的任何芥花籽粉，例如，从热己烷提取或冷油压榨方法获得。通常作为与在此所述的蛋白质分离物回收步骤分开的操作来实现从芥花籽油种子除去芥花籽油。
在本发明的一个方面中，使用食品级盐溶液来最有效地实现蛋白质溶解，因为盐的存在提高了从油种子粉中除去可溶性蛋白质。在打算将芥花籽蛋白质分离物用于非食品用途的情况中，可以使用非食品级的化学物质。盐通常是氯化钠，尽管可以使用其他盐，如氯化钾。盐溶液具有至少约0.05的离子强度，优选至少约0.10，至多约0.2，以能够溶解待实现的显著含量的蛋白质。随着盐溶液的离子强度的提高，油种子粉中蛋白质的溶解程度开始提高，直至获得最大值。任何随后的离子强度的提高并不提高溶解的总蛋白质。引起最大蛋白质溶解的食品级盐溶液的离子强度根据所涉及的盐和选择的芥花籽油种子粉而改变。
在本发明的这个方面中，在升高的温度实现芥花籽油种子粉的提取，通常在约70°至约100℃的温度，优选约80°至约95℃，来引起2S芥花籽蛋白质从油种子粉优先提取至蛋白质提取溶液中，优先于7S和12S蛋白质。
食品级盐水溶液通常具有约5至约6.8的pH，优选约5.3至约6.2。可以按照需要，使用任何适宜的酸，通常是盐酸，或碱，通常是氢氧化钠，将盐溶液的pH调节至约5至约6.8范围内的任何所需值，用于提取步骤中。
溶解步骤过程中食品级盐溶液中芥花籽油种子粉的浓度可以在很宽的范围内变化。通常的浓度值为约5％至约15％w/v。
从提取步骤获得的蛋白质溶液通常具有约1至约40g/L的蛋白质浓度，优选约10至约20g/L。
蛋白质溶液通常具有如下的芥花籽蛋白质分布：
约80至约100wt％2S蛋白质，
0至约10wt％7S蛋白质，和
0至约10wt％12S蛋白质；
优选约85至约100wt％2S蛋白质，
0至约15wt％7S蛋白质，和
0至约5wt％12S蛋白质。
盐水溶液可以含有抗氧化剂。抗氧化剂可以是任何适宜抗氧化剂，如亚硫酸钠或抗坏血酸。所用的抗氧化剂量可以为溶液的约0.01至约1wt％，优选约0.05wt％。抗氧化剂用来抑制蛋白质溶液中酚的氧化。
然后可以以任何适宜的方式从残余的芥花籽粉分离提取步骤获得的水相，如通过使用沉降式离心机，接着碟式离心和/或过滤来除去残余的粉。可以将分离的残余粉干燥，用于处置。
可以依据浅色和不那么强的黄色来改善最终芥花籽蛋白质分离物的颜色，通过将粉末状活性碳或其他色素吸附剂与分离的蛋白质水溶液混合，并随后除去吸附剂，适宜地通过过滤，来提供蛋白质溶液。渗滤也可以用来除去色素。
可以在任何适宜条件下进行这样的除色步骤，通常在分离蛋白质水溶液的环境温度下，使用任何合适的色素吸附剂。对于粉末状的活性碳，使用约0.025％至约5％w/v的量，优选约0.05％至约2％w/v。
在芥花籽种子粉含有显著含量脂肪的情况中，如US专利No.5,844,086和6,005,076(其转让于本受让人并将其公开内容在此引入作为参考)中所述，然后可以对分离的蛋白质水溶液和如下讨论的浓缩的蛋白质水溶液进行其中所述的脱脂步骤。当进行改善颜色的步骤时，可以在第一个脱脂步骤后进行该步骤。
处理蛋白质提取水溶液以从其回收芥花籽蛋白质分离物。其中产生的芥花籽蛋白质分离物具有至少约90wt％的蛋白质含量(N×6.25)，优选至少约100wt％，且主要由2S蛋白质构成。
在这样的处理中，可以将蛋白质提取溶液浓缩来提高其蛋白质浓度。可以使用任何适宜的选择性膜技术，如超滤，来进行这样的浓缩，使用具有合适截留分子量的膜，允许低分子量物质，包括盐以及从蛋白质源材料提取出来的其他非蛋白质低分子量材料通过膜，而将芥花籽蛋白质保留在溶液中。鉴于不同的膜材料和构型，可以使用具有约3,000至100,000道尔顿截留分子量的超滤膜，优选约5,000至约10,000道尔顿。以这种方式浓缩蛋白质提取溶液还可以降低回收蛋白质需要干燥的液体体积。通常将蛋白质提取溶液浓缩至至少约50g/L的蛋白质浓度，优选约100至约400g/L，更优选约200至约300g/L。可以以间歇式处理模式或以连续操作来进行这样的浓缩操作。
如所公知的，超滤和相似的选择性膜技术允许低分子量物质通过而阻止较高分子量的物质通过。低分子量物质不仅包括食品级盐的离子物质，而且包括从源材料提取出来的低分子量材料，如碳水化合物，色素和抗营养因子。鉴于不同的膜材料和构型，通常选择膜的截留分子量来确保相当大部分的蛋白质保留在溶液中，而允许杂质通过。
然后可以将浓缩的蛋白质提取溶液进行使用水的渗滤步骤。可以使用约2至约20体积渗滤溶液，优选约5至约10体积渗滤溶液，来进行这样的渗滤。在渗滤操作中，可以通过渗透物穿过膜，从蛋白质提取水溶液中除去更多含量的杂质。可以进行渗滤操作直至没有更多显著量的酚和可见的颜色存在于渗透物中。可以使用用于浓缩步骤的相同膜来进行这样的渗滤。然而，如果需要，鉴于不同的膜材料和构型，可以使用分开的膜来进行渗滤，如具有约3,000至约100,000道尔顿范围内截留分子量的膜，优选约5,000至约10,000道尔顿。
在渗滤步骤的至少部分过程中，渗滤介质中可以存在抗氧化剂。抗氧化剂可以是任何适宜的抗氧化剂，如亚硫酸钠或抗坏血酸。渗滤介质中所用的抗氧化剂量取决于所用的材料并可以为约0.01至约1wt％，优选约0.05wt％。抗氧化剂用来抑制浓缩的蛋白质提取溶液中存在的酚类的氧化。
可以在任何适宜的温度进行浓缩步骤和渗滤步骤，通常约20°至约60℃，优选约20至约30℃，并持续实现所需浓缩程度的时间段。所用的温度和其他条件一定程度上取决于用于实现浓缩的膜设备和所需的溶液蛋白质浓度。
如果需要，可以将浓缩并任选渗滤的蛋白质溶液进行进一步的脱脂操作，如US专利No.5,844,086和6,005,076中所述的。
可以将浓缩并任选渗滤的蛋白质溶液进行作为上述除色操作的可替换方案的除色操作。在此可以使用粉末状的活性碳以及颗粒状的活性碳(GAC)。可以用作颜色吸附剂的另一种材料是聚乙烯吡咯烷酮。
可以在任何适宜条件下进行颜色吸附剂处理步骤，通常在芥花籽蛋白质溶液的环境温度。对于粉末状的活性碳，可以使用约0.025％至约5％w/v的量，优选约0.05％至约2％w/v。在使用聚乙烯吡咯烷酮作为颜色吸附剂的情况下，可以使用约0.5％至约5％w/v，优选约2％至约3％w/v。可以通过任何适宜方法，如通过过滤，从芥花籽蛋白质溶液中除去颜色吸附剂。
如果需要，可以将浓缩并任选渗滤的蛋白质水溶液进行热处理步骤来降低溶液中存在的7S和12S蛋白质含量。可以使用足以降低溶液中存在的7S和12S比例的温度和时间分布来进行这样的热处理，优选将7S和12S蛋白质的比例降低显著的程度。通常，通过热处理将溶液中7S和12S蛋白质含量降低至少约50wt％，优选至少约75wt％。通常，可以在约70°至约100℃的温度进行热处理，优选约75至约95℃，持续约2至约30分钟，优选约5至约15分钟。可以以任何适宜方式，如通过离心或过滤，除去并回收沉淀的7S和12S蛋白质。
可以通过任何适宜技术，如喷雾干燥或冷冻干燥，将浓缩并任选渗滤和任选热处理的蛋白质水溶液干燥至干的形式来提供干燥的芥花籽蛋白质分离物，其主要由2S芥花籽蛋白质构成并具有至少约90wt％蛋白质含量(N×6.25)，优选至少100wt％。
(b)利用多次提取芥花籽油种子粉的方面
提供芥花籽蛋白质分离物方法的最初步骤包括从芥花籽油种子粉溶解蛋白质材料。从芥花籽种子粉回收的蛋白质材料可以是芥花籽种子中天然产生的蛋白质或者蛋白质材料可以是通过基因操作修饰但具有天然蛋白质特征性疏水和极性特征的蛋白质。芥花籽粉可以是从含有不同水平的非变性蛋白质的芥花籽油种子除去芥花籽油得到的任何芥花籽粉，例如，从热己烷提取或冷油压榨方法获得。通常作为与在此所述的蛋白质分离物回收步骤分开的操作来实现从芥花籽油种子除去芥花籽油。
以多个步骤来进行本发明这方面中的蛋白质溶解。在第一个步骤中，使用水作为提取介质，其优先从芥花籽油种子粉提取7S和12S芥花籽蛋白质并优先于2S芥花籽蛋白质和大小相当比例的可溶性杂质。可以作为芥花籽油种子粉的单次水提取或芥花籽油种子粉的多次水提取来进行水提取步骤，如约2至约25次提取，优选约2至约4次提取。
可以以任何所需的方式来处理7S和12S蛋白质的水溶液来回收7S和12S蛋白质作为芥花籽蛋白质分离物。例如，加入盐水后，可以将蛋白质水溶液进行浓缩和胶束形成步骤，如上述U.S.专利申请no.10/137,391中所述的。
在约10°至约70℃的温度进行使用水提取芥花籽油种子粉，优选约55℃至约65℃。溶解步骤过程中水中芥花籽油种子粉的浓度可以广泛改变。通常的浓度值为约5至约15％w/v。
从水提取步骤获得的蛋白质溶液通常具有约10至约40g/L的蛋白质浓度，优选约10至约25g/L。
在溶解的第二个步骤中，用盐水溶液提取来自水提取的残余芥花籽油种子粉，获得芥花籽蛋白质提取水溶液，其含有大部分2S芥花籽蛋白质，少量的7S和12S芥花籽蛋白质以及低含量的杂质。盐通常是氯化钠，尽管可以使用其他盐，如氯化钠。通常使用食品级盐溶液，但在打算将芥花籽蛋白质分离物用于非食品用途的情况中，可以使用非食品级化学物质。
溶解的第二个步骤中使用的盐水溶液通常具有至少约0.05的离子强度，优选至少约0.1，通常至多约0.5。
食品级盐水溶液通常具有约5至约6.8的pH，优选约5.3至约6.2，可以按照需要，使用任何适宜的酸，通常是盐酸，或碱，通常是氢氧化钠，将盐溶液的pH调节至约5至约6.8范围内的任何所需值，用于提取步骤中。
用食品级盐溶液提取上述芥花籽油种子粉通常在约5℃至约65℃的温度进行，优选约20℃至约30℃。溶解步骤过程中食品级盐溶液中芥花籽油种子粉的浓度可以广泛改变，通常约5至约15％w/v。
从盐水提取步骤获得的蛋白质溶液通常具有约1至约40g/L的蛋白质浓度，优选约5至约20g/L。
从油种子粉的盐水溶解得到的蛋白质水溶液通常具有如下的芥花籽蛋白质分布：
约80至约100wt％2S蛋白，
0至约10wt％7S蛋白，和
0至约10wt％12S蛋白；
优选约85至约100wt％2S蛋白，
0至约15wt％7S蛋白，和
0至约5wt％12S蛋白。
盐水溶液中可以含有抗氧化剂。抗氧化剂可以是任何适宜的抗氧化剂，如亚硫酸钠或抗坏血酸。所用的抗氧化剂量可以为溶液的约0.01至约1wt％，优选约0.05wt％。抗氧化剂用来抑制蛋白质溶液中酚类的氧化。
然后可以以任何适宜的方式从残余的芥花籽粉分离提取步骤获得的水相，如通过使用沉降式离心机，接着碟式离心和/或过滤来除去残余的粉。可以将分离的残余的粉干燥，用于处置。
可以依据浅色和不那么强烈的黄色来改善最终芥花籽蛋白质分离物的颜色，通过将粉末状活性碳或其他色素吸附剂与分离的蛋白质水溶液混合，并随后除去吸附剂，通常通过过滤，来提供蛋白质溶液。渗滤也可以用来除去色素。
可以在任何适宜条件下进行这样的除色步骤，通常在分离蛋白质水溶液的环境温度下，使用任何合适的色素吸附剂。对于粉末状的活性碳，使用约0.025％至约5％w/v的量，优选约0.05％至约2％w/v。
可以处理芥花籽蛋白质水溶液来回收具有至少约90wt％(N×6.25)蛋白质浓度，优选至少约100wt％，并主要由2S蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物。
在这样的处理中，可以将蛋白质提取溶液浓缩来提高其蛋白质浓度。可以使用任何适宜的选择性膜技术，如超滤，来进行这样的浓缩，使用具有合适截留分子量的膜，允许低分子量物质，包括盐以及从蛋白质源材料提取出来的其他非蛋白质低分子量材料通过膜，而将芥花籽蛋白质保留在溶液中。鉴于不同的膜材料和构型，可以使用具有约3,000至100,000道尔顿截留分子量的超滤膜，优选约5,000至约10,000道尔顿。以这种方式浓缩蛋白质提取溶液还可以降低回收蛋白质需要干燥的液体体积。通常将蛋白质提取溶液浓缩至至少约50g/L的蛋白质浓度，优选约100至约400g/L，更优选约200至约300g/L。可以以间歇式处理模式或以连续操作来进行这样的浓缩操作。
然后可以将浓缩的蛋白质提取溶液进行使用水的渗滤步骤。可以使用约2至约20体积渗滤溶液，优选约5至约10体积渗滤溶液，来进行这样的渗滤。在渗滤操作中，可以通过渗透物穿过膜，从蛋白质提取水溶液中除去更多含量的杂质。可以进行渗滤操作直至没有更多显著量的酚和可见的颜色存在于渗透物中。可以使用用于浓缩步骤的相同膜来进行这样的渗滤。然而，如果需要，鉴于不同的膜材料和构型，可以使用分开的膜来进行渗滤，如具有约3,000至约100,000道尔顿范围内截留分子量的膜，优选约5,000至约10,000道尔顿。
在渗滤步骤的至少部分过程中，渗滤介质中可以存在抗氧化剂。抗氧化剂可以是任何适宜的抗氧化剂，如亚硫酸钠或抗坏血酸。渗滤介质中所用的抗氧化剂量取决于所用的材料并可以为约0.01至约1wt％，优选约0.05wt％。抗氧化剂用来抑制浓缩的蛋白质提取溶液中存在的酚类的氧化。
可以在任何适宜的温度进行浓缩步骤和渗滤步骤，通常约20°至约60℃，优选约20至约30℃，并持续实现所需浓缩程度的时间段。所用的温度和其他条件一定程度上取决于用于实现浓缩的膜设备和所需的溶液蛋白质浓度。
如果需要，可以将浓缩并任选渗滤的蛋白质溶液进行进一步的脱脂操作，如US专利No.5,844,086和6,005,076中所述的。
如果需要，可以将浓缩并任选渗滤的蛋白质水溶液进行热处理步骤来降低溶液中存在的7S和12S蛋白质含量。可以使用足以降低溶液中存在的7S和12S比例的温度和时间分布来进行这样的热处理，优选将7S蛋白质的比例降低显著的程度。通常，通过热处理将溶液中7S蛋白质含量降低至少约50wt％，优选至少约75wt％。通常，可以在约70°至约100℃的温度进行热处理，优选约75至约95℃，持续约2至约30分钟，优选约5至约15分钟。可以以任何适宜方式，如通过离心或过滤，除去并回收沉淀的7S和12S蛋白质。
可以通过任何适宜技术，如喷雾干燥或冷冻干燥，将浓缩并任选渗滤和任选热处理的蛋白质水溶液干燥至干的形式来提供干燥的芥花籽蛋白质分离物，其主要由2S芥花籽蛋白质构成并具有至少约90wt％蛋白质含量，优选至少约100wt％。
(c)利用超滤滞留物热处理的方面
提供芥花籽蛋白质分离物方法的最初步骤包括从芥花籽油种子粉溶解蛋白质材料。从芥花籽种子粉回收的蛋白质材料可以是芥花籽种子中天然产生的蛋白质或者蛋白质材料可以是通过基因操作修饰但具有天然蛋白质特征性疏水和极性特征的蛋白质。芥花籽粉可以是从含有不同水平的非变性蛋白质的芥花籽油种子除去芥花籽油得到的任何芥花籽粉，例如，从热己烷提取或冷油压榨方法获得。通常作为与在此所述的蛋白质分离物回收步骤分开的操作来实现从芥花籽油种子除去芥花籽油。
使用食品级盐溶液能最有效地实现蛋白质溶解，因为盐的存在提高了从油种子粉中除去可溶性蛋白质。在打算将芥花籽蛋白质分离物用于非食品用途的情况中，可以使用非食品级的化学物质。盐通常是氯化钠，尽管可以使用其他盐，如氯化钾。盐溶液具有至少约0.05的离子强度，优选至少约0.10，至多约0.2，以能够溶解待实现的显著含量的蛋白质。随着盐溶液的离子强度提高，油种子粉中蛋白质的溶解程度开始提高，直至获得最大值。任何随后的离子强度的提高并不提高溶解的总蛋白质。引起最大蛋白质溶解的食品级盐溶液的离子强度根据所涉及的盐和选择的油种子粉而改变。
在间歇式生产中，在至少约5℃并优选至多约35℃的温度进行蛋白质的盐溶解，优选伴有搅拌以降低溶解时间，通常为约10至约60分钟。优选进行溶解来充分地从油种子粉中提取尽可能多的蛋白质，以便提供全面的高产量。
选择约5℃的温度下限，是因为低于该温度，溶解将不切实际地慢，而选择约35℃的优选温度上限，是因为在间歇式处理方式中在更高的温度水平，工艺将变得不经济。
在连续生产中，以任何从芥花籽油种子粉进行连续提取蛋白质相适应的方式进行从芥花籽油种子粉提取蛋白质。在一个实施方案中，将芥花籽油种子粉与盐溶液连续混合，并将混合物通过管道或导管传送，根据在此所述的参数，管道或导管的长度和流速使得能持续足以进行所需提取的停留时间。在这样的连续方法中，在至多约10分钟的时间内，快速进行盐溶解步骤，优选进行溶解以从芥花籽油种子粉充分地提取尽可能多的蛋白质。连续方法中的溶解优选在升高的温度进行，优选高于约35℃，通常至多约65℃。
盐水溶液和芥花籽油种子粉具有约5至约6.8的天然pH，优选约5.3至约6.2的pH值。
可以按照需要，使用任何适宜的酸，通常是盐酸，或碱，通常是氢氧化钠，将盐溶液的pH调节至约5至约6.8范围内的任何所需值，用于提取步骤中。在打算将芥花籽蛋白质分离物用于非食品用途的情况中，那么可以使用非食品级化学物质。
溶解步骤过程中盐溶液中油种子粉的浓度可以广泛改变。通常的浓度值为约5至约15％w/v。
使用盐水溶液的蛋白质提取步骤具有溶解芥花籽粉中可以存在的脂肪的附加作用，然后其使得脂肪存在于水相中。
从提取步骤获得的蛋白质溶液通常具有约5至约40g/L的蛋白质浓度，优选约10至约30g/L。
然后可以以任何适宜的方式从残余的芥花籽粉分离提取步骤获得的水相，如通过使用沉降式离心，接着碟式离心和/或过滤来除去残余的粉。可以将分离的残余的粉干燥，用于处置。
可以依据浅色和不那么强烈的黄色来改善最终芥花籽蛋白质分离物的颜色，通过将粉末状活性碳或其他色素吸附剂与分离的蛋白质水溶液混合，并随后除去吸附剂，通常通过过滤，来提供蛋白质溶液。如下所述，在浓缩之前或之后，分离的蛋白质水溶液的渗滤也可以用来除去色素。
可以在任何适宜条件下进行这样的除色步骤，通常在分离蛋白质水溶液的环境温度下，使用任何合适的色素吸附剂。对于粉末状的活性碳，使用约0.025％至约5％w/v的量，优选约0.05％至约2％w/v。
在芥花籽种子粉含有显著含量脂肪的情况中，如US专利No.5,844,086和6,005,076(其转让于本受让人并将其公开内容在此引入作为参考)中所述，然后可以对分离的蛋白质水溶液和如下讨论的浓缩的蛋白质水溶液进行其中所述的脱脂步骤。当进行改善颜色的步骤时，可以在第一个脱脂步骤后进行该步骤。
作为用盐水溶液提取油种子粉的可替换方案，可以单独使用水进行这样的提取，尽管单独使用水趋于从油种子粉中提取出比盐水溶液少的蛋白质。在使用这样的可替换方案的情况中，在上述的浓缩中，那么可以在与残余的油种子粉分离后将盐加入蛋白质溶液中，以便在以下所述浓缩步骤过程中将蛋白质维持于溶液中。当进行除色和/或第一个脱脂步骤时，通常在完成这样的操作后加入盐。
将蛋白质提取溶液浓缩来提高其蛋白质浓度。可以使用任何适宜的选择性膜技术，如超滤，来进行这样的浓缩，使用具有合适截留分子量的膜，允许低分子量物质，包括盐以及从蛋白质源材料提取出来的其他非蛋白质低分子量材料通过膜，而将芥花籽蛋白质保留在溶液中。鉴于不同的膜材料和构型，可以使用具有约3,000至100,000道尔顿截留分子量的超滤膜，优选约5,000至约10,000道尔顿。以这种方式浓缩蛋白质提取溶液还可以降低回收蛋白质需要干燥的液体体积。通常将蛋白质提取溶液浓缩至至少约50g/L的蛋白质浓度，优选约100至约400g/L，更优选约200至约300g/L。可以以间歇式处理模式或以连续操作来进行这样的浓缩操作。
然后可以将浓缩的蛋白质提取溶液进行使用水的渗滤步骤。可以使用约2至约20体积渗滤溶液，优选约5至约10体积渗滤溶液，来进行这样的渗滤。在渗滤操作中，可以通过渗透物穿过膜，从蛋白质提取水溶液中除去更多含量的杂质。可以进行渗滤操作直至没有更多显著量的酚和可见的颜色存在于渗透物中。可以使用用于浓缩步骤的相同膜来进行这样的渗滤。然而，如果需要，鉴于不同的膜材料和构型，可以使用分开的膜来进行渗滤，如具有约3,000至约100,000道尔顿范围内截留分子量的膜，优选约5,000至约10,000道尔顿。
在渗滤步骤的至少部分过程中，渗滤介质中可以存在抗氧化剂。抗氧化剂可以是任何适宜的抗氧化剂，如亚硫酸钠或抗坏血酸。渗滤介质中所用的抗氧化剂量取决于所用的材料并可以为约0.01至约1wt％，优选约0.05wt％。抗氧化剂用来抑制浓缩的蛋白质提取溶液中存在的酚类的氧化。
可以在任何适宜的温度进行浓缩步骤和渗滤步骤，通常约20°至约60℃，优选约20至约30℃，并持续实现所需浓缩程度的时间段。所用的温度和其他条件一定程度上取决于用于实现浓缩的膜设备和所需的溶液蛋白质浓度。
如果需要，可以将浓缩并任选渗滤的蛋白质溶液进行进一步的脱脂操作，如US专利No.5,844,086和6,005,076中所述的。
在本发明的这个方面中，可以将超滤和任选渗滤的芥花籽蛋白质溶液进行热处理来沉淀其中的7S和12S蛋白质并留下主要由2S蛋白质构成的芥花籽蛋白质溶液。可以在上述U.S.专利申请No.11/038,086中所述条件下进行这样的热处理。
可以使用足以降低浓缩溶液中存在的7S和12S比例的温度和时间分布来进行这样的热处理，优选将7S和12S蛋白质的比例降低显著的程度。通常，通过热处理将溶液中7S和12S蛋白质含量降低至少约50wt％，优选至少约75wt％。通常，可以在约70°至约100℃的温度进行热处理，优选约75至约95℃，持续约2至约30分钟，优选约5至约15分钟。可以以任何适宜方式，如通过离心或过滤，除去并回收沉淀的7S和12S蛋白质。
然后可以处理所得到的芥花籽蛋白质溶液来回收主要是2S的芥花籽蛋白质分离物。
在除去(如通过离心)沉淀的7S和12S蛋白质后，可以通过任何适宜技术，如喷雾干燥或冷冻干燥，将浓缩的热处理过的上清液干燥至干的形式，来提供主要由2S芥花籽蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物。这样的芥花籽蛋白质分离物具有高蛋白质含量，超过约90wt％，优选至少约100wt％蛋白质(按照凯氏N×6.25计算的)并且基本上是未变性的(如通过差示扫描量热法测定的)。
(d)利用芥花籽蛋白质水溶液热处理的方面
提供芥花籽蛋白质分离物方法的最初步骤包括从芥花籽油种子粉溶解蛋白质材料。从芥花籽种子粉回收的蛋白质材料可以是芥花籽种子中天然产生的蛋白质或者蛋白质材料可以是通过基因操作修饰但具有天然蛋白质特征性疏水和极性特征的蛋白质。芥花籽粉可以是从含有不同水平的非变性蛋白质的芥花籽油种子除去芥花籽油得到的任何芥花籽粉，例如，从热己烷提取或冷油压榨方法获得。通常作为与在此所述的蛋白质分离物回收步骤分开的操作来实现从芥花籽油种子除去芥花籽油。
使用食品级盐溶液能最有效地实现蛋白质溶解，因为盐的存在提高了从油种子粉中除去可溶性蛋白质。在打算将芥花籽蛋白质分离物用于非食品用途的情况中，可以使用非食品级的化学物质。盐通常是氯化钠，尽管可以使用其他盐，如氯化钾。盐溶液具有至少约0.05的离子强度，优选至少约0.10，至多约0.2，以能够溶解待实现的显著含量的蛋白质。随着盐溶液的离子强度提高，油种子粉中蛋白质的溶解程度开始提高，直至获得最大值。任何随后的离子强度的提高并不提高溶解的总蛋白质。引起最大蛋白质溶解的食品级盐溶液的离子强度根据所涉及的盐和选择的油种子粉而改变。
在间歇式生产中，在至少约5℃并优选至多约35℃的温度进行蛋白质的盐溶解，优选伴有搅拌来降低溶解时间，通常为约10至约60分钟。优选进行溶解来充分地从油种子粉中提取尽可能多的蛋白质，以便提供全面的高产量。
选择约5℃的温度下限，是因为低于该温度，溶解将不切实际地慢，而选择约35℃的优选温度上限，是因为在间歇式处理方式中在更高的温度水平，处理将变得不经济。
在连续生产中，以任何从芥花籽油种子粉进行连续提取蛋白质相适应的方式进行从芥花籽油种子粉提取蛋白质。在一个实施方案中，将芥花籽油种子粉与盐溶液连续混合，并将混合物通过管道或导管传送，根据在此所述的参数，管道或导管的长度和流速使得能持续足以进行所需提取的停留时间。在这样的连续方法中，在至多约10分钟的时间内，快速进行盐溶解步骤，优选进行溶解以从芥花籽油种子粉充分地提取尽可能多的蛋白质。连续方法中的溶解优选在升高的温度进行，优选高于约35℃，通常至多约65℃。
盐水溶液和芥花籽油种子粉具有约5至约6.8的天然pH，优选约5.3至约6.2的pH值。
可以按照需要，使用任何适宜的酸，通常是盐酸，或碱，通常是氢氧化钠，将盐溶液的pH调节至约5至约6.8范围内的任何所需值，用于提取步骤中。在打算将芥花籽蛋白质分离物用于非食品用途的情况中，那么可以使用非食品级化学物质。
溶解步骤过程中盐溶液中油种子粉的浓度可以广泛改变。通常的浓度值为约5至约15％w/v。
使用盐水溶液的蛋白质提取步骤具有溶解芥花籽粉中可能存在的脂肪的附加作用，然后其使得脂肪存在于水相中。
从提取步骤获得的蛋白质溶液通常具有约5至约40g/L的蛋白质浓度，优选约10至约30g/L。
然后可以以任何适宜的方式从残余的芥花籽粉分离提取步骤获得的水相，如通过使用沉降式离心，接着碟式离心和/或过滤来除去残余的粉。可以将分离的残余的粉干燥，用于处置。
可以依据浅色和不那么强烈的黄色来改善最终芥花籽蛋白质分离物的颜色，通过将粉末状活性碳或其他色素吸附剂与分离的蛋白质水溶液混合，并随后除去吸附剂，通常通过过滤，来提供蛋白质溶液。如下所述，在浓缩之前或之后，分离的蛋白质水溶液的渗滤也可以用来除去色素。
可以在任何适宜条件下进行这样的除色步骤，通常在分离蛋白质水溶液的环境温度下，使用任何合适的色素吸附剂。对于粉末状的活性碳，使用约0.025％至约5％w/v的量，优选约0.05％至约2％w/v。
在芥花籽种子粉含有显著含量脂肪的情况中，如US专利No.5,844,086和6,005,076(其转让于本受让人并将其公开内容在此引入作为参考)中所述，然后可以对分离的蛋白质水溶液和如下讨论的浓缩的蛋白质水溶液进行其中所述的脱脂步骤。当进行改善颜色的步骤时，可以在第一个脱脂步骤后进行该步骤。
作为用盐水溶液提取油种子粉的可替换方案，可以单独使用水进行这样的提取，尽管单独使用水趋于从油种子粉中提取出比盐水溶液少的蛋白质。在使用这样的可替换方案的情况中，在上述的浓缩中，那么可以在与残余的油种子粉分离后将盐加入蛋白质溶液中，以便在以下所述浓缩步骤过程中将蛋白质维持于溶液中。当进行除色和/或第一个脱脂步骤时，通常在完成这样的操作后加入盐。
根据本发明的这个方面，将芥花籽蛋白质水溶液热处理来沉淀其中的7S和12S蛋白质并留下其中芥花籽蛋白质主要由2S蛋白质构成的芥花籽蛋白质溶液。可以在上述U.S.专利申请No.11/038,086中所述条件下进行这样的热处理。
可以使用足以降低浓缩溶液中存在的7S和12S比例的温度和时间分布来进行这样的热处理，优选将7S和12S蛋白质的比例降低显著的程度。通常，通过热处理将溶液中7S和12S蛋白质含量降低至少约50wt％，优选至少约75wt％。通常，可以在约70°至约100℃的温度进行热处理，优选约75至约95℃，持续约2至约30分钟，优选约5至约15分钟。可以以任何适宜方式，如通过离心或过滤，除去并回收沉淀的7S和12S蛋白质。
在除去(如通过离心)沉淀的7S和12S蛋白质后，可以通过任何适宜技术，如喷雾干燥或冷冻干燥，将热处理过的芥花籽蛋白质溶液干燥至干的形式，来提供主要由2S芥花籽蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物。
或者，可以将热处理过的芥花籽蛋白质溶液在干燥之前进行以上关于方面(a)所述的浓缩，渗滤和脱色步骤。
芥花籽蛋白质分离物具有高蛋白质含量，超过约90wt％，优选至少约100wt％蛋白质(按照凯氏N×6.25计算的)并且基本上是未变性的(如通过差示扫描量热法测定的)。
在此提供的芥花籽蛋白质分离物含有高比例的2S蛋白质，优选分离物中芥花籽蛋白质的至少约90wt％，更优选至少约95wt％，并且基本上无7S和12S蛋白质。
实施例
实施例1：
该实施例说明了从芥花籽油种子粉提取蛋白质的升高的温度对提取溶液中芥花籽蛋白质分布的影响。
将15g真空除溶剂的芥花籽油种子粉样品(37.15％蛋白质)各自加入85℃温度的150ml反渗透(R0)水，0.1M NaCl水溶液，0.15M NaCl水溶液，0.2M NaCl水溶液，0.25M NaCl水溶液和0.5M NaCl水溶液样品中。将混合物搅拌5分钟，同时使用搅拌器/加热板来维持温度。
将提取物在10,000rpm离心10分钟，然后通过25μm有凹槽的滤纸进行过滤。将滤液通过0.45μm针筒过滤器进一步过滤。
分析滤过的提取物的蛋白质含量(使用LECO FP528测氮仪)，颜色和蛋白质分布(使用分析HPLC SEC BioSep 2000和S3000柱)。
使用通过0.1M NaCl溶液在环境温度的提取重复实验，作为对照和用于比较目的。获得的结果列于以下的表1和表2中：
表1：85℃的粉提取物与环境温度提取物的比较
  提取   A330   A390   LECO蛋白质(％)   表观可提取性(％)
  85℃RO水提取   89.9   4.34   0.48   12.93
  85℃0.1M NaCl提取   91.1   4.52   1.09   29.35
  85℃0.15M NaCl提取   94.8   4.51   1.11   29.88
  85℃0.2M NaCl提取   114.0   5.15   1.24   33.38
  85℃0.25M NaCl提取   110.7   5.51   1.26   33.92
  85℃0.5M NaCl提取   130.3   13.99   1.46   39.30
  对照环境温度提取0.10M NaCl   96.7   5.25   1.83   49.00
表2：提取物的蛋白质分布
  样品   ％2S   ％7S   ％12S
  85℃RO提取   83.8％   12.5％   3.8％
  85℃0.1M提取   93.9％   3.9％   2.1％
  85℃0.15M提取   98.2％   0.9％   0.9％
  85℃0.2M提取   88.2％   5.5％   6.2％
  85℃0.25M提取   86.9％   7.2％   5.9％
  85℃0.5M提取   64.8％   35.2％   0.0％
  环境温度提取   42.4％   55.9％   1.7％
从表1中呈现的结果可以看出，使用升高的提取温度似乎没有影响在A330(酚类)和A390(颜色)所测定的颜色，表明在升高的温度没有发生另外的酚类氧化。
85℃RO水的表观可提取性显著低于盐水提取，表明提取步骤过程中盐的存在有益地提高了可提取性，即使在升高的温度。
高温盐水提取的表观可提取性平均为约32％，低于在环境温度进行的提取，但是可以从表2看出，在升高的温度提取的大部分蛋白质是2S蛋白质。
实施例2
该实施例列出了一系列使用两个提取程序处理芥花籽油种子粉的试验程序。
进行一系列试验，其中最初用水，随后用盐水溶液提取含水芥花籽油种子粉。在此列出了该系列试验的结果。
(a)试验1
在60℃和10％w/v提取15g芥花籽油种子粉(A批)，将150ml水预热至65℃并加入种子中。通过在10,000g离心10分钟从用过的粉中除去后面的提取物，并且在分离上清液后，测定团粒(pellet)中湿粉(37g)和结合水(22g)的重量。然后加入足量(128ml)0.25M NaCl，使浓度回到10％w/v，并用悬臂式搅拌机将样品在室温220rpm混合30分钟。通过在10,000g离心10分钟从用过的粉中分离盐水提取物。用0.45μm孔径滤器过滤净化水提取物和盐水提取物的样品并分析样品的游离酚类(A330)，可见的颜色(A390)，蛋白质含量(LECO)和蛋白质分布(SEC HPLC)。还在冰箱中存储过夜沉淀7S蛋白后，再次分析了水提取物的蛋白质分布。
尽管蛋白质含量较低，但第二种盐水提取物比最初的水提取物更加澄清并且颜色较浅(表3)。
表3-水和盐水提取物的分析结果
  样品   A330   A390   ％蛋白质   ％HPLC非蛋白质峰面积
  60℃水提取物盐水提取物   133.935.3   5.511.80   1.791.12   80.4771.25
最初的水提取支持溶解7S蛋白质，而第二次盐水提取溶解大部分2S蛋白质(表4)。冷却水提取物过夜导致大部分7S和12S蛋白质沉淀。
表4-各种样品的蛋白质分布
  样品   属于12S的蛋白质峰面积的比例(％)   属于7S的蛋白质峰面积的比例(％)   属于2S的蛋白质峰面积的比例(％)
  60℃水提取物盐水提取物冷却水上清液   2.42.91.5   74.332.342.1   23.365.056.4
(b)试验2
用1500ml水以10％w/v在60℃提取150g芥花籽油种子粉(A批)5分钟，使用悬臂式搅拌机。通过在7100g离心10分钟从用过的粉中分离出水提取物并测定团粒中湿粉(392g)和结合水(242g)的重量。然后加入足量0.2M NaCl(1258ml)，使浓度回到10％w/v，并用悬臂式搅拌机将样品在室温混合30分钟。通过在7100g离心10分钟从用过的粉中分离出盐水提取物，然后通过#3滤板两次来过滤。然后使用两个平行连接的10,000MWCO Vivaflow HY膜(稳定剂纤维素)装置处理澄清的盐水提取物。将提取物浓缩，然后用5体积反渗透(RO)净化水渗滤。渗滤水的加入导致沉淀的产生，在再次浓缩之前通过在7100g离心10分钟来除去。将渗滤截留物在85℃热处理10分钟来沉淀7S和12S蛋白质，其通过在8000g离心15分钟来除去。然后将浓缩物冷冻干燥并命名为“C200H”。
将水提取物在4℃冷却过夜，然后在5℃7100g离心15分钟来收集沉淀。然后将收集的固体冷冻干燥。
分析各种样品的游离酚类(A330)，可见的颜色(A390)，蛋白质含量(LECO)和蛋白质分布(SEC HPLC)。使用Minolta色度计分析终产品的干颜色，并且还制备溶液用于湿颜色分析。使用涡旋搅拌机将蛋白质粉(0.7g)与0.1M NaCl或水(10ml)混合。然后将样品在8000g离心10分钟，并通过LECO测定上清液的蛋白质含量。将等份试样(8ml)的上清液转移至小烧杯中并加入足量的盐水或水，将蛋白质含量调节至5％。
和试验1中一样，第二个盐水提取物比最初的水提取物更加澄清并且颜色较浅(表5)。冷却最初的水提取物导致稍稍超过一半的总蛋白沉淀。
表5-水和盐水提取物的分析结果
  样品   A330   A390   ％蛋白质   ％HPLC非蛋白质峰面积
  60℃水提取物盐水提取物冷却的水上清液   128.921.3136.0   5.451.244.66   2.060.901.02   80.4670.8491.30
再者，最初的水提取支持溶解7S蛋白质，而第二次盐水提取溶解大部分2S蛋白质(表6)。热处理渗滤(DF)截留物成功地除去大量剩余的7S和12S蛋白质。冷却水提取物过夜导致大部分7S和12S蛋白质沉淀。
表6-各种样品的蛋白质分布
  样品   属于12S的蛋白质峰面积的比例(％)   属于7S的蛋白质峰面积的比例(％)   属于2S的蛋白质峰面积的比例(％)
  60℃水提取物盐水提取物加热的DF截留浓缩物(ret centrate)冷却的水上清液   2.31.20.81.4   75.230.81.543.5   22.568.097.755.1
该试验中形成的“C200H”具有良好的干颜色和可接受的湿颜色(表7)。粉末的蛋白质含量(w.b.)是93.90wt％，证实样品是分离物。冷沉淀物7S/12S是比较暗的黄色粉末，但具有可接受的湿颜色。尽管沉淀的7S/12S产物相对暗的颜色，通过LECO测试时，产物的纯度非常高。测定该样品的蛋白质含量(w.b.)为103.49％。7S/12S沉淀物湿颜色样品的色谱分析显示出低于4％蛋白质峰面积的杂质(由于约25％的2S蛋白质和非蛋白质峰面积)。鉴于没有进行沉淀以外的纯化步骤，这是相当低浓度的杂质。
表7-试验2终产品的干颜色
  样品   L   a   b
  “C200H”冷ppt 7S/12S   88.5266.79   -2.810.25   19.3635.15
(c)试验3：
用1500ml水以10％w/v在环境温度提取150g芥花籽油种子粉(A批)30分钟，使用悬臂式搅拌机。通过在7100g离心10分钟从用过的粉中分离出水提取物并测定湿粉(366g)和结合水(216g)的重量。然后加入足量0.2M NaCl(1284ml)，使浓度回到10％w/v，并用悬臂式搅拌机将样品在室温混合30分钟。通过在7100g离心10分钟从用过的粉中分离出盐水提取物，然后通过#3滤板两次来过滤。然后使用两个平行连接的10000MWCO Vivaflow HY膜装置处理澄清的盐水提取物。将提取物浓缩，然后用5体积反渗透(RO)净化水渗滤。渗滤水的加入导致沉淀的产生，并在再次浓缩之前通过在7100g离心10分钟来除去。将渗滤截留物在85℃热处理10分钟来沉淀7S和12S蛋白质，其通过在8000g离心15分钟来除去。然后将浓缩物冷冻干燥并命名为“C200H-盐水”。
将水提取物在4℃冷却过夜，然后在5℃7100g离心15分钟来收集沉淀。然后将收集的固体冷冻干燥。使用#3滤板来过滤上清液，然后使用两个平行连接的10000MWCO Vivaflow HY膜装置处理。将提取物浓缩，然后用5体积反渗透(RO)净化水渗滤。渗滤水的加入导致沉淀的产生，并在再次浓缩之前通过在7100g离心10分钟来除去。将渗滤截留物在85℃热处理10分钟来沉淀7S和12S蛋白质，其通过在8000g离心15分钟来除去。然后将浓缩物冷冻干燥并命名为“C200H-水”。和试验2中详述的一样分析各种样品。
和前一试验中一样，第二个盐水提取物比最初的水提取物更加澄清并且颜色较浅(表8)。然而，替代热水使用环境温度水溶解了更少的氮和略微更少的杂质。根据A390读数，该水提取物比热水提取物颜色更深。冷却水提取物比试验2中冷却60℃提取物时沉淀较少的蛋白质。
表8-水和盐水提取物的分析结果
  样品   A330   A390   ％蛋白质   ％HPLC非蛋白质峰面积
  环境温度水提取物盐水提取物冷却的水上清液   123.327.190.2   6.001.733.73   1.660.860.98   80.1871.7689.47
粉的环境温度水提取没有溶解和热水提取一样多的7S蛋白质。结果在盐水提取物中最后有更高比例的7S和12S蛋白质(表9)。然而，在渗滤截留物的热处理中成功地除去了7S和12S蛋白质。冷却环境温度水提取物沉淀了7S和12S蛋白质，但是没有和冷却热水提取物时一样多。令人惊讶地，热处理对从水处理料流制备的渗滤过的截留物中除去7S和12S蛋白质不那么有效。
表9-各种样品的蛋白质分布
  样品   属于12S的蛋白质峰面积的比例(％)   属于7S的蛋白质峰面积的比例(％)   属于2S的蛋白质峰面积的比例(％)
  环境温度水提取物盐水提取物加热的DF截留浓缩物-盐水冷却的水上清液加热的DF截留浓缩物-水   1.92.40.81.30.8   72.478.10.748.39.6   25.759.598.550.489.6
从盐水料流产生的“C200H”的颜色仅略微浅于来自水流的“C200H”的颜色(表9)。没有样品具有和最初提取中使用热水(试验2)时那样好的颜色。从水流产生的“C200H”的纯度(72.78％蛋白质w.b.)比从盐水料流产生的“C200H”(96.68％蛋白质w.b.)差得多。盐水所产生产物(16.4％非蛋白质峰面积)的HPLC色谱也比水产生产物(27.9％非蛋白质峰面积)的色谱更清洁。因此水提取物中杂质的水平比盐水提取物更高。因此，水提取物需要更大规模的渗析来用于纯化。该试验中获得的冷却沉淀的7S和12S蛋白质比前一试验中获得的略微浅一些，可能是因为环境温度水提取比热水提取溶解了较少的杂质。产物的纯度同样非常高，蛋白质含量为102.72％(w.b.)。
表10-试验3终产物的干颜色
  样品   L   a   b
  “C200H”-盐水“C200H”-水冷ppt 7S   86.0485.8968.92   -2.96-2.79-0.16   22.9124.6038.34
(d)试验4：
用水(2000ml)以10％w/v在环境温度提取200g芥花籽油种子粉(B批)30分钟，使用悬臂式搅拌机。通过在7100g离心10分钟从用过的粉中分离出水提取物并测定湿粉(639g)和结合水(439g)的重量。然后加入足量0.25M NaCl(1561ml)，使浓度回到10％w/v，并用悬臂式搅拌机将样品在室温混合30分钟。通过在7100g离心10分钟从用过的粉中分离出盐水提取物，然后通过#3滤板两次来过滤。然后使用两个平行连接的10000MWCO Vivaflow HY膜装置处理澄清的盐水提取物。将提取物浓缩，然后用5体积反渗透(RO)净化水渗滤。渗滤水的加入导致沉淀的产生，并在再次浓缩之前通过在7100g离心10分钟来除去。将渗滤截留物在85℃热处理10分钟来沉淀7S和12S蛋白质，其通过在8000g离心15分钟来除去。然后将浓缩物分成两个部分，一个与1wt％粉末状活性碳搅拌30分钟，另一半样品未处理。将两个样品在8000g离心10分钟，用0.45μm孔径针筒过滤器过滤，然后冷冻干燥并命名为“C200H”(无碳)和“C200HC(碳处理过的)。该试验中没有处理最初的水提取物。和试验2中详述的一样分析各种样品。
和其他试验中一样，第二个盐水提取物比最初的水提取物更澄清并且颜色更浅(表11)。
表11-水和盐水提取物的分析结果
  样品   A330   A390   ％蛋白质   ％HPLC非蛋白质峰面积
  环境温度水提取物盐水提取物   104.532.1   4.931.35   1.020.72   85.3769.32
同样，最初水提取支持溶解7S蛋白质，但是第二次盐水提取溶解了相似比例的两个蛋白质类别(表12)。水提取没有除去和其他试验一样多的蛋白质，这可能是不同粉批次的反映。热处理渗析截留物成功地除去了大量剩余的7S和12S蛋白质。碳处理所得到的浓缩物没有改变蛋白质分布。碳处理将HPLC非蛋白质峰面积从15.76％降低至4.82％。
表12-各种样品的蛋白质分布
  样品   属于12S的蛋白质峰面积的比例(％)   属于7S的蛋白质峰面积的比例(％)   属于2S的蛋白质峰面积的比例(％)
  环境温度水提取物盐水提取物加热的DF截留浓缩物加热的DF截留浓缩物-碳   2.04.21.91.9   77.944.70.50.5   20.151.197.697.6
热处理过的渗滤截留物浓缩物的碳处理改善了所得到产物的颜色(表13)。“C200HC”的干颜色略微淡一些并且黄色显著比“C200H”浅。在湿颜色样品中也注意到了改善。
表13-试验4终产物的干颜色
  样品   L   a   b
  “C200H”“C200HC”   83.6484.76   -1.61-1.64   22.6917.64
(e)试验5：
用水(2000ml)以10％w/v在环境温度提取200g筛过的芥花籽油种子粉(B批)30分钟，使用悬臂式搅拌机。通过在7100g离心10分钟从用过的粉中分离出水提取物并测定湿粉(648g)和结合水(448g)的重量。然后加入足量0.25M NaCl(1552ml)，使浓度回到10％w/v，并用悬臂式搅拌机将样品在室温混合30分钟。通过在7100g离心10分钟从用过的粉中分离出盐水提取物，然后通过#2和#3滤板来过滤。然后使用两个平行连接的10,000MWCO Vivaflow HY膜装置处理澄清的盐水提取物。将提取物浓缩，然后用5体积反渗透(RO)净化水渗滤。渗滤水的加入导致沉淀的产生，在再次浓缩之前通过在7100g离心10分钟来除去。将渗滤截留物在85℃热处理10分钟来沉淀7S和12S蛋白质，其通过在8000g离心15分钟来除去。然后将浓缩物分成两个部分，一个与1％粉末状活性碳搅拌30分钟，另一半样品未处理。将两个样品在8000g离心10分钟，用0.45μm孔径针筒过滤器过滤，然后冷冻干燥并命名为“C200H”(无碳)和“C200HC”(碳处理过的)。该试验中没有处理最初的水提取物。和试验2中详述的一样分析各种样品。
和其他试验中一样，第二个盐水提取物比最初的水提取物更澄清并且颜色更浅(表14)。使用筛过的粉替代含有更高含量外壳的常规粉导致提取了更多的蛋白质，颜色和酚类。
表14-水和盐水提取物的分析结果
  样品   A330   A390   ％蛋白质   ％HPLC非蛋白质峰面积
  环境温度水提取物盐水提取物   111.141.1   6.111.74   1.270.89   85.1270.59
同样，最初水提取相应地支持溶解了7S蛋白质，但是具有受限的可提取性，第二次盐水提取溶解了相似比例的两种蛋白质(表15)。热处理渗析截留物成功地除去了大量剩余的7S蛋白质。碳处理所得到的浓缩物没有改变蛋白质分布。碳处理将HPLC非蛋白质峰面积从10.94％降低至1.58％。
表15-各种样品的蛋白质分布
  样品   属于12S的蛋白质峰面积的比例(％)   属于7S的蛋白质峰面积的比例(％)   属于2S的蛋白质峰面积的比例(％)
  环境温度水提取物盐水提取物加热的DF截留浓缩物加热的DF截留浓缩物-碳   2.24.71.11.1   73.542.3O.5O.5   24.253.O98.498.4
热处理过的渗滤截留浓缩物的碳处理改善了所得到产物的颜色，但是没有前一试验中那样好(表16)。在该试验中，“C200HC”的干颜色略微比“C200H”的黄色淡一些，但是碳处理过的产物比未处理的样品略微更红一些并且更暗一些。碳处理改善了湿颜色，但是再次看到了在试验4中更强烈的改善。
表16-试验5终产物的干颜色．
  样品   L   a   b
  “C200H”“C200HC”   84.3183.29   -1.61-1.32   22.1718.39
(f)试验6：
用水(1500ml)以10％w/v在60℃提取150g芥花籽油种子粉(B批)15分钟，使用悬臂式搅拌机。通过在5200g离心10分钟从用过的粉中分离出水提取物并测定湿粉(458g)和结合水(308g)的重量。然后加入足量0.25M NaCl(1192ml)，使浓度回到10％w/v，并用悬臂式搅拌机将样品在室温混合30分钟。通过在5200g离心10分钟从用过的粉中分离出盐水提取物，然后用#3滤板过滤。然后使用两个平行连接的10,000MWCO Vivaflow HY膜装置处理澄清的盐水提取物。将提取物浓缩，然后用5体积反渗透(RO)净化水渗滤。渗滤水的加入导致沉淀的产生，在再次浓缩之前通过在5200g离心10分钟来除去。将渗滤截留物在85℃热处理10分钟来沉淀7S和12S蛋白质，其通过在8000g离心15分钟来除去。然后将浓缩物冷冻干燥，并命名为“C200H”。该试验中没有处理最初的水提取物。和试验2中详述的一样分析各种样品。
和其他试验中一样，第二个盐水提取物比最初的水提取物更澄清并且颜色更浅(表17)。较长时间的60℃水提取略微提高了盐水提取物的质量，但是效果似乎不显著。
表17-水和盐水提取物的分析结果
  样品   A330   A390   ％蛋白质   ％HPLC非蛋白质峰面积
  60℃水提取物盐水提取物   89.119.1   4.441.07   1.320.75   83.9770.57
各种样品的蛋白质分布显示于表18中。似乎在60℃更长时间的水提取比之前相同批次粉的提取溶解了更多的7S和12S蛋白质。这是理想的，因为这降低了盐水提取物的7S/12S含量，使其更易于制备纯2S蛋白质的样品。
表18-各种样品的蛋白质分布
  样品   属于12S的蛋白质峰面积的比例(％)   属于7S的蛋白质峰面积的比例(％)   属于2S的蛋白质峰面积的比例(％)
  60℃水提取物盐水提取物加热的DF截留浓缩物   3.52.01.5   81.127.70.4   15.570.398.1
该样品的干颜色是普通的(表19)，湿颜色是合适的，但是没有之前碳处理过的样品看到的那样好。
表19-试验6终产物的干颜色
  样品   L   a   b
  “C200H”   83.32   -1.12   21.56
(g)试验7：
用水(1600ml)以10％w/v在60℃提取160g芥花籽油种子粉(B批)和1wt％粉末状活性碳(16g)5分钟，使用悬臂式搅拌机。通过在7100g离心10分钟从用过的粉和碳中分离出水提取物并测定湿粉/碳(533g)和结合水(357g)的重量。然后加入足量0.2M NaCl(1243ml)，使浓度回到10％w/v。将另外16g新鲜粉末状活性碳也加入系统中并用悬臂式搅拌机将样品在室温混合30分钟。通过在7100g离心10分钟从用过的粉中分离出盐水提取物，然后用#3滤板过滤。然后使用两个平行连接的10,000MWCO Vivaflow HY膜装置处理澄清的盐水提取物。将提取物浓缩，然后用5体积反渗透(RO)净化水渗滤。渗滤水的加入导致沉淀的产生，在再次浓缩之前通过在7100g离心10分钟来除去。将渗滤截留物在85℃热处理10分钟来沉淀7S和12S蛋白质，其通过在8000g离心15分钟来除去。然后将浓缩物冷冻干燥，并命名为“C200H”。该试验中没有处理最初的水提取物。和试验2中详述的一样分析各种样品。
在提取步骤中包括碳很大程度上降低了处理料流的颜色和杂质含量(表20)。
表20-水和盐水提取物的分析结果
  样品   A330   A390   ％蛋白质   ％HPLC非蛋白质峰面积
  60℃水提取物盐水提取物   7.860.29   0.550.10   1.070.44   45.182.35
各种样品的蛋白质分布显示于表21中。水提取物中蛋白质的比例与试验6中看到的非常相似。然而，盐水提取物中蛋白质损耗(doss)比例甚至比其中明显支持2S蛋白质的试验6中多得多。对于这的解释可以为该试验中水相较低水平的蛋白质可提取性以及2S蛋白质对碳可能的损耗。然而，用于试验4和5中时，碳没有改变蛋白质分布。
表21-各种样品的蛋白质分布
  样品   属于12S的蛋白质峰面积的比例(％)   属于7S的蛋白质峰面积的比例(％)   属于2S的蛋白质峰面积的比例(％)
  60℃水提取物盐水提取物“C200H”   3.53.33.2   83.042.90.1   13.553.896.7
该样品具有极好的干和湿颜色(表22)。对于“C200H”粉的LECO结果只是89.3％w.b.，但是基于干基，样品可能是分离物。根据对终产物的HPLC，非蛋白质杂质的浓度仅为1.1％。因此，样品中存在的大部分非蛋白质物质在280nm没有吸收。盐会是这些化合物中最有可能的。另外用水的渗析可以用来除去这种盐并提高终产物的蛋白质含量。
表22-试验7终产物的干颜色
  样品   L   a   b
  “C200H”   89.67   -1.87   15.47
试验1至7的结果证明了对芥花籽油种子粉进行的双重提取方法产生了富含7S蛋白质和富含2S蛋白质的料流。
实施例3：
该实施例列出了一系列实施例2的双重提取方法的试验，其中在盐水提取之前进行多次水提取。
在此列出了该系列试验的结果。注意到，在工业上，使用逆流提取器进行种子粉的水提取。这样的处理将粉暴露于大量单独冲洗的等效处理中。
试验1：
用水(150ml)在60℃提取15g芥花籽种子粉(B批)5分钟。将水预热至65℃，然后使用在220rpm运作的轨道混合器与粉混合。通过在10,000g离心10分钟从用过的粉中分离出提取物。将提取物滗出，并回收湿粉，称重并计算捕获水的体积。然后将足量的65℃水加入用过的粉中，使体积回到150ml，并如上详述地重复提取。重复该过程，直至进行了四次水提取。然后用室温0.5M NaCl进行第五次提取。加入足量的盐水，使体积回到150ml，然后通过将样品在室温220rpm振荡30分钟来进行提取。表23显示了每次提取所加水或盐水的体积。注意到在第二次和第三次提取后离心时没有获得粘性团粒。因此，滗去样品时保留了更多的溶剂，以致没有损耗粉。在理论上，如果除去最大体积的用过的水并用新鲜水替代，将提取出更多的杂质。
表23-提取级分的体积
  提取编号  湿粉(g)   捕获的水的体积(ml)   加入的溶剂体积(ml)
  12345   1540577840   025426325   15012510887125
测量提取物样品的pH，传导性和白利糖度，然后用0.45μm孔径针筒滤器过滤样品并测试游离酚类(A330)，可见的颜色(A390)，蛋白质含量(LECO)和蛋白质分布(SEC HPLC)。
连续的水提取除去了大量的蛋白质和杂质(表24)。该试验中产生的盐水提取物比实施例2中报道的单次水提取试验中产生的盐水提取物清澈地多。在那些试验中，通过HPLC发现盐水提取物含有大约70％非-蛋白质峰面积。然而，来自都用碳处理的一次水提取接着盐水提取试验的盐水提取物比这个试验具有低得多的A330(0.29)，A390(0.10)和％HPLC非蛋白质峰面积(2.34％)。这些差异表明多次水提取可能没有产生足以纯净的盐水提取物来获得所需的产品颜色。
表24-试验1提取物的分析结果
  样品   pH   Cond.(mS)   白利糖度   A330   A390   蛋白质(％)   非蛋白质的％HPLC峰面积
  水提取物#1水提取物#2水提取物#3水提取物#405M NaCl提取物   5.866.066.166.266.01   2.5008250.4150.26933.5   3.3070.40.3   106.623.19.805.737.37   4.731.530.8110.5180.513   1.210.260.080.030.62   84.4291.6191.7391.8923.62
用热水提取7S蛋白质比2S蛋白质更容易(表25)。如所预期的，盐水提取物富含2S蛋白质。估算大约1/3总提取的2S蛋白质进入较低纯度的含有大部分7S/12S蛋白质和杂质的水流中。理想的是在高纯度料流中保持尽可能多的2S蛋白质。使用水相的2S蛋白质损耗的可接受性的极限(作为较低质量产物来回收)以及事实上整个多次提取方案的价值取决于来自盐水料流的2S蛋白质的质量和价值。
表25-试验1提取物的蛋白质分布
  样品   属于12S的蛋白质峰面积的比例(％)   属于7S的蛋白质峰面积的比例(％)   属于2S的蛋白质峰面积的比例(％)
  水提取物#1水提取物#2水提取物#3水提取物#40.5M NaCl提取物   2.43.38.38.75.1   80.686.683.381.020.0   17.010.18.410.374.9
试验2：
用水(1500ml)在60℃提取150g芥花籽油种子粉(B批)5分钟。将水预热至65℃，然后使用悬臂式搅拌器与粉混合。通过在7100g离心10分钟从用过的粉中分离出提取物。将提取物滗出，并回收湿粉，称重并计算捕获水的体积。然后将足量的65℃水加入用过的粉中，使体积回到1500ml，并如上详述地重复提取。重复该过程，直至进行了4次水提取。然后用室温0.2M NaCl进行第五次提取。选择比试验1中低的盐浓度，因为要通过渗滤除去盐和只允许用五个渗滤体积处理的时间。加入足量的0.2M NaCl，使体积回到1500ml，然后通过悬臂式搅拌器将样品在室温混合30分钟来进行提取。表26中显示了每次提取中加入的水或盐水体积。
表26-提取级分的体积
  提取编号   湿粉(g)   捕获的水的体积(ml)   加入的溶剂体积(ml)
  12345   150430459466426   0280309316276   15001220119111841224
通过在7100g离心10分钟，然后通过#3滤板过滤，将盐水提取物与用过的粉分离。然后使用两个平行连接的10000MWCO Vivaflow HY膜装置处理澄清的盐水提取物。将提取物浓缩，然后用5体积反渗透(RO)净化水渗滤。渗滤水的加入导致沉淀的产生，在再次浓缩之前通过在7100g离心10分钟来除去。将渗滤截留物在85℃热处理10分钟来沉淀7S和12S蛋白质，其通过在8000g离心15分钟来除去。然后将浓缩物冷冻干燥，并命名为“C200H”。
分析各种样品的游离酚类(A330)，可见的颜色(A390)，蛋白质含量(LECO)和蛋白质分布(SEC HPLC)。使用Minolta色度计分析终产品的干颜色，并且还制备溶液用于湿颜色分析。使用涡旋搅拌机将蛋白质粉(0.7g)与0.1M NaCl(10ml)混合。然后将样品在8000g离心10分钟，并通过LECO测定上清液的蛋白质含量。将等份试样(8ml)的上清液转移至小烧杯中并加入足量的盐水，将蛋白质含量调节至5％。然后将样品照相。
与试验1相比较，这次运行中的水提取似乎大致除去了相同含量的蛋白质，颜色和杂质(表27)。盐水提取物的质量似乎略有不同，该试验的提取物中发现具有较少的蛋白质，游离酚类，杂质和可见的颜色。
因为水提取的分析数据看上去很相似，盐水提取物的差异可能是由于不同的盐浓度引起的。
表27-试验2提取物的分析结果
  样品   pH   Cond.(mS)   白利糖度   A330   A390   蛋白质(％)   非蛋白质的％HPLC峰面积
  水提取物#1水提取物#2水提取物#3水提取物#40.2M NaCl提取物   6.026.246.396.496.18   2.530.90604000.22215.88   3.21.00.40.2   97.722.89.484.361.99   4.961.630.7560.4370.202   1.110.220.140.120.40   84.3691.1290.2784.1914.19
该试验中水提取物的蛋白质分布(表28)与试验1相似，但是发现盐水提取物具有更高比例的2S蛋白质。这稍微有点令人惊讶，因为该试验中使用了较少的盐，并且认为提高的盐度相对于7S蛋白质支持提取2S蛋白质。
表28-试验2提取物的蛋白质分布
  样品   属于12S的蛋白质峰面积的比例(％)   属于7S的蛋白质峰面积的比例(％)   属于2S的蛋白质峰面积的比例(％)
  水提取物#1水提取物#2水提取物#3水提取物#40.2M NaCl提取物   2.24.611.718.92.2   81.586.383.473.18.1   16.39.14.98.089.7
膜处理盐水提取物将其进一步纯化了，发现渗析截留物的HPLC非蛋白质峰面积％仅为2.3％。这比单次水提取试验(参见实施例2)中通常看到的低。
该试验中产生的“C200H”的干颜色显示于表29中。该颜色与其它使用相同粉的双重提取试验中看到的非常相似。粉末状碳和双重提取的一起使用产生了具有几乎90的亮度值以及比该实验中产物较浅红色和黄色标注的“C200H”。
表29-试验2产物的干颜色
  L   a   b
  “C200H”-试验2   83.53   -1.07   19.20
试验2中产生的“C200H”的湿颜色也没有比其他没有使用吸附剂的双重提取试验(60℃水)中看到的好，且无疑比使用吸附剂产生的样品暗。
这些试验的结果与实施例2中的那些相比较，表明了在盐水提取之前粉的多次水提取似乎消除了其他的杂质(无吸附剂)，但是对终产品质量不具有大的影响。
实施例4
该实施例说明了从超滤截留物制备分离的2S蛋白质产品。
将40kg芥花籽粉加入400L 0.15M NaCl溶液中，在环境温度搅拌30分钟来提供蛋白质水溶液。除去残余的芥花籽粉，通过离心和过滤澄清所得到的蛋白质溶液来产生139L过滤的蛋白质溶液，具有1.87％重量的蛋白质含量。
通过在具有30,000道尔顿截留分子量的PVDF膜上的浓缩，将139L蛋白质提取溶液的等份试样的体积降至8.9L。然后在具有100,000道尔顿截留分子量的PES膜上，使用24.8L 0.15M NaCl溶液将5L浓缩过的蛋白质溶液的等份试样渗滤。然后将渗滤过的截留物在60℃巴氏杀菌10分钟。
获得渗滤并巴氏杀菌的超滤(UF1)截留物的样品。该截留物的蛋白质含量为18.30wt％。认为UF1截留物中存在的高蛋白质浓度结合高比例的7S会导致凝胶化，而不是在加热时沉淀。结果，在热处理之前，通过混合100ml截留物和100ml 0.1M NaCl来调节样品的蛋白质浓度。
将稀释的样品在85℃热处理10分钟，然后在冷水中快速冷却至低于30℃。然后将样品在10200g离心15分钟。离心后，获得团粒以及一些漂浮沉淀颗粒。滗出上清液并通过25um孔径滤纸过滤来除去漂浮的颗粒。在Vivaflow 10000HY膜装置上浓缩回收的上清液(120ml)，然后用10体积反相渗透净化水渗滤来除去盐。然后将渗滤的截留物冷冻干燥并命名为C500H。
分析各种样品的游离酚类(A330)，可见的颜色(A390)，蛋白质含量(LECO)和蛋白质分布(SEC HPLC)。使用烘炉干燥方法分析终产物的含水量，使用Minolta色度计分析终产品的干颜色，并且还制备了溶液用于湿颜色分析。使用涡旋搅拌机将蛋白质粉(0.7g)与水(10ml)混合。然后将样品在7800g离心10分钟，并通过LECO测定上清液的蛋白质含量。将等份试样(8ml)的上清液转移至小烧杯中并加入足量的水，将蛋白质含量调节至5％。然后将样品照相。
UF1截留物的热处理成功地从样品中除去了大量的7S和12S蛋白质。最初截留物中由7S和12S产生的HPLC蛋白质峰面积的比例各自为61.4％和2％。这在热处理样品的上清液中降至4.4％7S和0.4％12S。获得的终产物是具有90.32％蛋白质含量(湿基)和4.82％含水量的分离物，导致94.89％的蛋白质含量(干基)。产物的干颜色比之前看到的C200H产物的要暗一点(表30)。
表30-从UF1截留物产生的C500H的干颜色
  样品   L   a   b
  C500H   80.84   -1.12   22.32
产物的湿颜色非常好，尽管可能比C200H看到的暗一点。样品略微有些模糊。
如在此所述的结果可以看出，基本上由2S蛋白质组成的芥花籽蛋白质分离物成功地从UF1截留物中产生。
实施例5
该实施例说明了从芥花籽油种子粉形成的芥花籽蛋白质提取溶液的热处理。
用1500ml 0.1M NaCl在室温用悬臂式搅拌器将150g芥花籽油种子粉(SB062)提取30分钟。将混合物在7100g离心10分钟，从用过的粉中分离出提取物。将回收的提取物在双重锅炉罐中85℃热处理10分钟来沉淀7S/12S。在热处理后，通过冷水浴中的浸泡将样品立即冷却至低于30℃。通过在7100g离心10分钟除去沉淀的固体，然后用#3滤板精炼浓缩物。然后在Vivaflow 10000HY超滤装置上浓缩澄清的浓缩物并用10体积反相渗透净化水渗滤。渗滤水的加入导致一些沉淀的形成，在再次浓缩之前通过在7100g离心样品10分钟来除去。将渗滤的截留物冷冻干燥来形成终产物。
分析各种样品的游离酚类(A330)，可见的颜色(A390)，蛋白质含量(LECO)和蛋白质分布(SEC HPLC)。使用烘炉干燥方法分析终产物的含水量，使用Minolta色度计分析终产品的干颜色，并且还制备了溶液用于湿颜色分析。使用涡旋搅拌机将蛋白质粉(0.8g)与水(10ml)混合。然后将样品在7800g离心10分钟，并通过LECO测定上清液的蛋白质含量。将等份试样(8ml)的上清液转移至小烧杯中并加入足量的水，将蛋白质含量调节至5％。然后将样品照相。
提取物的热处理成功地从样品中除去了大量的7S和12S。最初提取物中由7S和12S产生的HPLC蛋白质峰面积的比例各自为63.8％和3.8％。这在热处理样品的浓缩物中降至2.0％7S和0.8％12S。通过离心容易地除去加热提取物形成的沉淀。获得的终产物是具有84.15％蛋白质含量(湿基)和7.22％含水量的分离物，导致90.70％的蛋白质含量(干基)。产物的干颜色比之前看到的大部分分离的2S产物略微暗和红一些(表31)。
表31-从热处理的提取物产生的分离2S的干颜色
  样品   L   a   b
  来自热处理提取物的2S   80.60   -0.57   22.34
公开内容总结
总结本公开内容，提供了基本上由2S芥花籽蛋白质构成并且基本上无7S和12S蛋白质的芥花籽蛋白质分离物的制备方法。本发明范围内的修改是可能的。

Claims (27)

1.生产主要由2S芥花籽蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物的方法，其特征在于：
用具有至少0.05的离子强度和5至6.8的pH的盐水溶液在80℃至95℃的升高的温度提取芥花籽油种子粉，以优先于7S和12S蛋白质优先从芥花籽油种子粉提取2S蛋白质，并获得主要含有2S蛋白质的芥花籽蛋白质提取溶液，
将芥花籽蛋白质提取溶液与残余的芥花籽油种子粉分离，和
从芥花籽蛋白质提取溶液回收具有通过凯氏氮x6.25测定的至少90wt％蛋白质含量并且主要由2S芥花籽蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物。
2.权利要求1中所述的方法，特征在于所述盐水溶液具有至少0.10的离子强度，和5.3至6.2的pH。
3.权利要求1或2中所述的方法，其特征在于所述芥花籽蛋白质提取溶液具有如下的芥花籽蛋白质分布：
80至100wt％2S蛋白质，
0至10wt％7S蛋白质，和
0至约10wt％12S蛋白质。
4.权利要求1或2中所述的方法，其特征在于所述芥花籽蛋白质分布为：
85至100wt％2S蛋白质，
0至15wt％7S蛋白质，和
0至5wt％12S蛋白质。
5.制备主要由2S芥花籽蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物的方法，其特征在于：
用10℃至70℃的温度的水提取芥花籽油种子粉，以优先于2S蛋白质优先提取7S和12S芥花籽蛋白质以及可溶性杂质，以形成第一个芥花籽蛋白质提取溶液，
将第一个芥花籽蛋白质提取溶液与残余的油种子粉分离，
用5℃至65℃的温度的具有至少0.05的离子强度和5至6.8的pH的盐水溶液提取残余的油种子粉来溶解来自残余油种子粉的2S，7S和12S蛋白质，以形成第二个芥花籽蛋白质提取溶液，和
从第二个芥花籽蛋白质提取溶液回收具有通过凯氏氮x6.25测定的至少90wt％蛋白质含量并且主要由2S芥花籽蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物。
6.权利要求5中所述的方法，其特征在于用55℃至65℃的温度的水提取所述芥花籽油种子粉。
7.权利要求5或6中所述的方法，其特征在于从第一个芥花籽蛋白质提取溶液回收7S和12S芥花籽蛋白质作为芥花籽蛋白质分离物。
8.权利要求5或6中所述的方法，其特征在于以2至25次水提取来进行所述的水提取。
9.权利要求8中所述的方法，其特征在于所述提取的次数为2至4次提取。
10.权利要求5或6中所述的方法，其特征在于用20℃至30℃的温度并且离子强度至少0.10的盐水溶液提取所述芥花籽油种子粉。
11.权利要求10中所述的方法，其特征在于所述盐水溶液具有5.3至6.2的pH。
12.权利要求5或6中所述的方法，其特征在于所述第二个芥花籽蛋白质提取溶液具有如下的芥花籽蛋白质分布：
80至100wt％2S蛋白质，
0至10wt％7S蛋白质，和
0至10wt％12S蛋白质。
13.权利要求12中所述的方法，其特征在于所述芥花籽蛋白质分布为：
85至100wt％2S蛋白质
0至15wt％7S蛋白质，和
0至5wt％12S蛋白质。
14.权利要求1或5中所述的方法，其特征在于通过浓缩芥花籽蛋白质提取溶液或第二芥花籽蛋白质溶液至至少50g/L的浓度并干燥所得到的浓缩芥花籽蛋白质提取物水溶液，进行所述的回收步骤，用于回收主要由2S芥花籽蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物。
15.权利要求14中所述的方法，其特征在于将所述芥花籽蛋白质提取物水溶液浓缩至100g/L至400g/L的蛋白质浓度。
16.权利要求15中所述的方法，其特征在于所述蛋白质浓度为200g/L至300g/L。
17.权利要求15中所述的方法，其特征在于使用2至20体积的渗滤介质将浓缩过的含水芥花籽蛋白质提取物进行渗滤。
18.权利要求17中所述的方法，其特征在于所述渗滤是使用5至10体积渗滤介质来实现的。
19.权利要求17中所述的方法，其特征在于在至少部分渗滤步骤过程中存在抗氧化剂。
20.权利要求15至19任一项中所述的方法，其特征在于在所述干燥步骤之前，将浓缩的芥花籽蛋白质提取水溶液进行热处理步骤，在70℃至100℃的温度持续2至30分钟，从而通过从溶液中沉淀出来将所述溶液中的7S和12S蛋白质比例降低至少50wt％。
21.权利要求20中所述的方法，其特征在于所述热处理步骤在75℃至95℃的温度进行5至15分钟，从而通过从溶液中沉淀出来将存在的7S和12S蛋白质比例降低至少75wt％。
22.生产主要由2S芥花籽蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物的方法，其特征在于：
用具有至少0.05的离子强度和5至6.8的pH的盐水溶液提取芥花籽油种子粉，从芥花籽油种子粉提取芥花籽蛋白质并获得芥花籽蛋白质溶液，
将芥花籽蛋白质溶液与残余的油种子粉分离，
任选浓缩所述的芥花籽蛋白质溶液来提供浓缩的蛋白质溶液作为截留物，
热处理芥花籽蛋白质溶液或任选浓缩的蛋白质溶液，在70℃至100℃的温度持续2至30分钟，以优先于2S芥花籽蛋白质，从芥花籽蛋白质溶液或任选浓缩的芥花籽蛋白质溶液选择性地沉淀7S和12S芥花籽蛋白质并将7S和12S蛋白质含量降低至少50wt％，形成主要含有2S芥花籽蛋白质的热处理过的芥花籽蛋白质溶液，
将热处理过的芥花籽蛋白质溶液与沉淀的蛋白质分离，和
从分离的热处理过的芥花籽蛋白质溶液回收具有通过凯氏氮x6.25测定的至少90wt％蛋白质含量并且主要由2S芥花籽蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物。
23.权利要求22中所述的方法，其特征在于在75℃至95℃的温度进行所述的热处理步骤，持续5至15分钟，将7S和12S蛋白质含量降低至少75wt％。
24.权利要求22或23中所述的方法，其特征在于所述盐水溶液具有至少0.10的离子强度，和5.3至6.2的pH。
25.权利要求1，5或22中所述的方法，其特征在于主要由2S蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物具有至少100wt％的蛋白质含量。
26.权利要求1，5或22中所述的方法，其特征在于所述主要由2S蛋白质构成的芥花籽蛋白质分离物含有存在的芥花籽蛋白质的至少90wt％的2S蛋白质。
27.权利要求26中所述的方法，其特征在于所述芥花籽蛋白质分离物含有存在的芥花籽蛋白质的至少95wt％的2S蛋白质。
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