BRPI0612565A2

BRPI0612565A2 - método para produção de um isolado de proteìna de canola consistido predominantemente de proteìna de canola 2s

Info

Publication number: BRPI0612565A2
Application number: BRPI0612565-4A
Authority: BR
Inventors: Brand Gosnell; Kevin I Segall; Martin Schweizer
Original assignee: Burcon Nutrascience
Priority date: 2005-07-01
Filing date: 2006-06-30
Publication date: 2010-11-23
Also published as: ZA200900889B; MX2008000132A; US8075925B2; US20080125577A1; KR101321360B1; JP4913806B2; KR20130008650A; ZA200900888B; CN101272697A; JP2008546425A; RU2008103797A; NZ587045A; US20090203880A1; KR101267395B1; EP2674035A1; KR20080031217A; CN101272697B; AU2006265723A1; US7955625B2; EP1906753A1

Abstract

METODO PARA A PRODUçAO DE UM ISOLADO DE PROTEìNA DE CANOLA CONSISTINDO PREDOMINANTEMENTE DE PROTEìNA DE CANOLA 2S. Um isolado de proteína de canola possuindo um conteúdo de proteína de pelo menos cerca de 90% em peso (N x 6,25), preferivelmente pelo menos cerca de 100% em peso, e consistindo predominantemente de proteína 2S e substancialmente livre das proteínas 7S e 12S é preparado. Em um aspecto, a farinha de semente oleaginosa de canola é extraida com solução de proteína aquosa a uma temperatura elevada para extrair de forma preferível a proteína 2S da farinha para produzir uma solução de proteína de canola contendo predominantemente proteína 2S. A proteína de canola 2S é recuperada como um isolado. Em um outro aspecto, a farinha de semente oleaginosa de canola é inicialmente extraida com água para extrair de forma preferível as proteínas de canola 7S e 12S seguida pela extração da farinha de semente oleaginosa de canola com solução salina aquosa para extrair a proteína 2S da farinha. O isolado de proteína de canola 2S é recuperado a partir do extrato salino. Em um outro aspecto, a farinha de semente oleaginosa de canola é extraída com solução salina aquosa para extrair as proteínas 2S, 7S e 12S da farinha. A solução do extrato de proteína aquosa é tratada a aquente a uma temperatura elevada para precipitar as proteínas 7S e 12S e deixar uma solução de proteína 2S da qual o isolado pode ser recuperado. Em um aspecto adicional, a solução de proteína aquosa está concentrada antes do tratamento a quente.

Description

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM ISOLADO DE PROTEÍNA DE CANOLACONSISTINDO PREDOMINANTEMENTE DE PROTEÍNA DE CANOLA 2S

Referência Aos Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica prioridade sob 35 USC 119 (e)do Pedido de Patente U.S. Provisório de número 60/695.535depositado em Io de julho de 2005.

Campo Da Invenção

A presente invenção relaciona-se a novos procedimentospara a preparação da proteína 2S de canola,substancialmente livre das proteínas 7S e 12S de canola.

Fundamentos Da Invenção

Os isolados de proteína de canola podem ser formados apartir de farinha de semente oleaginosa de canola. NosPedidos de Patente dos Estados Unidos co-pendentes de números10/137.391, depositado em 3 de maio de 2002 (Publicação doPedido de Patente U.S. de número 20030125526A1), 10/476.230depositado em 9 de junho de 2004 (Publicação do Pedido dePatente U.S. de número 20040254353A1) e correspondentePublicação PCT de n° WO 02/089597, ambos cedidos aocessionário desta e as divulgações das quais estão aquiincorporadas por referência, descrevem um método de produçãode isolados de proteína de canola a partir de uma farinha desemente de oleaginosa de canola, tais isolados possuindo pelomenos 100% em peso de conteúdo de proteína (Ν χ 6,25). 0procedimento envolve um processo de etapas múltiplascompreendendo extrair farinha de semente oleaginosa de canolausando-se uma solução de sal, separar a solução de proteínaaquosa resultante da farinha de semente oleaginosaresidual, aumentando a concentração de proteína da soluçãoaquosa a pelo menos cerca de 200 g/L enquanto se mantém aforça iônica substancialmente constante pelo uso de umatécnica de membrana seletiva, diluir a solução de proteínaconcentrada resultante em água resfriada para causar aformação de micelas de proteína, assentar as micelas deproteína para formar uma massa micelar de proteína (PMM)semelhante a glúten gelatinosa, pegajosa e amorfa, erecuperar a massa micelar de proteína do sobrenadantepossuindo um conteúdo de proteína de pelo menos cerca de100% em peso conforme determinado por nitrogênio deKjeldahl (Ν χ 6,25). Conforme aqui usado, o conteúdo deproteína é determinado em uma base de peso seco. A PMMrecuperada pode ser seca.

Em uma modalidade do processo descrito acima, osobrenadante da etapa de assentamento de PMM é processadopara recuperar um isolado de proteína compreendendoproteína seca a partir da PMM úmida e do sobrenadante. Esteprocedimento pode ser efetuado concentrando-se inicialmenteo sobrenadante usando-se membranas de ultrafiltração,misturando-se o sobrenadante concentrado com a PMM úmida esecando-se a mistura. O isolado de proteína de canolaresultante possui uma alta pureza de pelo menos cerca de90% em peso de proteína (Ν χ 6,25), preferivelmente pelomenos cerca de 100% em peso de proteína (Ν χ 6,25).

Em uma outra modalidade do processo descrito acima, osobrenadante da etapa de assentamento de PMM é processadopara recuperar uma proteína do sobrenadante. Esteprocedimento pode ser efetuado inicialmente concentrando-seo sobrenadante usando-se membranas de ultrafiltração esecando-se o concentrado. O isolado de proteína de canolaresultante possui uma alta pureza de pelo menos cerca de90% em peso de proteína (Ν χ 6,25), preferivelmente pelomenos cerca de 100% em peso de proteína (Ν χ 6,25).

Os procedimentos descritos nos Pedidos de Patente U.S.supracitados são essencialmente procedimentos em batelada.No Pedido de Patente dos Estados Unidos co-pendente denúmero 10/298.678 depositado em 19 de novembro de 2002(Publicação de Patente U.S. de número 20040039174A1) ecorrespondente Pedido Internacional publicado de número WO03/043439, cedido ao cessionário desta e as divulgações dasquais estão aqui incorporadas por referência, descreve umprocesso contínuo para produção de isolados de proteína decanola. De acordo com esta, a farinha de semente oleaginosade canola é continuamente misturada com uma solução salina,a mistura é conduzida através de uma tubulação enquanto seextrai a proteína da farinha de semente oleaginosa decanola para formar uma solução de proteína aquosa, asolução de proteína aquosa é continuamente separada dafarinha de semente oleaginosa de canola residual, soluçãode proteína aquosa é continuamente conduzida através de umaoperação de membrana seletiva para aumentar o conteúdo deproteína da solução de proteína aquosa a pelo menos cercade 200 g/L enquanto se mantém a força iônicasubstancialmente constante, a solução de proteínaconcentrada resultante é continuamente misturada com águaresfriada para causar a formação de micelas de proteína, eé permitido que as micelas de proteína sejam assentadasenquanto o sobrenadante é continuamente transbordado atéque a quantidade desejada de PMM tenha sido acumulada norecipiente de assentamento. A PMM é removida do recipientede assentamento e pode ser seca. A PMM possui um conteúdode proteína de pelo menos cerca de 90% em peso conformedeterminado por nitrogênio de Kjeldahl (Ν χ 6,25),pref erivelmente pelo menos cerca de 100% em peso (Ν χ6,25).

Conforme descrito nos Pedidos de Patente U.S.supracitados de números 10/137.391 e 10/471.230, osobrenadante transbordado pode ser processado pararecuperar o isolado de proteína de canola a partir deste.

A semente oleaginosa de canola é conhecida por contercerca de 10 a cerca de 3 0% em peso de proteínas e váriosdiferentes componentes de proteína foram identificados.Estas proteínas são distinguidas por diferentescoeficientes de sedimentação (S) . Estas proteínasconhecidas e identificadas incluem uma globulina 12S,conhecida como cruciferina, e uma proteína de reserva 2Sconhecida como napina.

A canola é também conhecida como semente de colza ounabita.

Nos Pedidos de Patente dos Estados Unidos co-pendentesde números 10/413.371 depositado em 25 de agosto de 2003(Publicação de Pedido de Patente U.S. de número20040034204) e 10/510.766 depositado em 15 de abril de 2003assim como a correspondente Publicação PCT publicada de n°WO 03/08876 cedido ao cessionário desta e a divulgação daqual está aqui incorporada por referência, descreve acomposição do isolado de proteína de canola da PMM e doisolado de proteína de canola derivado do sobrenadante. Oisolado de proteína de canola derivado do sobrenadante écompreendido principalmente da proteína 2S com menoresquantidades da proteína 7S e uma quantidade de traço daproteína 12S. A proteína 2S é uma albumina de baixo pesomolecular. A PMM produzida é compreendida predominantementeda proteína 7S com a proteína 2S e a proteína 12S sendorelativamente componentes menores. As proteínas 7S e 12Ssão globulinas de peso molecular mais alta com a molécula7S sendo a meia molécula da proteína 12S.

Conforme descrito nesta, o isolado de proteína decanola derivado do sobrenadante exibe um perfil de proteínaque é:

de cerca de 60 a cerca de 95% em peso de proteína 2S,de cerca de 5 a cerca de 4 0% em peso de proteína 7S, ede 0 a cerca de 5% em peso de proteína 12S,preferivelmente

de cerca de 70 a cerca de 95% em peso de proteína 2S,de cerca de 5 a cerca de 30% em peso de proteína 7S, ede 0 a cerca de 2% em peso de proteína 12S.

O isolado de proteína de canola da PMM exibe um perfilde proteína que é:

de cerca de 60 a cerca de 98% em peso de proteína 7S,de cerca de 1 a cerca de 15% em peso de proteína 12S,

e

de 0 a cerca de 25% em peso de proteína 2S,preferivelmente

de cerca de 88 a cerca de 98% em peso de proteína 7S,de cerca de 1 a cerca de 10% em peso de proteína 12S,

e

de 0 a cerca de 6% em peso de proteína 2S.Foi descoberto que o isolado de proteína de canoladerivado do sobrenadante consistindo predominantemente deproteína 2S exibe propriedades funcionais superiores paracertas aplicações que o isolado de proteína de canoladerivado da PMM consistindo predominantemente de proteína7S. Nos procedimentos descritos nos pedidos anteriores, afim de produzir o isolado de proteína de canola derivado dosobrenadante, foi necessário percorrer as etapas daformação da PMM e o fornecimento de um sobrenadante a fimde, na realidade, fracionar as proteínas de canola.

No Pedido de Patente U.S. de número 11/038.086depositado em 21 de julho de 2005 (Publicação de Pedido dePatente U.S. de número 2005-0181112A1) , cedido aocessionário desta e a divulgação da qual está aquiincorporada por referência (WO 2005/067729), descreve umprocedimento no qual o sobrenadante da precipitação da PMMé, depois do processamento com membrana, sujeitado atratamento a quente para precipitar a proteína 7s e deixaruma solução de proteína rica em proteína 2S. A soluçãorestante pode ser seca por pulverização.

A proteína 2S possuindo uma proporção mínima dasproteínas 7 S e 12S demonstram solubilidade aumentada emrelação à proteína 2S não tratada a valores de pH ácidos eé capaz de fornecer clareza melhorada em solução e comrefrescos, fornecendo bebidas fortificadas com proteínatransparentes.

Sumário Da Invenção

Foi descoberto de forma surpreendente que, de acordocom um aspecto da presente invenção, se a extração dafarinha de semente oleaginosa de canola é efetuada a umatemperatura elevada, em vez de temperaturas relativamenteambientes, então a proteína 2S é extraída em vez dasproteínas 7S e 12S e a proteína de canola na solução deextrato resultante consiste predominantemente da proteína2S, que então pode ser obtida na forma relativamente pura apartir da solução de extrato.

Embora não desejando estar preso por qualquer teoria,acredita-se que a capacidade de extrair seletivamente aproteína de canola 2S em vez das proteínas 7S e/ou 12S àtemperatura de extração elevada resulta da degradação eprecipitação das proteínas 7S e 12S na farinha de sementeoleaginosa de canola durante a etapa de extração.

Conseqüentemente, em um aspecto da presente invenção,é fornecido um método para a produção de um isolado deproteína de canola consistindo predominantemente daproteína de canola 2S, que compreende: extrair a farinha dasemente oleaginosa de canola com uma solução de sal aquosaa uma temperatura elevada para preferencialmente extrair aproteína 2S da farinha da semente oleaginosa de canola emvez das proteínas 7S e 12S e para se obter uma solução deextrato de proteína de canola contendo predominantementeproteína 2S, separar a solução de extrato de proteína decanola da farinha da semente oleaginosa de canola residual,e recuperar da solução de extrato de proteína de canola umisolado de proteína de canola possuindo um conteúdo deproteína de pelo menos cerca de 90% em peso (Ν χ 6,25) econsistindo predominantemente da proteína de canola 2S.

Foi descoberto de forma surpreendente que, de acordocom um aspecto adicional da presente invenção, se aextração da farinha de semente oleaginosa de canola éefetuada em dois estágios, a primeira extração é efetuadausando-se água e a segunda usando-se solução de sal aquosa,é obtido da primeira etapa de extração uma solução deproteína de canola aquosa que é predominantemente aproteína 7S e da segunda etapa de extração uma solução deextrato de proteína de canola aquosa que épredominantemente a proteína 2S.

A etapa inicial de extração da farinha de sementeoleaginosa de canola com água solubiliza uma proporçãonotável das proteínas 7S e 12S, uma proporção menor daproteína 2S e uma proporção maior de impurezas insolúveis.

A segunda extração com solução salina aquosa, resulta emuma solução de proteína de canola aquosa contente umamaioria de proteína 2S, quantidades menores de proteínas 7Se 12S e uma baixa concentração de impurezas solúveis.

O extrato de proteína de canola salina aquosa éconcentrado, diafiltrado para reduzir o conteúdo de sal eentão a tratado a quente para precipitar as proteínas 7S e12S residuais, de acordo com o procedimento descrito noPedido de Patente U.S. supracitado de número 11/038.086.

De acordo com este aspecto adicional da presenteinvenção, é fornecido um método para a preparação de umisolado de proteína de canola consistindo predominantementeda proteína de canola 2S, que compreende: extrair a farinhada semente oleaginosa de canola com água extrairpreferencialmente as proteínas de canola 7S e 12S eimpurezas solúveis em vez da proteína 2S, para formar umaprimeira solução de extrato de proteína de canola, separara primeira solução de extrato de proteína de canola dafarinha da semente oleaginosa residual, extrair a farinhade semente oleaginosa residual com uma solução salinaaquosa para dissolver as proteínas 2S, 7S e 12S da farinhade semente oleaginosa residual para formar uma segundasolução de extrato de proteína de canola, e recuperar umisolado de proteína de canola possuindo um conteúdo deproteína de pelo menos cerca de 90% em peso (Ν χ 6,25) econsistindo predominantemente da proteína de canola 2S dasegunda solução de extrato de proteína de canola.

Foi descoberto de forma surpreendente também, deacordo com um outro aspecto da presente invenção, que asolução de proteína de canola concentrada da etapa deconcentração descrita no Pedido de Patente U.S. acimamencionado de n° 10/137.391 pode ser tratada a quente deacordo com o procedimento do Pedido de Patente U.S.supramencionado de n° 11/038.586 para precipitar a maiorparte das proteínas 7s e 12S contida nesta deixando umasolução de proteína de canola aquosa concentradaconsistindo substancialmente de proteína 2S.

De acordo com este aspecto adicional da presenteinvenção, é fornecido um método para a produção de umisolado de proteína de canola consistindo predominantementeda proteína de canola 2S, que compreende: extrair a farinhade semente oleaginosa de canola com uma solução salinaaquosa para extrair proteínas de canola da farinha desemente oleaginosa de canola e para obter uma solução deproteína de canola, separar a solução de proteína de canolada farinha de semente oleaginosa residual, concentrar areferida solução de proteína de canola para fornecer umasolução de proteína concentrada como um retentato, tratar aquente a solução de proteína concentrada para precipitar deforma seletiva as proteínas de canola 7S e 12S a partir dasolução de proteína de canola concentrada em vez daproteína de canola 2S para formar uma solução de proteínade canola tratada a quente contendo predominantemente aproteína de canola 2S, separar a solução de proteína decanola tratada a quente das proteínas precipitadas, erecuperar um isolado de proteína de canola possuindo umconteúdo de proteína de pelo menos cerca de 90% em peso (Nχ 6,25) e consistindo predominantemente de proteína decanola 2S da solução de proteína de canola tratada a quenteseparada.

Foi descoberto de forma surpreendente também, deacordo com um aspecto adicional da presente invenção, que asolução de proteína de canola aquosa obtida pela extraçãodo sal da farinha de semente oleaginosa de canola depois doprocedimento do Pedido de Patente U.S. acima mencionado den° 10/137.391 pode ser tratada a quente de acordo com oprocedimento do Pedido de Patente U.S. supramencionado den° 11/038.586 para precipitar a maior parte das proteínas7s e 12S contida nesta deixando uma solução de proteína decanola aquosa consistindo substancialmente de proteína 2S.

De acordo com este aspecto adicional da presenteinvenção, é fornecido um método para a produção de umisolado de proteína de canola consistindo predominantementeda proteína de canola 2S, que compreende: extrair a farinhade semente oleaginosa de canola com uma solução salinaaquosa para extrair proteínas de canola da farinha desemente oleaginosa de canola e para obter uma solução deproteína de canola, separar a solução de proteína de canolada farinha de semente oleaginosa residual, tratar a quentea solução de proteína concentrada para precipitarseletivamente as proteínas de canola 7S e 12S em vez daproteína de canola 2S da solução de proteína de canola paraformar uma solução de proteína de canola tratada a quentecontendo predominantemente a proteína de canola 2S, separara solução de proteína de canola tratada a quente dasproteínas precipitadas, e recuperar um isolado de proteínade canola possuindo um conteúdo de proteína de pelo menoscerca de 90% em peso (Ν χ 6,25) e consistindopredominantemente de proteína de canola 2S da solução deproteína de canola tratada a quente separada.

Os procedimentos da presente invenção permitem queseja obtido um isolado de proteína de canola consistindopredominantemente da proteína de canola 2S, sem anecessidade de empregar a etapa de fracionamento deprecipitação de PMM, simplificando assim enormemente oprocedimento e permitindo que o isolado de proteína decanola com predominância de proteína 2S seja obtido deforma mais econômica.

Os isolados de proteína de canola produzidos de acordocom os processos aqui podem ser usados em aplicaçõesconvencionais de isolados de proteína, tais como,fortificação de proteína dos alimentos processados,emulsificação de óleos, formadores de corpo em mercadoriasassadas, e agentes de formação de espuma em produtos quecapturam gases. Além disso, os isolados de proteína decanola podem ser formados em fibras protéicas, úteis emanálogos de carne, podem ser usados como um substituto daclara de ovo ou aditivos em produtos alimentícios onde aclara de ovo é usada como um ligante. 0 isolado de proteínade canola pode ser usado como suplementos nutricionais.Outros usos de isolado de proteína de canola estão embebidas fortificadas com proteína, alimentos de animaisdomésticos, alimentação de animais e em aplicaçõesindustriais e cosméticas e em produtos de cuidado pessoal.

Descrição Geral Da Invenção

Conforme descrito acima, a presente invenção fornecequatro aspectos de um processo para a produção de soluçãode proteína de canola consistindo predominantemente deproteína 2S substancialmente livre de proteínas 7S e 12S.

(a) Aspecto Utilizando Extração à Alta Temperatura daFarinha de Semente Oleaginosa de Canola

A etapa inicial do processo de fornecimento dosisolados de proteína de canola de acordo com este aspectoda invenção envolve a solubilização do material proteináceoda farinha de semente oleaginosa de canola. 0 materialproteináceo recuperado da farinha de semente oleaginosapode ser a proteína que ocorre naturalmente na semente decanola ou o material proteináceo pode ser uma proteínamodificada por manipulação genética mas possuindocaracterísticas hidrofóbicas e propriedades polares daproteína natural.

A farinha de canola pode ser qualquerfarinha de canola resultante da remoção de óleo de canolada semente oleaginosa de canola com níveis variantes deproteína não desnaturada, resultando, por exemplo, demétodos de extração com hexano a quente ou de métodos deextrusão de óleo a frio. A remoção de óleo de canola dasemente oleaginosa de canola é freqüentemente efetuada comouma operação separada do procedimento de recuperação doisolado de proteína descrito aqui.

A solubilização da proteína, em um aspecto da presenteinvenção, é efetuada mais eficientemente utilizando-se umasolução salina de grau alimentar uma vez que a presença dosal melhora a remoção de proteína solúvel da farinha desemente oleaginosa. Onde o isolado de proteína de canola éobjetivado para usos não alimentícios, produtos químicos degrau não alimentar podem ser usados. 0 sal freqüentemente écloreto de sódio, embora outros sais, tal como, cloreto depotássio, possam ser usados. A solução de sal possui umaforça iônica de pelo menos cerca de 0,05, preferivelmentede pelo menos cerca de 0,10, até cerca de 0,2, parapermitir que a solubilização de quantidades significativasde proteína seja efetuada. À medida que a força iônica dasolução de sal aumenta, o grau de solubilização da proteínana farinha de semente oleaginosa aumenta inicialmente atéque um valor máximo seja alcançado. Qualquer aumentosubseqüente na força iônica não aumenta a proteína totalsolubilizada. A força iônica da solução de sal de graualimentar que causa a máxima solubilização de proteínavaria dependendo do sal participante e da farinha desemente oleaginosa escolhida.

A extração da farinha de semente oleaginosa de canola,neste aspecto da presente invenção, é efetuada a umatemperatura elevada, geralmente a uma temperatura de cercade 70°C a cerca de 100°C, preferivelmente de cerca de 80°Ca cerca de 95°C, para causar a extração preferencial daproteína de canola 2S da farinha de semente oleaginosa nasolução do extrato de proteína, em vez das proteínas 7S e12S.

A solução de sal grau alimenta aquosa geralmentepossui um pH de cerca de 5 a cerca de 6,8, pref erivelmentede cerca de 5,3 a cerca de 6,2. O pH da solução salina podeser ajustado a qualquer valor desejado dentro da faixa decerca de 5 a cerca de 6,8 para uso na etapa de extraçãopelo uso de qualquer ácido conveniente, freqüentementeácido hidroclórico, ou álcali, freqüentemente hidróxido desódio, conforme solicitado.

A concentração da farinha de semente oleaginosa decanola na solução salina de grau alimentar durante a etapade solubilização pode variar amplamente. Valores deconcentração típicos são de cerca de 5 a cerca de 15% p/v.

A solução de proteína resultante da etapa de extraçãogeralmente possui uma concentração de proteína de cerca de1 a cerca de 40 g/L, preferivelmente de cerca de 10 a cercade 20 g/L.

A solução de proteína geralmente possui um perfil deproteína de canola que é:

de cerca de 80 a cerca de 100% em peso de proteína 2S,de 0 a cerca de 10% em peso de proteína 7S, ede 0 a cerca de 10% em peso de proteína 12S,pref erivelmente de 85 a cerca de 100% em peso deproteína 2S,

de 0 a cerca de 15% em peso de proteína 7S, ede 0 a cerca de 5% em peso de proteína 12S.A solução salina aquosa pode conter um antioxidante. 0antioxidante pode ser qualquer antioxidante conveniente,tal como sulfito de sódio ou ácido ascórbico. A quantidadede antioxidante empregada pode variar de cerca de 0,01 acerca de 1% em peso da solução, pref erivelmente cerca de0,05% em peso. O antioxidante serve para inibir a oxidaçãodos compostos fenólicos na solução de proteína.

A fase aquosa resultante da etapa de extração podeentão ser separada da farinha de canola residual, dequalquer maneira conveniente, tal como se empregando umacentrifuga de decantação, seguida por centrifugação a discoe/ou filtração para remover a farinha residual. A farinharesidual separada pode ser seca para descarte.

A cor do isolado de proteína de canola final pode sermelhorada em termos de cor clara e amarelo menos intensomisturando-se o carvão ativo em pó ou outro agente deadsorção de pigmento com a solução de proteína aquosaseparada e subseqüentemente removendo-se o adsorvente, deforma conveniente por filtração, para fornecer uma soluçãode proteína. A diafiltração pode também ser usada pararemoção de pigmento.

Tal etapa de remoção de pigmento pode ser executadasob quaisquer condições convenientes, geralmente àtemperatura ambiente da solução de proteína aquosaseparada, empregando-se qualquer agente de adsorção depigmento adequado. Para o carvão ativo em pó, umaquantidade de cerca de 0,025% a cerca de 5% p/v,preferivelmente cerca de 0,05% a cerca de 2% p/v, éempregada.

Onde a farinha de semente de canola contém quantidadessignificantes de gordura, conforme descrito nas PatentesU.S. de números 5.844.086 e 6.005.076, cedidas aocessionário desta e cujas divulgações estão aquiincorporadas por referência, então as etapas de retirada degordura descritas nesta podem ser efetuadas na solução deproteína aquosa separada e na solução de proteína aquosaconcentrada discutida abaixo. Quando a etapa demelhoramento de cor é executada, tal etapa pode serefetuada após a primeira etapa de retirada de gordura.A solução do extrato de proteína aquosa é processadapara recuperar o isolado de proteína de canola a partirdesta. 0 isolado de proteína de canola produzido aquipossui um conteúdo de proteína de pelo menos cerca de 90%em peso (Ν χ 6,25), preferivelmente pelo menos cerca de100% em peso, e consiste predominantemente de proteína 2S.

Em tal processamento, a solução de extrato de proteínapode ser concentrada para aumentar a concentração deproteína desta. Tal concentração é efetuada usando-sequalquer técnica de membrana seletiva conveniente, tal comoultrafiltração, usando membranas com um corte de pesomolecular adequado permitindo espécies de baixo pesomolecular, incluindo o sal e outros materiais de baixo pesomolecular não proteináceos extraídos do material fonte deproteína, para passar através da membrana, enquanto retém aproteína de canola na solução. Membranas de ultrafiltraçãopossuindo um corte de peso molecular de cerca de 3.000 a100.000 Da, preferivelmente de cerca de 5.000 a cerca de10.000 Da, com referência aos materiais de membrana econfigurações diferentes, podem ser usadas. A concentraçãoda solução do extrato de proteína nesta forma também reduzo volume de líquido exigido a ser seco para recuperar aproteína. A solução do extrato de proteína geralmente éconcentrada a uma concentração de proteína de pelo menos 50g/L, preferivelmente de cerca de 100 a cerca de 400 g/L,mais preferivelmente de cerca de 200 a cerca de 300 g/L.Tal operação de concentração pode ser executada em bateladaou em uma operação contínua.

Como é bem conhecido, a ultrafiltração e técnicas demembrana seletiva similares permitem que espécies de baixopeso molecular passem através enquanto impede que espéciesde peso molecular maior o façam. As espécies de baixo pesomolecular não incluem apenas as espécies iônicas do sal degrau alimentar mas também os materiais de baixo pesomolecular extraídos do material de fonte, tais comocarboidratos, pigmentos e fatores anti-nutricionais. 0corte de peso molecular da membrana é freqüentementeescolhido para assegurar a retenção de uma proporçãosignificante da proteína na solução, enquanto permite queos contaminantes passem, levando-se em consideração osdiferentes materiais de membrana e configurações.

A solução do extrato de proteína concentrada podeentão ser sujeitada a uma etapa de diafiltração usando-seágua. Tal diafiltração pode ser efetuada usando-se de cercade 2 a cerca de 20 volumes de solução de diafiltração,preferivelmente de cerca de 5 a cerca de 10 volumes desolução de diafiltração. Na operação de diafiltração,quantidades adicionais de contaminantes são removidas dasolução do extrato de proteína aquosa pela passagem atravésda membrana com o permeato. A operação de diafiltração podeser efetuada até que nenhuma quantidade adicionalsignificante de compostos fenólicos e coloração visívelesteja presente no permeato. Tal diafiltração pode serefetuada usando-se a mesma membrana da etapa deconcentração. Entretanto, se desejado, a diafiltração podeser efetuada usando-se uma membrana separada, tal como umamembrana que possua um corte de peso molecular na faixa decerca de 3.000 a cerca de 100.000 Da, preferivelmente decerca de 5.000 a cerca de 10.000 Da, com relação adiferentes materiais da membrana e configuração.Um antioxidante pode estar presente no meio dediafiltração durante pelo menos parte da etapa dediafiltração. 0 antioxidante pode ser qualquer antioxidanteconveniente, tal como sulfito de sódio ou ácido ascórbico.

A quantidade de antioxidante empregada no meio dediafiltração depende dos materiais empregados e pode variarde cerca de 0,01 a cerca de 1% em peso, preferivelmentecerca de 0,05% em peso. O antioxidante serve para inibir aoxidação dos compostos fenólicos presentes na solução doextrato de proteína concentrada.

A etapa de concentração e a etapa de diafiltraçãopodem ser efetuadas a qualquer temperatura conveniente,geralmente cerca de 200C a cerca de 60°C, preferivelmentede cerca de 200C a cerca de 30°C, e' pelo período de tempopara efetuar o grau desejado de concentração. A temperaturae outras condições usadas a algum grau dependem doequipamento de membrana usado para efetuar a concentração eda concentração de proteína desejada da solução.

A solução de proteína concentrada e opcionalmentediafiltrada pode ser sujeitada a uma operação de remoção degordura adicional, se desejado, conforme descrito nasPatentes U.S. de números 5.844.086 e 6.005.076.

A solução de proteína concentrada e opcionalmentediafiltrada pode ser sujeitada a uma operação de remoção decor como uma alternativa à operação de remoção de cordescrita acima. Carvão ativo em pó pode ser usado aquiassim como carvão ativo granulado (GAC). Um outro materialque pode ser usado como um agente de absorção de cor é apolivinil pirrolidona.

A etapa de tratamento com o agente de absorção de corpode ser executada sob quaisquer condições convenientes,geralmente à temperatura ambiente da solução de proteína decanola. Para o carvão ativo em pó, uma quantidade de cercade 0,025% a cerca de 5% p/v, preferivelmente cerca de 0,05% a cerca de 2% p/v, pode ser usada. Onde a polivinilpirrolidona é usada como o agente de absorção de cor, umaquantidade de cerca de 0,5% a cerca de 5% p/v,preferivelmente cerca de 2% a cerca de 3% p/v, pode serusada. O agente de absorção de cor pode ser removido dasolução de proteína de canola por qualquer meioconveniente, tal como por filtração.

Se desejado, a solução de proteína aquosa concentradae opcionalmente diafiltrada pode ser sujeitada a uma etapade tratamento a quente para reduzir a quantidade deproteínas 7S e 12S presente na solução. Tal tratamento aquente pode ser efetuado usando-se um perfil de temperaturae tempo suficiente para diminuir a proporção de 7S e 12Spresente na solução, preferivelmente para reduzir aproporção de proteínas 7S e 12S a um grau significante. Emgeral, o conteúdo de proteína 7S e 12S da solução éreduzido em pelo menos cerca de 50% em peso,preferivelmente pelo menos cerca de 75% em peso, pelotratamento a quente. Geralmente, o tratamento a quente podeser efetuado a uma temperatura de cerca de 700C a cerca de100°C, preferivelmente de cerca de 750C a cerca de 95°C,por cerca de 2 a cerca de 3 0 minutos, preferivelmente cercade 5 a cerca de 15 minutos. As proteínas 7S e 12Sprecipitadas podem ser removidas e recuperadas de qualquermaneira conveniente, tal como por centrifugação oufiltração.A solução de proteína aquosa concentrada eopcionalmente diafiltrada e opcionalmente tratada a quentepode ser seca por qualquer técnica conveniente, tal comosecagem por pulverização ou Iiofilização, a uma forma secapara fornecer um isolado de proteína de canola seco queconsiste predominantemente de proteína de canola 2S e quepossui um conteúdo de proteína de pelo menos cerca de 90%em peso (Ν χ 6,25), pref erivelmente pelo menos 100% empeso.

(b) Aspecto Utilizando Extrações Múltiplas da Farinhade Semente Oleaginosa de Canola

A etapa inicial do processo de fornecimento dosisolados de proteína de canola envolve a solubilização domaterial proteináceo da farinha de semente oleaginosa decanola. 0 material proteináceo recuperado da farinha desemente oleaginosa pode ser a proteína que ocorrenaturalmente na semente de canola ou o material proteináceopode ser uma proteína modificada por manipulação genéticamas possuindo características hidrofóbicas e propriedadespolares da proteína natural. A farinha de canola pode serqualquer farinha de canola resultante da remoção de óleo decanola da semente oleaginosa de canola com níveis variantesde proteína não desnaturada, resultante, por exemplo, demétodos de extração com hexano a quente ou de métodos deextrusão de óleo a frio. A remoção de óleo de canola dasemente oleaginosa de canola é freqüentemente efetuada comouma operação separada do procedimento de recuperação doisolado de proteína descrito aqui.

A solubilização da proteína neste aspecto da presenteinvenção é efetuada em múltiplas etapas. Em uma primeiraetapa, água é empregada como o meio de extração, quepreferivelmente extrai as proteínas de canola 7S e 12S dafarinha de semente oleaginosa de canola em vez da proteínade canola 2 S junto com as proporções de tamanhoconsiderável das impurezas solúveis. A etapa de extraçãocom água pode ser efetuada como uma única extração com águada farinha de semente oleaginosa de canola ou múltiplasextrações com água da farinha de semente oleaginosa decanola, tal como de cerca de 2 a cerca de 25 extrações,preferivelmente de cerca de 2 a cerca de 4 extrações.

A solução aquosa de proteínas 7S e 12S pode serprocessada de qualquer maneira desejada para se recuperaras proteínas 7 S e 12S como um isolado de proteína decanola. Por exemplo, a solução de proteína aquosa, após aadição de solução salina, pode ser sujeitada às etapas deconcentração e de formação de micelas conforme descrito noPedido de Patente U.S. supracitado de número 10/13 7.3 91.

A extração da farinha de semente oleaginosa de canolausando-se água pode ser efetuada a uma temperatura de cercade 10°C a cerca de 70°C, preferivelmente de cerca de 55°C acerca de 65°C. A concentração da farinha de sementeoleaginosa de canola na água durante a etapa desolubilização pode variar amplamente. Valores deconcentração típicos são de cerca de 5 a cerca de 15 % p/v.

A solução de proteína resultante da etapa de extraçãoaquosa geralmente possui uma concentração de proteína decerca de 10 a cerca de 40 g/L, pref erivelmente de cerca de10 a cerca de 25 g/L.

Na segunda etapa de solubilização, a farinha desemente oleaginosa de canola residual da(s) extração(ões)com água é extraída com uma solução salina aquosa queresulta em uma solução de extração de proteína de canolaaquosa contendo, em sua maior parte, proteína de canola 2S,menores quantidades de proteínas de canola 7S e 12S e umbaixo nível de impurezas. 0 sal freqüentemente é cloreto desódio, embora outros sais, tal como, cloreto de sódio,possam ser usados. Uma solução de sal de grau alimentageralmente é usada, mas onde o isolado de proteína decanola é objetivado para usos não alimentícios, produtosquímicos de grau não alimentar podem ser usados.

A solução salina aquosa usada na segunda etapa desolubilização geralmente possui uma força iônica de pelomenos cerca de 0,05, preferivelmente pelo menos cerca de0,1, geralmente até cerca de 0,5.

A solução salina de grau alimentar aquosa geralmentepossui um pH de cerca de 5 a cerca de 6,8 pref erivelmentede cerca de 5,3 a cerca de 6,2, o pH da solução salina podeser ajustado a qualquer valor desejado dentro da faixa decerca de 5 a cerca de 6,8 para uso na etapa de extraçãopelo uso de qualquer ácido conveniente, freqüentementeácido hidroclórico, ou álcali, freqüentemente hidróxido desódio, conforme solicitado.

A extração da farinha de semente oleaginosa de canolacitada acima com a solução salina de grau alimentar égeralmente executada a uma temperatura de cerca de 50C acerca de 65°C, preferivelmente cerca de 20°C a cerca de30°C. A concentração da farinha de semente oleaginosa decanola na solução salina de grau alimentar durante a etapade solubilização pode variar amplamente, geralmente cercade 5 a cerca de 15% p/v.A solução de proteína resultante da etapa de extraçãosalina geralmente possui uma concentração de proteína decerca de 1 a cerca de 4 0 g/L, preferivelmente de cerca de 5a cerca de 20 g/L.

A solução de proteína aquosa resultante dasolubilização salina da farinha de semente oleaginosageralmente possui um perfil de proteína de canola que é:

de 0 a cerca de 15% em peso de proteína 7S, ede 0 a cerca de 5% em peso de proteína 12S.A solução salina aquosa pode conter um antioxidante. Oantioxidante pode ser qualquer antioxidante conveniente,tal como sulfito de sódio ou ácido ascórbico. A quantidadede antioxidante empregada pode variar de cerca de 0,01 acerca de 1% em peso da solução, pref erivelmente cerca de0,05% em peso. O antioxidante serve para inibir a oxidaçãodos compostos fenólicos na solução de proteína.

A fase aquosa resultante da etapa de extração podeentão ser separada da farinha de canola residual, dequalquer maneira conveniente, tal como se empregando umacentrífuga de decantação, seguida por centrifugação a discoe/ou filtração para remover a farinha residual. A farinharesidual separada pode ser seca para descarte.

Tal etapa de remoção de pigmento pode ser executadasob quaisquer condições convenientes, geralmente àtemperatura ambiente da solução de proteína aquosaseparada, empregando-se qualquer agente de adsorção depigmento adequado. Para o carvão ativo em pó, umaquantidade de cerca de 0,025% a cerca de 5% p/v,pref erivelmente cerca de 0,05% a cerca de 2% p/v, éempregada.

A solução de proteína de canola aquosa pode serprocessada para se recuperar o isolado de proteína decanola possuindo uma concentração de proteína de pelo menoscerca de 90% em peso (Ν χ 6,25), preferivelmente pelo menoscerca de 100% em peso, e consistindo predominantemente deproteína 2S.

A solução do extrato de proteína concentrada podeentão ser sujeitada a uma etapa de diafiltração usando-seágua. Tal diafiltração pode ser efetuada usando-se de cercade 2 a cerca de 20 volumes de solução de diafiltração,preferivelmente de cerca de 5 a cerca de 10 volumes desolução de diafiltração. Na operação de diafiltração,quantidades adicionais de contaminantes são removidas dasolução do extrato de proteína aquosa pela passagem atravésda membrana com o permeato. A operação de diafiltração podeser efetuada até que nenhuma quantidade adicionalsignificante de compostos fenólicos e coloração visívelestejam presentes no permeato. Tal diafiltração pode serefetuada usando-se a mesma membrana da etapa deconcentração. Entretanto, se desejado, a diafiltração podeser efetuada usando-se uma membrana separada, tal como umamembrana que possua um corte de peso molecular na faixa decerca de 3.000 a cerca de 100.000 Da, preferivelmente decerca de 5.000 a cerca de 10.000 Da, com relação adiferentes materiais da membrana e configuração.Um antioxidante pode estar presente no meio dediafiltração durante pelo menos parte da etapa dediafiltração. 0 antioxidante pode ser qualquer antioxidanteconveniente, tal como sulfito de sódio ou ácido ascõrbico.

A etapa de concentração e a etapa de diafiltraçãopodem ser efetuadas a qualquer temperatura conveniente,geralmente cerca de 200C a cerca de 60°C, preferivelmentede cerca de 20 a cerca de 30°C, e pelo período de tempopara efetuar o grau desejado de concentração. A temperaturae outras condições usadas a algum grau dependem doequipamento de membrana usado para efetuar a concentração eda concentração de proteína desejada da solução.

Se desejado, a solução de proteína aquosa concentradae opcionalmente diafiltrada pode ser sujeitada a uma etapade tratamento a quente para reduzir a quantidade deproteínas 7S e 12S presente na solução. Tal tratamento aquente pode ser efetuado usando-se um perfil de temperaturae tempo suficiente para diminuir a proporção de 7S e 12Spresente na solução, preferivelmente para reduzir aproporção de proteína 7S a um grau significante. Em geral,o conteúdo de proteína 7S da solução é reduzido em pelomenos cerca de 50% em peso, pref erivelmente pelo menoscerca de 75% em peso, pelo tratamento a quente. Geralmente,o tratamento a quente pode ser efetuado a uma temperaturade cerca de 70°C a cerca de 100°C, preferivelmente de cercade 750C a cerca de 95°C, por cerca de 2 a cerca de 3 0minutos, preferivelmente cerca de 5 a cerca de 15 minutos.As proteínas 7S e 12S precipitadas podem ser removidas dequalquer maneira conveniente, tal como por centrifugação oufiltração.

A solução de proteína aquosa concentrada eopcionalmente diafiltrada e opcionalmente tratada a quentepode ser seca por qualquer técnica conveniente, tal comosecagem por pulverização ou Iiofilização, a uma forma secapara fornecer um isolado de proteína de canola seco queconsiste predominantemente de proteína de canola 2S e quepossui um conteúdo de proteína de pelo menos cerca de 90%em peso, preferivelmente pelo menos 100% em peso.

(c) Aspecto Utilizando Tratamento a Quente deRetentato de Ultrafiltração

A etapa inicial do processo de fornecimento dosisolados de proteína de canola envolve a solubilização domaterial proteináceo da farinha de semente oleaginosa decanola. 0 material proteináceo recuperado da farinha desemente oleaginosa pode ser a proteína que ocorrenaturalmente na semente de canola ou o material proteináceopode ser uma proteína modificada por manipulação genéticamas possuindo características hidrofóbicas e propriedadespolares da proteína natural. A farinha de canola pode serqualquer farinha de canola resultante da remoção de óleo decanola da semente oleaginosa de canola com níveis variantesde proteína não desnaturada, resultando, por exemplo, demétodos de extração com hexano a quente ou de métodos deextrusão de óleo a frio. A remoção de óleo de canola dasemente oleaginosa de canola é freqüentemente efetuada comouma operação separada do procedimento de recuperação doisolado de proteína descrito aqui.

A solubilização da proteína é efetuada maiseficientemente utilizando-se uma solução salina de graualimentar uma vez que a presença do sal melhora a remoçãode proteína solúvel da farinha de semente oleaginosa. Ondeo isolado de proteína de canola é objetivado para usos nãoalimentícios, produtos químicos de grau não alimentar podemser usados. 0 sal freqüentemente é cloreto de sódio, emboraoutros sais, tal como, cloreto de potássio, possam serusados. A solução de sal possui uma força iônica de pelomenos cerca de 0,05, preferivelmente de pelo menos cerca de0,10, até cerca de 0,2, para permitir que a solubilizaçãode quantidades significativas de proteína seja efetuada. Àmedida que a força iônica da solução de sal aumenta, o graude solubilização da proteína na farinha de sementeoleaginosa aumenta inicialmente até que um valor máximoseja alcançado. Qualquer aumento subseqüente na forçaiônica não aumenta a proteína total solubilizada. A forçaiônica da solução de sal de grau alimentar que causa amáxima solubilização de proteína varia dependendo do salparticipante e da farinha de semente oleaginosa escolhida.

Em um processo em batelada, a solubilização de sal daproteína é efetuada a uma temperatura de pelo menos cercade 5°C preferivelmente de até cerca de 35°C,preferivelmente acompanhada pela agitação para diminuir otempo de solubilização, que é freqüentemente de cerca de 10a cerca de 60 minutos. É preferido efetuar a solubilizaçãopara extrair substancialmente o máximo praticável deproteína da farinha de semente oleaginosa, de modo afornecer um alto rendimento de produto total.

O limite de temperatura inferior de cerca de 50C éescolhido uma vez que a solubilização é de formaimpraticável lenta abaixo desta temperatura enquanto olimite de temperatura superior preferido de cerca de 350C éescolhido uma vez que o processo torna-se dispendioso aníveis maiores de temperatura em um modo descontínuo.

Em um processo contínuo, a extração da proteína apartir da farinha de semente oleaginosa de canola éexecutada de qualquer maneira consistente com a realizaçãode uma extração contínua da proteína a partir da farinha desemente oleaginosa de canola. Em uma modalidade, a farinhade semente oleaginosa de canola é continuamente misturadacom uma solução de sal e a mistura é conduzida por umatubulação ou conduíte possuindo um comprimento e a uma taxade fluxo por um tempo de permanência suficiente paraefetuar a extração desejada de acordo com os parâmetrosdescritos aqui. Em tal procedimento contínuo, a etapa desolubilização do sal é efetuada rapidamente, em um tempo deaté cerca de 10 minutos, preferivelmente para efetuar asolubilização para extrair substancialmente o máximo deproteína praticável da farinha de semente oleaginosa decanola. A solubilização no procedimento contínuo épreferivelmente efetuada a temperaturas elevadas,preferivelmente acima de cerca de 35°C, geralmente atécerca de 65°C.

A solução salina aquosa e a farinha de sementeoleaginosa de canola possuem um pH natural de cerca de 5 acerca de 6,8, valores de pH de cerca de 5,3 a cerca de 6,2são preferidos.

O pH da solução salina pode ser ajustado a qualquervalor desejado dentro da faixa de cerca de 5 a cerca de 6,8para uso na etapa de extração pelo uso de qualquer ácidoconveniente, freqüentemente ácido hidroclõrico, ou álcali,freqüentemente hidróxido de sódio, conforme solicitado.Onde o isolado de proteína de canola é objetivado para usosnão alimentícios, então os produtos químicos de grau nãoalimentar podem ser usados.

A concentração da farinha de semente oleaginosa nasolução salina durante a etapa de solubilização pode variaramplamente. Valores de concentração típicos são de cerca de5 a cerca de 15% p/v.

A etapa de extração de proteína com a solução salinaaquosa possui o efeito adicional de solubilizar as gordurasque podem estar presentes na farinha de canola, que entãoresulta nas gorduras presentes na fase aquosa.

A solução de proteína resultante da etapa de extraçãogeralmente possui uma concentração de proteína de cerca de5 a cerca de 40 g/L, preferivelmente de cerca de 10 a cercade 3 0 g/L.

A fase aquosa resultante da etapa de extração podeentão ser separa da farinha de canola residual, de qualquermaneira conveniente, tal como se empregando uma centrífugade decantação, seguida por centrifugação a disco e/oufiltração para remover a farinha residual. A farinharesidual separada pode ser seca para descarte.

A cor do isolado de proteína de canola final pode sermelhorada em termos de cor clara e amarelo menos intensomisturando-se o carvão ativo em pó ou outro agente deadsorção de pigmento com a solução de proteína aquosaseparada e subseqüentemente removendo-se o adsorvente, deforma conveniente por filtração, para fornecer uma soluçãode proteína. A diafiltração da solução de proteína aquosa,antes ou após a concentração, conforme descrito abaixo,também pode ser usada para remoção de pigmento.

Tal etapa de remoção de pigmento pode ser executadasob quaisquer condições convenientes, geralmente àtemperatura ambiente da solução de proteína aquosaseparada, empregando-se qualquer agente de adsorção depigmento adequado. Para o carvão ativo em pó, umaquantidade de cerca de 0,025% a cerca de 5% p/v,pref erivelmente cerca de 0,05% a cerca de 2 % p/v, éempregada.

Onde a farinha de semente de canola contém quantidadessignificantes de gordura, conforme descrito nas PatentesU.S. de números 5.844.086 e 6.005.076, cedidas aocessionário desta e cujas divulgações estão aquiincorporadas por referência, então as etapas de retirada degordura descritas nesta podem ser efetuadas na solução deproteína aquosa separada e na solução de proteína aquosaconcentrada discutida abaixo. Quando a etapa demelhoramento de cor é executada, tal etapa pode serefetuada após a primeira etapa de retirada de gordura.

Como uma alternativa para extrair a farinha de sementeoleaginosa com uma solução salina aquosa, tal extração podeser feita usando-se água apenas, embora a utilização deágua apenas tenda a extrair menos proteína da farinha desemente oleaginosa que a solução salina aquosa. Onde talalternativa é empregada, então o sal, nas concentraçõesdiscutidas acima, pode ser adicionado ã solução de proteínaapós a separação da farinha de semente oleaginosa adicionalresidual a fim de manter a proteína na solução durante aetapa de concentração descrita abaixo. Quando uma etapa deremoção de cor e/ou uma primeira etapa de remoção degordura é executada, o sal geralmente é adicionado após afinalização de tais operações.

A solução de extrato de proteína é concentrada paraaumentar a concentração da proteína desta. Tal concentraçãoé efetuada usando-se qualquer técnica de membrana seletivaconveniente, tal como ultrafiltração, usando membranas comum corte de peso molecular adequado permitindo espécies debaixo peso molecular, incluindo o sal e outros materiais debaixo peso molecular não proteináceos extraídos do materialfonte de proteína, para passar através da membrana,enquanto retém a proteína de canola na solução. Membranasde ultrafiltração possuindo um corte de peso molecular decerca de 3.000 a 100.000 Da, preferivelmente de cerca de5.000 a cerca de 10.000 Da, com referência aos materiais demembrana e configurações diferentes, podem ser usadas. Aconcentração da solução do extrato de proteína nesta formatambém reduz o volume de líquido exigido a ser seco pararecuperar a proteína. A solução do extrato de proteínageralmente é concentrada a uma concentração de proteína depelo menos 50 g/L, preferivelmente de cerca de 100 a cercade 4 00 g/L, mais preferivelmente de cerca de 200 a cerca de300 g/L. Tal operação de concentração pode ser executada embatelada ou em uma operação contínua.

A solução do extrato de proteína concentrada podeentão ser sujeitada a uma etapa de diafiltração usando-seágua. Tal diafiltração pode ser efetuada usando-se de cercade 2 a cerca de 20 volumes de solução de diafiltração,pref erivelmente de cerca de 5 a cerca de 10 volumes desolução de diafiltração. Na operação de diafiltração,quantidades adicionais de contaminantes são removidas dasolução do extrato de proteína aquosa pela passagem atravésda membrana com o permeato. A operação de diafiltração podeser efetuada até que nenhuma quantidade adicionalsignificante de compostos fenólicos e coloração visívelestejam presentes no permeato. Tal diafiltração pode serefetuada usando-se a mesma membrana da etapa deconcentração. Entretanto, se desejado, a diafiltração podeser efetuada usando-se uma membrana separada, tal como umamembrana que possua um corte de peso molecular na faixa decerca de 3.000 a cerca de 100.000 Da, preferivelmente decerca de 5.000 a cerca de 10.000 Da, com relação adiferentes materiais da membrana e configuração.

Um antioxidante pode estar presente no meio dediafiltração durante pelo menos parte da etapa dediafiltração. O antioxidante pode ser qualquer antioxidanteconveniente, tal como sulfito de sódio ou ácido ascórbico.

A quantidade de antioxidante empregada no meio dediafiltração depende dos materiais empregados e pode variarde cerca de 0,01 a cerca de 1% em peso, preferivelmentecerca de 0,05% em peso. 0 antioxidante serve para inibir aoxidação dos compostos fenólicos presentes na solução doextrato de proteína concentrada.

A etapa de concentração e a etapa de diafiltraçãopodem ser efetuadas a qualquer temperatura conveniente,geralmente cerca de 200C a cerca de 60°C, preferivelmentede cerca de 20 a cerca de 3 0°C, e pelo período de tempopara efetuar o grau desejado de concentração. A temperaturae outras condições usadas a algum grau dependem doequipamento de membrana usado para efetuar a concentração eda concentração de proteína desejada da solução.

Neste aspecto da presente invenção, a solução deproteína de canola ultrafiltrada e opcionalmentediafiltrada é sujeitada a tratamento a quente paraprecipitar as proteínas 7S e 12S a partir deste e deixaruma solução de proteína de canola consistindopredominantemente de proteína 2S. Tal tratamento a quentepode ser efetuado sob as condições descritas no Pedido dePatente U.S. supracitado de número 11/038.086.

Tal tratamento a quente pode ser efetuado usando-se umperfil de temperatura e tempo suficiente para diminuir aproporção de 7S e 12S presente na solução concentrada,preferivelmente para reduzir a proporção de proteínas 7S e12S a um grau signif icante. Em geral, o conteúdo deproteína 7S e 12S da solução é reduzido em pelo menos cercade 50% em peso, preferivelmente pelo menos cerca de 75% empeso, pelo tratamento a quente. Geralmente, o tratamento aquente pode ser efetuado a uma temperatura de cerca de 700Ca cerca de IOO0C, preferivelmente de cerca de 750C a cercade 95 °C, por cerca de 2 a cerca de 3 0 minutos,preferivelmente cerca de 5 a cerca de 15 minutos. Asproteínas 7S e 12S precipitadas podem ser removidas erecuperadas de qualquer maneira conveniente, tal como porcentrifugação ou filtração.

A solução de proteína de canola resultante pode entãoser processada para recuperar o isolado de proteína decanola com predominância da proteína 2S.

O sobrenadante tratado a quente concentrado, após aremoção das proteínas 7S e 12S precipitadas, tal como porcentrifugação, pode ser seco por qualquer técnicaconveniente, tal como secagem por pulverização ouIiofilização, a uma forma seca para fornecer um isolado deproteína de canola que consiste predominantemente daproteína de canola 2S. Tal isolado de proteína de canolapossui um alto conteúdo de proteína, em excesso de cerca de90% em peso, preferivelmente pelo menos cerca de 100% empeso de proteína (calculado como N Kjeldahl χ 6,25), e ésubstancialmente não desnaturada (conforme determinado porcalorimetria de escaneamento diferencial).

(d) Aspecto Utilizando Tratamento a Quente de Soluçãode Proteína de Canola Aquosa

A solubilização da proteína é efetuada maiseficientemente utilizando-se uma solução salina de graualimentar uma vez que a presença do sal melhora a remoçãode proteína solúvel da farinha de semente oleaginosa. Ondeo isolado de proteína de canola é objetivado para usos nãoalimentícios, produtos químicos de grau não alimentar podemser usados. 0 sal freqüentemente é cloreto de sódio, emboraoutros sais, tal como, cloreto de potássio, possam serusados. A solução de sal possui uma força iônica de pelomenos cerca de 0,05, preferivelmente de pelo menos cerca de0,10, até cerca de 0,2, para permitir que a solubilizaçãode quantidades significativas de proteína seja efetuada. Àmedida que a força iônica da solução de sal aumenta, o graude solubilização da proteína na farinha de sementeoleaginosa aumenta inicialmente até que um valor máximoseja alcançado. Qualquer aumento subseqüente na forçaiônica não aumenta a proteína total solubilizada. A forçaiônica da solução de sal de grau alimentar que causa amáxima solubilização de proteína varia dependendo do salparticipante e da farinha de semente oleaginosa escolhida.Em um processo em batelada, a solubilização de sal daproteína é efetuada a uma temperatura de pelo menos cercade 5°C preferivelmente de até cerca de 35°C,preferivelmente acompanhada pela agitação para diminuir otempo de solubilização, que é freqüentemente de cerca de 10a cerca de 60 minutos. É preferido efetuar a solubilizaçãopara extrair substancialmente o máximo praticável deproteína da farinha de semente oleaginosa, de modo afornecer um alto rendimento de produto total.

O limite de temperatura inferior de cerca de 50C éescolhido uma vez que a solubilização é de formaimpraticável lenta abaixo desta temperatura enquanto olimite de temperatura superior preferido de cerca de 350C éescolhido uma vez que o processo torna-se dispendioso aníveis maiores de temperatura em um modo de batelada.

Em um processo contínuo, a extração da proteína apartir da farinha de semente oleaginosa de canola éexecutada de qualquer maneira consistente com a realizaçãode uma extração contínua da proteína a partir da farinha desemente oleaginosa de canola. Em uma modalidade, a farinhade semente oleaginosa de canola é continuamente misturadacom uma solução de sal e a mistura é conduzida através deum tubo ou conduíte possuindo um comprimento e a uma taxade fluxo por um tempo de permanência suficiente paraefetuar a extração desejada de acordo com os parâmetrosaqui descritos. Em tal procedimento contínuo, a etapa desolubilização do sal ê efetuada rapidamente, em um tempo deaté cerca de 10 minutos, preferivelmente para efetuar asolubilização para extrair substancialmente o máximo deproteína praticável da farinha de semente oleaginosa decanola. A solubilização no procedimento contínuo épreferivelmente efetuada a temperaturas elevadas,preferivelmente acima de cerca de 35°C, geralmente atécerca de 65°C.

0 pH da solução salina pode ser ajustado a qualquervalor desejado dentro da faixa de cerca de 5 a cerca de 6,8para uso na etapa de extração pelo uso de qualquer ácidoconveniente, freqüentemente ácido hidroclórico, ou álcali,freqüentemente hidróxido de sódio, conforme solicitado.Onde o isolado de proteína de canola é objetivado para usosnão alimentícios, então os produtos químicos de grau nãoalimentar podem ser usados.

A solução de proteína resultante da etapa de extraçãogeralmente possui uma concentração de proteína de cerca de5 a cerca de 40 g/L, preferivelmente de cerca de 10 a cercade 30 g/L.

Como uma alternativa para extrair a farinha de sementeoleaginosa com uma solução salina aquosa, tal extração podeser feita usando-se água apenas, embora a utilização deágua apenas tenda a extrair menos proteína da farinha desemente oleaginosa que a solução salina aquosa. Onde talalternativa é empregada, então o sal, nas concentraçõesdiscutidas acima, pode ser adicionado à solução de proteínaapós a separação da farinha de semente oleaginosa adicionalresidual a fim de manter a proteína na solução durante aetapa de concentração descrita abaixo. Quando uma etapa deremoção de cor e/ou uma primeira etapa de remoção degordura é executada, o sal geralmente é adicionado após afinalização de tais operações.

A solução de proteína de canola aquosa de acordo comeste aspecto da presente invenção, é tratada a quente paraprecipitar as proteínas 7S e 12S a partir desta e deixa umasolução de proteína de canola em que a proteína de canolaconsiste predominantemente de proteína 2S. Tal tratamento aquente pode ser efetuado sob a condição descrita no Pedidode Patente U.S. supracitado de número 11/038.086.

Tal tratamento a quente pode ser efetuado usando-se umperfil de temperatura e tempo suficiente para diminuir aproporção de 7S e 12S presente na solução concentrada,preferivelmente para reduzir a proporção de proteínas 7S e12S a um grau signif icante. Em geral, o conteúdo deproteína 7S e 12S da solução é reduzido em pelo menos cercade 50% em peso, preferivelmente pelo menos cerca de 75% empeso, pelo tratamento a quente. Geralmente, o tratamento aquente pode ser efetuado a uma temperatura de cerca de 700Ca cerca de IOO0C, preferivelmente de cerca de 75°C a cercade 95 °C, por cerca de 2 a cerca de 30 minutos,preferivelmente cerca de 5 a cerca de 15 minutos. Asproteínas 7S e 12S precipitadas podem ser removidas erecuperadas de qualquer maneira conveniente, tal como porcentrifugação ou filtração.

A solução de proteína de canola tratada a quente,após a remoção das proteínas IS e 12S precipitadas, talcomo por centrifugação, pode ser seca por qualquer técnicaconveniente, tal como secagem por pulverização ouIiofilização, a uma forma seca para fornecer um isolado deproteína de canola consistindo predominantemente daproteína de canola 2S.

Alternativamente, a solução de proteína de canolatratada a quente pode ser sujeitada a etapas deconcentração, diafiltração e remoção de cores descritasacima com relação a (a), antes da secagem.

0 isolado de proteína de canola possui um altoconteúdo de proteína, em excesso de cerca de 90% em peso,preferivelmente pelo menos cerca de 100% em peso deproteína (calculado como N Kjeldahl χ 6,25), e ésubstancialmente não desnaturada (conforme determinado porcalorimetria de escaneamento por difusão).

Os isolados de proteína de canola fornecidos aquicontinham uma alta proporção de proteína 2S,preferivelmente pelo menos cerca de 90% em peso e maispreferivelmente pelo menos cerca de 95% em peso, dasproteínas de canola nos isolados, e são substancialmentelivres das proteínas 7S e 12S.

ExemplosExemplo 1:

Este exemplo ilustra o efeito de temperatura elevadade extração de proteína de farinha de semente oleaginosa decanola no perfil de proteínas de canola na solução deextrato.

Amostras de 15g de farinha de semente oleaginosa decanola cujo solvente foi retirado a vácuo (37,15% deproteína) foram adicionadas a amostras de 150 mL de água deosmose reversa (RO), uma solução aquosa de NaCl 0,1 M, umasolução aquosa de NaCl 0,15 M, uma solução aquosa de NaCl0,2 M, uma solução aquosa de NaCl 0,25 M e uma soluçãoaquosa de NaCl 0,5 M, respectivamente a uma temperaturaambiente de 85°C. As misturas foram agitadas por 5 minutosenquanto a temperatura foi mantida utilizando uma placaaquecida/agitador.

Os extratos foram centrifugados por 10 minutos a10.000 rpm e depois filtrados através de um filtro de papelcanelado de 25 μπι. 0 filtrado foi adicionalmente filtradoatravés de um filtro de seringa de 0,45 pm.

Os extratos filtrados foram analisados quanto aconteúdo de proteína (utilizando um Determinador deNitrogênio LECO P528), cor e perfil de proteína(utilizando-se um HPLC SEC analítico ioSep 2000 e colunaS3000)

O experimento foi repetido utilizando-se uma extraçãopor solução de NaCl 0,1 Ma temperatura ambiente como umcontrole para finalidade de comparação. Os resultadosobtidos estão expostos nas seguintes Tabelas 1 e 2:

Tabela 1 - Extratos de Farinha a 850C Comparados a umExtrato Ambiente<table>table see original document page 44</column></row><table>

Tabela 2: Perfil de Proteína das Extrações

<table>table see original document page 44</column></row><table><table>table see original document page 45</column></row><table>

Conforme pode ser visto a partir dos resultadosapresentados na Tabela 1, a utilização de uma temperaturaelevada de extração não parece influenciar a cordeterminada em A330 (fenólicos) e A390 (cor), indicando quenenhuma oxidação adicional dos fenólicos ocorre às elevadastemperaturas.

A capacidade de extração aparente da água RO a 85°Cfoi substancialmente mais baixa que as extrações salinas,indicando que a presença de sal durante a etapa de extraçãomelhora de forma benéfica a capacidade de extração mesmo atemperaturas elevadas.

A capacidade de extração aparente das extraçõessalinas a alta temperatura está em média cerca de 32%,menos que a extração realizada a temperatura ambiente mas,como pode ser visto na Tabela 2, a maioria da proteínaextraída a temperatura elevada é a proteína 2S.

Exemplo 2:

Este exemplo expõe uma série de experimentos de umprocedimento para o processamento de óleo de farinha desemente oleaginosa de canola utilizando um procedimento deextração dupla.

Um conjunto de experimentos foi executado, onde afarinha de semente oleaginosa de canola aquosa foiinicialmente extraída com água e subseqüentemente comsolução salina aquosa. Os resultados de tais séries deexperimentos são aqui expostos.

(a) Experimento 1

15 g de farinha de semente oleaginosa de canola (loteA) foram extraídos a 60°C e 10% p/v com 150 mL de água pré-aquecida a 65°C e adicionados à semente. 0 último extratofoi subtraído da farinha usada por centrifugação a 10.000 gpor 10 minutos e após a separação do sobrenadante, o pesoda farinha úmida (3 7 g) e água coloidal (22 g) na pelotafoi determinado. Foi adicionado NaCl 0,25 M suficiente (128mL) para trazer a concentração de volta a 10% p/v e aamostra foi misturada com um agitador superior por 3 0minutos a 220 rpm à temperatura ambiente. O extrato salinofoi separado da farinha usada por centrifugação a 10.000 gpor 10 minutos. As amostras do extrato de água clarificadae extrato salino foram filtradas com um filtro de tamanhode poro de 0,45 μιη e as amostras analisadas quanto afenólicos livres (A33 0), cor visível (A3 90) , conteúdo deproteína (LECO) e perfil de proteína (SEC HPLC). O perfilde proteína do extrato de água foi também re-analisadodepois de armazenado durante a noite no refrigerador paraprecipitar proteína 7S.

Embora mais baixo em conteúdo protéico, o extratosalino secundário era claramente mais cristalino e menoscolorido que o extrato de água inicial (Tabela 3).

Tabela 3 - Resultados analíticos para extratos de água esalino

<table>table see original document page 46</column></row><table><table>table see original document page 47</column></row><table>

A extração de água inicial favoreceu a solubilizaçãode proteína 7S, enquanto a extração salina secundáriasolubilizou a maioria da proteína 2S (Tabela 4). Resfriar oextrato de água durante a noite fez com que uma grandeproporção das proteínas 7S e 12S precipitasse.

Tabela 4 - Perfis de proteína de várias amostras

<table>table see original document page 47</column></row><table>

150 g de farinha de semente oleaginosa de canola (loteA) foram extraídos a 60°C e 10% p/v com 1.500 mL de águapor 5 minutos com um agitador superior. O extrato de águafoi separado da farinha gasta por centrifugação a 7.100 gpor 10 minutos e o peso da farinha úmida (392 g) e águacoloidal (242 g) na pelota foi determinado. Foi adicionadoNaCl 0,2 M suficiente (1.258 mL) para trazer a concentraçãode volta a 10% p/v e a amostra foi misturada com umagitador superior por 3 0 minutos à temperatura ambiente. 0extrato salino foi separado da farinha usada porcentrifugação a 7.100 g por 10 minutos e depois filtradopor duas passadas através de absorventes de papel de filtronúmero 3. 0 extrato salino clarificado foi então processadoutilizando-se duas unidades de membranas Vivaflow HY de10.000 MWCO (celulose estabilizadora) unidas em paralelo. 0extrato foi concentrado e depois diafiltrado com 5 volumesde água purificada pro osmose reversa (RO) . A adição deágua de diafiltração resultou na geração de um precipitadoque foi removido por centrifugação a 7.100 g por 10 minutosantes da re-concentração. 0 retentato de diafiltração foitratado com calor a 850C por 10 minutos para precipitar 7Se 12S, as quais foram removidas pro centrifugação a 8.000 gpor 15 minutos. O concentrado foi então liofilizado erecebeu a designação "C200H".

O extrato de água foi resfriado durante a noite a 40Ce depois o precipitado foi coletado por centrifugação a7.100 g por 15 minutos a 5°C. Os sólidos coletados foramentão Iiofilizados.

Várias amostras foram analisadas quanto a fenólicoslivres (A33 0), cor visível (A3 90), conteúdo de proteína(LECO) e perfil de proteína (SEC HPLC). Os produtos finaisforam analisados quanto à cor seca utilizando-se umcolorímetro Minolta e soluções foram também preparadas paraanálise de cor. Proteína em pó (0,7 g) foi combinada a NaCl0,1 M ou água (10 mL) utilizando-se um misturador comvórtice. A amostra foi então centrifugara a 8.000 g por 10minutos e o conteúdo de proteína do sobrenadantedeterminado por LECO. Uma alíquota (8 mL) do sobrenadantefoi transferida a um bécher pequeno e adicionou-se soluçãosalina ou água suficiente para ajustar o conteúdo deproteína para 5%.

Como no Experimento 1, o extrato salino secundário eramais cristalino e menos colorido que o extrato de águainicial (Tabela 5) . Resfriando o extrato de água inicialfez com que mais da metade da proteína total precipitasse.

Tabela 5 - Resultados analíticos para extratos de água esalino

<table>table see original document page 49</column></row><table>

Novamente a extração de água inicial favoreceu asolubilização de proteína 7S, enquanto a extração salinasecundária solubilizou a maioria da proteína 2S (Tabela 6).

Tratar por aquecimento o retentato de diafiltração (DF)removeu com sucesso a maioria da proteína 7S e 12Srestante. Resfriar o extrato de água durante a noite fezcom que uma grande proporção das proteínas 7S e 12Sprecipitasse.

Tabela 6 - Perfis de proteína de várias amostras

<table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table>

A "C200H" formada neste experimento possuía uma boacor seca e cor úmida aceitável (Tabela 7) . O conteúdo deproteína do pó (base úmida) era de 93,90% em peso,confirmando que a amostra era um isolado. O precipitadofrio 7S/12S era um pó amarelo bastante escuro mas possuíauma cor úmida aceitável. Apesar da cor relativamente escurado produto de 7S/12S precipitado, a pureza do produto eramuito alta quando testada por LECO. 0 conteúdo de proteínadesta amostra (base úmida) foi determinado como sendo de103,49% em peso. Análise cromatográfica da amostra de corúmida de precipitado de 7S/12S mostrou contaminação comárea de pico de proteína de menos de 4% devido a proteína2S e uma área de pico de não-proteína de cerca de 25%. Estaé uma concentração bastante baixa de contaminantesconsiderando-se que nenhuma etapa de purificação foiexecutada que não a precipitação.

Tabela 7 - Cor seca do produto final do Experimento 2

<table>table see original document page 50</column></row><table>(c) Experimento 3

150 g de farinha de semente oleaginosa de canola (loteA) foram extraídos a 10% p/v com 1.500 mL de água Àtemperatura ambiente por 30 minutos com um agitadorsuperior. O extrato de água foi separado da farinha gastapor centrifugação a 7.100 g por 10 minutos e o peso dafarinha úmida (366 g) e água coloidal (216 g) foideterminado. Foi adicionado NaCl 0,2 M suficiente (1.284mL) para trazer a concentração de volta a 10% p/v e aamostra foi misturada com um agitador superior por 30minutos à temperatura ambiente. O extrato salino foiseparado da farinha usada por centrifugação a 7.100 g por10 minutos e depois filtrado por duas passadas através deabsorventes de papel de filtro número 3. O extrato salinoclarificado foi então processado utilizando-se duasunidades de membranas Vivaflow HY de 10.000 MWCO unidas emparalelo. 0 extrato foi concentrado e depois diafiltradocom 5 volumes de água purificada pro osmose reversa (RO). Aadição de água de diafiltração resultou na geração de umprecipitado que foi removido por centrifugação a 7.100 gpor 10 minutos antes da re-concentração. O retentato dediafiltração foi tratado com calor a 850C por 10 minutospara precipitar proteínas 7S e 12S, as quais foramremovidas por centrifugação a 8.000 g por 15 minutos. 0centrifugado foi então liofilizado e recebeu a designação"C200H - solução salina".

O extrato de água foi resfriado durante a noite a 40Ce depois o precipitado foi coletado por centrifugação a7.100 g por 15 minutos a 5°C. Os sólidos coletados foramentão Iiofilizados. O sobrenadante foi filtrado utilizando-se absorventes de filtro número 3 e então processadoutilizando-se duas unidades de membrana Vivaflow HY de10.000 MWCO unidas em paralelo. 0 extrato foi concentrado edepois diafiltrado com 5 volumes de água purificada porosmose reversa (RO) . A adição de água de diafiltraçãoresultou na geração de um precipitado que foi removido porcentrifugação a 7.100 g por 10 minutos antes da re-concentração. 0 retentato de diafiltração foi tratado comcalor a 850C por 10 minutos para precipitar proteínas 7S e12S, as quais foram removidas por centrifugação a 8.000 gpor 15 minutos. 0 centrifugado foi então liofilizado erecebeu a designação "C200H - água". Várias amostras foramanalisadas conforme detalhado no Experimento 2.

Como no experimento anterior, o extrato salinosecundário era mais cristalino e menos colorido que oextrato de água inicial (Tabela 8) . Entretanto, o suo deágua à temperatura ambiente ao invés de água aquecidasolubilizou menos nitrogênio e ligeiramente menoscontaminantes. Este extrato de água possuía muito mais corque os extratos de água quente, de acordo com a leituraA390. Resfriar o extrato de água precipitou menos proteínado que quando o extrato a 600C foi resfriado no Experimento 2.

Tabela 8 - Resultados analíticos para extratos de água esalino

<table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table>

resfriada

A extração de água ambiente da farinha não solubilizatanta proteína 7S quanto o fez a extração de água quente.

Como um resultado, uma proporção mais alta de proteínas 7Se 12S terminaram no extrato salino (Tabela 9). Entretanto,as proteínas 7S e 12S foram removidas de forma bem sucedidano tratamento a quente do retentato de diafiltração.Resfriar o extrato de água ambiente precipitou proteínas 7Se 12S, mas não tanto quanto ocorreu quando um extrato deágua quente foi resfriado. Surpreendentemente, o tratamentoa quente foi menos efetivo na remoção de proteínas 7S e 12Sdo retentato diafiltrado preparado a partir da corrente deprocesso de água.

Tabela 9 - Perfis de proteína de várias amostras

<table>table see original document page 53</column></row><table><table>table see original document page 54</column></row><table>

A cor da "C200H" produzida a partir da corrente desolução salina era apenas ligeiramente mais clara que a corda "C200H" da corrente de água (Tabela 9) . Nenhuma dasamostras possuía uma cor tão boa quanto aquelas onde seutilizou água quente na extração inicial (Experimento 2). Apureza da "C200H" produzida à partir da corrente de água(72,78% de proteína em base úmida) era muito inferioràquela da "C200H" produzida a partir de corrente salina(96,68% de proteína em base úmida). A cromatografia do tipoHPLC do produto derivado de solução salina (16,4% de áreade pico de não proteína) também estava mais limpo que acromatografia para o produto derivado de água (27,9% deárea de pico de não proteína) . 0 nível de contaminantes noextrato de água era, assim, maior que no extrato salino.

Conseqüentemente, o extrato de água exigiria umadiafiltração mais extensiva para purificação. A proteína 7Se 12S precipitada em resfriamento obtida neste experimentoera ligeiramente mais clara que aquela obtida noexperimento anterior, talvez devido à extração de águaambiente ter solubilizado menos impurezas que a extração deágua quente. A pureza do produto foi novamente muito altacom um conteúdo de proteína de 102,72% (base úmida).

Tabela 10 - Cor seca do produto final do Experimento 3

<table>table see original document page 55</column></row><table>

(d) Experimento 4

200 g de farinha de semente oleaginosa de canola (loteB) foram extraídos a 10% p/v com 2.000 mL de água àtemperatura ambiente por 3 0 minutos com um agitadorsuperior. O extrato de água foi separado da farinha gastapor centrifugação a 7.100 g por 10 minutos e o peso dafarinha úmida (639 g) e água coloidal (439 g) foideterminado. Foi adicionado NaCl 0,25 M suficiente (1.561mL) para trazer a concentração de volta a 10% p/v e aamostra foi misturada com um agitador superior por 3 0minutos à temperatura ambiente. 0 extrato salino foiseparado da farinha usada por centrifugação a 7.100 g por10 minutos e depois filtrado por duas passadas através deabsorventes de papel de filtro número 3. 0 extrato salinoclarificado foi então processado utilizando-se duasunidades de membranas Vivaflow HY de 10.000 MWCO unidas emparalelo. O extrato foi concentrado e depois diafiltradocom 5 volumes de água purificada por osmose reversa (RO). Aadição de água de diafiltração resultou na geração de umprecipitado que foi removido por centrifugação a 7.100 gpor 10 minutos antes da re-concentração. O retentato dediafiltração foi tratado a quente a 850C por 10 minutospara precipitar proteínas 7S e 12S, as quais foramremovidas por centrifugação a 8.000 g por 15 minutos. Ocentrifugado foi então dividido em duas porções, com umaagitada com carvão ativado em pó a 1% em peso por 30minutos e a outra metade da amostra permanecendo nãotratada. Ambas as amostras foram centrifugadas a 8.000 gpor 10 minutos, filtradas com um filtro de seringa detamanho d e poro de 0,45 pm e depois liofilizadas ereceberam as denominações "C200H" (sem carvão) e "C200HC"(tratada com carvão) . O extrato de água inicial não foiprocessado neste experimento. Várias amostras foramanalisadas conforme detalhado no Experimento 2.

Como em outros experimentos, o extrato salinosecundário era mais cristalino e menos colorido que oextrato de água inicial (Tabela 11).

Tabela 11 - Resultados analíticos para extratos de água esalino

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Novamente a extração de água inicial favoreceu asolubilização de proteína 7S, mas a extração salinasecundária solubilizou proporções similares de ambas asclasses de proteínas (Tabela 12) . A extração de água nãoremoveu tanta proteína quanto em outros experimentos, o quetende a ser um reflexo dos diferentes lotes de farinha.

Tratar por aquecimento o retentato de diafiltração removeucom sucesso a maioria da proteína IS e 12S restante. Tratarcom carvão o centrifugado resultante não alterou o perfilde proteína. 0 tratamento com carvão reduziu a área de piconão protéica do HPLC de 15,76% para 4,82%.

Tabela 12 - Perfis de proteína de várias amostras

<table>table see original document page 57</column></row><table>

O tratamento com carvão do centrifugado do retentatode diafiltração tratado com calor melhorou a cor do produtoresultante (Tabela 13). A cor seca da "C200HC" eraligeiramente mais clara e perceptivelmente menos amarelaque a da "C200H". Uma melhoria foi também observada nasamostras de cor úmida.

Tabela 13 - Cor seca do produto final do Experimento 4

<table>table see original document page 58</column></row><table>

(e) Experimento 5

200 g de farinha de semente oleaginosa de canolapeneirada (lote B) foram extraídos a 10% p/v com de água(2.000 mL) à temperatura ambiente por 30 minutos com umagitador superior. O extrato de água foi separado dafarinha gasta por centrifugação a 7.100 g por 10 minutos eo peso da farinha úmida (648 g) e água coloidal (448 g) foideterminado. Foi adicionado NaCl 0,25 M suficiente (1.552mL) para trazer a concentração de volta a 10% p/v e aamostra foi misturada com um agitador superior por 3 0minutos à temperatura ambiente. 0 extrato salino foiseparado da farinha usada por centrifugação a 7.100 g por10 minutos e depois filtrado passando-o através deabsorventes de papel de filtro número 2 e 3. 0 extratosalino clarificado foi então processado utilizando-se duasunidades de membranas Vivaflow HY de 10.000 MWCO unidas emparalelo. O extrato foi concentrado e depois diafiltradocom 5 volumes de água purificada por osmose reversa (RO). Aadição de água de diafiltração resultou na geração de umprecipitado que foi removido por centrifugação a 7.100 gpor 10 minutos antes da re-concentração. 0 retentato dediafiltração foi tratado a quente a 85°C por 10 minutospara precipitar proteínas 7S e 12S, as quais foramremovidas por centrifugação a 8.000 g por 15 minutos. Ocentrifugado foi então dividido em duas porções, com umaagitada com carvão ativado em pó a 1% por 30 minutos e aoutra metade da amostra permanecendo não tratada. Ambas asamostras foram centrifugadas a 8.000 g por 10 minutos,filtradas com um filtro de seringa de tamanho de poro de0,45 pm e depois liofilizadas e receberam as denominações"C200H" (sem carvão) e "C200HC" (tratada com carvão).O extrato de água inicial não foi processado nesteexperimento. Várias amostras foram analisadas conformedetalhado no Experimento 2.

Como em outros experimentos, o extrato salinosecundário era mais limpo e menos colorido que o extrato deágua inicial (Tabela 14) . O uso de farinha peneirada aoinvés de farinha comum com conteúdo mais alto de cascasresultou em mais proteína, cor e fenólicos sendo extraídos.

Tabela 14 - Resultados analíticos para extratos de água esalino

<table>table see original document page 59</column></row><table>

Novamente a extração de água inicial favoreceuproporcionalmente a solubilização de proteína 7S, mas com acapacidade de extração limitada, a extração salinasecundária solubilizou proporções similares de ambas asproteínas (Tabela 15) . Tratar por aquecimento o retentatode diafiltração removeu com sucesso a maioria da proteína7S restante. Tratar com carvão o centrifugado resultantenão alterou o perfil de proteína. O tratamento com carvãoreduziu a área de pico não protéica do HPLC de 10,94% para1,58%.

Tabela 15 - Perfis de proteína de várias amostras

<table>table see original document page 60</column></row><table>

O tratamento com carvão do centrifugado do retentatode diafiltração tratado com calor melhorou a cor do produtoresultante, mas não tão bem quanto no experimento anterior(Tabela 16) . Neste experimento, a cor seca da "C200HC"estava menos amarela que a da "C200H", mas o produtotratado com carvão estava ligeiramente mais vermelho eescuro que a amostra não tratada. 0 tratamento com carvãomelhorou a cor úmida, mas novamente uma melhoria mais fortefoi vista no Experimento 4.Tabela 16 - Cor seca do produto final do Experimento 5

<table>table see original document page 61</column></row><table>

(f) Experimento 6

150 g de farinha de semente oleaginosa de canola (loteB) foram extraídos a 10% p/v com 1.500 mL de água a 60°Cpor 15 minutos com um agitador superior. O extrato de águafoi separado da farinha gasta por centrifugação a 5.200 gpor 10 minutos e o peso da farinha úmida (458 g) e águacoloidal (3 08 g) foi determinado. Foi adicionado NaCl 0,25M suficiente (1.192 mL) para trazer a concentração de voltaa 10% p/v e a amostra foi misturada com um agitadorsuperior por 3 0 minutos à temperatura ambiente. O extratosalino foi separado da farinha usada por centrifugação a5.200 g por 10 minutos e depois filtrado com absorventes depapel de filtro número 3. O extrato salino clarificado foientão processado utilizando-se duas unidades de membranasVivaflow HY de 10.000 MWCO unidas em paralelo. 0 extratofoi concentrado e depois diafiltrado com 5 volumes de águapurificada por osmose reversa (RO) . A adição de água dediafiltração resultou na geração de um precipitado que foiremovido por centrifugação a 5.200 g por 10 minutos antesda re-concentração. O retentato de diafiltração foi tratadocom calor a 85°C por 10 minutos para precipitar proteínas7S e 12S, as quais foram removidas por centrifugação a8.000 g por 15 minutos. 0 centrifugado foi entãoIiofilizado e recebeu a designação "C200H". 0 extrato deágua inicial não foi processado neste experimento. Váriasamostras foram analisadas conforme detalhado no Experimento2.

Como em outros experimentos, o extrato salinosecundário era mais limpo e menos colorido que o extrato deágua inicial (Tabela 17) . A extração de água a 600C maislonga pode ter melhorado ligeiramente a qualidade doextrato salino, mas o efeito não parece ser significativo.

Tabela 17 - Resultados analíticos para extratos deágua e salino

<table>table see original document page 62</column></row><table>

Os perfis de proteína de várias amostras são mostradosna Tabela 18. Parece que uma extração de água mais longa a60 0C solubilizou mais proteínas 7S e 12S que extraçõesanteriores do mesmo lote de farinha. Isto é desejável umavez que reduziu o conteúdo de proteínas 7S/12S do extratosalino, facilitando o preparo de uma amostra de proteína 2Spurificada.

Tabela 18 - Perfis de proteína de várias amostras

<table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table>

A cor seca desta amostra era mediana (Tabela 19) e acor úmida era razoável, mas não tão boa guando foi vistoanteriormente em amostras tratadas com carvão.

Tabela 19 - Cor Seca dos Produtos Finais do Experimento 6

<table>table see original document page 63</column></row><table>

(g) Experimento 7

160 g de farinha de semente oleaginosa de canola (loteB) com % em peso de carvão ativo em pó (16 g) foramextraídos a 10% p/v com água (1600 mL) a 600C por 5 minutoscom um agitador superior. 0 extrato de água foi separado dafarinha gasta e carbono por centrifugação a 7100 g por 10minutos e o peso da farinha/carvão úmidos (533 g) e águacoloidal (357 g) determinado. NaCl 0,2M suficiente (1243mL) foram então adicionados para levar a concentração devolta 10% p/v. Outros 16 gramas de carvão ativo em pó novoforam também adicionados ao sistema e a amostra foimisturada com um agitador superior por 30 minutos àtemperatura ambiente. 0 extrato salino foi separado dafarinha gasta por centrifugação a 7100 g por 10 minutos eentão filtrado com absorvente de papel de filtro número 3.

0 extrato salino clarificado foi então processado usando-seduas unidades de membrana Vivaflow HY de 10.000 MWCO unidasem paralelo. O extrato foi concentrado e então diafiltradocom 5 volumes de água purificada por osmose reversa (RO). Aadição da água de diafiltração resultou na geração de umprecipitado que foi removido por centrifugação a 7.100 gpor 10 minutos antes da re-concentração. 0 retentato dediafiltração foi tratado a quente a 850C por 10 minutospara precipitar as proteínas 7S e 12S, que foram removidaspor centrifugação a 8000 g por 15 minutos. 0 centrifugadofoi então Iiofilizado e dado a denominação "C200H". 0extrato de água inicial não foi processado nesteexperimento. Várias amostras foram analisadas conformedetalhado para o Experimento 2.

A inclusão de carvão nas etapas de extração reduziuenormemente a cor e o conteúdo de impureza das correntes doprocesso (Tabela 20).

Tabela 2 0 - Resultados Analíticos para Extratos de Água eSalino

<table>table see original document page 64</column></row><table>

Os perfis de proteína de várias amostras estãomostrados na tabela 21. A proporção de proteínas no extratode água foi muito similar àquele visto no Experimento 6.Entretanto, a proporção das doses de proteína no extratosalino era muito mais uniforme que no Experimento 6 onde aproteína 2S era claramente favorecida. Uma explicação paraisto poderia ser o menor nível de capacidade de extração deproteína pela fase aquosa neste experimento e talvez asperdas de proteína 2S para o carvão. Entretanto, o carvãonão mudou o perfil da proteína quando aplicado nosExperimentos 4 e 5.

Tabela 21 - Perfis de Proteína de Várias Amostras

<table>table see original document page 65</column></row><table>

Esta amostra tinha excelente coloração seca e úmida(Tabela 22) . O resultado LECO para o pó de "C200H" eraapenas de 89,3% base úmida, mas em uma base seca a amostraera provavelmente um isolado. A concentração de impurezasque não são proteínas de acordo com HPLC no produto finalera apenas 1,1%. Portanto, a maior parte de espécies deproteína presentes na amostra não absorvem a 280 nm. Salseria o mais provável destes compostos. A diafiltraçãoadicional com água pode ser usada para remover este sal emelhorar o conteúdo de proteína do produto final.

Tabela 22 - Cor Seca dos Produtos Finais do Experimento 7

<table>table see original document page 65</column></row><table>Os resultados dos Experimentos 1 a 7 demonstram que umprocedimento de extração dupla executado em uma farinha desemente oleaginosa de canola produziu correntes ricas emproteína 7S e correntes ricas em proteína 2S.

Exemplo 3:

Este Exemplo expõe uma série de experimentos doprocedimento de extração dupla do Exemplo 2, em quemúltiplas extrações de água foram executadas antes daextração com solução salina.

Os resultados desta série de experimentos estãoexpostos aqui. É notado que, industrialmente, uma extraçãocom água da farinha de semente será executada usando-se umextrator contra-corrente. Tais processos expõem a farinhaao equivalente de um grande número de lavagens individuais.

Experimento 1:

15 g de farinha de semente oleaginosa de canola (loteB) foram extraídos com água (150 mL) a 600C por 5 minutos.A água foi pré-aquecida a 65cC e então misturada com umafarinha usando-se um agitador orbital a 220 rpm. 0 extratofoi separado da farinha gasta por centrifugação a 10.000 gpor 10 minutos. O extrato foi decantado e a farinha úmidafoi recuperada, pesada e o volume de água capturadacalculado. Água a 650C suficiente para levar o volume devolta a 150 mL foi então adicionado à farinha gasta e aextração repetida conforme detalhado acima. Este processofoi repetido até quatro extrações com água terem sidoexecutadas. Uma quinta extração foi então executada comNaCl 0, 5M à temperatura ambiente. Solução salina suficientefoi adicionada para levar o volume de volta a 50 mL e entãoa extração executada agitando-se a amostra a 220 rpm por 3 0minutos à temperatura ambiente. A Tabela 23 mostra o volumede água ou solução salina adicionado para cada extração.Note que pelotas coesivas não foram obtidas quando se fez acentrifugação após a segunda e terceira extrações.Portanto, mais solvente foi retido de modo a não perderfarinha quando se decantam as amostras. Teoricamente, maiscontaminantes podem ter sido extraído se o volume máximo deágua gasto poderia ter sido removido e substituído com águafresca.

Tabela 23 - Voliime das Frações de Extração

<table>table see original document page 67</column></row><table>

O pH, condutividade e Brix das amostras do extratoforam medidos e então as amostras foram filtradas com umfiltro de seringa de tamanho de poro de 0,45 pm e testadaspara compostos fenólicos livres (A330), cor visível (A390),conteúdo de proteína (LECO) e perfil de proteína (SECHPLC).

Extrações sucessivas com água não removem quantidadessubstanciais de proteína e impurezas (Tabela 24). 0 extratosalino produzido neste experimento estava mais limpo que osextratos salinos produzidos em experimentos com uma únicaextração com água relatados no Exemplo 2. Naquelesexperimentos, descobriu-se que o extrato salino contémaproximadamente 70% de área de pico de não proteína porHPLC. Entretanto, o extrato salino do experimento com umextrato com água seguido por um extrato salino, ambos comtratamento de carvão tinham A330 (0,29), A390 (0,10) eáreas de pico (2,34%) de não proteína por HPLC % muitomenores que o experimento corrente. Estas diferençassugerem que as múltiplas extrações com água podem nãoproduzir um extrato salino limpo o suficiente para se obtera cor do produto desejada.

Tabela 24 - Resultados Analíticos para Extratos doExperimento 1

<table>table see original document page 68</column></row><table>

A proteína 7S foi mais facilmente extraída com águaquente que a proteína 2S (Tabela 25). Conforme esperado, oextrato salino era rico em proteína 2S. Estima-se queaproximadamente 1/3 da proteína 2S extraída total foi paraa corrente de água a pureza inferior com a maior parte dasproteínas 7S/12S e as impurezas. É desejável manter tantaproteína 2S quanto possível na corrente de alta pureza. 0limite de aceitabilidade para perdas de proteína 2S com afase aquosa (recuperada como a proteína de menor qualidade)e de fato o valor do esquema de extração múltipla interirodepende da qualidade e do valor da proteína 2S vinda dacorrente salina.

Tabela 25 - Perfil de Proteína dos Extratos do Experimento

<table>table see original document page 69</column></row><table>

B) foram extraídos com água (1500 mL) a 600C por 5 minutos.A água foi pré-aquecida a 650C e então misturada com umafarinha usando-se um agitador orbital a 220 rpm. 0 extratofoi separado da farinha gasta por centrifugação a 7.100 gpor 10 minutos. O extrato foi decantado e a farinha úmidafoi recuperada, pesada e o volume de água capturadacalculado. Água a 65°C suficiente para levar o volume devolta a 1500 mL foi então adicionado à farinha gasta e aextração repetida conforme detalhado acima. Este processofoi repetido até quatro extrações com água terem sidoexecutadas. Uma quinta extração foi então executada comNaCl 0, 2M à temperatura ambiente. Uma concentração de salmais baixa foi escolhida em comparação ao Experimento 1,uma vez que o sal tinha de ser removido por diafiltração eo tempo permitir apenas o processamento com cinco volumesde diafiltração. Solução da NaCl 0,2M suficiente foiadicionada para levar o volume de volta a 1500 mL e então aextração executada agitando-se a amostra com um agitadorsuperior por 30 minutos à temperatura ambiente. A Tabela 26mostra o volume de água ou solução salina adicionado paracada extração.

Tabela 2 6 - Volume das Frações de Extração

<table>table see original document page 70</column></row><table>centrifugação a 7100 g por 10 minutos e então filtradoatravés de absorvente de filtro de papel número 3. Oextrato salino clarificado foi então processado usando-seduas unidades de membrana Vivaflow HY de 10000 MWCO unidasem paralelo. 0 extrato foi concentrado e então diafiltradocom 5 volumes de água purificada por osmose reversa (RO). Aadição da água de diafiltração resultou na geração de umprecipitado que foi removido por centrifugação a 7.100 gpor 10 minutos antes da re-concentração. 0 retentato dediafiltração foi tratado a quente a 850C por 10 minutospara precipitar as proteínas 7S e 12S, que foram removidaspor centrifugação a 8000 g por 15 minutos. 0 centrifugadofoi então liofilizado e dado a denominação "C200H".

Várias mostras foram analisadas para compostosfenólicos livres (A33 0), cor visível (A3 90), conteúdo deproteína (LECO) e perfil de proteína (SEC HPLC). osprodutos finais foram analisados para cor seca usando umcolorímetro Minolta e as soluções foram também preparadaspara análise de cor úmida. 0 pó de proteína (0,7 g) foicombinado com NaCl 0,1M (10 mL) usando-se um misturador comvórtice. A amostra foi então centrifugada a 8000 g por 10minutos e o conteúdo de proteína do sobrenadante foideterminado por LECO. Uma alíquota (8 mL) do sobrenadantefoi transferida a um pequeno bécher e solução salinasuficiente foi adicionada para ajustar o conteúdo deproteína a 5%. As amostras foram então fotografadas.

As extrações com água nesta execução pareceram removeraproximadamente a mesma quantidade de proteína, cor eimpurezas em comparação com o Experimento 1 (Tabela 27) . Aqualidade do extrato salino pareceu levemente diferente commenos proteína, livre de compostos fenólicos, impurezas ecor visível encontrados no extrato deste experimento. Umavez que os dados analíticos para os extratos de águapareceram tão similares, as diferenças nestes extratossalinos provavelmente foram devidas às diferentesconcentrações do sal.

Tabela 27 - Resultados Analíticos para Extratos doExperimento 2

<table>table see original document page 72</column></row><table>

Os perfis de proteína dos extratos de água nesteexperimento (Tabela 28) eram similares ao experimento 1,mas o extrato salino apresentou uma proporção mais alta deproteína 2S. Isto foi de alguma forma surpreendente uma vezque menos sal foi usado neste experimento e acredita-se quea salinidade aumentada favoreça a extração de proteína 2Ssobre a proteína 7S.

Tabela 28 - Perfil de Proteína dos Extratos doExperimento 2

<table>table see original document page 73</column></row><table>

A membrana que processa o extrato salino também opurificou, com a área de pico de não proteína de HPLC %para o retentato de diafiltração foi descoberto como sendode apenas 2,3%. Isto é mais baixo do que tipicamente vistopara os experimentos de extração com água única (vejaExemplo 2).

A cor seca do "C200H" produzida neste experimento estámostrada Tabela 29. Esta cor é muito similar àquela vistanos outros experimentos de extração dupla com a mesmafarinha. O uso de carvão em pó junto com a extração duplaproduziu um "C200H" com um valor de clareza de quase 90 emenos notas vermelhas e amarelas que no produto desteexperimento.

Tabela 29 - Cor Seca do Produto do Experimento 2

<table>table see original document page 74</column></row><table>

Experimento 2

A cor úmida do "C200H" produzida no Experimento 2 foitambém não melhor que a vista nos outros experimentos deextração dupla (água a 60°C) sem adsorvente e eradefinitivamente mais escura que a amostra produzida comadsorvente.

Os resultados destes experimentos em comparaçãoàqueles no Exemplo 2, indicam que múltiplas extrações comágua da farinha antes da extração salina parece eliminarimpurezas adicionais (nenhum adsorvente), mas não possui umgrande impacto na qualidade de produto final.

EXEMPLO 4:

Este Exemplo ilustra a preparação de um produto deproteína 2S isolado a partir do retentato deultrafiltração.

40 kg de farinha de canola foram adicionados a 400 Lde solução de NaCl 0,15 M à temperatura ambiente e foramagitados por 3 0 minutos para fornecer uma solução deproteína aquosa. A farinha de canola residual foi removidae a solução de proteína resultante foi clarificada porcentrifugação e f iltração para produzir 13 9 L de umasolução de proteína filtrada possuindo um conteúdo deproteína de 1,87 % em peso.Uma alíquota de 13 9 L da solução de extrato deproteína foi reduzida em volume a 8,9 L por concentraçãoem uma membrana PVDF possuindo um corte de peso molecularde 30.000 Da. Uma alíquota de 5 L da solução de proteínaconcentrada foi então diafiltrada com 24,8 L de solução deNaCl 0,15M em uma membrana PES possuindo um corte de pesomolecular de 100.000 Da. 0 retentato diafiltrado foi entãopasteurizado a 60°C por 10 minutos.

Uma amostra do retentato de ultrafiltração diafiltradoe pasteurizado (UFl) foi obtida. 0 conteúdo de proteínadeste retentato era de 18,30% em peso. Acreditava-se que aalta concentração de proteína cominada com a alta proporçãode proteína IS presente em um retentato de UFl iriaresultar na gelificação em vez de apenas a precipitação sobaquecimento. Como um resultado, a concentração de proteínada amostra foi ajustada antes do tratamento a quentecombinando-se 100 mL de retentato com 100 mL de NaCl 0,1M.

A amostra diluída foi tratada a quente a 850C por 0minutos e então foi rapidamente resfriada em água fria paramenos de 30°C. A amostra foi então centrifugada a 10.200 gpor 5 minutos. Após a centrifugação uma pelota foi obtidaassim como algumas partículas precipitadas flutuantes. 0sobrenadante foi decantado e as partículas flutuantesremovidas por filtração através do papel de filtro comtamanho de poro de 25 μπι. 0 sobrenadante recuperado (120mL) foi concentrado em uma unidade de membrana Vivaflow10000 HY7 foi então diafiltrada com 10 volumes de águapurificada por osmose reversa para remover sal. 0 retentatodiafiltrado foi então liofilizado e recebeu a designação deC500H.Várias amostras foram analisadas para compostosfenólicos livres (A330), cor visível (A390) , conteúdo deproteína (LECO) e perfil de proteína (SEC HPLC). 0 produtofinal foi analisado para conteúdo de umidade usando-se ummétodo de secagem em estufa, cor seca usando-se umcolorímetro Minolta e uma solução foi também preparada paraanálise de cor úmida. 0 pó de proteína (0,7 g) foicombinado com água (10 mL) usando-se um misturador comvórtice. A amostra foi então centrifugada a 7.800 g por 10minutos e o conteúdo de proteína do sobrenadante foideterminado por LECO. Uma alíquota (8 mL) do sobrenadantefoi transferida a um pequeno bécher e água suficiente foiadicionada para ajustar o conteúdo de proteína a 5%. Asamostras foram então fotografadas.

O tratamento a quente do retentato de UFl removeu deforma bem sucedida a maior parte das proteínas 7S e 12S daamostra. A proporção da área de pico de proteína por HPLCdevido às proteínas 7S e 12S no retentato inicial era de61,4% e 2% respectivamente. Esta foi reduzida a 4,4% para7S e 0,4% para 12S no sobrenadante da amostra tratada aquente. 0 produto final obtido era um isolado com umconteúdo de proteína (base úmida) de 90,32% e um conteúdode umidade de 4,82%, resultando em um conteúdo de proteína(base seca) de 94,89%. A cor seca do produto era um poucomais escura do que havia sido historicamente notado para osprodutos C200H (Tabela 30) .

Tabela 3 0 - Cor Seca para C500H Produzido a partir doRetentato de UFl

<table>table see original document page 76</column></row><table>A cor úmida da proteína era quase boa, embora talvezum pouco mais escura do que foi visto para o C200H. Asamostras eram levemente turvas.

Como pode ser visto a partir dos resultados aquiexpostos, um isolado de proteína de canola consistindo deproteína 2S era gerado de forma bem sucedida a partir doretentato de UFl.

EXEMPLO 5:

Este Exemplo ilustra o tratamento a quente da soluçãode extrato de proteína de canola formada a partir dafarinha de semente oleaginosa de canola.

150 g de farinha de semente oleaginosa de canola(SB062) foram extraídos com 1500 mL de NaCl 0,1M por 30minutos à temperatura ambiente usando-se um agitadorsuperior. A mistura foi centrifugada a 7.100 g por 10minutos para separar o extrato da farinha gasta. 0 extratocoletado foi tratado a quente a 850C por 10 minutos em umapanela para banho-maria para precipitar 7S/12S. Após otratamento a quente, a amostra foi imediatamente resfriadaabaixo de 300C por submersão em um banho de água gelada. Ossólidos precipitados foram removidos por centrifugação a7.100 g por 10 minutos e então o centrifugado foi refinadocom absorvente de filtro número 3. O centrifugadoclarificado foi então concentrado em uma unidade deultrafiltração Vivaflow 10000 HY e foi diafiltrado com 10volumes de água purificada por osmose reversa. A adição daágua de diafiltração resultou na formação de algumprecipitado que foi removido por centrifugação da amostraa 7.100 g por 10 minutos antes da re-concentração. 0retentato diafiltrado foi liofilizado para formar o produtofinal.

Várias mostras foram analisadas para compostosfenólicos livres (A330), cor visível (A390) , conteúdo deproteína (LECO) e perfil de proteína (SEC HPLC). 0 produtofinal foi analisado para conteúdo de umidade usando-se ummétodo de secagem em estufa, cor seca usando-se umcolorímetro Minolta e uma solução foi também preparada paraanálise de cor úmida. 0 pô de proteína (0,8 g) foicombinado com água (10 mL) usando-se um misturador comvórtice. A amostra foi então centrifugada a 7.800 g por 10minutos e o conteúdo de proteína do sobrenadante foideterminado por LECO. Uma alíquota (8 mL) do sobrenadantefoi transferida a um pequeno bécher e água suficiente foiadicionada para ajustar o conteúdo de proteína a 5%. Asamostras foram então fotografadas.

0 tratamento a quente do extrato removeu de forma bemsucedida a maior parte das proteínas 7S e 12S da amostra. Aproporção da área de pico de proteína por HPLC devido a 7Se 12 S no extrato inicial era de 6 3,8% e 3,8%,respectivamente. Esta foi reduzida a 2,0% para IS e 0,8%para 12S no centrifugado da amostra tratada a quente. 0precipitado formado aquecendo-se o extrato foi facilmenteremovido por centrifugação. 0 produto final obtido era umisolado com um conteúdo de proteína (base úmida) de 84,15%e um conteúdo de umidade de 7,22%, resultando em umconteúdo de proteína (base seca) de 90,70%. A cor seca doproduto era levemente mais escura e mais vermelha do quehavia sido historicamente notado para a maior parte das 2Sisoladas produzidas (Tabela 31).

Tabela 31 - Cor Seca para a 2S Isolada Produzida a partirdo Extrato Tratado a Quente

<table>table see original document page 79</column></row><table>

Em resumo desta divulgação, são fornecidosprocedimentos para a preparação de isolado de proteína decanola consistindo essencialmente da proteína de canola 2Se substancialmente livre das proteínas 7S e 12S.

Modificações são possíveis dentro do escopo da invenção.

Claims

1. Método para a produção de um isolado de proteína decanola consistindo predominantemente de proteína de canola 2S caracterizado pelo fato de:extrair farinha de semente oleaginosa de canola comuma solução de sal aquosa a uma temperatura elevada paraextrair preferencialmente a proteína 2S da farinha desemente oleaginosa de canola em vez das proteínas 7S e 12Se obter uma solução de extrato de proteína de canolacontendo predominantemente a proteína 2S,separar a solução de extrato de proteína de canola dafarinha de semente oleaginosa residual, erecuperar a partir da solução de extrato de proteínade canola um isolado de proteína de canola possuindo umconteúdo de proteína de pelo menos cerca de 90% em peso (Nχ 6,25) e consistindo predominantemente da proteína decanola 2S.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a referida solução de salaquosa possui uma força iônica de pelo menos cerca de 0,05,preferivelmente de pelo menos cerca de 0,01, e um pH de 5 a 6,8, preferivelmente de 5,3 a 6,2, e a referida temperaturaelevada varia de 70°C a 100°C, preferivelmente de 80°C a 95 °C.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que a referida solução deextrato de proteína de canola possui um perfil de proteínade canola que é:de 80 a 100% em peso de proteína 2S, pref erivelmentede 85 a 100% em peso de proteína 2S,de O a 10% em peso de proteína 7S, preferivelmente de-0 a 15% em peso de proteína 7S, ede 0 a cerca de 10% em peso de proteína 12S,preferivelmente de 0 a 5% em peso de proteína 12S.

4. Método para a preparação de um isolado de proteínade canola consistindo predominantemente da proteína decanola 2S caracterizado por:extrair a farinha de semente oleaginosa de canola comágua para preferivelmente extrair as proteínas 7s e 12S eimpurezas solúveis em vez da proteína 2S, para formar umaprimeira solução de extrato de proteína de canola,separar a primeira solução de extrato de proteína decanola da farinha de semente oleaginosa residual,extrair a farinha de semente oleaginosa residual comuma solução de sal aquosa para dissolver as proteínas 2S,-7s e 12S da farinha de semente oleaginosa residual paraformar uma segunda solução de extrato de proteína decanola, erecuperar um isolado de proteína de canola da segundasolução de extrato de proteína de canola possuindo umconteúdo de proteína de pelo menos 90% em peso (Ν χ 6,25) econsistindo predominantemente da proteína de canola 2S.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que a referida farinha desemente oleaginosa de canola é extraída com água a umatemperatura de 10°C a 70°C, preferivelmente de 55°C a 65°C.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5,caracterizado pelo fato de que as proteínas 7S e 12S sãorecuperadas como um isolado de proteína de canola a partirda primeira solução de extrato de proteína de canola.

7. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que areferida extração com água é efetuada em 2 a 25 extraçõescom água, preferivelmente de 2 a 4 extrações.

8. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 6 ou 7, caracterizado pelofato de que a referida farinha de semente oleaginosa decanola é extraída com solução de sal aquosa a umatemperatura de 5°C a 65°C, preferivelmente de 20°C a 30°C,a uma força iônica de pelo menos 0,05, preferivelmente pelomenos 0,10.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que a referida solução de salaquosa possui um pH de 5 a 6,8, pref erivelmente de 5,3 a 6,2.

10. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizadopelo fato de que a referida segunda solução de extrato deproteína de canola possui um perfil de proteína de canolaque é:de 80 a 100% em peso de proteína 2S, pref erivelmentede 85 a 100% em peso de proteína 2S,de 0 a 10% em peso de proteína 7S, pref erivelmente de-0 a 15% em peso de proteína 7S, ede 0 a 10% em peso de proteína 12S, preferivelmente de-0 a 5% em peso de proteína 12S.

11. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10,caracterizado pelo fato de que a referida etapa derecuperação para recuperar o isolado de proteína de canola,consistindo predominantemente de proteína de canola 2S, éefetuada pela concentração da solução de extrato deproteína de canola a uma concentração de pelo menos 50 g/Le secar a solução de extrato de proteína de canola aquosaconcentrada resultante.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a referida solução deextrato de proteína de canola aquosa ê concentrada a umaconcentração de proteína de 100 g/L a 400 g/L,preferivelmente de 200 g/L a 300 g/L.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o extrato de proteína decanola aquoso concentrado é sujeitado a diafiltraçãousando-se de 2 a 20 volumes de meio de diafiltração,preferivelmente de 5 a 10 volumes de meio de diafiltração.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que um antioxidante estápresente durante pelo menos parte da etapa de diafiltração.

15. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 12, 13 ou 14, caracterizado pelo fato de quea solução de extrato de proteína de canola aquosaconcentrada é sujeitada a uma etapa de tratamento a quente,preferivelmente a uma temperatura de 70°C a IOO0C por 2 a 30 minutos, mais preferivelmente a uma temperatura de 750Ca 95 0C por 5 a 15 minutos, antes da referida etapa desecagem para diminuir a proporção das proteínas 7S e 12S nareferida solução em pelo menos 50% em peso, preferivelmentepelo menos 75% em peso por precipitação da solução.

16. Método para a produção de um isolado de proteínade canola consistindo predominantemente da proteína decanola 2S caracterizado pelo fato de:extrair a farinha de semente oleaginosa de canola comuma solução de sal aquosa para extrair proteínas de canolada farinha de semente oleaginosa de canola e para se obteruma solução de proteína de canola,separar a solução de proteína de canola da farinha desemente oleaginosa residual,opcionalmente concentrar a referida solução deproteína de canola para fornecer uma solução de proteínaconcentrada como um retentato,tratar a quente a solução de proteína de canola ou asolução de proteína opcionalmente concentrada paraprecipitar seletivamente as proteínas de canola 7S e 12S,em vez da proteína de canola 2S, a partir da solução deproteína de canola ou da solução de proteína de canolaconcentrada opcionalmente para formar uma solução deproteína de canola tratada a quente contendopredominantemente a proteína de canola 2S,separar a solução de proteína de canola tratada aquente das proteínas precipitadas, erecuperar um isolado de proteína de canola possuindoum conteúdo de proteína de pelo menos 90% em peso (Ν χ-6,25) e consistindo predominantemente da proteína de canola-2S a partir da solução de proteína de canola tratada aquente separada.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que a referida etapa detratamento a quente é efetuada a uma temperatura de 70°C a-100°C, preferivelmente de 750C a 95°C, por 2 a 30 minutos,preferivelmente de 5 a 15 minutos, para reduzir osconteúdos de proteína IS e 12S em pelo menos 50% em peso,preferivelmente pelo menos 75% em peso.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 17,caracterizado pelo fato de que a referida solução de salaquosa possui uma força iônica de pelo menos cerca de 0,05,preferivelmente de pelo menos cerca de 0,10, e um pH de 5 a-6,8, preferivelmente de 5,3 a 6,2.

19. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que oisolado de proteína de canola consistindo predominantementede proteína 2S possui um conteúdo de proteína de pelo menos-100% em peso.

20. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que oreferido isolado de proteína de canola consistindopredominantemente de proteína 2S contém pelo menos 90% empeso, preferivelmente pelo menos 95% em peso de proteína 2Sdas proteínas de canola presentes.