KR20040089118A - 약제학적으로 허용되는 포스페이트-글리세롤 함유 소체 - Google Patents

약제학적으로 허용되는 포스페이트-글리세롤 함유 소체 Download PDF

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KR20040089118A
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볼튼안토니이
맨델아카디
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Abstract

본 발명은 생물학적 활성을 갖는 삼차원적 합성 및 반합성 조성물, 포유동물 환자에서의 다양한 질환의 치료 및/또는 예방에서의 그것의 사용에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 환자 체내에 들어간 후, 유익한 항염증, 기관 방어 및 면역 조절 효과를 나타내는, 리포솜 같은 합성 및 반합성체의 제제 및 사용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 감염 및 자가면역 질환 및 그것의 증상을 완화하기 위한 치료 및 조성물에 관한 것이다.

Description

약제학적으로 허용되는 포스페이트-글리세롤 함유 소체{PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE PHOSPHATE-GLYCEROL CARRYING BODIES}
수지상 세포 (DCs) 및 마크로파지 (Mph)를 포함하는 전문적 항원제공세포 (APCs)는 활발하게 항원 (Ags)을 포획 및 처리하고, 세포 잔해를 청소하고, 감염된 생체 및 사멸하는 세포로부터의 찌꺼기를 포함하는 사멸하는 세포를 제거한다. 이 처리과정 동안, APC는 항원 (Ag)또는 식작용을 받는 물질의 성질과 APC 성숙/활성화 수준에 따라 염증성 Thl 염증촉진 사이토카인 (IL-12,IL-1,INF-γ,TNF-α, 등)의 생산; 또는 (IL-10, TGF-β, IL-4 등 같은) 조절성 Th2/Th3 사이토카인 우세 반응을 촉진할 수 있다.
APC는, 일부는 생체의 세포막으로부터, 일부는 박테리아나 기생적 감염 및소화관 박테리아 같은 공생생물로부터 유래한 세포 찌꺼기를 제거한다. 이 세포 찌꺼기의 일부는 염증전 반응을 개시시킬 것이고, 일부는 보호 및 항염증 반응을 개시시킬 것이다.
정상적으로 기능하는 면역 시스템은 외래 침입 생명체 (비자기)의 항원과 "자기" 유래의 조직 또는 찌꺼기를 구별할 수 있고, 오직 외래 항원에 대항하여만 면역반응을 개시한다. 환자의 면역 시스템이 자기와 비자기를 구별하는데 실패하는 경우, 자가면역 질환이 발생한다.
발명의 개요
본 발명은 포스페이트-글리세롤기를 포함하는 리포솜, 비드 및 유사 입자 같은 약제학적으로 허용되는 소체는 포유동물 환자에 투여된 후 항염증 효과를 일으킬 것이고 따라서 다수의 질환을 치료하는데 사용될 수 있다는 발견에 관한 것이다. 이들 소체는 소량 성분으로서 불활성 구성요소 및/또는 상이한 기작을 통하여 활성화되는 구성성분을 더 포함할 수 있다.
바람직한 한 구체예에서, 본 발명은 포유동물 생체내에서 항염증 반응을 생산할 수 있는 소체의 조성물에 관한 것인데, 상기 조성물은 다수의 포스페이트-글리세롤기나 이 같은 기로 치환 가능한 기를 포함하는, 약 20 나노미터 (nm) 내지 500 마이크로미터 (㎛)의 약제학적으로 허용되는 소체를 포함한다. 바람직하게는 이 소체는 지질 아닌 약제학적으로 허용되는 물질이 본질적으로 없는 물질이다. 바람직하게는, 포스페이트-클리세롤기는 소체의 활성기의 60% 내지 100%를 구성한다. 포유동물에 투여된 후, 소체는 포스포레이트-글리세롤기를 통하여 면역 시스템과 상호작용하는 것으로 믿어지고 있다. 결과적으로, 이와 같이 투여된 물질은 항염증 반응을 유발한다.
다른 구체예에서, 본 발명은, 여기서 달리 언급하지 않는 한 약제학적으로 허용되는 소체로서, 20 nm 내지 500 ㎛ 범위의 크기를 갖고 주성분으로서 적어도 하나의 항염증 촉진 리간드를 포함하도록 변형된 삼차원적 합성 또는 반합성 소체에 관한 것인데, 상기 리간드는 포스페이트-글리세롤기이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은, 여기서 달리 언급하지 않는 한 약제학적으로 허용되는 소체로서, 20 nm 내지 500 ㎛ 범위의 크기를 갖는 포스페이트-글리세롤기를 그것의 표면에 갖는 삼차원적 합성 또는 반합성 소체에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 포유동물 환자에게 T-세포기능매개 질환의 진행을 저해하고/또는 감소시키기에 유효한 수의 포스페이트-글리세롤기를 함유하는 약제학적으로 허용되는 소체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 T-세포기능매개 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 포유동물 환자에게 염증성 질환의 진행을 저해하고/또는 감소시키기에 유효한 수의 포스페이트-글리세롤기를 함유하는 약제학적으로 허용되는 소체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 염증성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 본 발명의 구체예는 포유동물 환자에게 내피기능 이상의 진행을 저해하고/또는 감소시키기에 유효한 수의 포스페이트-글리세롤기를 함유하는 약제학적으로 허용되는 소체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 내피기능 이상을 치료하는 방법이다.
다른 구체예는 포유동물 환자에게 부적절한 사이토카인 발현을 특징으로 하는 면역질환의 진행을 저해하고/또는 감소시키기에 유효한 수의 포스페이트-글리세롤기를 함유하는 약제학적으로 허용되는 소체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 면역질환을 치료하는 방법이다.
본 발명은 더욱이 환자의 심전도 상의 연장된 QT-c 간격을 관찰함으로써 그 존재 또는 감수성이 검출 가능한 포유동물의 심장질환의 치료 또는 예방 방법에 관한 것인데, 이 방법은 그 질환을 앓거나 그 질환에 감수성이 있는 포유동물 환자에게, 여기서 달리 언급하지 않는 한 약제학적으로 허용되는 소체로서의 약제학적으로 허용되는 생체적합성 합성 또는 반합성 소체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기에서 상기 소체의 적어도 일부는 약 20 nm 내지 500 ㎛ 범위의 크기를 갖고, 상기 소체의 표면은 주성분으로서 적어도 하나의 항염증 촉진 리간드를 포함하도록 변형되었고, 상기 리간드는 포스페이트-글리세롤기이다.
본 발명의 다른 구체예는 약제학적으로 허용되는 소체와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 포유동물에 투여하기 위한 단위 투여 형태의 약제학적 조성물인데, 여기에서 적어도 일부의 상기 소체는 약 20 nm 내지 500 ㎛ 범위의 크기를 갖고, 상기 소체의 표면은 포스페이트-글리세롤기 또는 포스페이트-글리세롤기로 전환될 수 있는 기이며, 상기 단위투여량은 약 500 내지 약 2.5 x 109개의 소체를 포함한다.
본 발명의 더 나아간 구체예는 (여기서 달리 언급하지 않는 한 약제학적으로 허용되는 소체로서의) 약제학적으로 허용되는 생체적합성 합성 또는 반합성 소체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물인데, 여기에서 상기 소체의 적어도 일부는 약 20 nm 내지 500 ㎛ 범위의 크기를 갖고, 상기 소체의 표면은 주성분으로서 적어도 하나의 항염증 촉진 리간드를 포함하도록 변형되었고, 상기 리간드는 포스페이트-글리세롤기이다.
본 발명의 더욱 더 나아간 구체예는 여기서 달리 언급하지 않는 한 약제학적으로 허용되는 물질으로서의) 약제학적으로 허용되는 생체적합성 합성 또는 반합성 소체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물인데, 여기에서 상기 소체의 적어도 일부는 약 20 nm 내지 500 ㎛ 범위의 크기를 갖고, 카르디올리핀을 포함한다.
선택적으로, 상기 기재된 소체는 불활성 구성성분 표면기 및/또는 다른 기작을 통하여 활성되는 구성성분 표면기, 예를 들어 포스파티딜세린을 더 포함할 수 있다. (예를 들어, Fadok et al., 국제특허공보 WO01/66785 참조).
다른 구체예에서, 본 발명은 포스페이트-글리세롤기 또는 포스페이트-글리세롤기로 전환 가능한 기를 함유하는 라이오필라이즈된, 즉 동결건조된 약제학적으로 허용되는 소체, 및 포스페이트-글리세롤기 또는 포스페이트-글리세롤기로 전환 가능한 기를 함유하는 라이오필라이즈된, 즉 동결건조된 약제학적으로 허용되는 소체, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 키트에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 T-세포기능매개 질환을 앓거나 앓을 위험이 있는포유동물 환자에게 약 20 nm 내지 500 ㎛ 범위의 크기를 갖고, 그것의 표면상에 다수의 포스페이트-글리세롤기 또는 포스페이트-글리세롤기로 전환될 수 있는 기를 포함하는 약제학적으로 허용되는 소체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하여, 투여 후 T-세포기능매개 질환의 진행이 저해되고/또는 감소되는 것을 포함하는 T-세포기능매개 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구체예는 내피기능 이상을 앓거나 앓을 위험이 있는 포유동물 환자에게 약 20 nm 내지 500 ㎛ 범위의 크기를 갖고, 그것의 표면상에 다수의 포스페이트-글리세롤기 또는 포스페이트-글리세롤기로 전환될 수 있는 기를 포함하는 약제학적으로 허용되는 소체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하여, 투여 후 내피기능 이상의 진행이 저해되고/또는 감소되는 것을 포함하는 내피기능 이상을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구체예는 면역질환을 앓거나 앓을 위험이 있는 포유동물 환자에게 약 20 nm 내지 500 ㎛ 범위의 크기를 갖고, 그것의 표면상에 다수의 포스페이트-글리세롤기 또는 포스페이트-글리세롤기로 전환될 수 있는 기를 포함하는 약제학적으로 허용되는 소체를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하여, 투여 후 면역질환의 진행이 저해되고/또는 감소되는 것을 포함하는 면역질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 다른 측면에서, 포스페이트-글리세롤기에 특이적으로 결합하는 포유동물 면역 시스템의 세포, 예를 들어 마크로파지 상의 리셉터의 사용으로서 이해될 수 있다. 본 발명은 리간드와 그 같은 리셉터에 결합하여 궁극적으로는 항염증 반응을 생산할 기를 포함하는 소체를 포괄한다. 따라서, 본 발명은 여기에 기재된 것과 같은 항원제공세포에 의한 포스페이트-글리세롤 발현 소체의 결합이나 흡수와 경쟁적인 리간드나 활성기를 포함하는 소체로서 정의될 수 있다. 당업자에게는 단순한 시험 실험을 수행함으로써 특정 소체가 그와 같이 경쟁할 것인지 아닌지를 결정하는 것은 용이하다. 예를 들어, 물질은 U937 세포 같은 이용하기 용이한 단핵세포 세포주로 시험될 수 있다. 제 1 실험에서, U937 세포는 형광성으로 표지된 PG 리포솜 단독과 함께 인큐베이션시키고 다른 실험에서는 U937 세포는 형광성으로 표지된 PG 리포솜 및 상이한 양의 시험 화합물 둘 모두의 존재 하에서 인큐베이션 시킨다. 제 1 실험과 비교하여 다른 실험에서 형광성으로 표지된 PG 리포솜의 흡수가 감소하면, 시험 화합물은 특이적 리셉터에 대하여 경쟁하는 것이고 본 발명의 범위 내에 있는 화합물이다.
본 발명은 생물학적 활성을 갖는 삼차원적 합성 및 반합성 조성물, 및 포유동물 환자에서의 다양한 질환의 치료 및/또는 예방에서의 그것의 사용에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 환자 체내에 들어간 후, 유익한 항염증, 기관 방어 및 면역 조절 효과를 나타내는 합성 및 반합성 소체의 제제 및 사용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 감염 및 자가면역 질환 및 그것의 증상을 완화하기 위한 치료 및 조성물에 관한 것이다.
도 1은 하기 실시예 1의 결과의 막대 그래프 도시이다, 다른 리포솜과 대조표준과 비교한 본 발명의 바람직한 구체예에 따른 리포솜을 사용한 마우스 접촉 감수성 (CHS, 급성 T-세포 매개 염증 모델) 실험.
도 2는 다양한 포스파티딜글리세롤 (PG) 함량의 리포솜의 사용을 나타내는, 유사한 그래프 도시이다, CHS 모델, 하기 실시예 2.
도 3은 마우스 CHS 모델에서 상이한 농도의 75% PG 리포솜이 사용된 하기 실시예 3의 결과의 유사한 그래프 도시이다.
도 4는 마우스 CHS 모델에서 상이한 농도의 100% PG 리포솜이 사용된 하기실시예 4의 결과의 유사한 그래프 도시이다.
도 5는 CHS 모델에서 상이한 크기의 리포솜을 사용한 하기 실시예 5의 결과의 유사한 그래프 도시이다.
도 6은 지연형 과민증 (DHS, 만성 T-세포 매개 염증 모델)의 마우스 모델을 사용한 실시예 6의 결과의 유사한 그래프 도시이다.
도 7은 DHS 마우스 모델의 카르디올리핀 리포솜을 사용한 실시예 7의 결과의 유사한 그래프 도시이다.
도 8은 CHS 마우스 모델의 카르디올리핀 리포솜을 사용한 실시예 8의 결과의 유사한 그래프 도시이다.
도 9는 대조표준 및 처리된 마우스에서의 흥분성 시냅스후 전위 (EPSP) 기울기의 백분율의 변화이고, 그것은 실시예 9의 장기 촉진작용(LTP)에 미치는 영향의 지표이다.
도 10은 도9에서 나타나는 데이터의 막대 차트 형태 도시이다, 하기 실시예 9.
도 11은 대조 표준 및 처리 동물의 해마 내 항염증 사이토카인 IL-4의 농도의 차이를 나타낸다, 하기 실시예 10.
도 12는 대조 표준 및 처리 동물의 비장 세포의 단일 세포 현탁물 내의 항염증 사이토카인 IL-1β의 농도의 차이를 나타낸다, 하기 실시예 11.
도 13은 다양한 농도의 75% PG 리포솜으로 처리된 U937 단핵구 세포주 내의 TNF-α의 농도의 차이를 나타낸다, 하기 실시예 12.
도 14는 하기 실시예 13의 결과의 그래프 도시이다, 본 발명의 바람직한 실시예 대 대조표준에 따라 처리된 마우스의 귀의 엔도텔린-1 함량.
도 15는 하기 실시예 14의 결과의 그래프 도시이다, 본 발명의 바람직한 실시예의 존재 및 부재 하에서의 HUVEC 배양물로부터의 ICAM-1 포지티브 세포.
바람직한 구체예의 설명
본 발명에 따라서, 표면에 포스페이트-글리세롤기를 지닌 약학적으로 허용되는 소체가 환자에게 투여된다. 어떤 이론과 결부되지는 않지만, 이들 소체는 환자의 면역시스템과 상호작용하며, 생체내 염증촉진성 사이토카인의 억제 및 항염증성 사이토카인의 촉진과 같은 유리한 효과를 수반하는 것으로 여겨진다. 반응하는 세포는 전문 또는 비-전문 항원제공세포, 내피세포, NK-T와 같은 조절세포 및 다른 여러 가지 면역세포일 수 있다.
이들 약학적으로 허용되는 소체는 전형적으로 그러나 비배타적으로 회전타원형, 원통형, 편원 및 편장 회전타원형을 포함하는 타원체, S자형, 잠두형 등의 모양과 바람직하게는 장축을 따라 측정된 직경 약 20nm 내지 약 50㎛의 크기를 가지며, 그것의 표면에 포스페이트-글리세롤기를 포함하는 합성 및 반합성 소체를 포함한다.
약학적으로 허용되는 소체는 외부 표면에 정해진 특성의 포스페이트-글리세롤기를 가진다. 어떤 이론과 결부되지는 않지만, 이들 기는 생체내 항원제공세포 상의 PS 수용체를 제외한 다른 적합한 수용체(들)과 상호작용할 수 있는 것으로 여겨진다. 이들 기의 구조는 합성적으로 변경될 수 있으며, 원 포스페이트-글리세롤기의 전부, 일부 또는 변형된 버전을 포함할 수 있다. 예들 들어, 포스페이트-글리세롤기의 포스페이트기의 음으로 하전된 산소는 포스페이트 에스테르기(예를 들어, L-OP(O)(OR')(OR''), 여기서 L은 포스페이트-글리세롤기의 나머지이고, R'은 -CH2CH(OH)CH2OH이고, R''는 1 내지 4개 탄소원자의 알킬 또는 2 내지 4개 탄소원자의 히드록실 치환된 알킬, 및 R''가 R'기 보다 생체내에서 더 쉽게 가수분해된다면 1 내지 3개 히드록실기이다); 디포스페이트 에스테르를 포함하는 디포스페이트기(예를 들어, L-OP(O)(OR')OP(O)(OR'')2, 여기서 L 및 R'은 상기 정의된 바와 같고, 각 R''는 독립적으로 수소, 1 내지 4개 탄소원자의 알킬, 또는 2 내지 4개 탄소원자의 히드록실 치환된 알킬 및 제 2 포스페이트기 [-P(O)(OR'')2]가 R'기 보다 생체내에서 더 쉽게 가수분해된다면 1 내지 3개 히드록실기이다); 또는 트리포스페이트 에스테르를 포함하는 트리포스페이트기(예를 들어, L-OP(O)(OR')OP(O)(OR'')OP(O)-(OR'')2, 여기서 L 및 R'은 상기 정의된 바와 같고, 각 R''는 독립적으로 수소, 1 내지 4개 탄소원자의 알킬 또는 2 내지 4개 탄소원자의 히드록실 치환된 알킬, 및 제 2 및 제 3 포스페이트기가 R'기 보다 생체내에서 더 쉽게 가수분해된다면 1 내지 3개 히드록실기이다); 등으로 전환될 수 있다. 그러한 합성적으로 변경된 포스페이트-글리세롤기는 생체내에서 포스페이트-글리세롤을 발현할 수 있으며, 따라서 그러한 변경된 기는 포스페이트-글리세롤 전환가능한 기이다.
포스파티딜글리세롤은 잘 알려진 화합물이다. 그것은 예를 들어 포스파티딜글리세롤의 천연발생 이량체 형태인 카르디올리핀을 포스포리파제 D로 처리함에 의해서생성될 수 있다. 또한, 그것은 포스포리파제 D를 사용하여 포스파티딜콜린으로부터 효소합성하여 제조될 수 있다. 예를 들어 미국특허 5,188,951(Tremblay 등)를 참조한다. 화학적으로 그것은 포스페이트-글리세롤기 및 한 쌍의 유사하지만 상이한 C18-C20지방산 사슬을 가진다.
본원에 사용된 용어 "PG"는 결과의 PG 존재가 리포솜의 구조 성분으로서 참여할 수 있다면 광범위한 적어도 하나의 지방산 사슬과 함께 포스페이트-글리세롤기를 지니는 인지질들을 포함하도록 의도된다. 바람직하게, 그러한 PG 성분은 화학식 I에 의해 나타낼 수 있다:
상기 식에서, R 및 R1은 독립적으로, 포화 또는 불포화 직쇄형 또는 제한된 수의 분지를 함유하는 C1-C24탄화수소 사슬로부터 선택되며, 여기서 적어도 하나의 사슬은 10 내지 24개 탄소원자를 가진다. 본질적으로, 지질 사슬 R 및 R1은 활성 성분을 형성하기 보다는 오히려 리포솜의 구조 성분을 형성한다. 따라서, 이들은 구조적 기능을 다하기만 한다면 그러한 지질 사슬을 동일하거나 상이한 둘 또는 하나만 포함하도록 변화될 수 있다. 바람직하게, 지질 사슬은 약 10 내지 약 24개 탄소원자 길이일 수 있으며, 포화, 단일-불포화 또는 다-불포화된 직쇄이거나 또는 제한된 수의 분지를 가질 수 있다. 라우레이트(C12), 미리스테이트(C14), 팔미테이트(C16), 스테아레이트(C18), 아라키데이트(C20), 베헤네이트(C22) 및 리그노세레이트(C24)가 본 발명에 사용되는 유용한 포화 지질 사슬의 예이다. 팔미톨레에이트(C16), 올레에이트(C18), 리놀레네이트(C18) 및 아리키도네이트(C20)가 본 발명의 리포솜에서 PG로 사용되는 적합한 다-불포화 지질 사슬의 예이다. 라이소인지질로서 알려진 그러한 지질 사슬을 단 하나 갖는 인지질이 또한 본 발명에 유용하다. 또한, 본 발명은 활성 성분이 PG의 이량체 형태, 즉 카르디올리핀이지만 화학식 I의 다른 이량체도 역시 적합한 리포솜의 사용을 포함하는데까지 확장된다. 바람직하게, 그러한 이량체는 말레이미드와 같은 합성 가교결합제를 사용하여 합성적으로 가교결합될 수 없고, 오히려 Lehniger, Biochemistry, p. 525(1970)에 의해 설명된 대로 글리세롤 단위의 제거에 의해 가교결합되며, 이것을 하기 반응식으로 나타낸다.
성
상기 식에서, R 및 R1은 각각 독립적으로 상기 정의된 바와 같다.
상기 기재된 바와 같이, 어떤 한 이론에 한정되지는 않지만, PG 기와 그의 이량체는 단백질 또는 다른 분자("PG 수용체") 상의 특이적 부위와 결합하는 것으로 여겨지기 때문에 리간드로 여겨지며, 따라서 포스파티딜글리세롤(및 그의 이량체 형태)의 이 분자는 본원에서 때로는 "리간드"나 "결합기"로 언급된다. 그러한 결합은 본원에서 때로 "머리기", "활성기", 또는 "결합기"로 언급되는 포스페이트-글리세롤기 -O-P(=O)(OH)-O-CH2-CH(OH)-CH2-OH를 통해서 발생한다고 여겨진다. 상기한 관점에서 본다면, 본원에서 "결합", "결합기" 또는 "리간드"에 관한 언급이 어떤 메카니즘이나 작용 방식을 의미하는 것은 아니다. 그렇지만, 상기 포스페이트-글리세롤기는 환자 면역시스템 성분과의 상호작용을 위해 본 발명 물질의 외부 표면 상에 존재한다고 여겨진다. 이 상호작용은 항원제공세포 상에서 아폽토시스성 세포와 포스파티딜세린 수용체의 특이적 상호작용과 다르다는 것에 주목해야 한다.
"3차원 소체 부분" 또는 "약학적으로 허용되는 소체"의 예는 제약학 분야에서 통상 사용되는 천연 또는 합성의 생체적합성 재료로 된 리포솜, 고체 비드, 중공 비드, 충진 비드, 입자, 과립 및 미소구와 같은 생체적합성 합성 또는 반-합성 물질을 포함한다. 비드는 고체 또는 중공이거나 또는 생체적합성 물질로 충진될 수 있다. 용어 "생체적합성"은 사용된 양이 비독성이거나 허용되는 독성 프로필을 가짐으로써 생체내 사용이 허용되는 물질로 간주한다. 마찬가지로, "약학적으로허용되는 소체"에 관하여 사용된 용어 "약학적으로 허용되는"은 약학적으로 허용되며 생체내 송달에 적합한 하나 이상의 재료로 이루어진 소체로 간주한다. 그러한 소체는 지질로 형성된 리포솜을 포함하며, 그 중 하나가 PG이다. 또는 달리, 약학적으로 허용되는 소체는 생체적합성 재료로 된 고체 비드, 중공 비드, 충진 비드, 입자, 과립 및 미소구일 수 있으며, 이것은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(메틸메타크릴레이트), 폴리비닐피롤리돈, 폴리스티렌, 및 포스페이트-글리세롤기가 부착된 광범위한 다른 천연, 반-합성 및 합성 재료와 같은 하나 이상의 생체적합성 재료를 포함한다.
상기 주목된 대로, PG와 동일한 수용체 경로나, 또는 달리 수용자 신체에 항염증 반응을 가져오는 경로를 통하여 항원제공세포 상에서 PG 수용체와 상호작용하는 변형된 활성기를 갖는 포스파티딜글리세롤 유사체가 용어 포스파티딜글리세롤의 범위로 고려된다. 이것은 제한은 없지만, 하나 이상의 히드록실기 및/또는 포스페이트기가 유도된 화합물 또는 염 영태의 화합물을 포함한다. 많은 그러한 화합물은 화합물의 투여시나 투여에 이어서 생체내에서 유리 히드록실기를 형성하며, 따라서 전환성 PG기를 포함한다.
바람직한 조성물은 리포솜이며, 이것은 다양한 지질들로 이루어질 수 있다. 그러나, 바람직하게는 지질 중 어느 것도 양으로 하전되지 않는다. 리포솜의 경우 포스파티딜글리세롤 PG가 리포솜 층(들) 또는 벽(들)의 주요 부분이나 전체 부분을 구성할 수 있으며, 포스페이트-글리세롤기 부분은 바깥쪽으로 존재하도록 배향되어 결합기로서 작용하고, 지질 사슬 또는 사슬들은 구조벽을 형성한다.
리포솜, 또는 지질 소포는 미크론 또는 서브-미크론 범위의 밀봉낭이며, 이것의 벽(단층 또는 다층)은 적합한 양친매성 물질을 포함한다. 본 발명에서는 내부 내용물이 중요하지 않지만, 그들은 통상 수성 매질을 함유하며 일반적으로 불활성이다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 리포솜 뿐만 아니라 다른 약학적으로 허용되는 소체는 본질적으로 비지질성 약학적 활성 물질을 함유하지 않으며(예를 들어 <1%), 더 바람직하게는 비지질성의 약학적으로 허용되는 물질을 함유하지 않는다. 그러한 리포솜은 활성기가 리포솜 소체의 바깥쪽으로 존재하도록 제조되고 처리된다. 본 발명의 바람직한 구체예의 리포솜에서 PG는 이와 같이 리포솜의 리간드와 구조 성분 두 가지로 작용한다.
본 발명의 이와 같은 바람직한 구체예는 그들의 표면 상에 하나 이상의 포스페이트-글리세롤기를 노출하거나 노출하도록 처리 또는 유도되어 결합기로서 작용할 수 있는 리포솜 소체를 제공한다. 포스파티딜글리세롤이 바람직한 PG 리간드이며, 그러한 지질은 불활성 성분, 예를 들어 포스파티딜콜린 PC, 또는 상이한 메카니즘을 통해 작용하는 성분, 예를 들어 포스파티딜세린 PS, 또는 그러한 물질의 혼합물과 균형을 맞추어 리포솜을 10% 내지 100% 포함해야 한다. PC와 같은 불활성 보조성분이 바람직하다.
그러한 리포솜의 적어도 10중량%는 PG로 이루어지며, 바람직하게 적어도 50중량%, 더 바람직하게는 60 내지 100중량%, 가장 바람직하게 70 내지 90중량%로 이루어지고, 한 가장 바람직한 구체예에서는 약 75중량%의 PG로 이루어진다.
PG의 총량이 총 혼합물을 기준으로 최하 약 10% 이상, 바람직하게는 60% 이상으로 유지된다면, 상이한 메카니즘을 통해 작용하는 불활성 리포솜 및/또는 인지질의 리포솜과 PG 리포솜의 혼합물이 또한 사용될 수 있다.
본 발명에 사용되는 비-리포솜 물질에 관하여, 이들은 적합한 크기의 생체적합성 고체 또는 중공 비드를 포함한다. 생체적합성 비-리포솜 합성 또는 반합성 소체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(메틸메타크릴레이트), 폴리비닐피롤리돈, 폴리스티렌 및 표면에 포스페이트-글리세롤기가 부착된 광범위한 다른 천연, 반합성 또는 합성 재료로부터 선택될 수 있다. 그러한 재료는 본원에 참고자료로 그 전체가 수록된 Dunn 등의 미국특허 4,938,763에 의해 개시된 것들과 같은 생분해성 중합체를 포함한다.
생분해성 중합체는 본 분야에 개시되어 있으며, 예를 들어 직쇄 중합체, 예컨대 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리카프로락톤, 폴리안히드리드, 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리에스테라미드, 폴리오르토에스테르, 폴리디옥사논, 폴리아세탈, 폴리케탈, 폴리카르보네이트, 폴리오르토카르보네이트, 폴리포스파진, 폴리히드록시부티레이트, 폴리히드록시발레레이트, 폴리알킬렌 옥살레이트, 폴리알킬렌 숙시네이트, 폴리(말산), 폴리(아미노산), 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리히드록시셀룰로스, 키틴, 키토산, 및 그들의 공중합체, 삼중합체 그리고 조합을 포함한다. 다른 생분해성 중합체는, 예를 들어 젤라틴, 콜라겐 등을 포함한다.
기들 또는 결합기들을 갖는 인지질(들), 또는 그의 일부를 3차원 소체에 부착하는 유도체화에 적합한 물질은, 예를 들어 Polysciences Inc(400 Valley Road Warrington, PA 18976), 또는 Sigma Aldrich Fine Chemicals로부터 시중구입 가능하다. 그들의 유도체화 방법은 본 분야에 공지되어 있다. 그런 방법의 특히 바람직한 예는 본원에 참고자료로 수록된 국제특허출원 PCT/CA02/01398(Vasogen Ireland Limited)에 개시되어 있다.
환자는 포유동물일 수 있다는 것이 고려되며, 제한은 없지만 사람과 소, 말, 돼지, 개, 고양이 등과 같은 가축을 포함한다.
인지질은 양친매성 분자(즉, 양친매성 물질)이며, 이것은 이 화합물이 수불용성 탄화수소 사슬에 부착된 극성 수용성기를 갖는 분자를 포함한다는 의미이다. 매트릭스 층으로서 작용하는 양친매성 물질은 한정된 극성 및 비극성 영역을 가진다. 양친매성 물질은 본 발명의 PG에 더하여, 활성기를 지니는 인지질과 함께 사용되는 다른 천연발생 지질을 포함하거나, 또는 다른 것과의 혼합물로 포함할 수 있다. 리포솜 층(들)로서 작용하는 양친매성 물질은 폴리옥시에틸렌 알킬에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬에스테르 및 사카로스디에스테르와 같은 불활성의 구조부여 합성 화합물일 수 있다.
적합한 크기의 리포솜을 제조하는 방법이 본 분야에 공지되어 있으며 이것은 본 발명의 일부를 형성하지 않는다. 이것에 대해 다양한 교본과 문헌의 논문을 참고자료로 이용할 수 있으며, 예를 들어 논문 "Liposomes as Pharmaceutical Dosage Forms",(Yechezkel Barenholz 및 Daan J. A. Chrommelin), 및 본원에 인용된 문헌, 예를 들어 New, R. C. "LIposomes: A Practical Approach", (IRL Press at Oxford University Press (1990)을 참조한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서 리포솜 및 다른 약학적으로 허용되는 소체의직경은 약 20nm 내지 약 50㎛, 바람직하게는 약 2nm 내지 약 1000nm, 더 바람직하게는 약 50nm 내지 약 500nm, 가장 바람직하게는 약 80nm 내지 약 120nm이다(바람직하게 장축을 따라 측정됨). 한 구체예에서, 리포솜의 직경은 60nm 내지 500㎛이다.
약학적으로 허용되는 소체는 멸균 생리 식염수, 멸균수, 피로겐 무함유 물, 등장 식염수 및 포스페이트 완충용액(예를 들어, 포스페이트 완충액을 포함하는 멸균 수용액)과 같은 약학적으로 허용되는 담체 뿐만 아니라, 약제에 사용되는 다른 비독성 양립성 물질, 예를 들어 애쥬번트, 완충액, 보존제 등에 현탁될 수 있다. 바람직하게, 약학적으로 허용되는 소체는 완충 식염수 같은 멸균된 생체적합성 액체 중에 액상 현탁액으로 구성되며, 하나 이상의 면역시스템 성분에 그것을 노출시키는 어떤 적합한 경로에 의해, 예를 들어 동맥내, 정맥내 또는 가장 바람직하게는 근육내 또는 피하적으로 환자에게 투여된다.
약학적으로 허용되는 소체는 그들이 나중에 투여를 위해 재현탁될 수 있도록 냉동건조 또는 동결건조될 수 있다는 것이 고려된다. 본 발명은 또한 동결건조된 또는 냉동건조된 결합기를 지닌 소체와, 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들어 멸균 생리 식염수, 멸균수, 피로겐 무함유 물, 등장 식염수, 및 포스페이트 완충용액(예를 들어, 포스페이트 완충액을 포함하는 멸균 수용액), 그리고 약제에 사용되는 다른 비독성 양립성 물질, 예를 들어 애쥬번트, 완충액, 보존제 등을 포함하는 부분의 키트에 관한 것이다. 본 분야에 공지된 냉동건조용 예방보호제, 예를 들어 락토스 또는 수크로스가 또한 포함될 수 있다.
환자에게 약학적으로 허용되는 소체를 투여하는 바람직한 방식은 일주일 내지는 몇 개월의 기간에 걸쳐서 환자에게 매일, 주 몇 회, 매주 또는 매월 투여되는 주사 경로이다. 투여 과정의 주기 및 지속기간은 환자, 치료될 상태, 심각도, 그리고 치료가 예방적, 치료적 또는 치유적으로 처방되었는지에 따라 변할 수 있다. 투약 계획 및 최적화는 주치의의 기술 범위 내이다. 특히 둔근을 통한 근육내 주사가 가장 바람직하다. 본 발명의 적어도 일부의 처방에서, 한 특정한 주사 일정은 적합하다면 매월 간격으로 둔근을 통해 적합한 양의 물질을 1일째에 주사하고, 2일째에 추가 주사하고, 14일째에 추가 주사한 후, "추가접종"를 주사하는 것이다.
본 발명의 많은 구체예에서, 결합기로서 PG기들을 표면에 포함하는 약학적으로 허용되는 소체가 백신과 유사한 방법으로 환자의 면역 체계의 조절제로서 작용하고 있는 것으로 추정된다. 따라서, 그것들은 도입부위에서 소체의 충분한 편재화된 농도를 제공하기 위한 투여방법과 양으로 사용된다. 면역 체계 조절을 위해 적당한 이러한 소체의 양은 수용자의 신체 크기와 직접 상관되지 않을 수도 있고 따라서, 환자의 혈류 및 조직내의 활성물질의 치료학적 수준을 제공하도록 설계되어 있는 약물 투여량과는 분명하게 구별될 수 있다. 약물 투여량은 따라서 면역 체계 조절 투여량보다 훨씬 더 큰 것 같다.
리포솜의 중량과 리포솜의 수의 상관관계는 100 nm 직경 이중층 소포가, 층 사이에 대략 50:50으로 분포된 소포당 81,230개의 지질 분자를 갖는 리포솜 조제의 당업자에 의해 인정되어 지는 지식으로부터 유도가능하다 (Richard Harrigan- 1992 University of British Columbia PhD 논문 "리포솜에 있어서 멤브레인 경유 pH 구배 (microform) : 약물-소포 상호작용 및 프로톤 플럭스", published by National Library of Canada, Ottawa, Canada (1993); University Microfilms order no. UMI00406756 ; Canadiana no. 942042220, ISBN 0315796936 참조). 이로부터, 예를 들어, 이하의 특정 생체내 실시예에서 사용된 투여량의 오다의 5×108개 소포의 투여량이 4.06×1013개 지질 분자에 상당한다는 것을 계산할 수 있다. 그램 분자내 지질 분자의 수(몰)에 대한 아보가드로수인 6.023×1023을 사용하여, 이것은 PG에 대한 729의 분자량에서 이러한 투여량에 대해 대략 3.83×10-8gm, 또는 38.3ng의 PG인 6.74×10-11몰을 나타낸다는 것을 결정한다.
투여할 약학적으로 허용되는 소체의 양은 치료하고자 하는 포유동물 질병의 성질과 환자의 정체 및 특징에 따라 다양할 것이다. 바람직하게는, 약학적으로 허용되는 소체의 유효량은 환자에게 비독성이고 면역체계를 압도할 만큼 크지 않다. 약학적으로 허용되는 소체의 멸균 수성 현탁액의 동맥내, 정맥내, 피하 또는 근육내 투여를 사용할 때, 각 투여량에 대해, 등부피의 전체 혈액에서 정상적으로 발견되는 백혈구의 수의 10%-1000%에 일반적으로 상당하는 소체의 양을 함유하는 약 0.1-50 ml 의 액체를 투여하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 사람 환자에의 매 송달시의 소체의 수는 약 500 내지 약 2.5×109(리포솜의 경우에 < 250 ng 소체, 소체의 다른 구체예에 대해 밀도 차이로 할당된 것), 더 바람직하게는 약 1,000 내지 약 1,500,000,000, 더욱더 바람직하게는 10,000 내지 약 50,000,000, 및 가장 바람직하게는 200,000 내지 약 2,000,000의 범위이다.
본 발명의 방법에서 약학적으로 허용되는 소체는 백신의 성질을 띠고 있는 면역 체계 조절제로서 작용하기 때문에, 각 투여에 대한 주사부위에 투여된 이러한 소체의 수는 환자 체중 단위당 소체의 수 또는 중량보다 더 의미있는 정량일 수도 있다. 같은 이유로, 이제, 작은 동물에의 사용을 위한 소체의 유효량 또는 수가, 중량비례로, 큰 포유동물(즉, 5kg이상)에 대한 유효량으로 직접 해석되지 않을 수도 있다는 것이 생각된다.
본 발명은 T-세포 기능, 염증, 내피세포 기능부전 및 부적절한 사이토카인 발현이 수반되는 크게 다양한 포유동물 질병의 예방 및/또는 치료에의 용도를 가리킨다. 이러한 질병을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 환자가 치료를 위해 선택된다. "치료"는 특정 질환의 증상의 중한 정도나 회수의 감소 또는 증상의 더 이상의 진행의 제한과 같은 증상의 감소를 말하나, 이에 제한되지는 않는다.
T-세포 기능 (T-세포 매개) 질병에 관하여, 이들 질병은 적어도 부분적으로 T-세포에 의해 매개된 어떤 모든 질병을 포함하며 예를 들어서, 궤양, 상처, 그리고 당뇨병, 공피증, 건선 및 류마티스 관절염을 포함하나 이들에 제한되지 않는 자가면역 질환을 포함한다.
본 발명은 또한 염증성 알레르기 반응, 기관 및 세포이식 반응 장애, 및 염증반응을 일으키는 미생물 감염에의 용도를 가리킨다. 본 발명은 또한 산화성 스트레스 및/또는 허혈 재관류, 독소의 섭취, 독성 화학물질에의 노출, 방사선 손상, 그리고해로운 염증을 일으키는 공기 및 수인성 자극 물질에의 노출 등에 대한 예방에의 용도를 가리킨다. 본 발명은 또한 신장, 간, 심장 등과 같은 내부 기관의 염증, 알레르기 및 T-세포 매개 질병을 위한 용도를 가리킨다.
본 발명이 가리키는 부적절한 사이토카인 발현을 수반하는 질병에 관하여, 이것들은 부적절한 사이토카인 발현을 수반하는 어떤 모든 질병을 포함하며, 예를 들어서, 신경퇴행 질환을 포함한다. 다운 증후군, 알쯔하이머 병 및 파킨스 병을 포함하는 신경퇴행 질환은 인터루킨-1β(IL-1β)를 포함하는 어떤 사이토카인의 증가된 수준과 관련된다 (Griffin WST et al. (1989); Mogi M. et al. (1996) 참조). IL-1β는 해마에서 장기 상승작용을 억제하는 것으로 또한 나타났다 (Murray, C.A. et al. (1998)). 해마에서의 장기 상승작용은 시냅스 유연성의 형태이고 일반적으로 기억과 학습을 위한 적절한 모델인 것으로 생각된다 (Bliss, T. V. P. et al. (1993)). 따라서, 뇌에서의 부적절한 사이토카인 발현은 현재 신경퇴행 질환 및 신경염증 질병의 발달 및 진행에 수반되는 것으로 생각된다.
따라서, 본 발명은 다운 증후군, 알쯔하이머 병, 파킨슨 병, 노인성 치매, 우울증, 헌팅톤 무도병, 말초 신경병증, 구일라인 바르(Guillain Barr) 증후군, 척수질환, 신경병성 관절 질환, 만성 염증성 수초파괴 질환, 단발신경병증, 다발신경병증, 비대칭 말단 감각 신경병증, 신경근육 이음부 질병, 근육무력증 및 비근육영양 측경화증 (ALS)을 포함하는 신경병증을 포함하는 크게 다양한 포유동물 신경퇴행 및 다른 신경병성 질병의 치료 및 예방을 위한 용도를 가리킨다. 이들 신경퇴행 질환의 치료 및 예방은 본 발명의 특히 바람직한 구체예를 나타내며, 알쯔하이머 병, 파킨슨 병 및 ALS가 특히 바람직하다.
내피세포 기능부전을 수반하는 질병에 관하여, 본 발명은 적어도 부분적으로 내피세포 기능부전 매개된 어떤 모든 질병을 포함하는 크게 다양한 이러한 포유동물 질병의 치료 및 예방을 위한 용도를 가리키며, 예를 들어서, 동맥경화증, 말초 동맥 또는 동맥폐색증, 울혈성 심부전, 뇌혈관질환(발작), 심근경색, 앙기나, 고혈압, 등과 같은 심장혈관 질환, 레이너드 병(Raynaud's disease), 심장증후군 X, 편두통 등과 같은 혈관경련 질병, 그리고 허혈로부터 결과되는 손상(허혈손상 또는 허혈-재관류 손상)을 포함한다. 요약하면, 병인이 부적절하게 기능하는 내피세포를 수반하는 실질적으로 어떤 질병도 될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에 대한 더이상의 교시내용은 상처 치유 및 궤양 치유 속도를 촉진하기 위한 환자의 치료와 외과적 수술에 앞서 환자의 수술상처 및 절개부의 치유속도를 포함하여 환자의 회복속도를 촉진하기 위한 환자의 치료를 포함한다.
"심장 질병"에 관하여, 본 발명은 심장에 관한 어떤 모든 질병을 포함하는 크게 다양한 이러한 포유동물 질병의 치료 및 예방을 교시하며, 예를 들어서, 심실 부정맥(심실 빠른맥 또는 세동) 및 심장질환으로인한 돌연사를 포함한다.
환자의 부정맥 및 돌연 심장사와 같은 심장 질병의 혐의는 심박 리듬에서 지연된 QT-c 간격에 의해 표시된다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따르는 조성물의 투여는 포유동물 환자에서 QT-c 간격을 감소시키는 것으로 생각되고 이것은 부정맥 및 돌연 심장사의 혐의가 줄어든 것을 가리킨다.
본 발명을 예시의 목적인 다음의 비제한적 실시예에서 더 기술한다.
이하의 실시예에서, 다음의 약어는 다음의 의미를 갖는다. 약어에서 정의되지 않은 것은 일반적으로 허용되는 의미를 갖는다.
㎍ = 마이크로그램
㎕ = 마이크로리터
㎛ = 마이크로미터
μM = 마이크로몰
CHS = 접촉 고감도(contact hypersensitivity)
cm = 센티미터
DMSO = 디메틸술폭시드
DNFB = 2, 4-디니트로플루오로벤젠
DHS = 지연형 고감도(delayed-type hypersensitivity)
EtOH = 에탄올
g = 그램
hrs = 시간
Hz = 헤르츠
IM = 근육내
IP = 복강내
kg =킬로그램
LPS = 리포다당류
LTP = 장기 상승작용
mg = 밀리그램
min = 분
ml = 밀리리터
mM = 밀리목
ms = 밀리초
ng = 나노그램
nm = 나노미터
nM = 나노몰
PBS = 인산염완충식염수
PCR = 폴리머라제 연쇄반응
POPS = 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린],여기서 PS라 함
POPG = 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3- [포스포-rac- (l-글리세롤)]], 여기서 PG라 함.
POPC = 1-팔미토일-2-올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 여기서 PC라고 함.
RPM = 분당 회전수
S = 초
달리 언급이 없으면, 실험에서 사용된 지질의 정밀한 형태는 상기 제시된 바와 같은 POPS, POPG 및 POPC 이었다.
실시예 1
당업계에 공지된 표준 방법에 따라 평균 직경 100±20nm의 리포솜을 제조하였고 리포솜은 하기 조성을 가졌다.
그룹 A-100% PS
그룹 B-100% PG
그룹 C-대조군, 리포솜 없음.
ml당 4.8 x 1014리포솜을 함유하는 각각의 리포솜 조성의 보존 현탁액은 PBS로 희석되어 ml당 6 x 106입자들을 함유하는 주사 현탁액을 제공한다. 리포솜 현탁액은 생쥐 접촉 과민(CHS) 모델에서 귀 종창에 대한 효과를 결정하기 위해, 6-8 주령이고 19-23 g 체중의 암컷 BALB/c 마우스 (Jackson Laboratories)안으로 주사하였다. CHS 모델은 THL-매개 염증 반응을 검사한다.
동물들은 각각의 그룹에서 5마리 동물을 갖는 3 그룹중 하나로 배당되었다. 그룹 A 와 B는 대략 50 μ1의 부피로, 위에서 확인된 리포솜(즉, 각각 100% PC 및 100%)의 대략 3 x 105를 받았다. 그룹 C는 리포솜을 받지 않는 대조군 그룹이었다.
프로토콜
하기의 실험을 수행하였다:
그룹 리포솜 1일 2일 3일 4일 5일 6일 7일(24시간)
A 100% PS 주사한 후에 감작 주사 주사 주사 주사 주사한 후에 항원자극 귀 측정
B 100% PG 주사한 후에 감작 주사 주사 주사 주사 주사한 후에 항원자극 귀 측정
1-6일째에, 그룹 A 와 B의 마우스는 각각의 리포솜 제제를 주사하였다. 시험 기간에 걸쳐서 약 1,800,000 리포솜의 총 투여를 위해 대략 300,000 리포솜이 근육내 (IM) 주사를 통해 50 μl 부피로 주사되었다. 대조군 그룹 (그룹 C)의 마우스는 리포솜을 전혀 받지 않았지만, 하기에 기술된 바와 같이 그룹 A 와 B와 동일한 방식으로 감작시키고, 항원자극하고 시험하였다.
감작
1일째에, 그날에 있어서 리포솜 주사후에, 마우스는 IP 주사를 통해 0.2 ml 5 mg/ml 나트륨 펜토바르비탈로 마취시켰다. 마우스의 복부 피부에 70% EtOH을 분무하고 외과용 메스 칼날을 사용하여 복부로부터 약 1-인치 직경 패치의 털을 제거하였다. 면도된 영역은 그후 피펫 끝을 사용하여 4: 1 아세톤: 올리브유 중의 25μl의 0.5% 2,4-디니트로플루오로벤젠(DNFB)으로 도포하였다.
항원자극
6일째에 리포솜 주사후에, 마우스는 피펫 끝으로 오른쪽 귀의 등쪽 표면위에 10 μl의 0.2% DNFB으로 도포하고 피펫 끝으로 왼쪽 귀 위에 10 μl의 부형액을 도포함으로써 항원자극시켰다.
결과
7일째에, 항원자극 24 시간 후에, 각각의 동물은 Halothane으로 마취시키고, 귀 두께는 Peacock 스프링-로드 마이크로미터를 사용하여 측정하였다. 데이타는 처리된 오른쪽 귀 두께와 부형액-처리된 왼쪽 귀 두께 사이의 차이로서 표현되었다. 실험은 유사한 동물에서 3회 반복하였다. 귀 종창의 증가는 CHS 반응의 척도로서 사용되었다. 데이타의 유의성은 양쪽 꼬리 스튜던트의 t-검정에 의해 결정되었다. < 0. 05의 P 값은 유의한 것으로 간주되었다.
결과는 도 1에 나와있고, 막대 그래프는 μm로 보고된, 귀 종창의 3개의 실험으로부터의 평균 값을 보여준다.
도 1은 본 발명에 따르는 리포솜의 주사에 의해 귀 종창의 상당한 감소를 얻었다는 것을 보여준다. 100% PG 리포솜으로 획득된 감소는 100% PS 리포솜으로부터의 그것보다 실질적으로 더 크다.
실시예 2
평균 직경 100±20 nm의 리포솜을 당업계에 공지된 표준 방법에 따라 제조하였고 그것은 하기의 조성을 가졌다:
그룹 A-100% PG
그룹 B-75% PG, 25% PC
그룹 C-50% PG, 50% PC
그룹 D-25% PG, 75% PC
그룹 E-PBS만
그룹 F-주사하지 않음
ml 당 4. 8 x 1014리포솜을 함유하는 각각의 리포솜의 A 보존 현탁액은 희석되어 ml 당 12 x 106리포솜을 함유하는 주사 현탁액을 제공하였다. 리포솜 현탁액은 THL-매개 염증 반응을 검정하는데 유용한 생물학적 시스템인 생쥐 CHS 모델에서 귀 종창에 대한 효과를 결정하기 위해 마우스 안으로 주사되었다. 이들 실험을 위해, 6-8 주령이고 19-23 g 체중인 암컷 BALB/c 마우스(Jackson Laboratories)를 사용하였다.
동물은 각각의 그룹에 10마리 동물을 갖는 6개의 그룹(그룹 A-F, 상기) 중 하나로 배당되었다. 주사를 받지 않거나(그룹 F) 리포솜이 없는 PBS 주사를 받은(그룹 E) 대조군 그룹들이 또한 포함되었다. 그룹 A-D에서의 동물은 각각 약 6 x 105리포솜을 함유하는, 위에서 확인된 리포솜 현탁액의 50μ1를 주사하였다.
프로토콜
시험은 잠재적으로 염증을 유발하는 물질로의 감작(Sens), 시험 동물에서 리포솜 또는 대조군에서 PBS의 주사(Inj) 그리고 리포솜의 주사가 항원자극의 의한 염증의 발전에 대해 효과적인지 여부를 결정하기 위한 측정(Meas) 후에 잠재적으로 염증-유발 물질로 항원자극 (Chal)을 포함한다.
하기의 실험을 수행하였다:
그룹 리포솜 1일 2일 3일 4일 5일 6일 7일
A 100% PG Sens & Inj Inj Inj Inj Inj Chal& Inj Meas
B 75% PG Sens & Inj Inj Inj Inj Inj Chal& Inj Meas
C 50% PG Sens & Inj Inj Inj Inj Inj Chal& Inj Meas
D 25% PG Sens & Inj Inj Inj Inj Inj Chal& Inj Meas
E 없음(PBS만) Sens & Inj Inj Inj Inj Inj Chal& Inj Meas
F 없음 Sens Chal Meas
1-6일째에, 마우스는 위에서 지시한 각각의 리포솜 제제를 주사하였다. 시험 기간에 걸쳐서 3,600,000 리포솜의 총 투여를 위해, IM 주사를 통해 50 μl 부피로 즉, 주사당 600,000 리포솜이 주사되었다. 대조군 그룹의 마우스는 리포솜을 전혀 받지 않았지만, 하기에 기술된 바와 같이 다른 그룹의 마우스와 동일한 방식으로 감작시키고, 항원자극하고 시험하였다.
감작 (Sens)
1일째에, 그날에 대해 리포솜 주사 후에, 마우스는 IP 주사를 통해 0.2 ml 5 mg/ml 나트륨 페노바르비탈로 마취시켰다. 마우스의 복부 피부는 70% ETOH로 분무하였고 칼날을 사용하여 복부로부터 약 1인치 직경의 털을 제거하였다. 면도된 영역은 피펫 끝을 사용하여 4: 1 아세톤: 올리브유중의 25μl의 0.5% 2,4-디니트로플루오로벤젠 (DNFB)으로 도포되었다.
항원자극 (Chal)
6일째에, 그날에 있어서 리포솜 주사 후에, 마우스는 하기에 따라 DNFB로 항원자극되었다(Chal): 10μl의 0.2% DNFB를 피펫 끝으로 오른쪽 귀의 등쪽 표면위에 도포하고 10 μl의 부형액은 왼쪽 귀위에 피펫 끝으로 도포되었다.
결과
7일째에, 항원자극 24 시간 후에, 각각의 동물은 Halothane으로 마취시키고, Peacock 스프링-로드 마이크로미터를 사용하여 귀 두께를 측정하였다(Meas). 귀 종창의 증가는 CHS 반응의 척도로서 사용되었다. 데이타는 처리된 오른쪽 귀 두께에서 부형액 처리된 왼쪽 귀의 두께를 뺀 것에서의 차이로서 나타내었다. 2개의 그룹 사이의 유의성은 양쪽 꼬리 스튜던트의 t-검정에 의해 결정되었다. < 0. 05의 P 값은 유의한 것으로 간주된다.
결과는 도 2에서 그래프로 나타내고, 막대 그래프는 μm으로 귀 종창을 나타낸다. 각각의 실험으로부터의 평균값은 그래프를 수집하는데 사용되었다.
도 2는 100 와 75% PG 모두로 귀 종창에서의 상당한 감소가 달성된다는 것을 보여주며, 이 농도 모두 알레르겐성 물질인 DNFB과의 접촉으로부터 기인하는 염증의 발전을 막는다는 것을 나타낸다. 50% 와 25% PG 리포솜은 또한 두가지 대조군과 비교할 때 감소를 나타내었지만, 그 차이는 이 실험에서 통계적 유의성에 도달하지는 않았다.
실시예 3
평균 직경 100± 20 nm의 리포솜은 당업계에 공지된 표준 방법에 따라 제조되었고 75% PG, 25% PC으로 구성되었다. ml 당 4.8 x 1014리포솜을 함유하는 보존 현탁액은 이전과 같이 사용되었고 PBS에서 희석되어 하기 농도의 리포솜을 함유하는 주사 현탁액을 제공하였다:
그룹 리포솜 농도(mL당 리포솜) 주사 당 리포솜 그룹에서의 동물
A 75% PG, 25% PC 12 x 1011 6 x 1010 10
B 75% PG, 25% PC 12 x 109 6 x 108 10
C 75% PG, 25% PC 12 x 108 6 x 107 16
D 75% PG, 25% PC 12 x 107 6 x 106 16
E 75% PG, 25% PC 12 x 106 6 x 105 16
F 없음(PBS만) 16
BALB-c 마우스는 리포솜을 받지 않지만 50 μL의 PBS로 주사한 대조군 그룹(그룹 F)을 포함하는 6개의 그룹(그룹 A-F)으로 나누었다. 마우스는 옆구리에서 감작되었고, 감작(1일)과 같은 날과, 그러나 그후에 2,3,4 및 5일째에 그들의 선택된 리포솜 용량으로 오른쪽 다리 근육에 근육내 주사하였다. 6일째에 그들은 실시예1에서 기술된 바와 같이 귀위에 주사하고 항원자극되었다. 귀의 두께는 기술된 바와 같이 항원자극 24 시간 후에 측정되었다.
결과(도 3)는 대조군 그룹(그룹 F)과 그룹 C(ml 당 12 x 108리포솜)사이 및 대조군 그룹과 그룹 D(ml 당 12 x 107리포솜)사이 그리고 대조군 그룹과 그룹 E(ml 당 12 x 106리포솜 )사이의 상당한 차이를 보여준다. 대조군 그룹과 그룹 A 또는 B (각각, ml 당 12 x 1011과 12 x 109리포솜) 사이에 차이가 거의 없었고, 이는 그 농도 이상에서는 유익한 효과가 감소될 수 있는 최적 범위의 리포솜 농도가 존재한다는 것을 암시한다. 다른 실험에서는, 리포솜의 농도가 ml 당 12 x 104리포솜 아래로 감소될 때 효과의 감소가 또한 관찰되었다.
실시예 4
조제물 100% PG 및 평균 크기 100±20 nm의 리포솜을 표준 방법에 따라 제조하였다. 10마리 마우스의 4개의 그룹(그룹 A-D)은 실시예 3에서 기술된 과정과 스케줄에 따라 50 μl 현탁액에 송달된 하기 수의 100% PG 리포솜으로 감작시키고, 주사하고 항원자극하였다.
그룹 A- 6 x 107
그룹 B- 6 x 106
그룹 C- 6 x 105
그룹 D- 6 x 104
실시예 4로부터의 PBS 대조군과 함께, 결과는 도 4에서 유사한 막대 그래프 형태로 나타낸다. 대조군 그룹과 비교할 때, 귀 종창에서의 상당한 감소가 시험 그룹의 각각에 대해 나타나겠지만, 다양한 그룹들 사이에서는 차이는 거의 없다.
실시예 5
평균 직경 50, 100, 200, 400 nm의 조성 75% PG, 25% PC 리포솜을 표준 방법에 의해 제조하였다. 그들은 실시예 3 과 4에서와 같이 생쥐 CHS 모델에서, 각각의 주사를 대해 50 μl 현탁액 중의 6 x 105리포솜, 및 실시예 3에서와 같은 감작-주사-항원자극 스케줄 및 과정을 사용하여 시험되었다. 그룹은 하기와 같았다:
그룹 A- 50 nm 리포솜
그룹 B- 100 nm 리포솜
그룹 C- 200 nm 리포솜
그룹 D- 400 nm 리포솜
그룹 E- 리포솜 없음
결과는 도 5에 나와있다. 400 nm 직경 리포솜을 사용하는 그룹 D로부터의 결과는 대조군 그룹 (그룹 E)과 상당히 다르지는 않고, 이 모델에서 예상되는 크기 범위 결정성을 나타낸다.
실시예 6
ml 당 4.8 x 1014리포솜을 함유하는 평균 직경 100±20 nm의 75% PG 리포솜의 보존 현탁액을 희석시켜 ml 당 6 x 105리포솜을 함유하는 주사 현탁액을 제공하였다. 생쥐 DHS 모델에서 귀 종창에 대한 효과를 결정하기 위해, 리포솜 현탁액을 사용하여 마우스 안으로 주사하였다. 실시예 1에서와 같이, 6-8 주령이고 19-23 g 체중인 암컷 BALB/c 마우스 (Jackson Laboratories)를 사용하였다.
동물은 각각의 그룹에서 10마리 동물을 갖는 3개의 그룹 중 하나로 배당되었다. 대조군 그룹 (그룹 C)은 오직 PBS 주사만을 받았다. 그룹 A 와 B의 동물은 6 x 105리포솜을 함유하는 50μl의 현탁액으로 주사하였다.
프로토콜
13-18일째에 마우스는 아래에 지시한 바와 같이 75% PG 리포솜으로 주사하였다. 리포솜은 시험 기간에 걸쳐 3,600,000 리포솜의 총 투여를 위해, IM 주사를 통해 50 μl 부피로, 즉, 주사당 600,000 리포솜이 주사되었다. 실시예 2에서 기술된 바와 같이 감작과 항원자극을 수행하였다.
일 처리
1 감작
6 항원자극됨
7 측정됨
12 항원자극됨
13 측정 및 주사
14 주사
15 주사
16 측정 및 주사
17 주사
18 주사 및 항원자극
19 측정
결과
결과는 첨부한 도 6에서 그래프로 나타내고 75% PG는 16일째에서 두번째 항원자극 후의 세번째 주사 24 시간후에 DHS 모델에서 효과적이라는 것을 보여준다.
실시예 7
100% 카디오리핀(CL)로 구성되고 평균 직경이 100±20 nm인 리포솜을 표준 방법에 의해 제조하였다. 이들은 실시예 6에서 기술된 생쥐 DHS 모델에서 주사 당 50 μl 당 6 x 105리포솜의 투여량으로 사용되었다. CL 리포솜로 주사한 동물(그룹 A; 10 동물)로부터 얻어진 데이타는 PBS만을 받는 동물(그룹 B; 10 동물)로부터 얻어진 데이타와 비교되었다. 감작, 주사 및 항원자극 과정은 실시예 2에서 기술된 바와 같았다. 19 일째 6번째 주사후 24시간에 얻은 귀 두께 측정 결과는 도 7에 나타나있다. 결과는 CL-주사된 시험(그룹 A) 내에서 귀 종창에서의 상당한 감소를 보여주었다.
실시예 8
평균 직경 100 nm 이고, 100% 카르디올리핀 또는 75% 카르디오리핀 및 25% PC 를 포함하는 리포솜을 표준 방법으로 제조하였다. 3개의 그룹(그룹 A-C)의 10 마리 마우스를 1일에 감작시켰다. 1, 2, 그리고 6일에 대조표준 그룹(그룹 C)에 PBS 를주입하였다. 동일한 스케줄에 따라서 주입당 50㎕로, 6×105100% 카르디오리핀 리포솜(그룹 A) 또는 6×10575% 카르디올리핀 리포솜(그룹 B)의 리포솜을 다른 2개의 그룹에 주입하였다. 7일에 마우스를 항원자극하였고, 상기 실시예들에 기재된 대로 귀 두께를 측정하였다.
도 8은 각 그룹의 평균 측정치를 도시한다. CL 리포솜을 수용한 두 그룹은대조표준 그룹에 비교할 때, CHS 의 통계학적으로 유의한 억제를 나타냈다.
실시예 9
인지기능의 기저를 이루는 세포 및 분자적 메카니즘을 연구하기 위해서, 장기간 증강(LTP) 동물 모델을 사용하였다. LTP 는 학습 및 기억을 위한 생물학적 기질로서 제안되어온 해마체에서 발생하는 스냅스 유연성 형태이다(Bliss 등, Nature 361:31-39(1990)). 래트의 LTP 를 당업계에서 잘 알려진 방법에 의해서 전기생리학적으로 모티터하였다. 그 다음, 해마 조직내의 생화학적 변화를 조사하기 위해서 동물을 도살하였다. 전기생리적 데이타 결과와 생화학적 해마 변화의 비교는 노화, 스트레스, 알쯔하이머 질환, 및 박테리아 감염과 같은 신경성 염증과 연관된 질환 또는 장애를 앓는 동물에서 LTP 의 기저를 이루는 세포 이벤트가 어떻게 변경될 수 있는지를 결정하는데 유용하다.
리포폴리사카라이드(LPS)의 전신투여, 그람-네가티브 박테리아의 세포벽 성분은 IL-1β와 같은 염증 촉진성 사이토카인의 증가를 유발함으로써 면역계의 활성화를 유발한다. 상기에 언급된 대로, LPS 및 IL-1β에 의해서 유발된 신경세포 결손의 예는 해마에서 LTP 의 기능장애이다. LTP 의 지표는 흥분성 시냅스 후 전위 (epsp) 집합의 평균 기울기이다. 강직성 자극시에, epsp 기울기(%)는 빠르게 증가하고, 이것은 증가된 시냅스 활성을 나타낸다. LTP 의 LPS-유발 저해는 기울기의 증가를 감소시키고, 및/또는 epsp 기울기가 더욱 빠르게 기저선으로 되돌아가게 한다. 이것은 증가된 시냅스 활성이 일시적임을 나타낸다. 따라서, 강직성 자극후에 조정된 시간 간격에서 epsp 기울기(%)의 측정치가 뇌의 해마에 있어서의 염증자극에 뿐만 아니라 염증에 따른 기억 및 기억상실을 반영하는데 사용될 수 있다.
평균 직경 100±20 nm 의 리포솜을 표준 방법으로 제조하였고, 이것은 75% PG 및 25% PC 로 이루어져 있다. ml 당 약 2.9×1014리포솜을 함유하는 리포솜의 스톡 현탁액을 PBS 로 희석하여 ml 당 약 1.2×107리포솜을 함유하는 주입 현탁액을 얻었다. 그 다음, LTP 의 LPS 유발 기능 장애에 대한 효과를 결정하기 위해서 이것을 래트에 주입하였다. 이러한 실험들에, 약 300 g 체중의 수컷 위스타 (Wistar) 래트(BioResources Unit, Trinity College, Dublin)를 사용하였다.
동물은 각각의 그룹에서 8마리 동물을 갖는 4개의 그룹 중 하나로 배당되었으며, 다음과 같이 처치되었다.
그룹 A - 식염수 + 대조표준
그룹 B - 식염수 + PG
그룹 C - LPS + 대조표준
그룹 D - LPS + PG
1, 13, 및 14일에 IM 주입을 통해서 각각의 상기-동정된 제제의 150㎕를 주입하였다. 그룹 B 및 그룹 D는 총 5,400,000 리포솜(주입당 1,800,000 리포솜)을 수용하였다. LTP 방법 및 조직 제조 방법을 0일에서 수행하였다.
LTP 방법
우레탄(1.5g/kg)의 IP 주입으로 래트를 마취시켰다. 래트는 복막내로 LPS(100㎍/kg) 또는 식염수를 수용하였다. 3시간 후에, 양극 자극전극 및 단극 기록전극을 각각 관통섬유 및 치상회의 등측 세포체 영역에 놓았다. 0.033 Hz 의 시험 쇼크를 가하였고, 고주파 자극 전 10분동안과 자극후 45분 동안 반응을 기록하였다(30초 간격, 200 ms 동안 250Hz 로 전달된 일련의 3 자극).
래트를 절두하여 죽였다. 해마, 강직 치상회 및 비강직 치상회, 대뇌피질 및 측후각뇌 피질을 아이스상에서 절개하였고, 절편화하였고, 10% DMSO 를 함유하는 1ml Krebs 용액(mM 중의 Krebs 조성: NaCl 136, KCl 2.54, KH2PO41.18, MgSO4.7H20 1.18, NaHCO316, 글루코스 10, CaCl21.13)으로 동결하였다.
결과
결과는 도 9에 나타난다. 그래프는 과립 세포의 세포체에서 기록된 흥분성 시냅스 후 전위(epsp)에서의 차이를 나타낸다. 제공된 데이타는 각 처치 그룹에서 7 내지 8 관측물의 평균이고, 강직성 자극 바로 5분전의 평균값과 비교하여 표준화된 매 30초마다의 epsp 기울기의 평균 백분율 변화로 나타난다. 도 9는 관통섬유-과립 세포 시냅스에서 LTP 의 LPS 유발 저해가 PG 리포솜으로의 예비 처치로 회복될 수 있다는 것을 나타낸다. 채워진 삼각형은 그룹 A(식염수 + 대조표준)을 나타내고, 오픈 삼각형은 그룹 D(식염수 + PG)를 나타내고, 채워진 사각형은 그룹 C(LPS + 대조표준)을 나타내고, 오픈 사각형은 그룹 D(LPS + PG)를 나타낸다.
도 10은 경직성 자극 40-45분 후의 평균값의 분석을 나타내고, epsp 기울기 집합이 대조표준-LPS 그룹(오픈 막대)에서 감소하였고, PG 리포솜(빗금친 막대)이 유의하게 이 효과를 반전하였다는 것을 나타낸다(*p〈0.01). 기억 및 학습 기능의지표로서, 본 실시예에서 증명된 LTP 의 유지능력의 향상은 예를 들어, 알쯔하이머 질환 및 기억상실과 같은 치매에 대한 치료에 적합하다는 것을 나타낸다.
실시예 10
IL-4 는 림프구의 Th2 서브클래스에 의해서 분비된 많은 사이토카인 중의 하나이고, 그것의 항-염증효과로 알려져 있다. 도 11은 해마에서의 IL-4 농도가 PG 리포솜(*p〈0.05)으로 예비-처치된 LPS 그룹에서 유의하게 증가되었다는 것을 나타낸다. 오픈 막대는 대조표준 그룹(그룹 E)을 나타내고, 빗금친 막대는 PG 처치그룹(그룹 F)을 나타낸다. IL-4 는 ELISA 로 측정하였고, 총 단백질의 mg 당 IL-4 의 PG 로 표현되었다. 뇌에서의 항-염증성 사이토카인 IL-4 의 상향조절은 파킨스 질환, ALS, 만성 염증 탈수초화 질환 CIPD 및 길레인 바레 증후군을 포함하는 광범위한 신경염증성 장애의 치료에 있어서 본 발명의 바람직한 구체예의 방법 및 조성물의 사용을 나타낸다.
실시예 11
IL-1β 는 림프구의 Th1 서브클래스에 의해서 분비된 많은 사이토카인 중 하나이고, 염증촉진성 효과로 알려져있다. 실시예 9, 이것의 그룹 C 및 D 에 기재된 대로 처치된 동물로부터 비장을 추출하였고, 비장세포를 수집하였다. 다음과 같이 준비하였다.
도 12는 비장세포에서 IL-1β 농도가 PG 리포솜(*p〈0.05)으로 예비-처치된 LPS 그룹에서 유의하게 감소되었다는 것을 나타낸다. IL-1β를 ELISA 로 측정하였고, 총 단백질의 mg 당 IL-1β 피카그램으로 표현되었다. 이것은 본 발명의 바람직한 구체예의 방법 및 조성물의 전신성 염증효과를 나타낸다.
실시예 12
U937 은 포르볼에스테르의 투여에 의해서 마크로파아지로 분화될 수 있는 단핵구 백혈병 세포주이다. 그람-네가티브 박테리아의 세포벽 성분인 리포폴리사카라이드(LPS)로의 처치는 TNFα를 포함하는 수많은 염증성 분자의 발현을 상향조절하면서 U937 세포에서 염증성 반응을 자극한다. 이러한 모델은 항-염증 요법을 평가하기 위한 실험 시스템을 제공한다. 마크로파아지는 추정된 항-염증성 조성의 존재하에서 배양 배지에서 증식될 수 있고, TNFα의 발현이 측정될 수 있다.
당업계의 표준 방법에 따라서 평균 직경 100±20nm 의 리포솜을 제조하였고, 이것은 75% 포스파티딜글리세롤(PG), 25% 포스파티딜콜린(PC)의 조성을 가졌다. 리포솜의 스톡 농도는 약 40mM 리피드였고, 검정에서 다음의 최종 농도로 희석되었다:
100μM 포스파티딜글리세롤(PG)
40μM PG
10μM PG
4.0μM PG
1μM PG
U937 세포를 10% 우태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 배지(GIBCO BRL)에서 증식시킴으로써 배양하였고, 5% CO2를 함유하는 대기중에서 37℃로 배양하였다. 5 ×105세포를 6-웰 플레이트의 벽에 접종하였고, 2-3일동안 150nM 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)로 처리함으로써 마크로파아지로 분화되도록 하였다. 그 다음, U937 세포가 마크로파아지로 분화된 후에 세포 배지를 완전배지로 교체하였다. 그 다음, 세포를 24시간 더 인큐베이션하여 PMA 처리로 인한 다면적 효과를 최소화하였다.
그 다음, 세포를 다음 중 하나로 인큐베이션하였다.
그룹 A 인산완충식염수(PBS) - 음성 대조표준
그룹 B 10ng/ml LPS - 양성 대조표준
그룹 C 10ng/ml LPS + 100μM PG
그룹 D 10ng/ml LPS + 40μM PG
그룹 E 10ng/ml LPS + 10μM PG
그룹 F 10ng/ml LPS + 4.0μM PG, 또는
그룹 G 10ng/ml LPS + 1μM PG.
상기에 기재된 대로 세포를 37℃, 5%CO2에서 인큐베이션하였다. 18시간 후에, 각 처리물로부터의 상청액을 수집하였고, 표준 Quantikine 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)키트(R&D 시스템, Minneapolis, USA)를 사용하여 TNF-α에 대하여 검정하였다.
결과
도 13은 ml 당 PG 에서 분비된 TNF-α의 양을 나타낸다. 결과는 U937 분화된 마크로파아지 세포가 정상 조건하에서 매우 낮은 수준의 TNF-α를 발현한다는 것을 증명한다. 그러나, 일단 LPS 에 노출되면, 이들은 주변 배지에 대량의 TNF-α를 분비하고, 이것은 세포 스트레스 발생을 나타낸다. PG 리포솜과 함께 세포의 인큐베이션은 투여량-의존적인 방식으로 TNF-α의 분비를 저해하며, TNF-α 발현에 있어서, 최고 농도 100μM 은 98% 감소를 초래하고, 최저 농도 1μM 조차 58% 감소를 초래한다.
실시예 13
내피 기능에 대한 본 발명의 바람직한 구체예에 따른 PG 리포솜의 효과를 결정하기 위해서, 실시예 3에 기재된 대로 CHS 연구 대상이 된 마우스 귀내의 엔도테린-1(ET-1) 함량을 결정하였다. 엔도테린-1 은 강력한 혈관수축제이고, 효력작용 및 분열촉진적 작용을 가지고, 염과 물의 항성성을 조절하고, 혈관긴장과 혈압유지에 중요한 역할을 한다. 다양한 증거의 세포주는, 내인성 ET-1 이 심부전과 같은 지속성 혈관수축과 연관된 상태의 병리생리학에 기여할 수 있다는 것을 나타낸다. 심부전에서, 증가된 수준의 순환 ET-1 및 빅-ET-1 이 관찰되었다(Giannessi D, Del RyS, Vitale RL. "심부전에서 엔도테린과 그것의 수용체의 역할" Pharmacol Res 2001 Feb 43:2 111-26). 따라서, ET-1 은 내피 기능의 마커이고 조직내의 ET-1 의 증가된 생산은 손상된 내피 기능을 나타낸다.
ET-1 발현을 결정하기 위해서, CHS 실험에서 항원자극 24시간 후에 마우스 귀(항원자극된 오른쪽 귀)를 수집하였다. 6시간동안 PBS 를 근육내주입한 마우스(그룹 A)와 75% PG/25% PC 리포솜을 근육내주입한 마우스(600,000 리포솜/주입; 그룹 B)의 귀를 얻었다. RNA 추출전까지 -20℃로 RNAlater에서 귀를 저장하였다. RNA 를 추출하였고, ET-1 특이적인 프라이머와 함께 역전사효소(RT)를 사용하여 내부 대조표준으로서의 cDNA 를 생산하였고, 또한 β-액틴-특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 를 수행하였다. PCR 생산물을 1.5% 아가로스겔에서 해상하였고 DNA 밴드를 농도측정 분석에 의해서 정량화하였다. ET-1/β-액틴의 비율을 계산하였다.
PCR 제법
PCR 믹스(ET-1) PCR 믹스(β-액틴)
5㎕ PCR 완충액(10×) 5㎕ PCR 완충액(10×)
1.5㎕ MgCl2(50mM) 1.5㎕ MgCl2(50mM)
1㎕ dNTP(10mM) 1㎕ dNTP(10mM)
0.5㎕ 프라이머 1(25uM) 1㎕ 프라이머 1(10uM)
0.5㎕ 프라이머 2(25uM) 1㎕ 프라이머 2(10uM)
0.25㎕ TAQ 0.25㎕ TAQ
2.5㎕ cDNA 2.5㎕ cDNA
38㎕ 물 37.75㎕ 물
총 50㎕ 총 50㎕
프라이머: (상기에 기술된 대로임-예를 들어, Yang, L; Husain, M; 및 Stewart.D.J.,"트랜스제닉 마우스에서 엔도테린-1 의 조건적 심장 과발현", FASEBJ 15(5):A1138-A1138 Part 2, MAR82001.
ET-1(r) 5'-CAG CAC TTC TTG TCT TTT TGG-3'
ET-1(f) 5'-CCA AGG AGC TCC AGA AAC AG-3'
β-액틴(F) 5'-GTG GGC CGC TCT AGG CAC CAA-3'
β-액틴(r) 5'-CTC TTT GAT GTC ACG CAC GAT TTC-3'
PCR 셋팅:
94℃- 5분
94℃- 30초 ｜ 30 사이클
60℃- 30초
72℃- 30초
72℃- 10분
4℃ - 침지
75% PG 리포솜을 6일 주입한 후에, ET-1 의 수준은 동일한 주입 섭생동안에 PBS 를 수용한 대조표준 마우스에 비하여 36% 감소하였다. 결과는 도 14에 그래프로 나타냈다. 이러한 감소는, 본 발명의 바람직한 구체예에 따른 리포솜 주입의 결과가 Th1 매개 염증 감소를 통하여, 포유동물 환자의 내피 기능에 유리한 효과가 있음을 나타낸다.
실시예 14
세포내 부착 분자-1(ICAM-1)은 백혈구 및 내피세포를 포함하는 수개의 세포형으로 발현된 세포 표면 분자이다. 이것은 단핵구의 내피세포에의 부착에 관여하며, 염증반응과 T-세포 매개 숙주 방어계에서 작용한다. ICAM-1 발현은 아마도, 주로 정상적인 면역 기능을 방해하는 것에 의해서 다양한 질환의 임상적 발현에 기여한다. 질환들 중에는 악성종양(예를 들어, 흑색종 및 림프종), 많은 염증장애(예를 들어, 천식 및 자가면역장애), 죽상동맥경화증, 허혈, 어떤 신경성 장애, 및 동종기관 이식(Van de Stolpe A, van der Saag PT, "세포내 부착 분자-1" J. Mol. Mel. (1996)74:1 13-33)이 있다.
사람 제대정맥 내피세포(HUVECs)는 다음과 같이 제대정맥으로부터 분리된 내피세포의 주요한 세포주이다.
T75 플라스크를 최소 15/20 분 또는 하룻밤동안 0.2% 젤라틴(5-7ml/플라스크)으로 코팅하여 준비하였다. 그 다음, 과잉량을 제거하였다. 수순전에 70% 에탄올을 제대에 분무하였고, 제대에 부착되어 여전히 남아있는 태반을 절단하여 제거하였다. 그 다음, 제대를 절단하여 약 5-6 인치의 길이로 하였다. 제대는 두꺼운 벽을 가진 2개의 동맥과 더크고 얇은 벽을 가진 하나의 정맥을 가진다. 정맥을 찾아내어, 스토퍼의 톱니모양의 가장자리를 정맥에 배치시켰다. 그 다음, 약 20cm 의 끈을 사용하여 스토퍼상에 제대를 묶었다.
그 다음, 인산완충식염수(PBS)가 청정하게 될 때까지 수차례 PBS로 제대를 세척하였다. 15-20ml 의 콜라겐아제 용액을 제대에 배치한 다음; 알루미늄박으로 래핑하여 37℃에서 15분동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 제대의 묶인 단부를 컷팅하여 콜라겐아제를 50ml 튜브로 배출시켰다. 그 다음 콜라겐아제를 다시제대에 통과시켰고, 내피세포를 느슨하게 하기 위해서 제대를 맛사지하였고, PBS 를 제대에 통과시켜서 콜라겐아제 용액을 함유하는 동일한 튜브로 수집하였다. 그 다음, 1600 RPM 으로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 10-12ml 의 M199 완전배지에서 펠렛을 재현탁하였다. 최종적으로 세포를 함유하는 배지를 젤라틴화된 플라스크에 부가하였다.
당업계에 알려진 표준방법에 따라서 평균 직경 100±20 nm 의 리포솜을 제조하였고, 이것은 75% 포스파티딜글리세롤(PG), 25% 포스파티딜콜린(PC)의 조성을 가졌다. 리포솜의 스톡 농도는 40mM 리피드였고, 검정에서 100μM 으로 희석하였다.
HUVECs 를 수많은 조직 배양 플라스크로 분할하였고, 플라스크의 표면에 부착되도록 한 다음, 다음과 같이 처치하였다.
그룹 A - PBS- 음성 대조표준
그룹 B - 500ng/ml LPS- 양성 대조표준
그룹 C - 500ng/ml LPS + 100 μM PG
그룹 D - 500ng/ml LPS + 100 μM PC
세포를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 18시간후에, 각 처리물로부터의 상청액을 수집하였고, 표준 ELISA 키트(아세이 디자인으로부터 구입)를 사용하여 ET-1에 대하여 검정하였고, 다음과 같이, 세포를 수집하여 ICAM-1 을 분석하였다.
우선, 세포를 PBS 로 세척한 다음 37℃에서 25-30 분동안 세포 해리 완충액과 함께 인큐베이션하였다. 그 다음 세포를 원심분리에 의해서 세척하였고 30분동안 항-CD54(ICAM-1)항체와 함께 인큐베이션하였다. 그 다음, 제2의 FITC 항체를 부가하였고 상기와 같이 세포와 함께 인큐베이션하였다. 최종적으로 이들을 1ml PBS 에서 재현탁하였고 유동 세포계수기에서 형광성에 대하여 분석하였다.
결과
결과는 도 15에 제시되었고, 도 15는 각각의 배양에서 ICAM-1 에 대해 양성인 세포 염색 백분율에 관한 그래프 도시이다. PG-리포솜-함유 배양에서 양성인 세포 염색의 수는 음성 대조표준 수준으로 감소되었고, 양성 대조표준 수준보다 훨씬 낮다는 것을 나타낸다.
실시예 15
마이크로글리아 세포(뇌 마크로파아지)를 배양하였고, 그들의 TNF-α 생산물인 염증성 사이토카인을 측정하였다. ALS 를 앓는 환자의 면역글로불린(IgG)으로 세포를 자극하였고, 결과적으로 TNF-α 생산량이 약 800배 증가하였다. 동일한 세포를 ALS IgG 및 PG 리포솜 모두의 존재하에서 배양하였을 때, TNF-α의 생산량은 약 75% 로 감소하였다. 이것은 ALS 의 치료에 있어서 본 발명의 바람직한 구체예의 가능성을 나타낸다. 결과는 도 16에 제시된다.

Claims (51)

  1. 다수의 포스페이트-글리세롤기 또는 포스페이트-글리세롤기로 전환될 수 있는 기를 포함하는, 약 20 나노미터 (nm) 내지 500 마이크로미터 (㎛) 크기의 약제학적으로 허용되는 소체를 포함하는, 포유동물 생체내에서 항염증 반응을 생산할 수 있는 것의 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 소체는 리포솜인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 비지질의 약제학적으로 허용되는 물질이 실질적으로 없는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 비지질의 약제학적으로 허용되는 물질이 없는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 2 항, 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 리포솜은 약 60 내지 100%의 포스파티딜글리세롤 (PG)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 리포솜은 약 70% 내지 90%의 포스파티딜글리세롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 리포솜의 나머지는 포스파티딜 콜린을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜은 약 50 내지 500 나노미터의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 리포솜은 약 80 내지 120 나노미터의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 약 20 nm 내지 500 ㎛ 크기 범위를 갖고 표면 상에서 발현되거나 발현될 수 있는 다수의 PG 머리기를 갖는 약제학적으로 허용되는 생체적합성 소체를 포함하는 조성물의, T-세포 기능매개 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서의 사용.
  11. 제 10 항에 있어서, PG 머리기는 소체의 표면에서 발현되고 PG 리간드의 머리기인 것을 특징으로 하는 사용.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 소체는 리포솜인 것을 특징으로 하는 사용.
  13. 제 12 항에 있어서, 리포솜은 50 중량% 내지 100 중량%의 포스파티딜글리세롤로 구성되는 것을 특징으로 하는 사용.
  14. 제 13 항에 있어서, 리포솜은 65 중량% 내지 90 중량%의 포스파티딜글리세롤로 구성되는 것을 특징으로 하는 사용.
  15. 제 11 항, 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 리포솜은 약 20 나노미터 내지 약 1000 나노미터의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 사용.
  16. 제 10 항 내지 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 단위투여량은 약 50 내지 약 2.5 x 109개의 소체를 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 조성물의 단위 투여량은 약 10,000 내지 약 50,000,000 개의 소체를 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
  18. 약 20 nm 내지 500 ㎛ 크기 범위를 갖고 표면 상에서 발현되거나 발현될 수 있는 다수의 PG 머리기를 갖는 약제학적으로 허용되는 생체적합성 소체를 포함하는 조성물의, 염증질환의 치료를 위한 의약의 제조에서의 사용.
  19. 제 18 항에 있어서, PG 머리기는 소체의 표면에서 발현되고 PG 리간드의 머리기인 것을 특징으로 하는 사용.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 소체는 리포솜인 것을 특징으로 하는 사용.
  21. 제 20 항에 있어서, 리포솜은 50 중량% 내지 100 중량%의 포스파티딜글리세롤로 구성되는 것을 특징으로 하는 사용.
  22. 제 21 항에 있어서, 리포솜은 65 중량% 내지 90 중량%의 포스파티딜글리세롤로 구성되는 것을 특징으로 하는 사용.
  23. 제 20 항, 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 리포솜은 약 20 나노미터 내지 약 1000 나노미터의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 사용.
  24. 제 20 항 내지 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 단위투여량은 약 50 내지 약 2.5 x 109개의 소체를 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
  25. 약 20 nm 내지 500 ㎛ 크기 범위를 갖고 표면 상에서 발현되거나 발현될 수있는 다수의 PG 머리기를 갖는 약제학적으로 허용되는 생체적합성 소체를 포함하는 조성물의, 내피기능 이상의 치료를 위한 의약의 제조에서의 사용.
  26. 제 25 항에 있어서, PG 머리기는 소체의 표면에서 발현되고 PG 리간드의 머리기인 것을 특징으로 하는 사용.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 소체는 리포솜인 것을 특징으로 하는 사용.
  28. 제 27 항에 있어서, 리포솜은 50 중량% 내지 100 중량%의 포스파티딜글리세롤로 구성되는 것을 특징으로 하는 사용.
  29. 제 28 항에 있어서, 리포솜은 65 중량% 내지 90 중량%의 포스파티딜글리세롤로 구성되는 것을 특징으로 하는 사용.
  30. 제 27 항, 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, 리포솜은 약 20 나노미터 내지 약 1000 나노미터의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 사용.
  31. 제 27 항 내지 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 단위투여량은약 50 내지 약 2.5 x 109개의 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 조성물의 단위 투여량은 약 10,000 내지 약 50,000,000 개의 소체를 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 조성물의 단위 투여량은 약 10,000 내지 약 50,000,000 개의 소체를 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
  34. 약 20 nm 내지 500 ㎛ 크기 범위를 갖고 표면 상에서 발현되거나 발현될 수 있는 다수의 PG 머리기를 갖는 약제학적으로 허용되는 생체적합성 소체를 포함하는 조성물의, 면역질환의 치료를 위한 의약의 제조에서의 사용.
  35. 제 34 항에 있어서, PG 머리기는 소체의 표면에서 발현되고 PG 리간드의 머리기인 것을 특징으로 하는 사용.
  36. 제 34 항 또는 제 35 항에 있어서, 소체는 리포솜인 것을 특징으로 하는 사용.
  37. 제 36 항에 있어서, 리포솜은 50 중량% 내지 100 중량%의 포스파티딜글리세롤로 구성되는 것을 특징으로 하는 사용.
  38. 제 37 항에 있어서, 리포솜은 65 중량% 내지 90 중량%의 포스파티딜글리세롤로 구성되는 것을 특징으로 하는 사용.
  39. 제 36 항, 제 37 항 또는 제 38 항에 있어서, 리포솜은 약 20 나노미터 내지 약 1000 나노미터의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 사용.
  40. 제 36 항 내지 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 단위투여량은 약 50 내지 약 2.5 x 109개의 소체를 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 조성물의 단위 투여량은 약 10,000 내지 약 50,000,000 개의 소체를 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 조성물의 단위 투여량은 약 10,000 내지 약 50,000,000 개의 소체를 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
  43. 제 34 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 질환은 신경계 질환인 것을 특징으로 하는 사용.
  44. 약제학적으로 허용되는 소체와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 포유동물에 투여하기 위한 단위 투여 형태의 약제학적 조성물로서, 적어도 일부의 상기 소체는 약 20 nm 내지 500 ㎛ 범위의 크기를 갖고, 상기 소체의 표면은 포스페이트-글리세롤기 또는 포스페이트-글리세롤기로 전환될 수 있는 기이며, 상기 단위투여량은 약 500 내지 약 2.5 x 109개의 소체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  45. 제 44 항에 있어서, 소체는 리포솜인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  46. 제 45 항에 있어서, 조성물은 비지질인 약제학적으로 허용되는 물질이 실질적으로 없는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  47. 제 45 항에 있어서, 조성물은 비지질인 약제학적으로 허용되는 물질이 없는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  48. 제 45 항, 제 46 항 또는 제 47 항에 있어서, 리포솜은 약 60% 내지 100%의 포스파티딜글리세롤 (PG)를 포함하는 포스페이트-글리세롤기를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  49. 제 48 항에 있어서, 리포솜은 약 70% 내지 90%의 PG를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  50. 제 48 항 또는 제 49 항에 있어서, 리포솜의 나머지는 포스파티딜 콜린을 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  51. 제 44 항에 있어서, 상기 소체 포스페이트-글리세롤기의 결합에 대하여 특이적인 포유동물 면역 시스템의 세포상 리셉터에 특이적으로 결합하는 표면 기를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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