CN1934271A - 通过分子复制期间核苷酸摄取的拉曼监测进行核酸测序 - Google Patents

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Abstract

此处描述的方法和设备用于检测核苷酸、核苷、和碱基，以及用于核酸序列的确定。本方法涉及应用表面增强拉曼光谱(SERS)或表面增强相干反斯托克斯拉曼光谱(SECARS)检测核苷酸、核苷或碱基。检测可以是核酸测序反应的一部分，用来检测核酸聚合反应、如核酸测序反应期间对脱氧核苷三磷酸的摄取。合成的新生链的核酸序列以及模板链的互补序列，可以通过追踪聚合反应期间核苷酸整合的顺序来确定。提供了通过从糖部分切割碱基以增强核苷酸或核苷的SERS信号的方法。而且，提供了检测单个碱基重复的方法。

Description

通过分子复制期间核苷酸摄取的拉曼监测进行核酸测序
                     发明背景
                     技术领域
[1]本发明涉及生物分子的检测和分析，更具体地涉及核酸的检测和序列确定。
                     背景技术
[2]遗传信息以组织成染色体的非常长的脱氧核糖核酸(DNA)分子的形式储存。人类基因组含有大约30亿个碱基的DNA序列。该DNA序列信息决定了每个个体的多种特征。许多常见的疾病都至少部分地基于DNA序列中的变异。
[3]人类基因组整个序列的测定已经为鉴定这些疾病的遗传根据提供了基础。然而，为了鉴定与每一种疾病相联系的遗传变异，仍有大量的试验需要去做。为了鉴定在DNA序列中促发疾病的特定变化，这些试验就要求对表现有每一种这样的疾病的个体或家族的染色体部分进行DNA测序。核糖核酸(RNA)是加工遗传信息时所需要的中间分子，它也能被测序以确定各种疾病的遗传基础。
[4]目前的测序方法需要制得所需模板核酸的许多拷贝，把它们切为相互重叠的片段，并测序，之后再把相互重叠的DNA序列组合为完整的基因。这个过程费力、昂贵、低效而且耗时。它也通常需要使用荧光或放射性标记，这潜在地引起安全和废物处理问题。因此，存在对比目前的方法更便宜、更有效和更安全的改进的核酸测序方法的需求。
                       附图简述
[5]图1图解说明了示范性的设备10(非按比例)和DNA测序的方法，其中通过监测核酸合成期间从溶液摄取的核苷酸17，对核酸13进行测序。
[6]图2显示所有四种脱氧核苷一磷酸(dNMPs)在100mM浓度下的拉曼光谱，其使用10秒的数据采集时间。每种不同类型的核苷酸的特征拉曼发射峰如图所示。数据的采集不使用表面增强或者对核苷酸标记。
[7]图3显示1nM鸟嘌呤的SERS检测，其由dGMP经酸处理取得，酸处理根据Nucleic Acid Chemistry，Part 1，L.B.Townsend和R.S.Tipson(Eds.)，Wiley-Interscience，New York，1978。
[8]图4显示100nM胞嘧啶的SERS检测。
[9]图5显示100nM胸腺嘧啶的SERS检测。
[10]图6显示100pM腺嘌呤的SERS检测。
[11]图7显示以荧光素共价标记的脱氧腺苷三磷酸(dATP-荧光素)(上部的曲线)和未标记的dATP(下部的曲线)的500nM溶液的比较性SERS谱图。dATP-荧光素从Roche Applied Science(Indianapolis，IN)获得。在荧光素标记的dATP中检测到SERS信号的强烈增强。
[12]图8显示0.9nM(纳摩)腺嘌呤溶液的SERS检测。检测体积估计为大约100到150飞升(femtoliter)，包含大约60个腺嘌呤分子。
[13]图9A图解说明了用dATP50确定一组模板核酸分子60中靶位点处的核苷酸发生的情况，所述模板核酸分子60固定在固体基质70上。从反应前混合物(pre-reaction mixture)测定的SERS信号显示在图9B中，其中检测了dATP的SERS信号。图9C显示了从反应后混合物测定的SERS信号，其中没有检测到信号。
[14]图10是用于多重测序的微流体芯片的示意图。
[15]图11是用于混合室180的可选设计的示意图。
[16]图12A-D图解说明了此处公开方法的一个具体例子，用于确定模板核酸分子中靶位点处的核苷酸发生的情况。图12A显示了被固定在基质70上的模板链60，并显示了和模板链60杂交的引物90，其中和引物结合位点3′端紧靠的核苷酸是靶位点65。在图12B中，dATP 50和聚合酶95被加入核酸模板链60。在图12C中，dTTP 51和聚合酶95被加入带有杂交引物90的模板链60。在图12D中显示，胸腺嘧啶(T)核苷酸被加入模板核酸链60的靶位点65。
[17]图13显示了90pM dAMP的SECARS光谱(相当于约6个分子)。
[18]图14显示了银/盐溶液对照的SECARS光谱。
                       发明详述
[19]本公开的发明和设备用于快速、自动检测包含嘌呤或嘧啶碱基的靶分子，如核苷酸和核苷。本方法和设备涉及发现了，用SERS可以检测相对少拷贝数的嘌呤和嘧啶碱基，并在一些情况下，可以检测单个拷贝的嘌呤和嘧啶碱基。而且，本方法和设备涉及发现了，通过在检测前从靶分子切割出嘌呤或嘧啶碱基，和/或通过应用相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)与SERS的结合，可以增加包含嘌呤和嘧啶碱基的靶分子对拉曼检测的敏感度，特别是对于检测嘧啶碱基而言。
[20]这里公开的方法和设备典型地用在测定核苷酸摄取的核酸测序反应中。这里公开的核酸测序反应比传统的测序方法有优势，这包括获得序列数据的速度更快、测序的成本降低、在每单位序列数据所需的操作时间上更有效和在单轮测序中读取长核酸序列的能力。并且，这里提供了改进的方法，用于在测定核苷酸摄取的核酸测序反应中检测相同核苷酸的连续重复。
[21]因此，提供了检测包含嘌呤或嘧啶碱基的靶分子的方法，其中从靶分子的其余部分分离出嘌呤或嘧啶，并且用拉曼光谱检测分离的嘌呤或嘧啶碱基。在一些方面。拉曼光谱是表面增强拉曼光谱(surfaceenhanced Raman spectroscopy，SERS)或SECARS。
[22]在一些方面，本方法可以包含，在从靶分子分离出嘌呤或嘧啶碱基之前，分离该靶分子。所述分离步骤包含在，例如，从含有生成拉曼信号的其它分子的环境获得靶分子的情况中。
[23]从靶分子分离嘌呤或嘧啶的方法是本领域中已知的，所述靶分子典型地是生物分子，其中的嘌呤或嘧啶和糖部分结合。在靶分子是核苷酸或核苷的情况下，术语“分离”用来涵盖从核苷酸或核苷的其它部分移去碱基的所有有机方法和酶学方法。例如，当靶分子是核苷酸或核苷时，可以用0.2N HCl在＞60℃去糖基化20分钟，以便从糖骨架切割出碱基。可选地，也可以应用酶如DNA糖基化酶、磷酸化酶或核苷水解酶。在碱基被沉积在SERS基质上之前进行去糖基化。在碱基被沉积在SERS基质上之前从糖部分分离出碱基不是必需的。
[24]在一些方面，本方法进一步包含，在从靶分子分离碱基之前或之后和用SERS检测分离的嘌呤或嘧啶碱基之前，在表面增强拉曼光谱(SERS)基质上沉积嘌呤碱基或嘧啶碱基。在SERS基质上沉积核苷酸、核苷以及嘌呤和嘧啶碱基的方法在本文中进一步详细论述。
[25]用于这些方面的靶分子典型地包含妨碍拉曼信号从靶分子的嘌呤或嘧啶碱基产生的干扰部分(intefering moiety)。例如，干扰部分可以是糖部分，如核糖或脱氧核糖，例如2-脱氧核糖。在本发明这些实施方案的某些方面，靶分子是核苷磷酸(nucleotide phosphate)、核苷酸或核苷。可以根据本方法检测的靶分子的例子包含核酸如多核苷酸或寡核苷酸以及氧代-或脱氧-核苷酸一、二或三磷酸。例如，靶分子可以是一种或多种dNTPs。而且，靶分子可以是包含为嘌呤或嘧啶碱基的核苷。
[26]在包含在从靶分子分离碱基之前或之后将碱基沉积在SERS基质上的实施方案的某些方面，本方法进一步包含，用相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)检测分离的嘌呤或嘧啶碱基。涉及在SERS基质上沉积分子之后用CARS进行检测的发明方面，在本文中被称为SECARS。因此，提供了检测包含嘌呤碱基或嘧啶碱基的靶分子的方法，方法包含，在CARS检测靶分子之前，将靶分子沉积在表面增强拉曼光谱(SERS)的基质上。包含用两种SE CARS检测的本发明实施方案任选地包含，在检测前从靶分子的其余部分分离出嘌呤或嘧啶碱基，用以增强拉曼信号，如上所述。
[27]如已知的那样，CARS检测相干反斯托克斯拉曼散射，其为自发拉曼散射的非线性光学类似物。在这种技术中，特定的拉曼跃迁被两个激光场——称为“泵浦激光器(pump laser)”和“斯托克斯激光器(Stokes laser)”——相干地驱动，产生反斯托克斯信号场(anti-Stokessignal field)(Miiller等，CARS microscopy with folded BoxCARSphasematching.J.Microsc.197：150-158，2000)。此过程的相干性质允许激光场(laser fields)和特定的振动模式有效地耦合，使来自此模式的信号增加许多数量级。
[28]在本发明的一些方面，特别是涉及用SECARS检测靶分子的那些方面，靶分子包含嘧啶碱基。例如，靶分子可以是包含嘧啶碱基如胸腺嘧啶、尿嘧啶或胞嘧啶的核苷磷酸、核苷酸或核苷。如本文的实施例中所示例，与得到的嘌呤碱基信号水平相比，单独应用SERS检测嘧啶导致信号水平降低。因此，在SERS基质上沉积分子后用CARS检测该分子，提供了比单独应用SERS更灵敏的方法。
[29]在一些方面，靶分子“基本上由”碱基“组成”。在这些方面，可以将通常不与核苷酸中的碱基相连接的其它基团连接到碱基上。例如，碱基可以包含其它官能基或标签。
[30]在一些方面，核苷酸、核苷或碱基被沉积在一个或几个银纳米颗粒上，如纳米结构的SERS基质上，它的直径是例如约5和20纳米之间。在这些方面，核苷酸、核苷或碱基可以和碱金属卤化物盐例如氯化锂，以及例如银纳米颗粒接触。可以应用的氯化锂浓度例如是约50至约150微摩，约80至约100微摩，或者在一些更特定的实施方案中，是约90微摩。
[31]在一些方面，检测碱基，例如，单分子腺嘌呤。为了增强碱基的信号，例如，在碱基是嘧啶的实施方案中，碱基可以和拉曼标记相连。[32]在一些方面，在核酸测序方法中应用检测靶分子的方法。例如，在这些方面，靶分子是脱氧核苷三磷酸。因此，在这些实施方案中，在嘌呤或嘧啶碱基从靶分子分离并沉积在SERS表面之前，将靶分子如脱氧核苷三磷酸和模板核酸用于测序反应。在这些方面，例如，待测序的模板核酸或测序引物被固定并和包含脱氧核苷三磷酸的测序反应混合物成分接触，形成新生链，新生链和反应后混合物中的靶核酸互补，所述反应后混合物中含有未被整合进新生链的脱氧核苷三磷酸。将含有未被整合进新生链的脱氧核苷三磷酸的反应后混合物沉积在SERS基质上，并检测拉曼散射。在这些实施方案中，在检测分离的嘌呤或嘧啶碱基之前，不需要分离脱氧核苷三磷酸(dNTP)。反应后混合物中产生的拉曼信号强度比在包含除模板核酸外的所有反应物的反应前混合物中所预期或测定的拉曼信号强度下降，表明dNTP核苷酸被整合进新生链中，从而说明互补模板核酸的核苷酸发生。
[33]可以用拉曼标记增强dNTP或其它核苷酸或核苷产生的信号。在一些方面，将核苷酸连接到拉曼标记，例如，荧光团或纳米颗粒上，随后用拉曼光谱检测该核苷酸。可以将嘌呤或嘧啶碱基在将其从靶分子其余部分分离之前或之后连接到拉曼标记上。
[34]在本发明的一些方面，从生物样品分离靶分子，随后用本文提供的方法检测所述分子。生物样品是，例如，尿、血液、血浆、血清、唾液、精液、便、痰、脑脊髓液、泪液、粘液和类似物质。
[35]在一些方面，生物样品来自哺乳动物对象，例如人类对象。实际上，生物样品可以是任何生物样品，特别是含有来自对象的RNA或DNA的样品。生物样品可以是组织样品，其含有例如，1至10,000,000；1000至10,000,000；或1,000,000至10,000,000个体细胞。该样品不需要含有完整细胞，只要其含有用于本文提供方法的足够的RNA或DNA即可，在一些方面，仅需要1分子RNA或DNA。根据本发明生物样品来自哺乳动物对象的方面，生物样品或组织样品可以来自任何组织。例如，组织可以通过手术、活组织检查、拭纸、便检、或其它收集方法得到。
[36]在其它方面，生物样品含有病原体，例如，病毒或细菌病原体。在一些方面，模板核酸是在与探针接触之前从生物样品纯化的。分离的模板核酸可以不经扩增和反应混合物接触。
[37]在另一实施方案中，提供了检测模板核酸分子的连续靶位点处的相同核苷酸的方法，其中已知拷贝数的模板核酸分子，典型地是单链模板核酸分子，和包含引物、聚合酶和已知起始浓度的第一核苷酸的反应混合物接触，形成反应后混合物，对反应后混合物中第一核苷酸摄取进入新生链的情况进行定量，并用以确定靶位点处是否存在多拷贝的核苷酸，如本文更加详细论述的。根据本方法，温育使得新生链由聚合酶合成和形成反应后混合物之后，反应后混合物随后被沉积在SERS基质上，并通过检测反应后混合物的SERS信号，测定反应后混合物中第一核苷酸的浓度，并用该浓度检测第一核苷酸进入新生核酸链的摄取情况。将引物或模板核酸固定在反应室表面，并且引物的3′末端和连续靶位点5′核苷酸上游的模板核酸分子结合。可以用其它核苷酸重复该方法，例如，直至检测到SERS信号下降。
[38]在一些方面，核苷酸是dNTPs。例如，dATP可以是第一核苷酸，本方法的随后循环可以分别用例如dGTP、dCTP和dTTP来进行。反应混合物是本领域中已知的核酸聚合反应混合物。反应混合物典型地包含dNTP形式的核苷酸，以及缓冲液中的引物和聚合酶，如此处所论述。
[39]在一些方面，第一核苷酸可以在沉积于SERS基质之前从反应后混合物分离。而且，嘌呤或嘧啶碱基可以在沉积于SERS基质和SERS检测之前从dNTP的核糖或脱氧核糖部分分离，如此处论述。
[40]可以用本领域中的已知方法(参见，例如，Sambrook等，(1989))测定模板核酸分子的拷贝数目和核苷酸的浓度。例如，可以在260和280纳米的波长处用分光光度测定，或通过测定插入核酸的溴化乙锭分子发出的荧光来确定核酸含量。将该测定值和来自一系列已知浓度核酸样品的相似测定值相比较，用以估计模板核酸分子和核苷酸的浓度和拷贝数。可选地，根据聚合反应前后测定的SERS信号强度，可以确定相对浓度。
[41]在一些方面，模板核酸分子的拷贝数是1/20、1/10、1/4、1/3、1/2或与和模板核酸分子接触的第一核苷酸的拷贝数大约相同(即，在10％之内)。例如，如图9A所示，在提供大约相同拷贝数的模板核酸分子60及dNTPs 50的方面，和模板核酸分子60被固定在反应室80中的基质70上的方面，反应后混合物中的SERS信号(图9C)比起始dNTP溶液产生的SERS信号(FIG.9B)小得多或检测不到。
[42]在一些方面，用SERS最初测定第一核苷酸之后，使附加的第一核苷酸和模板核酸分子相接触。这是通过，例如，使靶核酸分子和与第一反应混合物相同的第二反应后混合物相接触而完成的。随后使第二反应后混合物，或从第二反应后混合物分离的嘌呤或嘧啶碱基沉积在SERS基质上，并用SERS检测。
[43]通过使模板核酸分子和附加的第一核苷酸分子相接触，使在连续靶位点处对相同核苷酸的测定得以迅速有效地进行。例如，可以使模板核酸分子和大约相同拷贝数的第一核苷酸相接触，并且可以使反应后混合物沉积并用SERS检测。随后可以用第二反应混合物中附加拷贝的第一核苷酸检测模板核酸分子，形成第二反应后混合物产物。随后使第二反应混合物沉积在SERS基质上，再次用SERS检测第一核苷酸。SERS信号强度比预期的SERS信号降低，表明模板核酸分子包含连续靶位点处的相同核苷酸。在本例子中，不需要确定反应混合物中第一核苷酸的绝对浓度，而根据拉曼信号强度的相对浓度就足够。对本方面的各种修改可以预见。靶核酸分子和附加的核苷酸接触也有助于确保核苷酸已经被整合进和模板链互补的所有拷贝的互补链，所述互补链由聚合酶合成。
[44]在本发明的本实施方案的一些方面，在将第一核苷酸沉积在SERS基质上之后，用SECARS(即，相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS))测定第一核苷酸。如上提示，在一些方面，在此处提供的方法中，将SECARS用作检测方法。
[45]如本文进一步详细论述，在一些例子中，将拉曼标记连接到每一核苷酸，用以增强核苷酸的拉曼信号。例如，拉曼标记可以和所有核苷酸连接，或者拉曼标记可以仅与嘧啶核苷酸连接。本发明的本方面涉及此处实施例中提供的数据，其表明在一些条件下，与嘌呤分子相比，需要更多的嘧啶分子达到检测限。在一些方面，拉曼标记是荧光团。
[46]在另一实施方案中，提供了确定模板核酸分子靶位点处的核苷酸发生情况的方法，模板核酸分子典型地是单链核酸分子，方法包括：使可测定数目的模板核酸分子和反应混合物在反应室中接触并温育，使得引物和模板核酸结合，形成反应后混合物，将反应后混合物沉积在SERS基质上，用SERS检测反应后混合物中的第一核苷酸。反应后混合物中的拉曼信号强度下降，鉴定出延伸反应产物(extension reactionproduct)，从而鉴定出靶位点处的核苷酸发生。在一些方面，将第一核苷酸的切割产物沉积在表面增强拉曼光谱(SERS)表面，随后从反应后混合物产生拉曼信号，用以增强拉曼信号。
[47]反应混合物包含引物、聚合酶和起始浓度的第一核苷酸，典型地是脱氧核苷三磷酸(dNTP)。引物或模板核酸典型地被固定在反应室的表面。
[48]在一些方面，用不同核苷酸重复本方法，直至鉴定出核苷酸的发生。例如，dATP可以是第一核苷酸，本方法的随后循环可以分别用，例如dGTP、dCTP和dTTP进行。在这些方面，典型地在基质和第二、第三或第四核苷酸接触之前清洗基质。任选地，dNTP被整合进新生链后，可以将附加拷贝的整合dNTP导入模板核酸分子中，例如，用以检测核苷酸重复，如此处所论述。随后，任选地重复本方法，用以鉴定模板核酸分子的其它靶核苷酸处的其它核苷酸发生，例如，直至整个模板核酸分子得以测序。
[49]如此处所公开，可以用SECARS增加本分析的灵敏性。在其它方面，用SERS或SECARS检测碱基之前，从核苷酸的糖部分分离出嘌呤和嘧啶碱基。
[50]在一些方面，在模板核酸分子不存在时，在核苷酸被包含在反应混合物中之前或核苷酸被包含在反应混合物中之后，使起始的反应前浓度的核苷酸样品沉积在SERS基质上，并用SERS检测。将从反应前浓度的测定的SERS光谱强度和从反应后浓度测定的强度相比较。统计学意义的反应后浓度和反应前浓度之间强度的降低表明了延伸反应产物，从而鉴定了靶位点处的核苷酸发生。如果核苷酸的浓度，典型地是dNTP的浓度是已知的和被很好控制的，则本发明的本方面可以省略。
[51]可选地，在反应混合物中提供dNTP和内部对照(internal control)分子的混合物。温育之后，可以检测dNTP和内部对照的SERS谱。可以测定dNTP和内部对照的相对强度，来确定dNTP的反应后浓度。内部对照分子可以是在确定核苷酸发生的方法中不应用的不同类型的核苷酸。这些内部对照的例子包括，例如，8-溴腺嘌呤二磷酸(Altcorp，Lexington，KY)，也可以应用带有修饰碱基的其它核苷酸，和从而可以应用不同的标记(例如，可以从Glen Research，Sterling，VA得到)。这样的化合物不能被整合进延伸产物，并具有不同的拉曼光谱。信号可以通过去除磷酸而增强，从而，修饰的碱基可以被用作本发明所有步骤的内部对照。
[52]在本发明本方面的方法中，用于形成反应后产物的温育时间足以使模板核酸被反应混合物组分所接触。反应混合物组分接触模板核酸的速度，和因而最小的温育时间，受到许多因素的影响。这些因素包含模板核酸的浓度、引物和核苷酸的浓度、反应物通过反应室的速度和反应室的尺寸和形状。为了确保温育时间足以使模板核酸分子接触反应组分，这些因素中任何因素都可以改变。
[53]根据上面论述的因素，形成反应产物所需的温育时间，可以是从1毫秒到1小时的范围，但是典型地是从100毫秒到10分钟的范围。例如，在一些方面，温育时间是100毫秒；1、2、3、4、5、10、15、20、30、45或60秒；或2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟。
[54]模板核酸的拷贝数范围是从1个拷贝至100,000个拷贝。在本发明的仅检测腺苷和鸟苷部分的方面中，模板拷贝数范围可以是从1个拷贝至10,000个拷贝。在本发明的一些方面，仅用腺嘌呤核苷酸和鸟嘌呤核苷酸，通过和模板核酸的每一链单独进行反应，实施本方法。在这些方面中，尽管仅应用含嘌呤的核苷酸，但由于两条链均被分析，可以检测到模板部位处的任何核苷酸发生。
[55]在本方法中应用的核苷酸包含嘌呤和嘧啶的实施方案中，例如，应用dATP、dGTP、dCTP、dTTP的实施方案时，或在仅包含嘧啶的实施方案中，典型地，至少应用10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000或100,000拷贝的模板核酸分子。在一些方面，应用SERS和CARS检测嘧啶核苷酸，目的是增加检测的灵敏性。
[56]如上所提示，模板核酸分子接触反应混合物组分所需的温育时间受到反应物通过反应室的速度的影响。可以用多种力推动反应室中的反应物，如此处所示。例如，可以用流体动力、热力或电力。而且，可以用压力或真空推动反应物通过反应室。
[57]如上所提示，模板核酸分子接触反应混合物组分所需的温育时间受到反应室形状和大小的影响。如此处所述可以用来分选和分离核酸分子的微流体学和纳米流体学(nanofluidics)，用在此处公开的多种实施方案的方法中，所述方法包含确定模板核酸分子靶位点处的核苷酸发生的方法。在这些实施方案中，反应室的尺寸在至少一个方向是7纳米至100毫米范围。总之，这些实施方案降低了经过较大反应室时所需的温育时间。在一些方面，反应室是100纳米或更小，例如，其在至少一个方向上包括50nm、25nm、20nm、15nm、10nm、9nm、8nm或7nm。
[58]在本发明的另一方面，本方法仅用嘌呤残基实施。此方法基于观察到在一些条件下，如此处的实施例所示，可以在比嘧啶残基高的灵敏度下检测嘌呤残基。对于靶核苷酸位点，本发明此方面的方法被实施两次，其中应用dATP和dGTP，每种加入一次，作为第一核苷酸和第二核苷酸。然后用第二反应室中固定的模板核酸分子的互补链重复本方法，其中再次应用dATP和dGTP，每种加入一次，作为第一核苷酸和第二核苷酸。根据本实施方案，仅用嘌呤核苷酸就可以确定靶位点处的任何核苷酸的发生情况。
[59]如图10所示，此处提供的方法可以在用于核酸测序的设备中，以多重分析来实施，所述设备例如微流体设备300，诸如微流体芯片，这本身形成了本发明的另一种实施方案。微流体芯片包含一系列试剂贮存器(reservior)，其典型地包含聚合酶贮存器150、缓冲液贮存器160、系列dTNP贮存器110、120、130、140、150、160和任选地引物或模板核酸分子贮存器155。在一些例子中，引物和/或模板核酸分子可以包含在芯片上。设备进一步包含混合室180，它和所述系列试剂贮存器存在流体交通，其中来自系列试剂贮存器的试剂在混合室180中混合，形成反应混合物。此外，设备包含一个或多个反应室190，其包含固定的模板核酸或固定的引物。一个或多个反应室190和混合室180存在流体交通。在某些方面，一个或多个反应室190的至少一个方向的尺寸小于100纳米，和/或一系列dNTP贮存器110、120、130、140、150、160仅包含嘌呤dNTP贮存器110、120。在进一步的方面，设备包含一组阀门210，用以控制dNTP贮存器110、120、140、150、160和反应室180之间的流动；引物或模板核酸分子贮存器155和反应室190之间的流动；和/或混合室180和反应室190之间的流动。
[60]在图10示例的设备中实施的本发明的方法包含，在反应室190中，使可检测数目的模板核酸分子和反应混合物接触，反应室190也称为温育室。反应混合物的组分包含在一系列贮存器中，所述贮存器包含任选的引物贮存器、聚合酶贮存器150、缓冲液贮存器160和一系列脱氧核苷酸(dNTP)贮存器，包括dATP贮存器110、dGTP贮存器120、dCTP贮存器130和dTTP贮存器140。反应混合物组分的流动是由一系列阀门210控制的。包含四种dNTP中的一种的反应混合物组分进入混合室180，从混合室180流入系列反应室190中的一个。每一反应室可以包含多拷贝的不同单链模板核酸分子，其固定在反应室表面。如上所述，反应室可以是微米级或纳米级的室，例如，在至少第一尺度上是100nm或更小。残余溶液室可以有用于SERS基质和LiCl溶液的供给管线(supply lines)(未显示)。可选地，在溶液进入废物管线(wasteline)(未显示)之前，可以有检测室。在检测室中，来自每一残余溶液室的残余溶液按顺序流动，和SERS基质及LiCl溶液混合，并被激光设备所检测。过量的溶液可以收集在残余溶液室200中并被引导通过废物管线170。图11示例了混合室180的可选设计，其中来自贮存器，包含dNTP贮存器110、120、130、140(未显示)和聚合酶贮存器150的试剂，在加入混合室180之前，流过一系列阀门210，和来自缓冲液贮存器160的缓冲液混合。在一些方面，使dNTPs和聚合酶在混合室中单独混合。
[61]在本发明的其它方面，dNTP贮存器仅包含嘌呤核苷三磷酸，例如dGTP和dATP。如此处所论述，仅用嘌呤残基，用本发明的微流体芯片的此方面，可以实施检测核苷酸发生的方法。
[62]在另一方面，设备的反应室和包括表面增强拉曼光谱(SERS)基质的SERS室存在流体交通。此外，设备可以是检测系统的一部分，所述检测系统包含拉曼光源和拉曼分光光度计，它们与SERS室基质存在光学和/或可操作的交通。在一些方面，拉曼光源和拉曼分光光度计被设计用于CARS分析。被设计用于CARS的拉曼光源和拉曼分光光度计是本领域已知的。
[63]如本领域已知和本文中更详细讨论的，光源典型地是激光。来自光源的光被投射在SERS基质上，SERS分光光度计中的检测单元检测来自反应后产物，如dNTPs或其切割产物、如游离的嘌呤或嘧啶碱基的拉曼信号。在本发明的一些方面，拉曼检测单元能够在单分子水平上检测至少一种核苷酸或碱基，如腺苷。此外，在一些方面，核苷酸流经反应室进入形成SERS室的通道。所述通道的内表面可以包含银、金、铂、铜或铝网孔。
[64]在另一种实施方案中，提供了测序核酸的方法，其包含，使一个或多个模板核酸分子与引物、核苷酸和聚合酶接触，形成反应混合物，从核苷酸合成一条或多条互补链，和用拉曼光谱检测核苷酸，其中互补链合成后反应混合物中核苷酸的浓度下降，表明该核苷酸被整合进互补链中。模板核酸序列是从整合进互补链的核苷酸确定的。
[65]在涉及确定靶位点处核苷酸发生情况的方法中，靶位点，例如，可以是多态性位点，如单核苷酸多态性(SNP)。多态性是群体中发生的等位基因变异。多态性可以是一个基因座中的单个核苷酸不同，或者可以是一个或几个核苷酸的插入或缺失。如此，单核苷酸多态性(SNP)的特征是，在基因组如人类基因组的特定基因座中，存在一种或两种、三种或四种核苷酸发生(即，腺苷、胞苷、鸟苷或胸苷)的群体。如此处所示，在一些方面，本发明的方法提供检测SNP位点处的核苷酸发生或检测二倍体生物体如哺乳动物的SNP位点处的两个基因组核苷酸发生。此外，可以确定单链反应中多于一个SNP位点，如2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多SNP位点处的核苷酸发生情况。例如，SNP位点可以是一群SNP位点。
[66]在一些方面，在如此处更详细讨论的，测定核苷酸浓度之前，从模板核酸分子分离出所述核苷酸。此外，在一些例子中，将单一种类的核苷酸同时暴露于模板。可选地，可以使所有四种类型的核苷酸同时暴露于模板。
[67]在一些例子中，将拉曼标记连接在每一核苷酸上，用以增强核苷酸的拉曼信号，如此处更详细论述。例如，可以使拉曼标记和所有核苷酸相连接，或者可以使拉曼标记仅和嘧啶核苷酸相连接。本发明的此方面涉及此处的实施例中提供的数据，其表明，在一些情况下，与嘌呤分子相比，需要更多的嘧啶分子达到检测限。
[68]可以重复该方法，直至确定2、3、4、5、10、15、20、25、50、100、150、250、500、1000、2000、2500、5000个核苷酸的核苷酸序列或全长模板核酸的核苷酸序列。在一些方面，方法包含，在任选地重复上面公开的接触、温育和检测步骤之前，清洗基质。为了确保在所有新生核酸分子中，核酸分子相邻位都加入了互补核苷酸，可以使一个或多个核酸分子和附加拷贝的3′核苷酸相接触。
[69]在某些方面，测定基质上固定的核酸量并测定反应混合物中含有的第一核苷酸的数目。如上所论述，可以用这些测定值来检测核苷酸重复。
[70]如此处所论述，在本发明的一些方面，用表面增强拉曼光谱(SERS)，根据第一核苷酸的测定值，确定第一核苷酸的反应后浓度。此外，在一些方面，在核苷酸和模板核酸接触之前，检测反应混合物中的所述核苷酸。在本发明的一些方面，用与模板核酸分子接触之前及之后的反应混合物的SERS谱来确定该核苷酸是否被整合进新生链。在这些方面中，通过比较反应后混合物中的核苷酸的拉曼信号和与模板核酸接触之前反应混合物中的核苷酸的拉曼信号，确定第一核苷酸的反应后浓度。
[71]在某些方面，反应混合物包含内部对照分子，如此处所论述。内部对照分子产生拉曼信号，所述信号可以和第一核苷酸产生的拉曼信号可检测地区分。在本发明应用内部对照的几个方面，通过比较反应后混合物中的核苷酸的拉曼信号和内部对照分子的拉曼信号，确定第一核苷酸的反应后浓度。
[72]在另一方面，提供了设备，设备包含反应室，用来含有和固定化表面连接的一个或多个核酸分子，和反应室流体交通的通道；以及与通道可操作连接的拉曼检测单元。在本发明的一些方面，拉曼检测单元能够在单分子水平上检测至少一种核苷酸或碱基，如dAMP或腺嘌呤。此外，在一些方面，核苷酸通过反应室流入通道。在一些实施方案中，设备包含通道中的银、金、铂、铜或铝网孔。
[73]提供了为核酸测序的方法，包含：使一个或多个模板核酸分子和核苷酸及聚合酶接触，形成反应混合物，和分析来自核苷酸的一条或多条互补链，其中随后用拉曼光谱测核苷酸的浓度。合成互补链之后反应混合物中的核苷酸浓度降低，表明该核苷酸被整合进互补链中。从整合进互补链的核苷酸确定出模板核酸序列。
[74]在一些方面，在测定核苷酸浓度之前，从模板核酸分子分离该核苷酸，如此处详细论述。此外，将单一种类的核苷酸同时暴露于模板。可选地，可以使四种类型的核苷酸同时暴露于模板。
[75]在另一种实施方案中，提供了设备，设备包含反应室，用来含有和固定化表面连接的一个或多个核酸分子，和反应室流体交通的通道，以及与通道可操作连接的拉曼检测单元。在本发明的一些方面，拉曼检测单元能够在单分子水平上检测至少一种核苷酸。此外，在一些方面，核苷酸通过反应室流入通道，通道中可以包含银、金、铂、铜或铝SERS基质。
[76]在另一种实施方案中，提供了确定一个或多个模板核酸的核苷酸序列的方法，其包含：使一个或多个模板核酸和反应混合物接触，反应混合物包含引物、聚合酶和起始浓度的第一核苷酸，以及用拉曼光谱检测反应后混合物中第一核苷酸的浓度，其中第一核苷酸的反应后浓度降低，表明该核苷酸被加在一个或多个新生核酸分子的3′末端。典型地，模板核酸或引物被固定在固体支持物上，同时模板核酸在反应混合物中被温育，形成反应后混合物和互补于模板核酸的至少一部分的一种或多种新生核酸分子。任选地用不同核苷酸重复上述方法，直至鉴定出一种或多种新生核酸分子的3′核苷酸，从而确定一种或多种核酸分子的核苷酸序列。
[77]在一些方面，在用拉曼光谱检测核苷酸之前，使核苷酸和拉曼标记，例如，荧光团或纳米颗粒连接。例如，可以用表面增强拉曼光谱(SERS)实施拉曼光谱术。
[78]在一些方面，在应用此处公开的方法检测模板核酸之前，从生物样品中分离模板核酸。生物样品是，例如，尿、血液、血浆、血清、唾液、精液、便、痰、脑脊髓液、泪液、粘液和类似物质。
[79]在另一种实施方案中，提供了确定模板核酸分子靶位点处核苷酸发生的方法，其包含：使模板核酸与反应混合物接触，形成反应后混合物，反应混合物包含引物、聚合酶和起始浓度的第一核苷酸，其中引物的3′核苷酸结合到邻近靶核苷酸位点处的模板核酸，以及用拉曼光谱检测反应后混合物中第一核苷酸的浓度，其中第一核苷酸的反应后浓度降低鉴定出延伸反应产物，并表明该核苷酸互补于靶位点处的核苷酸，从而鉴定靶位点处的核苷酸发生。典型地，或是将靶核酸分子或是将引物固定在基质上。任选地用不同核苷酸重复本方法，直至鉴定到核苷酸发生。
[80]在另一种实施方案中，提供了检测核苷酸、核苷或碱基的方法，其中所述核苷酸、核苷或碱基被沉积在包含金属纳米颗粒、金属涂覆纳米结构的基质上，或者包含铝的基质上，随后用激光束照射沉积的核苷酸、核苷或碱基，以及检测形成的拉曼散射。该检测方法用于，例如，此处公开的核酸测序方法中。
[81]在一些例子中，核苷酸、核苷或碱基被沉积在直径是约5和200nm之间的一个或多个银纳米颗粒上。例如，核苷酸、核苷或碱基被沉积在银纳米颗粒上。在这些方面，例如，核苷酸、核苷或碱基可以和碱金属卤化物盐及银纳米颗粒相接触。碱金属卤化物盐是，例如，氯化锂。在这些方面，例如，可以应用浓度是约50至约150微摩、约80至约100微摩、或约90微摩的氯化锂。
[82]在一些方面，核苷酸、核苷或碱基包含腺嘌呤，在一些例子中，检测单分子腺嘌呤。在一些例子中，碱基可以和拉曼标记相连接。
[83]在另一种实施方案中，提供了测序核酸的方法，其包含：获得一个或多个模板核酸分子，和向模板提供核苷酸和聚合酶，使得能够用核苷酸合成一条或多条互补链，以及用拉曼光谱测定核苷酸的浓度。模板核酸的序列是从整合进互补链的核苷酸确定出的。
[84]在另一种实施方案中，提供了设备，该设备包含反应室，反应室中含有与固定化表面连接的单个模板核酸分子或引物；与反应室流体交通的通道；以及与通道可操作连接的拉曼检测单元。
[85]应用本文提供的方法得到的序列信息可以在单轮测序过程中，使用单一核酸分子获得。或者，可以对核酸分子的多个拷贝同时或逐个地测序，以确认核酸序列或获得完整的序列数据。在其它可以选择的方式中，可以既对核酸分子又对其互补链测序，以确认序列信息的准确性。待测序的核酸可以是DNA，虽然包含RNA或合成的核苷酸类似物的核酸也可以被测序。
[86]可以将待测序的核酸共价或非共价地连接在一个表面上。可选地，可以通过非连接方法，如光捕获，将待测序的核酸限制在一定位置(参见，例如，Goodwin et al.，1996，Acc.Chem.Res.29：607-619；美国专利4,962,037；5,405,747；5,776,674；6，136,543；6,225,068.)。连接和对核酸的其它定位方法使得核苷酸能够被拉曼光谱检测，而没有来自核酸的背景信号。例如，可以提供连续或不连续的核苷酸流，用于核酸合成。可以在合成反应的上游或下游确定核苷酸的浓度。核苷酸浓度差异表明，该核苷酸已被整合进新合成的互补核酸链中。可选地，可以将核酸模板、引物和聚合酶限制在反应室的亚区室(subcompartment)中。可以布置拉曼检测器，用以检测反应室不同部分的核苷酸浓度，而不带有来自核酸、聚合酶和引物的背景信号。可以使核苷酸通过被动扩散或主动混合过程，在反应室的不同部分之间达到平衡。
[87]下面的详细描述含有许多细节，目的是为所要求保护的方法和设备提供更加充分的理解。然而，对本领域技术人员显而易见的是，在没有这些具体细节的情况下，可以实施这些设备和/或方法。在其它情况中，本领域熟知的那些设备、方法、过程和个别组分在这里未进行描述。
[88]图1图解说明了用于核酸测序的设备10的非限制性例子，其包含反应室11和拉曼检测单元12。反应室11含有连接于固定化表面14的核酸(模板)分子13和聚合酶15，如DNA聚合酶。使与模板分子13在序列上互补的引物分子16和模板分子13杂交。核苷酸17存在于反应室11中的溶液中。为了新生DNA链16的合成，核苷酸17可以包含脱氧腺苷-5′-三磷酸(dATP)、脱氧鸟苷-5′-三磷酸(dGTP)、脱氧胞苷-5′-三磷酸(dCTP)和/或脱氧胸苷-5′-三磷酸(dTTP)。这四种核苷酸17中的每一种可以同时在溶液中存在。可选地，可以将不同类型的核苷酸17相继加入反应室11。此外，可以应用其它核苷酸如尿苷-5′-三磷酸(UTP)，特别是在新生链是RNA分子时。也可以应用非天然核苷酸，如常规核酸测序中应用的那些。这些包含所有荧光染料标记的核苷酸(例如，Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、TAMRA、R6G(例如，可以从Applied Biosystems，Foster City，CA；或NEN Life ScienceProducts，Boston，MA得到)，它们可以在常规测序或标记反应中应用。这些染料可以被SERS或SECARS检测。
[89]为了引发测序反应，聚合酶15在某时刻将一个核苷酸分子17加入引物16的3′末端，延长引物分子16。由于引物分子16得到延伸，将其称为新生链16。对于每一轮延伸而言，单一的核苷酸17被整合进新生链16中。因为核苷酸17的整合是由与模板链13的Watson-Crick碱基对相互作用所决定的，生成的新生链16的序列将和模板链13的序列互补。在Watson-Crick碱基配对中，一条链上的腺苷(A)残基和另一条链上的胸苷(T)残基配对。相似地，一条链上的鸟苷(G)残基和另一条链上的胞苷(C)残基配对。因此，可以从新生链16的序列确定出模板链13的序列。
[90]图1图解说明了方法和设备10，其中反应室11中含有单个核酸分子13。可选地，单个反应室11中可以存在相同序列的两个或更多个模板核酸分子13。在反应室11中存在多于一个模板核酸13时，拉曼发射信号将反映反应室11中整合进所有新生链16的核苷酸17的均值。技术人员将能够用已知的分析技术，校正任何指定时间得到的合成反应的信号，所述时间落后于反应室11中发生的大多数反应或早于反应室11中发生的大多数反应。
[91]图1中图解说明的非限制性例子显示了欲被拉曼光谱检测的核苷酸17，其在与模板链13、引物16和聚合酶15相同的室11中。为了降低干扰拉曼信号，可以布置反应室11和检测单元12，以至于仅激发和检测核苷酸17。例如，可以将反应室11分成两部分，通过在表面14上固定，通过应用低分子量截止过滤器(cutoff filter)，通过光捕获或通过本领域中的其它已知方法，使模板13、引物16和聚合酶15限制在室11的一部分中(参见，例如，Goodwin等1996，Acc.Chem.Res.29：607-619；美国专利4,962,037；5,405,747；5,776,674；6,136,543；6,225,068.)。可以布置检测单元12，以至于仅激发反应室11第二部分中的核苷酸17，发射拉曼信号。可选地，可以使反应室11和流过系统(flow-through system)如微流体通道、微毛细管或纳米通道相连接。核苷酸17可以进入反应室11并被整合进新生链16。残留的未整合的核苷酸17可以流出反应室11进入第二通道，它们在第二通道中被拉曼光谱检测。通过连接、应用过滤器、光捕获或其它已知方法，模板13、引物16和聚合酶15可以被限制在反应室11中。由于核苷酸17是在与模板13、引物16和聚合酶15分开的室中被检测的，干扰拉曼信号得以最小化。通过进入反应室11和离开反应室11的核苷酸17的浓度差异，可以鉴定整合进新生链16的核苷酸17。在这种选择中，可以在反应室11之前或之后放置两个检测单元12。可选地，当进入反应室11的核苷酸17浓度已知时，可以在反应室11下游放置单个检测单元12，用以测定反应室11中存在的核苷酸17的浓度。
[92]技术人员会认识到，根据应用的聚合酶15的种类，新生链16可以含有一些百分数的错配碱基，其中新整合的碱基和模板13中的相应碱基不正确地以氢键连接。可以观察到至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％、至少99.9％或更高的准确性。已知一些聚合酶15有校正错误的活性(也称为3′核酸外切酶活性或校正活性)，该活性的作用是去除新整合的、与模板链13不正确地碱基配对的核苷酸17。在本公开的方法中，可以应用带有或不带有校正活性的聚合酶15。对于特定的用途，可以用具有最低可能错误率的聚合酶15。聚合酶15错误率是本领域已知的。
[93]检测单元12包含激发源18如激光和拉曼光谱检测器19。激发源18以激发光束20照射反应室11或通道。激发光束20和核苷酸17相互作用，导致电子被激发到较高能态。当电子回到较低能态时，其发射出可以被拉曼检测器19检测的拉曼发射信号。由于来自四种核苷酸17中每一种的拉曼发射信号可以被区分，检测单元12能够测定反应室11和/或通道中的每种核苷酸17的量。
[94]核苷酸17整合进生成的新生链16，使得反应室11中的核苷酸17被消耗。为了使合成反应继续，需要获得新的核苷酸17来源。此来源在图1中以分子分配器(molecule dispenser)21得到说明。分子分配器21可以是测序设备10的一部分，或者可以不是测序设备10的一部分。
[95]分子分配器21可以被设计成，以相等的量释放四种核苷酸17中的每一种，针对新生链16的合成速度进行校准。然而，核酸13不必要显示出A、T、G和C残基的均一分布。具体地，DNA分子13的某些区域可以富含AT或者富含GC，这取决于DNA13的来源种类和被测序的DNA分子13的具体区域。核苷酸17从分子分配器21的释放可以被控制，以至于相对恒定浓度的每种核苷酸17保持在反应室11中。
[96]可以从检测器19，如分光光度计或单色仪阵列收集数据，并将这些数据提供给信息处理和控制系统。信息处理和控制系统可以保存将特定的拉曼信号与具体的核苷酸17联系起来的数据库。信息处理和控制系统可以记录检测器19检测到的信号，并且可以使这些信号与已知核苷酸17的信号相关联。信息处理和控制系统也可以保存核苷酸17摄取的记录，其表明模板13的序列。信息处理和控制系统也可以实施本领域中已知的常规程序，如减去背景信号。
[97]当新生链16包含DNA时，模板链13可以是RNA或DNA。模板链13是RNA时，聚合酶15可以是反转录酶，其例子是本领域已知的。当模板链13是DNA分子时，聚合酶15可以是DNA聚合酶。
[98]可选地，新生链16可以是RNA分子。这需要聚合酶15是RNA聚合酶，其不需要引物16。然而，模板链13应该含有有效结合RNA聚合酶15并启动RNA新生链16转录的启动子序列。启动子序列的确切组成取决于应用的RNA聚合酶15的类型。最优化启动子序列，使得有效起始转录是本领域中的常规技术。本方法不受应用的模板分子13的类型、合成的新生链16的类型、或应用的聚合酶15的类型所限。事实上，能够支持与模板链13序列互补的核酸分子16合成的任何模板13和任何聚合酶15都可以应用。
[99]可以用拉曼标记对核苷酸17进行化学修饰。该标记可以具有独特的和高度可视的光学信号，对于每一种常规核苷酸17而言，该信号是可以区分的。标记也可以增强拉曼发射信号的强度，或者否则增强拉曼检测器19对核苷酸17的敏感度或特异性。可以在拉曼光谱中应用的标签分子(tag molecules)的非限制性例子公开于下。标记在拉曼光谱中的应用是本领域中已知的(例如，美国专利5,306,403和6,174,677)。技术人员将认识到，当拉曼标记结合到不同的核苷酸17时，其可以产生可区分的拉曼光谱，或者可以设计不同的标记，仅用来结合一种类型的核苷酸17。
[100]可以将模板分子13连接到表面14，如功能化的玻璃、硅、PDMS(聚二甲基硅氧烷)、银或其它金属涂覆的表面、石英、塑料、PTFE(聚四氟乙烯)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、乳胶、尼龙、硝化纤维、玻璃珠、磁珠或本领域中已知的其它任何物质，所述物质能够带有整合进其表面的官能基如氨基、羧基、硫醇、羟基或Diels-Alder反应物。
[101]官能基可以和交联剂共价连接，以使模板链13和聚合酶15之间可以发生结合作用，而没有空间位祖。典型的交联剂基团包含乙二醇寡聚物和二胺。连接可以是共价结合或非共价结合。将核酸分子13连接到表面14的多种方法是本领域已知的并且可以应用。
[102]如本文所应用，“一个(a)”或“一个(an)”可以指一个或多于一个的项目。
[103]“核酸(nucleic acid)”是指DNA、RNA，可以是单链的、双链或三链的以及它们的任何化学修饰形式。事实上，可以考虑核酸的任何修饰形式。“核酸”可以为几乎任何长度，它的碱基数可以是10、20、30、40、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、150,000、200,000、500,000、1,000,000、1,500,000、2,000,000、5,000,000或者甚至更多，直到全长染色体DNA分子。
[104]核苷(nucleoside)是包括嘌呤或嘧啶碱基的分子，这些碱基共价连接到戊糖如脱氧核糖、核糖或者戊糖的衍生物或类似物上。核苷酸(nucleotide)指进一步包括至少一个磷酸基团的核苷，该磷酸基团共价连接于戊糖上。考虑可在核苷酸结构上做出各种不同的取代或者修饰，只要它们仍然能够通过聚合酶整合进新生链。例如，核糖或脱氧核糖部分可以被别的戊糖或者戊糖类似物取代。磷酸基团可被各种基团取代，如膦酸、硫酸或磺酸。天然发生的嘌呤和嘧啶碱基可以被其它嘌呤或嘧啶或其类似物取代，只要整合进新生链的核苷酸序列反映模板链的序列即可。
[105]可以用本领域普通技术人员已知的任何技术制备模板分子。模板分子可以是天然发生的DNA或RNA分子，例如，染色体DNA或信使RNA(mRNA)。事实上，任何天然发生的核酸都可以制备并用本文公开的方法测序，包括但不限于染色体、线粒体或叶绿体DNA或核糖体、转运RNA、不均一核RNA或信使RNA。待测序的核酸可以从原核来源或真核来源获得，用本领域已知的标准方法得到。
[106]制备和分离多种形式的细胞核酸的方法是已知的(参见，例如，Guide to Molecular Cloning Techniques，eds.Berger and Ibmmel，Academic Press，New York，NY，1987；Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd Ed.，eds.Sambrook，Fritsch and Maniatis，Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。通常地，含有待测序核酸的细胞、组织或其它来源物质首先被匀浆，例如，在液氮中冷冻，随后在研钵中研棒研磨。可以用Waring搅拌机、Virtis匀浆器、Dounce匀浆器或其它匀浆器对一些组织进行匀浆。粗提的匀浆物可以用去污剂来萃取，如十二烷基硫酸钠(SDS)、Triton X-100、CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)-二甲氨基]-1-丙磺酸)、辛基葡糖苷或本领域已知的其它去污剂。可选地或附加地，可以用离液剂如异硫氰酸胍，或有机溶剂如酚进行萃取。也可以用蛋白酶处理来降解细胞蛋白，如应用蛋白酶K。通过离心或超速离心，可以去除颗粒污染物(例如，10至30分钟，在约5,000至10,000xg下，或30至60分钟，在约50,000至100,000xg下)。针对低离子强度含水缓冲液的透析对于去除盐或其它可溶污染物是有用的。通过在-20℃加入乙醇，或通过加入乙酸钠(pH 6.5，约0.3M)和0.8倍体积的2-丙醇，可以使核酸沉淀出来。沉淀出的核酸可以通过离心被收集，或者对染色体DNA而言，通过使沉淀出的DNA缠绕在玻璃移液管或其它探针上而得以收集。
[107]技术人员将认识到，上面列举的方法仅是示范性的，根据待测序的核酸的具体类型，可以应用许多变化。例如，线粒体DNA通常是应用阶段梯度，经氯化铯密度梯度离心制备的，而mRNA通常是用商业来源的制备柱如Promega(Madison，WI)或(Palo Alto，CA)的制备柱制备的。这些变化是本领域已知的。
[108]技术人员将认识到，根据欲制备的模板核酸的类型，可以应用多种核酸酶抑制剂。例如，经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理，可以去除大体积溶液中的RNA酶污染，而商业上得到的核酸酶抑制剂可以从常规来源如Promega(Madison，WI)或BRL(Gaithersburg，MD)得到。在使用之前，纯化的核酸可以被溶解在含水缓冲液如TE(Tris-EDTA)(乙二胺四乙酸)中并保存在-20℃或液氮中。
[109]在要对单链DNA(ssDNA)测序的情况下，ssDNA可以经常规方法从双链DNA(dsDNA)制得。最简单地，可以将dsDNA加热到高于其退火温度，在这个温度下，其自发地分解为ssDNA。典型的条件可能涉及，在92至95℃加热5分钟或更长时间。确定分离dsDNA条件的方法是本领域已知的，例如，根据GC含量和分子长度。可选地，应用仅与双链中的一条链结合的引物，通过本领域已知的常规扩增技术，可以从双链DNA制备出单链DNA。制备单链DNA的其它方法是本领域中已知的，例如，通过使待测序的双链核酸插入复制形式的类噬菌体M13，并使该噬菌体产生单链拷贝的模板。
[110]事实上，可以作为RNA或DNA聚合酶模板的任何种类的核酸都可以潜在地被测序。例如，通过多种扩增技术，如聚合酶链式反应(PCR)扩增制备的核酸，可以被测序(参见，美国专利4,683,195、4,683,202和4,800,159)。可选地，可以在常规的载体如质粒、粘粒、BACs(细菌人工染色体)或YACs(酵母人工染色体)中对待测序的核酸进行克隆(参见，例如，Berger and Kimmel，1987；Sambrook等1989.)核酸插入物可以从载体DNA中分离出来，例如，用合适的限制性内切酶进行切割，随后进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色。选出的按大小分级的核酸可以从凝胶中移除，例如，应用低熔点琼脂糖或从凝胶片中电洗脱。插入分离物的方法是本领域普通技术人员已知的。
[111]在一些方面，待测序的核酸可以是单分子ssDNA或ssRNA。对于包含少数(例如，1000个分子或更少)核酸模板的方面，可以包含使核酸与反应容器及基质表面的结合最小化的过程，如向表面加入负电荷(参见，例如，Braslavsky等，Proc.100：3960-3964，2003)。
[112]选择和操作单个ssDNA或ssRNA分子的各种方法都可以被应用，例如，流体动力学聚焦(hydrodynamic focusing)、微操纵器偶联(micro-manipulator coupling)、光捕获或这些方法的组合和类似的方法。(见，例如，Goodwin等，1996，Acc.Chem.Res.29：607-619；美国专利4,962,037；5,405,747；5,776,674；6,136,543；6,225,068.)。
[113]在本发明的特定实施方案中，本方法和设备适用于获得非常长的核酸分子的序列，所述核酸分子的碱基数目大于1,000、大于2,000、大于5,000、大于10,000、大于20,000、大于50,000、大于100,000或者甚至更多。然而，在一些实施方案中，本方法和设备提供了较短核酸分子的序列，所述核酸分子的长度是500、400、300、200、150、100、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸。此较短的核酸分子可以直接从样品分离，或者可以通过处理较长核酸分子而得到。
[114]可以应用微流体学或超微流体学(nanofluidics)来分选和分离核酸分子。可以运用流体动力学来操纵核酸的运动，使其进入微通道、微毛细管或微孔。可以使用流体动力来移动核酸分子通过一个梳状结构，从而分离出单个核酸分子。一旦核酸分子被分离开，就可以使用流力聚焦(hydrodynamic focusing)将这些分子定位。热学或电学上的势差、压力或真空也都可用来提供操作核酸所需的驱动力。为了测序而对核酸进行的操作可以涉及到使用通道砌块(channel block)设计，它整合了微加工出的通道和一体化的胶质材料，如在美国专利5,867,266和6,214,246中公开的。
[115]可选地，含有核酸分子的样品可以在偶联到固定化表面之前被稀释。固定化表面可以是磁性或非磁性珠子(bead)的形式，或是其他离散的结构单元。经过适当的稀释，每个珠子将具有结合零个或一个核酸分子的统计概率。连接有一个核酸分子的珠子可以用例如荧光染料和流式细胞仪筛选或磁性筛选来鉴定。取决于珠子和核酸的相对大小和均一性，使用磁滤器和质量分离法来分离含有单个结合核酸分子的珠子是可能的。在其它选择中，连接到单个珠子或其他固定化表面的多个核酸可以被测序。
[116]在进一步的选择中，可以用有包被的纤维探头(coated fiber tip)，产生用于测序的单个核酸分子(例如，美国专利6,225,068)。可以制备含有抗生物素蛋白或其他交联剂的单个分子的固定化表面。这样的表面能够连接单个生物素化引物，其反过来可以和待测序的单个模板核酸分子杂交。这不限于抗生物素蛋白-生物素结合体系，而是可以适用于本领域任何已知的偶联体系。
[117]在其它可选方案中，可以使用光捕获来操纵用于测序的单分子核酸模板。(例如，美国专利5,776,674)。示例性的光捕获系统可以通过商业渠道从Cell Robotics，Inc.(Albuquerque，NM)、S+L GmbH(Heidelberg，Germany)和P.A.L.M Gmbh(Wolfratshausen，Germany)获得。
[118]要被测序的核酸分子可以被附着于固体表面(或固定化)。核酸分子的固定化可以通过多种方法来实现，其涉及核酸分子和表面之间的非共价或共价连接。例如，固定化可以通过这样的方法完成，即用链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包覆表面，并随后进行生物素化多核苷酸的连接(Holmstrom等，Anal.Biochem.209：278-283，1993)。固定化亦可这样实现，即用聚L-Lys(赖氨酸)包覆硅、玻璃或其他表面，接着用双功能交联剂共价连接氨基或巯基修饰的核酸(Running等，BioTechniques 8：276-277，1990；Newton等，Nucleic Acids Res.21：1155-62，1993)。通过使用用于交联的氨基硅烷，可以将胺基残基引入到表面上。
[119]可以将5′-磷酸化核酸直接共价连接到化学修饰的表面，从而实现固定化(Rasmussen等，Anal.Biochem.198：138-142，1991)。核酸与表面之间的共价键通过与水溶性碳二亚胺的缩合而形成。这种方法有助于核酸通过其5′-磷酸进行主要的5′-连接。
[120]要将DNA结合到玻璃上，通常要先对玻璃表面进行硅烷化，然后用碳二亚胺或戊二醛活化。可选择的步骤可以使用的试剂例如3-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(GOP)或氨丙基三甲氧基硅烷(APTS)，DNA通过整合到分子的3′或5′端的氨基连接子来联接。使用紫外辐射可以将DNA直接结合到膜表面。核酸固定化技术的其他非限制性实例公开在美国专利5,610,287、5,776,674和6,225,068。
[121]用于核酸固定化的表面的类型没有限制。该固定化表面可以是磁珠、非磁性珠、平表面、尖锐的表面或者任何其它构型的固体表面，它们可以包含几乎任何材料，只要该材料足够耐用和有足够的惰性以允许核酸测序反应发生。可被使用的表面的非限制性的例子包括玻璃、硅石、硅酸盐、PDMS、银或其它金属涂覆的表面、硝化纤维、尼龙，活化的石英、活化的玻璃、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺，其它聚合物，诸如聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、或聚二甲基硅氧烷，以及光聚合物，其含有光活性物质如氮宾、卡宾和能与核酸分子形成共价连接的羰自由基(参见美国专利申请5,405,766和5,986,076)。
[122]双功能交联剂可以用来将核酸分子连接到表面。可以根据双功能交联剂的功能基团特异性，例如氨基、胍基、吲哚或羧基特异性基团来划分它们。其中，涉及自由氨基基团的试剂是受欢迎的，因为它们可以通过商业途径获得、易于合成并且其可应用的反应条件温和。用于交联分子的示范性的方法在美国专利5,603,872和5,401,511中公开。交联剂包括戊二醛(GAD)、双功能环氧乙烷(OXR)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)和碳二亚胺如1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)。
[123]在一些方法中，测序反应涉及将聚合酶如DNA聚合酶结合到引物分子以及催化将核苷酸添加到该引物的3′末端。潜在应用的聚合酶的非限定性例子包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶和RNA依赖型RNA聚合酶。关于这些聚合酶在“校正”活性以及要求或不要求引物和启动子序列方面的差别在本文中讨论并且是本领域已知的。当应用RNA聚合酶时，要测序的模板分子可以是双链DNA。由于整合了错配核苷酸而造成的错误可以被纠正，例如，对原始模板的两条链测序，或者对多拷贝的相同链测序。
[124]可以应用的聚合酶的非限定性例子包括海栖热袍菌(Thermatoga maritima)DNA聚合酶、AmplitaqFS3 DNA聚合酶、Taquenase3 DNA聚合酶、ThermoSequenase3、Taq DNA聚合酶、Qbeta3复制酶、T4 DNA聚合酶、嗜热菌(Thermus thermophilus)DNA聚合酶、RNA依赖型RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。
[125]许多聚合酶可以通过商业途径获得，包括来自BoehringerMannheim Biochemicals(Indianapolis，TN)的Pwo DNA聚合酶；来自Bio-Rad Laboratories(Hercules，CA)的Bst聚合酶；来自EpicentreTechnologies(Madison，WI)的IsoTherm3 DNA聚合酶；莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶，Pfu DNA聚合酶，禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶，黄色栖热菌(Thermus flavus(Tfl))DNA聚合酶和热球菌(Thermococcuslitoralis(Tli))DNA聚合酶，来自Promega(Madison，WI)；RAV2逆转录酶，HIV-1逆转录酶，T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶，SP6 RNA聚合酶，大肠杆菌(E.coli)RNA聚合酶，水生栖热菌(Thermosaquaticus)DNA聚合酶，T7 DNA聚合酶+/-3′→3 5′外切核酸酶，DNA聚合酶I的Klenow片段，‘普遍存在’栖热菌(Thermus′ubiquitous′)DNA聚合酶以及DNA聚合酶I，来自Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)。然而，可以使用用于模板依赖性的核苷酸聚合的本领域已知的任何聚合酶。(参见，例如，Goodman和Tippin，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.1(2)：101-9，2000；美国专利6,090,589。)
[126]技术人员将认识到，聚合酶活性速率可以被控制以与检测单元进行的核苷酸分析的最佳速率相匹配。已知多种调整聚合酶活性速率的方法，包括调整反应室中的温度、压力、pH、盐浓度、二价阳离子浓度、或核苷酸的浓度。聚合酶活性的优化方法为本领域普通技术人员已知。
[127]可以通过本领域已知的任何方法得到引物。一般地，引物的长度在10到20个碱基之间，虽然可以使用更长的引物。引物可以被设计为，在序列上与模板核酸分子的已知部分互补，其也可以靠近模板与固定化表面的结合位点。任何序列的引物的合成方法是已知的，例如，应用自动化核酸合成仪，用亚磷酰胺化学方法合成，这种仪器可以从常规的来源得到，如Applied Biosystems(Foster City，CA)。
[128]其它方法涉及，在不存在已知引物结合位点的情况下对核酸进行测序。在这种情况下，可能应用随机引物如随机六聚体或7、8、9、10、11、12、13、14、15个碱基或更长长度的随机寡聚体，用来引发新生链的聚合。在合成反应开始之前，可以去除未杂交的引物。
[129]未杂交引物的去除，可以通过例如，应用包覆有结合剂，如链霉抗生物素蛋白的固定化表面来实现。互补的结合剂如抗生物素蛋白，可以被连接在模板核酸的5′末端，模板分子可以被固定在固定化表面上。使引物和模板之间发生杂交之后，可以去除不与固定化表面结合的那些引物分子。仅仅是和模板链杂交的那些引物作为用于模板依赖性DNA合成的引物。在其它可选实施方案中，可以将多个引物分子结合在固定化表面上。可以加入模板分子并使其和互补引物氢键结合。随后，模板依赖型聚合酶可以起到引发新生链合成的作用。
[130]可以应用其它类型的交联剂，选择性地对每个模板链仅保留一个引物，如可光活化的交联剂。如上所论述，在本领域中已知许多交联剂并且可以应用它们。也可以通过连接臂(linker arm)将交联剂连接在固定化表面上，以避免与固定化表面产生空间位阻的可能性，所述空间位阻干扰引物和模板之间的氢键结合。
[131]一些方法可以涉及将标记整合进核苷酸，用来协助检测单元对它们的测定。拉曼标记可以是能够产生可检测拉曼信号的任何有机或无机分子、原子、复合物或结构，包括但不限于合成分子、染料、天然发生的色素如藻红蛋白、有机纳米结构如C60、巴基球(buckyball)和碳纳米管，金属纳米结构如金或银纳米颗粒或纳米菱镜(nanoprism)以及纳米尺寸半导体如量子点。下面公开了拉曼标记的大量例子。技术人员将认识到，这些例子不是限制性的，拉曼标记包括本领域已知的可用拉曼光谱术检测的任何有机或无机原子、分子、化合物或结构。
[132]可以用于拉曼光谱术的标记的非限定性例子包括TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、NBD(7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑)、德克萨斯红染料、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、藻红、生物素、地高辛、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、偶氮甲碱(azomethine)、花菁、黄嘌呤、琥珀酰荧光素以及氨基吖啶。多环芳香化合物通常可用作拉曼标记，正如本领域已知的。这些以及其它拉曼标记可以从商业来源获得(例如，Molecular Probes，Eugene，OR)。
[133]其它可以使用的标记包括氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷和硫。碳纳米管也可用作拉曼标记。标记在拉曼光谱术中的用法是已知的(例如美国专利5,306,403和6,174,677)。技术人员将会意识到，当拉曼标记结合于不同类型的核苷酸时，其应该产生可区分的拉曼光谱。
[134]标记可以直接与核苷酸连接或者通过各种连接化合物与之连接。可选地，与拉曼标记共价连接的核苷酸前体可以从标准商业来源得到(例如，Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN；PromegaCorp.，Madison，WI；Ambion，Inc.，Austin，TX；Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)。含有被设计为可以与其它分子如核苷酸共价反应的活性基团的拉曼标记是商业上可获得的(例如，MolecularProbes，Eugene，OR)。制备标记的核苷酸以及将它们整合进核酸的方法是已知的(例如美国专利4,962,037；5,405,747；6,136,543；6,210,896)。在一些方面，拉曼标记被连接到嘧啶核苷酸上。
[135]本文提供的设备包含通道。在一些方面，核苷酸的浓度是通过它们流经通道时的拉曼光谱测定的。在一些方面，通道包含银、金、铂、铜或铝网孔。通道是，例如，微流体通道、微通道、微毛细管或纳米通道。此外，在一些例子中，反应室和通道被整合入单个芯片中。
[136]在一些例子中，设备进一步包含通道中的金属纳米颗粒。在本发明的一些方面，纳米颗粒流过通道。在一些方面，通道的直径是约5、10、20、25、30、40、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275和300微米。例如，通道的直径是，直径在约100和约200微米之间。在其它方面，通道是圆的。
[137]本文提供的一种设备典型地包含反应室。可以将反应室设计为在水环境中保持固定化表面、核酸模板、引物、聚合酶和/或核苷酸。反应室可以被设计为温度可控的，例如通过结合佩尔帖元件(Pelletierelement)或者本领域已知的其它方法。控制用于核酸聚合的小体积液体的温度的方法是本领域已知的。(参见，例如美国专利5,038,853、5,919,622、6,054,263和6,180,372)。
[138]可以用计算机芯片制造或微毛细管芯片制造领域已知的批制造方法，制造反应室和任何相关的流体通道，例如，提供与分子分配器、检测单元、废物口(waste port)、进料口(loading port)、或核苷酸来源的连接的流体通道。可以将反应室和设备的其它部件制造为单个的集成芯片。这样的芯片可以使用本领域已知的方法来制造，诸如通过光刻法(photolithography)和蚀刻法(etching)、激光烧蚀法(laserablation)、注塑(iniection molding)、铸造法(casting)、分子束外延(molecular beam epitaxy)、蘸水笔纳米光刻术(dip-pennanolithography)、化学气相沉积(chemical vapor deposition，CVD)制造、电子束或聚焦离子束技术(electron beam or focused ion beamtechnology)或压印技术(imprinting techniques)。非限制性例子包括用可流动的、光学上透明的材料诸如塑料或玻璃进行的传统的模塑；二氧化硅的光刻蚀和干刻蚀(dry etching)；电子束光刻(electron beamlithography)，其使用聚甲基丙烯酸甲酯抗蚀剂在二氧化硅衬底上进行铝掩模构图，然后进行活性离子蚀刻(reactive ion etching)。根据Anderson等(″Fabrication of topologically complex three-dimensionalmicrofluidic systems in PDMS by rapid prototyping，″Anal.Chem.72：3158-3164，2000)，可以通过模塑聚二甲基硅氧烷(PDMS)制造微流体通道。可使用用于制造纳米机电系统(nanoelectromechanicalsystem)的方法。(参见，例如Craighead，Science 290：1532-36，2000.)。微加工的芯片(microfabricated chip)是可通过商业途径获得的，其来源诸如Caliper Technologies Inc.(Mountain View，CA)和ACLARABioSciences Inc.(Mountain View，CA)。
[139]已知用于集成芯片的任何材料都可用在本公开的设备中，其包括硅、二氧化硅、氮化硅、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、塑料、玻璃、石英等等。设备的部分或者全部可以被选择为，对于拉曼光谱术所使用的激发和发射频率处的电磁辐射是可透过的，诸如玻璃、硅或者石英或者其它任何光学透明材料。对于可能暴露于核酸和/或核苷酸的充满流体的部分(compartments)，诸如反应室、微流体通道和纳米通道或微通道，暴露于这些分子的表面可以通过涂覆来修饰，例如将表面从疏水性表面转变成亲水性表面以及/或者减少表面对分子的吸附。普通芯片材料诸如玻璃、硅和/或石英的表面修饰为本领域已知(例如，美国专利6,263,286)。这些修饰可以包括但不仅限于涂覆以可通过商业途径获得的毛细涂料(Supelco，Bellafonte，PA)、具有各种官能团诸如聚环氧乙烷或丙烯酰胺的硅烷，或者其它任何为本领域已知的涂料。
[140]待检测的核苷酸可以沿微流体通道、纳米通道或微通道被移动。微通道或纳米通道的直径可以介于约3nm和约1μm之间。该通道的直径可以被选为稍小于激发激光束(excitatory laser beam)的尺寸。通道可包含微毛细管(可从例如ACLARA BioSciences Inc.，Mountain View，CA获得)或者液体集成线路(liquid integrated circuit)(例如，CaliperTechnologies Inc.，Mountain View，CA)。这样的微流体平台仅仅需要纳升体积的样品。通过溶剂的整体流动(bulk flow)、电渗透或者本领域所知的其它任何技术，核苷酸可沿着微流体通道移动。
[141]可选地，可利用微毛细管电泳来运输核苷酸。微毛细管电泳一般涉及使用细的毛细管或通道，其可以充满或者不充满特定的分离介质。带有适当电荷的分子物质例如带负电荷的核苷酸，响应于施加的电场而发生电泳。尽管电泳通常是被用来将同时加进微毛细管的成分的混合物按大小分开，但它也可以被用来运送连续地从核酸分子释放的尺寸相似的核苷酸。因为嘌呤核苷酸比嘧啶核苷酸大并且因此会更慢地迁移，所以可以将各个通道的长度以及相应的通过检测器的通行时间保持为最小，以防止有差异的迁移将核苷酸的顺序弄混。可选地，填充微毛细管中的分离介质可以被选择，以便嘌呤和嘧啶核苷酸的迁移速率相似或相同。微毛细管电泳的方法已被公开，例如被Wolley和Mathies公开(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11348-352，1994)。
[142]包括微毛细管电泳设备在内的微流体设备的微细加工已经被讨论，例如Jacobsen等(Anal.Biochem，209：278-283，1994)；Effenhauser等(Anal.Chem.66：2949-2953，1994)；Harrison等(Science 261：895-897，1993)和美国专利5,904,824。一般地，这些方法包含在二氧化硅、硅或其它晶体基材或芯片上进行微米级通道的照相平版印刷蚀刻(photolithographic etching)，它们可以被容易地调整以在本公开的方法和设备中使用。直径更小的通道，诸如纳米通道，可以通过已知的方法制备，诸如涂覆微通道的内壁以使直径更窄，或者使用纳米光刻术(nanolithography)、聚焦电子束、聚焦离子束或聚焦原子激光技术。
[143]纳米通道的制造可利用，例如，使用高通量电子束光刻系统(high-throughput electron-beam lithography system)来制造。电子束光刻可用来在硅芯片上写出像5纳米那么小的特征。灵敏性抗蚀剂诸如聚甲基丙烯酸甲酯被涂布于硅的表面，可以不使用掩模而形成图案。电子束阵列可以与具有微通道放大器的场发射簇(field emitter cluster)结合，以增加电子束的稳定性，允许在低电流下的操作。SoftMask3计算机控制系统可以被用来控制在硅或者其它芯片上的纳米级特征的电子束光刻。
[144]可选地，纳米通道可以使用聚焦原子激光(focused atom laser)来制造。(例如，Bloch等，“Optics with an atom laser beam，”Phy.Rev.Lett.87：123-321，2001.)。聚焦原子激光可以被用于光刻法(lithography)，这很像标准激光或者聚焦电子束。这样的技术可以在芯片上制造出微米级或甚至纳米级的结构。蘸水笔纳米光刻也可以被用来形成纳米通道。(例如，Ivanisevic等，”’Dip-pen’Nanolithography on SemiconductorSurfaces，”J.Am.Chem.Soc.，123：7887-7889，2001.)蘸水笔纳米光刻使用原子力显微术(atomic force microscopy)在表面诸如硅芯片上沉积分子。尺寸上像15纳米那么小的特征都可以被形成，具有10纳米的空间分辨率。使用蘸水笔纳米光刻，结合常规的光刻(photolithography)技术，可形成纳米级通道。例如，抗蚀剂层上的微米级的线可以用标准的光刻术来形成。使用蘸水笔纳米光刻，可以通过在抗蚀剂的边缘沉积额外的抗蚀剂化合物来使线的宽度(以及蚀刻之后通道的对应直径)变窄。蚀刻更窄的线之后，可形成纳米级的通道。可选地，可用原子力显微术移除光致抗蚀剂(photoresist)以形成纳米级的特征。
[145]离子束光刻可被用来在芯片上制造纳米通道。(例如，Siegel，”Ion Beam Lithography，”VLSI Electronics，Microstructure Science，Vol.16，Einspruch and Watts eds.，Academic Press，New York，1987.)精细聚焦的离子束可被用来直接在抗蚀剂层上写出痕迹诸如纳米通道而不使用掩模。可选地，宽的离子束可以与掩模结合使用以形成小至100纳米级别的痕迹。化学蚀刻，例如氢氟酸蚀刻，可以用来移除未被抗蚀剂保护的暴露的硅。技术人员将会意识到上面公开的技术并不是限制，纳米通道可以使用本领域所知的任何方法来形成。
[146]在非限制性例子中，将Borofloat玻璃晶片(Precision Glass &Opitics，Santa Ana，CA)在浓HF(氢氟酸)中预蚀刻一小段时间，进行清洗，然后在等离子体增强化学气相沉积(PECVD)系统(PEII-A，Technics West，San Jose，CA)中沉积无定形硅牺牲层。晶片可以用六甲基二硅氮烷(HMDS)涂底，然后用光刻胶(Shipley 1818，Marlborough，MA)旋涂并烘烤软化。使用接触掩模对准器(Quintel Corp.San Jose，CA)将光刻胶层暴露于一种或多种掩模图案，然后将暴露的光刻胶用Microposit显影剂浓缩物(Shipley)和水的混合物除去。显影的晶片可以被烘烤硬化，然后在PECVD反应器中用CF4(四氟化碳)除去暴露的无定形硅。可以用浓HF对晶片进行化学蚀刻以制造出反应室和任何通道。剥去剩余的光刻胶，并除去无定形硅。
[147]用金刚石打孔钻头(Crystalite，Westerville，OH)在蚀刻的晶片上钻出接通孔(access holes)。在可程控的真空炉(Centurion VPM，J.M.Ney，Yucaipa，CA)中，将蚀刻和钻孔平板和相同尺寸的扁平晶片热结合，制得最终的芯片。可选地，可以通过相互结合两个蚀刻平板制造芯片。制造反应室芯片的可选的示范性制造方法在美国专利5,867,266和6,214,246中公开。
[148]在一些方面，本文提供的设备包含分子分配器。分子分配器可以被设计为，释放核苷酸进入反应室。分子分配器可以释放等量的每种核苷酸。可以用单个分子分配器释放所有四种核苷酸进入反应室。可选地，四种核苷酸的释放速率可以被独立控制，例如，用多个分子分配器，每一分子分配器释放单一类型的核苷酸。在一些方法中，单一类型的核苷酸可以被一次释放入室中。可选地，所有四种核苷酸可以同时存在于反应室中。
[149]分子分配器可以是泵装置(pumping device)的形式。可以使用的泵装置包含本领域已知的许多微加工泵(micromachined pumps)。例如，具有膨胀膜(bulging diaphragm)、由压电组(piezoelectric stack)和两个止回阀(check valves)驱动的泵公开在美国专利5,277,556、5,271,724和5,171,132中。由热力气动组件(thermopneumatic element)驱动的泵公开在美国专利5,126,022中。应用一串多个膜的压电蠕动泵(Piezoelectric peristaltic pumps)或由施加电压驱动的蠕动泵公开在美国专利5,705,018中。出版的PCT申请No.WO 94/05414公开了应用兰姆波泵(lamb-wave pump)在微米级通道中输送流体。技术人员将认识到，分子分配器不限于本文公开的泵，而是可以包含本领域已知的精确分配极低量流体的任何设计。
[150]分子分配器可以采用电流体动力泵(electrohydrodynamic pump)的形式(例如，Richter等，Sensors and Actuators 29：159-165 1991；美国专利5,126,022)。典型地，这种泵应用布置在通道或反应室/泵室的一个表面上的一系列电极。在电极之间施加电场使得样品中的带电物质电泳运动。铟-锡氧化物膜特别适于在衬底表面，例如玻璃或硅衬底表面进行电极构图。也可以用这些方法将核苷酸引入反应室。例如，可以将电极构图在分子分配器的表面上，并用合适的官能基修饰，用于将核苷酸接合在电极表面。在分子分配器表面的电极以及相对的电极(opposing electrode)之间施加电流，使得核苷酸电泳运动进入反应室。
[151]检测单元可以被设计用来通过拉曼光谱术检测和/或量化核苷酸。用拉曼光谱术检测核苷酸的各种方法为本领域已知。(参见，例如美国专利5,306,403；6,002,471；6,174,677)。表面增强拉曼光谱术(SERS)或表面增强共振拉曼光谱术(SERRS)中的变化已经被公开。在SERS和SERRS中，对于吸附于粗糙金属表面诸如银、金、铂、铜或铝表面、或纳米结构表面的分子，拉曼检测的灵敏度被增强的系数为106或更多。
[152]检测单元的非限制性例子公开于美国专利6,002,471中。在此实施方案中，激发光束可以由钕:钇铝石榴石(Nd:YAG)激光器产生，波长为532nm；或者由频率加倍的钛:蓝宝石(Ti:sapphire)激光器产生，波长为365nm。然而，激发波长可以变化很大，而不限制本发明的方法。例如，如此处的例子中所示，在一些方面，激发光束输送的波长是约750nm至约900nm之间。可以使用脉冲激光束或连续激光束。激发光束可以经过共聚焦光学元件和显微物镜，并且聚焦在反应室上。来自核苷酸的拉曼发射光由显微物镜和共聚焦光学元件收集，然后连到单色仪上进行光谱分离。共聚焦光学元件用于降低背景信号，包括双色滤片、二次滤片、共聚焦孔、透镜和平面镜。标准的全视场光学元件可以同共聚焦光学元件一起使用。拉曼发射信号可以由拉曼检测器检测。检测器包括与用于信号计数和数字化的计算机相连接的雪崩光电二极管。在一些实施方案中，反应室或通道中可以包括含有银、金、铂、铜或铝的网孔，用以提供由于表面增强拉曼或表面增强拉曼共振形成的增强信号。可选地，可以包括含有拉曼活性金属的纳米颗粒。
[153]检测单元的可选实施方案被公开例如在美国专利5,306,403中，其包括Spex Model 1403双栅分光光度计，并配有砷化镓光电倍增管(RCA Model C31034或Burle Industries Model C3103402)，它以单光子计数模式运作。激发源是来自SpectraPhysics的514.5nm线氩离子激光器，Model 166和氪离子激光器(Innova 70，Coherent)的647.1nm线。
[154]可选择的激发源包括337nm的氮激光器(Laser Science Inc.)和325nm的氦-镉激光器(Liconox)(美国专利6,174,677)。激发光束可以用带通滤波器(Corion)进行光谱纯化，并可以用6×物镜(Newport，Model L6X)聚焦到反应室。可以用物镜来激发核苷酸和收集拉曼信号，其中使用全息光束分离器(Kaiser Optical Systems，Inc.，Model HB647-26N18)，以产生激发光束和发射的拉曼信号的直角几何关系。可以使用全息陷波滤波器(Kaiser Optical Systems，Inc.)来减少瑞利散射。可选择的拉曼检测器包括ISA HR-320摄谱仪，其装配有红增强放大电荷耦合器件(RE-ICCD)检测系统(Princeton Instruments)。可以使用其他类型的检测器，如电荷注入器件、光电二极管阵列或光电晶体管阵列。
[155]本领域已知的任何适当形式或结构的拉曼光谱术或相关技术都可以用来检测核苷酸，包括但不限于常规拉曼散射、共振拉曼散射(resonance Raman scattering)、表面增强拉曼散射(surface enhancedRaman scattering)、表面增强共振拉曼散射(surface enhanced resonanceRaman scattering)、相干反斯托克斯拉曼光谱术(CARS)、受激拉曼散射术(stimulated Raman scattering)、逆转拉曼光谱术(inverse Ramanspectroscopy)、受激增益拉曼光谱术(stimulated gain Ramanspectroscopy)、超拉曼散射(hyper-Raman scattering)、分子光学激光检测器(molecular optical laser examiner，MOLE)或拉曼显微探针(Ramanmicroprobe)或拉曼显微镜(Raman microscopy)或共聚焦拉曼微光谱测定法(confocal Raman microspectrometry)、三维或扫描拉曼(three-dimensional or scanning Raman)、拉曼饱和光谱术(Ramansaturation spectroscopy)、时间分辨共振拉曼(time resolved resonanceRaman)、拉曼退耦光谱术(Raman decoupling spectroscopy)或紫外-拉曼显微术(UV-Raman microscopy)。
[156]在本文提供的实施方案中，根据待检测的具体核苷酸、核苷、或碱基，可以检测不同数目的分子。典型地，与嘧啶相反，可以检测出较少分子数的嘌呤，与核苷酸相比，可以检测出较少分子数的碱基。例如，当核苷酸、核苷或碱基包含腺嘌呤时，可以检测10个或更少、5个或更少、或1个分子的核苷酸、核苷或碱基。
[157]在核苷酸、核苷或碱基包含鸟嘌呤的例子中，例如，约50到约100分子，诸如，约60分子的鸟嘌呤碱基被检测。在核苷酸、核苷或碱基包含胞嘧啶的例子中，约1000到约10000分子，例如，约5000和7000个分子可以被检测。在核苷酸、核苷或碱基包含胸腺嘧啶的例子中，例如，约1000到10000之间，更具体地，例如，约5000至约7000个分子可以被检测。
[158]在一些实施方案中，提供了试剂盒，其包含所需的探针、核苷酸、核苷、靶分子、酶和/或其它分子及试剂，用于实施本文公开的方法。
[1591下面的实施例意图于说明而不是限制本发明。
                          实施例1
                   [160]核苷酸的拉曼检测
[161]方法和设备
[162]在非限定性的例子中，拉曼检测单元的激发光束由钛∶蓝宝石激光器(Mira，Coherent)产生，波长为近红外波长(750～950nm)，或由镓铝砷二极管激光器(PI-ECL系列，Process Instruments)产生，波长为785nm或830nm。使用脉冲激光束或连续光束。激发光束穿透通过分色镜(Kaiser Optical的全息陷波滤波器或Chroma或OmegaOptical的双色干涉滤光器)，与收集的光束成共线的几何关系。发射的光束通过显微镜物镜(Nikon LU系列)，被聚焦在放置有目标分析物(核苷酸或嘌呤或嘧啶碱基)的拉曼活性基质。
[163]来自分析物的拉曼散射光被同一显微镜物镜收集，并通过分色镜，到达拉曼检测器。拉曼检测器包含聚焦透镜、摄谱仪和阵列检测器。聚焦透镜聚焦拉曼散射光，通过摄谱仪的入口狭缝。摄谱仪(ActonResearch)包含光栅，光栅按波长分散光线。分散的光线成像在阵列检测器(RoperScientific公司的背景照明深度耗尽CCD照相机)上。阵列检测器与控制器电路相连，其与计算机连接，以传输数据和控制检测器功能。
[164]对于表面增强拉曼光谱术(SERS)，拉曼活性基质由金属纳米颗粒或包覆有金属的纳米结构组成。用Lee和Meisel(J.Phys.Chem.，86：3391，1982)的方法，制备银纳米颗粒，大小为5到200nm。可选地，将样品放置在显微镜物镜下面的铝基质上。下面讨论的附图是从铝基质上的静止样品收集的。检测的分子的数量取决于被照射样品的光学采集体积(optical collection volume)。低至单分子水平的检测敏感度得以证明。
[165]单个核苷酸也可通过SERS检测，其中使用100μm或200μm的微流体通道。核苷酸可以通过微流体通道(约5到200μm宽)被输送到拉曼活性基质。微流体通道可通过模塑聚二甲基硅氧烷(PDMS)来制造，其中使用Anderson等(“Fabrication of topologically complexthree-dimensional microfluidic systems in PDMS by rapid prototyping，”Anal.Chem.72：3158-3164，2000)公开的技术。
[166]在银纳米颗粒存在的情况下进行SERS时，核苷酸、嘌呤或嘧啶分析物与LiCl(最终浓度90μM)和纳米颗粒(银原子最终浓度0.25M)混合。使用室温的分析物溶液来收集SERS数据。
[167]用上面公开的系统，通过SERS分析核苷一磷酸、嘌呤碱基和嘧啶碱基。表1显示了本发明对多种感兴趣的分析物的检测限。
[168]表1.核苷一磷酸、嘌呤和嘧啶的SERS检测
  分析物   最终浓度   被检测的分子的数目
  dAMP   9皮摩(pM)   ～1个分子
  腺嘌呤   9pM   ～1个分子
  dGMP   90μM   6×106
  鸟嘌呤   909pM   60
  dCMP   909μM   6×107
  胞嘧啶   90nM   6×103
  dTMP   90μM   6×106
  胸腺嘧啶   90nM   6×103
[169]仅对腺嘌呤核苷酸优化了条件。确定LiCl(最终浓度为90μM)，以提供腺嘌呤核苷酸的最佳SERS检测。通过使用其它碱金属卤化物盐例如NaCl、KCl、RbCl或CsCl，可能有助于其它核苷酸的检测。要求保护的方法并不被所用的电解质溶液限制，可以考虑使用其它类型的电解质溶液，例如MgCl2、CaCl2、NaF、KBr、LiI等。技术人员将认识到，不显示强拉曼信号的电解质溶液将对核苷酸的SERS检测提供最小的干扰。结果表明，上面公开的拉曼检测系统和方法能够检测和鉴定单个分子的核苷酸和嘌呤碱基。
                       实施例2
        [170]核苷酸、嘌呤和嘧啶的拉曼发射光谱
[171]使用实施例1中的方案获得感兴趣的各种分析物的拉曼发射光谱，其中带有所指出的修饰。图2显示了，在不存在表面增强并且无拉曼标记的情况下，四种核苷一磷酸中的每一种的100mM溶液的拉曼发射光谱。溶液中未添加LiCl。使用10秒钟的数据采集时间。激发发生在514nm。使用更长的采集时间，加入电解质和/或使用表面增强，可以检测更低浓度的核苷酸。下面的每个图都使用785nm的激发波长。如图2所示，未经增强的拉曼光谱显示了四种未标记的核苷一磷酸中的每一种的特征发射峰。
[172]图3显示在存在LiCl和银纳米颗粒的情况下，1nm鸟嘌呤溶液的SERS光谱。鸟嘌呤通过dGMP的酸处理获得，如在 Nucleic Acid Chemistry，Part 1，L.B.Townsend and R.S.Tipson(eds.)，Wiley-Interscience，New York，1978中讨论的。使用100毫秒的数据采集时间来获得SERS光谱。
[173]图4显示10nM的胞嘧啶溶液的SERS光谱。使用1秒的采集时间来采集数据。
[174]图5显示100nM的胸腺嘧啶溶液的SERS光谱。使用100毫秒的采集时间采集数据。
[175]图6显示100pM的腺嘌呤溶液的SERS光谱。采集数据1秒种。
[176]图7显示dATP(下面的迹线)和荧光素标记的dATP(上面的迹线)的500nM溶液的SERS光谱。dATP-荧光素购买自Roche AppliedScience(Indianapolis，IN)。该图显示了由于使用荧光素标记而产生SERS信号的强烈增加。采集数据100毫秒。
[177]图8显示0.9nM的腺嘌呤溶液的SERS。检测体积是100至150飞升，含有估计60个分子的腺嘌呤。收集数据100毫秒。
                      实施例3
               [178]核苷酸的SERS检测
[179]银纳米颗粒的形成
[180]根据Lee和Meisel(1982)的方法，产生用于SERS检测的银纳米颗粒。将18毫克AgNO3溶解在100mL(毫升)的蒸馏水中，并加热沸腾。用10min的时间，逐滴加入10mL的1％柠檬酸钠溶液到AgNO3溶液中。维持溶液再沸腾一小时。将形成的银胶体溶液冷却并存放。
[181]腺嘌呤的SERS检测
[182]拉曼检测系统如实施例1所公开。用2mL蒸馏水稀释1mL银胶体溶液。在铝盘上，将稀释的银胶体溶液(160μL)(微升)与20μL 10nM(纳摩尔)的腺嘌呤溶液和40μL的LiCl(0.5摩尔)混合。LiCl作为腺嘌呤的拉曼增强剂。样品中腺嘌呤的最终浓度是0.9nM，检测体积为约100到150飞升，含有估计60个腺嘌呤分子。拉曼发射光谱的收集使用785nm处激发的激发源，收集时间为100毫秒。如图8所示，这个过程说明了60个腺嘌呤分子的检测，其中检测到的强发射峰在大约833nm和877nm处。如实施例1所讨论，已经表明，使用所公开的方法和设备，检测到腺嘌呤的单个分子。
[183]核酸测序
[184]根据Sambrook等(1989)的方法，纯化人染色体DNA。在用Bam H1消化之后，可以将基因组DNA片段插入pBluescriptI1噬粒载体(Stratagene，Inc.，La Jolla，CA)的多克隆位点，并在大肠杆菌(E.coli.)中复制。在铺板于含有氨苄青霉素的琼脂糖板上之后，选择单个菌落，并使其生长，用于测序。可以通过用辅助噬菌体进行共感染，援救基因组DNA插入物的单链DNA拷贝。可以在蛋白酶K:十二烷基硫酸钠(SDS)的溶液中进行消化之后，对该DNA进行酚提取，并加入乙酸钠(pH6.5，约0.3M)和0.8体积的2-丙醇使其沉淀。可以将含有DNA的颗粒重新悬浮在Tris-EDTA缓冲液中，并在-20℃下存放待用。琼脂糖凝胶电泳显示出纯化DNA的单一条带。
[185]与位置邻接于基因组DNA插入物的已知pBluescript序列互补的M13正向引物可以从Midland Certified Reagent Company(Midland，TX)购得。这些引物可以被共价地修饰，以包含与寡核苷酸5′末端连接的生物素部分。通过(CH2)6间隔物，将生物素基团与引物的5′-磷酸共价地连接。使标记生物素的引物与由pBluescript载体制备的ssDNA模板分子杂交。按照Dorre等(Bioimaging 5：139-152，1997)的方法，将引物-模板复合体与包被有链霉抗生素蛋白的珠子连接。在合适的DNA稀释下，单个引物-模板复合体与单个珠子连接。将含有单个引物-模板复合体的珠子插入到测序设备的反应室中。
[186]将引物-模板与修饰型T7 DNA聚合酶(United States BiochemicalCorp.，Cleveland，OH)一起温育。通过光捕获将聚合酶限制在反应室中(Goodwin等，1996，Acc.Chem.Res.29：607-619)。反应混合物包含未标记的脱氧腺苷-5′-三磷酸(dATP)和脱氧鸟苷-5′-三磷酸(dGTP)、地高辛标记的脱氧尿苷-5′-三磷酸(地高辛-dUTP)以及罗丹明标记的脱氧胞苷-5′-三磷酸(罗丹明-dCTP)。使聚合反应在37℃下进行。
[187]引导所有四种核苷酸持续流动通过反应室。用SERS检测反应室之前和之后的核苷酸浓度。反应室出来的核苷酸浓度降低，确定出核苷酸整合进互补链。用时间依赖性核苷酸摄取得到模板链的序列。
[188]在一种可选方法中，仅向反应室一次提供单一类型的核苷酸。将四种核苷酸中的每一种相继加入反应室。提供的核苷酸量和反应室中的模板核酸量成正比。当核苷酸与模板链中的邻近碱基互补时，在离开反应室的流过通道中观察到核苷酸浓度大大下降。当加入其它三种核苷酸中的任一种时，观察到核苷酸浓度几乎没有变化。对模板链中的每一碱基重复此过程，用以确定核酸序列。
                       实施例4
        [189]确定模板核酸分子靶位点处的核苷酸发生
[190]本实施例说明了确定模板核酸分子靶位点处的核苷酸发生的方法，如图12A-D所示。在反应室中，使可检测拷贝数的模板核酸分子60、序列是5′ATGCTATGCAGATGTACATATGTCT 3′(SEQ ID NO：1)的单链核酸分子和反应混合物接触。反应混合物包含序列是5′AGACATA 3′(SEQ ID NO：2)的引物90、聚合酶95和起始浓度的第一核苷酸50(dATP50)。模板核酸50被固定在反应室的表面70上。温育反应混合物，使得引物和模板核酸分子杂交，如图12A所示，并形成包含模板-引物复合物的反应后混合物。由于dATP 50不与靶位点65的核苷酸互补，因此dATP 50保留在溶液中。随后收集第一反应混合物并将其沉积在表面增强拉曼光谱(SERS)基质上，用SERS检测(未显示)。由于dATP 50未整合进互补链(即，新生链)，在反应后混合物中，没有观察到dATP 50(即，第一核苷酸)的拉曼信号强度降低。由于dATP 50的拉曼信号不降低，推断靶位点处不存在胸腺嘧啶，并用缓冲液洗涤模板-引物复合物。
[191]任选地在此时用缓冲液洗涤模板核酸分子，用以去除残留的dATP。用于此洗涤步骤的缓冲条件，例如，允许引物仍然和模板核酸分子结合。
[192]如图12C所示，由于没有观察到dATP 50信号降低，随后将第二核苷酸(例如，dTTP50)和聚合酶95以及任选地更多引物90一同导入，形成第二反应混合物。温育足够时间后，dTTP和聚合酶与模板接触，形成包含模板-引物复合物以及延伸产物的反应后混合物。换言之，由于第二核苷酸与模板核酸分子60靶位点的核苷酸互补，因此胸苷被整合进新生链的3′末端，与杂交引物的3′紧邻，位于与靶位点65杂交的位点。随后收集第二反应混合物并将其沉积在表面增强拉曼光谱(SERS)基质上，用SERS检测(未显示)。由于dTTP 51被整合进互补链(即，新生链)，在反应后混合物中，观察到dTTP 50(即，第二核苷酸)的拉曼信号强度降低。由于dTTP 50的拉曼信号降低，推断靶位点处的核苷酸发生是腺苷残基。
[193]此时，任选地导入附加的dTTP 51，用以确保所有的新生核酸分子都具有整合的胸苷。此外，如果加入第二反应混合物以及在任选的附加步骤中加入的dTTP 51的量是已知的，并且如果固定在反应室中的模板核酸分子数目是已知的，则可以将任选的附加步骤中的附加dTTPs沉积在SERS基质上并用SERS检测，目的是确定在模板核酸分子上，在靶核苷酸和3′相邻核苷酸处，是否发现了连续的A残基。
[194]在需要时，可以用dATP、dTTP以及dCTP和dGTP重复上述过程，每次一种，可以持续测序，用以鉴定相邻核苷酸处的核苷酸发生。可以重复此过程，直至获得模板核酸分子的全部核苷酸序列。
                       实施例5
             [195]对dAMP的SERS和CARS分析
[196]本实施例说明了用SECARS对dAMP进行的光学分析。根据Leeand Meisel(1982)，如上所公开，产生用于SECARS检测的银纳米颗粒。稀释银胶体溶液并和dAMP及LiCl混合，产生90pM dAMP、24mMAg和90mM LiCl的最终样品。收集拉曼光谱100毫秒。泵浦激光器和斯托克斯激光器以约2皮秒脉冲触发。泵浦激光器的平均功率是约500mW，斯托克斯激光器的平均功率是约300mW。用激发源在785nm激发处收集拉曼发射光谱，收集时间是100毫秒。
[197]如图13所示，此过程说明了对dAMP的检测，强的拉曼位移峰(Raman shift peaks)在约737cm-1。如图14所示，用与dAMP样品相同，但不加入dAMP的对照样品得到的结果，支持观察到的拉曼位移发射峰产生于dAMP的结论。此外，在这些条件下，单独应用SERS或CARS，可以检测90pM dAMP。
[198]尽管参照上述实施例描述了本发明，应该理解，其修饰和变化包含在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅被所附权利要求所限定。

Claims (44)

1.检测核苷酸或核苷的方法，包括：
a)从所述核苷酸或核苷的核糖或脱氧核糖部分分离出嘌呤或嘧啶碱基；
b)将分离出的嘌呤碱基或嘧啶碱基沉积在表面增强拉曼光谱(SERS)基质上；和
c)用SERS检测所述分离出的嘌呤或嘧啶碱基。
2.权利要求1所述的方法，其中所述方法检测脱氧核苷三磷酸。
3.权利要求2所述的方法，其中所述方法进一步包括，在从所述嘌呤或嘧啶部分分离嘌呤或嘧啶碱基之前，将脱氧核苷三磷酸包含在核酸测序反应混合物中。
4.权利要求1所述的方法，其中在用SERS检测所述嘌呤或嘧啶碱基之前，使所述嘌呤或嘧啶碱基和拉曼标记相连接。
5.权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸或核苷包括嘌呤碱基。
6.权利要求5所述的方法，其中所述碱基基本上由腺嘌呤组成。
7.权利要求5所述的方法，其中所述碱基基本上由鸟嘌呤组成。
8.权利要求1所述的方法，其中所述表面增强拉曼光谱是表面增强相干反斯托克斯拉曼光谱(SECARS)。
9.权利要求8所述的方法，其中所述核苷酸或核苷包括嘧啶碱基。
10.权利要求9所述的方法，其中所述核苷酸或核苷包括胸腺嘧啶。
11.权利要求9所述的方法，其中所述核苷酸或核苷包括尿嘧啶。
12.权利要求9所述的方法，其中所述核苷酸或核苷包括胞嘧啶。
13.权利要求1所述的方法，其中所述靶分子被沉积在银纳米颗粒上。
14.权利要求13所述的方法，其中使所述靶分子和碱金属卤化物盐接触。
15.权利要求14所述的方法，其中所述碱金属卤化物盐是氯化锂。
16.检测包括嘌呤碱基和嘧啶碱基的靶分子的方法，包括：
a)分离所述靶分子；
b)将靶分子沉积在表面增强拉曼光谱(SERS)基质上；和
c)用表面增强相干反斯托克斯拉曼光谱(SECARS)检测来自被照射的靶分子的拉曼散射，从而检测所述靶分子。
17.权利要求16所述的方法，其中所述靶分子是从生物样品分离出的。
18.权利要求16所述的方法，其中所述靶分子是核苷酸、核苷或碱基。
19.权利要求18所述的方法，其中所述靶分子基本上由嘧啶碱基组成。
20.权利要求19所述的方法，其中所述碱基基本上由胸腺嘧啶组成。
21.权利要求19所述的方法，其中所述碱基基本上由尿嘧啶组成。
22.权利要求19所述的方法，其中所述碱基基本上由胞嘧啶组成。
23.权利要求16所述的方法，其中所述靶分子是核苷三磷酸。
24.检测模板核酸分子中连续靶位点处的相同核苷酸的方法，包括：
a)使已知拷贝数的所述模板核酸分子与包括引物、聚合酶和已知起始浓度的第一核苷酸的反应混合物接触，形成反应后混合物，所述引物或模板核酸被固定在反应室表面，其中引物的3′末端和连续靶位点的5′核苷酸上游的模板核酸分子结合；
b)使所述反应后混合物沉积在表面增强拉曼光谱(SERS)基质上；
c)用SRES检测所述第一核苷酸；和
d)确定在连续靶位点处是否加入了多于一个的第一核苷酸。
25.权利要求24所述的方法，其中所述已知拷贝数的模板核酸分子与反应混合物中第一核苷酸分子的已知数目大约相同。
26.权利要求24所述的方法，其中所述已知拷贝数的模板核酸分子是反应混合物中第一核苷酸分子的已知数目的大约一半。
27.权利要求24所述的方法，进一步包括，在检测所述第一核苷酸之后，向反应混合物中加入附加的第一核苷酸。
28.权利要求24所述的方法，进一步包括，从核苷酸切割碱基和用SERS检测所述碱基。
29.权利要求24所述的方法，其中所述SERS检测是表面增强相干反斯托克斯拉曼光谱(SECARS)。
30.权利要求24所述的方法，进一步包括，用不同核苷酸重复步骤a-d。
31.权利要求24所述的方法，其中在用SERS检测所述核苷酸之前，将它连接到拉曼标记上。
32.权利要求24所述的方法，其中内部对照被包含在所述反应混合物中并用SERS检测。
33.权利要求32所述的方法，其中对所述内部对照和核苷酸的SESR信号进行比较，用以确定在连续靶位点处是否加入了多于一个的核苷酸。
34.确定模板核酸分子靶位点处核苷酸发生的方法，包括：
a)使可检测数目的模板核酸与反应混合物在反应室中接触，所述反应混合物包括引物、聚合酶和起始浓度的第一核苷三磷酸，所述引物或模板核酸被固定在反应室表面；
b)温育所述反应混合物，使引物与模板核酸结合，形成反应后混合物；
c)将反应后混合物或其组分沉积在表面增强拉曼光谱(SERS)基质上；和
d)用SRES检测来自第一核苷酸的拉曼信号，其中反应后混合物中第一核苷酸的拉曼信号强度的降低鉴定出延伸反应产物，从而鉴定出靶位点处的核苷酸发生。
35.权利要求34所述的方法，进一步包括，用不同的核苷酸重复步骤a-d，直至鉴定出核苷酸发生。
36.权利要求35所述的方法，进一步包括，在任选地重复步骤a-d之前洗涤基质。
37.权利要求34所述的方法，其中所述温育时间是约1秒至10分钟。
38.权利要求34所述的方法，其中所述反应室在至少一个方向上小于100纳米。
39.权利要求34所述的方法，其中反应前SERS分析是在第一核苷酸与模板核酸分子接触之前对第一核苷酸实施的。
40.权利要求39所述的方法，其中反应后混合物比反应前混合物中的第一核苷酸的拉曼信号强度的降低鉴定出延伸反应产物。
41.权利要求34所述的方法，其中对靶核苷酸位点实施所述方法两次，应用dATP和dGTP，每次一种，作为第一核苷酸和第二核苷酸。
42.权利要求41所述的方法，其中所述模板核酸分子的互补链被固定在第二反应室中，并且再实施所述方法两次，再次应用dATP和dGTP，每次一种，作为第一核苷酸和第二核苷酸。
43.权利要求34所述的方法，其中所述内部对照被包含在反应混合物中并用SERS检测。
44.权利要求43所述的方法，其中对所述内部对照和核苷酸的SESR信号进行比较，用以确定靶位点处的核苷酸发生。
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7372562B2 (en) * 2005-10-17 2008-05-13 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Dynamic random separation among nanoparticles for nano enhanced Raman spectroscopy (NERS) molecular sensing
US7342656B2 (en) * 2005-10-17 2008-03-11 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Dynamically variable separation among nanoparticles for nano-enhanced Raman spectroscopy (NERS) molecular sensing
US20070141714A1 (en) * 2005-12-19 2007-06-21 Intel Corporation Method to detect small molecules binding to proteins using surface enhanced Raman scattering (SERS)
US9114398B2 (en) 2006-11-29 2015-08-25 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Device and method for digital multiplex PCR assays
US20080241828A1 (en) * 2007-03-30 2008-10-02 Kai Wu Detection of dna methylation using raman spectroscopy
US8945481B1 (en) * 2007-06-27 2015-02-03 Applied Biosystems, Llc Microfluidic devices and method for their use
TR200802195A2 (tr) * 2008-04-01 2009-10-21 Yed�Tepe �N�Vers�Tes� Yüzeyde zenginleştirilmiş raman saçılmasına dayalı doku farklılaştırma yöntemi.
US8178120B2 (en) * 2008-06-20 2012-05-15 Baxter International Inc. Methods for processing substrates having an antimicrobial coating
US8753561B2 (en) * 2008-06-20 2014-06-17 Baxter International Inc. Methods for processing substrates comprising metallic nanoparticles
US8277826B2 (en) * 2008-06-25 2012-10-02 Baxter International Inc. Methods for making antimicrobial resins
US20090324738A1 (en) * 2008-06-30 2009-12-31 Baxter International Inc. Methods for making antimicrobial coatings
US20100227052A1 (en) * 2009-03-09 2010-09-09 Baxter International Inc. Methods for processing substrates having an antimicrobial coating
JP5870497B2 (ja) * 2011-03-18 2016-03-01 セイコーエプソン株式会社 測定装置及び測定方法
GB201300957D0 (en) * 2013-01-18 2013-03-06 Base4 Innovation Ltd Sequencing method
US10174363B2 (en) * 2015-05-20 2019-01-08 Quantum-Si Incorporated Methods for nucleic acid sequencing

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4863849A (en) * 1985-07-18 1989-09-05 New York Medical College Automatable process for sequencing nucleotide
US4800159A (en) * 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US4962037A (en) * 1987-10-07 1990-10-09 United States Of America Method for rapid base sequencing in DNA and RNA
US5038853A (en) * 1989-01-17 1991-08-13 Callaway Sr James K Heat exchange assembly
KR910012538A (ko) * 1989-12-27 1991-08-08 야마무라 가쯔미 마이크로 펌프 및 그 제조 방법
US5126022A (en) * 1990-02-28 1992-06-30 Soane Tecnologies, Inc. Method and device for moving molecules by the application of a plurality of electrical fields
WO1992001160A1 (en) * 1990-07-10 1992-01-23 Westonbridge International Limited Valve and micropump incorporating said valve
US5271724A (en) * 1990-08-31 1993-12-21 Westonbridge International Limited Valve equipped with a position detector and a micropump incorporating said valve
US5603872A (en) * 1991-02-14 1997-02-18 Baxter International Inc. Method of binding recognizing substances to liposomes
CA2079444C (en) * 1991-02-14 2004-02-03 Rimona Margalit Binding of recognizing substances to liposomes
US5405747A (en) * 1991-09-25 1995-04-11 The Regents Of The University Of California Office Of Technology Transfer Method for rapid base sequencing in DNA and RNA with two base labeling
CA2064683A1 (en) * 1992-03-26 1993-09-27 Krishna Mohan Rao Kallury Formation of thermostable enzymes with extra-ordinary heat tolerance by immobilization on phospholipid matrices
US5306403A (en) * 1992-08-24 1994-04-26 Martin Marietta Energy Systems, Inc. Raman-based system for DNA sequencing-mapping and other separations
CA2155186A1 (en) * 1993-02-01 1994-08-18 Kevin M. Ulmer Methods and apparatus for dna sequencing
US5610287A (en) * 1993-12-06 1997-03-11 Molecular Tool, Inc. Method for immobilizing nucleic acid molecules
US5986076A (en) * 1994-05-11 1999-11-16 Trustees Of Boston University Photocleavable agents and conjugates for the detection and isolation of biomolecules
US5776674A (en) * 1995-06-05 1998-07-07 Seq, Ltd Chemical biochemical and biological processing in thin films
DE19534632A1 (de) * 1995-09-19 1997-03-20 Boehringer Mannheim Gmbh System zur Temperaturwechselbehandlung von Probenflüssigkeiten
US6174677B1 (en) * 1995-10-13 2001-01-16 Ut-Battelle, Llc Advanced surface-enhanced Raman gene probe systems and methods thereof
US5705018A (en) * 1995-12-13 1998-01-06 Hartley; Frank T. Micromachined peristaltic pump
US5876480A (en) * 1996-02-20 1999-03-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Synthesis of unagglomerated metal nano-particles at membrane interfaces
US5867266A (en) * 1996-04-17 1999-02-02 Cornell Research Foundation, Inc. Multiple optical channels for chemical analysis
US5948598A (en) * 1996-10-31 1999-09-07 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company Ltd. Anti-reflective silicon nitride film using in-situ deposition
US6002471A (en) * 1996-11-04 1999-12-14 California Institute Of Technology High resolution scanning raman microscope
US5837254A (en) * 1996-11-14 1998-11-17 Chen; Yu Method of treating candida and cryptococcus fungal infections by administering gentian
US6136543A (en) * 1997-01-31 2000-10-24 Hitachi, Ltd. Method for determining nucleic acids base sequence and apparatus therefor
US5904824A (en) * 1997-03-07 1999-05-18 Beckman Instruments, Inc. Microfluidic electrophoresis device
DE19717085C2 (de) * 1997-04-23 1999-06-17 Bruker Daltonik Gmbh Verfahren und Geräte für extrem schnelle DNA-Vervielfachung durch Polymerase-Kettenreaktionen (PCR)
DE19742227A1 (de) * 1997-09-25 1999-04-01 Juergen Prof Dipl Phys Wolfrum Verfahren zum Sequenzieren eines einzelnen DNA-Moleküls
WO1999044045A1 (en) * 1998-02-27 1999-09-02 Massachusetts Institute Of Technology Single molecule detection with surface-enhanced raman scattering and applications in dna or rna sequencing
US6263286B1 (en) * 1998-08-13 2001-07-17 U.S. Genomics, Inc. Methods of analyzing polymers using a spatial network of fluorophores and fluorescence resonance energy transfer
US6210896B1 (en) * 1998-08-13 2001-04-03 Us Genomics Molecular motors
US6232075B1 (en) * 1998-12-14 2001-05-15 Li-Cor, Inc. Heterogeneous assay for pyrophosphate detection
US20020187477A1 (en) * 2001-06-06 2002-12-12 Hong Xue Method for detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs) and point mutations
US20030077584A1 (en) * 2001-08-28 2003-04-24 Mark Kunkel Methods and compositons for bi-directional polymorphism detection
US6852492B2 (en) * 2001-09-24 2005-02-08 Intel Corporation Nucleic acid sequencing by raman monitoring of uptake of precursors during molecular replication
US6972173B2 (en) * 2002-03-14 2005-12-06 Intel Corporation Methods to increase nucleotide signals by raman scattering
US6982165B2 (en) * 2001-09-24 2006-01-03 Intel Corporation Nucleic acid sequencing by raman monitoring of molecular deconstruction
AU2003207448A1 (en) * 2002-01-04 2003-07-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Proofreading, error deletion, and ligation method for synthesis of high-fidelity polynucleotide sequences
US7476501B2 (en) * 2002-03-26 2009-01-13 Intel Corporation Methods and device for DNA sequencing using surface enhanced raman scattering (SERS)
US20050084980A1 (en) * 2003-10-17 2005-04-21 Intel Corporation Method and device for detecting a small number of molecules using surface-enhanced coherant anti-stokes raman spectroscopy

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