KR20050004177A - 핵산 서열결정에 있어서의 캔틸레버의 적용법 - Google Patents

핵산 서열결정에 있어서의 캔틸레버의 적용법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 방법 및 장치(100)는 뉴클레오타이드(218)를 핵산 가닥(220)으로 도입함으로써 핵산(214)을 서열결정하는 것에 관한 것이다. 뉴클레오타이드(218)의 도입은 구조물(116, 212)의 질량 및/또는 표면 응력의 변화에 의해 검출된다. 본 발명의 몇몇 실시태양에서, 구조물(116, 212)은 하나 이상의 나노스케일 또는 마이크로스케일 캔틸레버를 포함한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 각각 상이한 유형의 뉴클레오타이드(218)는 거대 기에 의해 식별가능하게 표지되고, 각각 도입된 뉴클레오타이드(218)는 뉴클레오타이드(218)의 도입시 구조물(116, 212)의 질량 및/또는 표면 응력의 변화에 의해 확인된다. 본 발명의 대안적 실시태양에서, 단 한가지 유형의 뉴클레오타이드(218)를 핵산(214, 220)에 한번 노출시킨다. 구조물(116, 212)의 특성 변화는 압전 검출, 구조물(116, 212)의 공명 진동수의 이동, 및/또는 위치 민감형 광검출과 같은 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다.

Description

핵산 서열결정에 있어서의 캔틸레버의 적용법{APPLICATION OF CANTILEVERS IN NUCLEIC ACID SEQUENCING}
게놈 정보는 데옥시리보핵산(DNA)의 매우 긴 분자 형태로 저장되어 염색체로 유기체화된다. 인간 게놈은 대략 30억개의 염기로 이루어진 DNA 서열을 함유한다. 이 DNA 서열 정보는 각 개체의 수많은 특성을 결정한다. 많은 공통적인 질병들은 적어도 부분적으로는 DNA 서열의 변화에 기인한다.
인간 게놈의 전체 서열의 결정은 이러한 질병의 유전적 기초를 규명하기 위한 토대를 제공해 왔다. 그러나, 이러한 질병과 관련된 유전적 변화를 규명하기 위해 수행되어야 하는 수많은 과제가 남아있다. 이는 상기 질병을 촉진하는 DNA 서열에서 특정한 변화를 규명하기 위해 이러한 질병을 나타내는 개체 또는 가족의 염색체 일부를 DNA 서열결정하는 것을 필요로 할 것이다. 유전 정보를 처리하는데있어서 중간 분자인 리보핵산(RNA)은 다양한 질병의 유전 염기를 규명하도록 서열결정될 수 있다.
크기에 의해 분리되어지는 형광 표지된 핵산의 검출에 기초한, 핵산을 서열결정하는 현존 방법은 서열결정될 수 있는 핵산의 길이에 의해 제한된다. 전형적으로, 핵산 서열의 단지 500 내지 1000개의 염기만이 한번에 결정될 수 있다. 이는 길이상 수만 내지 수십만개의 염기일 수 있는 유전자로서 지칭되는 DNA의 기능 유닛의 길이보다 훨씬 짧다. 현행 방법을 이용하면 완전한 유전자 서열의 결정에 있어서, 유전자의 수많은 복제가 이루어지고, 중첩 단편으로 절단되어 서열결정하는 것을 필요로 한다(이후에 중첩 DNA 서열은 완전한 유전자로 조립될 수 있다). 이 과정은 힘들고, 비싸고, 비효율적이고, 시간 소모적이다. 또한, 이는 형광 또는 방사능 표지의 사용을 필요로 하고, 이는 잠재적으로 포즈 안전성 및 폐기물 처리 문제를 야기할 수 있다.
보다 최근에, 짧은 올리고뉴클레오타이드가 DNA 칩상의 특정 위치상에 한정되고 서열결정되고 부착되는 혼성화를 비롯한 핵산 서열결정 방법이 개발되었다. 이러한 방법은 짧은 핵산 서열을 추론하거나 샘플 중의 특정 핵산의 존재를 검출하는데 사용될 수 있지만 긴 핵산 서열을 규명하는데는 적합하지 않다.
본원에 기재된 방법 및 장치는 분자 생물학 및 핵산 분석 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 개시된 방법 및 장치는 표지된 뉴클레오타이드의 도입시 질량 및/또는 표면 응력의 변화를 검출함으로써 핵산을 서열결정하는 것에 관한 것이다.
다음의 도면은 명세서의 일부를 구성하고, 본 발명의 특정 실시태양을 보다 잘 나타내고자 포함되어 있다. 상기 실시태양은 본원에 제시된 상세한 설명과 조합하여 하나 이상의 이들 도면을 참조함으로써 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1은 핵산(214) 분석을 위한 전형적인 장치(100)(일정한 비율로 나타내지 않았음)를 예시하고 있다.
도 2a, 2b 및 2c는 핵산(214) 분석을 위한 장치(100)(일정한 비율로 나타내지 않았음)의 다른 전형적인 실시태양을 예시하고 있다.
도 3은 본원에 기재된 방법 및 장치(100)를 사용하여 생성될 수 있는 서열결정 데이터의 예를 예시하고 있다.
도 4는 본원에 기재된 방법 및 장치(100)를 사용하여 생성될 수 있는 서열결정 데이터의 다른 예를 예시하고 있다.
정의
본원에 사용된 "정관사"는 하나의 아이템 또는 그 이상의 아이템을 의미할 수도 있다.
본원에 사용된 "약"은 특정 수의 ±5% 이내를 의미한다. 예를 들어, "약 100"은 95 내지 105 사이의 임의의 수를 의미한다.
본원에 사용된 "작동적으로 연결된"은 둘 이상의 유닛 사이에 기능적 상호작용이 있음을 의미한다. 예를 들어, 검출 유닛(118)은, 검출 유닛(118)이 구조물(116, 212)의 특성 변화를 검출할 수 있도록 배열된 구조물(116, 212)에 "작동적으로 연결"될 수 있다.
본원에 사용된 "유체 연통"은 유체를 구획 사이를 통과시키는 2개 이상의 구획 사이의 기능적 연결부를 지칭한다. 예를 들어, 유체가 제 1 구획에서 제 2 구획으로 및/또는 제 2 구획에서 제 1 구획으로 통과할 수 있다면 제 1 구획은 제 2 구획과 "유체 연통"된 상태에 있는 것이다.
"핵산"(214)은 DNA, RNA, 외가닥, 이중가닥 또는 삼중 가닥, 및 이들의 임의의 화학적 변형물을 포함한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 외가닥 핵산(214)을 사용할 수도 있다. 사실상 핵산(214)의 임의 변형물도 고려된다. "핵산"(214)은 길이가 10, 20, 50, 100, 200, 300, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 15,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 75,000, 100,000, 150,000, 200,000, 500,000, 1,000,000, 2,000,000, 5,000,000 또는 심지어 그 이상의 염기 길이로부터 염색체 DNA 분자 전체 길이에 이르기까지의 거의 모든 길이일 수 있다.
본원에 개시된 방법 및 장치(100)는 핵산(214)의 신속하고 자동화된 서열결정에 사용된다. 선행 기술 방법에 비한 잇점은 외가닥 서열결정 실시에서 긴 핵산(214) 서열을 판독하는 능력, 보다 빠른 서열 데이터의 수득 속도, 감소된 서열결정 비용 및 서열 데이터 유닛 당 필요한 작동 시간에 있어서의 보다 큰 효율성을 포함한다. 본 발명의 몇몇 실시태양에서, 형광 또는 방사능 표지를 이용하지 않고 핵산(214)을 서열결정하는 능력도 유익하다.
다음의 상세한 설명은 본 발명의 개시된 실시태양을 보다 완전히 이해하도록 하기 위해 수많은 구체적인 세부사항을 포함한다. 그러나, 본 발명의 실시태양이이들 구체적인 세부사항없이 수행될 수도 있음은 당해 기술분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 한편, 당해 기술분야에 널리 공지된 장치, 방법, 과정 및 개별적 요소들은 본원에서 상세히 기재하지 않았다.
본 발명의 특정 실시태양은 핵산(214) 서열결정을 위한 방법 및 장치(100)에 관한 것이다. 본 발명의 한 실시태양에서, 서열결정될 핵산(214)을 나노스케일 또는 마이크로스케일 캔틸레버(116, 212)와 같은 하나 이상의 구조물(116, 212)에 부착할 수 있다. 본 발명의 다양한 실시태양에서, 부착된 핵산(214)은 상보적 가닥(220)의 생성 또는 중복 핵산(213)의 복제를 위한 주형으로서 기능할 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시태양에서, 상보적 가닥(220)의 합성에 사용되는 뉴클레오타이드(218)는 거대 기로 태그되어 각 유형의 뉴클레오타이드(218)를 위한 유일한 질량 표지를 제공할 수 있다. 핵산(214, 220)은 모두 4가지 유형의 표지된 뉴클레오타이드(218)를 함유한 용액에서 항온처리될 수 있다. 각 뉴클레오타이드(218)를 성장중인 가닥(220)에 첨가할 때 구조물(116, 212)에 부착된 질량에 첨가한다. 각 뉴클레오타이드(218)는 그의 독특한 질량에 의해 확인될 수 있기 때문에, 구조물(116, 212)의 표면 응력의 변화 및/또는 질량-의존성, 예를 들어 공명 진동수 또는 굴절률을 측정함으로써 뉴클레오타이드(218)를 첨가 순서대로 확인할 수 있다. 본 발명의 다양한 실시태양에서 동일한 핵산 주형(214)의 수많은 복제물이 각 구조물(116, 212)에 부착될 수 있고, 많은 상보적 가닥(220)의 합성이 동시에 일어나 서열에 각 뉴클레오타이드(218)의 첨가시 질량의 충분한 증가 및/또는 표면 응력의 변화가 검출될 수 있음이 예상된다.
본 발명의 대안적 실시태양에서, 성장중인 상보적 핵산(220)을 한번에 단 한가지 유형의 뉴클레오타이드(218)에만 노출시킬 수 있다. 뉴클레오타이드(218)의 도입은 뉴클레오타이드(218)가 주형 가닥(214)에서 상응하는 뉴클레오타이드(218)에 대응될 때에만 일어날 것이다. 이로써, 구조물(116, 212)에 부착된 핵산(214, 220)의 질량 및/또는 구조물의 표면 응력은 정확한 뉴클레오타이드(218)가 존재할 때에만 변할 것이다. 동일한 유형의 연속 뉴클레오타이드(218)의 첨가는 질량 및/또는 표면 응력에서의 상응하는 큰 변화에 의해 표시된다. 이러한 실시태양에서는 각 유형의 뉴클레오타이드(218)가 식별가능한 질량 표지를 가질 필요가 없다.
핵산(214) 서열결정을 위한 전형적인 장치(100)에 관한 본 발명의 다양한 실시태양은 도 1에 예시되어 있다. 도 1의 장치(100)는 시약 저장부(112), 분석 챔버(114, 210), 검출 유닛(118), 및 출구(128)와 같은 장치의 다른 구성요소에 작동적으로 연결된 데이터 처리 및 제어 유닛(110)을 포함한다. 도 1의 시약 저장부(112)는 입구(124)를 통해 분석 챔버(114, 210)에 유체 연통되어 있다. 분석 챔버(114, 210)는 주형 핵산(213)을 부착하기 위한 1개 이상의 구조물(116, 212)을 포함한다. 마이크로유체 장치를 운반 효소, 표지된 뉴클레오타이드(218), 및/또는 그밖의 시약으로 분석 챔버(114, 210)로부터 도입시킬 수 있다.
서열에서 주형 핵산(214)에 대응하는 핵산 가닥(220)을 공지된 기법, 예를 들어 임의의 공지된 핵산 폴리머라제(222)를 사용하여 합성할 수 있다. 표지된 뉴클레오타이드(218)의 상보적 가닥(220)으로의 도입은 부착된 구조물(116, 212)의 임의의 질량 의존성 및/또는 표면 응력을 측정함으로써 검출될 수 있다.
사용될 수 있는 구조물(116, 212)의 비제한적인 예로는, 스프링 또는 다른 가요성 구조물에 의해 서스펜딩되거나 지지된 캔틸레버, 다이아프램, 플랫폼, 또는 굴절 및/또는 공명 진동수의 이동과 같은 질량 의존성 및/또는 표면 응력이 측정될 수 있는 종래 기술분야에 공지된 임의의 다른 구조물(116, 212)을 들 수 있다. 적합한 구조물(116, 212)의 예는 도 1에 도시된 바와 같은 캔틸레버(116, 2121)이다. 공지된 마이크로조립 기법을 사용하여 이러한 하나 이상의 구조물(116, 212)을 갖는 분석 챔버(114, 210)를 조립할 수 있다(예: 밸러(Baller) 등의 문헌[2000,Ultramicroscopy.82:1-9; 미국 특허 제 6,073,484 호]). 나노스케일의 캔틸레버(116, 212) 배열의 조립 기법도 공지되어 있다(밸러, 랭(Lang) 등의 문헌[Appl. Phys. Lett. 72-383, 1998]; 랭 등의 문헌[Analytica Chimica Acta 393: 59, 1999]; http://monet.physik.unibas.ch/nose/inficon/; http://www.phantomsnet.com/phantom/net/phantomsconf/doc/Abadal.pdf; http://lmn.web.psi.ch/annrep/mntech3.pdf; www.nnf.comell.edu/2001cnfra/200138.pdf; http://www.princeton.edu/-cml/html/research/biosensor. html 참조). 본 발명의 다른 실시태양에서, 석영 결정 미량 천칭과 같은 압전 물질을 상기 구조물(116, 212)로서 사용할 수 있다(예: 조(Zhou) 등의 문헌[Biosensors & Bioelectronics16:85-95, 2001]; 야마구치(Yamaguchi) 등의 문헌[Anal. Chem.65: 1925-1927]; 바데아(Bardea) 등의 문헌[Chem. Commun.7:839-40, 1998]).
하나 이상의 주형 핵산(214)을 각 캔틸레버(116, 212)에 부착시킬 수 있다.검출 유닛(118)은 캔틸레버(116, 212)의 위치 및/또는 공명 진동수를 모니터한다. 본 발명의 몇몇 실시태양에서, 검출 유닛(118)은 광검출기(122)에 작동적으로 연결된 광원(120)을 포함할 수 있다. 또다르게, 압전 센서를 검출기(122)에 작동적으로 연결하거나 데이터 처리 및 제어 유닛(110)에 직접 연결할 수 있다.
도 1에 예시된 본 발명의 전형적인 실시태양은 캔틸레버(116, 212)의 굴절률의 광학적 검출을 도시한다. 검출 방법은 원자력 현미경 기술(AFM)로 공지된 바와 같은 광학 레버 기법에 기초한다. 낮은 전력의 레이저 빔(132)을 캔틸레버(116, 212)의 자유단 위에 집중시킬 수 있다. 반사된 레이저 빔(132)은 위치 민감형 광검출기(122)(PSD)를 때린다. 캔틸레버(116, 212)가 부착된 핵산(214, 220)의 질량 및/또는 캔틸레버(116, 212)의 표면 응력의 변화에 응답해서 구부러질 때, 반사된 레이저 빔(132)이 PSD(122)에 때리는 위치가 옮겨져 굴절 신호를 생성하게 된다. 질량 및/또는 표면 응력의 변화, 및 그 결과로서 생기는 캔틸레버(116, 212)의 굴절 정도는 PSD(122)상의 반사된 레이저 빔(132)의 이동으로부터 계산될 수 있다.
본 발명의 다양한 실시태양에서, 표지된 뉴클레오타이드(218) 용액을 분석 챔버(114, 210)로 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 표지된 구아닌("G") 뉴클레오타이드(218)를 포함한 용액을 시약 저장부(112)를 통해 분석 챔버(114, 210)로 도입시킬 수 있다. 상기 용액을 적절한 시간동안 주형 핵산(214), 프라이머(224) 또는 상보적 핵산(220) 및 폴리머라제(222)와 함께 항온처리할 수 있다. 주형 핵산(214)의 서열에서 다음 뉴클레오타이드(218)가 싸이토신("C")이면, 이어서 표지된 G를 성장중인 상보적 핵산(220) 가닥에 도입하고, 구조의 상응하는 변화를 검출할수 있다. 표지된 G 뉴클레오타이드(218)를 함유한 용액을 분석 챔버(114, 210)로부터 제거하고, 그 다음 표지된 뉴클레오타이드(218)(아데닌-"A", 티민-"T" 또는 싸이토신-"C")를 함유한 용액을 도입한다. 모두 4가지 표지된 뉴클레오타이드(218) 용액을 분석 챔버(114, 210)를 통해 사이클링한 후, 핵산(214)이 서열결정될 때까지 상기 사이클을 자체 반복하고 계속한다. 주형 핵산(214)의 서열은 상이한 뉴클레오타이드(218)가 주형(214)에 노출되는 순서와 측정된 구조물의 특성 변화를 서로 관련시킴으로써 결정할 수 있다. 동일한 유형의 수많은 뉴클레오타이드(218)를 상보적 가닥(220)에 도입시킬 때, 구조물(116, 212)의 특성의 비례하는 변화를 주지할 것이다. 예를 들어, 단일 뉴클레오타이드(218)의 도입이 구조물(116, 212)의 특성에서 "X"의 변화를 일으킨다면, 동일한 유형의 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드의 도입은 각각 약 2X 또는 3X의 변화를 일으킬 것으로 예상될 것이다.
본 발명의 대안적 실시태양에서, 표적 핵산(214)의 서열의 일부는 공지될 수 있다. 예를 들어, 핵산(214)을 이미 부분적으로 서열결정하거나, 공지되지 않은 핵산(214) 서열을 공지된 서열의 벡터, 링커 또는 그밖의 DNA에 연결시킬 수 있다. 이 경우, 모두 4가지의 뉴클레오타이드(218) 전체를 사이클링하기 보다는 서열에서 공지되지 않은 서열 영역에 도달할 때까지 그 다음 첨가를 위한 정확한 뉴클레오타이드(218)를 첨가할 수 있다. 일부 공지된 서열을 사용하면 적당한 기능을 위한 시스템 및 점검을 보정하도록 도울 수 있다. 예를 들어 단일 뉴클레오타이드 폴리모피즘(SNP)이 분석되는 특정 실시태양에서, 전체 핵산(214) 서열은 전형적으로 2개의 뉴클레오타이드(218) 중 하나를 함유하는 단일 위치를 제외하고는 공지될 수있다. 이러한 실시태양은 분석 챔버(114, 210)를 통한 보다 더욱 효율적인 뉴클레오타이드(218)의 사이클링을 허용한다.
도 2a, 도 2b 및 도 2c는 캔틸레버(116, 212) 및 캔틸레버(116, 212)에 부착된 주형 핵산(214)을 포함한 전형적인 분석 챔버(114, 210)의 세부도를 예시하고 있다. 도 2b는 캔틸레버(116, 212)에 부착된 단일 주형 핵산(214)의 확대도를 예시하고 있다. 주형(214)은 서열에서 주형 분자(214)의 3' 말단에 대응하는 프라이머(224) 올리고뉴클레오타이드와 혼성화된다. DNA 폴리머라제(222)와 같은 핵산 폴리머라제(222)는 프라이머(224)의 3' 말단에 부착되고, 상보적 가닥(220)을 합성하기 시작한다. 서열에서 각 뉴클레오타이드(218)는 폴리머라제(222)에 의해 프라이머(224)의 3' 말단 또는 상보적 가닥(220)에 첨가된다. 상보적 가닥(220)의 서열은 주형 가닥(214)과의 표준 워트슨 크리크(Watson-Crick) 염기쌍 형성에 의해 결정되는데, 이때 A는 오직 T(또는 RNA 주형(124)의 경우 우라실-"U")와 결합하고, C는 오직 G와 결합한다. 비록 본원에 논의된 발명의 실시태양이 DNA 주형 가닥(214)으로부터 DNA의 상보적 가닥(220)의 합성을 고려하고 있지만, 본 발명의 또다른 실시태양에서는 RNA 주형(214)이 상보적 RNA 또는 DNA 가닥(220)의 합성에 사용될 수 있거나, DNA 주형(214)이 상보적 RNA 가닥(220)의 합성에 사용될 수도 있음을 고려한다. RNA 합성의 경우, 예를 들어 RNA 폴리머라제(222)를 사용하면 프라이머(224)가 필요하지 않다.
뉴클레오타이드(218)의 도입시 질량 및/또는 표면 응력의 변화는 광학 검출 방법 또는 압전 장치를 사용하여 캔틸레버(116, 212)의 공명 진동수의 이동 또는굴절률에 의해 검출될 수 있다(미국 특허 제 6,079255 호 및 제 6,033,852 호 참조). 도 2c는 뉴클레오타이드(218) 도입에 따른 캔틸레버(116, 212)의 굴절률 차이(Δd)를 검출하는 전형적인 방법을 예시하고 있다. 정확성을 높이고 배경 소음을 줄이기 위해, 새로 도입된 뉴클레오타이드(218)를 함유한 캔틸레버(212)의 위치는 뉴클레오타이드(218) 도입이 예를 들어 프라이머(224)의 3' 말단에서 다이데옥시뉴클레오타이드의 사용에 의해 차단되는 하나 이상의 제어 캔틸레버(212)의 위치와 비교할 수 있다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 다이데옥시뉴클레오타이드는 핵산(220) 합성을 차단하거나 종료하도록 작용한다.
본 발명의 다양한 대안적 실시태양에서, 뉴클레오타이드(218)는 나노입자 또는 별개 질량을 갖는 나노입자 응집체와 같은 거대 기로 독특하게 표지될 수 있는데, 이는 각 유형의 뉴클레오타이드(218)를 규명하는데 사용될 수 있다. 뉴클레오타이드(218)의 용액은 1, 2, 3 또는 4가지 상이한 유형의 표지된 뉴클레오타이드(218)(A, G, C 및 T 또는 U)를 함유할 수 있다. 본 발명의 특정 대안적 실시태양에서, 4가지 유형의 뉴클레오타이드(218) 중 2개, 예를 들어 A 및 C 뉴클레오타이드(218)만을 질량 표지할 수 있다. 표지되지 않은 피리미딘(C, T 또는 U)과 퓨린(A, G) 뉴클레오타이드(218)간의 질량 차이는 질량 및/또는 표면 응력 검출에 의해 구별되어야 하고, 표지된 뉴클레오타이드(218)와 표지되지 않은 뉴클레오타이드(218)간의 차이도 마찬가지로 구별되어야 한다.
상보적 핵산(220) 가닥으로 도입되는 뉴클레오타이드(218)의 정체는 질량 및/또는 표면 응력의 변화 및 변화가 일어나는 순서에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 각 뉴클레오타이드(218)는 독특한 거대 기에 의해 표지될 수 있다. 도입된 표지 뉴클레오타이드(218)의 정체는 구조물(116, 212)의 질량 및/또는 표면 응력의 특수한 변화로부터 결정될 수 있다. 본 발명의 대안적 실시태양에서, 각 뉴클레오타이드(218)는 동일하거나 유사한 거대 기에 의해 표지될 수 있다. 표지된 뉴클레오타이드(218)가 길어진 상보적 핵산 가닥(220)에 첨가되는 서열을 규명함으로써 주형 핵산 가닥(214)의 서열을 결정할 수 있다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 첨가되는 뉴클레오타이드(218)는 DNA 전구체-데옥시아데노신 5' 트라이포스페이트(dATP)(218), 데옥시타이미딘 5' 트라이포스페이트(dTTP)(218), 데옥시구아노신 5'트라이포스페이트(dGTP)(218) 및 데옥시싸이토신 5'트라이포스페이트(dCTP)(218)일 수 있다. 본 발명의 대안적 실시태양에서, 뉴클레오타이드(218)는 아데노신 5' 트라이포스페이트(ATP)(218), 타이미딘 5' 트라이포스페이트(TTP)(218), 구아노신 5' 트라이포스페이트(GTP)(218) 및 싸이토신 5' 트라이포스페이트(CTP)(218)와 같은 RNA 전구체일 수 있다.
단일 뉴클레오타이드(218) 용액에의 연속 노출을 이용하여 수득될 수 있는 전형적인 데이터의 예는 도 3에 제공되어 있다. 표시된 바와 같이, 각 사이클에 있어서 주형(214), 프라이머(224) 또는 상보적 가닥(220) 및 폴리머라제(222)를 4가지 뉴클레오타이드(218) 유형(G, T, A 및 C)에 각각 연속해서 노출시킬 것이다. 사이클 1에서, T 용액이 첨가된 경우 질량 및/또는 표면 응력의 변화가 관찰되고, 이는 주형(214)상의 상응하는 A의 존재를 나타낸다. 사이클 2에서, G 용액이 첨가된 경우 질량 및/또는 표면 응력의 변화가 관찰되고, 이는 주형(214)에서 C를 나타낸다. 주형(214)의 직선 서열은 주기적인 첨가 및 측정을 연속함으로써 확인될 수 있다.
모두 4가지의 뉴클레오타이드(218)가 식별가능하게 표지되고 동일한 용액에 첨가되는 대안적 방법을 이용함으로써 얻을 수 있는 데이터의 예는 도 4에 예시되어 있다. 질량 표지는 예를 들어 G가 1 질량 유닛을 갖고, A가 2 질량 유닛을 갖고, T가 3 질량 유닛을 갖고, C가 4 질량 유닛을 갖도록 임의로 선택된다. 숙련자는 질량 유닛의 정확한 값들이 4가지 유형의 뉴클레오타이드(218) 각각에 대해 구별되는 한 상기 값들이 중요하지 않음을 알 것이다. 도 4에 도시된 바와 같이, 첨가된 제 1 뉴클레오타이드(218)는 T에 상응하는 3 유닛의 질량을 갖고, 첨가된 제 2 뉴클레오타이드(218)는 G에 상응하는 1 유닛의 질량을 갖고, 제 3 뉴클레오타이드(218)는 C에 상응하는 4 유닛의 질량을 갖는다. 5'에서 3'의 상보적(220) 서열을 판독해보면 도시되는 서열은 TGCAC이다. 3' 내지 5'의 주형(214) 가닥의 상응하는 서열은 ACGTG이다.
모두 4가지의 뉴클레오타이드(218)의 혼합물에 노출된 수많은 주형 가닥(214)을 포함한 본 발명의 실시태양에서, 중합 반응은 예를 들어 온도 변화가 제어되는 상태에서 분취량의 폴리머라제(222) 및/또는 프라이머(224)를 급속하게 혼합하면서 첨가하거나, 동일한 뉴클레오타이드(218)가 각 상보적 가닥(220)에 동시에 첨가되게 하는 유사한 공지 기법에 의해 동기화(synchronize)될 수 잇다. 긴 서열결정을 실시하는 경우, 중합 반응의 주기적 재동기화가 요구될 수 있다. 또다르게는, 동기화된 중합은 상보적 핵산 가닥(220)의 3' 말단에서 1개 이상의 보호기를이용할 수도 있다. 추가의 뉴클레오타이드(218)는 앞서 도입된 뉴클레오타이드(218)의 보호기를 제거하기 전에만 도입될 수 있다. 뉴클레오타이드(218)로부터 보호기의 첨가 및 분해는 널리 공지되어 있고, 미국 특허 제 6,310,189 호에 논의된 바와 같이 화학적 및/또는 광분해가능한 기를 포함할 수 있다.
표지된 뉴클레오타이드(218)가 사용되는 본 발명의 실시태양에서, 긴 주형 가닥(214)은 표지에 사용되는 거대 기로부터의 가능한 입체 장애의 영향을 피하거나 줄이기 위해 단계에서 서열결정될 수 있다. 입체 장애는 핵산 폴리머라제(222)의 활성을 잠재적으로 간섭할 수 있다. 비제한적인 예에서 주형 DNA 분자(214)를 서열결정하기 위해 프라이머(224)를 첨가하고 전술한 바와 같은 단일 표지된 뉴클레오타이드(218)(A, G, T 또는 C)를 함유한 용액을 첨가하여 첫 번째로 10개의 염기를 서열결정한다. 합성 후, 표지된 뉴클레오타이드(218)를 예를 들어 옥소뉴클레아제 활성을 이용하여 제거하고, 단일 표지되지 않은 뉴클레오타이드(218)를 함유한 용액에 노출시켜 표지되지 않은 뉴클레오타이드(218)로 대체시킬 수 있다. 주형(214)에서 그 다음 10개의 염기를 단일 표지된 뉴클레오타이드(218)를 함유한 용액에 노출시켜 서열결정한 후, 표지된 뉴클레오타이드(218)를 표지되지 않은 뉴클레오타이드(218)로 대체시킬 수 있다. 전체 주형(214)이 서열결정될 때까지 상기 과정을 반복할 수 있다. 숙련자는 이러한 실례가 단지 본보기가 되는 것이고, 상기 방법이 한번에 10개의 염기를 서열결정하는 것으로 한정되지 않음을 이해할 것이다. 폴리머라제(222) 활성과의 실질적 간섭이 일어나기 전에 상보적 가닥(220)으로 도입될 수 있는 인접한 표지 뉴클레오타이드(218)의 수를 결정하는 것은종래 기술 범위내에 널리 공지되어 있다. 그 수는 폴리머라제(222)의 유형 및 사용된 표지의 유형에 부분적으로 좌우될 것이다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 캔틸레버(116, 212)에 결합된 주형 핵산 분자(214)의 양을 제한할 수도 있다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 주형 핵산(214)은 최적의 신호를 얻기 위해 특별한 패턴 및/또는 배향으로 하나 이상의 캔틸레버(116, 212)에 부착될 수 있다. 주형 분자(214)의 패턴화는 예를 들어 구조물(116, 212)을 하기 논의된 바와 같은 다양한 공지 작용기로 코팅함으로써 달성될 수 있다.
주형 핵산(214)의 분석은 생물 제제 또는 질병 상태에 관한 정보를 적시에 비용 효과적인 방식으로 제공할 수 있다. 핵산(214) 분석으로부터 얻은 정보를 이용하여 백신 투여, 항생 요법, 항바이러스성 투여 또는 그밖의 치료법과 같은 효과적인 치료법을 결정할 수 있다.
마이크로-전기-기계 시스템(MEMS)
마이크로-전기-기계 시스템(MEMS)은 기계적 요소, 센서, 액추에이터, 및 일렉트로닉스를 포함하는 종합 시스템이다. 이들 모든 요소는 실리콘계 또는 동등한 기판을 포함한, 공통 칩상의 공지된 미세조립 기법에 의해 제작될 수 있다(예: 볼드만(Voldman) 등의 문헌[Ann. Rev. Biomed. Eng.1:401-425, 1999]). MEMS의 센서 요소를 사용하여 기계적, 열적, 생물학적, 화학적, 광학적 및/또는 자기적 현상을 측정할 수 있다. 일렉트로닉스는 센서로부터 정보를 처리하고 펌프, 밸브, 히터, 쿨러, 필터 등과 같은 액추에이터 요소를 제어하여 MEMS의 작용을 제어할 수있다.
MEMS의 전기적 요소는 집적 회로(IC) 처리(예: CMOS, 바이폴라(Bipolar) 또는 BICMOS 처리)를 이용하여 조립될 수 있다. 이들은 컴퓨터 칩 제작용으로 공지된 포토리소그래피 및 에칭 방법을 이용하여 패턴화할 수 있다. 마이크로공학적 요소는 실리콘 웨이퍼의 일부를 선택적으로 에칭하거나 새로운 구조층을 첨가하여 기계적 및/또는 전기기계적 요소를 제조하는 호환성 "마이크로매칭" 처리를 이용하여 조립될 수 있다. MEMS 제작에 기본적인 기법은 물질의 박막을 침착시키고, 포토리소그래픽 이미징 또는 그밖의 공지된 리소그래픽 방법에 의해 막의 상부에 패턴화 마스크를 적용하고 상기 막을 선택적으로 에칭하는 것을 포함한다. 박막은 수 나노미터 내지 100마이크로미터 범위의 두께를 가질 것이다. 사용되는 침착 기법으로는 화학적 증착(CVD), 전기침착법, 에피택시 및 열적 산화와 같은 화학적 방법 및 물리적 증착(PVD) 및 캐스팅과 같은 물리적 방법을 들 수 있다.
제작 방법은 제한되지 않고 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 레이저 삭막, 주입 성형, 분자 빔 에피택시, 딥-펜 나노리소그래피, 반응성-이온 빔 에칭, 화학적으로 보조되는 이온 빔 에칭, 마이크로파 보조된 플라즈마 에칭, 집중화 이온 빔 밀링, 전자 빔 또는 집중화 이온 빔 기법 또는 전사 기법을 사용할 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양을 위해 나노전기기계적 시스템의 제작 방법을 사용할 수 있다(예: 문헌[Craighead, Science 290: 1532-36, 2000]). 다양한 형태의 미세조립된 칩은 예를 들어 캘리퍼 테크놀로지즈 인코포레이티드(Caliper Technologies Inc.)(미국 캘리포니아주 마운튼 뷰 소재) 및 애클라라 바이오사이언스 인코포레이티드(ACLARA BioSciences Inc.)(미국 캘리포니아주 마운튼 뷰 소재)로부터 상업적으로 시판되고 있다.
본 발명의 다양한 실시태양에서, 도 1 및 도 2에 예시된 핵산 서열결정 장치(100)의 일부 또는 모든 요소는 통합된 MEMS 장치의 일부로서 구성될 수도 있음이 예측된다.
캔틸레버
본 발명의 특정 실시태양에서, 핵산(214,220)이 부착되는 구조물(116, 212)은 하나 이상의 캔틸레버(116, 212)를 포함한다. 캔틸레버(116, 212)는 한 말단은 부착되고 다른 말단은 자유로운 작고 얇은 탄성 레버이다. 캔틸레버(116, 212)의 제작 방법은 공지되어 있다(예: 밸러 등의 문헌[Ultramicroscopy82: 1-9, 2000]; 미국 특허 제 6,079,255 호]). 원자력 현미경 기술에 사용되는 캔틸레버(116, 212)는 전형적으로 길이가 약 100 내지 200㎛이고 두께가 약 1㎛이다. 1개의 이콜라이 세포와의 결합을 검출할 수 있는 길이가 15 내지 400㎛이고, 폭이 5 내지 50㎛이고, 두께가 320㎚인 실리콘 다이옥사이드 캔틸레버(116, 212)는 공지된 방법에 의해 제작되었다(일릭(Ilic) 등의 문헌[Appl. Phys. Lett.77: 450, 2000]). 상기 물질은 비제한적이고, 실리콘 또는 실리콘 나이트라이드와 같은 캔틸레버(116, 212) 구조물용으로 공지된 임의의 다른 물질을 사용할 수 있다. 본 발명의 다른 실시태양에서는 길이 약 50㎛, 폭 10㎛ 및 두께 100㎚의 캔틸레버(116, 212)를 사용할 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 길이가 100㎚ 정도로 작은, 크기가 훨씬 더 작은 나노스케일의 캔틸레버(116, 212)를 사용할 수도 있다. 본 발명의몇몇 실시태양에서, 길이가 약 10 내지 500㎛이고, 폭이 1 내지 100㎛이고, 두께가 100㎚ 내지 1㎛인 캔틸레버(116, 212)를 사용할 수도 있다.
캔틸레버(116, 212)가 공명하도록 유도된 경우, 캔틸레버(116, 212)의 자유단에 집중된 레이저 빔(132)을 굴절시킬 수 있다. 광 검출기(122)를 사용하여 캔틸레버(116, 212) 굴절률을 측정함으로써, 캔틸레버(116, 212)의 공명 진동수를 측정할 수 있다. 또다르게는, 캔틸레버(116, 212)의 굴절률은 반사광 빔(132)의 위치를 측정하는 위치 민감형 광검출기(122)를 이용하여 캔틸레버(116, 212)의 위치를 측정함으로써 결정될 수 있다. 이들 방법은 비제한적이고, 뉴클레오타이드(218)의 도입에 의해 영향을 받을 수 있는 구조물의 특성 변화를 측정하는 임의의 공지된 방법이 청구된 내용의 범위내에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 캔틸레버(116, 212)에 도입되거나 표면에 부착되는 금속 와이어는 캔틸레버(116, 212)가 구부러지고 와이어의 길이(및 폭)가 변할 때 그의 저항을 변화시킬 것으로 예측된다. 나노와이어를 캔틸레버(116, 212)에 부착하거나 도입하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 전기 저항을 측정하는 방법도 마찬가지이다.
검출 유닛
검출 유닛(118)을 사용하여 캔틸레버(116, 212)의 굴절률 및/또는 공명 진동수를 검출할 수 있다. 캔틸레버(116, 212)의 굴절률은 예를 들어 광학 및/또는 압전저항 검출기(122)(예: 미국 특허 제 6,079,255 호) 및/또는 표면 응력 검출기(122)(예: 프리츠(Fritz) 등의 문헌[Science 288(5464]: 316-8, 2000])를 사용하여 검출될 수 있다.
본 발명의 전형적인 실시태양에서, 압전저항 저항기를 캔틸레버(116, 212) 암의 고정단에 끼워 넣을 수 있다. 캔틸레버(116, 212)의 자유단의 굴절은 캔틸레버(116, 212)를 따라 응력을 생성한다. 상기 응력은 캔틸레버(116, 212) 굴절 정도에 비례하여 저항기(116, 212)의 저항을 변화시킨다. 저항 측정 장치는 압전저항 저항기에 연결되어 그의 저항을 측정하고 캔틸레버(116, 212) 굴절에 상응하는 신호를 생성할 수 있다. 이러한 압전저항 검출기(122)는, 캔틸레버(116, 212)가 굴절된 때 검출기(122)가 더 큰 응력을 견디도록 캔틸레버(116, 212)의 고정단에서 압축되어 제조될 수 있다(PCT 특허 출원 WO 97/09584).
저항 변화는 당해 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 캔틸레버(116, 212)의 굴절률 및/또는 공명 진동수의 변화를 계산하는데 이용할 수 있다. 작은 압전저항 캔틸레버(116, 212)를 제작하는 방법도 공지되어 있다. 비제한적으로 예로서, 압전저항 캔틸레버(116, 212)는 실리콘 절연막(SOI) 웨이퍼의 상부 층상에 하나 이상의 캔틸레버(116, 212) 형태를 한정함으로써 제조될 수 있다. 캔틸레버(116, 212)는 붕소 또는 다른 도판트로 도핑되어 p형 전도층을 생성할 수 있다. 도핑층과의 전기 접촉을 위해 금속을 침착시킬 수 있고, 캔틸레버(116, 212) 하면의 거대 실리콘을 제거함으로써 캔틸레버(116, 212)를 방출시킬 수도 있다. 이러한 방법은 전술한 바와 같이 공지된 리소그래피 및 에칭 기법을 이용할 수 있다.
본 발명의 몇몇 대안적 실시태양에서, 압전저항기 고유의 노이즈를 줄이기 위해 도판트 도입 후 얇은 옥사이드 층을 성장시킬 수 있다. 압전저항기 캔틸레버(116, 212)도 공지된 기법을 사용하여 증기상 에피택시에 의해 성장시킬 수 있다.본 발명의 특정 실시태양에서, 압전은 캔틸레버(116, 212)의 진동을 유도하는데 사용될 수 있다. 압전저항기를 대조 저항기와 함께 휘트스톤 브리지 회로로 도입시킴으로써, 캔틸레버(116, 212)의 저항을 모니터할 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 캔틸레버(116, 212) 굴절률 및/또는 공명 진동수는 광학 검출 센서(118)를 사용하여 검출될 수 있다. 이러한 검출 유닛(118)은 광원(120), 예를 들어 레이저 다이오드 또는 수직 공동 표면 방출 레이저(VCSEL)의 배열, 및 위치 민감형 광검출기(122)를 포함한다. 예비증폭기를 사용하여 광전류를 전압으로 전환시킬 수 있다. 광원(120)에 의해 방출된 광은 캔틸레버(116, 212)의 자유단 위로 보내져 하나 이상의 포토다이오드(122)로 반사된다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 캔틸레버(116, 212)의 자유단은 고반사 표면, 예를 들어 은으로 피복되어 반사된 빔(132)의 강도를 증가시킬 수 있다. 캔틸레버(116, 212)의 굴절은 반사광 빔(132)의 위치를 변화시킨다. 이러한 변화는 위치 민감형 광검출기(122)에 의해 검출되고 분석되어 캔틸레버(116, 212)의 이동량을 측정할 수 있다. 그 결과 캔틸레버(116, 212)의 이동은 캔틸레버(116, 212)에 부착된 핵산(214, 220)의 추가 질량을 측정하는데 이용될 수 있다. 숙련자는 본원에서 논의된 전형적인 검출 기법을 다이아프램 또는 서스펜딩된 플랫폼과 같은 다른 유형의 구조물(116, 212)에 적용시킬 수 있음을 알 것이다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 구조물(116, 212)의 굴절률 및/또는 공명 진동수는 압전(PE) 및/또는 압전자기 검출 유닛(118)을 사용하여 측정될 수 있다(예: 발라톤(Ballato)의 문헌["Modeling piezoelectric and piezomagnetic devices andstructures via equivalent networks",IEEE Trans. Ultrason. Ferroelectr. Freq. Control48: 1189-240, 2001]). 압전 검출 유닛(118)은 센싱 요소(들)의 압전 효과를 이용하여 전하 출력을 생성한다. PE 검출 유닛(118)은 작동을 위한 외부 전력원을 요하지 않는다. "스프링" 센싱 요소는 가해진 응력량에 비례하는 일정한 수의 전자를 생성한다. 수많은 천연 및 인조 물질, 예를 들어 크리스탈, 세라믹 및 몇몇 중합체가 이러한 특성을 나타낸다. 이들 물질은 변형되었을 때 변하는 순수 전하 분포를 갖는 일정한 결정질 분자 구조를 갖는다.
또한, 압전 물질은 응력을 받지 않은 상태에서 쌍극자를 가질 수도 있다. 이러한 물질에서 응력으로부터 변형에 의해 전기장이 생성되어 압전 응답을 일으킬 수 있다. 전하는 실제로 생성되지 않지만 대체된다. 쌍극자의 방향에 따라 전기장이 생성되는 경우 압전 물질의 한 말단으로부터 단일 검출기(122)를 통해 안전 물질의 다른 말단까지 이동하여 회로를 폐쇄하는 이동성 전자가 생성된다. 이동된 전자의 양은 압전 물질에서 응력의 정도와 시스템의 전기용량의 함수이다.
숙련자는 본원에 논의된 검출 기법이 단지 예시적인 것이고, 구조물(116, 212)의 굴절률 및/또는 공명 진동수, 또는 임의의 그밖의 질량 및/또는 표면 응력 의존성의 변화를 측정하기 위해 임의의 공지된 기법을 사용할 수도 있음을 알 것이다.
핵산
서열결정되는 핵산 분자(214)는 임의의 공지된 기법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 한 실시태양에서, 핵산(214)은 자연적으로 발생된 DNA 또는 RNA 분자이다. 실제로, 염색체, 미토콘드리아 또는 엽록체 DNA이거나, 메신저, 이형 핵 리보솜 또는 운반 RNA를 포함하지만 이들로 한정되지 않는, 임의의 자연적으로 발생되는 핵산(214)은 상기 개시된 방법에 의해 제조 및 서열결정될 수 있다. 핵산(214)의 다양한 형태의 제조 및 단리 방법은 공지되어 있다(예: 문헌[Guide to Molecular Cloning Techniques, eds. Berger and Kimmel, Academic Press, New York, N.Y., 1987]; [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., eds. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989] 참조). 인용 문헌에 개시된 방법은 다만 예시적인 것이고, 당해 기술분야에 공지된 임의의 다양한 방법을 이용할 수 있다.
외가닥 DNA(ssDNA)(214)가 서열결정되는 경우, ssDNA(214)는 이중 가닥 DNA(dsDNA)로부터 임의의 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법에는 dsDNA를 가열하고 상기 가닥을 분리하는 것을 포함하거나, 또다르게는 M13으로의 클로닝과 같은 공지된 증폭 또는 복제 방법에 의해 dsDNA로부터 ssDNA(214)를 제조하는 것을 포함한다. 이러한 임의의 공지된 방법을 ssDNA 또는 ssRNA(214)를 제조하는데 이용할 수 있다.
상기 논의는 자연적으로 발생된 핵산(214)의 제조에 관한 것이지만, 실제로 캔틸레버 또는 등등한 구조물(116, 212)에 부착될 수 있는 임의의 유형의 핵산은 개시된 방법에 의해 서열결정될 수 있다. 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응(PCRTM) 증폭과 같은 다양한 증폭 기법에 의해 제조된 핵산(214)은 서열결정될 수 있다(미국 특허 제 4,683,195 호, 제 4,683,202 호 및 제 4,800,159 호). 서열결정되는 핵산(214)은 또다르게는 표준 벡터(예: 플라스미드, 코스미드, BAC(인위적인 박테리아 염색체) 또는 YAC(인위적인 이스트 염색체))에서 클로닝될 수 있다(예: 문헌[Berger and Kimmel, 1998; Sambrook et al., 1989] 참조). 핵산 삽입체(214)는, 예를 들어 적당한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고 이어서 아가로스 겔 전기영동법에 의해 벡터 DNA로부터 단리될 수 있다. 삽입된 핵산(214)의 단리 방법은 널리 공지되어 있다.
서열결정되는 핵산(214)은 바이러스, 박테리아, 병원균 유기체, 진핵세포, 식물, 동물, 포유동물, 개, 고양이, 양, 소, 돼지, 염소 및 인간을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 매우 다양한 유기체로부터 단리될 수 있다. 또한, 사용에 있어서 증폭된 핵산(214) 또는 핵산의 증폭된 부분을 고려한다.
서열결정에 사용되는 핵산(214)은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭, 리가제 연쇄 반응 증폭, 큐베타(Qbeta) 복제효소 증폭, 가닥 이동 증폭, 전사계 증폭 및 핵산 서열계 증폭(NASBA)과 같은 임의의 공지된 방법에 의해 증폭될 수 있다.
핵산 합성
본 발명의 특정 실시태양은, 예를 들어 DNA 폴리머라제(222)를 사용한 상보적 DNA(220)의 합성을 포함한다. 이러한 폴리머라제(22)는 프라이머 분자(224)에 결합하고, 표지된 뉴클레오타이드(218)를 프라이머(224)의 3' 말단에 첨가할 수 있다. 사용가능한 폴리머라제(222)의 비제한적 예는 DNA 폴리머라제(222), RNA 폴리머라제(222), 역전사효소(222), 및 RNA-의존성 RNA 폴리머라제(222)를 포함한다.이들 폴리머자제의 "교정(proofreading)" 활성 및 프라이머(224) 및 프로모터 서열의 필요성 또는 필요성 결여에 대한 이들 폴리머라제 간의 차이는 당해 기술분야에 공지되어 있다. RNA 폴리머라제(222)가 사용된 경우, 서열결정되는 주형 분자(214)는 이중 가닥 DNA(214)일 수 있다. 사용될 수 있는 폴리머라제(222)의 비제한적 예로는 써마토가 마리티마(Thermatoga maritima) DNA 폴리머라제(222), 등록상표 앰플리택FS(AmplitaqFS) DNA 폴리머라제(222), 등록상표 태쿼나아제(Taquenase) DNA 폴리머라제(222), 등록상표 써모시쿼나아제(ThermaSequenase)(222), 태크(Taq) DNA 폴리머라제(222), 등록상표 큐베타 복제효소(222), T4 DMA 폴리머라제(222), 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus) DNA 폴리머라제(222), RNA-의존성 RNA 폴리머라제(222) 및 SP6 RNA 폴리머라제(222)를 들 수 있다.
푸(Pwo) DNA 폴리머라제(222)(미국 인디아나주 인디아나폴리스 소재의 베링거 만하임 바이오케미칼스(Boehringer Mannheim Biochemicals)); 비스트(Bst) 폴리머라제(222)(미국 캘리포니아주 헤르쿨레스 소재의 바이오-라드 래보러토리스(Bio-Rad Laboratories)); 등록상표 아이소썸(IsoTherm) DNA 폴리머라제(222)(미국 위스콘신주 메디슨 소재의 에피센트르 테크놀러지스(Epicentre Technologies)); 몰로니 뮤린 류케미아 바이러스 리버스 트랜스크립타제(222)(Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase),PfuDNA 폴리머라제(222), 아비안 미엘로블라스토시스 바이러스 리버스 트랜스크립타제(222)(Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase), 써무스 플라버스(Thermus flavus;Tfl) DNA 폴리머라제(222) 및써모코코스 리토랄리스(Termococcus litoralis;Tli) DNA 폴리머라제(222)(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가 코포레이션(Promega Corp.); RAV2 리버스 트랜스크립타제(222), HIV-1 리버스 트랜스크립타제(222), T7 RNA 폴리머라제(222), T3 RNA 폴리머라제(222), SP6 RNA 폴리머라제(222), 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) DNA 폴리머라제(222), T7 DNA 폴리머라제(222) +/- 3'→5' 엑소뉴클레아제, DNA 폴리머라제 I(222)의 클레노우 프래그먼트(Klenow Fragment), 써무스(Thermus) '보편적(ubiquitous)' DNA 폴리머라제(222), 및 DNA 폴리머라제 I(222)(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech))을 비롯한 수많은 폴리머라제(222)가 상업적으로 시판중이다. 표지된 뉴클레오타이드(218)의 주형 의존성 중합화할 수 있는 당해 기술분야에 공지된 임의의 폴리머라제(222)를 사용할 수 있다(굿맨(Goodman) 및 티핀(Tippin)의 문헌["Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1(2)", 101-9, 2000]; 미국 특허 제 6,090,589 호 참조). 폴리머라제(222)를 사용하여 표지된 뉴클레오타이드(218)로부터 핵산(220)을 합성하는 방법은 공지되어 있다(미국 특허 제 4,962,037 호, 제 5,405,747 호, 제 6,136,543 호 및 제 6,210,896 호 참조).
프라이머
긴 프라이머(224)가 사용될 수도 있지만, 일반적으로 프라이머(224)의 길이는 10 내지 20개의 염기 사이이다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 프라이머(224)는 서열에서 주형 핵산(214)의 공지된 부분에 정확히 대응하도록 설계된다. 공지된 프라이머(224) 서열은, 예컨대 프라이머(224)가 공지된 고정 염색체 서열에 인접한 서열 변형체를 확인하기 위해 선택되는 경우, 공지되지 않은 핵산(214) 서열이 공지된 서열의 벡터로 삽입되는 경우, 또는 천연 핵산(214)이 부분적으로 서열결정되는 경우에 사용될 수 있다. 프라이머를 합성하는 방법은 공지되어 있고, 올리고뉴클레오타이드 합성제는 상업적으로 시판중이다(예: 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems); 매사추세츠주 베드포드 소재의 밀리포어 코포레이션(Millipore Corp.)). 프라이머(224)는 또한 상업적 행상인으로부터 구입할 수 있다(예: 텍사스주 미드랜드 소재의 미드랜드 서티파이드 리에이젼츠(Midland Certified Reagents)).
본 발명의 대안적 실시태양은 공지된 프라이머(224) 결합 부위의 부재하에 핵산(214)을 서열결정하는 것을 포함할 수 있다. 이 경우, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개의 염기 또는 그 이상의 길이로 이루어진 랜덤 헥사머(224) 또는 랜덤 올리고머(224)와 같은 랜덤 프라이머(24)의 사용이 가능할 수 있다.
핵산 부착
본 발명의 다양한 실시태양에서, 핵산(214)을 비공유 또는 공유 결합에 의해 구조물(116, 212)에 부착시킬 수 있다. 비제한적인 예에서, 부착은 구조물(116, 212)을 스트렙트아비딘 또는 아비딘으로 코팅한 후 비오틴화 핵산(214) 및/또는 프라이머(224)를 결합함으로써 일어날 수 있다. 다른 실시태양에서, 부착되는 핵산 분자(214)의 표면 및/또는 구조물(116, 212)의 표면은 다양한 공지된 반응기로 개질시켜 부착을 용이하게 할 수 있다.
예를 들어, 표면은 알데하이드, 카복시, 아미노, 에폭시, 설프하이드릴, 광활성화된 기 또는 그밖의 공지된 기로 개질시킬 수 있다. 표면 개질은 반응기를 함유한 실레인으로 코팅하는 것과 같은 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 비제한적인 예로는 아미노실레인, 아지도트라이메틸실레인, 브로모트라이메틸실레인, 요오도트라이메틸실레인, 클로로다이메틸실레인, 다이아세톡시다이-t-뷰톡시실레인, 3-글리시독시프로필트라이메톡시실레인(GOP) 및 아미노프로필트라이메톡시실레인(APTS)을 들 수 있다. 핵산을 부착하기 위한 실레인 및 그밖의 표면 코팅제는 상업적 공급원으로부터 얻을 수 있다(예: 펜실베니아주 브리스톨 소재 유나이티드 케미칼 테크놀로지즈(United Chemical Technologies)).
하기 논의된 본 발명의 특정 실시태양에서는 개질되지 않은 핵산(214)을 표면에 부착할 수도 있지만 핵산(214)을 다양한 반응기로 개질시켜 부착을 용이하게 할 수도 있다. 특별한 실시태양에서, 핵산(214)은 표면 반응기, 예를 들어 설프하이드릴, 아미노, 알데하이드, 카복실 또는 에폭시 기 또는 광반응 기를 함유하도록 5' 또는 3' 말단 및/또는 내부 잔기에서 개질될 수 있다. 본 발명의 특별한 실시태양에서, 핵산(214)은 바이오틴, 스트렙트아비딘, 아비딘, 다이작시게닌, 플루오레세인 또는 콜레스테롤과 같은 표면에 비공유 부착용 기로 개질시킬 수 있다. 개질된 핵산, 올리고뉴클레오타이드 및/또는 뉴클레오타이드는 상업적 공급원(예: http://www.operon.com/store/desref.php)으로부터 얻을 수 있거나 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 특별한 실시태양에서, 부착은 화학적으로 개질된 구조물(116, 212)에의 5'-포스포릴화 핵산(214)의 직접 공유 부착에 의해 일어날 수 있다(라스뮤센(Rasmussen) 등의 문헌[Anal. Biochem.198: 138-142, 1991]). 핵산(214) 및 구조물(116, 212) 사이의 공유 결합은 형성될 수 있는데, 예를 들어 수용성 카보다이이미드와의 축합일 수 있다. 이 방법은 주로 5'-포스페이트를 통한 핵산(214)의 5'-부착을 용이하게 한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 주형 핵산(214)은 그의 3' 말단을 통해 고정화되어 상보적 핵산(220)의 중합이 5'에서 3' 방식으로 진행되게 할 수 있다.
부착은 구조물(116, 212)을 폴리-L-Lys(라이신)으로 코팅하고, 이어서 이작용성 가교제를 사용하여 아미노- 또는 설프하이드릴-개질된 핵산(214) 중 하나의 공유 부착을 수행함으로써 일어날 수 있다(러닝(Running) 등의 문헌[BioTechniques8: 276-277, 1990; Newton et al.,Nucleic Acids Res.21:1155-62, 1993] 참조). 본 발명의 대안적 실시태양에서, 핵산(214)은 나이트렌, 카벤 또는 케틸 라디칼과 같은 광반응성 종을 함유한 광중합체를 사용하여 구조물(116, 212)에 부착시킬 수 있다(미국 특허 제 5,405,766 호 및 제 5,986,076 호 참조). 또한, 부착은 구조물(116, 212)을 금과 같은 금속으로 코팅하고, 이어서 아미노- 또는 설프하이드릴-개질된 핵산(214)의 공유 부착을 수행함으로써 일어날 수 있다.
이작용성 가교제는 부착을 위해 사용될 수 있다. 전형적인 가교제로는 글루타르알데하이드(GAD), 이작용성 옥시레인(OXR), 에틸렌 글리콜 다이글리시딜 에테르(EGDE) 및 카보다이이미드(예; 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드(EDC))를 들 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시태양에서, 구조물(116, 212) 작용기는 가교 화합물에 공유 부착되어 핵산 분자(214) 및 폴리머라제(22) 사이의 입체장애를 줄일 수 있다. 전형적인 가교기로는 에틸렌 글리콜 올리고머 및 다이아민을 포함한다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 캡처 올리고뉴클레오타이드(224)는 구조물(116, 212)에 결합될 수 있다. 캡처 올리고뉴클레오타이드(224)는 주형 핵산(214)상의 상보적 서열과 혼성화할 수 있다. 일단 주형 핵산(214)이 결합되면 캡처 올리고뉴클레오타이드는 핵산 중합을 위해 프라이머(224)로서 사용될 수 있다.
각 구조물(116, 212)에 부착되는 핵산의 수는 구조물(116, 212)의 민감도 및 시스템의 소음 수준에 따라 변할 것이다. 길이 약 500㎛의 큰 캔틸레버(116, 212)는 캔틸레버(116, 212) 당 부착된 핵산(214)의 1010개 분자만큼 이용할 수 있다. 그러나, 작은 캔틸레버(116, 212)를 이용하면, 부착된 핵산(214)의 수를 크게 줄일 수 있다. 이용가능한 신호를 생성하는데 필요한 부착된 핵산(214)의 수는 당해 분야의 기술내에서 널리 알려져 있다.
구조물에 부착된 핵산의 패턴화
본 발명의 특별한 실시태양에서, 핵산(214)은 구조물(116, 212)의 표면에 신호 진폭을 최적화하고 배경 소음을 줄이도록 선택된 특정 패턴으로 부착시킬 수 있다. 핵산(214)을 표면에 선택된 패턴으로 부착시키는 다양한 방법이 종래 기술분야에 공지되어 있고, 이러한 임의의 방법을 사용할 수 있다.
예를 들어, 싸이올-유도된 핵산(214)은 금의 박층으로 코팅된 구조물(116, 212)의 표면에 부착시킬 수 있다. 싸이올 기는 금 표면과 반응하여 공유 결합을형성한다(한센(Hansen) 등의 문헌[Anal. Chem.73:1567-71, 2001]). 핵산(214)은 대안적 방법에 의해 특정 패턴으로 부착될 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 구조물의 전체 표면은 금 또는 대안적 반응기로 코팅될 수 있다. 유도체화 핵산(214)은 예를 들어 딥-핀 나노리소그래피에 의해 임의의 선택된 패턴으로 표면상에 침착될 수 있다. 또다르게는, 금층은 반응성-이온 빔 에칭, 전자 빔 또는 집중화 이온 빔 기법과 같은 공지된 방법에 의해 선택된 패턴으로 에칭될 수 있다. 싸이올-개질된 핵산(214)에의 노출시, 핵산(214)은 잔류 금층이 존재하는 경우에만 구조물(116, 212)의 표면에 결합될 것이다.
패턴화는 포토리소그래피 방법을 이용하여 달성될 수도 있다. 표면에 핵산(214)을 부착하는 포토리소그래피 방법은 널리 공지되어 있다(예: 미국 특허 제 6,379,895 호 참조). 구조물(116, 212)의 선택된 면적을 광 빔에 노출시키거나 보호하기 위해 포토마스크를 사용할 수 있다. 광 빔은 광활성가능한 결합기와 같은 특정 영역의 화학적 성질을 활성화하여, 주형 핵산(214)을 보호된 영역이 아니라 활성화된 영역에 부착되게 한다. 아지도 화합물과 같은 광활성기는 공지되어 있고, 상업적 공급원으로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 나노스케일 패턴은 딥-펜 나노리소그래피, 반응성-이온 빔 에칭, 화학적으로 보조된 이온 빔 에칭, 집중화 이온 빔 밀링, 저전압 전자 빔 또는 집중화 이온 빔 기법 또는 전사 기법과 같은 공지된 방법을 이용하여 구조물의 표면상에 침착시킬 수 있다.
패턴화된 핵산(214) 침착은 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 핵산(214) 패턴은 저전압 전자 빔리소그래피와 같은 공지된 리소그래픽 기법에 의해 패턴으로 배열된 자체-조립된 단층을 이용하여 침착될 수 있다. 예를 들어, 패릴렌 또는 동등 화합물로 된 층을 구조물의 표면에 침착시켜 리프트오프(liftoff) 방법에 의해 패턴화하여 핵산(214) 부착을 위한 패턴화 표면을 형성할 수 있다(예: 미국 특허 제 5,612,254 호, 제 5,891,804 호, 제 6,210,514 호).
뉴클레오타이드 표지
본 발명의 특정 실시태양에서, 1개 이상의 표지를 하나 이상의 유형의 뉴클레오타이드(218)에 부착시킬 수 있다. 표지는 거대 기로 구성될 수 있다. 사용될 수 있는 표지의 비제한적인 예로는 나노입자(예: 금 나노입자), 중합체, 카본 나노튜브, 풀러렌, 작용화 풀러렌, 양자 점(quantum dot), 덴드리머, 형광물, 발광물, 인광물, 전자 조밀 또는 질량 분광학적 표지를 포함한다. 유기 표지, 무기 표지 및/또는 유기-무기 혼성 표지와 같은 임의의 유형의 표지를 사용할 수 있다. 표지는 다양한 방법, 예를 들어 구조물(116, 212)의 공명 진동수의 변화, 압전 시뮬레이션, 구조물(116, 212) 굴절률, 및 질량 및/또는 표면 응력의 변화를 측정하는 그밖의 수단을 이용하여 검출될 수 있다.
표지된 뉴클레오타이드(218)는 스페이서 암에 의해 표지에 연결되는 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드(218) 염기, 당 및 포스페이트 기는 수소 결합 형성 또는 핵산(220) 중합을 절충하지 않고 개질될 수 있다. 표지의 첨가에 의해 개질될 수 있는 퓨린 또는 피리미딘 염기의 위치는, 예를 들어 구아닌의 N2 및 N7 위치, 아데닌의 N6 및 N7 위치, 싸이토신, 타이미딘 및 우라실의 C5 위치, 및 싸이토신의 N4 위치를 포함한다.
사용될 수 있는 당해 기술분야에 공지된 다양한 표지로는 TRIT(테트라메틸 로다민 아이소티올), NBD(7-나이트로벤즈-2-옥사-1,3-다이아졸), 텍사스 레드 염료, 프탈산, 테레프탈산, 아이소프탈산, 크레실 패스트 바이올렛, 크레실 블루 바이올렛, 브릴리언트 크레실 블루, 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 바이오틴, 다이작시게닌, 5-카복시-4',5'-다이클로로-2',7'-다이메톡시 플루오레세인, 5-카복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 5-카복시 로다민, 6-카복시로다민, 6-카복시테트라메틸 아미노 프탈로사이아닌, 아조메틴, 사이아닌, 크산틴, 숙시닐플루오레세인 및 아미노아크리딘을 포함한다. 이들 및 그밖의 표지는 상업적 공급원(예: 미국 오래건주 유진 소재의 몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes))으로부터 구입할 수 있다. 다환상 방향족 화합물 또는 카본 나노튜브도 표지로서 사용될 수 있다.
표지에 공유 부착된 뉴클레오타이드(218)는 표준 상업적 공급원(예: 미국 인디아나주 인디아나폴리스 소재의 로슈 몰레큘러 바이오케미칼스(Roche Molecular Biochemicals); 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가 코포레이션(Promega Corp.); 미국 텍사스 오스틴 소재의 앰비온 인코포레이티드(Ambion Inc.); 미국 뉴저지주 피츠카타웨이 소재의 애머셤 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech))으로부터 시판된다. 다른 분자, 예컨대 뉴클레오타이드(218)와 공유결합적으로 반응하도록 설계된 반응기를 함유한 다양한 표지는 상업적으로 시판중이다(예: 미국 오래건주 유진 소재의 몰레큘러 프로브즈). 표지된 뉴클레오타이드(218)를 제조하는 방법도 공지되어 있다(예: 미국 특허 제 4,962,037 호, 제 5,405,747 호, 제 6,136,543 호 및 제 6,210,896 호).
나노입자
본 발명의 특정 실시태양에서 나노입자는 뉴클레오타이드(218)를 표지하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시태양에서, 나노입자는 은 또는 금 나노입자이다. 다른 크기 및 질량을 갖는 나노입자도 고려되지만 본 발명의 다양한 실시태양에서는 직경 1 내지 100㎚의 나노입자를 사용할 수 있다. 나노입자를 제조하는 방법은 공지되어 있다(예: 미국 특허 제 6,054,495 호; 제 6,127,120 호; 제 6,149,868 호; 리(Lee) 및 마이셀(Meisel)의 문헌[J. Phys. Chem.86:3391-3395, 1982] 참조). 또한, 나노입자는 상업적 공급원으로부터 구입할 수 있다(예: 미국 뉴욕주 야판크 소재의 나노프로브즈 인코포레이티드(Nanoprobes Inc.); 미국 펜실베이아주 워링톤 소재의 폴리사이언스 인코포레이티드(Polysciences, Inc.)).
본 발명의 특정 실시태양에서, 나노입자는 단일 나노입자이다. 또다르게는, 나노입자는 가교되어 나노입자의 특정한 응집체, 예컨대 이량체, 삼량체, 사량체 또는 기타 응집체를 생성할 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 선택된 수의 나노입자(이량체, 삼량체 등)를 함유한 응집체는 자당 용액 중에서 한외 여과와 같은 공지된 기법에 의해 진하게 하거나 정제할 수 있다.
나노입자의 가교 방법은 공지되어 있다(예: 펠트하임(Feldheim)의 문헌["Assembly of metal nanoparticle arrays using molecular bridges", The Electrochemical Society Interface, Fall, 2001, pp. 22-25]). 금 나노입자는,예컨대 말단 싸이올 또는 설프하이드릴 기를 함유하는 이작용성 연결 화합물을 사용하여 가교될 수 있다. 금 나노입자와의 반응시, 연결자는 연결자의 길이만큼 떨어진 나노입자 이량체를 형성한다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 3개, 4개 또는 그 이상의 싸이올 기를 갖는 연결자를 사용하여 복수개의 나노입자에 동시에 부착시킬 수 있다([Feldheim, 2001] 참조). 연결 화합물에 대해 과량의 나노입자를 사용하는 것은 나노입자 침전과 다중 가교의 형성을 방지한다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 나노입자는 연결 화합물에 부착하기 전에 다양한 반응기를 함유하도록 개질될 수 있다. 개질된 나노입자는 상업적으로 입수가능하다(예: 미국 뉴욕주 야판크 소재의 나노프로브즈 인코포레이티드의 나노골드(Nanogold)(등록상표) 나노입자). 나노골드(등록상표) 나노입자는 나노입자 당 부착된 1개 또는 복수개의 말레이미드, 아민 또는 기타 기와 함께 수득될 수 있다. 또한, 나노골드(등록상표) 나노입자는 양극 또는 음극으로 대전된 형태로 이용가능하다. 이러한 개질된 나노입자는 다양한 공지 연결 화합물에 부착되어 나노입자의 이량체, 삼량체 또는 기타 응집체를 제공할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시태양에서, 나노입자는 뉴클레오타이드(218)에 공유 부착될 수 있다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 뉴클레오타이드(218)는 나노입자에 직접 부착되거나 나노입자에 공유결합되거나 비공유결합된 연결 화합물에 부착될 수 있다. 본 발명의 이러한 실시태양에서, 연결 화합물은, 둘 이상의 나노입자를 함께 가교하기보다는 뉴클레오타이드(218)를 나노입자 또는 나노입자 응집체에 부착시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 나노입자는 유도체화실레인으로 코팅될 수 있다. 이러한 개질된 실레인은 공지된 방법을 사용하여 뉴클레오타이드(218)에 공유 부착될 수 있다.
본 발명의 전형적인 실시태양에서, 뉴클레오타이드(218)는 작은 크기의 나노입자를 1, 2, 3 또는 4개 함유한 응집체로 구별되게 표지될 수 있다. 또다르게는, 뉴클레오타이드(218)는 크기 및 질량이 상이한 개별적인 나노입자로 표지될 수 있다. 사용되는 전형적인 금 나노입자는 5, 10, 15, 20, 40 및 60㎚ 크기로 폴리사이언스 인코포레이티드로부터 구입가능하다. 특정 실시태양에서, 각각 상이한 유형의 뉴클레오타이드(218)(A, G, C 및 T 또는 U)는 식별가능한 질량을 갖는 나노입자 또는 나노입자 응집체로 표지될 수 있다.
정보 처리 및 제어 시스템 및 데이터 분석
본 발명의 특정 실시태양에서, 서열결정 장치(100)는 데이터 처리 및 제어 시스템(110)과 인터페이스로 접속될 수 있다. 본 발명의 전형적인 실시태양에서, 상기 시스템(110)은 정보를 전달하기 위한 버스 또는 그밖의 전달 수단, 및 정보를 처리하기 위한 버스와 연결된 프로세서 또는 그밖의 프로세서 수단을 포함하는 컴퓨터(110)를 도입할 수 있다. 본 발명의 한 실시태양에서, 프로세서는, 인텔 코포레이션(Intel Corp.)(미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)으로부터 구입가능한 펜티엄(Pentium, 등록상표) II 급, 펜티엄 III 급 및 펜티엄 4 급 프로세서를 포함하는 펜티엄 급 프로세서 중에서 선택된다. 본 발명의 대안적 실시태양에서, 프로세서는 셀러론(Celeron, 등록상표), 이타늄(Itanium, 등록상표) 또는 펜티엄 제온(Pentium Xeon, 등록상표) 프로세서 또는 X-스케일(X-scale, 등록상표) 급 프로세서일 수 있다(인텔 코포레이션, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재). 본 발명의 여러 다른 실시태양에서, 프로세서는 인텔(Intel) IA-32 또는 인텔 IA-64 구조와 같은 인텔 구조에 기초할 수 있다. 또다르게는, 다른 프로세서를 사용할 수 있다.
컴퓨터(110)는 상기 프로세서에 의해 실행되는 정보 및 지시를 저장하기 위해 버스에 연결된 임의 접근 기억장치(RAM) 또는 다른 동적 기억 장치(주 기억장치)를 추가로 포함할 수 있다. 주 기억장치는 프로세서에 의한 지시의 실행 동안 일시적인 변수 또는 그밖의 중간 정보를 저장하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 컴퓨터(110)는 프로세서를 위한 정적 정보 및 지시를 저장하기 위해 버스에 연결된 읽기 전용 기억장치(ROM) 및/또는 그밖의 다른 정적 저장 장치를 포함할 수 있다. 디스플레이 장치, 키보드, 마우스, 모뎀, 네트워크 카드 또는 종래 기술분야에 공지된 그밖의 다른 요소와 같은 그밖의 다른 표준 컴퓨터(100) 요소를 정보 처리 및 제어 시스템으로 도입시킬 수 있다. 숙련자는 본원에 기재된 예와 다르게 장착된 정보 처리 및 제어 시스템(110)이 특별한 이행을 위해 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 시스템(100)의 구성은 변할 수 있다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 검출 유닛(118)은 또한 버스에 연결될 수 있다. 프로세서는 검출 유닛(118)으로부터 데이터를 처리할 수 있다. 처리된 및/또는 처리되지 않은 데이터는 주 기억장치에 저장될 수 있다. 분석 챔버(114, 210)에 도입된 표지된 뉴클레오타이드(218) 용액의 서열 및/또는 뉴클레오타이드(218)의 질량에 관한 데이터는 주 기억장치 또는 ROM에 저장될 수도 있다. 프로세서는 상보적 핵산 가닥(220)으로 도입된 뉴클레오타이드(218)의 서열을 규명하기 위해검출된 질량 및/또는 표면 응력의 변화를 표지된 뉴클레오타이드(218) 질량과 비교할 수 있다. 프로세서는 검출 유닛(118)으로부터 데이터를 분석하여 주형 핵산(214)의 서열을 결정할 수 있다.
정보 처리 및 제어 시스템(110)은 서열결정 장치(100)의 자동화된 제어를 추가로 제공할 수 있다. 프로세서로부터의 지시는 버스를 통해 다양한 출력 장치, 예를 들어 제어 펌프, 전기영동 또는 전기삼투 도선 및 그밖의 장치(100) 요소로 전달될 수 있다.
본원에 개시된 처리는 프로그래밍된 프로세서 하에서 실시될 수 있으므로, 본 발명의 대안전 실시태양에서, 상기 처리는 예를 들어 필드 프로그래머블 게이트 어레이즈(Field Programmable Gate Arrays)(FPGA), TTL 로직 또는 어플리케이션 스페시픽 집적 회로(Application Specific Integrated Circuits)(ASIC)와 같은 프로그래밍되거나 하드코딩된 로직에 의해 완전히 또는 부분적으로 실행될 수 있음을 주지해야 한다. 이외에, 개시된 방법은 프로그래밍된 일반적인 목적의 컴퓨터(110) 요소 및/또는 통상적인 하드웨어 요소의 조합에 의해 실시될 수도 있다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 통상적으로 설계된 소프트웨어 팩키지는 검출 유닛(118)으로부터 수득한 데이터를 분석하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 대안적 실시태양에서, 데이터 분석은 데이터 처리 및 제어 시스템(110) 및 공개적으로 입수가능한 소프트웨어 팩키지를 사용하여 실시될 수 있다. DNA 서열 분석용으로서 입수가능한 소프트웨어의 비제한적인 예로는 프리즘(PRISM, 상표) DNA 서열결정 분석 소프트웨어(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)), 시퀀처(Sequencher, 상표) 팩키지(미국 미시건주 앤 아버(Ann Arbor) 소재의 진 코즈(Gene Codes)) 및 웹사이트 www.nbif.org/links/1.4.1.php.의 내셔널 바이오테크놀로지 인포메이션 패실리티(National Biotechnology Information Facility)로부터 입수가능한 다양한 소프트웨어 팩키지를 포함한다.
본원에 개시되고 청구되는 모든 방법 및 장치(100)는 본 발명의 개시내용에 비추어 부적당한 실험 없이 이루어지거나 실행될 수 있다. 변경안이 청구된 내용의 개념, 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 본원에 기재된 방법 및 장치(100)에 적용될 수 있음은 당해 분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 보다 구체적으로는, 화학적으로 및 생리학적으로 둘다 관련된 특정 약제는 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 본원에 기재된 약제로 대체될 수 있음이 자명할 것이다. 당해 기술분야의 숙련자에게 자명한 이러한 모든 유사한 대체안 및 수정안은 청구된 내용의 취지, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.

Claims (30)

  1. a) 하나 이상의 주형 핵산 분자를 하나 이상의 구조물에 부착하고;
    b) 하나 이상의 상보적 핵산을 표지된 뉴클레오타이드로부터 합성하고;
    c) 구조물의 특성 변화를 검출하고;
    d) 구조물의 특성 변화로부터 도입된 뉴클레오타이드를 확인하고;
    e) 주형 핵산의 서열을 결정하는 것을 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    구조물의 특성 변화가 부착된 핵산의 질량의 함수인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    구조물의 특성 변화가 구조물의 표면 응력의 함수인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    구조물이 캔틸레버인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    구조물의 특성 변화가 광학 빔 검출, 압전 검출, 압전저항 검출 또는 전기 저항 검출에 의해 검출되는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    구조물의 특성 변화가 구조물의 공명 진동수의 변화 또는 구조물과 결합된 전기 회로의 저항의 변화에 의해 검출되는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    표지된 뉴클레오타이드가 하나 이상의 질량 표지 기를 포함하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    각각 상이한 유형의 뉴클레오타이드가 식별가능한 질량 표지 기를 포함하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    질량 표지 기가 나노입자, 나노입자 응집체, 카본 나노튜브, 풀러렌, 작용화 풀러렌, 양자 점(quantum dot), 덴드리머, 유기 분자, 중합체, 중원자, 형광 표지, 발광 표지 및 질량 분광학적 표지로 이루어진 군중에서 선택되는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    프라이머를 주형 핵산으로 혼성화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    표지된 뉴클레오타이드가 폴리머라제에 의해 프라이머의 3' 말단에 공유 부착되는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    주형 핵산 분자가 구조물의 표면 일부상에 선택된 패턴으로 배열되는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    단 한가지 유형의 뉴클레오타이드가 주형 및 상보적 핵산에 한번 노출되는 방법.
  14. 제 8 항에 있어서,
    4가지 상이한 유형의 뉴클레오타이드가 주형 및 상보적 핵산에 동시 노출되는 방법.
  15. a) 하나 이상의 주형 핵산을 하나 이상의 구조물에 부착하고;
    b) 선택된 수의 표지된 뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 상보적 핵산 단편을 합성하고;
    c) 표지된 뉴클레오타이드의 도입시 구조물의 특성 변화를 검출하고;
    d) 구조물의 특성 변화로부터 핵산 단편의 서열을 결정하는 것을 포함하는 핵산 분석 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    e) 상보적 핵산 단편 중 표지된 뉴클레오타이드를 표지되지 않은 뉴클레오타이드로 대체하고;
    f) 선택된 수의 표지된 뉴클레오타이드를 포함하는 인접한 상보적 핵산을 합성하고;
    g) 표지된 뉴클레오타이드의 도입시 구조물의 특성 변화를 검출하고;
    h) 인접한 상보적 핵산 단편의 서열을 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    핵산 서열이 수득될 때까지 (e) 내지 (h) 단계를 반복하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  18. 제 16 항에 있어서,
    표지된 뉴클레오타이드로부터 표지를 제거함으로써 표지된 뉴클레오타이드를 표지되지 않은 뉴클레오타이드로 대체하는 방법.
  19. 제 15 항에 있어서,
    구조물이 캔틸레버인 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    구조물의 특성이 캔틸레버의 굴절률, 캔틸레버의 공명 진동수 또는 캔틸레버에 결합된 전기 회로의 저항인 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    캔틸레버의 굴절률, 캔틸레버의 공명 진동수의 이동 또는 캔틸레버에 결합된 전기 회로의 저항의 변화가 표지된 뉴클레오타이드의 질량의 함수인 방법.
  22. 제 20 항에 있어서,
    캔틸레버의 굴절률, 캔틸레버의 공명 진동수의 이동 또는 캔틸레버에 결합된 전기 회로의 저항의 변화가 캔틸레버의 표면 응력의 함수인 방법.
  23. 제 15 항에 있어서,
    주형 핵산이 구조물의 표면 일부상에 선택된 패턴으로 배열되는 방법.
  24. a) 하나 이상의 구조물을 포함한 분석 챔버;
    b) 분석 챔버와 유체 연통되어 있는 하나 이상의 시약 저장부;
    c) 구조물과 작동적으로 연결되어 있는 검출 유닛;
    d) 데이터 처리 및 제어 유닛을 포함하는 장치.
  25. 제 24 항에 있어서,
    구조물에 부착된 하나 이상의 핵산을 추가로 포함하는 장치.
  26. 제 25 항에 있어서,
    분석 챔버에 하나 이상의 폴리머라제를 추가로 포함하는 장치.
  27. 제 24 항에 있어서,
    구조물이 캔틸레버인 장치.
  28. 제 24 항에 있어서,
    검출 유닛이 위치 민감형 광검출기, 압전 검출기 또는 압전 저항기를 포함하는 장치.
  29. 제 24 항에 있어서,
    검출 유닛이 레이저를 포함하는 장치.
  30. 제 25 항에 있어서,
    검출 유닛이 구조물에 부착된 핵산의 질량 및/또는 구조물의 표면 응력의 변화를 검출하는 장치.
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