JP2005526512A - 核酸シークエンシングにおけるカンチレバーの使用 - Google Patents

Abstract

本発明の方法および装置１００は、ヌクレオチド２１８の核酸鎖２２０への取込みによって核酸２１４の配列を決定することに関する。ヌクレオチド２１８の取込みは構造体１１６、２１２の質量および／または表面応力の変化によって決定される。本発明の幾つかの実施形態において、構造体１１６、２１２は一つ以上のナノスケールまたはマイクロスケールのカンチレバーを含む。本発明のある実施形態において、それぞれ異なる種類のヌクレオチド２１８は大きな基で識別可能に標識され、取込まれた各ヌクレオチド２１８は、ヌクレオチド２１８が取込まれたときの構造体１１６、２１２の質量および／または表面応力の変化によって確認される。構造体１１６、２１２の特性の変化は、圧電性検出、構造体１１６、２１２の共振周波数のシフトおよび／または位置感受性光検出法など種々の方法によって検出出来る。

Description

本明細書に記載される方法および装置は分子生物学および核酸分析の分野に関する。より詳細には、本願明細書に開示される方法および装置は、標識化ヌクレオチドの取込み時における質量および／または表面応力の変化を検出することによる核酸の配列決定に関する。

遺伝情報は非常に長いデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の形で染色体に組織化されて保存されている。ヒトゲノムは約３０億のＤＮＡ塩基配列を含む。このＤＮＡ配列情報が各個体の多数の特徴を決定する。多くの一般的病気は少なくも一部はＤＮＡ配列の変化に基づくものである。

ヒトゲノムの全配列の決定はこのような病気の遺伝的原因を確認するための基礎をもたらした。しかし多くの研究は依然としてそれぞれの疾患と関連した遺伝的変化を確認していない。そのため、このような各疾患をあらわす個人または家族の染色体部分のＤＮＡを配列決定し、その疾患を発生させるＤＮＡ配列の固有の変化を確認することが必要である。種々の疾患の遺伝的基礎を確認するために、遺伝情報処理における中間分子であるリボ核酸（ＲＮＡ）の配列を決定してもよい。

サイズによって分離された蛍光標識核酸の検出に基づく既存の核酸シークエンシング法は配列決定可能の核酸の長さに制限がある。一般的に一度に決定出来る核酸配列は５００ないし１０００塩基に過ぎない。これは、何万または何十万という塩基長さを有し得る遺伝子と呼ばれるＤＮＡの機能的単位の長さに比べて遥かに短い。現在の方法を使用した場合、完全な遺伝子配列を決定するためには、その遺伝子の多くのコピーを生成し、重なり合った断片に切断し、配列決定し、その後その重なり合ったＤＮＡ配列を完全な遺伝子に組み立てなければならない。この処理は煩雑で、費用がかかり、非効率でしかも時間をとる。また、一般的には蛍光標識または放射性標識の使用を必要とし、それは安全性および廃棄物の問題を起こす可能性がある。

より最近になって、ＤＮＡチップ上の特定部位に付加された、配列決定された短いオリゴヌクレオチドへのハイブリッド形成を含む核酸シークエンシング法が開発された。このような方法は短い核酸配列を推測したり、サンプル中の固有の核酸の存在を見つけたりするために使用することは出来るが、長い核酸配列の確認には適さない。

添付の図は、明細書の一部を構成し、本発明の幾つかの実施形態をさらに詳しく説明するために含まれる。これらの実施形態は、これらの図の一つ以上を本明細書中の詳細な説明と組み合わせて参照することによってよりよく理解される。

定義：本明細書に使用する単数形の名詞は、一つまたは一つ以上の品目を意味する。

本明細書に使用する“約（ａｂｏｕｔ）”は或る数のプラスまたはマイナス５パーセント以内を意味する。例えば“約１００”は９５から１０５までの数を意味する。

本明細書に使用する“操作可能に結合する（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｃｏｕｐｌｅｄ）”は、２つ以上のユニット間に機能的相互作用があることを意味する。例えば、検出ユニット１１８が構造体１１６、２１２の特性の変化を検出出来るように配置されている場合は、検出ユニット１１８は構造体１１６、２１２に操作可能に結合している。

本明細書に使用される“流体連絡（ｆｌｕｉｄ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）”はコンパートメント間を流体が通過出来るという、２個以上のコンパートメント間の機能的連絡を言う。例えば、流体が第一コンパートメントから第二コンパートメントへおよび／または第二コンパートメントから第一コンパートメントへ通過出来る場合、第一コンパートメントは第二コンパートメントと“流体連絡”している。

“核酸”２１４はＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、二本鎖または三本鎖およびそれらのあらゆる化学的変形体を包含する。本発明の幾つかの実施形態では一本鎖核酸２１４を使用する。核酸２１４のほとんどすべての変形体が考慮されている。“核酸”２１４は１０、２０、５０、１００、２００、３００、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、５，０００，０００またはそれ以上の塩基長さから、完全染色体ＤＮＡ分子の長さまでのほとんど全ての長さでよい。

実施形態の詳細な説明：本明細書に開示される方法および装置１００は核酸２１４の迅速自動シークエンシングに使用される。先行技術の方法にまさる利点は、長い核酸２１４配列を１回のシークエンシング行程で読む事が出来る能力、より高速度で配列データが得られること、シークエンシングコストの低下、配列データ単位あたりに必要なオペレータ時間の高効率などである。本発明の幾つかの実施形態において、蛍光標識または放射性標識を使用せずに核酸２１４の配列を決定する事が出来ることも有益である。

下記の詳細な説明は、開示された本発明の実施形態をより徹底的に理解するための多数の特定の詳細を含む。しかし、本発明の実施形態はこれらの特定の詳細がなくとも実施出来ることは当業者には明らかである。その他の場合には、当業者に公知の装置、方法、操作法および個々の構成部品はここには詳細には記載されていない。

本発明の或る実施形態は核酸２１４シークエンシングのための方法および装置１００に関する。本発明の幾つかの実施形態において、配列決定すべき核酸２１４をナノスケールまたはマイクロスケールのカンチレバー１１６、２１２のような一つ以上の構造体１１６、２１２に付加する。本発明の種々の実施形態において、付加された核酸２１４は相補的鎖２２０の生成、または二本鎖核酸２１４の複製のための鋳型として役立つ。本発明の幾つかの実施形態において、相補的鎖２２０を合成するために使用されるヌクレオチド２１８を大きな基で標識を付し、各種類のヌクレオチド２１８に固有の質量標識を与える。核酸２１４、２２０を、４種類全ての標識化ヌクレオチド２１８を含む溶液中でインキュベートする。各ヌクレオチド２１８を、成長中の鎖２２０に加えると、それは構造体１１６、２１２に付加された質量に加わる。各ヌクレオチド２１８はその固有の質量によって確認出来るから、構造体１１６、２１２の質量依存性特性および／または表面応力の変化、例えばそれらの共振周波数または偏向（ｄｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）などを測定することによって、ヌクレオチド類２１８の付加順序を確認する事が出来る。本発明の種々の実施形態において、同じ核酸鋳型２１４の複数のコピーが各構造体１１６、２１２に付加し、多くの相補的鎖２２０の合成が同時に起こり、各ヌクレオチド２１８が次々と付加されると、検出出来る十分な質量増加および／または表面応力の変化がもたらされると考えられる。

本発明の更に別の実施形態において、成長する相補的核酸２２０は或る時には１つの種類のヌクレオチド２１８だけにさらされる。ヌクレオチド２１８の取込みは、そのヌクレオチド２１８が鋳型鎖２１４の対応するヌクレオチド２１８に相補的である場合だけに起こる。こうして構造体１１６、２１２に付加された核酸２１４、２２０の質量および／またはその構造体の表面応力は、正しいヌクレオチド２１８が存在する場合にだけ変化する。同種類のヌクレオチド２１８の連続的な付加は、質量および／または表面応力の対応するより大きい変化によって示される。或る実施形態においては、ヌクレオチド２１８の各種類が識別可能の質量標識を担う必要はない。

核酸２１４シークエンシングのための典型的装置１００に関する本発明の種々の実施形態が図１に示される。図１の装置１００はデータ処理および制御ユニット１１０を備え、装置１００のその他の構成部分、例えば試薬貯蔵器１１２、分析チェンバ１１４、２１０、検出ユニット１１８、出口１２８などと操作可能に結合している。図１の試薬貯蔵器１１２は入り口１２４を介して分析チェンバ１１４、２１０と流体連絡している。分析チェンバ１１４、２１０は鋳型核酸２１４を付加させるための一つ以上の構造体１１６、２１２を含む。マイクロ流体デバイスが組み込まれ、酵素、標識化ヌクレオチド類２１８および／または試薬類を分析チェンバ１１４、２１０に運び込んだり、ここから運び出したりする。

鋳型核酸２１４に相補的な配列の核酸鎖２２０が、公知の核酸ポリメラーゼ類２２２の使用など、公知の方法によって合成される。相補的鎖２２０への標識化ヌクレオチド類２１８の取込みは、付加された構造体１１６、２２２の質量依存特性および／または表面応力の測定によって検出される。

使用出来る構造体１１６、２１２の非制限的例としては、カンチレバー、ダイヤフラム、スプリング類またはその他の柔軟構造によって吊るされるかまたは支持されたプラットフォーム、または質量依存特性および／または表面応力、例えば偏向および／または共振周波数のシフトなどの測定を行う事が出来る当業者に公知のその他の構造体１１６、２１２が含まれる。適切な構造体１１６、２１２の一例は図１に示すカンチレバー１１６、２１２である。公知のマイクロ成形法を使用してこのような構造体１１６、２１２を一つ以上有する分析チェンバ１１４、２１０を作製する事が出来る（バラー（Ｂａｌｌｅｒ）ら、２０００、超顕微法（Ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）８２巻、１〜９ページ；米国特許第６，０７３，４８４号など）。ナノスケール・カンチレバー１１６、２１２アレーの作製法は公知である。（バラーら、２０００；ラング（Ｌａｎｇ）ら、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．７２巻：３８３ページ、１９９８；ラングら、Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３９３巻、５９ページ、１９９９；以下も参照されたい ｈｔｔｐ：／／ｍｏｎｅｔ．ｐｈｙｓｉｋ．ｕｎｉｂａｓ．ｃｈ／ｎｏｓｅ／ｉｎｆｉｃｏｎ／；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈａｎｔｏｍｓｎｅｔ．ｃｏｍ／ｐｈａｎｔｏｍ／ｎｅｔ／ｐｈａｎｔｏｍｓｃｏｎｆ／ｄｏｃ／Ａｂａｄａｌ．ｐｄｆ；ｈｔｔｐ：／／ｌｍｎ．ｗｅｂ．ｐｓｉ．ｃｈ／ａｎｎｒｅｐ／ｍｎｔｅｃｈ３．ｐｄｆ； ｗｗｗ．ｎｎｆ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／２００１ｃｎｆｒａ／２００１３８．ｐｄｆ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ．ｅｄｕ／〜ｃｍｌ／ｈｔｍｌ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ．ｈｔｍｌ）本発明の更に別の実施形態において、石英結晶微量天秤のような圧電性物質を構造体１１６、２１２として使用してもよい（ゾウ（Ｚｈｏｕ）ら、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ＆ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ １６巻：８５〜９５ページ、２００１；ヤマグチら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６５巻：１９２５〜１９２７；バーデア（Ｂａｒｄｅａ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．７巻：８３９〜４０ページ、１９９８など）。

一つ以上の鋳型核酸２１４を各カンチレバー１１６、２１２に付加させる。検出ユニット１１８がカンチレバー１１６、２１２の位置および／または共振周波数をモニターする。本発明の或る実施形態において、検出ユニット１１８は、光検出器１２２に操作可能に結合した光源１２０を含む事が出来る。或いは、圧電センサーは検出器１２２に操作可能に結合するかまたはデータ処理および制御ユニット１１０に直接結合する事が出来る。

図１に示された本発明の典型的実施形態はカンチレバー１１６、２１２の偏向の光学的検出を示す。この検出法は原子間力顕微法（ＡＦＭ）において公知の光学レバー技術である。低パワーレーザビーム１３２の焦点がカンチレバー１１６、２１２の自由端に集束する。反射したレーザビーム１３２が位置感受性光検出器１２２（ＰＳＤ）に当たる。付加された核酸２１４、２２０の質量の変化および／またはカンチレバー１１６、２１２の表面応力の変化に応答してカンチレバー１１６、２１２が曲がる際に、反射したレーザビーム１３２がＰＳＤ１２２に当たる位置が移動し、偏向信号を発生する。質量および／または表面応力の変化およびその結果としてのカンチレバー１１６、２１２の偏向度の変化がＰＳＤ１２２上の反射レーザビーム１３２のずれから計算出来る。

本発明の種々の実施形態において、標識化ヌクレオチド類２１８の溶液は、一つの標識化ヌクレオチド２１８を一度に分析チェンバ１１４、２１０に導入する事が出来る。例えば、標識化グアニン（“Ｇ”）ヌクレオチド２１８を含む溶液を試薬貯蔵器１１２を介して分析チェンバ１１４、２１０に導入する事が出来る。上記溶液を適切な時間、鋳型核酸２１４、プライマー２２４または相補的核酸２２０およびポリメラーゼ２２２と共にインキュベートする。鋳型核酸２１４の配列において次のヌクレオチド２１８がシトシン（“Ｃ”）である場合は、標識化Ｇは成長する相補的核酸２２０鎖に組み込まれ、対応する構造変化が検出される。もしも鋳型核酸２１４の次のヌクレオチド２１８がＣでない場合は、変化は検出されない。標識化Ｇヌクレオチド２１８を含む溶液は分析チェンバ１１４、２１０から除去され、次の標識化ヌクレオチド２１８（アデニン−“Ａ”、チミン−“Ｔ”またはシトシン−“Ｃ”）を含む溶液が導入される。４種類全ての標識化ヌクレオチド２１８溶液が分析チェンバ１１４、２１０を循環した後、この循環は繰り返され、核酸２１４の配列が決定されるまで続く。鋳型核酸２１４の配列は、測定された構造変化と種々のヌクレオチド類２１８を鋳型２１４にさらした順序とを関係づけることによって決定される。同種類の複数のヌクレオチド２１８が相補的鎖２２０に組み込まれた際には、構造体１１６、２１２の特性に比例的変化が認められる。例えば、１個のヌクレオチド２１８の取込みが構造体１１６、２１２の特性に“Ｘ”の変化を生ずるならば、同種類の２個または３個のヌクレオチドの取込みはそれぞれ約２Ｘまたは３Ｘの変化をおこすと予想される。

本発明の更に別の実施形態においては、標的核酸２１４の配列の一部分が公知である。例えば、核酸２１４はすでに一部は配列決定されているか、または未知の核酸２１４配列が、既知の配列を有するベクター、リンカーまたはその他のＤＮＡに結合している。この場合、４種類全てのヌクレオチド２１８を循環させるよりも、次に配列に付加すべき正しいヌクレオチド２１８を未知の配列領域に達するまで加える方がよい。一部分配列がわかっている配列の使用は、そのシステムを較正し、正しい機能をチェックするためにも役立つ。例えば単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）を分析しなければならないような幾つかの実施形態において、１箇所（それは２つのヌクレオチド２１８のうちの１つを含むのが普通である）を除けば核酸２１４全体の配列が公知であるかも知れない。このような実施形態において、分析チェンバ１１４、２１０を通過するヌクレオチド類２１８のさらにより効率的なサイクルが可能となる。

図２Ａ、図２Ｂおよび図２Ｃはカンチレバー１１６、２１２およびそのカンチレバー１１６、２１２に付加された鋳型核酸２１４を含む典型的分析チェンバ１１４、２１０の詳細な図を示す。図２Ｂはカンチレバー１１６、２１２に付加された単一の鋳型核酸２１４の拡大図を示す。鋳型２１４は、鋳型分子２１４の３’末端に相補的配列を有するプライマー２２４オリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成する。例えばＤＮＡポリメラーゼ２２２などの核酸ポリメラーゼ２２２はプライマー２２４の３’末端に付加し、相補的鎖２２０を合成し始める。配列の各ヌクレオチド２１８はポリメラーゼ２２２によってプライマー２２４の３’末端または相補的鎖２２０に付加する。相補的鎖２２０の配列は鋳型鎖２１４を使用する標準ワトソン−クリック塩基対形成によって決定される。この際ＡはＴのみと（またはＲＮＡ鋳型２１４の場合はウラシル−“Ｕ”のみと）結合し、ＣはＧのみと結合する。ここで述べる本発明の実施形態はＤＮＡ鋳型鎖２１４からＤＮＡの相補的鎖２２０を合成することを考慮しているとはいえ、本発明の別の実施形態では、ＲＮＡ鋳型２１４を使用して相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ鎖２２０を合成する事が出来、或いはＤＮＡ鋳型２１４を使用して相補的ＲＮＡ鎖２２０を合成出来ると考えられる。例えばＲＮＡポリメラーゼ２２２を使用するＲＮＡ合成の場合、プライマー２２４は必要ない。

ヌクレオチド類２１８の取込みに際して起こる質量および／または表面応力の変化は、光学的検出法または圧電装置を用い、カンチレバー１１６、２１２の偏向または共振周波数のシフトによって検出出来る（米国特許第６，０７９，２５５号および第６，０３３，８５２号を参照）。図２Ｃは、ヌクレオチド２１８取込みに応答するカンチレバー１１６、２１２の偏向（△ｄ）の典型的検出法を示す。精度を高め、バックグラウンドノイズを減らすために、新たに組み込まれたヌクレオチド２１８を含むカンチレバー２１２の位置を、プライマー２２４の３’末端のジデオキシヌクレオチドの使用などによってヌクレオチド２１８の取込みが阻止（ブロック）された一つ以上の対照カンチレバーの位置と比較する。当業者には公知のように、ジデオキシヌクレオチドは核酸２２０合成を遮断または中止するように作用する。

本発明のその他の種々の実施形態において、ヌクレオチド類２１８は、ヌクレオチド２１８の各種類を確認するために使用される、大きな質量を有するナノ粒子および／またはナノ粒子凝集体などの大きな基で一意に標識化される。ヌクレオチド類２１８の溶液は１、２、３、または４種類の標識化ヌクレオチド２１８（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵ）を含む事が出来る。本発明の更に別の実施形態において、４種類のヌクレオチドのうち２種類だけ、例えばＡおよびＣヌクレオチド２１８だけが質量標識化される。未標識のピリミジン（Ｃ、ＴまたはＵ）およびプリン（Ａ、Ｇ）間の質量の差は、標識化および未標識ヌクレオチド２１８間の差と同様に、質量および／または表面応力の検出によって識別されるはずである。

相補的核酸２２０鎖に取込まれたヌクレオチド２１８の同定は、質量および／または表面応力の明確な変化およびそれらの変化が起こる順序によって決定される。本発明の幾つかの実施形態において、各ヌクレオチド２１８は一意の大きな基で標識化される。取込まれた標識化ヌクレオチド２１８の同定は、構造体１１６、２１２の質量および／または表面応力の明白な変化から確認される。本発明の更に別の実施形態において、各ヌクレオチド２１８は同一かまたは類似の大きな基で標識化される。延長しつつある相補的核酸鎖２２０への標識化ヌクレオチド２１８の付加の順序を確認することによって、鋳型核酸鎖２１４の配列が決定される。

本発明の幾つかの実施形態において、付加されるヌクレオチド２１８はＤＮＡ前駆体−デオキシアデノシン５’トリホスフェート（ｄＡＴＰ）２１８、デオキシチミジン５’トリホスフェート（ｄＴＴＰ）２１８、デオキシグアノシン５’トリホスフェート（ｄＧＴＰ）２１８、およびデオキシシトシン５’トリホスフェート（ｄＣＴＰ）２１８でよい。本発明の更に別の実施形態において、ヌクレオチド類２１８は、アデノシン５’トリホスフェート（ＡＴＰ）２１８、チミジン５’トリホスフェート（ＴＴＰ）２１８、グアノシン５’トリホスフェート（ＧＴＰ）２１８およびシトシン５’トリホスフェート（ＣＴＰ）２１８などのＲＮＡ前駆体でよい。

単一ヌクレオチド２１８の溶液に逐次さらすことによって得られる例示的データの図を図３に示す。示されるように、各サイクルで鋳型２１４、プライマー２２４または相補的鎖２２０、およびポリメラーゼ２２２が、４種類のヌクレオチド２１８（Ｇ、Ｔ、ＡおよびＣ）の各々に逐次さらされる。サイクル１では、Ｔ溶液を加えると質量および／または表面応力の変化が認められ、鋳型２１４上に対応するＡが存在することを示唆する。サイクル２では、Ｇ溶液を加えたときに質量および／または表面応力の変化が認められ、鋳型２１４上のＣの存在が示唆される。鋳型２１４の線状配列が循環的付加および測定を続けることによって確認される。

４種類全てのヌクレオチド２１８を識別可能に標識化して、同じ溶液に加えるという別な方法を用いて得られたデータの一例を図４に示す。説明のために、例えばＧが１質量単位を有し、Ａが２質量単位を有し、Ｔが３質量単位を有し、Ｃが４質量単位を有するなどと質量標識を任意に選択する。ヌクレオチド２１８の４種類の各々が識別される限り、上記質量単位の正確な数値は重要でないことは当業者には理解出来る。図４に示すように、付加された第一ヌクレオチド２１８はＴに相当する３単位の質量を有し、付加された第二ヌクレオチド２１８はＧに相当する１単位の質量を有し、第三のヌクレオチド２１８はＣに対応する４単位の質量を有する。５’から３’までの相補的２２０配列を読むと、その配列はＴＧＣＡＣである。３’から５’までの、鋳型２１４鎖の対応する配列はＡＣＧＴＧとなる。

４種類全てのヌクレオチド２１８の混合物にさらされる複数の鋳型鎖２１４を含む本発明の実施形態において、例えば制御された温度変化によって、またはポリメラーゼ２２２および／またはプライマー２２４を少しずつ急速撹拌下で加えることによって、または同じヌクレオチド２１８が各相補的鎖２２０に同時に付加するような、同様な公知の方法によって、重合反応を同時に進行させる事が出来る。より長いシークエンシング行程では、重合反応の周期的再同期化が必要である。或いは、同期性重合では相補的核酸鎖２２０の３’末端に一つ以上の保護基を使用する事が出来る。追加のヌクレオチド類２１８は、それまでに取込まれたヌクレオチド２１８の保護基を除去した後に取込まれる。保護基のヌクレオチド類２１８への付加およびそれらからの切断は公知であり、米国特許第６，３１０，１８９号に記載されているように化学的および／または光学的切断基などがある。

標識化ヌクレオチド２１８を使用する本発明の実施形態において、長い鋳型鎖２１４は、標識のために使用する大きな基によって起こり得る立体障害効果を避けるかまたは減らすための諸工程において配列決定される。立体障害は核酸ポリメラーゼ２２２の活性を妨害する可能性がある。非制限的例において、鋳型ＤＮＡ分子２１４の配列を決定するために、プライマー２２４を加え、前述のように単一の標識化ヌクレオチド２１８（Ａ、Ｇ、ＴまたはＣ）を含む溶液の添加によって最初の１０個の塩基の配列を決定する。合成後、標識化ヌクレオチド２１８をエキソヌクレアーゼ活性などを利用して除去し、単一の未標識ヌクレオチド２１８を含む溶液にさらすことによって未標識ヌクレオチド２１８で置換する。鋳型２１４の次の１０個の塩基を、単一の標識化ヌクレオチド２１８を含む溶液にさらすことによって配列決定し、その後標識化ヌクレオチド２１８を未標識ヌクレオチド２１８で置換する。鋳型２１４全体が配列決定されるまでこの操作を繰り返す。当業者は、この説明が例示的なものであり、この方法は１０個の塩基の同時シークエンシングに制限されるものではないことを理解出来る。ポリメラーゼ２２２活性による実質的妨害の起きる前に相補的鎖２２０に組み込まれる隣接する標識化ヌクレオチド２１８の数を決定することは当業者には公知である。その数は一部はポリメラーゼ２２２の種類および使用する標識の種類に依存する。

本発明の幾つかの実施形態において、カンチレバー１１６、２１２に結合する鋳型核酸分子２１４の量は制限される。本発明のその他の実施形態において、鋳型核酸２１４は一つ以上のカンチレバー１１６、２１２に、最適信号を得るための特定のパターンおよび／または方向で付加する。鋳型分子２１４のパターン化は構造体１１６、２１２を下記のような種々の公知の機能的基でコーティングすることによって実現する。

鋳型核酸２１４の分析は、生物学的作用物質または疾病状態に関する情報を適時に、費用効率的に提供する事が出来る。核酸２１４の分析から得られる情報を用いてワクチン投与、抗生物質治療、抗ウィルス剤投与またはその他の治療などの効果的治療を決定する事が出来る。

マイクロ電気機械システム（ＭＥＭＳ）：マイクロ電気機械システム（ＭＥＭＳ）は機械的要素、センサー、アクチュエータおよびエレクトロニックスを備える集積システムである。これら構成部分の全ては公知のマイクロ成形法によって、シリコン−ベース基板またはその同等物を備える一般的チップ上に作製される（例えばバルドマン（Ｖａｌｄｍａｎ）ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１巻：４０１〜２５ページ、１９９９など）。ＭＥＭＳのセンサーコンポーネントを使用して機械的、熱的、生物学的、化学的、光学的および／または磁気的現象を測定出来る。このエレクトロニクスは、センサーからの情報を処理してポンプ、バルブ、ヒーター、クーラー、フィルターなどのアクチュエータコンポーネントを制御し、それによってＭＥＭＳの機能を制御する。

ＭＥＭＳの電子コンポーネント類は集積回路（ＩＣ）処理（例えば、ＣＭＯＳ、Ｂｉｐｏｌａｒ、またはＢＩＣＭＯＳ処理など）によって作製される。これらにはコンピュータチップ製造において公知のフォトリソグラフィー法およびエッチング法を使用してパターン（型）がつけられる。マイクロ機械構成部分は、シリコンウェーハの離れた部分を選択的にエッチングするかまたは新しい構造層を加えて機械的および／または電気機械的構成部分を形成するという、適切な“マイクロ機械”加工によって作られる。ＭＥＭＳ製造における基礎技術は薄い材料フィルム類を基板上に沈着させ、フォトリソグラフィー画像法またはその他の公知のリソグラフィー法によって上記フィルム類の最上部を、パターン（型）をつけたマスクで覆い、選択的にそれらフィルムをエッチングすることを含む。薄いフィルムは数ナノメートルから１００マイクロメートルの範囲の厚さを有する。使用する沈着法としては、化学蒸着（ＣＶＤ）、電着、エピタキシーおよび熱酸化および、物理的蒸着（ＰＶＤ）や流し込み成形などの物理的処理法がある。

上記の製法は制限的ではなく、当業者に公知のあらゆる方法、例えばレーザアブレーション、射出成形、分子ビームエピタキシー、ディップペン・ナノリソグラフィー、反応性イオンビームエッチング、化学的補助イオンビームエッチング、マイクロ波補助プラズマエッチング、焦点性イオンビーム微粉砕、電子ビームまたは焦点性イオンビーム法または捺印法などが使用出来る。本発明の幾つかの実施形態のためにナノ電気機械システムの製法が使用される（クレイグヘッド（Ｃｒａｉｇｈｅａｄ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０巻：１５３２〜６ページ、２０００を参照）。種々の形のマイクロ成形チップ類がキャリパー・テクノロジー社（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）（マウンテンビュー、ＣＡ）およびＡＣＬＡＲＡ ビオサイエンシズ社（ＡＣＬＡＲＡ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）（マウンテンビュー、ＣＡ）から市販されている。

本発明の種々の実施形態において、図１および図２に図示される核酸シークエンシング装置１００の構成部分の幾つかまたは全ては集積ＭＥＭＳデバイスの部分として構成される。

カンチレバー：本発明の幾つかの実施形態において、核酸２１４、２２０が付加する構造体１１６、２１２は一つ以上のカンチレバー１１６、２１２を備える。カンチレバー１１６、２１２は、一端が結合し、多端は遊離している小さくて薄い弾性レバーである。カンチレバー１１６、２１２アレーの形成法は公知である（バラー（Ｂａｌｌｅｒ）ら、超顕微法 ８２巻：１〜９ページ、２０００；米国特許第６，０７９，２５５号など）。原子間力顕微鏡のために用いられるカンチレバー１１６、２１２は一般的には長さ約１００ないし２００マイクロメートル（μｍ）で、厚さ約１μｍである。単純大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞類の結合を検出する事が出来た、長さ１５ないし４００μｍ、巾５ないし５０μｍ、厚さ３２０ナノメートル（ｎｍ）の二酸化珪素カンチレバー１１６、２１２は公知の方法によって作製された（イリク（Ｉｌｉｃ）ら、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．７７巻：４５０ページ、２０００）。上記材料は制限的ではなく、カンチレバー１１６、２１２の構成のために知られているその他の材料、例えばシリコンまたは窒化珪素なども使用出来る。本発明のその他の実施形態において、約５０μｍ長さ、１０μｍ巾、１００ｎｍ厚さのカンチレバー１１６、２１２が使用される。本発明の幾つかの実施形態において、長さが１００ｎｍに過ぎないような更に小さいサイズのナノスケール・カンチレバー１１６、２１２が使用される。本発明の幾つかの実施形態では、長さ約１０ないし５００μｍ、巾１ないし１００μｍおよび厚さ１００ｎｍないし１μｍのカンチレバー１１６、２１２が用いられる。

カンチレバー１１６、２１２を共振させると、そのカンチレバー１１６、２１２の自由端上に焦点を合わせたレーザビーム１３２は偏向する。カンチレバー１１６、２１２の偏向を光検出器で測定することによってカンチレバー１１６、２１２の共振周波数を決定出来る。或いは、カンチレバー１１６、２１２の偏向は、位置感受性光検出器１２２を使用して、反射した光ビーム１３２の位置を測定し、それによってカンチレバー１１６、２１２の位置を決めるという様態で決定される。これらの方法は制限的でなく、ヌクレオチド２１８の取込みによって影響を受ける構造の諸特性の変化を測定するためのあらゆる公知の方法が請求の主題の範囲内で使用出来る。例えば、カンチレバー１１６、２１２の表面に取り付けられた、またはカンチレバー１１６、２１２内に取込まれた金属ワイヤーは、カンチレバー１１６、２１２が曲がり、ワイヤーの長さ（または巾）が変化するにつれてその抵抗が変化すると予想される。ナノワイヤーをカンチレバー１１６、２１２に取り付け、または取込む方法は、電気抵抗の測定法と同じく当業者には公知である。

検出ユニット：検出ユニット１１８を使用してカンチレバー１１６、２１２の偏向および／または共振周波数を検出する事が出来る。カンチレバー１１６、２１２の偏向は例えば光学的および／またはピエゾ抵抗検出器１２２（米国特許第６，０７９，２５５号など）および／または表面応力検出器１２２（フリッツ（Ｆｒｉｔｚ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８［５４６４］；３１６〜８ページ、２０００など）を使用して検出出来る。

本発明の典型的実施形態において、ピエゾ抵抗性抵抗器をカンチレバー１１６、２１２アームの固定端に埋め込む事が出来る。カンチレバー１１６、２１２の自由端の偏向がカンチレバー１１６、２１２に沿って応力を生成する。その応力は抵抗器１１６、２１２の抵抗をカンチレバー１１６、２１２の偏向度に比例して変化させる。抵抗測定デバイスをピエゾ抵抗性抵抗器に連結し、その抵抗を測定し、カンチレバー１１６、２１２の偏向に対応する信号を発生させる。このようなピエゾ抵抗性抵抗器１２２はカンチレバー１１６、２１２の固定端に圧迫されて形成される。これにより、カンチレバー１１６、２１２が偏向するとき、上記抵抗器１２２がさらにより大きい応力を受けるようになる（国際公開第９７／０９５８４号）。

抵抗の変化を利用して、当業者には公知の方法を用いてカンチレバー１１６、２１２の偏向および／または共振周波数の変化を計算出来る。小さいピエゾ抵抗性カンチレバー１１６、２１２の製法もまた公知である。非制限的例において、ピエゾ抵抗性カンチレバー１１６、２１２は、絶縁体上シリコン（ＳＯＩ）ウェーハの最上部層に一つ以上のピエゾ抵抗性カンチレバー１１６、２１２を形作るという様態で形成される。カンチレバー１１６、２１２にホウ素またはその他のドーパントを添加し、ｐ型伝導層を形成する。金属は、ドープした層への電気接点、およびその真下の容積シリコンの削除によりリリースされたカンチレバー１１６、２１２のために置かれて良い。添加層への電気的な接触のために金属の層が堆積されても良く、カンチレバー１１６、２１２はその下部の多量のシリコンを取り除く事によってリリースされる。このような方法には上に述べた公知のリソグラフィー法およびエッチング法を使用する事が出来る。

本発明の更に別の実施形態において、ドーパント導入後に薄い酸化物層を成長させ、ピエゾ抵抗器に固有のノイズを減らす事が出来る。ピエゾ抵抗器カンチレバー１１６、２１２は公知の方法による気相エピタキシーによって成長させる事も出来る。本発明の幾つかの実施形態において、カンチレバー１１６、２１２の振動を制御するためにピエゾを使用する事が出来る。上記ピエゾ抵抗器を、基準抵抗器を有するホイートストンブリッジ回路に組み込むことによって、カンチレバー１１６、２１２の抵抗性をモニター出来る。

本発明のその他の実施形態において、カンチレバー１１６、２１２の偏向および／または共振周波数を光学的偏向センサー１１８を用いて検出する事が出来る。このような検出ユニット１１８は光源１２０、例えばレーザダイオードまたは垂直共振器型面発光レーザ（ＶＣＳＥＬ）アレーなど、および位置感受性光検出器１２２を含む。プリアンプを使用して光電流を電圧に変換する事が出来る。光源１２０によって放出される光はカンチレバー１１６、２１２の自由端上に向かい、一つ以上のフォトダイオード１２２に反射する。本発明の幾つかの実施形態において、カンチレバー１１６、２１２の自由端は銀などの高度に反射性の表面で被覆され、反射ビーム１３２の強度を高める事が出来る。カンチレバー１１６、２１２の偏向によって、反射した光ビーム１３２の位置が変化する。この変化を位置感受性光検出器１２２によって検出し、分析して、カンチレバー１１６、２１２のずれの量を決定出来る。カンチレバー１１６、２１２のずれ自体を利用して、カンチレバー１１６、２１２に付加された核酸２１４、２２０の追加的質量を決定出来る。ここに述べる典型的検出法は、隔膜または吊プラットフォーム（ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ）など、その他の種類の構造に応用出来ることは当業者には当然である。

本発明のその他の実施形態において、構造体１１６、２１２の偏向および／または共振周波数は圧電性（ＰＥ）および／または圧磁性検出ユニット１１８を使用して測定出来る（バラト（Ｂａｌｌａｔｏ）“圧電性および圧磁性デバイスおよび構造体の、同一ネットワークによるモデル化（Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ａｎｄ ｐｉｅｚｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｖｉａ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｎｅｔｗｏｒｋｓ）”、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ．Ｕｌｔｒａｓｏｎ．Ｆｅｒｒｏｅｌｅｃｔｒ．Ｆｒｅｑ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ４８巻：１１８９〜２４０ページ、２００１）。圧電性検出ユニット１１８は検出要素（類）の圧電効果を利用して電荷出力を作る。ＰＥ検出ユニット１１８は、作動するために外部電源を必要としない。“スプリング”検出要素は適用される応力の量に比例して所定数の電子を発生する。多くの天然および人工物質、例えば結晶、セラミックスおよび少数のポリマー類はこの特性を示す。これらの物質は規則正しい結晶性分子構造を有し、歪んだときに変化する正味電荷分布を有する。

圧電性物質はそれらの無応力状態では双極子を有して良い。このような物質では、応力による変形によって電場が生じ、圧電性反応を起こすこともある。電荷は実際には発生せず、むしろ転位する。電場が上記双極子の方向に沿って発生する場合は、圧電性物質の一端から信号検出器１２２を通って圧電性物質の他端に流れる移動電子が発生し、回路を閉じる。移動する電子の量は圧電性物質内の応力の程度およびそのシステムのキャパシタンスの関数である。

ここに述べる検出法は例に過ぎず、構造体１１６、２１２の偏向および／または共振周波数またはその他の質量および／または表面応力依存性特性の変化を測定するためのいかなる公知の技術も使用出来ることは当業者には当然である。

核酸：配列決定すべき核酸分子２１４は任意の公知の方法によって作る事が出来る。本発明の一実施形態において、核酸２１４は天然に発生するＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。非制限的に、染色体、ミトコンドリヤまたは葉緑体のＤＮＡまたはメッセンジャー、ヘテロ核ＲＮＡ、リボソームまたはトランスファーＲＮＡを含むほとんど全ての天然核酸２１４は開示された方法によって作る事が出来、配列を決定する事が出来る。種々の形の核酸２１４の作製法および分離法は公知である（分子クローニング入門（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）およびキメル（Ｋｉｍｍｅｌ）編集、アカデミックプレス、ニューヨーク、ＮＹ、１９８７；分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、２版、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッチ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）編集、コールドスプリングハーバー・プレス、コールドスプリングハーバー、ＮＹ、１９８９、などを参照）。上記の参考文献に開示されている方法は例に過ぎず、当業者に公知のいかなる変法も使用出来る。

一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）２１４を配列決定しなければならない場合、公知のいずれかの方法によってｓｓＤＮＡ２１４を二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）から作る。このような方法は、ｄｓＤＮＡを加熱し、その鎖を分離させることを含み、またはその代わりにＭ１３へのクローニングなど公知の増幅または複製法によってｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡ２１４を作製することを含む。このような公知の方法を使用してｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡ２１４を作る事が出来る。

上記の議論は天然発生性核酸２１４の製法に関するとはいえ、カンチレバーまたはこの種の構造体１１６、２１２に付加することの出来る実質的に全ての種類の核酸２１４が本願明細書に開示された方法によって配列決定出来る。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ（商標））など、種々の増幅法によってつくられた核酸２１４の配列を決定する事が出来る。（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，８００，１５９号を参照）。或いは配列決定すべき核酸２１４を標準的ベクター、例えばプラスミド類、コスミド類、ＢＡＣｓ（細菌性人工染色体）またはＹＡＣｓ（酵母人工染色体）中でクローン化する。（バーガーおよびキメル、１９８７；サムブルックら、１９８９。） 核酸取込み配列２１４をベクターＤＮＡから例えば適切な制限酵素で切断し、その後アガロースゲル電気泳動を行うことによって分離出来る。取込み核酸２１４の分離法は公知である。

配列決定すべき核酸２１４は、非制限的に、ウィルス、細菌、病原体、真核生物、植物、動物、哺乳動物、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギおよびヒトを含む種々の有機体から分離出来る。増幅核酸２１４、または核酸２１４の増幅部分の使用も考えられる。

配列決定に使用される核酸２１４は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、リガーゼ連鎖反応増幅、Ｑベータ・レプリカーゼ増幅、ストランド・ディスプレースメント増幅、転写ベース増幅および核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）など、公知のあらゆる方法によって増幅出来る。

核酸の合成：本発明の幾つかの実施形態は、例えばＤＮＡポリメラーゼ２２２などを使用して相補的ＤＮＡ２２０を合成することを含む。このようなポリメラーゼ２２２はプライマー分子２２４に結合し、標識化ヌクレオチド類２１８をプライマー２２４の３’末端に付加する。使用出来るポリメラーゼ２２２の非制限的例としてはＤＮＡポリメラーゼ２２２、ＲＮＡポリメラーゼ２２２、逆転写酵素２２２、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ２２２などがある。“校正（ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ）”活性に関するこれらポリメラーゼ２２２間の相違、およびプライマー２２４およびプロモータ配列の要求性または不要求性は当業者には公知である。ＲＮＡポリメラーゼ２２２を使用する場合は、配列決定すべき鋳型分子２１４は二本鎖ＤＮＡ２１４でよい。使用出来るポリメラーゼ２２２の例は非制限的にテルマトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ２２２、アンプリタク・エフ・エス（ＡｍｐｌｉｔａｑＦＳ）（商標）ＤＮＡポリメラーゼ２２２、タケナーゼ（Ｔａｑｕｅｎａｓｅ）（商標）ＤＮＡポリメラーゼ２２２、テルモシーケナーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｎａｓｅ）（商標）２２２、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ２２２、Ｑベータ（商標）レプリカーゼ２２２、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ２２２、テルムス・テルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ２２２、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ２２２およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ２２２である。

多数のポリメラーゼ２２２が市販されており、それらにはＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ２２２（ベーリンガー・マンハイム・ビオケミカルス、インディアナポリス、ＩＮ）；Ｂｓｔ ポリメラーゼ２２２（ビオ−ラド ラボラトリース、ヘラクレス、ＣＡ）；イソサーム（ＩｓｏＴｈｅｒｍ）（商標）ＤＮＡポリメラーゼ２２２（エピセンター・テクノロジース（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、マジソン、ＷＩ）；モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）ネズミ白血病ウィルス逆転写酵素２２２、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ２２２、トリ骨髄芽球症ウィルス逆転写酵素２２２、サームス・フラヴス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）（Ｔｆｌ）ＤＮＡポリメラーゼ２２２およびサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ２２２（プロメガ社、マジソン、ＷＩ）；ＲＡＶ２逆転写酵素２２２、ＨＩＶ−１逆転写酵素２２２、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ２２２、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ２２２、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ２２２、サームス アクァティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ２２２、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ２２２＋／−３’→５’エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ２２２のクレノウ・フラグメント、サームス“ユビキタス”（Ｔｈｅｒｍｕｓ‘ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ’）ＤＮＡポリメラーゼ２２２、およびＤＮＡポリメラーゼＩ２２２（アマーシャム・ファーマシア・ビオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、ピスカタウェイ、ＮＪ）がある。標識ヌクレオチド類２１８の鋳型依存性重合を可能にする当業者に公知のポリメラーゼ２２２は全て使用出来る。（グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）およびチッピン（Ｔｉｐｐｉｎ）、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１巻（２号）：１０１〜９ページ、２０００；米国特許第６，０９０，５８９号などを参照）。ポリメラーゼ２２２を使用して標識化ヌクレオチド２１８から核酸２２０を合成する方法は知られている（例えば、米国特許第４，９６２，０３７号；第５，４０５，７４７号；第６，１３６，５４３号；第６，２１０，８９６号）。

プライマー：一般にプライマー２２４は１０ないし２０塩基の長さを有する。ただしこれより長いプライマー２２４も使用出来る。本発明の幾つかの実施形態において、プライマー２２４は鋳型核酸２１４の既知部分に正確に相補的な配列になるように設計される。例えば既知の一定の染色体配列に隣接する変異配列を同定するためにプライマー２２４が選択される場合、未知核酸２１４配列が既知の配列のベクターに取込まれる場合、または天然核酸２１４が部分的に配列が決定されている場合に、既知のプライマー配列を使用出来る。プライマー２２４の合成法は公知であり、自動オリゴヌクレオチド合成器が市販されている（例えば、アプライド・ビオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、フォスターシティー、ＣＡ；ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）、ベッドフォード、ＭＡ）。プライマー２２４もまた市販先（例えばミドランド・サーティファイド・リアジェンツ、ミドランド、ＴＸ）から入手可能である。

本発明の更に別の実施形態は、既知のプライマー２２４結合部位が存在しない核酸２１４の配列決定を含む。このような場合、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５塩基長さ、またはそれより長い塩基長さのランダムヘキサマー２２４またはランダムオリゴマー２２４のようなランダムプライマー２２４を使用して重合を開始する事が出来る。

核酸の付加：本発明の種々の実施形態において、核酸分子２１４は非共有結合または共有結合によって構造体１１６、２１２に付加される。非制限的例において、付加は、ストレプトアビジンまたはアビジンによる構造体１１６、２１２のコーティング、およびその後のビオチニル化核酸２１４および／またはプライマー２２４の結合によって起きる。異なる実施形態において、構造体１１６、２１２の表面および／または付加すべき核酸分子２１４を種々の既知の反応性基で修飾して付加を容易にする。

例えば、上記表面をアルデヒド、カルボキシル、アミノ、エポキシ、スルフヒドリル、光活性化基またはその他の公知の基で修飾する。表面の修飾は、反応性基を含むシラン類によるコーティングなど、当業者に公知の任意の方法を使用してよい。非制限的例には、アミノシラン、アチドトリメチルシラン、ブロモトリメチルシラン、ヨードトリメチルシラン、クロロジメチルシラン、ジアセトキシジ−ｔ−ブトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメチルシラン（ＧＯＰ）およびアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＳ）が含まれる。核酸を付加するためのシラン類およびその他の表面コーティング剤は市場で入手出来る（例：ユナイテド・ケミカル・テクノロジーズ、ブリストル、ＰＡ）。

核酸２１４を種々の反応性基で修飾して付加を容易にする事も出来る。ただし以下に述べる本発明の実施形態では、未修飾の核酸２１４を表面に付加する事も出来る。特定の実施形態において、核酸２１４を、それらの５’または３’末端および／または内部残基において修飾し、スルフヒドリル、アミノ、アルデヒド、カルボキシルまたはエポキシ基または光反応性基を含むようにする。本発明の特定の実施形態において、核酸２１４は表面に非共有結合するための基、例えばビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、ジゴキシゲニン、フルオレッセインまたはコレステロールなどで修飾する事が出来る。修飾された核酸、オリゴヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドは市場で入手でき（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｐｅｒｏｎ．ｃｏｍ／ｓｔｏｒｅ／ｄｅｓｒｅｆ．ｐｈｐ などを参照）または当業者に公知の方法を使用して作る事が出来る。

本発明の特定の実施形態において、化学的に修飾された構造体１１６、２１２に５’燐酸化核酸２１４を直接共有結合付加するという様態で付加がおこる（ラスムッセン（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８巻：１３８〜４２ページ、１９９１）。核酸２１４と構造体１１６、２１２との共有結合は、例えば水溶性カルボジイミドとの縮合によって形成出来る。この方法は（核酸の）５’ホスフェートによって核酸２１４の主として５’付加を容易にする。本発明の幾つかの実施形態において、鋳型核酸２１４はその３’末端によって固定され、相補的核酸２２０の重合が５’から３’へという様態で進行し得る。

構造体１１６、２１２をポリ−Ｌ−Ｌｙｓ（リジン）でコーティングし、その後二官能価の架橋試薬を用いてアミノ−またはスルフヒドリル−修飾核酸２１４を共有結合させるという様態で付加をおこす事が出来る（ランニング（Ｒｕｎｎｉｎｇ）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８巻：２７６〜７ページ、１９９０；ニュートン（Ｎｅｗｔｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１巻：１１５５〜６２ページ、１９９３）。本発明の更に別の実施形態において、ニトレン、カルベンまたはケチル基などの光化学反応種を含む感光性ポリマーを使用して、核酸２１４を構造体１１６、２１２に付加する事が出来る（米国特許第５，４０５，７６６号および第５，９８６，０７６号を参照）。構造体１１６、２１２を金のような金属でコーティングし、その後アミノまたはスルフヒドリル修飾核酸２１４を共有結合させるという様態で付加させる事も出来る。

付加のために、二官能価の架橋試薬を使用出来る。典型的架橋試薬には、グルタールアルデヒド（ＧＡＤ）、二官能価オキシラン（ＯＸＲ）、エチルグリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）および、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などのカルボジイミド類が含まれる。本発明の幾つかの実施形態において、構造体１１６、２１２の官能基は架橋化合物に共有結合し、核酸分子２１４とポリメラーゼ２２２との間の立体障害を減らす事が出来る。典型的架橋基にはエチレングリコール・オリゴマー類およびジアミン類がある。

本発明の幾つかの実施形態において、キャプチャーオリゴヌクレオチド２２４を構造体１１６、２１２に結合させる。キャプチャーオリゴヌクレオチド２２４は鋳型核酸２１４の相補的配列とハイブリッド化出来る。鋳型核酸２１４が結合すると、上記キャプチャーオリゴヌクレオチドを核酸重合のためのプライマー２２４として使用出来る。

各構造体１１６、２１２に付加させる核酸２１４の数は、構造体１１６、２１２の感度およびシステムのノイズレベルに応じて種々変化する。長さ約５００μｍという大きいカンチレバー１１６、２１２は、カンチレバー１１６、２１２ごとに、付加する核酸２１４分子を１０^１０も使用する。しかし、より小さいカンチレバー１１６、２１２を使用する際には、付加する核酸２１４の数は著しく減少する。有用な信号を発生するのに必要は付加核酸２１４の数の決定法は当業者には公知である。

構造体に付加する核酸のパターン化：本発明の特定の実施形態において、核酸２１４は信号振幅を最適化し、バックグラウンドノイズを減らすように選択した特定のパターンで構造体１１６、２１２表面に付加される。選択されたパターンで表面に核酸２１４を付加する種々の方法が当業者には公知であり、そのような方法のいずれを用いてもよい。

例えば、チオール誘導化核酸２１４を金の薄層でコーティングした構造体１１６、２１２に付加する事が出来る。このチオール基は金の表面と反応して共有結合を形成する（ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３巻：１５６７〜７１ページ、２００１）。核酸２１４は別の方法によって特定のパターンに付加してもよい。本発明のある実施形態では、構造の全表面を金または他の反応性基でコーティングする。誘導化核酸２１４を例えばディップペン・ナノリソグラフィーによって、選択したいずれかのパターンで表面に付加されて良い。または、金層を、反応性イオンビームエッチング、電子ビームまたは焦点性イオンビーム法などの公知の方法によって選択したパターンにエッチングしてもよい。チオール修飾核酸２１４にさらすと、この核酸２１４は構造体１１６、２１２の表面の、金層が残っている部分にだけ結合する。

パターン形成はフォトリソグラフィー法を使用して実行してもよい。核酸２１４を表面に付加するためのフォトリソグラフィー法は公知である（例えば米国特許第６，３７９，８９５号）。フォトマスクを使用して構造体１１６、２１２の選択領域を保護し、或いは光ビームに曝露する。光ビームは感光性結合基などの特定領域の化学反応を活性化し、鋳型核酸２１４を活性化領域へ付加させ、保護領域へは付加させない。アチド化合物のような感光性基は公知であり、市販されている。本発明の幾つかの実施形態において、ディップペン・ナノリソグラフィー、反応性イオンビームエッチング、化学的補助イオンビームエッチング、焦点性イオンビーム微粉砕、低電圧電子ビームまたは焦点性イオンビーム法または印刷技術などの公知の方法によって、ナノ−スケールのパターンが構造の表面につけられる。

パターン化核酸２１４の付加は当業者に公知のいずれの方法によっても実現出来る。本発明のある実施形態において、核酸２１４のパターンは、低電圧電子ビームリソグラフィーのような公知のリソグラフィー法によりパターンとして配置された自己集合性単層によって作られる。例えば、パリレンまたは同等化合物の層を構造表面に置き、リフトオフ処理によってパターンを作り、核酸２１４付加のためのパターン化表面を形成する（例えば米国特許第５，６１２，２５４号；第５，８９１，８０４号；第６，２１０，５１４号など）。

ヌクレオチドの標識：本発明のある実施形態において、一つ以上の標識を１つ以上の種類のヌクレオチド２１８につける事が出来る。標識は大きな基からなる。使用出来る標識の非制限的例は、ナノ粒子類（例えば金のナノ粒子）、ポリマー類、炭素ナノチューブ類、フラーレン類、官能性フラーレン類、量子ドット、デンドリマー類、蛍光、ルミネッセント、りん光、電子密度または質量分析標識を含む。有機性標識、無機性標識、および／または有機−無機ハイブリッド標識などあらゆる種類の標識が使用出来る。標識は、種々の方法、例えば構造体１１６、２１２の共振周波数の変化、圧電性刺激、構造体１１６、２１２の偏向、および質量および／または表面応力の変化を測定するその他の手段を使用して検出出来る。

標識化ヌクレオチド２１８はスペーサーアームによって標識に結合するプリンまたはピリミジン塩基を含む事が出来る。ヌクレオチド２１８の塩基類、糖類および燐酸基は水素結合の形成や核酸２２０の重合を阻害することなく修飾される。標識の付加によって修飾されるプリンまたはピリミジンの位置は、例えばグアニンのＮ２およびＮ７の位置、アデニンのＮ６およびＮ７の位置、シトシン、チミジンおよびウラシルのＣ５の位置、およびシトシンのＮ４の位置を含む。

当業者に公知の、使用出来る種々の標識としては、ＴＲＩＴ（テトラメチル ローダミン イソチオール）、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１、３−ジアゾール）、テキサスレッド色素、フタール酸、テレフタール酸、イソフタール酸、クレシル ファスト バイオレット、クレシルブルー バイオレット、ブリリアント クレシルブルー、パラ−アミノ安息香酸、エリスロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン、５−カルボキシ−４’、５’ジクロロ−２’、７’−ジメトキシフルオレッセイン、５−カルボキシ−２’、４’、５’、７’−テトラクロロフルオレッセイン、５−カルボキシフルオレッセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルアミノフタロシアニン類、アゾメチン類、シアニン類、キサンチン類、スクシニルフルオレッセイン類およびアミノアクリジンがある。これらのおよびその他の標識は市場から入手出来る（例えば、モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）社、ユージーン、ＯＲ）。多環式芳香族化合物または炭素ナノチューブ類も標識として使用出来る。

標識に共有結合するヌクレオチド２１８は標準的な市販元より入手可能である（例：ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ、インディアナポリス、ＩＮ；プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社、マジソン、ＷＩ；アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社、オースチン、ＴＸ；アマーシャム・ファーマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ピスカタウェイ、ＮＪ）。その他のヌクレオチド２１８など分子に共有結合反応するようにデザインされた反応性基を含む種々の標識が市販されている（例えば、モレキュラー・プローブス社、ユージーン、ＯＲ）。標識ヌクレオチド２１８の製法は公知である（例えば米国特許第４，９６２，０３７号；第５，４０５，７４７号；第６，１３６，５４３号；第６，２１０，８９６号など）。

ナノ粒子：本発明のある実施形態において、ナノ粒子を使用してヌクレオチド２１８を標識する事が出来る。本発明の幾つかの実施形態において、ナノ粒子は銀または金のナノ粒子である。本発明の種々の実施形態において、直径１ｎｍないし１００ｎｍのナノ粒子が使用出来る。ただし異なる大きさおよび質量のナノ粒子も考慮される。ナノ粒子の製法は公知である（例えば米国特許第６，０５４，４９５号；第６，１２７，１２０号；第６，１４９，８６８号；リー（Ｌｅｅ）およびメイセル（Ｍｅｉｓｅｌ）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．８６巻：３３９１〜５ページ、１９８２）。ナノ粒子は市販元からも入手可能である（例：ナノプローブス（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ）社、ヤファンク、ＮＹ；ポリサイエンシズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、ウォリントン、ＰＡ）。

本発明の幾つかの実施形態において、ナノ粒子は単一のナノ粒子である。或いはナノ粒子を架橋して、ナノ粒子の特定の凝集体、例えばダイマー、トリマー、テトラマーまたはその他の凝集体を生成する事が出来る。本発明のある実施形態において、選択された数のナノ粒子を含む凝集体（ダイマー、トリマーなど）はスクロース溶液中で超遠心分離するなどの公知の方法によって濃化または精製される。

ナノ粒子を架橋する方法は公知である（フェルドハイム（Ｆｅｌｄｈｅｉｍ）、“分子橋を用いる金属ナノ粒子アレーの組立て（Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ａｒｒａｙｓ ｕｓｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｉｄｇｅｓ）”、エレクトロケミカル・ソサイエティー・インターフェース（Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）、秋号、２００１、２２〜５ページ、など）。金のナノ粒子は例えば末端チオールまたはスルフヒドリル基を担う二官能価リンカー化合物を使用して架橋される。金のナノ粒子との反応の際に、上記リンカーは、リンカーの長さだけ離れたナノ粒子ダイマーを形成する。本発明のその他の実施形態において、３、４またはそれ以上のチオール基を有するリンカーを使用して複数のナノ粒子を同時に付加させる事が出来る（フェルドハイム、２００１）。リンカー化合物に対する過剰のナノ粒子の使用によって、多重架橋の形成およびナノ粒子の沈殿が阻止される。

本発明の更に別の実施形態において、ナノ粒子がリンカー化合物に付加する前に、ナノ粒子を種々の反応性基を含むように修飾する事が出来る。修飾されたナノ粒子は市販されており、ナノプローブス（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ）社（ヤファンク、ＮＹ）からのナノゴールド（Ｎａｎｏｇｏｌｄ）（商標）ナノ粒子などがある。ナノゴールド（商標）ナノ粒子には、ナノ粒子ごとに１個または複数のマレイミド、アミンまたはその他の基が付加している。ナノゴールド（商標）ナノ粒子はプラスまたはマイナスを帯電した形でも提供される。このように修飾されたナノ粒子は種々の公知のリンカー化合物に付加してナノ粒子のダイマー、トリマーまたはその他のナノ粒子凝集体を与える。

本発明の種々の実施形態において、ナノ粒子はヌクレオチド２１８に共有結合によって付加する。本発明のその他の実施形態において、ヌクレオチド２１８は直接ナノ粒子に付加してもよいし、ナノ粒子に共有または非共有結合するリンカー化合物に付加してもよい。本発明のこのような実施形態において、架橋よりむしろ、２つ以上のナノ粒子をリンカー化合物と共に使用してヌクレオチド２１８をナノ粒子またはナノ粒子凝集体に付加させる。本発明の特定の実施形態において、上記ナノ粒子に誘導化シランをコーティングする事が出来る。このように修飾されたシランを公知の方法によってヌクレオチド２１８に共有結合させる事が出来る。

本発明の典型的実施形態において、ヌクレオチド２１８を同じ大きさの１、２、３または４個のナノ粒子を含む凝集体で明白に標識化する事が出来る。或いは、ヌクレオチド２１８を異なる大きさおよび質量の個々のナノ粒子で標識化する事が出来る。使用する典型的金のナノ粒子はポリサイエンシズ社から、５、１０、１５、２０、４０および６０ｎｍサイズのものが入手出来る。幾つかの実施形態において、異なる種類の各ヌクレオチド２１８（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵ）を識別出来る質量を有するナノ粒子またはナノ粒子凝集体で標識化する。

情報処理・制御システムおよびデータ分析：本発明の幾つかの実施形態において、シークエンシング装置１００にはデータ処理および制御システム１１０がインターフェースとして付属している。本発明の典型的一実施形態において、システム１１０は情報を伝達するためのバスまたはその他の伝達手段および情報を処理するためのバスと連結したプロセッサまたはその他の処理手段を含むコンピュータ１１０を組み込む。本発明の一実施形態において、プロセッサは、インテル社（サンタクララ、ＣＡ）から入手出来るペンティアム（Ｐｅｎｔｉｕｍ）（商標）ＩＩファミリー、ペンティアム（商標）ＩＩＩファミリーおよびペンティアム（商標）４ファミリーのプロセッサ類を含むペンティアム（商標）ファミリーのプロセッサ類から選択される。本発明の更に別の実施形態において、プロセッサはセレロン（Ｃｅｌｅｒｏｎ）（商標）、イタニウム（Ｉｔａｎｉｕｍ）（商標）、ペンティアム・ジオン（Ｐｅｎｔｉｕｍ Ｘｅｏｎ）（商標）プロセッサまたは、Ｘ−スケール（商標）ファミリー・プロセッサ類（インテル社、サンタクララ、ＣＡ）の１つでもよい。本発明のその他の種々の実施形態において、プロセッサはインテルＩＡ−３２またはインテルＩＡ−６４アーキテクチャーなどのインテル・アーキテクチャーに基づく。この代わりにその他のプロセッサを使用してもよい。

コンピュータ１１０はさらに、情報およびプロセッサにより実行される命令を保存するためにバスに連結されたランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）またはその他のダイナミック保存装置（メインメモリー）を含む事が出来る。メインメモリーを使用して、プロセッサによる命令の実行中に一時的な変数またはその他の中間情報を保存する事も出来る。コンピュータ１１０は、スタティックなデータとプロセッサのための命令を保存するためのバスに連結されたリード・オンリー・メモリー（ＲＯＭ）および／またはその他のスタティック保存装置も含む事が出来る。その他の標準的コンピュータ１１０の構成部品、例えば表示デバイス、キーボード、マウス、モデム、ネットワークカード、または当業者に公知のその他の構成部品が情報処理および制御システムに組み込まれる。当業者は、本明細書に記載の例とは異なるように備えつけられた情報処理および制御システム１１０をある種の実装のために使用出来ることを理解出来る。したがってシステム１１０の構成は多岐にわたる。

本発明の特定の実施形態において、検出ユニット１１８も上記バスに連結する事が出来る。プロセッサは検出ユニット１１８からのデータを処理する。処理済みおよび／または生のデータはメインメモリーに保存される。分析チェンバ１１４、２１０に導かれた標識ヌクレオチド２１８および／またはヌクレオチド２１８の配列の質量に関するデータもメインメモリーまたはＲＯＭに保存される。プロセッサは検出された質量および／または表面応力の変化を標識ヌクレオチド２１８の質量に比較し、相補的核酸鎖２２０に取込まれたヌクレオチド２１８の配列を確認する事が出来る。プロセッサは検出ユニット１１８からのデータを分析して鋳型核酸２１４の配列を決定する事が出来る。

情報処理および制御システム１１０はその他にシークエンシング装置１００を自動制御する。プロセッサからの命令はバスを通って種々の出力デバイス、例えば制御ポンプ、電気泳動または電気浸透リードおよび装置１００のその他の構成部品などに伝達される。

ここに記載するプロセスはプログラムされたプロセッサの制御下で行われる一方、本発明の別の実施形態では、プロセスが全部または部分的に、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレー（ＦＰＧＡｓ）、ＴＴＬロジック、または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣｓ）などのプログラム可能なまたはハードコードされたロジックによって行われ得ることに注意しなければならない。さらに、ここに記載の方法はプログラムされた汎用コンピュータ１１０の構成部品および／またはカスタム・ハードウエア構成部品の任意の組み合わせによって実行し得る。

本発明の幾つかの実施形態において、カスタム設計されたソフトウエアパッケージを使用して検出ユニット１１８から得られるデータを分析する事が出来る。本発明の更に別の実施形態において、データ分析はデータ処理および制御システム１１０および公的に使用出来るソフトウエアパッケージを用いて行ってもよい。ＤＮＡ配列分析のために使用出来るソフトウエアの例は非制限的に、ＰＲＩＳＭ（商標）ＤＮＡシークエンシング分析ソフトウエア（アプライド・ビオシステムズ、フォスターシティー、ＣＡ）、シーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）（商標）パッケージ（ジーン・コーズ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ）、アンアーバー、ＭＩ）、およびウエブサイトｗｗｗ．ｎｂｉｆ．ｏｒｇ／ｌｉｎｋｓ／１．４．１．ｐｈｐ のナショナル・バイオテクノロジー・インフォメーション・ファシリティーから提供される種々のソフトウエアパッケージを含む。

ここに開示され請求される全ての方法および装置１００は本開示を考慮して不当な実験をせずに作られ、実行される。ここに記載の方法および装置１００には、所有権を主張する主題の概念、精神および範囲から逸脱することなく変更を加え得ることは当業者には当然である。より詳細に述べれば、ここに記載される作用物質の代わりに、化学的にも物理的にも関係のある幾つかの作用物質を使用する事が出来、しかも同一または同様の結果が得られることは明らかである。当業者に明らかな、このようなあらゆる類似の代替物および変更は、請求の主題の精神、範囲および概念の範囲内であると思われる。

核酸２１４分析のための典型的装置１００（一定の縮尺ではない）を示す。 核酸２１４分析のための装置１００（一定の縮尺ではない）の更に別の典型的実施形態を示す。 核酸２１４分析のための装置１００（一定の縮尺ではない）の更に別の典型的実施形態を示す。 核酸２１４分析のための装置１００（一定の縮尺ではない）の更に別の典型的実施形態を示す。 本明細書に記載の方法および装置を使用して作成されたシークエンシングデータの例を示す。 本明細書に記載の方法および装置１００を使用して作成されるシークエンシングデータの更に別の例を示す。

Claims (30)

1. ａ）一つ以上の鋳型核酸分子を一つ以上の構造体に付加する段階と、
   ｂ）標識化ヌクレオチド類から一つ以上の相補的核酸を合成する段階と、
   ｃ）前記構造体の特性の変化を検出する段階と、
   ｄ）前記構造体の特性の変化から、取込まれたヌクレオチドを確認する段階と、
   ｅ）前記鋳型核酸の配列を決定する段階と
   を備える、方法。
2. 構造体の特性の変化が付加された核酸の質量の関数である、請求項１に記載の方法。
3. 構造体の特性の変化が前記構造体の表面応力の関数である、請求項１に記載の方法。
4. 構造体がカンチレバーである、請求項１に記載の方法。
5. 構造体の特性の変化が光学的ビーム検出、圧電性検出、ピエゾ抵抗検出または電気抵抗検出によって検出される、請求項１に記載の方法。
6. 構造体の特性の変化が前記構造体の共振周波数の変化または前記構造体と結合する電気回路の抵抗の変化によって検出される、請求項１に記載の方法。
7. 標識化ヌクレオチド類が少なくも１個の質量標識基を備える、請求項１に記載の方法。
8. それぞれ異なる種類のヌクレオチドが識別可能の質量標識基を有する、請求項７記載の方法。
9. 質量標識基がナノ粒子類、ナノ粒子凝集体類、炭素ナノチューブ類、フラーレン類、官能価フラーレン類、量子ドット類、デンドリマー類、有機分子類、ポリマー類、重原子類、蛍光標識類、ルミネッセント標識類および質量分光光度標識類からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
10. 鋳型核酸にプライマーをハイブリッド化する段階を更に備える、請求項１に記載の方法。
11. 標識化ヌクレオチドがポリメラーゼによってプライマーの３’末端に共有結合で付加する請求項１０記載の方法。
12. 鋳型核酸分子が、前記構造体の表面の部分に選択されたパターンで配置される、請求項１に記載の方法。
13. １つの種類だけのヌクレオチドが鋳型核酸および相補的核酸に同時にさらされる、請求項１に記載の方法。
14. ４つの種類のヌクレオチド類が鋳型核酸および相補的核酸に同時にさらされる、請求項８記載の方法。
15. 核酸分析法であって：
    ａ）少なくも一つの鋳型核酸を一つ以上の構造体に付加する段階と；
    ｂ）選択された数の標識化ヌクレオチドを含む少なくも一つの核酸セグメントを合成する段階と、
    ｃ）前記標識化ヌクレオチドの取込み時の構造体の特性の変化を検出する段階と、
    ｄ）前記構造体の特性の変化から前記核酸セグメントの配列を決定する段階と
    を備える、方法。
16. ｅ）相補的核酸セグメント中の前記標識化ヌクレオチドを未標識ヌクレオチドで置換する段階と、
    ｆ）選択された数の標識化ヌクレオチドを含む隣接相補的核酸セグメントを合成する段階と、
    ｇ）これら標識化ヌクレオチドの取込み時の前記構造体の特性の変化を検出する段階と、
    ｈ）隣接する相補的核酸セグメントの配列を決定する段階と
    を更に備える、請求項１５に記載の方法。
17. （ｅ）から（ｈ）までを、核酸配列が判明するまで反復する段階を更に備える、請求項１６に記載の方法。
18. 前記標識化ヌクレオチドから標識を除去することによって、未標識ヌクレオチドが前記標識化ヌクレオチドに取って代わる、請求項１６に記載の方法。
19. 前記構造体がカンチレバーである、請求項１５に記載の方法。
20. 前記構造体の特性が、カンチレバーの偏向、カンチレバーの共振周波数またはカンチレバーと接続する電気回路の抵抗である、請求項１９に記載の方法。
21. カンチレバーの偏向、カンチレバーの共振周波数のシフト、またはカンチレバーと接続する電気回路の抵抗の変化が、標識化ヌクレオチドの質量の関数である、請求項２０に記載の方法。
22. カンチレバーの偏向、カンチレバーの共振周波数のシフトまたはカンチレバーと接続する電気回路の抵抗の変化が、前記カンチレバーの表面応力の関数である、請求項２０に記載の方法。
23. 鋳型核酸が、選択されたパターンで前記構造体の表面の部分に配置される、請求項１５に記載の方法。
24. ａ）一つ以上の構造体を含む分析チェンバと、
    ｂ）前記分析チェンバと液体連絡する一つ以上の試薬貯蔵器と、
    ｃ）前記構造体に操作可能に結合する検出ユニットと、
    ｄ）データ処理および制御ユニットと
    を備える装置。
25. 前記構造体に付加された一つ以上の核酸を更に備える、請求項２４に記載の装置。
26. １種類以上のポリメラーゼを前記分析チェンバ内に更に備える、請求項２５に記載の装置。
27. 前記構造体がカンチレバーである、請求項２４に記載の装置。
28. 検出ユニットが位置感受性光検出器、圧電性検出器またはピエゾ抵抗器を備える、請求項２４に記載の装置。
29. 検出ユニットがレーザを含む、請求項２４に記載の装置。
30. 前記検出ユニットが、前記構造体に付加された核酸の質量および／または前記構造体の表面応力の変化を検出する、請求項２５に記載の装置。

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