KR20070000447A

KR20070000447A - 분자 복제 동안 뉴클레오티드의 흡착을 라만 모니터링하는것에 의한 핵산 시퀀싱

Info

Publication number: KR20070000447A
Application number: KR1020067015270A
Authority: KR
Inventors: 앤드류 벌린; 싱 수; 셀레나 챈; 태웅 구; 레이 선; 나라얀 선다라라잔
Original assignee: 인텔 코포레이션
Priority date: 2003-12-30
Filing date: 2004-12-28
Publication date: 2007-01-02
Also published as: JP2007520215A; EP1711626A2; CN1934271A; WO2005066369A3; WO2005066369A2; US20050202468A1; US20050147979A1

Abstract

본원에 개시된 방법 및 장치는 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 및 염기의 검출, 및 핵산 서열 결정에 유용하다. 방법은 표면 증강 라만 분광법(SERS) 또는 표면 증강 가간섭성 반스토크스 라만 분광법(SECARS)을 이용한 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기의 검출을 포함한다. 검출은 핵산 중합 반응, 예컨대 핵산 시퀀싱 반응 동안 데옥시뉴클레오티드 삼인산염의 흡착을 검출하기 위한 핵산 시퀀싱 반응의 일부일 수 있다. 합성된 초기 가닥의 핵산 서열, 및 주형 가닥의 상보적 서열은 중합 반응 동안 뉴클레오티드의 혼입 순서를 추적함으로써 결정될 수 있다. 당 부분으로부터 염기를 절단함으로써 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 SERS 신호를 증강시키는 방법이 제공된다. 또한, 단일 염기 반복체의 검출 방법도 제공된다.

Description

분자 복제 동안 뉴클레오티드의 흡착을 라만 모니터링하는 것에 의한 핵산 시퀀싱{NUCLEIC ACID SEQUENCING BY RAMAN MONITORING OF UPTAKE OF NUCLEOTIDES DURING MOLECULAR REPLICATION}

본 발명은 생체분자의 검출 및 분석, 보다 구체적으로는 핵산의 검출 및 서열 결정에 관한 것이다.

유전 정보는 염색체로 조직화되는 데옥시리보핵산(DNA)의 매우 긴 분자의 형태로 저장된다. 인간 게놈은 DNA 서열의 대략 삼십억개 염기를 함유한다. 이 DNA 서열 정보는 각 서열의 다중 특성들을 결정한다. 많은 통상적 질병들은 DNA 서열의 변화에 적어도 부분적으로 기초한다.

인간 게놈의 전체 서열의 결정은 그러한 질병의 유전적 기초를 확인하기 위한 토대를 제공하였다. 그러나, 상당한 실험이 각 질병과 연관된 유전적 변종들을 확인하기 위해 행해지고 있다. 이 실험은 질병을 촉진하는 DNA 서열의 특정 변화를 확인하기 위해, 그러한 질병을 나타내는 개인 또는 가족에서의 염색체의 부분을 DNA 시퀀싱을 필요로 한다. 유전 정보 처리에서의 중간 분자인 리보핵산(RNA)도 또한 각종 질병들의 유전적 염기를 동정하기 위해 시퀀싱될 수 있다.

현 시퀀싱 방법들은 관심 주형 핵산의 많은 복사체들이 생성되어 중복 단편으로 절단된 후 시퀀싱될 것을 필요로 하며, 시퀀싱 후 중복 DNA 서열은 완전 유전자로 조립된다. 이 공정은 번거롭고, 고가이며, 비효율적이고, 시간 소모적이다. 또한 그것은 전형적으로 가능히 안전성 및 폐기물 처분 문제를 부과할 수 있는, 형광 또는 방사능 표지의 사용을 필요로 한다. 따라서, 현 방법보다 더 저렴하고, 더 효율적이며, 더 안전한 향상된 핵산 시퀀싱 방법에 대한 필요가 존재한다.

도 1은 한 예시적 장치(10)(비례에 맞게 그려지지 않음), 및 핵산 합성 동안에 용액으로부터 뉴클레오티드(17)의 흡착을 모니터링함으로써 핵산(13)이 시퀀싱되는 DNA 시퀀싱 방법을 도시한다.

도 2는 10초의 데이터 수집 시간을 이용하여, 100 mM 농도에서의 4개의 모든 데옥시뉴클레오티드 일인산염(dNMP)의 라만 스펙트럼을 나타낸다. 특징적 라만 방출 피크는 각 상이한 유형의 뉴클레오티드에 대해 나와 있다. 뉴클레오티드의 표지화 또는 표면 증강 없이 데이터가 수집되었다.

도 3은 [Nucleic Acid Chemistry, 제1 파트, L. B. Townsend 및 R. S. Tipson(편저), Wiley-Interscience, New York, 1978]에 따라 산 처리하여 dGMP로부터 수득된 1 nM 구아닌의 SERS 검출을 보여준다.

도 4는 100 nM 시토신의 SERS 검출을 보여준다.

도 5는 100 nM 티민의 SERS 검출을 보여준다.

도 6는 100 pM 아데닌의 SERS 검출을 보여준다.

도 7은 플루오레신으로 공유 표지된 데옥시아데노신 삼인산염(dATP-플루오레신)(상부 추적) 및 비표지된 dATP(하부 추적)의 500 nM 용액의 비교 SERS 검출을 보여준다. dATP-플루오레신은 로쉐 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science)(미국 인디애나주 인디아나폴리스 소재)로부터 수득되었다. 플루오레신으로 표지된 dATP에서 SERS 신호의 강한 증가가 검출되었다.

도 8은 아데닌의 0.9 nM (나노몰) 용액의 SERS 검출을 보여준다. 검출 체적은 아데닌의 대략 60개 분자를 포함하여 약 100 내지 150 펨토리터인 것으로 평가되었다.

도 9a는 dATP(50)을 이용하여 고체 기재(70) 상에 고정된 주형 핵산 분자(60)의 집단의 표적 위치에서의 뉴클레오티드 존재를 결정하는 것을 도시한다. 반응전 혼합물로부터 검출된 SERS 신호가 도 9b에 나와 있고, 여기서 dATP의 SERS 신호가 검출된다. 도 9c는 반응후 혼합물로부터의 SERS 신호를 보여주고, 여기로부터는 신호가 검출되지 않는다.

도 10은 다중 시퀀싱을 위한 마이크로유체상 칩의 개략적 모식도이다.

도 11은 혼합실(180)의 교대 설계의 모식도이다.

도 12a 내지 12d는 주형 핵산 분자의 표적 위치에서의 뉴클레오티드 존재를 결정하기 위한 본원에 개시된 방법의 구체예를 도시한다. 도 12a는 기재(70) 상에 고정된 주형 가닥(60)을 보여주고, 주형 가닥(60)에 혼성화된 프라이머(90)를 보여주며, 여기서 프라이머 결합 부위에 대해 3'으로 인접해 있는 뉴클레오티드는 표적 위치(65)이다. 도 12b에서, dATP(50) 및 폴리머라제(95)가 핵산 주형 가닥(60)에 첨가된다. 도 12c에서, dTTP(51) 및 폴리머라제(95)가 혼성화된 프라이머(90)와 함께 주형 가닥(60)에 첨가된다. 도 12d는 주형 핵산 가닥(60)의 표적 위치(65)에 첨가된 티미딘(T) 뉴클레오티드를 보여준다.

도 13은 (대략 6개 분자에 상응하는) 90 pM dAMP의 SECARS 스펙트럼을 보여준다.

도 14는 은/염 용액 대조군의 SECARS 스펙트럼을 보여준다.

개시된 방법 및 장치는 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함하는 표적 분자, 예컨대 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드의 급속 자동화 검출에 유용하다. 방법 및 장치는 퓨린 및 피리미딘 염기의 상대적으로 거의 0에 가까운 개수의 복사체, 일부 경우들에서는 단일 복사체가 SERS을 이용하여 검출될 수 있다는 발견과 관련된다. 또한, 방법 및 장치는 피리미딘 및 퓨린 염기를 포함하는 표적 분자의 라만 검출의 감도가 검출 전에 표적 분자로부터 퓨린 또는 피리미딘 염기를 절단하고/하거나, 특히 피리미딘 염기의 검출을 위해, SERS와 조합된 가간섭성 반스토크스 라만 분광법(CARS)을 이용함으로써 증가될 수 있다는 발견과 관련된 것이다.

본원에 개시된 방법 및 장치는 전형적으로 뉴클레오티드 흡착을 측정하는 핵산 시퀀싱 반응에 사용된다. 본원에 개시된 핵산 시퀀싱 반응은 보다 빠른 서열 데이터 수득 속도, 감소된 시퀀싱 비용, 서열 데이터 단위 당 필요한 오퍼레이터 시간에서의 보다 큰 효율, 및 단일 시퀀싱 운용에서 긴 핵산 서열을 읽는 능력을 포함한, 종래 시퀀싱 방법 대비 이점들을 제공한다. 또한, 뉴클레오티드 흡착을 측정하는 핵산 시퀀싱 반응에서 동일한 뉴클레오티드의 연속적 반복체를 검출하기 위한 향상된 방법이 제공된다.

따라서, 퓨린 또는 피리미딘 염기 표적 분자의 잔여로부터 분리되고, 분리된 퓨린 또는 피리미딘 염기가 라만 분광법을 이용하여 검출되는, 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함하는 표적 분자의 검출 방법이 제공된다. 특정 측면들에서 라만 분광법은 표면 증강 라만 분광법(SERS) 또는 SECARS이다.

방법은 특정 측면들에서 표적 분자로부터 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기를 분리하기 전에 표적 분자를 단리하는 것을 포함할 수 있다. 단리 단계는, 예를 들어 라만 신호를 발생시키는 다른 분자를 포함하는 환경으로부터 표적 분자가 수득되는 측면들에 포함된다.

표적 분자, 전형적으로는 퓨린 또는 피리미딘이 당 부분에 결합된 생체분자로부터 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기를 분리하는 방법은 당 기술분야에 공지되어 있다. 표적 분자가 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드인 측면들에서, 용어 "분리(separating)"는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 잔여로부터 염기를 제거하기 위한 모든 유기 및 효소적 방식들을 포괄하여 사용된다. 예를 들어, 표적 분자가 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드인 경우, 20분 동안 >60℃에서의 0.2 N HCl을 이용한 탈글루코실화를 사용하여, 당 골격으로부터 염기를 절단할 수 있다. 대안적으로, 효소, 예컨대 DNA 글리코실라제, 포스포릴라제, 또는 뉴클레오시드 하이드롤라제가 또한 사용될 수 있다. 탈글루코실화는 염기가 SERS 기재 상에 침착되기 전에 수행된다. 염기는 그것이 SERS 기재 상에 침착되기 전에 당 부분으로부터 분리될 필요는 없다.

특정 측면들에서, 방법은 표적 분자로부터 염기를 분리하기 전 또는 후에, 또한 SERS를 이용하여 분리된 퓨린 또는 피리미딘 염기를 검출하기 전에, 표면 증강 라만 분광법(SERS) 기재 상에 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기를 침착시키는 것을 더 포함한다. 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 및 퓨린 및 피리미딘 염기를 SERS 기재 상에 침착시키는 방법은 본원에서 더 상세히 논의된다.

이 측면들에 대한 표적 분자는 전형적으로 표적 분자의 퓨린 또는 피리미딘 염기에 의한 라만 신호 발생을 간섭하는 간섭 부분을 포함한다. 예를 들어, 간섭 부분은 당 부분, 예컨대 리보스 또는 데옥시리보스, 예를 들어 2-데옥시리보스일 수 있다. 본 발명의 이 실시양태들의 특정 측면들에서, 표적 분자는 뉴클레오티드 인산염, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드이다. 방법에 따라 검출될 수 있는 표적 분자의 예에는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 핵산, 및 옥시 또는 데옥시-뉴클레오티드 일-, 이- 또는 삼인산염이 포함된다. 예를 들어, 표적 분자는 하나 이상의 dNTP일 수 있다. 또한, 표적 분자는 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함하는 뉴클레오시드일 수 있다.

표적 분자를 분리하기 전 또는 후에 SERS 기재 상에 염기를 침착시키는 것을 포함하는 실시양태들의 특정 측면들에서, 방법은 가간섭성 반스토크스 라만 분광법(CARS)을 이용하여 분리된 퓨린 또는 피리미딘 염기를 검출하는 것을 더 포함한다. SERS 기재 상에 분자를 침착시킨 후에 CARS를 이용하여 검출하는 것을 포함하는 발명의 측면은 본원에서 SECARS로 칭해진다. 따라서, CARS에 의해 표적 분자를 검출하기 전에 표면 증강 라만 분광법(SERS) 기재 상에 표적 분자를 침착시키는 것을 포함하는, 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기를 포함하는 표적 분자의 검출 방법이 제공된다. 양 SE CARS에 의한 검출을 포함하는 발명의 실시양태들은, 상기 개시된 바와 같이 검출 전에 표적 분자의 잔여로부터 퓨린 또는 피리미딘 염기를 분리하여 라만 신호를 증강시키는 것을 임의로 포함한다.

알려진 바와 같이, CARS는 자발적 라만 산란의 비선형 광학 유사 형태인 가간섭성 반스토크스 라만 산란을 검출한다. 이 기법에서, 특별한 라만 전이는 2개의 레이저 장, 즉 소위 "펌프 레이저", 및 반스토크스 신호장을 발생시키는 "스토크스 레이저"에 의해 가간섭으로 구동된다(Muller 등, CARS microscopy with folded BoxCARS phasematching. J. Microsc. 197:150-158, 2000). 프로세스의 가간섭 성질은 특별한 진동 모드에 레이저 장이 효율적으로 결합되도록 하며, 이로써 많은 등급만큼 이 모드로부터의 신호를 증가시킨다.

방법, 특히 SECARS를 이용하여 표적 분자를 검출하는 것을 포함하는 방법의 특정 측면들에서, 표적 분자는 피리미딘 염기를 포함한다. 예를 들어, 표적 분자는 티민, 우라실 또는 시토신과 같은 피리미딘 염기를 포함하는 뉴클레오티드 인산염, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드일 수 있다. 본원의 실시예에서 설명된 바와 같이, 피리미딘을 검출하기 위해 SERS를 단독 사용하는 것은 퓨린 염기에 대해 수득된 신호 수준에 비해 감소된 신호 수준을 초래한다. 그러므로, SERS 기재 상의 침착 후에 분자를 검출하기 위해 CARS를 사용하는 것은 SERS를 단독 사용하는 것보다 더 민감한 포맷을 제공한다.

특정 측면들에서, 표적 분자는 염기로 "실질적으로 구성된다". 이 측면들에서, 다른 기가 뉴클레오티드 내의 염기에 정상적으로 결합되지 않은 염기에 결합될 수 있다. 예를 들어, 염기는 부가적 관능기 또는 표지를 포함할 수 있다.

특정 측면들에서 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기는 예를 들어 직경이 약 5 내지 200 nm인, 하나 이상의 은 나노입자, 예컨대 나노구조의 SERS 기재 상에 침착된다. 이 측면들에서, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기는 예를 들어 염화리튬과 같은 알칼리-금속 할로겐화물 염과 은 나노입자 모두와 접촉될 수 있다. 염화리튬은 예를 들어 약 50 내지 약 150 마이크로몰, 약 80 내지 약 100 마이크로몰, 또는 일부 더 특정한 실시양태들에서는 약 90 마이크로몰의 농도로 사용될 수 있다.

특정 측면들에서, 염기, 예를 들어 아데닌의 단일 분자가 검출된다. 염기의 신호를 증강시키기 위해, 예를 들어 염기가 피리미딘인 실시양태들에서, 염기는 라만 표지와 결합될 수 있다.

특정 측면들에서, 표적 분자의 검출 방법은 핵산 시퀀싱 방법에 사용된다. 예를 들어, 이 측면들에서, 표적 분자는 데옥시뉴클레오티드 삼인산염이다. 따라서, 이 실시양태들에서, 표적 분자, 예컨대 데옥시뉴클레오티드 삼인산염이 퓨린 또는 피리미딘 염기가 표적 분자로부터 분리되어 SERS 표면 상에 침착되기 전에, 주형 핵산과의 시퀀싱 반응에 사용된다. 이 측면들에서, 예를 들어 시퀀싱되는 주형 핵산 또는 시퀀싱 프라이머는 고정되어, 데옥시뉴클레오티드 삼인산염을 포함하는 시퀀싱 반응 혼합물 성분과 접촉하여, 초기(nascent) 가닥에 혼입되지 않은 데옥시뉴클레오티드 삼인산염 분자를 포함하는 반응후 혼합물 내의 표적 핵산에 대해 상보적인 초기 가닥을 형성한다. 초기 가닥에 혼입되지 않은 데옥시뉴클레오티드 삼인산염 분자를 포함하는 반응후 혼합물이 SERS 기재 상에 침착되고, 라만 산란이 검출된다. 이 실시양태들에서, 분리된 퓨린 또는 피리미딘 염기를 검출하기 전에 데옥시뉴클레오티드 삼인산염(dNTP)을 단리할 필요가 없다. 주형 핵산을 제외한 모든 반응물들을 포함하는 반응전 혼합물에서 예기되거나 결정되는 경우와 대비되는, 반응후 혼합물에서 발생되는 라만 신호의 강도의 감소는, dNTP의 뉴클레오티드가 초기 가닥에 혼입됨으로써, 상보적 주형 핵산의 뉴클레오티드 존재를 나타냄을 가리킨다.

dNTP 또는 기타 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드에 의해 발생되는 신호를 증가시키기 위해 라만 표지가 사용될 수 있다. 특정 측면들에서, 뉴클레오티드는 라만 분광법에 의해 검출되기 전에 라만 표지, 예를 들어 형광체 또는 나노입자에 결합된다. 퓨린 또는 피리미딘 염기는 표적 분자의 잔여로부터 분리되기 전 또는 후에 라만 표지에 결합될 수 있다.

본 발명의 특정 측면들에서, 표적 분자는 본원에 제공된 방법에 의해 검출되기 전에 생물학적 샘플로부터 단리된다. 생물학적 샘플은, 예를 들어 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 침, 뇌척수액, 눈물, 점액 등이다.

특정 측면들에서, 생물학적 샘플은 포유동물 대상, 예를 들어 인간 대상으로부터의 샘플이다. 생물학적 샘플은 사실상 임의의 생물학적 샘플, 특히 대상으로부터의 RNA 또는 DNA를 포함하는 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 예를 들어 1 내지 10,000,000개; 1000 내지 10,000,000개; 또는 1,000,000 내지 10,000,000개 체세포를 포함하는 조직 샘플일 수 있다. 샘플은 일부 측면들에서 단지 RNA 또는 DNA의 1개 분자만을 필요로 하는, 본원에 제공된 방법을 위해 충분한 RNA 또는 DNA를 포함하는 한, 완전 세포를 포함할 필요는 없다. 생물학적 샘플이 포유동물 대상으로부터의 샘플인 본 발명의 측면들에 따라, 생물학적 또는 조직 샘플은 임의의 조직으로부터의 샘플일 수 있다. 예를 들어, 조직은 수술, 생검, 면봉, 채변 또는 기타 수집 방법에 의해 수득될 수 있다.

다른 측면들에서, 생물학적 샘플은 병원체, 예를 들어 바이러스 또는 세균성 병원체를 포함한다. 특정 측면들에서, 주형 핵산은 프로브와 접촉되기 전에 생물학적 샘플로부터 정제된다. 단리된 주형 핵산은 증폭되지 않고 반응 혼합물과 접촉할 수 있다.

다른 한 실시양태에서, 주형 핵산 분자, 전형적으로 단일 가닥의 주형 핵산 분자의 기지(旣知)의 수의 복사체가 프라이머, 폴리머라제 및 기지의 초기 농도의 제1 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물과 접촉하여 반응후 혼합물을 형성하고, 여기서 본원에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이 제1 뉴클레오티드의 초기 가닥으로의 흡착이 정량화되어, 표적 위치에 뉴클레오티드의 다중 복사체가 존재하는지의 여부를 결정하기 위해 사용되는, 주형 핵산 분자 내의 연속적 표적 위치에서의 동일 뉴클레오티드의 검출 방법이 제공된다. 이 방법에 따라, 인큐베이션하여, 폴리머라제에 의해 초기 가닥이 합성되도록 하고, 반응후 혼합물을 형성한 후에, 반응후 혼합물을 이어서 SERS 기재 상에 침착시키고, 반응후 혼합물 중의 제1 뉴클레오티드의 농도를 결정하여, 반응후 혼합물의 SERS 신호의 검출에 의해 초기 핵산 가닥으로의 제1 뉴클레오티드의 흡착을 검출하기 위해 사용한다. 프라이머 또는 주형 핵산은 반응실의 표명 상에 고정되고, 프라이머의 3' 말단은 연속적 표적 위치의 5' 뉴클레오티드의 상류에 있는 주형 핵산 분자에 결합한다. 방법은 예를 들어 SERS 신호의 감소가 검출될 때까지, 부가적 뉴클레오티드로 반복될 수 있다.

특정 측면들에서, 뉴클레오티드는 dNTP이다. 예를 들어, dATP는 제1 뉴클레오티드일 수 있고, 방법의 후속 사이클은 예를 들어 dGTP, dCTP 및 dTTP을 각기 이용하여 수행될 수 있다. 반응 혼합물은 당 기술분야에 공지된 바와 같은 핵산 중합 반응 혼합물이다. 반응 혼합물은 본원에서 논의되는 바와 같이, 전형적으로 완충액 중의 프라이머 및 폴리머라제뿐만 아니라 dNTP 형태의 뉴클레오티드를 포함한다.

특정 측면들에서, 제1 뉴클레오티드는 SERS 기재 상에 침착되기 전에 반응후 혼합물로부터 단리될 수 있다. 또한, 퓨린 또는 피리미딘 염기는 SERS 기재 상에 침착되어 SERS에 의해 검출되기 전에, 본원에서 논의되는 바와 같이, dNTP의 리보스 또는 데옥시리보스 부분으로부터 분리될 수 있다.

주형 핵산 분자의 복사체 수, 및 뉴클레오티드의 농도는 당 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다(예컨대, [Sambrook 등, (1989)]을 참고한다). 예를 들어, 핵산 정량화는 260 및 280 nm의 파장에서의 분광광도 측정을 이용하여, 혹은 핵산 내에 삽입된 에티디움 브로마이드 분자에 의해 방출된 형광을 측정함으로써 결정될 수 있다. 측정은 주형 핵산 분자 및 뉴클레오티드의 농도 및 복사체 수를 평가하기 위해 기지의 농도의 핵산의 일련의 샘플들에 대한 유사 측정들과 비교될 수 있다. 대안적으로, 상대 농도는 중합 반응 전 및 후에 측정된 SERS 신호 강도에 기초하여 결정될 수 있다.

특정 측면들에서, 주형 핵산 분자의 복사체 수는 주형 핵산 분자와 접촉된 제1 뉴클레오티드의 복사체 수의 1/20, 1/10, 1/5, 1/4, 1/3, 1/2이거나 대략 동일하다(즉, 10% 내). 예를 들어, 도 9a에 나와 있는 바와 같이, 주형 핵산 분자(60) 및 dNTP(50)의 대략 동일한 복사체 수가 제공되고, 주형 핵산 분자(60)이 반응실(80)에서 기재(70)에 고정되는 측면들에서, 반응후 혼합물 내의 SERS 신호(도 9c)는 dNTP의 초기 농도에 대해 발생된 SERS 신호(도 9b)에 비해 훨씬 더 적거나 검출불가능하다.

특정 측면들에서, 제1 뉴클레오티드가 SERS를 이용하여 처음으로 검출된 후에, 부가적 제1 뉴클레오티드는 주형 핵산 분자와 접촉된다. 이는 예를 들어 표적 핵산 분자를 제1 반응 혼합물과 동일한 제2 반응 혼합물과 접촉시켜, 제2 반응후 혼합물을 형성함으로써 달성된다. 이어서, 제2 반응후 혼합물, 또는 제2 반응후 혼합물로부터 단리된 퓨린 또는 피리미딘 염기는 SERS 기재 상에 침착되어, SERS을 이용하여 검출된다.

연속적 표적 위치에서의 동일한 뉴클레오티드의 검출은 주형 핵산 분자를 제1 뉴클레오티드의 부가적 분자와 접촉시킴으로써 촉진된다. 예를 들어, 주형 핵산 분자는 제1 뉴클레오티드의 대략 동일한 수의 복사체와 접촉될 수 있고, 반응후 혼합물은 침착되어, SERS을 이용하여 검출될 수 있다. 이어서, 주형 핵산 분자는 제2 반응 혼합물에서 제1 뉴클레오티드의 부가적 복사체로 검출되어, 제2 반응후 혼합물 생성물을 형성할 수 있다. 이어서, 제2 반응 혼합물은 SERS 기재 상에 침착되고, 제1 뉴클레오티드는 다시 SERS을 이용하여 검출된다. 예상 SERS 신호 대비 SERS 신호의 감도의 감소는, 주형 핵산 분자가 연속적 표적 위치에서 동일한 뉴클레오티드를 포함함을 가리킨다. 이 예에서, 반응 혼합물 중의 제1 뉴클레오티드의 절대 농도를 결정할 필요 없이, 라만 신호 강도에 기초한 상대 농도로 충분하다. 이 측면들의 각종 변형들이 구상될 수 있다. 표적 핵산 분자를 부가적 뉴클레오티드와 접촉시키는 것은 또한 폴리머라제에 의해 합성된 주형 가닥에 대한 모든 복사체에 상보적인 가닥이 혼입되었음을 확실히 하는데 도움이 된다.

본 발명의 이 실시양태의 특정 측면들에서, 제1 뉴클레오티드는 SECARS (즉, SERS 기재 상에 제1 뉴클레오티드를 침착시킨 후, 가간섭성 반스토크스 라만 분광법(CARS))을 이용하여 검출된다. 상기 나타낸 바와 같이, 특정 측면들에서 SECARS는 본원에 제공된 방법에서 검출 방법으로 사용된다.

특정 예들에서, 라만 표지는 본원에 더 상세하게 논의되는 바와 같이 각 뉴클레오티드에 결합되어, 뉴클레오티드의 라만 신호를 증강시킨다. 라만 표지는 뉴클레오티드의 모두에 결합될 수 있거나, 라만 표지가, 예를 들어, 피리미딘 뉴클레오티드에만 결합될 수 있다. 본 발명의 이 측면들은, 특정 조건 하에서 퓨린 분자보다 더욱 많은 피리미딘 분자가 검출 한도에 도달할 것이 요구됨을 가리키는 본원의 실시예에 제공된 데이터에 관한 것이다. 특정 측면들에서, 라만 표지는 형광체이다.

다른 한 실시양태에서, 반응실에서 검출가능한 수의 주형 핵산 분자를 반응 혼합물과 접촉시키고, 인큐베이션하여, 프라이머가 주형 핵산과 결합하도록 하여 반응후 혼합물을 형성하고, 이를 SERS 기재 상에 침착시키고, 반응후 혼합물 내의 제1 뉴클레오티드를 SERS를 이용하여 검출하는 것을 포함하는, 주형 핵산 분자, 전형적으로는 단일 가닥의 핵산 분자의 표적 위치에서의 뉴클레오티드 존재를 결정하는 방법이 제공된다. 반응후 혼합물 내의 라만 신호의 강도의 감소는 연장 반응 생성물을 확인하고, 이로써 표적 위치에서의 뉴클레오티드 존재를 확인시킨다. 특정 측면들에서, 라만 신호를 증강시키기 위해, 반응후 혼합물로부터 라만 신호를 발생시키기 전에 제1 뉴클레오티드의 절단 생성물을 표면 증강 라만 분광법(SERS) 표면 상에 침착시킨다.

반응 혼합물은 프라이머, 폴리머라제, 및 초기 농도의 제1 뉴클레오티드, 전형적으로는 데옥시뉴클레오티드 삼인산염(dNTP)을 포함한다. 프라이머 또는 주형 핵산은 전형적으로 반응실의 표면에 고정된다.

특정 측면들에서, 뉴클레오티드 존재가 확인될 때까지, 상이한 뉴클레오티드를 이용하여 방법을 반복한다. 예를 들어, dATP는 제1 뉴클레오티드일 수 있고, 방법의 후속 사이클은 예를 들어 dGTP, dCTP 및 dTTP를 각기 이용하여 수행될 수 있다. 이 측면들에서, 기재는 전형적으로 그것이 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 뉴클레오티드와 접촉되기 전에 세척된다. 임의로, 일단 dNTP이 초기 가닥에 혼입되면, 혼입된 dNTP의 부가적 복사체가 예를 들어 주형 핵산 분자에 도입되어, 본원에서 논의되는 바와 같이 뉴클레오티드 반복체를 검출할 수 있다. 이어서, 예를 들어 전체 주형 핵산 분자가 시퀀싱될 때까지, 주형 핵산 분자의 부가적 표적 뉴클레오티드에서의 부가적 뉴클레오티드 존재를 확인하기 위해 방법을 임의로 반복한다.

본원에 개시된 바와 같이, 검정의 감도를 증가시키기 위해 SECARS가 사용될 수 있다. 다른 측면들에서, 퓨린 및 피리미딘 염기는 염기가 SERS 또는 SECARS에 의해 검출되기 전에 뉴클레오티드의 당 부분으로부터 분리된다.

특정 측면들에서, 뉴클레오티드가 반응 혼합물에 포함되기 전, 또는 뉴클레오티드가 주형 핵산 분자의 부재 하에 반응 혼합물에 포함된 후, 초기 반응전 농도의 뉴클레오티드의 샘플을 SERS 기재 상에 침착시키고, SERS를 이용하여 검출한다. 반응전 농도로부터의 결정된 SERS 스펙트럼의 강도를 반응후 농도와 비교한다. 반응후 농도와 반응전 농도 사이의 강도의 통계적으로 유의한 감소로 연장 반응 생성물을 확인하고, 이로써 표적 위치에서의 뉴클레오티드 존재를 확인한다. 본 발명의 이 측면은 뉴클레오티드, 전형적으로 dNTP의 농도가 알려져 있고 잘 조절되는 경우에는 생략될 수 있다.

대안적으로, dNTP 및 내부 대조군 분자의 혼합물이 반응 혼합물 내에 제공된다. 인큐베이션 후에, dNTP 및 내부 대조군 모두의 SERS 스펙트럼이 검출될 수 있다. dNTP 및 내부 대조군의 상대 강도를 측정하여 dNTP의 반응후 농도를 결정할 수 있다. 내부 대조군 분자는 뉴클레오티드 존재를 결정하는 방법에 사용되지 않는 상이한 유형의 뉴클레오티드일 수 있다. 그러한 내부 대조군의 예에는 예를 들어 8-브로모아데닌 이인산염(알트코프(Altcorp)(미국 켄터키주 렉싱톤 소재))이 포함된다. 변형된 염기를 가지고, 이로써 상이한 신호를 가지는 다른 뉴클레오티드도 또한 사용될 수 있다(예를 들어, 글렌 리서치(Glen Research)(미국 버지니아주 스터링 소재). 그러한 화합물은 연장 생성물에 혼입되고, 상이한 라만 스펙트럼을 가질 수 없다. 신호는 인산염의 제거에 의해 증강될 수 있고, 이에 따라 변형된 염기는 방법의 모든 단계들에서 내부 대조군으로 사용될 수 있다.

본 발명의 이 측면들의 방법에서, 반응후 생성물의 형성을 위한 인큐베이션 시간은 주형 핵산이 반응 혼합물 성분에 의해 접촉되도록 하기에 충분하다. 반응 혼합물 성분이 주형 핵산과 접촉하는 속도, 및 이에 따른 최소의 인큐베이션 시간은 수많은 인자들에 의해 영향을 받는다. 이 인자들에는 주형 핵산의 농도, 프라이머 및 뉴클레오티드의 농도, 반응물의 반응실을 통한 이동 속도, 및 반응실의 크기 및 모양이 포함된다. 이 인자들은 모두 인큐베이션 시간이 주형 핵산 분자가 반응 성분과 접촉하도록 하기에 충분하다고 가정하도록 변경될 수 있다.

상기 논의된 인자들에 의존하는 반응 생성물의 형성을 위한 인큐베이션 시간은 1 밀리초 내지 1 시간의 범위일 수 있고, 전형적으로는 100 밀리초 내지 10 분의 범위 내이다. 예를 들어, 특정 측면들에서 인큐베이션 시간은 100 밀리초; 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 45 또는 60 초; 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 분이다.

주형 핵산 복사체의 수는 1개 내지 100,000개의 범위 내이다. 단지 아데노신 및 구아노신 부분만이 검출되는 본발명의 측면들에서, 주형 복사체는 1개 내지 10,000개의 범위 내일 수 있다. 본 발명의 특정 측면들에서, 주형 핵산의 각 가닥과 별도로 반응을 수행함으로써 단지 아데노신 및 구아노신 뉴클레오티드만을 이용하여 방법을 수행한다. 이 측면들에서, 단지 퓨린 함유의 뉴클레오티드가 사용되나, 양 가닥이 분석되기 때문에, 주형 위치에서의 임의의 뉴클레오티드 존재가 검출될 수 있다.

방법에 사용되는 뉴클레오티드가 퓨린 및 피리미딘을 포함하는 실시양태들, 예를 들어 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP가 사용되거나, 단지 피리미딘만이 포함되는 실시양태들에는, 주형 핵산 분자의 적어도 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 75,000 또는 100,000개 복사체가 전형적으로 사용된다. 특정 측면들에서, 검출의 감도를 증가시키기 위해 SERS 및 CARS를 사용하여 피리미딘 뉴클레오티드를 검출한다.

상기 나타낸 바와 같이, 주형 핵산 분자가 반응 혼합물 성분과 접촉하기 위해 필요한 인큐베이션 시간은 반응물이 반응실을 통과하여 이동하는 속도에 의해 영향을 받는다. 각종 힘들을 사용하여, 본원에 나타낸 바와 같이 반응물을 반응실에서 이동시킬 수 있다. 예를 들어, 수력학, 열 또는 전기 힘을 사용할 수 있다. 또한, 압력 또는 진공을 사용하여, 반응물을 반응실을 통과하여 이동시킬 수 있다.

상기 나타낸 바와 같이, 주형 핵산 분자가 반응 혼합물 성분과 접촉하기 위해 필요한 시간은 반응실의 모양 및 크기에 의해 영향을 받는다. 본원에 나타낸 바와 같이 사용되어 주형 핵산 분자를 분류하고 단리할 수 있는 마이크로유체상 및 나노유체상은, 주형 핵산 분자의 표적 위치에서의 뉴클레오티드 존재를 결정하기 위한 방법을 포함한, 본원에 개시된 각종 실시양태들의 방법에 사용된다. 이 실시양태들에서, 1차원 이상이 7 나노미터 내지 100 밀리미터의 범위 내이다. 일반적으로, 이 실시양태들은 보다 큰 반응실에 비해 필요한 인큐베이션 시간을 감소시킨다. 특정 측면들에서, 반응실은 1차원 이상에서, 예를 들어 50 nm, 25 nm, 20 nm, 15 nm, 10 nm, 9 nm, 8 nm 또는 7 nm를 포함한, 100 나노미터 이하이다.

본 발명의 다른 한 측면들에서, 단지 퓨린 잔기만을 사용하여 방법을 수행한다. 이 방법은 본원의 실시예에서 설명되는 바와 같이 특정 조건 하에서의 퓨린 잔기가 피리미딘 잔기보다 높은 감도로 검출될 수 있다는 관찰에 기초한다. 본 발명의 이 측면에서 방법은 제1 뉴클레오티드 및 제2 뉴클레오티드로서 ATP 및 dGTP를 동시에 이용하여, 표적 뉴클레오티드 위치에 대해 두 번 수행된다. 이어서, 방법은, 제2 반응실에서 고정된 주형 핵산 분자의 상보적 가닥을 이용하고, 다시 제1 뉴클레오티드 및 제2 뉴클레오티드로서 dATP 및 dGTP를 동시에 이용하여 반복된다. 이 실시양태에 따라, 단지 퓨린 뉴클레오티드만을 이용하여, 표적 위치의 임의의 뉴클레오티드 존재가 결정될 수 있다.

도 10에 도시된 바와 같이, 본원에 제공된 방법은 핵산 시퀀싱을 위한 장치, 예를 들어 마이크로유체상 장치(300), 예컨대 그 자체가 본 발명의 다른 한 실시양태를 형성하는 마이크로유체상 칩에서 다중 분석으로서 수행될 수 있다. 마이크로유체상 칩은, 전형적으로 폴리머라제 저장소(150), 완충액 저장소(160), 일련의 dNTP 저장소들(110), (120), (130), (140), (150), (160), 및 임의로 프라이머 또는 주형 핵산 분자 저장소(155)를 포함하는 일련의 시약 저장소들을 포함한다. 일부 예들에서, 프라이머 및/또는 주형 핵산 분자는 칩 상에 포함될 수 있다. 장치는 일련의 시약 저장소들과 유체 소통하는 혼합실(180)을 더 포함하고, 여기서 일련의 시약 저장소들로부터의 시약들을 혼합실(180)에서 혼합하여, 반응 혼합물을 형성한다. 또한, 장치는 고정된 주형 핵산 또는 고정된 프라이머를 포함하는 하나 이상의 반응실(190)을 포함한다. 하나 이상의 반응실(190)은 혼합실(180)과 유체 소통한다. 특정 측면들에서 하나 이상의 반응실(190)은 1차원 이상에서 100 나노미터 미만이고/이거나, 일련의 dTNP 저장소(110), (120), (130), (140), (150), 및 (160)은 퓨린 dNTP 저장소(110) 및 (120)만을 포함한다. 장치는 추가 측면들에서, dNTP 저장소 (110), (120), (130), (140), (150), (160) 및 혼합실(180) 사이; 프라이머 또는 주형 핵산 분자 저장소(155) 및 반응실(190), 및/또는 혼합실(180)과 반응실(190) 사이에 유동을 조절하기 위한 밸브들(210)의 집단을 포함한다.

도 10에 도시된 장치에서 수행되는 본 발명의 방법은 인큐베이션실이라고도 칭하는 반응실(190)에서 검출가능한 수의 주형 핵산 분자를 반응 혼합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 반응 혼합물의 성분들은 임의적 프라이머 저장소, 폴리머라제 저장소(150), 및 완충액 저장소(160)를 포함한 일련의 저장소, 및 dATP 저장소(110), dGTP 저장소(120), dCTP 저장소(130) 및 dTTP 저장소(140)를 포함한 일련의 데옥시뉴클레오티드(dNTP) 저장소에 포함된다. 반응 혼합물 성분의 유동은 일련의 밸브들(210)에 의해 조절된다. 4가지 dNTP 중 하나를 포함하는 반응 혼합물 성분은 혼합실(180)로 이동하고, 여기로부터 그것은 일련의 반응실들(190) 중 하나로 흘러들어간다. 각 반응실은 반응실 표면 상에 고정된 상이한 단일 가닥의 주형 핵산 분자의 다중 복사체를 포함할 수 있다. 상기 논의된 바와 같은 반응실은 마이크로- 또는 나노-크기의 실, 예를 들어 1차원 이상에서 100 nm 이하인 실일 수 있다. 잔여 용액실은 SERS 기재 및 LiCl 용액(도시되지 않음)을 위한 공급 라인을 가질 수 있다. 대안적으로, 용액이 폐기물 라인(도시되지 않음)으로 들어가기 전에 검출실이 있을 수 있다. 검출실에서, 각 잔여 용액실로부터의 잔여 용액은 SERS 기재 및 LiCl 용액과 순차적으로 혼합되어 흐르고, 레이저 기기에 의해 검출된다. 과량의 용액은 잔여 용액실(200)에서 포획되어, 폐기물 라인(170)을 통해 인도될 수 있다. 도 11은 dNTP 저장소(110), (120), (130) 및 (140)(도시되지 않음) 및 폴리머라제 저장소(150)를 포함한 저장소로부터의 시약이 일련의 밸브들(210)을 통해 흘러, 혼합실(180)에 첨가되기 전에 완충액 저장소(160)로부터의 완충액과 혼합되는, 혼합실(180)에 대한 대안적 설계를 도시한다. 특정 측면들에서, dNTP는 별도로 혼합실에서 폴리머라제와 혼합된다.

본 발명의 다른 측면들에서, dNTP 저장소는 단지 퓨린 뉴클레오티드 삼인산염, 예를 들어 dGTP 및 dATP만을 포함한다. 본 발명의 마이크로유체상 칩의 이 측면들은, 본원에서 논의되는 바와 같이, 단지 퓨린 잔기만을 사용하여 뉴클레오티드 존재를 검출하는 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있다.

다른 한 측면들에서, 장치의 반응실은 표면 증강 라만 분광법(SERS) 기재를 포함하는 SERS 실과 유체 통과한다. 또한, 장치는 SERS 실 기재와 광학적으로 및/또는 작용적으로 소통되는 라만 광원 및 라만 분광계를 포함하는 검출 시스템의 일부일 수 있다. 특정 측면들에서, 라만 광원 및 라만 분광계는 CARS 분석을 위해 설계될 수 있다. CARS 분석을 위해 설계된 라만 광원 및 라만 분광계가 당 기술분야에 공지되어 있다.

광원은 전형적으로 당 기술분야에 공지되어 있고 본원에서 더욱 상세하게 논의되는레이저 광이다. 광원으로부터의 빛은 SERS 기재에 투사되어, SERS 분광계 내의 검출 유니트는 반응후 생성물, 예컨대 dNTP 또는 이의 절단 생성물, 예컨대 유리 퓨린 또는 피리미딘 염기로부터 라만 신호를 검출한다. 본 발명의 특정 측면들에서, 라만 검출 유니트는 단일 분자 수준에서 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 염기, 예컨대 아데노신을 검출할 수 있다. 또한, 특정 측면들에서, 뉴클레오티드는 반응실에서 SERS 실을 형성하는 채널로 흘러들어간다. 채널의 내부 표면은 은, 금, 백금, 구리 또는 알루미늄 메쉬를 포함할 수 있다.

다른 한 실시양태에서, 하나 이상의 주형 핵산 분자를 프라이머, 뉴클레오티드 및 폴리머라제와 접촉시켜 반응 혼합물을 형성하고, 뉴클레오티드로부터 하나 이상의 상보적 가닥을 합성하며, 라만 분광법을 이용하여 뉴클레오티드를 검출하는 것을 포함하는 핵산의 시퀀싱 방법으로서, 상보적 가닥의 합성 후에 반응 혼합물 중의 뉴클레오티드의 농도의 감소가 뉴클레오티드가 상보적 가닥에 혼입되었음을 나타내는 방법이 제공된다. 주형 핵산의 서열은 상보적 가닥에 혼입된 뉴클레오티드로부터 결정된다.

표적 위치에서의 뉴클레오티드 존재를 결정하기 위한 방법에서, 예를 들어 표적 위치는 다형체, 예컨대 단일 뉴클레오티드 다형체(SNP)의 부위일 수 있다. 다형체는 집단에서 일어나는 대립유전자 변종체이다. 다형체는 한 위치에 존재하는 단일 뉴클레오티드이거나, 하나 또는 수개의 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실일 수 있다. 따라서, 단일 뉴클레오티드 다형체(SNP)는 인간 게놈과 같은 게놈에서의 한 특별한 위치에서의 1개 또는 2개, 3개 또는 4개 뉴클레오티드 존재(즉, 아데노신, 시토신, 구아노신 또는 티미딘)의 집단 내에서의 존재를 그 특징으로 한다. 본원에 나와 있는 바와 같이, 특정 측면들에서 본 발명의 방법은 포유동물과 같은 이배체 유기체에 대한 SNP 위치에서의 뉴클레오티드 존재의 검출 또는 SNP 위치에서의 양 게놈 뉴클레오티드 존재의 검출을 제공한다. 또한, 단일 반응에서 1 이상의 SNP 위치, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 이상의 SNP 위치에서의 뉴클레오티드 존재가 결정될 수 있다. 예를 들어, SNP 위치는 SNP 위치들의 집단일 수 있다.

특정 측면들에서, 뉴클레오티드는 본원에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이 뉴클레오티드 농도가 측정되기 전에, 주형 핵산 분자로부터 분리된다. 또한, 단일 유형의 뉴클레오티드는 특정 예들에서, 한 번에 주형에 노출된다. 대안적으로, 4개 유형 모두의 뉴클레오티드가 동시에 주형에 노출될 수 있다.

특정 예들에서, 라만 표지는 본원에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이 각 뉴클레오티드에 결합되어 뉴클레오티드의 라만 신호를 증강시킨다. 라만 표지는 모든 뉴클레오티드들에 결합될 수 있거나, 라만 표지가 예를 들어 단지 피리미딘 뉴클레오티드에만 결합될 수 있다. 본 발명의 이 측면들은, 특정 조건 하에서 퓨린 분자보다 더욱 많은 피리미딘 분자들이 검출 한계에 도달할 것이 요구됨을 나타내는 본원의 실시예들에서 제공되는 데이터에 관한 것이다.

2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 150, 250, 500, 1000, 2000, 2500, 5000개 뉴클레오티드 또는 전체 주형 핵산의 뉴클레오티드 서열이 결정될 때까지 방법이 반복될 수 있다. 특정 측면들에서, 방법은 상기 개시된 접촉, 인큐베이션 및 검출 단계들을 임의로 반복하기 전에 기재를 세척하는 것을 포함한다. 특정 측면들에서, 주형 핵산의 하나 이상의 집단은 기재 상에 고정된다. 핵산 분자의 다음 위치에 있는 모든 초기 핵산 분자들 내의 상보적 뉴클레오티드가 부가되었음을 확실히 하기 위해, 하나 이상의 핵산 분자가 3' 뉴클레오티드의 부가적 복사체와 접촉될 수 있다.

특정 측면들에서, 기재 상에 고정된 핵산의 양이 결정되고, 반응 혼합물 내에 포함된 제1 뉴클레오티드의 수가 결정된다. 상기 논의된 바와 같이, 이 결정을 사용하여 뉴클레오티드 반복체를 검출할 수 있다.

본원에서 논의되는 바와 같이, 본 발명의 특정 측면들에서, 표면 증강 라만 분광법(SERS)을 이용하여 제1 뉴클레오티드의 측정에 기초하여, 제1 뉴클레오티드의 반응후 농도가 결정된다. 또한 특정 측면들에서, 뉴클레오티드는 주형 핵산과 접촉하기 전에 반응 혼합물에서 검출된다. 주형 핵산 분자와 접촉하기 전 및 후의 반응 혼합물의 SERS 스펙트럼은 본 발명의 특정 측면들에서 사용되어, 뉴클레오티드가 초기 가닥에 혼입되었는지의 여부를 결정한다. 이 측면들에서, 반응후 혼합물 내의 뉴클레오티드의 라만 신호를 주형 핵산과 접촉하기 전의 반응 혼합물 내의 뉴클레오티드의 라만 신호와 비교함으로써, 제1 뉴클레오티드의 반응후 농도가 결정된다.

특정 측면들에서, 반응 혼합물은 본원에서 논의되는 바와 같이 내부 대조군 분자를 포함한다. 내부 대조군 분자는 제1 뉴클레오티드에 의해 발생되는 라만 신호와 검출가능하게 구분될 수 있는 라만 신호를 발생시킨다. 내부 대조군을 이용하는 본 발명의 측면들에서, 반응후 혼합물 내의 뉴클레오티드의 라만 신호를 내부 대조군 분자의 라만 신호와 비교함으로써 제1 뉴클레오티드의 반응후 농도가 결정된다.

다른 한 측면들에서, 고정화 표면에 고정된 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 반응실, 반응실과 유체 소통하는 채널, 및 채널에 작용적으로 결합된 라만 검출 유니트를 포함하는 장치가 제공된다. 본 발명의 특정 측면들에서, 라만 검출 유니트는 단일 분자 수준에서 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 염기, 예컨대 dAMP 또는 아데닌을 검출할 수 있다. 또한, 특정 측면들에서, 뉴클레오티드는 반응실에서 채널로 흘러 들어간다. 장치에, 특정 예들에서는 채널 내의 은, 금, 백금, 구리 또는 알루미늄 메쉬가 포함된다.

하나 이상의 주형 핵산 분자를 뉴클레오티드 및 폴리머라제와 접촉시켜 반응 혼합물을 형성하고, 뉴클레오티드로부터 하나 이상의 상보적 가닥을 합성하는 것을 포함하는 핵산의 시퀀싱 방법으로서, 뉴클레오티드의 농도가 이어서 라만 분광법에 의해 측정되는 방법이 제공된다. 상보적 가닥의 합성 후의 반응 혼합물 내의 뉴클레오티드의 농도의 감소는 뉴클레오티드가 상보적 가닥에 혼입되었음을 가리킨다. 주형 핵산의 서열은 상보적 가닥에 혼입된 뉴클레오티드로부터 결정된다.

특정 측면들에서, 뉴클레오티드는 본원에서 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 뉴클레오티드 농도가 결정되기 전에 주형 핵산 분자로부터 분리된다. 또한, 단일 유형의 뉴클레오티드가 한 번에 주형에 노출될 수 있다. 대안적으로, 4개 유형 모두의 뉴클레오티드들이 한번에 주형에 노출될 수 있다.

다른 한 실시양태에서, 고정화 표면에 결합된 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 반응실, 반응실과 유체 소통하는 채널, 및 채널과 작용적으로 결합된 라만 검출 유니트를 포함하는 장치가 제공된다. 특정 측면들에서, 라만 검출 유니트는 단일 분자 수준에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 검출할 수 있다. 또한, 특정 측면들에서, 뉴클레오티드는 반응실에서, 은, 금, 백금, 구리 또는 알루미늄 SERS 기재를 포함할 수 있는 채널로 흘러 들어간다.

다른 한 실시양태에서, 하나 이상의 주형 핵산을 프라이머, 폴리머라제 및 초기 농도의 제1 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물과 접촉시키고, 라만 분광법을 이용하여 반응후 혼합물 내의 제1 뉴클레오티드의 농도를 결정하는 것을 포함하는 하나 이상의 주형 핵산의 뉴클레오티드 서열의 결정 방법으로서, 제1 뉴클레오티드의 반응후 농도의 감소가 뉴클레오티드가 하나 이상의 초기 핵산 분자의 3' 말단에 첨가되었음을 가리키는 방법이 제공된다. 전형적으로, 주형 핵산 또는 프라이머는 고체 지지체 상에 고정되고, 한편 주형 핵산은 반응 혼합물 내에 인큐베이션되어, 반응후 혼합물, 및 주형 핵산의 적어도 일부분에 상보적인 하나 이상의 초기 핵산 분자를 형성한다. 상기 방법은 하나 이상의 초기 핵산 분자의 3' 뉴클레오티드가 동정되고, 이로써 하나 이상의 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열이 결정될 때까지, 다른 뉴클레오티드로 임의로 반복된다.

특정 측면들에서, 뉴클레오티드는 라만 분광법에 의해 검출되기 전에 라만 표지, 예를 들어 형광체 또는 나노입자에 결합된다. 예를 들어, 표면 증강 라만 분광법(SERS)을 이용하여 라만 분광법이 수행될 수 있다.

주형 분자는 특정 측면들에서, 본원에 개시된 방법에 의해 검출되기 전에, 생물학적 샘플로부터 단리된다. 생물학적 샘플은 예를 들어 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 대변, 침, 뇌척수액, 눈물, 점액 등이다.

다른 한 실시양태에서, 주형 핵산을 프라이머, 폴리머라제 및 초기 농도의 제1 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물과 접촉시켜 반응후 혼합물을 형성하고(여기서, 프라이머의 3' 뉴클레오티드는 표적 뉴클레오티드 위치에 인접한 주형 핵산에 결합함), 라만 분광법을 이용하여 반응후 혼합물 내의 제1 뉴클레오티드의 농도를 결정함(여기서, 제1 뉴클레오티드의 반응후 농도의 감소는 연장 반응 생성물을 확인시키고, 뉴클레오티드가 표적 위치에서의 뉴클레오티드에 대해 상보적임을 가리킴)으로써, 표적 위치에서 뉴클레오티드 존재를 확인하는 것을 포함하는, 주형 핵산 분자의 표적 위치에서의 뉴클레오티드 존재의 결정 방법이 제공된다. 전형적으로, 표적 핵산 분자 또는 프라이머는 기재 상에 고정된다. 방법은 뉴클레오티드 존재가 확인될 때까지 다른 뉴클레오티드로 임의로 반복된다.

다른 한 실시양태에서, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기가 금속성 나노입자, 금속 코팅된 나노구조를 포함하는 기재, 또는 알루미늄을 포함하는 기재 상에 침착시킨 후, 침착된 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기를 레이저 빔으로 조사하고, 생성된 라만 산란을 검출하는 것을 포함하는, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기의 검출 방법이 제공된다. 검출 방법은 예를 들어 본원에 개시된 핵산의 시퀀싱 방법에 유용하다.

뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기는 특정 예들에서 직경이 약 5 내지 200 nm인 하나 이상의 은 나노입자 상에 침착된다. 예를 들어, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기는 은 나노입자 상에 침착된다. 이 측면들에서, 예를 들어 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기는 알칼리-금속 할로겐화물 염 및 은 나노입자와 접촉될 수 있다. 알칼리-금속 할로겐화물 염은, 예를 들어 염화리튬이다. 이 측면들에서, 예를 들어 염화리튬은 약 50 내지 약 150 마이크로몰, 약 80 내지 약 100 마이크로몰, 또는 약 90 마이크로몰의 농도로 사용될 수 있다.

뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기는 특정 측면들에서 아데닌을 포함하고, 특정 예들에서는 아데닌의 단일 분자가 검출된다. 염기는 특정 예들에서 라만 표지와 연합될 수 있다.

다른 한 실시양태에서, 하나 이상의 주형 핵산 분자를 수득하고, 뉴클레오티드 및 폴리머라제를 주형에 제공하여, 뉴클레오티드를 이용하여 하나 이상의 상보적 가닥이 합성되도록 하고, 라만 분광법을 이용하여 뉴클레오티드의 농도를 측정하는 것을 포함하는 핵산의 시퀀싱 방법이 제공하다. 주형 핵산의 서열은 상보적 가닥에 혼입된 뉴클레오티드로부터 결정된다.

다른 한 실시양태에서, 고정화 표면에 결합된 단일 주형 핵산 분자 또는 프라이머를 포함하는 반응실; 반응실과 유체 소통하는 채널; 및 채널에 작용적으로 결합된 라만 검출 유니트를 포함하는 장치가 제공된다.

본원에 제공된 방법을 이용하는 서열 정보는, 단일 핵산 분자를 이용하여 단일 시퀀싱 운용 과정 중에 수득될 수 있다. 대안적으로, 핵산 서열을 확인하거나 완전한 서열 데이터를 수득하기 위해, 핵산 분자의 다중 복사체들을 병행적으로 또는 평행하게 시퀀싱할 수 있다. 다른 대안들에서, 서열 정보의 정확성을 확인하기 위해, 핵산 분자 및 그것의 상보적 가닥 모두를 시퀀싱할 수 있다. 시퀀싱되는 핵산은 DNA일 수 있으나, RNA 또는 합성 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 다른 핵산도 또한 시퀀싱될 수 있다.

시퀀싱되는 핵산은 표면에 공유 또는 비공유적으로 결합될 수 있다. 대안적으로, 시퀀싱되는 핵산은 비결합 방법, 예컨대 광학 포획에 의해 위치가 제한될 수 있다(예컨대, [Goodwin 등, 1996, Acc. Chem. Res. 29:607-619; U.S. 특허 No. 4,962,037; 5,405,747; 5,776,674; 6,136,543; 6,225,068]를 참고한다). 핵산의 결합 또는 기타 위치 결정은 핵산으로부터의 배경 신호 없이 라만 분광법에 의해 뉴클레오티드가 검출되도록 한다. 예를 들어, 뉴클레오티드의 연속적 또는 불연속적 유동이 핵산 합성을 위해 제공될 수 있다. 뉴클레오티드의 농도는 합성 반응의 상류 또는 하류에서 결정될 수 있다. 뉴클레오티드 농도의 차이는 새로 합성된 상보적 핵산 가닥에 혼입된 뉴클레오티드를 나타낸다. 대안적으로, 핵산 주형, 프라이머 및 폴리머라제는 반응실의 하위구획에 제한될 수 있다. 핵산, 폴리머라제 및 프라이머로부터의 배경 신호 없이, 반응실의 다른 부분에서의 뉴클레오티드 농도를 검출하기 위해 라만 검출기가 배치될 수 있다. 뉴클레오티드는 수동 확산 또는 활성 혼합 공정에 의해 반응실의 상이한 부분들 사이에 평형화를 이루게 될 수 있다.

하기 발명의 상세한 설명은 청구된 방법 및 장치를 보다 잘 이해시키기 위해 수많은 특정 상세 사항들을 포함한다. 그러나, 장치 및/또는 방법은 이 특정 상세 사항없이 수행될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 다른 예들에서, 당 기술분야에 공지된 그 장치, 방법, 절차 및 개별 성분은 본원의 상세한 설명에 기재되지 않았다.

도 1은 반응실(11) 및 라만 검출 유니트(12)를 포함하는 핵산 시퀀싱을 위한 장치(10)의 한 비제한적 예를 도시한다. 반응실(11)은 폴리머라제(15), 예컨대 DNA 폴리머라제와 함께 고정화 표면(14)에 결합된 핵산(주형) 분자(13)를 포함한다. 주형 분자(13)의 서열에서 상보적인 프라이머 분자(16)는 주형 분자(13)에 혼성화되게 된다. 뉴클레오티드(17)는 반응실(11) 내의 용액에 존재한다. 초기 DNA 가닥(16)의 합성을 위해, 뉴클레오티드(17)는 데옥시아데노신-5'-삼인산염(dATP), 데옥시구아노신-5'-삼인산염(dGTP), 데옥시시토신-5'-삼인산염(dCTP) 및/또는데옥시티미딘-5'-삼인산염(dTTP)을 포함할 수 있다. 4개 뉴클레오티드(17)의 각각은 용액 내에 동시에 존재할 수 있다. 대안적으로, 상이한 유형의 뉴클레오티드들(17)이 반응실(11)에 순차적으로 첨가될 수 있다. 또한, 특히 초기 가닥이 RNA 분자인 경우에, 다른 뉴클레오티드, 예컨대 유리딘-5'-삼인산염(UTP)이 이용될 수 있다. 비천연 뉴클레오티드, 예컨대 종래 핵산 시퀀싱에 사용된 것도 또한 사용될 수 있다. 이에는, 표준 시퀀싱 또는 표지화 반응에 의해 사용된, 4개 형광 염료-표지된 뉴클레오티드(예컨대, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, TAMRA, R6G(예를 들어, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)(미국 캘리포니아주 포스터시티 소재); 또는 NEN 라이프 사이언스 프로덕츠(NEN Life Science Products)(미국 메사츄세츠주 보스톤 소재)로부터 입수가능함)가 포함된다. 이 염료는 SERS 또는 SECARS에 의해 검출될 수 있다.

시퀀싱 반응을 개시하기 위해, 폴리머라제(15)는 프라이머(16)의 3' 말단에 한 번에 하나의 뉴클레오티드 분자(17)를 부가하여, 프라이머 분자(16)를 신장시킨다. 프라이머 분자(16)가 연장되면, 그것을 초기 가닥(16)이라 한다. 각 회의 신장 라운드에 대해, 단일 뉴클레오티드(17)가 초기 가닥(16)에 혼입된다. 뉴클레오티드(17)의 혼입은 주형 가닥(13)과의 와트슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍 상호작용에 의해 결정되기 때문에, 성장하는 초기 가닥(16)의 서열은 주형 가닥(13)의 서열에 대해 상보적일 것이다. 와트슨-크릭 염기 쌍 결합에서, 한 가닥에 있는 아데노신(A) 잔기는 다른 한 가닥에 있는 티미딘(T) 잔기와 짝을 이룬다. 마찬가지로, 한 가닥에 있는 구아노신(G) 잔기는 다른 한 가닥에 있는 시토신(C) 잔기와 짝을 이룬다. 이에 따라, 주형 가닥(13)의 서열은 초기 가닥(16)의 서열로부터 결정될 수 있다.

도 1은 단일 핵산 분자(13)가 반응실(11)에 포함되는 방법 및 장치(10)를 도시한다. 대안적으로, 동일한 서열의 2개 이상의 주형 핵산 분자(13)가 단일 반응실(11)에 존재할 수 있다. 1 이상의 주형 핵산(13)이 반응실(11)에 존재할 경우, 라만 방출 신호는 반응실(11)에서 모든 초기 가닥(16)들에 혼입된 뉴클레오티드(17)의 평균을 반영할 것이다. 당업자는 공지의 데이터 분석 기법을 이용하여, 반응실(11)에서 일어나는 대부분의 반응 후에 지체되거나 그 전에 일어나는 합성 반응을 위한 소정의 임의 시간에 수득되는 신호를 수정할 수 있을 것이다.

도 1에 도시된 비제한적 예는 주형 가닥(13), 프라이머(16) 및 폴리머라제(15)로서 동일한 반응실(11)에서 라만 분광법에 의해 검출되는 뉴클레오티드(17)를 보여준다. 간섭 라만 신호를 감소시키기 위해, 반응실(11) 및 검출 유니트(12)가 단지 뉴클레오티드(17)만이 여기되고 검출되도록 배치될 수 있다. 예를 들어, 반응실(11)은 저분자량 컷오프 필터를 이용하거나, 광학 포획에 의하거나, 당 기술분야에 공지된 다른 방법에 의해, 표면(14)에 고정시킴으로써 반응실(11)의 한 부분에 한정된 주형(13), 프라이머(16) 및 폴리머라제(15)와 함께 2 부분으로 분할될 수 있다. (예컨대, [Goodwin 등, 1996, Acc. Chem. Res. 29: 607-619; U.S. 특허 No. 4,962,037; 5,405,747; 5,776,674; 6,136,543; 6,225,068]을 참고한다) 검출 유니트(12)는 반응실(11)의 제2 부분에 있는 뉴클레오티드(17)만이 여기되어 라만 신호를 방출하도록 배치될 수 있다. 대안적으로, 반응실(11)은 유동 통과(flow-through) 시스템, 예컨대 마이크로유체상 채널, 마이크로모세관 또는 나노채널에 결합될 수 있다. 뉴클레오티드(17)는 반응실(11)에 들어가, 초기 가닥(16)에 혼입될 수 있다. 잔여 비혼입된 뉴클레오티드(17)는 반응실(11)에서 나와 제2 채널로 들어갈 수 있고, 거기에서 라만 분광법에 의해 검출된다. 주형(13), 프라이머(16) 및 폴리머라제(15)는 결합, 필터 사용, 광학 포획 또는 기타 공지 방법에 의해 반응실(11)에 한정될 수 있다. 뉴클레오티드(17)가 주형(13), 프라이머(16) 및 폴리머라제(15)로부터 분리된 구획에서 검출되기 때문에, 간섭 라만 신호가 최소화된다. 초기 가닥(16)에 혼입된 뉴클레오티드(17)는 반응실(11)로 들어가고 반응실(11)에서 나오는 뉴클레오티드(17)의 농도의 차이에 의해 확인될 수 있다. 그러한 대안에서, 이중 검출 유니트(12)는 반응실(11) 전 및 후에 위치될 수 있다. 대안적으로, 반응실(11)에 들어가는 뉴클레오티드(17)의 농도를 알고 있는 경우, 단일 검출 유니트(12)가 반응실(11)의 하류에 위치하여, 반응실(11)에서 나가는 뉴클레오티드(17) 농도를 측정할 수 있다.

당업자는 사용되는 폴리머라제(15)의 유형에 따라 초기 가닥(16)이 새로 혼입된 염기가 주형 가닥(13)에서의 상응하는 염기와 올바로 수소 결합되어 있지 않은 미스매치 염기의 약간의 퍼센티지를 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.8% 이상, 99.9% 이상의 정확도가 관찰될 수 있다. 특정 폴리머라제(15)는, 주형 가닥(13)과 올바로 염기 쌍을 이루고 있지 않은 새로 혼입된 뉴클레오티드(17)를 제거하는 작용을 하는 에러 보정 활성(이는 또한 3' 엔도뉴클레아제 또는 프루프-리딩 활성이라고도 칭해짐)을 가지는 것으로 알려져 있다. 프루프-리딩 활성이 있거나 없는 폴리머라제(15)가 개시된 방법들에 이용될 수 있다. 가장 낮은 가능한 에러율을 가지는 폴리머라제(15)가 특정 용도들에 대해 사용될 수 있다. 폴리머라제(15) 에러 율이 당 기술분야에 공지되어 있다.

검출 유니트(12)는 여기원(18), 예컨대 레이저 및 라만 분광법 검출기(19)를 포함한다. 여기원(18)은 반응실(11) 또는 채널에 여기 빔(20)을 조사한다. 여기 빔(20)은 뉴클레오티드(17)와 상호작용하여, 전자가 보다 높은 에너지 상태로 여기되도록 한다. 전자가 보다 낮은 에너지 상태로 되돌아갈 때, 그것은 라만 검출기(19)에 의해 검출되는 라만 방출 신호를 방출한다. 4개 유형의 뉴클레오티드(17)의 각각으로부터의 라만 방출 신호는 구별될 수 있기 때문에, 검출 유니트(12)는 반응실(11) 및/또는 채널에서 각 유형의 뉴클레오티드(17)의 양을 측정할 수 있다.

성장하는 초기 가닥(16)으로의 뉴클레오티드(17)의 혼입은 반응실(11)로부터의 뉴클레오티드(17)의 결실을 초래한다. 합성 반응이 계속되도록 하기 위해, 새 뉴클레오티드(17)의 원이 필요할 수 있다. 이 원이 도 1에서 분자 디스펜서(21)로 도시되어 있다. 분자 디스펜서(21)는 시퀀싱 장치(10)의 부분이거나 부분이 아닐 수 있다.

분자 디스펜서(21)는 초기 가닥(16)의 합성 속도로 보정된 동량으로 4개 뉴클레오티드(17)의 각각을 방출하도록 설계될 수 있다. 그러나, 핵산(13)은 A, T, G 및 C 잔기의 균일한 분포를 반드시 나타내지는 않는다. 특히, DNA 분자(13)의 특정 영역들은 DNA(13)가 수득되도록 하는 종, 및 시퀀싱되는 DNA 분자(13)의 특정 영역에 따라, AT가 풍부하거나 GC가 풍부할 수 있다. 각 유형의 뉴클레오티드(17)의 비교적 일정한 농도가 반응실(11)에서 유지되도록, 분자 디스펜서(21)로부터의 뉴클레오티드(17)의 방출이 조절될 수 있다.

데이터는 검출기(19), 예컨대 분광계 또는 단색화장치 어레이로부터 수집되어, 정보 처리 및 조절 시스템에 제공될 수 있다. 정보 처리 및 조절 시스템은 특정 뉴클레오티드(17)와 특정 라민 신호를 연합하는 데이터베이스를 관리할 수 있다. 정보 처리 및 조절 시스템은 검출기(19)에 의해 검출된 신호를 기록할 수 있고, 그 신호를 알려진 뉴클레오티드(17)의 신호와 상관시킬 수 있다. 정보 처리 및 조절 시스템은 또한 주형 분자(13)의 서열을 나타내는 뉴클레오티드(17) 흡착의 기록을 관리할 수 있다. 정보 처리 및 조절 시스템은 또한 당 기술분야에 공지된 표준 절차, 예컨대 배경 신호의 차감을 수행할 수 있다.

초기 가닥(16)이 DNA를 포함하는 경우, 주형 가닥(13)는 RNA 또는 DNA일 수 있다. RNA 주형 가닥(13)으로, 폴리머라제(15)는 역전사효소일 수 있고, 그 효소의 예는 당 기술분야에 공지되어 있다. 주형 가닥(13)이 DNA의 분자인 경우, 폴리머라제(15)가 DNA 폴리머라제일 수 있다.

대안적으로, 초기 가닥(16)은 RNA의 분자일 수 있다. 이는 폴리머라제(15)가 RNA 폴리머라제일 것을 요하며, 이 경우에 프라이머(16)가 필요하지 않다. 그러나, 주형 가닥(13)은 RNA 폴리머라제(15)에 결합하고 RNA 초기 가닥(16)의 전사를 개시하는데 효과적인 프로모터 서열을 포함해야 한다. 프로모터 서열의 정확한 조성은 사용된 RNA 폴리머라제(15)의 유형에 의존한다. 전사가 효율적으로 개시되도록 하는 프로모터 서열의 최적화는 당 기술분야의 통상의 기술 내에 속한다. 방법은 사용된 주형 분자(13)의 유형, 합성된 초기 가닥(16)의 유형, 또는 이용된 폴리머라제(15)의 유형에 대해 제한되지 않는다. 주형 가닥(13)에 대해 서열이 상보적인 핵산 분자(16)의 합성을 지지할 수 있는 사실상 임의의 주형(13) 및 임의의 폴리머라제(15)가 사용될 수 있다.

뉴클레오티드(17)는 라만 표지로 화학적으로 변형될 수 있다. 표지는 각각의 통상의 뉴클레오티드(17)와 구분될 수 있는, 독특하고 매우 시각적인 광학 신호를 가질 수 있다. 표지는 또한 라만 방출 신호의 강도를 증가시키거나, 그와 다른 방식으로 뉴클레오티드(17)에 대한 라만 검출기(19)의 감도 또는 특이성을 증강시키는 작용을 할 수 있다. 라만 분광법을 위해 사용될 수 있는 택 분자의 비제한적 예가 이하게 개시되어 있다. 라만 분광법에서의 표지의 사용은 당 기술분야에 공지되어 있다(예컨대, U.S. 특허 No. 5,306,403 및 6,174,677). 당업자는 라만 표지가 다른 뉴클레오티드(17)에 결합할 때 구분가능한 라만 스펙트럼을 발생시킬 수 있거나, 상이한 표지들이 단지 한 유형의 뉴클레오티드(17)에만 결합하도록 설계될 수 있음을 인식할 것이다.

주형 분자(13)는 표면(14), 예컨대 관능화 유리, 실리콘, PDMS(폴리디메틸 실록산), 은 또는 기타 금속 코팅 표면, 석영, 플라스틱, PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌), PVP(폴리비닐 피롤리돈), 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드, 라텍스, 나일론, 니트로셀룰로스, 유리 비이드, 자기 비이드, 또는 아미노, 카르복실, 티올, 히드록실과 같은 관능기, 또는 디엘스-알더(Diels-Alder) 반응물과 같이 그 표면에 혼입된 당 기술분야에 공지된 임의의 기타 물질에 결합될 수 있다.

관능기는 주형 가닥(13) 및 폴리머라제(15) 사이의 결합 상호작용이 입체 장애 없이 일어날 수 있도록, 가교제에 공유결합될 수 있다. 전형적인 가교결합기에는 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민이 포함된다. 결합은 공유결합 또는 비공유결합일 수 있다. 핵산 분자(13)을 표면(14)에 결합시키는 각종 방법들이 당 기술분야에 공지되어 있고, 이용될 수 있다.

본원에 사용되는 "하나의"는 항목이 1 이상임을 의미한다.

"핵산"은 DNA, RNA, 또는 이의 단일 가닥, 이중 가닥 또는 삼중-가닥, 및 임의의 화학적 변형들을 의미한다. 핵산의 사실상 임의의 변형이 구상된다. "핵산"은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 15,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 75,000, 100,000, 150,000, 200,000, 500,000, 1,000,000, 1,500,000, 2,000,000, 5,000,000개 또는 보다 많은 염기의 길이, 내지 전장 염색체 DNA 분자에 이르는 거의 임의의 길이의 것일 수 있다.

뉴클레오시드는 데옥시리보스, 리보스와 같은 오탄당, 또는 오탄당의 유도체 또는 유사체에 공유결합된 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함하는 분자이다. "뉴클레오티드"는 오탄당에 공유결합된 하나 이상의 인산염기를 더 포함하는 뉴클레오시드를 가리킨다. 폴리머라제에 의해 초기 가닥에 혼입될 수 있는 한, 뉴클레오티드의 구조에 각종 치환들 또는 변형들이 가해질 수 있는 것으로 구상된다. 예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스 부분은 다른 한 오탄당 또는 오탄당 유사체로 치환될 수 있다. 인산염기는 각종 기들, 예컨대 포스포네이트, 술페이트 또는 술포네이트에 의해 치환될 수 있다. 초기 가닥에 혼입된 뉴클레오티드의 서열이 주형 가닥의 서열을 반영하는 한, 천연 발생 퓨린 또는 피리미딘 염기는 다른 퓨린 또는 피리미딘, 또는 이의 유사체에 의해 치환될 수 있다.

주형 분자는 당업자에게 공지된 임의의 기법에 의해 제조될 수 있다. 주형 분자는 천연 발생 DNA 또는 RNA 분자, 예를 들어 염색체 DNA 또는 메신저 RNA(mRNA)일 수 있다. 사실상 임의의 천연 발생 핵산이 비제한적으로 염색체 DNA, 미토콘드리아 DNA 또는 엽록체 DNA 또는 리보솜 RNA, 전사 RNA, 이형 핵 RNA 또는 메신저 RNA를 포함하는 개시된 방법에 의해 제조되고 시퀀싱될 수 있다. 시퀀싱되는 핵산은 당 기술분야에 공지된 표준 방법에 의해 원핵세포 또는 진핵세포 원으로부터 수득될 수 있다.

각종 형태들의 세포 핵산을 제조하고 단리하는 방법이 공지되어 있다. (예컨대, [Guide to Molecular Cloning Techniques, Berger 및 Ibmmel 편저, Academic Press, New York, NY, 1987; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판, 편저 Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]을 참고한다). 일반적으로, 시퀀싱되는 핵산을 포함하는 세포, 조직 또는 기타 원 물질은 예를 들어 액체 질소 중에 동결화한 후, 유발 및 유봉에서 분쇄함으로써 먼저 균질화된다. 특정 조직은 웨어링(Waring) 블렌더, 버티스(Virtis) 균질기, 다운스(Dounce) 균질기 또는 기타 균질기를 이용하여 균질화될 수 있다. 조 균질화물을 세제, 예컨대 나트륨 도데실 술페이트(SDS), 트리톤(Triton) X-100, CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)-디메틸암모니오]-1-프로판 술포네이), 옥틸글루코시드 또는 당 기술분야에 공지된 기타 세제로 추출할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 추출은 케이오트로픽(chaotrophic)제, 예컨대 구아니디늄 이소티오시아네이트, 또는 유기 용매, 예컨대 페놀을 사용할 수 있다. 프로테아제 처리, 예를 들어 프로테이나제 K를 이용한 처리를 사용하여, 세포 단백질을 분해할 수 있다. 입상물 오염물을 원심분리 또는 초원심분리에 의해 제거할 수 있다(예를 들어, 약 5,000 내지 10,000 x g에서 10 내지 30분, 또는 약 50,000 내지 100,000 x g에서 30 내지 60 분). 낮은 이온 강도의 수성 완충액에 대한 투석을 사용하여, 염 또는 기타 가용성 오염물을 제거할 수 있다. 핵산은 -20℃에서 에탄올 첨가에 의해, 또는 나트륨 아세테이트(pH 6.5, 약 0.3 M) 및 0.8 부피의 2-프로판올의 첨가에 의해 석출될 수 있다. 석출된 핵산은 원심분리에 의해 수집될 수 있거나, 혹은 염색체 DNA의 경우에는 유리 피펫 또는 기타 프로브 상에 석출된 DNA를 스풀링함으로써 수집될 수 있다.

당업자는 상기 열거된 절차들이 단지 예시적이며, 시퀀싱되는 핵산의 특별 유형에 따라 많은 변형 절차가 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 미토콘드리아 DNA는 종종 단계 구배를 이용하여 염화세슘 밀도 구배 원심분리에 의해 제조되며, 한편 mRNA은 종종 프로메가(Promega)(미국 위스콘신주 매디슨 소재) 또는 클론테크(Clontech)(미국 캘리포니아주 팔로알토 소재)와 같은 상업적 출처의 제조 칼럼을 이용하여 제조된다. 그러한 변형법들은 당 기술분야에 공지되어 있다.

당업자는 제조되는 주형 핵산의 유형에 따라, 각종 뉴클레아제 억제제들이 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 벌크 용액에서 RNA아제 오염은 디에틸 파이로카르보네이트(DEPC)로 처리함으로써 제거될 수 있고, 한편 시중 입수가능한 뉴클레아제 억제제가 프로메가(미국 위스콘신주 매디슨 소재) 또는 BRL(미국 매디슨주 가이테르버르그 소재)와 같은 표준 출처로부터 수득될 수 있다. 정제된 핵산은 수성 완충액, 예컨대 TE(트리스-EDTA)(에틸렌 디아민 테트라아세트산)에 용해되거나, 사용 전에 -20℃에서 또는 액체 질소 중에 저장될 수 있다.

단일 가닥의 DNA(ssDNA)가 시퀀싱되는 경우, ssDNA가 표준 방법에 의해 이중 가닥의 DNA(dsDNA)로부터 제조될 수 있다. 가장 간단하게는, dsDNA는 그것의 어닐링 온도 초과로 가열될 수 있고, 이 시점에서 그것은 자발적으로 ssDNA로 분리된다. 대표적 조건은 92 내지 95℃에서 5분 이상 동안 가열하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어 GC 함량 및 분자의 길이에 기초하여 dsDNA를 분리하는 조건을 결정하기 위한 방식이 당 기술분야에 공지되어 있다. 대안적으로, 단일 가닥의 DNA는 이중 가닥의 DNA 중 한 가닥에만 결합하는 프라이머를 이용하여, 당 기술분야에 공지된 표준 증폭 기법에 의해 이중 가닥의 DNA로부터 제조될 수 있다. 예를 들어 시퀀싱되는 이중 가닥의 핵산을 복제 형태의 M13과 같은 파지에 삽입하고, 파지가 주형의 단일 가닥의 복사체를 제조하도록 함으로써, 단일 가닥의 DNA을 제조하는 다른 방법이 당 기술분야에 공지되어 있다.

RNA 또는 DNA 폴리머라제를 위한 주형으로 작용할 수 있는 사실상 임의의 유형의 핵산이 잠재적으로 시퀀싱될 수 있다. 예를 들어, 각종 증폭 기법, 예컨대 폴리머라제 사슬 반응(PCR) 증폭에 의해 제조된 핵산이 시퀀싱될 수 있다. (U.S. 특허 No. 4,683,195, 4,683,202 및 4,800,159를 참고한다). 시퀀싱되는 핵산은 대안적으로 표준 벡터, 예컨대 플라스미드, 코스미드, BAC(박테리아 인공 염색체) 또는 YAC(효모 인공 염색체)에서 클로닝될 수 있다. (예컨대, [Berger 및 Kimmel, 1987; Sambrook등, 1989]를 참고한다.) 핵산 삽입체는 예를 들어 적당한 제한 엔도뉴클레아제로 절단한 후, 아가로스 겔 전기영동 및 에티디움 브로마이드 염색에 의해 벡터 DNA로부터 단리될 수 있다. 선택된 크기 분획화 핵산은 예를 들어 저융점 아가로스의 사용에 의해 겔로부터, 혹은 겔 슬라이스로부터 전기용리에 의해 제거될 수 있다. 삽입체 단리 방법이 당업자에게 공지되어 있다.

특정 측면들에서, 시퀀싱되는 핵산은 ssDNA 또는 ssRNA의 단일 분자일 수 있다. 적은 수(예컨대, 1000개 분자 이하)의 핵산 주형이 포함되는 측면들에서, 음전하를 표면에 첨가함으로써 핵산이 반응 용기의 표면 및 기재에 결합하는 것을 최소화하기 위한 절차가 포함될 수 있다(예컨대, [Braslavsky 등, Proc. Natl. Acad. Sci., 100:3960-3964, 2003]를 참고한다).

단일 ssDNA 또는 ssRNA 분자의 선택 및 조작을 위한 다양한 방법들, 예를 들어 수력학 집속, 마이크로-조작자 커플링, 광학 포획, 또는 이들의 조합, 및 유사 방법이 사용될 수 있다.(예컨대, [Goodwin 등, 1996, Acc. Chem. Res. 29: 607-619; U.S. 특허 No. 4,962,037; 5,405,747; 5,776,674; 6,136,543; 6,225,068]를 참고한다.)

본 발명의 특별한 실시양태들에서, 방법 및 장치가 1,000개 초과, 2,000개 초과, 5,000개 초과, 10,000개 초과, 20,000개 초과, 50,000개 초과, 100,000개 초과, 또는 더 많은 개수의 염기로 된 길이의 매우 긴 핵산 분자의 서열을 수득하기 위해 적당하다. 그러나, 특정 실시양태들에서, 방법 및 장치는 500, 400, 300, 200, 150, 100, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 보다 짧은 핵산 분자의 서열을 제공한다. 이 보다 짧은 핵산 분자는 샘플로부터 직접 단리되거나, 보다 긴 핵산 분자의 처리로부터 수득될 수 있다.

마이크로유체상 또는 나노유체상을 사용하여, 주형 핵산을 분류하고 단리할 수 있다. 수력학을 사용하여, 핵산을 마이크로채널, 마이크로모세관 또는 마이크로포어에 조작하여 삽입할 수 있다. 수력학 힘을 사용하여, 핵산 분자를 콤(comb) 구조에 가로질러 이동시켜, 단일 핵산 분자를 분리할 수 있다. 일단 핵산 분자가 분리되면, 수력학 집속을 사용하여, 분자를 위치시킬 수 있다. 열 또는 전기 포텐셜, 압력 또는 진공을 또한 사용하여, 핵산의 조작을 위한 모티브 힘을 제공할 수 있다. 시퀀싱을 위한 주형 핵산의 조작은 U.S. 특허 No. 5,867,266 및 6,214,246에 개시된 바와 같이, 미세제작된 채널을 혼입하는 채널 블록 설계, 및 집적 겔 물질을 사용하는 것을 포함할 수 있다.

대안적으로, 핵산 주형을 포함하는 샘플을 고정화 표면에 결합시키기 전에 희석할 수 있다. 고정화 표면은 자기 또는 비자기 비이드 또는 기타 구분된 구조 단위의 형태일 수 있다. 한 적당한 희석으로, 각 비이드는 0개 또는 1개 핵산 분자에 결합하는 통계학적 확률을 가질 것이다. 예를 들어 형광 염료 및 유동분석기 분류 또는 자기 분류를 이용하여, 하나의 결합된 핵산 분자를 갖는 비이드를 확인할 수 있다. 비이드 및 핵산의 상대적 크기 및 균일도에 따라, 단일 결합 핵산 분자를 포함하는 비이드를 분리하기 위해 자기 필터 및 질량 분리를 사용할 수 있다. 다른 대안들에서, 단일 비이드 또는 기타 고정화 표면에 결합된 다중 핵산들이 시퀀싱될 수 있다.

다른 대안들에서, 코팅된 섬유 팁을 사용하여, 시퀀싱을 위한 단일 분자 핵산 주형을 발생시킬 수 있다(예컨대, U.S. 특허 No. 6,225,068). 아비딘 또는 기타 가교제의 단일 분자를 포함하는 고정화 표면이 제조될 수 있다. 그러한 표면은 단일 비오티닐화 프라이머를 부착할 수 있고, 이는 다시 단일 주형 핵산과 혼성화하여, 시퀀싱될 수 있다. 이는 아비딘-비오틴 결합 시스템에 제한되지 않으나, 당 기술분야에 공지된 임의의 커플링 시스템에 적합화될 수 있다.

다른 대안들에서, 광학적 트랩을 사용하여, 시퀀싱을 위해 단일 분자 핵산 주형를 조작할 수 있다(예컨대, U.S. 특허 No. 5,776,674). 예시적 광학 포획 시스템은 셀 로보틱스 인코포레이티드(Cell Robotics, Inc.)(미국 뉴멕시코주 알부퀘르크 소재), S+L GmbH(독일 하이델베르크 소재) 및 P.A.L.M. Gmbh(독일 울프라트샤우젠 소재)로부터 시중 입수가능하다.

시퀀싱되는 핵산 분자는 고체 표면에 결합(또는 고정)될 수 있다. 핵산 분자의 고정은 핵산 분자와 표면 사이의 비공유 또는 공유결합을 포함하는 다양한 방법들에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 고정은 표면을 스트렙타비딘 또는 아비딘으로 코팅하고, 후속하여 비오티닐화 폴리뉴클레오티드를 결합시킴으로써 달성될 수 있다(Holmstrom 등, Anal. Biochem. 209:278-283, 1993). 고정은 또한 실리콘, 유리 또는 기타 표면을 폴리-L-Lys(리신)으로 코팅한 후, 이관능성 가교결합 시약을 이용하여 아미노- 또는 술프히드릴-변형된 핵산의 공유결합에 의해 일어날 수 있다(Running 등, BioTechniques 8:276-277, 1990; Newton 등, Nucleic Acids Res. 21:1155-62, 1993). 아민 잔기는 가교결합을 위해 아미노실란을 사용함으로써 표면에 도입될 수 있다.

고정은 화학적으로 변형된 표면에 5'- 포스포릴화 핵산을 직접적으로 공유 결합시킴으로써 일어날 수 있다(Rasmussen 등, Anal. Biochem. 198:138-142, 1991). 핵산과 표면 사이의 공유결합은 수용성 카르보디이미드와의 축합에 의해 형성된다. 이 방법은 그것의 5'-인산염을 통한 핵산의 주된 5'-결합을 촉진한다.

DNA는 통상 먼저 유리 표면을 실란화한 후, 카르보디이미드 또는 글루타르알데히드로 활성화함으로써 유리에 결합된다. 대안적 절차는, 분자의 3' 또는 5' 말단에 혼입된 아미노 링커를 통해 연결된 DNA와 함께 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GOP) 또는 아미노프로필트리메톡시실란(APTS)과 같은 시약을 사용할 수 있다. DNA는 자외선 조사를 이용하여 막 표면에 직접 결합될 수 있다. 핵산에 대한 고정 기법의 다른 비제한적 예가 U.S. 특허 No. 5,610,287, 5,776,674 및 6,225,068에 개시되어 있다.

핵산의 고정을 위해 사용되는 표면의 유형은 제한적이지 않다. 고정화 표면은 자기 비이드, 비자기 비이드, 평면 표면, 첨예 표면, 또는 물질이 핵산 시퀀싱 반응을 일으키도록 하기에 충분히 내구적이고 불활성인 한 거의 임의의 물질을 포함하는 고체 표면의 임의의 다른 형태일 수 있다. 사용될 수 있는 표면의 비제한적 예에는 유리, 실리카, 실리케이트, PDMS, 은 또는 기타 금속 코팅 표면, 니트로셀룰로스, 나일론, 활성화 석영, 활성화 유리, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF), 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 기타 중합체, 예컨대 폴리(비닐 클로라이드), 폴리(메틸 메타크릴레이트) 또는 폴리(디메틸 실록산), 및 핵산 분자와 공유결합을 형성할 수 있는 케틸 라디칼, 니트렌 및 카르벤과 같은 광활성 종을 함유하는 광중합체가 포함된다(U.S. Pat. No. 5,405,766 및 5,986,076을 참고한다).

이관능성 가교결합 시약은 표면에 핵산 분자를 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 이관능성 가교결합 시약은 그것의 관능기, 예컨대, 아미노, 구아니디노, 인돌 또는 카르복실의 특이적 기의 특이성에 따라 분류될 수 있다. 이들 중, 유리 아미노기에 대한 시약이 시중 입수가능하고, 합성이 용이하며, 그것의 적용 반응 조건이 온화하기 때문에 보편적이다. 분자의 가교결합을 위한 예시적 방법이 U.S. 특허 No. 5,603,872 및 5,401,511에 개시되어 있다. 가교결합 시약에는 글루타르알데히드(GAD), 이관능성 옥시란(OXR), 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르(EGDE) 및 카르보디이미드, 예컨대 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)가 포함된다.

특정 방법들에서, 시퀀싱 반응은 폴리머라제, 예컨대 DNA 폴리머라제를 프라이머 분자에 결합시키고, 뉴클레오티드를 프라이머의 3' 말단에 촉매적으로 부가하는 것을 포함할 수 있다. 사용가능한 폴리머라제의 비제한적 예에는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사효소 및 RNA-의존성 RNA 폴리머라제가 포함된다. "프루프리딩" 활성 및 요건의 측면에서의 상기 폴리머라제들 사이의 차이, 또 프라이머 및 프로모터 서열에 대한 요건의 결핍이 본원에서 논의되고 당 기술분야에 공지되어 있다. RNA 폴리머라제가 사용되는 경우, 시퀀싱되는 주형 분자는 이중 가닥의 DNA일 수 있다. 미스매치 뉴클레오티드의 혼입으로 인한 에러는, 예를 들어 원래의 주형의 양 가닥을 시퀀싱함으로써, 또는 동일한 가닥의 다중 복사체를 시퀀싱함으로써 수정될 수 있다.

사용될 수 있는 폴리머라제의 비제한적 예에는 써마토가 마리티마(Thermato gamaritima) DNA 폴리머라제, AmplitaqFS3 DNA 폴리머라제, 타케나제(Taquenase)3 DNA 폴리머라제, 써모시쿼나제(ThermoSequenase)3, Taq DNA 폴리머라제, Qbeta3 리플리카제, T4 DNA 폴리머라제, 써무스 써모필러스(Thermus thermophilus) DNA 폴리머라제, RNA-의존성 RNA 폴리머라제 및 SP6 RNA 폴리머라제가 포함된다.

베링거 만하임 바이오케미칼즈(Boehringer Mannheim Biochemicals)(미국 테네시주 인디아나폴리스 소재)의 Pwo DNA 폴리머라제; 바이오-래드 라보라토리즈(Bio-Rad Laboratories)(미국 캘리포니아주 헤르큘스 소재)의 Bst 폴리머라제; 에피센터 테크놀로지즈(Epicentre Technologies)(미국 위스콘신주 매디슨 소재)의 이소썸(IsoTherm)3 DNA 폴리머라제; 프로메가(Promega)(미국 위스콘신주 매디슨 소재)의 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 역전사효소, Pfu DNA 폴리머라제, 조류 골수아세포증 바이러스 역전사효소, 써무스 플라부스(Thermus flavus)(Tfl) DNA 폴리머라제 및 써모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis)(Tli) DNA 폴리머라제; 아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech)(미국 뉴저지주 피스케터웨이 소재)의 RAV2 역전사효소, HIV-1 역전사효소, T7 RNA 폴리머라제, T3 RNA 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 E. 콜라이, 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) DNA 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제 +/- 3'→3 5' 엑소뉴클레아제, DNA 폴리머라제 I의 클레노우 단편, 써무스 유비퀴토우스(Thermus ubiquitous) DNA 폴리머라제, 및 DNA 폴리머라제 I을 포함한 수많은 폴리머라제들이 시중 입수가능하다. 그러나, 뉴클레오티드의 주형 의존성 중합에 대해 당 기술분야에 공지된 임의의 폴리머라제가 사용될 수 있다. (예컨대, [Goodman 및 Tippin, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1(2):101-9, 2000; U.S. 특허 No. 6,090,389]을 참고한다).

당업자는 폴리머라제 활성율이 검출 유니트에 의한 뉴클레오티드의 최적 분석 속도와 일치하도록 조작될 수 있음을 인식할 것이다. 온도, 압력, pH, 염 농도, 이가 양이온 농도 또는 반응실 내의 뉴클레오티드의 농도를 조정하는 것을 포함한, 폴리머라제 활성율의 속도를 조정하기 위한 각종 방법들이 공지되어 있다. 폴리머라제 활성의 최적화 방법이 당업자에게 공지되어 있다.

프라이머는 당 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 일반적으로, 프라이머는 10개 염기 내지 20개 염기의 길이를 가지나, 보다 긴 프라이머도 이용될 수 있다. 프라이머는 고정화 표면에 대한 주형의 결합 부위에 근접할 수 있는, 주형 핵산 분자의 기지 부분에 대해 서열이 정확히 상보적이도록 설계될 수 있다. 예를 들어 포스포라미다이트 화학을 이용하는 자동화 핵산 합성기를 이용하는, 임의의 서열의 프라이머의 합성 방법이 공지되어 있고, 그러한 기기는 표준 출처, 예컨대 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)(미국 캘리포니아주 포스터시티 소재)로부터 수득될 수 있다.

다른 방법들은 기지의 프라이머 결합 부위의 부재 하에 핵산을 시퀀싱하는 것을 포함한다. 그러한 경우, 랜덤 프라이머, 예컨대 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 염기 또는 그 보다 많은 개수의 염기의 길이의 랜덤 헥사머 또는 랜덤 올리고머를 사용하여, 초기 가닥의 중합을 개시할 수 있다. 비혼성화된 프라이머는 합성 반응의 개시 전에 제거될 수 있다.

비혼성화된 프라이머 제거는, 예를 들어 결합제, 예컨대 스트렙타비딘으로 코팅된 고정화 표면을 이용함으로써 달성될 수 있다. 상보적 결합제, 예컨대 비오틴이 주형 분자의 5' 말단에 결합될 수 있고, 주형 분자는 고정화 표면 상에 고정될 수 있다. 프라이머와 주형 사이에 혼성화가 일어나도록 한 후, 고정화 표면에 결합되지 않은 그 프라이머 분자들이 제거될 수 있다. 주형 가닥에 혼성화된 그 프라이머들만이 주형 의존성 DNA 합성을 위한 프라이머로서 작용할 것이다. 다른 대안적 실시양태들에서, 다중 프라이머 분자가 고정화 표면에 결합될 수 있다. 주형 분자가 부가되어 상보적 프라이머에 수소결합될 수 있다. 이어서, 주형 의존성 폴리머라제는 초기 가닥 합성을 개시하는 작용을 할 수 있다.

주형 가닥 당 단지 하나의 프라이머, 예컨대 광활성가능한 가교제를 선택적으로 보유하는 다른 유형의 가교결합이 사용될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 수많은 가교제들이 당 기술분야에 공지되어 있고, 사용될 수 있다. 가교제는 또한 링커 암을 통해 고정화 표면에 결합되어, 프라이머와 주형 사이의 수소 결합을 방해하는 고정화 표면과의 입체 장애의 가능성을 피할 수 있다.

특정 방법은 표지를 뉴클레오티드에 혼입하여, 검출 유니트에 의한 그것의 측정을 용이하게 하는 것을 포함할 수 있다. 라만 표지는, 합성 분자, 염료, 천연 발생 안료, 예컨대 피코에리트린, 유기 나노구조, 예컨대 C₆₀, 벅키볼(buckyball) 및 탄소 나노튜브, 금속 나노구조, 예컨대 금 또는 은 나노입자 또는 나노프리즘 및 나노 크기의 반도체, 예컨대 퀀텀 도트를 비제한적으로 포함하는, 검출가능한 라만 신호를 생성시킬 수 있는 임의의 유기 또는 무기 분자, 원자, 착물 또는 구조일 수 있다. 라만 표지의 수많은 예들이 이하 논의된다. 당업자는 그러한 예들이 제한적이지 않고, 라만 표지가 라만 분광법의 검출될 수 있는 당 기술분야에 공지된 임의의 유기 또는 무기 원자, 분자, 화합물 또는 구조를 포괄할 수 있음을 인식할 것이다.

라만 분광법을 위해 사용될 수 있는 표지의 비제한적 예에는 TRIT(테트라메틸 로다민 이소티올), NBD(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸), 텍사스 레드(Texas Red) 염료, 프탈산, 테레프탈산, 이소프탈산, 크레실 패스트 바이올렛, 크레실 블루 바이올렛, 브릴리언트 크레실 블루, 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 비오틴, 디곡시게닌, 5-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신, 5-카르복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레신, 5-카르복시플루오레신, 5-카르복시로다민, 6-카르복시로다민, 6-카르복시테트라메틸 아미노 프탈로시아닌, 아조메틴, 시아닌, 잔틴, 숙시닐 플루오레신 및 아미노아크리딘이 포함된다. 당 기술분야에 공지된 바와 같이 일반적으로 폴리시클릭 방향족 화합물이 라만 표지로 기능할 수 있다. 이 라만 표지 및 다른 라만 표지들은 상업적 출처(예컨대, 몰레큘러 브로브스(Molecular Probes)(미국 오레곤주 유겐 소재)로부터 수득될 수 있다.

사용될 수 있는 다른 표지에는 시아니드, 티올, 염소, 브롬, 메틸, 인 및 황이 포함된다. 탄소 나노튜브가 또한 라만 표지로 사용될 수 있다. 라만 분광법에서의 표지의 사용이 공지되어 있다(예컨대, U.S. 특허 No. 5,306,403 및 6,174,677). 당업자는 라만 표지는 다른 유형의 뉴클레오티드에 결합될 때 구별가능한 라만 스펙트럼을 발생시키게 됨을 인식할 것이다.

표지는 뉴클레오티드에 직접적으로 결합되거나, 각종 링커 화합물을 통해 결합될 수 있다. 대안적으로, 라만 표지에 공유결합된 뉴클레오티드 전구체는 표준 상업적 출처(예컨대, 로쉐 몰레큘러 바이오케미칼즈(Roche Molecular Biochemicals)(미국 인디애나주 인디아나폴리스 소재); 프로메가 코포레이션(Promega Corp.)(미국 위스콘신주 매디슨 소재); 암비온 인코포레이티드(Ambion, Inc.)(미국 텍사스주 오스틴 소재); 아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech)(미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)로부터 입수가능하다. 다른 분자, 예컨대 뉴클레오티드와 공유 반응하도록 설계된 반응기를 갖는 라만 표지가 시중 입수가능하다(예컨대, 몰레큘러 프로브즈(미국 오레곤주 유겐 소재). 표지된 뉴클레오티드를 제조하고, 그것을 핵산에 혼입하는 방법이 공지되어 있다(예컨대, U.S. 특허 No. 4,962,037; 5,405,747; 6,136,543; 6,210,896). 특정 측면들에서, 라만 표지는 피리미딘 뉴클레오티드에 결합된다.

본원에 제공된 장치에는 채널이 포함된다. 특정 측면들에서, 뉴클레오티드의 농도는 그것이 채널을 통과하여 흐를 때, 라만 분광법에 의해 측정된다. 채널은 특정 측면들에서 은, 금, 백금, 구리 또는 알루미늄 메쉬를 포함한다. 채널은, 예를 들어 마이크로유체상 채널, 마이크로채널, 마이크로모세관 또는 나노채널이다. 또한, 반응실 및 채널은 특정 예들에서 단일 칩에 혼입된다.

장치는 특정 예들에서 채널 내의 금속 나노입자를 더 포함한다. 나노입자는 본 발명의 특정 측면들에서 채널을 통과하여 흐른다. 채널 직경은 특정 측면들에서 약 5, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 및 300 마이크로미터이다. 예를 들어, 채널 직경은 약 100 내지 약 200 마이크로미터의 직경이다. 다른 측면들에서, 채널이 둥글다.

본원에 제공된 장치는 전형적으로 반응실을 포함한다. 반응실은 고정화 표면, 핵산 주형, 프라이머, 폴리머라제 및/또는 뉴클레오티드를 수성 환경에 보유하도록 설계될 수 있다. 반응실은 예를 들어 펠레티어 요소의 혼입 또는 당 기술분야에 공지된 기타 방법에 의해 온도 제어되도록 설계될 수 있다. 핵산 중합에 사용된 저체적 액체에 대한 온도 조절 방법이 당 기술분야에 공지되어 있다. (예컨대, U.S. 특허 No. 5,038,853, 5,919,622, 6,054,263 및 6,180,372를 참고한다.)

예를 들어 분자 디스펜서, 검출 유니트, 폐기물 포트, 로딩 포트, 또는 뉴클레오티드의 소스에 연결부를 제공하는 반응실 및 임의의 결합 유체 채널은 컴퓨터 칩 제조 또는 마이크로모세관 칩 제조 분야에서 알려져 있는 바와 같이 배치 제작 공정에서 제조될 수 있다. 장치의 반응실 및 기타 성분은 단일 집적 칩으로 제조될 수 있다. 그러한 칩은 당 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 사진석판술 및 에칭, 레이저 제거, 사출 성형, 캐스팅, 분자 빔 성장법, 딥-펜 나노석판술, 화학적 증착(CVD) 제작, 전자빔 또는 집속 이온 빔 기술 또는 임프린팅 기법에 의해 제조될 수 있다. 비제한적 예에는 유동성, 광학적으로 투명한 물질, 예컨대 플라스틱 또는 유리를 이용하는 통상적 성형; 이산화규소의 사진석판술 및 드라이 에칭; 이산화규소 기재 상에 알루미늄 마스크를 패턴화한 후, 반응성 이온 에칭하기 위해 폴리메틸메타크릴레이트 레지스트를 이용하는 전자빔 석판술이 포함된다. 마이크로유체상 채널이 Anderson 등("Fabrication of topologically complex three-dimensional microfluidic systems in PDMS by rapidprototyping", Anal. Chem. 72:3158-3164, 2000)에 따라 폴리디메틸실록산(PDMS)을 성형함으로써 제조될 수 있다. 나노전기기계 시스템의 제조 방법이 사용될 수 있다. (예컨대, [Craighead, Science 290:1532-36, 2000]을 참고한다.) 미세제작된 칩이 칼리퍼 테크놀로지즈 인코포레이티드(Caliper Technologies Inc.)(미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재) 및 클라라 바이오사이언스 인코포레이티드(CLARA BioSciences Inc.)(미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재) 등으로부터 상업적으로 입수가능하다.

규소, 이산화규소, 질화규소, 폴리디메틸 실록산(PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 플라스틱, 유리, 석영 등을 포함한, 집적 칩에 사용되는 것으로 공지된 임의의 물질을 사용할 수 있다. 유리, 규소, 석영 및 기타 광학적으로 투명한 물질과 같은, 라만 분광법에 사용되는 여기 및 방출 주파수에서 전자기 조사에 대해 투명한 장치의 부분 또는 전부이 선택될 수 있다. 핵산 및/또는 뉴클레오티드에 노출될 수 있는 유체 충전 구획, 예컨대 반응실, 마이크로유체상 채널, 나노채널 또는 마이크로채널에 있어, 그러한 분자에 노출된 표면은 표면을 소수성 표면에서 친수성 표면으로 변형시키고/시키거나, 표면에 대한 분자의 흡착을 감소시키기 위해, 예를 들어 코팅에 의해 변형될 수 있다. 통상적 칩 물질, 예컨대 유리, 규소 및/또는 석영의 표면 변형이 당 기술분야에 공지되어 있다(예컨대 U.S. 특허 No. 6,263,286). 그러한 변형들에는 상업적으로 입수가능한 모세관 코팅(수펠코(Supelco)(미국 펜실베니아주 벨라폰트 소재), 폴리에틸렌옥시드 또는 아크릴아미드와 같은 각종 관능기들을 갖는 실란, 또는 당 기술분야에 공지된 임의의 기타 코팅을 비제한적으로 포함할 수 있다.

피검출 뉴클레오티드는 마이크로유체상 채널, 나노채널 또는 마이크로채널 아래로 이동될 수 있다. 마이크로채널 또는 나노채널은 약 3 nm 내지 약 1 ㎛의 직경을 가질 수 있다. 여기 레이저 빔보다 크기가 약간 더 작은 채널의 직경이 선택될 수 있다. 채널은 예컨대, 알크라라 바이오사이언스 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재) 또는 액체 집적 회로(예컨대, 칼리퍼 테크놀로지즈 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재)로부터 입수가능한) 마이크로모세관을 포함할 수 있다. 그러한 마이크로유체상 플랫폼은 단지 나노리터 체적의 샘플만을 필요로 한다. 뉴클레오티드는 용매의 벌크 유동, 전기-침투, 또는 당 기술분야에 공지된 임의의 기타 기법에 의해 마이크로유체상 채널 아래로 이동할 수 있다.

대안적으로, 마이크로모세관 전기영동을 사용하여, 뉴클레오티드를 수송할 수 있다. 마이크로모세관 전기영동은 일반적으로 특별한 분리 매질로 충전 또는 비충전될 수 있는 가는 모세관 또는 채널의 사용을 포함한다. 적절히 하전된 분자체, 예컨대 음 하전 뉴클레오티드의 전기영동이 부과된 자기장에 반응하여 일어난다. 전기영동은 종종 마이크로모세관에 동시 첨가된 성분들의 혼합물의 크기 분리를 위해 사용되나, 핵산 분자로부터 순차적으로 해리되는 유사 크기의 뉴클레오티드를 수송하기 위해 사용될 수도 있다. 퓨린 뉴클레오티드가 피리미딘 뉴클레오티드보다 크고, 이에 따라 더욱 천천히 이동할 것이기 때문에, 각종 채널의 길이 및 상응하는 전이 시간 경과 검출기는, 시차 이동이 뉴클레오티드의 순서를 뒤섞는 것을 방지하기 위해 최소로 유지될 수 있다. 대안적으로, 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드의 이동 속도가 유사하거나 동일하도록, 마이크로모세관에 충전되는 분리 매질을 선택할 수 있다. 예를 들어 Woolley 및 Mathies의 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11348-352, 1994]에 의해 마이크로모세관 전기영동의 방법이 개시되었다.

마이크로모세관 전기영동 장치를 포함한 마이크로유체상 장치의 마이크로제작이 예컨대, [Jacobsen 등(Anal. Biochem, 209:278-283, 1994); Effenhauser 등(Anal. Chem. 66:2949-2953, 1994); Harrison 등(Science 261:895-897, 1993) 및 U.S. 특허 No. 5,904,824]에 개시되었다. 전형적으로, 이 방법들에는 실리카, 실리콘 또는 기타 결정성 기재나 칩 상의 마이크론 크기의 채널의 사진석판술 에칭이 포함되고, 개시된 방법 및 장치에 사용하기 위해 용이하게 적합화될 수 있다. 보다 작은 직경 채널, 예컨대 나노채널이 공지의 방법, 예컨대 마이크로채널의 내부를 코팅하여 직경을 감소시키거나, 나노석판술, 집속 전자빔, 집속 이온 빔, 집속 원자 레이저 기법을 이용함으로써 제조될 수 있다.

나노채널은 예를 들어 고산출량 전자빔 석판술 시스템을 이용하여 제조될 수 있다. 전자빔 석판술을 사용하여 실리콘 칩 상에 5 nm만큼 작은 피쳐를 쓸 수 있다. 실리콘 표면 상에 코팅된 민감성 레지스트, 예컨대 폴리메틸-메타크릴레이트는 마스크를 사용하지 않고 패턴화될 수 있다. 전자빔 어레이는 장 방출기 클러스터(field emitter cluster)를 마이크로채널 증폭기와 조합하여 전자빔의 안정성을 증가시켜, 저전류에서의 작동을 허용할 수 있다. 소프트마스크(SoftMask)3 컴퓨터 조절 시스템을 사용하여, 실리콘 또는 기타 칩 상에 나노 크기의 피쳐의 전자빔 석판술을 조절할 수 있다.

대안적으로, 집속 원자 레이저를 이용하여 나노채널을 제조할 수 있다. (예컨대, [Bloch 등, "Optics with an atomic laser beam", Phys. Rev. Lett. 87:123-321, 2001].) 석판술을 위해 표준 레이저 또는 집속 전자빔과 같은 집속 원자 레이저를 사용할 수 있다. 그러한 기법은 칩 상에 마이크론 크기 또는 나노 크기의 구조를 생성시킬 수 있다. 딥-펜 나노석판술을 또한 사용하여 나노채널을 형성할 수 있다. (예컨대, [Ivanisevic 등, "'Dip-pen' Nanolithography on Semiconductor Surfaces", J. Am. Chem. Soc., 123:7887-7889, 2001.]) 딥-펜 나노석판술은 원자간력 현미경 기술을 사용하여 분자를 실리콘 칩과 같은 표면 상에 침착시킨다. 크기가 15 nm만큼 작은 피쳐가 10 nm의 공간 해상도로 형성될 수 있다. 정규 사진석판술 기법과 조합하여 딥-펜 나노석판술을 이용함으로써 나노 크기의 채널이 형성될 수 있다. 예를 들어, 표준 사진석판술에 의해 레지스트의 층 내의 마이크론 크기의 라인이 형성될 수 있다. 딥-펜 나노석판술을 이용하여, 라인의 폭(및 에칭 후에 채널의 상응하는 직경)이 레지스트의 가장자리 상에 부가적 레지스트 화합물을 침착시킴으로써 좁아질 수 있다. 보다 가는 라인의 에칭 후, 나노 크기의 채널이 형성될 수 있다. 대안적으로, 원자간력 현미경 기술을 사용하여, 포토레지스트를 제거함으로써 나노미터 크기의 피쳐를 형성할 수 있다.

이온 빔 석판술을 또한 사용하여 칩 상에 나노채널을 생성시킬 수 있다. (예컨대, Siegel, "Ion Beam Lithography", VLSI Electronics, Microstructure Science, 제16권, Einspruch 및 Watts 편저, Academic Press, New York, 1987).) 미세 집속 이온 빔을 사용하여, 마스크를 사용하지 않고 레지스트의 층 상에 피쳐, 예컨대 나노채널을 직접 쓸 수 있다. 대안적으로, 넓은 이온 빔을 마스크와 조합하여 사용하여, 크기가 100 nm만큼 작은 피쳐를 형성할 수 있다. 예를 들어 불화수소산을 이용한 화학적 에칭을 사용하여, 레지스트에 의해 보호되지 않는 노출된 실리콘을 제거할 수 있다. 당업자는 상기 개시된 기법들이 제한적이지 않고, 나노채널이 당 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 형성될 수 있음을 인식할 것이다.

비제한적 예에서, 보로플로우트 유리 웨이퍼(Borofloat glass wafer)(프리시젼 글라스 & 옵틱스(Precision Glass & Optics)(미국 캘리포니아주 산타아나 소재)를 농축 HF(염화불소산)에서 짧은 시간 동안 예비 농축하고, 플라즈마 증강 화학적 증착(PECVD) 시스템(PEII-A, 테크닉스 웨스트(Technics West)(미국 캘리포니아주 산호세 소재))으로 비정형 실리콘 희생 층의 침착 전에, 세정할 수 있다. 웨이퍼를 헥사메틸디실라잔(HMDS)으로 프라이밍하고, 포토레지스트(쉬플레이(Shipley) 1818(미국 매사츄세츠주 말보로 소재))로 스핀 코팅하여, 소프트-베이킹할 수 있다. 접촉 마스크 배열기(퀸텔 코포레이션(Quintel Corp)(미국 캘리포니아주 산호세 소재)을 사용하여, 포토레지스트 층을 하나 이상의 마스크 디자인으로 노출시키고, 노출된 포토레지스트를 마이크로포지트(Microposit) 현상액 농축물(쉬플레이) 및 물의 혼합물을 이용하여 제거할 수 있다. 현상된 웨이퍼를 하드-베이킹하고, 노출된 비정형 실리콘을 PECVD 반응기에서 CF4(사불화탄소) 플라즈마를 이용하여 제거할 수 있다. 웨이퍼는 농축 HF로 화학적으로 에칭하여, 반응실 및 임의의 채널을 제조할 수 있다. 잔여 포토레지스트를 스트리핑하고, 비정형 실리콘을 제거할 수 있다.

억세스 홀을 다이아 몬드 드릴 비트(크라스탈라이트(Crystalite)(미국 오하이오주 웨스터빌 소재))를 이용하여 에칭된 웨이퍼로 천공될 수 있다. 에칭되고 천공된 판을 프로그래밍가능한 진공로(센투리온(Centurion) VPM, J. M. Ney(미국 캘리포니아주 유카이파 소재))에서 동일한 크기의 평평한 웨이퍼에 열 결합시킴으로써 피니슁된 칩을 제조할 수 있다. 대안적으로, 2개의 에칭된 칩 판을 상호 결합시킴으로써 칩을 제조할 수 있다. 반응실 칩을 제조하기 위한 다른 대안적 예시적 방법들이 U.S. 특허 No. 5,867,266 및 6,214,246에 개시되어 있다.

특정 측면들에서, 본원에 개시된 장치는 분자 디스펜서를 포함한다. 분자 디스펜서는 뉴클레오티드를 반응실에 방출하도록 설계될 수 있다. 분자 디스펜서는 각 유형의 뉴클레오티드를 동량으로 방출할 수 있다. 단일 분자 디스펜서를 사용하여, 4개 모든 뉴클레오티드를 반응실에 방출할 수 있다. 대안적으로, 4개 유형의 뉴클레오티드의 방출 속도는, 예를 들어 단일 유형의 뉴클레오티드를 각기 방출하는 다중 분자 디스펜서를 이용함으로써 독립적으로 조절될 수 있다. 특정 방법들에서, 단일 유형의 뉴클레오티드는 한 번에 실에 방출될 수 있다. 대안적으로, 4개 유형 모두의 뉴클레오티드들이 반응실에 동시에 존재할 수 있다.

분자 디스펜서는 펌핑 장치의 형태일 수 있다. 사용될 수 있는 펌핑 장치는 당 기술분야에 공지된 다양한 마이크로머쉬닝된 펌프들을 포함한다. 예를 들어, 피에조전기 스택에 의해 가동되는 벌징 다이어그램, 및 2개의 체크 밸브를 갖는 펌프가 U.S. 특허 No. 5,277,556, 5,271,724 및 5,171,132에 개시되어 있다. 열공압식 소자에 의해 가동되는 펌프가 U.S. 특허 No. 5,126,022에 개시되어 있다. 직렬의 다중 막을 이용하는 피에조전기 튜브연동식 펌프, 또는 인가된 전압에 의해 가동되는 튜브연동식 펌프가 U.S. 특허 No. 5,705,018에 개시되어 있다. 공개 PCT 출원 No. WO 94/05414는 마이크론 크기의 채널에서의 유체 수송을 위한 램파(lamb-wave) 펌프의 사용을 개시한다. 당업자는 분자 디스펜서가 본원에 개시된 펌프에 제한되지 않으나, 당 기술분야에 공지된 매우 적은 체적의 유체의 측정된 지불을 위한 임의의 설계를 포함할 수 있음을 인식할 것이다.

분자 디스펜서는 전기수력학 펌프의 형태를 가질 수 있다. (예컨대, [Richter 등, Sensors and Actuators 29:159-165, 1991; U.S. 특허 No. 5,126,022]). 전형적으로, 그러한 펌프는 채널 또는 반응실/펌핑실의 한 표면에 가로질러 배치된 직렬 전극들을 이용한다. 전극에 가로지르는 전기장의 인가는 샘플에서 하전 종의 전기영동 이동을 초래한다. 인듐-주석 산화물 필름이 기재 표면, 예를 들어 유리 또는 실리콘 기재 상에 전극을 패턴화하는데 특히 적당할 수 있다. 이 방법을 또한 뉴클레오티드를 반응실로 인취하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 전극이 분자 디스펜서의 표면에 패턴화되고, 전극의 표면에 뉴클레오티드를 결합시키기 위한 적당한 관능기로 변형될 수 있다. 분자 디스펜서의 표면 상의 전극과 반대되는 전극 사이의 전류 인가는 뉴클레오티드를 반응실로 전기영동 이동시키게 된다.

검출 유니트는 라만 분광법에 의해 뉴클레오티드를 검출 및/또는 정량화하기 위해 설계될 수 있다. 라만 분광법에 의해 뉴클레오티드를 검출하기 위한 각종 방법들이 당 기술분야에 공지되어 있다. (예컨대, [U.S. 특허 No. 5,306,403; 6,002,471; 6,174,677]를 참고한다). 표면 증강 라만 분광법(SERS) 또는 표면 증강 공명 라만 분광법(SERRS)에 대한 변형법이 개시되었다. SERS 및 SERRS에서, 라만 검출의 감도는 조질화 금속 표면, 예컨대 은, 금, 백금, 구리 또는 알루미늄 표면, 또는 나노구조의 표면 상에 흡착된 분자의 경우, 10⁶ 이상의 인자만큼 증강된다.

검출 유니트의 비제한적 예가 U.S. 특허 No. 6,002,471에 개시되어 있다. 이 실시양태에서, 여기 빔이 Nd: 532 nm 파장의 YAG 레이저, 또는 주파수 2배화 Ti: 365 nm 파장의 사파이어 레이저 중 하나에 의해 발생된다. 그러나, 여기 파장은 본 발명의 방법을 제한하지 않고 상당하게 다양할 수 있다. 예를 들어, 본원의 실시예들에 도시된 바와 같이, 특정 측면들에서 여기 빔은 약 750 내지 약 950 nm의 파장으로 전달된다. 펄스 레이저 빔 또는 연속적 레이저 빔이 사용될 수 있다. 여기 빔은 공초점 광학렌즈 및 현미경 대물렌즈를 통과하여 반응실에 집중된다. 뉴클레오티드로부터의 라만 방출 빛은 현미경 대물렌즈 및 공초점 광학렌즈에 의해 수집되어, 스펙트럼 분해를 위해 단색화장치에 결합된다. 공초점 광학렌즈는 다이크로익 필터, 배리어 필터, 공초점 핀홀, 렌즈 및 배경 신호를 감소시키기 위한 거울의 조합을 포함한다. 공초점 광학렌즈뿐만 아니라, 표준 전장 광학렌즈를 사용할 수 있다. 라만 방출 신호는 라만 검출기에 의해 검출된다. 검출기는 신호의 계수 및 디지털화를 위한 컴퓨터와 인터페이스로 접속되는 전자사태 광다이오드를 포함한다. 특정 실시양태들에서, 은, 금, 백금, 구리 또는 알루미늄을 포함하는 메쉬가 반응실 또는 채널에 포함되어, 표면 증강 라만 또는 표면 증강 라만 공명으로 인한 증가된 신호를 제공할 수 있다. 대안적으로, 라만-활성 금속을 포함하는 나노입자가 포함될 수 있다.

단광자 계수 모드로 작동되는 갈륨-비화물 광전자증폭관(RCA 모델 C31034 또는 버얼 인더사트리즈(Burle Industries) 모델 C3103402)이 장착된 스펙스(Spex) 모델 1403 이중-격자 분광광도계를 포함한, 검출 유니트의 대안적 실시양태들이 예를 들어 U.S. 특허 No. 5,306,403에 개시되어 있다. 여기원은 514.5 nm 라인 아르곤-이온 레이저(스펙트럼 피직스(Spectrum Physics), 모델 166), 및 크립톤-이온 레이저(인노바(Innova) 70, 코히어런트(Coherent))의 647.1 nm 라인이다.

대안적 여기원은 337 nm의 질소 레이저(레이저 사이언스 인코포레이티드(Laser Science Inc.)) 및 325 nm의 헬륨-카드뮴 레이저(리코녹스(Liconox))(U.S. 특허 No. 6,174,677)를 포함한다. 여기 빔이 밴드패스 필터(코리온(Corion))로 스펙트럼으로 정제될 수 있고, 6X 대상 렌즈(뉴포트(Newport), 모델 L6X)를 이용하여 반응실에 집중될 수 있다. 대물렌즈를 사용하여, 뉴클레오티드를 여기함과 동시에 홀로그래픽 빔 분할기(카이저 옵티컬 시스템즈 인코포레이티드(Optical Systems, Inc.), 모델 HB 647-26N18))를 이용하여 라만 신호를 수집함으로써, 여기 빔 및 방출된 라만 신호를 위한 직각 기하학적 모양을 생성시킬 수 있다. 홀로그래픽 노치 필터(카이저 옵티컬 시스템즈 인코포레이티드)를 사용하여, 레이레이(Rayleigh) 산란 조사를 감소시킬 수 있다. 대안적 라만 검출기는 적색-증강된 강화 전하-결합 장치(RE-ICCD) 검출 시스템(프린스톤 인스트루먼츠(Princeton Instruments))가 장착된 ISAHR-320 분광사진을 포함한다. 다른 유형의 검출기, 예컨대 하전 주입 장치, 포토다이오드 어레이 또는 포토트랜지스터 어레이가 사용될 수 있다.

정상 라만 산란, 공명 라만 산란, 표면 증강 라만 산란, 표면 증강 공명 라만 산란, 가간섭성 반스토크스 라만 분광법(CARS), 자극 라만 산란, 역 라만 분광법, 게인 라만 분광법, 하이퍼-라만 산란, 분자 광학 레이저 조사기(MOLE) 또는 라만 마이크로프로브 또는 라만 현미경사용법 또는 공초점 라만 현미경측정, 삼차원 또는 주사 라만, 라만 포화 분광법, 시분해 공명 라만, 라만 결합해체 분광법 또는 UV-라만 현미경사용법을 비제한적으로 포함하는, 임의의 적당한 형태 또는 구성형태의 라만 분광법 또는 당 기술분야에 공지된 관련 기법들을 사용하여 뉴클레오티드를 검출할 수 있다.

본원에 제공된 실시양태들에서, 피검출 특정 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기에 따라, 상이한 수의 분자들이 검출될 수 있다. 전형적으로, 보다 적은 수의 분자들이 피리미딘과 반대되는 퓨린에 대해 검출될 수 있고, 염기는 뉴클레오티드에 대해 검출될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기가 아데닌을 포함하는 경우, 10개 이하, 5개 이하, 또는 1개 분자의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기가 검출될 수 있다.

뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기가 구아닌을 포함하는 예들에서, 예를 들어 약 50 내지 약 100개 분자, 예를 들어 약 60개 분자의 구아닌 염기가 검출된다. 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기가 시토신을 포함하는 예들에서, 약 1000개 내지 10000개 분자, 예를 들어 5000개 내지 7000개가 검출될 수 있다. 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기가 티민을 포함하는 예들에서, 약 1000개 내지 10000개, 보다 특히 예를 들어 약 5000개 내지 약 7000개 분자가 검출될 수 있다.

특정 실시양태들에서, 필요한 프로브, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 표적 분자, 효소 및/또는 본원에 개시된 방법을 수행하기 위한 기타 분자 및 시약을 포함하는 키트가 제공된다.

하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하지 않는 것으로 의도된다.

실시예 1

뉴클레오티드의 라만 검출

방법 및 장치

비제한적 예에서, 라만 검출 유니트의 여기 빔이 근적외선 파장(750 내지 950 nm)의 티타늄:사파이어 레이저(코히어런트의 미라(Mira)) 또는 785 nm 또는 830 nm의 갈륨 알루미늄 비화물 다이오드 레이저(프로세스 인스트루먼츠(Process Instruments)의 PI-ECL 계열)에 의해 발생되었다. 펄스 레이저 빔 또는 연속적 빔이 사용되었다. 여기 빔은 디크로익 거울(카이저 옵티컬(Kaiser Optical) 또는 이색성 간섭 필터(크로마(Chroma) 또는 오메가 옵티칼(Omega Optical)에 의한 홀로그래픽 노치 필터)을 통과하여 수집된 빔과 함께 공선 기하학적 모양이 되었다. 투과된 빔은 현미경 대물렌즈(니콘(Nikon) LU 계열)을 통과하여, 표적 분석물(뉴클레오티드 또는 퓨린 또는 피리미딘 염기)이 위치한 라만 활성 기재 상에 집중되었다.

분석물로부터의 라만 산란 광을 동일한 현미경 대물렌즈에 의해 수집하여, 디크로익 거울을 통과하여 라만 검출기로 보냈다. 라만 검출기는 집속 렌즈, 분광사진 및 어레이 검출기를 포함하였다. 집속 렌즈는 분광사진의 입구 슬릿을 통해 라만 산란 광을 집속시킨다. 분광사진(악톤 리서치(Acton Research))은 그 파장에 의해 빛을 분산시킨 격자를 포함하였다. 분산된 빛은 어레이 검출기(로퍼사이언티픽(Roperscientific)에 의한 후조명 깊은 공핍의(deep-depletion) CCD 카메라) 상에 이미화되었다. 데이터 전달 및 검출기 기능의 조절을 위해 어레이 검출기를 컴퓨터에 연결된 조절기 회로에 연결하였다.

표면-증강된 라만 분광법(SERS)에 있어, 라만 활성 기재는 금속성 나노입자 또는 금속 코팅된 나노구조로 구성되었다. 크기가 5 내지 200 nm의 범위 내인 은 나노입자는 Lee 및 Meisel의 방법(J. Phys. Chem., 86:3391, 1982)에 의해 제조되었다. 대안적으로, 샘플을 현미경 대물렌즈 하에 알루미늄 기재 상에 두었다. 이하 논의되는 도면들을 알루미늄 기재 상의 정지 샘플로 수집하였다. 검출된 분자의 수를 조명을 받은 샘플의 광학 수집 체적에 의해 결정하였다. 단일 분자 수준에 이르는 검출 감도가 입증되었다.

단일 뉴클레오티드는 100 ㎛ 또는 200 ㎛ 마이크로유체상 채널을 이용하여 SERS에 의해 검출될 수 있다. 뉴클레오티드는 마이크로유체상 채널(약 5 내지 200 ㎛ 폭)을 통해 라만 활성 기재에 전달될 수 있다. 마이크로유체상 채널은 Anderson 등("Fabrication of topologically complex three-dimensional microfluidic systems in PDMS by rapid phototyping", Anal. Chem. 72:3158-3164, 2000)에 개시된 기법을 이용하여 폴리디메틸실록산(PDMS)을 성형함으로써 제조될 수 있다.

SERS가 은 나노입자의 존재 하에 수행된 경우, 뉴클레오티드, 퓨린 또는 피리미딘 분석물을 LiCl(90 μM 최종 농도) 및 나노입자(0.25 M 최종 농도 은 원자)와 혼합하였다. 실온 분석물 용액을 이용하여 SERS 데이터를 수집하였다.

뉴클레오시드 일인산염, 퓨린 염기 및 피리미딘 염기를 상기 개시된 시스템을 이용하여, SERS에 의해 분석하였다. 표 1은 각종 관심 분석물에 대한 본 검출 한계를 보여준다.

뉴클레오시드 일인산염, 퓨린 및 피리미딘의 SERS 검출
분석물	최종 농도	검출된 분자 수
dAMP	9 피코몰(pM)	~ 1개 몰
아데닌	9 pM	~ 1개 몰
dGMP	90 μM	6×10⁶개 몰
구아닌	909 pM	60개 몰
dCMP	909 μM	6×10⁷개 몰
시토신	90 nM	6×10³개 몰
dTMP	90 μM	6×10⁶개 몰
티민	90 nM	6×10³개 몰

아데닌 뉴클레오티드만에 대해서만 조건을 최적화하였다. LiCL(90 μM 최종 농도)을 결정하여, 아데닌 뉴클레오티드의 최적 SERS 검출을 제공하였다. 다른 뉴클레오티드의 검출은 다른 알칼리-금속 할로겐화물 염, 예컨대 NaCl, KCl, RbCl 또는 CsCl를 사용함으로써 촉진될 수 있다. 청구된 방법은 사용된 전해질 용액에 의해 제한되지 않고, 다른 유형의 전해질 용액, 예컨대 MgCl₂, CaCl₂, NaF, KBr, LiI 등이 사용될 수 있는 것으로 구상된다. 당업자는 강한 라만 신호를 나타내지 않는 전해질 용액은 뉴클레오티드의 SERS 검출을 최소로 간섭하게 됨을 인식할 것이다. 결과는 상기 개시된 라만 검출 시스템 및 방법이 뉴클레오티드 및 퓨린 염기의 단일 분자를 검출하고 확인할 수 있음을 입증하였다.

실시예 2

뉴클레오티드, 퓨린 및 피리미딘의 라만 방출 스펙트럼

나타낸 변형들을 이용하여 실시예 1의 프로토콜을 이용하여, 각종 관심 분석물들의 라만 방출 스펙트럼을 수득하였다. 도 2는 표면 증강의 부재 하에 또한 라만 표지없이, 4개 뉴클레오시드 일인산염의 각각의 100 mM 용액의 라만 방출 스펙트럼을 보여준다. LiCl을 용액에 첨가하지 않았다. 10초의 데이터 수집 시간을 사용하였다. 514 nm에서 여기가 일어났다. 보다 긴 검출 시간, 첨가된 전해질 및/또는 표면 증강으로, 보다 낮은 농도의 뉴클레오티드가 검출될 수 있다. 하기 도면들의 각각에 있어, 785 nm 여기 파장을 사용하였다. 도 2에 나와 있는 바와 같이, 증강되지 않은 라만 스펙트럼은 4개 비표지 뉴클레오시드 일인산염의 각각에 대한 특징적 방출 피크를 나타냈다.

도 3은 LiCl 및 은 나노입자의 존재 하에서의 구아닌의 1 nm 용액의 SERS 스펙트럼을 나타낸다. [Nucleic Acid Chemistry, 파트 1, L.B. Townsend 및 R.S. Tipson(편저), Wiley-Interscience, New York, 1978]에 논의된 바와 같이 산 처리에 의해 dGMP로부터 구아닌을 수득하였다. 100 msec 데이터 수집 시간을 이용하여 SERS 스펙트럼을 수득하였다.

도 4는 100 nM 시토신 용액의 SERS 스펙트럼을 보여준다. 1초의 수집 시간을 이용하여 데이터를 수집하였다.

도 5는 100 nM 티민 용액의 SERS 스펙트럼을 보여준다. 100 msec의 수집 시간을 이용하여 데이터를 수집하였다.

도 6는 100 pM 아데닌 용액의 SERS 스펙트럼을 보여준다. 1초 동안 데이터를 수집하였다.

도 7는 dATP(하부 추적) 및 플루오레신-표지된 dATP(상부 추적)의 500 nM 용액의 SERS 스펙트럼을 보여준다. 로쉐 어플라이드 사이언스(미국 인디애나주 인디아나폴리스 소재)로부터 dATP-플루오레신을 구매하였다. 도면은 플루오레신으로의 표지로 인해 SERS 신호의 강한 증가를 보여준다. 100 msec 동안 데이터를 수집하였다.

도 8은 아데닌의 0.9 nM 용액의 SERS를 보여준다. 검출 부피는 평가된 60개 분자의 아데닌을 포함하여 100 내지 150 펨토리터였다. 100 msec 동안 데이터를 수집하였다.

실시예 3

뉴클레오티드의 SERS 검출

은 나노입자 제형

Lee 및 Meisel(1982)에 따라, SERS 검출을 위해 사용되는 은 나노입자를 제조하였다. 18 밀리그램의 AgN0₃을 100 mL(밀리리터)의 증류수에 용해시켰고, 가열 비등시켰다. 10 mL의 1% 시트르산나트륨 용액을 10분 동안 AgN0₃ 용액에 적가하였다. 용액을 다시 1시간 동안 계속 비등시켰다. 생성된 은 콜로이드 용액을 냉각시키고 저장하였다.

아데닌의 SERS 검출

라만 검출 시스템은 실시예 1에 개시된 바와 같았다. 1 mL의 은 콜로이드 용액을 2 mL의 증류수로 희석시켰다. 희석된 은 콜로이드 용액(160 μL)(마이크로리터)을 알루미늄 트레이에서 20 μL의 10 nM(나노몰) 아데닌 용액 및 40 μL의 LiCl(0.5 몰)과 혼합하였다. LiCl은 아데닌에 대한 라만 증강제로서 작용하였다. 샘플 내의 아데닌의 최종 농도는 평가된 60개 분자의 아데닌을 포함하여 약 100 내지 150 펨토리터의 검출 체적에서 0.9 nM였다. 785 nm 여기서 여기원을 이용하고, 100 밀리초 수집 시간으로 라만 방출 스펙트럼을 수집하였다. 도 8에 나와 있는 바와 같이, 이 절차는 60개 분자의 아데닌의 검출을 입증하였고, 강한 방출 피크가 약 833 nm 및 877 nm에서 검출되었다. 실시예 1에 논의된 바와 같이, 개시된 방법 및 장치를 이용하여, 아데닌의 단일 분자 검출을 나타냈다.

핵산 시퀀싱

Sambrook 등(1989)에 따라, 인간 염색체 DNA를 정제한다. Bam H1를 이용하여 절단한 후, 게놈 DNA 단편을 pBluescript I1 파지미드 벡터(스트라겐 인코포레이티드)(Stratagene, Inc.)(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재))의 다중 클로닝 부위에 삽입하고, E. 콜라이에서 복제한다. 암피실린 함유의 아가로스 플레이트에 도말한 후, 단일 콜로니를 선택하여, 시퀀싱을 위해 성장시킨다. 게놈 DNA 삽입체의 단일 가닥의 DNA 복사체를 헬퍼 파지로 동시 감염함으로써 구출한다. 프로테이나제 K: 나트륨 도데실 술페이트(SDS)의 용액에서 절단한 후, DNA을 페놀 추출한 후, 아세트산나트륨(pH 6.5, 약 0.3 M) 및 0.8 부피의 2-프로판올을 첨가함으로써 석출한다. DNA 함유 펠렛을 트리스-EDTA 완충액에 재현탁시키고, 사용할 때까지 -20℃에서 저장한다. 아가로스 겔 전기영동은 정제된 DNA의 단일 밴드를 나타낸다.

게놈 DNA 삽입체 다음에 위치하는, 기지의 pBluescript 서열에 상보적인 M13 포워드(forward) 프라이머를 미들랜드 앤드 서치파이드 리에이전트 컴퍼니(Midland Certified Reagent Company)(미국 텍사스주 미들랜드 소재)로부터 구매한다. 프라이머는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 결합된 비오틴 부분을 포함하도록 공유 변형된다. 비오틴기는 (CH₂)₆ 스페이서를 통해 프라이머의 5'-인산염에 공유결합된다. 비오틴-표지 프라이머를 pBluescript 벡터로부터 제조된 ssDNA 주형 분자에 혼성화하도록 한다. 이어서, 프라이머-주형 착체를 Dorre 등(Bioimaging 5:139-152, 1997)에 따라 스트렙타비딘-코팅 비이드에 결합시킨다. 적당한 DNA 희석으로, 단일 프라이머-주형 착체를 단일 비이드에 결합시킨다. 단일 프라이머- 주형 착체를 함유하는 비이드를 시퀀싱 장치의 반응실에 삽입시킨다.

프라이머-주형을 변형된 T7 DNA 폴리머라제(미국 바이오케이칼즈 코포레이션(United States Biochemical Corp.)(미국 오하이오주 클레블랜드 소재))와 함께 인큐베이션한다. 폴리머라제를 광학 포획에 의해 반응실 내에 한정한다(Goodwin 등, 1996, Acc. Chem. Res. 29:607-619). 반응 혼합물은 비표지 데옥시아데노신-5'-삼인산염(dATP) 및 데옥시구아노신-5'-삼인산염(dGTP), 디곡시게닌-표지된 데옥시유리딘-5'-삼인산염(디곡시게닌-dUTP) 및 로다민-표지된 데옥시시티딘-5'-삼인산염(로다민-dCTP)을 함유한다. 중합 반응이 37℃에서 진행되도록 한다.

4개의 모든 뉴클레오티드들의 연속적 유동이 반응실을 통과한다. SERS에 의해 반응실 전 및 후에 뉴클레오티드 농도를 측정한다. 뉴클레오티드의 상보적 가닥으로의 혼입을 반응실을 나가는 뉴클레오티드의 농도 감소에 의해 결정한다. 뉴클레오티드의 시간 의존적 흡착을 사용하여, 주형 가닥의 서열을 유도한다.

한 대안적 방법에서, 단지 단일 유형의 뉴클레오티드만이 한 번에 반응실에 제공된다. 4개 유형의 뉴클레오티드의 각각이 반응실에 순차적으로 첨가된다. 제공된 뉴클레오티드의 양은 반응실 내의 주형 핵산의 양에 비례한다. 뉴클레오티드가 주형 가닥에서 다음 염기에 대해 상보적일 때, 뉴클레오티드 농도에서의 큰 결실이 반응실을 나가는 유동 통과 채털에서 관찰된다. 임의의 다른 3개 유형의 뉴클레오티드가 첨가될 때, 뉴클레오티드 농도의 변화가 거의 관찰되지 않는다. 주형 가닥에서 각 염기에 대해 공정을 반복하여, 핵산 서열을 결정한다.

실시예 4

주형 핵산 분자의 표적 위치에서의 뉴클레오티드 존재의 결정

이 실시예는 도 12a-d에 도시된 바와 같이, 주형 핵산 분자의 표적 위치에서 뉴클레오티드 존재를 결정하기 위한 방법을 도시한다. 주형 핵산 분자(60), 즉 서열 5' ATGCTATGCAGATGTACATATGTCT 3'(서열번호: 1)을 갖는 단일 가닥의 핵산 분자의 검출가능한 수의 복사체는 반응실에서 반응 혼합물과 접촉된다. 반응 혼합물은 서열 5' AGACATA 3'(서열번호: 2)을 갖는 프라이머(90), 폴리머라제(95) 및 초기 농도의 제1 뉴클레오티드(dATP(50))를 포함한다. 주형 핵산(50)을 반응실의 표면(70)에 고정한다. 반응 혼합물을 인큐베이션하여, 도 12a에 나와 있는 바와 같이 프라이머가 주형 핵산 분자에 혼성화되도록 하고, 주형-프라이머 착체를 포함하는 반응후 혼합물이 형성되도록 한다. dATP(50)는 표적 위치(65)에서 뉴클레오티드에 대해 상보적이지 않기 때문에, dATP(50)가 용액에 남는다. 이어서, 제1 반응 혼합물을 수집하여, 표면 증강 라만 분광법(SERS) 기재 상에 침착시키며, SERS를 이용하여 검출한다(도시되지 않음). dATP(50)가 상보적 가닥(즉, 초기 가닥)에 혼입되지 않았기 때문에, 반응후 혼합물 중 dATP(50)(즉, 제1 뉴클레오티드)의 라만 신호의 강도의 감소가 관찰되지 않는다. dATP(50)의 라만 신호가 감소하지 않기 때문에, 티미딘 잔기가 표적 위치에 존재하지 않고, 주형-프라이머 착체가 완충 용액으로 세척되는 것으로 결론내려진다.

주형 핵산 분자는 임의로 이 시점에서 완충액으로 세척되어 잔여 dATP를 제거한다. 이 세척 단계의 완충액 조건은, 예를 들어 프라이머가 주형 핵산 분자에 결합되어 남도록 한다.

도 12c에 나와 있는 바와 같이, dATP(50) 신호의 감소가 관찰되지 않기 때문에, 제2 뉴클레오티드(예컨대, dTTP 51)가 이어서 폴리머라제(95) 및 임의로 더 많은 프라이머(90)와 함께 도입되어, 제2 반응 혼합물을 형성한다. 충분한 시간 동안 인큐베이션한 후에, dTTP 및 폴리머라제는 주형과 접촉하여, 연장 생성물뿐만 아니라 주형-프라이머 착체를 포함하는 반응후 혼합물을 형성한다. 즉, 제2 뉴클레오티드가 주형 핵산 분자(60)의 표적 위치에서의 뉴클레오티드에 대해 상보적이기 때문에, 티미딘 잔기가 표적 위치(65)에 혼성화하는 위치에서 초기 가닥의 3' 말단, 혼성화된 프라이머의 바로 3'에서 혼입된다. 이어서, 제2 반응 혼합물을 수집하여, 표면 증강 라만 분광법(SERS) 기재 상에 침착시켜, SERS을 이용하여 검출한다(도시되지 않음). dTTP 51이 상보적 가닥(즉, 초기 가닥)에 혼입되었기 때문에, 반응후 혼합물 내의 dTTP(50)(즉, 제2 뉴클레오티드)의 라만 신호의 강도 감소가 관찰된다. dTTP(50)의 라만 신호가 감소되기 때문에, 표적 위치에서의 뉴클레오티드 존재가 아데노신 잔기인 것으로 결론내려진다.

이 시점에서, 부가적 dTTP 51를 임의로 도입하여, 모든 초기 핵산 분자들에 티미딘이 혼입되도록 확실히 한다. 또한, 제2 반응 혼합물에서, 또한 임의적 부가적 단계에서 첨가된 dTTP 51의 양이 알려져 있는 경우, 또한 반응실에 고정된 주형 핵산 분자의 수가 알려져 있는 경우, 연속적 A 잔기가 표적 뉴클레오티드 및 3' 인접 뉴클레오티드에서 주형 핵산 분자에서 발견되는지의 여부를 결정하기 위해, 임의적 부가적 단계에서의 부가적 dTTP는 SERS 기재 상에 침착되어, SERS를 이용하여 검출될 수 있다.

이어서, 상기 공정을 dATP, dTTP, 및 dCTP 및 dGTP를 이용하여, 필요한 경우에는 한 번에 반복할 수 있고, 시퀀싱을 계속하여 다음 뉴클레오티드에서 뉴클레오티드 존재를 확인할 수 있다. 이 공정은 주형 핵산 분자의 전체 뉴클레오티드 서열이 수득될 때까지 반복될 수 있다.

실시예 5

dAMP의 SERS 및 CARS 분석

이 실시예는 SECARS를 이용하는 dAMP의 광학적 분석을 도시한다. Lee 및 Meisel(1982)에 따라, 상기 개시된 바대로 SECARS 검출을 위해 사용되는 은 나노입자를 제조하였다. 은 콜로이드 용액을 dAMP 및 LiCI로 희석하고 혼합하여, 90 pM dAMP, 24 mM Ag 및 90 mM LiCl의 최종 샘플을 수득하였다. 100 밀리초 동안 라만 스펙트럼을 수집하였다. 펌프 및 스토크스 레이저를 -2 피코초에서 파동시켰다. 펌프 레이저의 평균 전력은 ~500 mW이었고, 스토크스 레이저의 평균 전력은 ~300 mW이었다. 785 nm 여기서의 여기원을 이용하고, 100 밀리초 수집 시간으로 하여 라만 방출 스펙트럼을 수집하였다.

도 13에 나와 있는 바와 같이, 이 절차는 약 737 cm^-1에서 강한 라만 이동 피크로 dAMP의 검출을 입증하였다. 도 14에 나와 있는 바와 같이, dAMP 샘플과 동일하나, dAMP를 첨가하지 않은 대조군 샘플로 얻은 결과는, 관찰된 라만 이동 방출 피크가 dAMP로부터 발생되었음을 지지한다. 또한, 이 조건 하에서 90 pM dAMP는 단독 SERS 또는 CARS만을 이용하여서는 검출될 수 없었다.

본 발명이 상기 실시예를 참고로 하여 기재되었으나, 본 발명의 기술적 사상 및 범주 내에서 변형들 및 변화들도 포괄됨을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 특허청구범위에 의해서만 제한된다.

SEQUENCE LISTING <110> INTEL CORPORATION BERLIN, Andrew SU, Xing CHAN, Selena KOO, Tae-Woong SUN, Lei SUNDARARAJAN, Narayan <120> NUCLEIC ACID SEQUENCING BY RAMAN MONITORING OF UPTAKE OF NUCLEOTIDES DURING MOLECULAR REPLICATION <130> INTEL1190WO (P18024PCT) <140> PCT/US2004/043633 <141> 2004-12-28 <150> US 10/749,527 <151> 2003-12-30 <160> 3 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Template sequence <400> 1 atgctatgca gatgtacata tgtct 25 <210> 2 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence <400> 2 agacata 7 <210> 3 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer sequence <400> 3 agacatat 8

Claims

a) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 리보스 또는 데옥시리보스 부분으로부터 퓨린 또는 피리미딘 염기를 분리하는 단계;

b) 분리된 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기를 표면 증강 라만 분광법(SERS) 기재 상에 침착시키는 단계;

c) SERS를 이용하여 분리된 퓨린 또는 피리미딘 염기를 검출하는 단계

를 포함하는, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 검출 방법.
제1항에 있어서, 데옥시뉴클레오티드 삼인산염을 검출하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 퓨린 또는 피리미딘 부분으로부터 퓨린 또는 피리미딘 염기를 분리하기 전, 핵산 시퀀싱 반응 혼합물 내에 데옥시뉴클레오티드 삼인산염을 포함시키는 것을 더 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 퓨린 또는 피리미딘 염기는 SERS에 의해 검출하기 전, 라만 표지와 연합시키는 것인 방법.
제1항에 있어서, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드는 퓨린 염기를 포함하는 것인 방법.
제5항에 있어서, 염기는 실질적으로 아데닌으로 구성되는 것인 방법.
제5항에 있어서, 염기는 실질적으로 구아닌으로 구성되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 표면 증강 라만 분광법은 표면 증강 가간섭성 반스토크스 라만 분광법(SECARS)인 것인 방법.
제8항에 있어서, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드는 피리미딘 염기를 포함하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드는 티민을 포함하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드는 우라실을 포함하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드는 시토신을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 표적 분자는 은 나노입자 상에 침착시키는 것인 방법.
제13항에 있어서, 표적 분자는 알칼리-금속 할로겐화물 염과 접촉시키는 것인 방법.
제14항에 있어서, 알칼리-금속 할로겐화물 염은 염화리튬인 것인 방법.
a) 표적 분자를 단리하는 단계;

b) 표적 분자를 표면 증강 라만 분광법(SERS) 기재 상에 침착시키는 단계;

c) 표면 증강 가간섭성 반스토크스 라만 분광법(SECARS)을 이용하여 조사된 표적 분자로부터 라만 산란을 검출함으로써, 표적 분자를 검출하는 단계

를 포함하는, 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기를 포함하는 표적 분자의 검출 방법.
제16항에 있어서, 표적 분자는 생물학적 샘플로부터 단리시키는 것인 방법.
제16항에 있어서, 표적 분자는 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기인 것인 방법.
제18항에 있어서, 표적 분자는 실질적으로 피리미딘 염기로 구성되는 것인 방법.
제19항에 있어서, 염기는 실질적으로 티민으로 구성되는 것인 방법.
제19항에 있어서, 염기는 실질적으로 우라실로 구성되는 것인 방법.
제19항에 있어서, 염기는 실질적으로 시티딘으로 구성되는 것인 방법.
제16항에 있어서, 표적 분자는 뉴클레오티드 삼인산염인 것인 방법.
a) 주형 핵산 분자의 기지(旣知)의 수의 복사체를 프라이머, 폴리머라제, 및 기지의 초기 농도의 제1 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물과 접촉시켜, 반응후 혼합물을 형성하는 단계(프라이머 또는 주형 핵산은 반응실의 표면 상에 고정시키고, 여기서 프라이머의 3' 말단은 연속적 표적 위치의 5' 뉴클레오티드의 상류에 있는 주형 핵산 분자에 결합함);

b) 반응후 혼합물을 표면 증강 라만 분광법(SERS) 기재 상에 침착시키는 단계;

c) SERS를 이용하여 제1 뉴클레오티드를 검출하는 단계;

d) 1 이상의 제1 뉴클레오티드가 연속적 표적 위치에 부가되는지의 여부를 결정하는 단계

를 포함하는, 주형 핵산 분자 내의 연속적 표적 위치에서 동일한 뉴클레오티드를 검출하는 방법.
제24항에 있어서, 주형 핵산 분자의 복사체의 기지의 수는 반응 혼합물 내의 제1 뉴클레오티드 분자의 기지의 수와 대략 동일한 것인 방법.
제24항에 있어서, 주형 핵산 분자의 복사체의 기지의 수는 반응 혼합물 내의 제1 뉴클레오티드 분자의 기지의 수의 대략 1/2인 것인 방법.
제24항에 있어서, 제1 뉴클레오티드를 검출한 후, 부가적 제1 뉴클레오티드를 반응 혼합물에 첨가하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제24항에 있어서, 뉴클레오티드로부터 염기를 절단하고, SERS를 이용하여 염기를 검출하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제24항에 있어서, SERS 검출은 표면 증강 가간섭성 반스토크스 라만 분광법(SECARS)인 것인 방법.
제24항에 있어서, 다른 뉴클레오티드를 이용하여 단계 a 내지 d를 반복하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제24항에 있어서, 뉴클레오티드는 SERS에 의해 검출하기 전, 라만 표지에 부착시키는 것인 방법.
제24항에 있어서, 내부 대조군은 반응 혼합물 내에 포함시키고, SERS을 이용하여 검출하는 것인 방법.
제32항에 있어서, 1 이상의 뉴클레오티드가 연속적 표적 위치에 부가되었는지의 여부를 결정하기 위해, 내부 대조군 및 뉴클레오티드의 SERS 신호를 비교하는 것인 방법.
a) 검출가능한 수의 주형 핵산을 반응실에서 반응 혼합물과 접촉시키는 단계(반응 혼합물은 프라이머, 폴리머라제 및 초기 농도의 제1 뉴클레오티드 삼인산염을 포함하고, 프라이머 또는 주형 핵산은 반응실의 표면 상에 고정시킴);

b) 반응 혼합물을 인큐베이션하여, 프라이머가 주형 핵산에 결합되도록 하고, 반응후 혼합물이 형성되도록 하는 단계;

c) 반응후 혼합물 또는 이의 성분을 표면 증강 라만 분광법(SERS) 기재 상에 침착시키는 단계;

d) SERS를 이용하여 제1 뉴클레오티드로부터의 라만 신호를 검출하는 단계(여기서, 반응후 혼합물 내의 제1 뉴클레오티드의 라만 신호의 강도의 감소는 연장 반응 생성물을 확인시키고, 이로써 표적 위치에서의 뉴클레오티드 존재를 확인시킴)

를 포함하는, 주형 핵산 분자의 표적 위치에서의 뉴클레오티드 존재의 결정 방법.
제34항에 있어서, 뉴클레오티드 존재가 확인될 때까지, 다른 뉴클레오티드를 이용하여 단계 a 내지 d를 반복하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제35항에 있어서, 단계 a 내지 d를 임의로 반복하기 전에 기재를 세척하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제34항에 있어서, 인큐베이션 시간은 약 1 초 내지 10 분인 것인 방법.
제34항에 있어서, 반응실은 1차원 이상에서 100 nm 미만인 것인 방법.
제34항에 있어서, 반응전 SERS 분석은, 제1 뉴클레오티드를 주형 핵산 분자와 접촉시키기 전, 제1 뉴클레오티드에 대해 수행하는 것인 방법.
제39항에 있어서, 반응전 혼합물과 대비한, 반응후 혼합물 내의 제1 뉴클레오티드의 SERS 신호의 강도의 감소가 연장 반응 생성물을 확인시키는 것인 방법.
제34항에 있어서, 제1 뉴클레오티드 및 제2 뉴클레오티드로서 한 번에 dATP 및 dGTP를 이용하여, 표적 뉴클레오티드 위치에 대해 두 번 수행하는 것인 방법.
제41항에 있어서, 주형 핵산 분자의 상보적 가닥은 제2 반응실에서 고정시키며, 제1 뉴클레오티드 및 제2 뉴클레오티드로서 한 번에 dATP 및 dGTP를 재차 이용하여 부가적으로 2회 더 수행하는 것인 방법.
제34항에 있어서, 내부 대조군은 반응 혼합물 내에 포함시키고, SERS를 이용하여 검출하는 것인 방법.
제43항에 있어서, 표적 위치에서의 뉴클레오티드 존재를 확인하기 위해, 내부 대조군 및 뉴클레오티드의 SERS 신호를 비교하는 것인 방법.