KR20040028960A - 면역성 질환 치료제 - Google Patents

면역성 질환 치료제 Download PDF

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KR20040028960A
KR20040028960A KR10-2004-7001435A KR20047001435A KR20040028960A KR 20040028960 A KR20040028960 A KR 20040028960A KR 20047001435 A KR20047001435 A KR 20047001435A KR 20040028960 A KR20040028960 A KR 20040028960A
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데즈카가쯔나리
와타나베요시히로
아베료
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니뽄 다바코 산교 가부시키가이샤
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Abstract

AILIM(JTT-1항원, JTT-2항원, ICOS 및 8F4라고도 부른다)에 대한 항체가, 관절류마치스나 변형성 관절증 등의 관절증, 이식편 대 숙주병, 이식면역거절, 염증(간염이나 염증성 장질환), 외래항원에 의한 면역감작에 의해 야기되는 상기 항원 에 대한 항체의 과잉산생을 동반하는 질환증상에 대해 유의한 치료효과를 갖는 것을 발견하였다.

Description

면역성 질환 치료제{Remedies for immunological diseases}
본 발명은, AILIM(activation inducible lymphocyte immunomodulatory molecule;별명을 「JTT-1항원」, 「JTT-2항원」,「ICOS(inducible co-stimulator)」 또는 「8F4」라고 한다.)의 생물활성, 특히 AILIM을 매개로 하는 시그날전달을제어하는 활성을 갖는 물질을 포함하여 된 의약조성물에 관한 것이다.
구체적으로는, 본 발명은, AILIM 발현세포의 증식을 제어(예를 들면 억제)하던가, 또는 AILIM 발현세포에 의한 사이토카인(예를 들면, 인터페론γ 또는 인터루킨4 등)의 산생을 제어(예를 들면 억제)하는 활성을 갖는 물질을 포함하여 된 의약조성물에 관한 것이다.
더욱 구체적으로는, 본 발명은, (1) 관절증(예를 들면, 관절류마치스(rheumatoid arthritis; RA), 변형성 관절증(osteoarthritis; OA)을 억제, 치료 또는 예방하기 위한 의약조성물; (2) 염증(예를 들면, 간염)을 억제, 치료 또는 예방하기 위한 의약조성물; (3) 이식편 대 숙주반응(graft versus host reaction; GVH reaction), 이식편 대 숙주병(graft versus host disease; GVHD) 또는 조직 또는 장기의 이식에 동반되는 면역 거절반응을 억제, 치료 또는 예방하기 위한 의약조성물; (4) 외래항원 또는 자기항원에 의해 야기되는 면역반응(예를 들면, 상기 항원에 대한 항체의 산생, 세포증식, 사이토카인의 산생 등)을 억제 또는 예방하기 위한 의약조성물에 관한 것이다.
포유동물의 생체는, 체내에 침입한 병원미생물(바이러스, 세균, 기생충 등)이나 외래 이물질 등(이하, 합쳐서 「항원」이라고 부른다.)을 배제하려고 하는 면역응답시스템을 갖는다. 그중 하나는, 자연 면역응답시스템으로 불리고, 다른 하나는 획득 면역응답시스템으로 불리는 것이다. 전자는, 식세포(다형 핵 백혈구, 단구, 마크로파지 등)에 의한 식균작용(phagocytosis), 내츄럴 킬러(NK)세포에 의한 공격 및 보체에 의한 항원의 옵소닌화 등과 같은 비특이적인 인식에 의한 배제기구이다. 후자의 획득면역응답시스템은, 상기 항원에 대한 특이성을 획득(활성화)한 림프구(주로 T세포, B세포)에 의한 배제기구이다.
항원특이성을 획득한 B세포는, 상기 항원에 특이적인 항체를 산생함으로써 세포외에 존재하는 상기 항원을 공격한다. 항원특이성을 획득(활성화)한 T세포는, 헬퍼 T세포와 세포상해성 T세포(cytotoxic T cell; cytotoxic lymphocyte; CTL)로 분류되어, 전자는 B세포의 분화나 항체의 산생을 조절함과 동시에 식세포와 협동하여 상기 항원을 파괴한다. 후자는, 스스로 바이러스 감염세포 등을 공격한다(실험의학(별책) ·「Bio Science 용어 라이브러리「면역」」, 요도샤, p.14-17, 1995).
이 T세포에 의한 항원특이성의 획득(활성화)은, T세포가, 마크로파지, B세포 또는 수상(樹狀) 세포 등의 항원제시세포(antigen-presenting cells: APC)에 의해 제시되는 항원을 인식함으로써 개시된다. 항원제시세포는, 함입한(incorporation) 항원을 프로세싱(가공)하고, 이 가공된 항원을 주요 조직 적합성 항원복합체(MHC)에 결합시켜 항원제시한다. T세포는, 항원제시세포에 의해 제시된 상기 가공항원을, 그 세포막 표면에 갖는 T세포 수용체(TcR)와 CD3 항원과의 복합체(TcR/CD3 복합체)를 통해 인식함으로써 세포의 활성화(특이성의 획득)를 위한 제1시그날을 받는다.
그러나, 이 TcR/CD3 복합체를 매개로 한 제1시그날 만으로는, T세포의 충분한 활성화가 일어나지 않을 뿐 아니라, 그 후에 받는 어떠한 자극에 대해서도 반응하지 않게 되는 불응답상태(unresponsiveness) 또는 클론 마비(clonal anergy)로 불리는 상태에 빠진다. T세포가 활성화되어 항원특이적인 T세포 클론으로 분화, 증식하기 위해서는 인터루킨-2(IL-2)의 자기분비(오토크린;autocrine)가 필요하지만, 클론 마비상태에서는 IL-2 등이 산생되지 않아 세포분열이 일어나지 않기 때문에, T세포가 불활성화된 상태로 된다. 즉, IL-2 등의 사이토카인의 산생을 동반하는 T세포의 활성화에는, TcR/CD3 복합체를 매개로 한 제1시그날에 계속되는 제2시그날을 필요로 한다. 이 제2시그날은 코스티뮬레이토리 시그날(부자극 시그날; costimulatory signal)로 불린다.
T세포는, T세포 표면상의 TcR/CD3 복합체와는 별도의 분자를 매개로 하여 항원제시세포상의 MHC와는 별도의 분자와 상호작용(세포간 접착)함으로써 이 제2시그날을 받아 세포내에 전달한다. 이 제2시그날에 의해 세포의 아네르기(anergy)(클론 마비)가 회피되는 동시에 세포가 활성화된다.
항원제시세포와 T세포 등의 림프구와의 사이의 제2시그날전달의 메카니즘에 대해서는 아직 상세히 해명되어 있지 않은 부분은 있지만, 지금까지의 연구로부터, 이 제2시그날전달에는, 주로 T세포 및 흉선세포에서 발현하는 세포 표면분자인 CD28(별명:Tp44, T44 또는 9.3항원)과 항원제시세포(마크로파지, 단구, 수상 세포 등)에서 발현하는 세포 표면분자인 CD80(별명:B7-1, B7, BB1, 또는 B7/BB1) 및 마찬가지로 항원제시세포상 세포 표면분자인 CD86(별명:B7-2 또는 B70)과의 사이의 상호작용(즉, 그들 분자간의 결합을 매개로 한 세포간 접착)이 지극히 중요한 것이 명백해졌다.
더욱이 이 제2시그날에 의한 T세포의 활성화 제어에는, 상기 제2시그날에 의존하여 그 발현이 증강되는 것으로 생각되고 있는 CTLA-4(Cytolytic T lymphocyteassociated antigen 4)와 상기 CD80(B7-1) 및 CD86(B7-2)과의 사이의 상호작용(즉, 그들 분자간의 결합을 매개로 한 세포간 접착)도 중요한 역할을 담당하고 있는 것이 실험적으로 명백해졌다. 즉, 이 제2시그날의 전달에 의한 T세포의 활성화 제어에는, 적어도 CD28과 CD80/CD86과의 사이의 상호작용, 상기 상호작용에 의존하는 것으로 생각되는 CTLA-4 발현의 증강 및 CTLA-4와 CD80/CD86과의 사이의 상호작용이 포함되는 것이 명백해졌다.
CD28은, 이 T세포의 활성화와 아네르기의 회피에 필요한 제2시그날(코스티뮬레이토리 시그날)을 전달하는 코스티뮬레이터 분자인 것이 명백해졌다. 이 분자가 항원제시세포상의 코스티뮬레이터 분자인 CD80(B7-1) 및 CD86(B7-2)와 결합하는 것(바꿔 말하면, 그들 분자간의 결합을 매개로 한 세포간 접착)에 의해 전달되는 제2시그날은, Th1형 사이토카인의 mRNA를 안정화시키고, 그 결과 T세포로부터의 IL-2, IFNγ 및 TNFα 등의 Th1형 사이토카인의 대량생산을 촉진한다. 한편, CTLA-4는, TcR/CD3을 통해 들어가는 제1시그날에 의해 발현이 유도됨과 동시에, CD28과 CD80과의 결합에 의해 들어가는 상기 제2시그날에 의해서도 그 발현이 증강되는 것이 알려져있다. CTLA-4는, 그들의 시그날을 받아, CD28로부터 들어가는 제2시그날에 의한 T세포의 활성화와는 반대로 T세포기능에 대해 억제적으로 작용하는 것이 명백해졌다.
인간의 CD28 및 CTLA-4-는, 각각 44 kD 및 41~43 kD의 분자량을 갖는 I형 당단백질이다. 동시에 면역글로불린양 도메인 1개를 가지고, 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속해, 세포간 접착분자로서의 기능과 세포내로의 시그날전달 분자로서의 양쪽기능을 함께 가진 분자이다.
인간 CD28은 디술피드결합에 의해 호모2량체를 형성하고, 한편, CTLA-4는 단량체로 존재하는 것이 나타내어져 있다. CD28 및 CTLA-4 유전자의 염색체상의 위치는, 인간에게 있어서는 어느 것도 「2q33」, 또 마우스에 있어서는 「1C」로, 어느 것도 4개의 엑손으로 된다. 인간의 CD28 및 CTLA-4는, 리더서열을 포함하여 각각 220 및 223개의 아미노산으로 구성되고, 양자의 아미노산 상동성은 20~30% 정도이다.
CD28 및 CTLA-4의 리간드는, 인간 및 마우스에게 있어서 CD80(B7-1) 및 CD86(B7-2)인 것이 해명되었다. CTLA-4는, 어느 리간드에 대해서도 CD28 보다 친화성이 높고, 그 차는 약 20배이다. CD28 및 CTLA-4의 CD80(B7-1)으로의 결합에는, 동물종을 초월하여 보존되고 있는 아미노산 서열구조인 「MYPPPY(Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr)」가 중요한 것이 명백해졌다. 또한, CD28이 자극을 받으면, 그 세포내의 부분서열「YMNM(Tyr-Met-Asn-Met)」내의 인산화된 티로신잔기로 PI3 키나아제(phosphoinositide 3 kinase, PI3K)가 회합하는 것이 나타내어져, CD28은 이 「YxxM」구조를 매개로 하여 세포내 시그날전달에 있어서 중요한 작용을 하고 있는 것이 나타내어졌다. 또한, CTLA-4의 세포내 영역에도 「YxxM」으로 나타내어지는 서열, 즉 「YVKM(Tyr-Val-Lys-Met)」를 가지고 있어, 자극을 받은 후, 이 서열에 SYP가 회합하는 것이 나타내어지고 있다.
CD28은, 흉선세포 및 말초혈 T세포에 국한하여 발현하고, 한편 CTLA-4는 활성화 T세포에 특이적으로 발현하는 것을 알게되었다(세포공학 ·별책「접착분자 핸드북」, 슈쥰사발행, 제93-102페이지, 1994년; 동지, 제120-136페이지; 실험의학 ·별책「BIO SCIENCE 용어 라이브러리 ·면역」, 요도사발행, 제94-98페이지, 1995년; 실험의학 ·별책「BIO SCIENCE 용어 라이브러리 ·세포내 시그날전달」, 요도사발행, 제58-59페이지, 1997년; 일본임상, 제55권, 제6호, 제215-220페이지, 1997년).
이와 같이 하여 T세포기능의 제어(T세포의 활성화 및 기능억제)에 있어서의 코스티뮬레이터 분자(CD28, CD80(B7-1) 및 CD86(B7-2) 등) 및 연동하는 CTLA-4 등의 복수의 분자간 상호작용(바꿔 말하면, 그들의 분자간 결합을 매개로 한 세포간 접착)의 중요성이 제창되어지게 되어, 그들의 분자와 질환과의 관계 해명 및 그들 분자의 기능을 제어하는 것에 의한 질환치료의 시도가 주목되게 되었다.
상술한 바와 같이, 생체는, 생체(자기)에 있어 이물질인 항원에 대해서는 획득 면역응답시스템을 작동시키지만, 자기의 생체성분(자기항원)에 대해서는 면역응답을 나타내지 않는 면역관용을 가지고 있다. 그러나, 어떤 원인으로 면역관용의 파탄이 일어나면, 자기항원에 대한 면역응답이 일어나 상술과 동일한 메커니즘에 의해 자기항원반응성 T세포가 유도되어 면역 이상상태에 빠져, 여러 가지 자기면역질환이 야기된다.
즉, 생체의 면역시스템이 정상인 상태에서는, 정상 조직의 무자극 항원제시세포(antigen presenting cell; APC)는 코스티뮬레이토리 분자를 발현하지 않기 때문에, 예를 들어 자기항원에 반응하는 자기항원반응성 T세포가 존재하고 있더라도, T세포가 불응답상태에 빠져 있기 때문에 자기관용이 유지되고 있지만, 면역 이상상태에 있어서는 과잉 또는 계속적인 코스티뮬레이토리 분자의 발현이상에 의해 자기항원반응성 T세포가 활성화되어 자기면역질환이 야기된다고 하는 가능성이 제시되고 있다.
이러한 관점에서 최근, 코스티뮬레이토리 시그날의 전달, 예를 들면 상술의 CD28/CTLA-4-CD80/CD86 사이의 시그날전달을 조절함으로써 여러 가지 자기면역성 질환치료의 시도가 다수 행해지고 있다.
그러나, 그러한 치료의 시도가 행해지는 한편으로, 코스티뮬레이터 분자 및 관련된 분자와의 사이의 상호작용(바꿔 말하면, 그들 분자간의 결합을 매개로 한 세포간 접착)에 의한 T세포의 활성화 메커니즘의 상세한 해명은 아직 되어 있지 않고, 또 이 메커니즘에는 아직 동정되지 않은 다른 분자가 관여할 가능성도 남아 있다.
최근 본 발명자들은, 상기 「CD28」이나 「CTLA-4」와 마찬가지로, T세포 등의 림프구의 활성화에 필수인 제2시그날(코스티뮬레이토리 시그날)의 전달 및 상기 시그날에 연동하여 활성화 T세포 등의 활성화 림프구의 기능제어를 행하는 분자인 것으로 생각되는 신규한 포유동물(인간, 마우스 및 쥐)유래의 세포막 표면분자를 동정 및 단리함으로써 성공하여, 그 분자를 「JTT-1항원」 또는 ·「JTT-2항원」으로 명명했다(일본국특허출원공개11-29599호 공보;국제 특허출원 공개 WO98/38216호; Int.Immunology, Vol.12, No.1, p.51-55, 2000). 또한, 나중에 본 발명자들은 이들 분자를 AILIM(activation inducible lymphocyte immunomodulatory molecule)으로 개명했다.
본 발명자들에 의한 지금까지의 연구로부터, 이 신분자 AILIM에 대해서 아래와 같은 사실이 얻어지고 있다.
(1) T세포의 활성화에 중요한 코스티뮬레이토리 시그날을 세포간 접착을 매개로 하여 전달하는 T세포 등의 림프구의 세포 표면분자인 「CD28」 및 상기 시그날에 연동하여 활성화 T세포 등의 활성화 림프구의 기능제어를 행하는 T세포 등의 림프구의 세포 표면분자인 「CTLA-4」와 아래와 같은 유사성을 갖는다.
① 시스테인잔기를 포함하는 20 이상의 아미노산잔기가 잘 보존되어 있다.
② 리간드 결합영역으로서 필수인 프롤린잔기의 연속하는 서열 「Pro-Pro-Pro(PPP)」가 세포외 영역에 보존되어 있다.
③ 시그날 전달영역으로서 필수인 서열 「Tyr-Xaa-Xaa-Met(YxxM)」(Xaa 및 x는 임의의 아미노산을 의미한다.)이 세포내 영역에 보존되어 있다.
④ 「마우스 AILIM(마우스 JTT-1항원)」을 코드화 하는 유전자의 마우스 염색체상에서의 위치는, 마우스의 「CD28」 및 「CTLA-4」의 위치와 마찬가지로, 「1C3」이다.
(2) 세포간 접착을 매개하는 기능을 갖는 「CD28」 및 「CTLA-4」와 마찬가지로, 「AILIM(JTT-1항원)」은 흉선세포, ConA 등의 마이토젠으로 자극한 림프아구 및 흉선종세포의 세포간 접착을 매개하는 능력을 갖는다.
(3) AILIM은, 적어도 흉선세포, ConA 등의 마이토젠으로 자극한 림프아구세포(활성화 T림프아구세포나 활성화 B림프아구세포), 말초혈림프구 및 흉선종세포에서 강하게 발현한다.
(4) AILIM(JTT-1항원)에 대한 항체는, 인간 말초혈림프구를 유의하게 증식시키고, 또 그 증식은, T세포의 활성화에 필수인 항원제시세포로부터의 제1시그날을 받는 T세포상의 TcR/CD3 복합체를 구성하는 CD3에 대한 단일클론항체를 공존시킴으로써 더욱 높은 증식을 유도한다.
(5) AILIM(JTT-1항원)에 대한 항체를, 실험적 알레르기성 뇌척추염(EAE)에 투여함으로써, 그 병상이 억제된다.
(6) AILIM(JTT-1항원)에 대한 항체를, 사구체기저막(GBM)신장염의 모델쥐에 투여함으로써, 그 병상이 억제된다.
본 발명자들에 의한 AILIM의 동정 및 성상 해석의 보고가 있은 후에, 크로체크(Kroczek)등의 그룹에 의해, 인간 유래의 AILIM과 동일한 분자인 ICOS(inducible co-stimulator) 또는 8F4라 명명한 분자 동정의 보고가 이루어져 있다(Nature, Vol.397, p.263-266, 1999 및 국제 특허출원 공개 WO99/15553호).
AILIM(별명:JTT-1항원, JTT-2항원, ICOS, 또는 8F4)에 대해서는, 상술의 보고가 있을 뿐으로, 그 생물학적 기능 및 질환과의 관계에 대해서는 아직 상세하게 해명되지 않았다.
한편, 최근 들어, 이 부자극 전달분자 AILIM과 상호작용하는 리간드로 생각되는 B7h, B7RP-1, GL50 또는 LICOS라 칭해지는 신규분자도 동정되어 있다(Nature, Vol.402, No.6763, p.827-832, 1999;Nature, Medicine, Vol.5, No.12, p.1365-1369, 1999;J. Immunology, Vol.164, p.1653-1657, 2000;Curr. Biol. Vol.10, No.6, p.333-336, 2000).
이들 2종류의 신규한 분자, 즉, AILIM(ICOS)과 B7RP-1(B7h, GL50, LICOS)의 동정에 의해, 상술한 T세포 등의 림프구의 활성화 및 활성화 T세포의 기능제어에 필수인 코스티뮬레이토리 시그날의 전달경로에는, 지금까지 알려져 있던 CD28과 CD80(B7-1)/CD86(B7-2)과의 사이의 시그날전달경로 및 CTLA-4와 CD80(B7-1)/(B7-2)와의 사이의 시그날전달경로인 제1 및 제2경로 외에 AILIM(ICOS)과 B7RP-1(B7h, GL50, LICOS)과의 상호작용에 의한 새로운 제3경로가 있는 것이 판명되었다.
이 새로운 두개의 분자 각각의 생물학적 기능, 상기 분자에 의한 제3코스티뮬레이토리 시그날전달에 의한 T세포 등의 림프구의 기능제어 및 상기 신규한 시그날전달과 질환과의 관련성에 대해서는, 매우 활발히 연구가 진행되고 있는 바이다.
즉, 본 발명은, 상기 「CD28」이나 「CTLA-4」와 마찬가지로, T세포 등의 림프구의 활성화에 필수인 제2시그날(코스티뮬레이토리 시그날)의 전달 및 상기 시그날에 연동하여 활성화 T 세포 등의 활성화 림프구의 기능제어를 행하는 분자인 것으로 생각되는 신규 분자 AILIM의 생물학적 기능 및 AILIM의 발현과 질환과의 관계를 명확하게 함과 동시에, 상기 AILIM의 생물학적 기능을 의학 및 약학적 수법(예를 들면, 저분자화합물 및 항체 등의 약제)에 의해 제어함으로써 AILIM 발현상태에 의존하는 여러 가지 질환의 발증을 억제하고, 또는 상기 질환을 치료하는 방법 및 약제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
도1은, 정상 마우스 흉선 유래 T세포에 있어서의 CD3, CD28 및 AILIM(ThA라 별칭한다)의 발현상태를 나타내는 도.
분도(a)는 CD3 및 AILIM(ThA라 별칭한다)의 발현상태를 나타낸다. 분도(b)는 CD3 및 CD28의 발현상태를 나타낸다.
도2는, 정상 마우스 흉선 유래 T세포에서의 CD28 및 AILIM의 발현상태를, CD4 및 CD8의 발현을 지표로 한 T세포 분화의 각 단계마다 나타내는 도.
R2~R8은, 각각 아래의 내용을 나타낸다.
R2:CD4음성 CD8음성 T세포에서의 AILIM 및 CD28의 발현상태.
R3:CD4약양성 CD8약양성 T세포에서의 AILIM 및 CD28의 발현상태.
R4:CD4양성 CD8양성 T세포에서의 AILIM 및 CD28의 발현상태.
R5:CD4양성 CD8약양성 T세포에서의 AILIM 및 CD28의 발현상태.
R6:CD4양성 CD8음성 T세포에서의 AILIM 및 CD28의 발현상태.
R7:CD4약양성 CD8양성 T세포에서의 AILIM 및 CD28의 발현상태.
R8:CD4음성 CD8양성 T세포에서의 AILIM 및 CD28의 발현상태.
도3은, 정상 마우스 비장조직에 포함되는 CD4양성 T세포에 있어서의 AILIM의 발현상태를 나타내는 도.
도4는, 간염을 이환한 숙주의 간장조직 침윤 CD4양성 T세포에 있어서의 AILIM의 발현상태를 나타내는 도.
도5는, 관절류마치스 환자의 말초혈중 T세포 및 관절강침윤 T세포의 각각에 포함되는 CD4양성 T세포 및 CD4음성 T세포 각각에 있어서의 AILIM 및 CD28의 발현상태를 나타내는 도.
도6은, 여러 가지 자극제로 자극하여 활성화한 정상 마우스의 림프조직 유래 T세포에 있어서의, AILIM의 발현상태를 경시적으로 나타내는 도.
도7은, 마우스의 각종 T세포주 및 T세포 유래 하이브리도마에서의 AILIM의 발현상태 및 다른 여러 가지 성상을 개략적으로 나타내는 도.
도8은, 항 CD3 항체와 항 AILIM 항체를 코팅한 플레이트를 사용하여 재현한 CD3과 AILIM의 크로스 링크에 의한, 마우스 비장 유래 T세포의 활성화능(IFNγ의 산생유도능)을 나타내는 도.
도9는, 항 CD3 항체와 항 AILIM 항체를 코팅한 플레이트를 사용하여 재현한 CD3과 AILIM의 크로스 링크에 의한, 쥐 비장 유래 T세포의 활성화능(IFNγ산생유도능)을 나타내는 도.
도10은, 항 CD3 항체와 항 AILIM 항체를 코팅한 플레이트를 사용하여 재현한 CD3과 AILIM의 크로스 링크에 의한, 인간 말초혈 유래 T세포의 활성화능(IFNγ산생유도능)을 나타내는 도.
도11은, 항 CD3 항체에 의한 자극에 의해 활성화한 인간 말초혈 유래 T세포에 있어서의, T세포반응의 하나인 IFN-γ 산생의 상승에 대한 항 AILIM 항체에 의한 억제효과를 나타내는 도.
도12는, 항 CD3 항체에 의한 자극에 의해 활성화한 인간 말초혈 유래 T세포에 있어서의, T세포반응의 하나인 IL-4 산생의 상승에 대한 항 AILIM 항체에 의한 억제효과를 나타내는 도.
도13은, 항 CD3 항체에 의한 자극에 의해 활성화한 마우스 흉선 유래 T세포에 있어서의, T세포반응의 하나인 IL-4 산생의 상승에 대한 항 AILIM 항체에 의한 억제효과를 나타내는 도.
도14는, 항 CD3 항체에 의한 자극에 의해 활성화한 마우스 비장 유래 T세포에 있어서의, T세포반응의 하나인 IL-4 산생의 상승에 대한 항 AILIM 항체에 의한 억제효과를 나타내는 도.
도15는, 관절증 숙주에 있어서의 관절증의 파라미터인 발 부음에 대한 항 AILIM 항체의 복수회 투여에 의한 치료효과를 나타내는 도.
도16은, 간염 숙주에 있어서의 병상악화의 파라미터인 IFN-γ 산생의 상승에 대한 항 AILIM 항체에 의한 치료효과를 나타내는 도.
도17은, 간염 숙주에 있어서의 병상악화의 파라미터인 GPT 및 GOT 산생의 상승에 대한 항 AILIM 항체에 의한 억제효과를 나타내는 도.
도18은, 이식편 대 숙주병(GVHD)의 이식편 대 숙주반응(GVH 반응)의 하나인 IgG 산생의 상승에 대한 항 AILIM 항체에 의한 억제효과를 나타내는 도.
도19는, 이식편 대 숙주병(GVHD)의 이식편 대 숙주반응(GVH 반응)의 하나인 IgE 산생의 상승에 대한 항 AILIM 항체에 의한 억제효과를 나타내는 도.
도20은, 이식편 대 숙주병(GVHD)의 이식편 대 숙주반응(GVH 반응)의 하나인 항 dsDNA 항체가의 상승에 대한 항 AILIM 항체에 의한 억제효과를 나타내는 도.
도21은, 외래항원인 SRBC로 면역감작된 숙주의 생체에서의 상기 외래항원에 대한 항체 산생의 항 AILIM 항체(항원감작 직후에 투여)에 의한 억제효과를 나타내는 도.
도22는, 외래항원인 SRBC로 면역감작된 숙주의 생체에서의 상기 외래항원에 대한 항체 산생의 항 AILIM 항체(항원감작 7일째에 투여)에 의한 억제효과를 나타내는 도.
도23은, 정상조직(흉선, 림프절 및 말초혈) 및 병변부위에서의 AILIM의 발현상태 및 CD28의 발현상태를 모식적으로 나타내는 도.
도24는, 정상인 말초혈 유래 T세포 및 상기 T세포로부터 분리한 AILIM 양성세포에 있어서의 AILIM, CD28, CD4, CD8, CD19 및 CTLA-4 각각의 발현상태를 나타내는 도.
분도(a)는, 말초혈 유래 T세포의 여러 가지 세포의 분포를 나타낸다.
분도(b)는, 말초혈 유래 T세포로부터 분리한 AILIM 양성 세포의 분포를 나타낸다.
분도(c)는, 말초혈 유래 T세포에 있어서의 CD4 및 CD8의 발현상태를 나타낸다.
분도(d)는, 말초혈 유래 T세포로부터 분리한 AILIM 양성 세포에 있어서의 CD4 및 CD8의 발현상태를 나타낸다.
분도(e)는, 말초혈 유래 T세포에 있어서의 AILIM 및 CD4의 발현상태를 나타낸다.
분도(f)는, 말초혈 유래 T세포로부터 분리한 AILIM 양성 세포에 있어서의 AILIM 및 CD4의 발현상태를 나타낸다.
분도(g)는, 말초혈 유래 T세포에 있어서의 AILIM 및 CD28의 발현상태를 나타낸다.
분도(h)는, 말초혈 유래 T세포로부터 분리한 AILIM 양성 세포에 있어서의 AILIM 및 CD28의 발현상태를 나타낸다.
분도(i)는, 말초혈 유래 T세포에 있어서의 AILIM 및 CTLA-4의 발현상태를 나타낸다.
분도(j)는, 말초혈 유래 T세포로부터 분리한 AILIM 양성 세포에 있어서의 AILIM 및 CTLA-4의 발현상태를 나타낸다.
분도(k)는, 말초혈 유래 T세포에 있어서의 AILIM 및 CD19의 발현상태를 나타낸다.
분도(l)는, 말초혈 유래 T세포로부터 분리한 AILIM 양성 세포에 있어서의 AILIM 및 CD19의 발현상태를 나타낸다.
도25는, 정상인 말초혈에 유래하는 T세포, CD4양성 T세포, CD8양성 T세포, 상기 각각의 T세포로부터 분리한 AILIM 양성 세포의 각각에 있어서의 AILIM의 발현의 강함을 나타내는 도.
분도(a)는, 말초혈 T세포 및 상기 T세포로부터 분리한 AILIM 양성세포의 각각에 있어서의 AILIM의 발현의 강함을 나타낸다.
분도(b)는, 말초혈 CD4양성 T세포 및 상기 T세포로부터 분리한 CD4양성 AILIM 양성 T세포의 각각에 있어서의 AILIM의 발현의 강함을 나타낸다.
분도(c)는, 말초혈 CD8양성 T세포 및 상기 T세포로부터 분리한 CD8양성 AILIM 양성 T세포의 각각에 있어서의 AILIM의 발현의 강함을 나타낸다.
도26은, 만성 관절류마치스(RA) 및 변형성 관절염(OA)에 이환하고 있는 환자의 각각의 말초혈 유래 T세포 및 관절강액 유래 T세포 및 진행성 전신성 경화증(강피증; PSS) 및 전신성 에리테마토데스(SLE)에 이환하고 있는 환자 각각의 말초혈 T세포의 각각에 있어서의 AILIM의 발현상태를 나타내는 도.
도27은, 아쥬반트 유발 관절염모델 쥐의 흉선, 비장, 림프절 및 말초혈의 각각에 유래하는 T세포(CD4양성 T세포, CD8양성 T세포)에 있어서의 AILIM의 발현상태를 나타내는 도.
도28은, 각종의 자극으로 활성화시킨 정상인 말초혈 유래 T세포에 있어서의 AILIM 및 CTLA-4의 각각의 발현상태를 나타내는 도.
분도(a)는, PMA 및 이온운반체의 자극에 의해 활성화한 T세포에 있어서의 AILIM 발현의 강함을 나타낸다.
분도(b)는, PMA 및 이온운반체의 자극에 의해 활성화한 T세포에 있어서의 CTLA-4의 발현의 강함을 나타낸다.
분도(c)는, PMA 및 이온운반체의 자극에 의해 활성화한 CD4양성 T세포에 있어서의 AILIM의 발현의 강함을 나타낸다.
분도(d)는, PMA 및 이온운반체의 자극에 의해 활성화한 CD4양성 T세포에 있어서의 CTLA-4의 발현의 강함을 나타낸다.
분도(e)는, 항 CD3 항체와 항 AILIM 항체에 의한 자극 또는 항 CD3 항체와 항 CD28 항체에 의한 자극으로 활성화한 T세포에 있어서의 AILIM의 발현의 강함을 나타낸다.
분도(f)는, 항 CD3 항체와 항 AILIM 항체에 의한 자극 또는 항 CD3 항체와 항 CD28 항체에 의한 자극으로 활성화한 T세포에 있어서의 CTLA-4의 발현의 강함을 나타낸다.
도29는, 여러 가지 항체의 자극에 의한 인간 말초혈 T세포에 있어서의 여러 가지 사이토카인의 산생유도능을 나타내는 도.
도30은, 여러 가지 농도의 여러 가지 항체의 자극에 의한 인간 말초혈 T세포의 세포증식 유도능을 나타내는 도.
도31은, 여러 가지 항체의 자극에 의한 인간 말초혈 T세포의 경시적인 세포증식 유도능을 나타내는 도.
도32는, 항 CD3 항체 및 항 AILIM 항체를 코팅한 마이크로플레이트중에서의 배양에 있어서의 마우스 비장세포 및 마우스 비장 유래 T세포 각각의 증식 정도를 나타내는 도.
분도(a)는, 마우스 비장세포의 증식 정도를 나타낸다.
분도(b)는, 마우스 비장 유래 T세포의 증식 정도를 나타낸다.
도33은, 항 CD3 항체(농도 일정) 및 항 AILIM 항체(각종 농도)를 코팅한 마이크로비드(농도 일정)를 사용한 배양에 있어서의 마우스 비장세포의 각각의 증식 정도를 나타내는 도.
도34는, 항 CD3 항체(농도 일정) 및 항 AILIM 항체(농도 일정)를 코팅한 마이크로비드(여러 농도)를 사용한 배양에 있어서의 마우스 비장세포의 증식 정도를 나타내는 도.
도35는, 항 CD3 항체(농도 일정) 및 항 AILIM 항체(농도 일정)를 코팅한 마이크로비드(여러 농도)를 사용한 배양에 있어서의 마우스 비장 유래 T세포의 증식 정도를 나타내는 도.
도36은, 여러 농도의 여러 가지 항체의 자극에 의한 쥐 림프절 유래 T세포의 세포증식 유도능을 나타내는 도.
도37은, 관절증 숙주에 있어서의 관절증의 파라미터인 발 부음에 대한 항 AILIM 항체의 단회투여(농도 일정)에 의한 치료효과를 나타내는 도.
도38은, 관절증 숙주에 있어서의 관절증의 파라미터인 발 부음에 대한 항 AILIM 항체의 단회투여(여러 농도)에 의한 치료효과를 나타내는 도.
도39는, 이식편 대 숙주병(GVHD)의 이식편 대 숙주반응(GVH 반응)의 하나인 IgG 산생의 상승에 대한 항 AILIM 항체에 의한 억제효과를 나타내는 도.
도40은, 이식편 대 숙주병(GVHD)의 이식편 대 숙주반응(GVH 반응)의 하나인 IgE 산생의 상승에 대한 항 AILIM 항체에 의한 억제효과를 나타내는 도.
도41은, 이식편 대 숙주병(GVHD)의 이식편 대 숙주반응(GVH 반응)의 하나인 항 dsDNA 항체가의 상승에 대한 항 AILIM 항체에 의한 억제효과를 나타내는 도.
도42는, 외래항원인 NP-KLH로 면역감작된 숙주의 생체에서의 상기 외래항원에 대한 IgG1 항체 산생의 항 AILIM 항체에 의한 억제효과를 나타내는 도.
도43은, 외래항원인 NP-KLH로 면역감작된 숙주의 생체에서의 상기 외래항원에 대한 IgM 항체 산생의 항 AILIM 항체에 의한 억제효과를 나타내는 도.
도44는, 외래항원인 NP-KLH로 면역감작된 숙주의 생체에서의 상기 외래항원에 대한 IgG1 항체 산생의 항 AILIM 항체에 의한 억제효과를 나타내는 도.
도45는, 외래항원인 NP-KLH로 면역감작된 숙주의 생체에서의 상기 외래항원에 대한 IgG2b 항체 산생의 항 AILIM 항체에 의한 억제효과를 나타내는 도.
도46은, 외래항원인 NP-KLH로 면역감작된 숙주의 생체에서의 상기 외래항원에 대한 IgG2a 항체 산생의 항 AILIM 항체에 의한 억제효과를 나타내는 도.
도47은, 정상인 「도너 A」의 T세포를 정상인 「도너 D」의 PBMC와 배양한 경우의 혼합 림프구반응(MLR)으로의 상기 T세포의 증식시험에 있어서의, 여러 가지 대조 실험 대상물질에 의한 상기 T세포 증식의 억제효과를 나타내는 도.
세로축은 세포증식 정도의 지표로서의 [3H]티미딘의 세포내로의 함입량을 나타내고, 가로축은 상기 실험 대상물질의 농도를 나타낸다.
또한, 도중의 각종 표기는 아래의 내용을 의미한다.
「CD80+86」: 항 CD80 항체와 항 CD86 항체와의 혼합물.
「mIgG1」: 항 인간 CD34/IgG1 마우스 단일클론항체.
「CTLA4-Ig」: 인간 CTLA4-IgFc 키메라분자.
「SA12」: 항 인간 AILIM 마우스 단일클론항체.
도48은, 정상인 「도너 D」의 T세포를 정상인 「도너 B」의 PBMC와 배양한 경우의 혼합 림프구반응(MLR)으로의 상기 T세포의 증식시험에 있어서의, 여러 가지 대조실험 대상물질에 의한 상기 T세포의 증식 억제효과를 나타내는 도.
세로축은 세포증식 정도의 지표로서의 [3H]티미딘의 세포내로의 함입량을 나타내고, 가로축은 상기 실험 대상물질의 농도를 나타낸다.
또한, 도중의 각종 표기는 아래 내용을 의미한다.
「CD80+ 86」: 항 CD80 항체와 항 CD86 항체와의 혼합물.
「mIgG1」: 항 인간 CD34/IgG1 마우스 단일클론항체.
「CTLA4-Ig」: 인간 CTLA4-IgFc 키메라분자.
「SA12」: 항 인간 AILIM 마우스 단일클론항체.
도49는, 정상인 「도너 C」의 T세포를 정상인 「도너 A」의 PBMC와 배양한 경우의 혼합 림프구반응(MLR)으로의 상기 T세포의 증식시험에 있어서의, 여러 가지 대조실험 대상물질에 의한 상기 T세포의 증식 억제효과를 나타내는 도.
세로축은 세포증식 정도의 지표로서의 [3H]티미딘의 세포내로의 함입량을 나타내고, 가로축은 상기 실험 대상물질의 농도를 나타낸다.
또한, 도중의 각종 표기는 아래의 내용을 의미한다.
「CD80+86」: 항 CD80 항체와 항 CD86 항체와의 혼합물.
「mIgG1」: 항 인간 CD34/IgG1 마우스 단일클론항체.
「CTLA4-Ig」: 인간 CTLA4-IgFc 키메라분자.
「SA12」: 항 인간 AILIM 마우스 단일클론항체.
도50은, 정상인 「도너 E」의 T세포를 정상인 「도너 G」의 PBMC와 배양한 경우의 혼합 림프구반응(MLR)으로의 상기 T세포의 증식시험에 있어서의, 여러 가지 대조실험 대상물질에 의한 상기 T세포의 증식 억제효과를 나타내는 도.
세로축은 세포증식 정도의 지표로서의 [3H]티미딘의 세포내로의 함입량을 나타내고, 가로축은 상기 실험 대상물질의 농도를 나타낸다.
또한, 도중의 각종 표기는 아래의 내용을 의미한다.
「control mIgG」: 항 인간 CD34/IgG1 마우스 단일클론항체.
「CD80+ 86 Ab」: 항 CD80 항체와 항 CD86 항체와의 혼합물.
「SA12」: 항 인간 AILIM 마우스 단일클론항체.
「CTLA4-Ig」: 인간 CTLA4-IgFc 키메라분자.
도51은, 정상인 「도너 F」의 T세포를 정상인 「도너 E」의 PBMC와 배양한 경우의 혼합 림프구반응(MLR)으로의 상기 T세포의 증식시험에 있어서의, 여러 가지 대조실험 대상물질에 의한 상기 T세포의 증식의 억제효과를 나타내는 도.
세로축은 세포증식 정도의 지표로서의 [3H]티미딘의 세포내로의 함입량을 나타내고, 가로축은 상기 실험 대상물질의 농도를 나타낸다.
또한, 도중의 각종 표기는 아래의 내용을 의미한다.
「control mIgG」: 항 인간 CD34/IgG1 마우스 단일클론항체.
「CD80+ 86 Ab」: 항 CD80 항체와 항 CD86 항체와의 혼합물.
「SA12」: 항 인간 AILIM 마우스 단일클론항체.
「CTLA4-Ig」: 인간 CTLA4-IgFc 키메라분자.
도52는, 정상인 「도너 G」의 T세포를 정상인 「도너 F」의 PBMC와 배양한 경우의 혼합 림프구반응(MLR)으로의 상기 T세포의 증식시험에 있어서의, 여러 가지 대조실험 대상물질에 의한 상기 T세포의 증식의 억제효과를 나타내는 도.
세로축은 세포증식의 정도의 지표로서의 [3H]티미딘의 세포내로의 함입량을 나타내고, 가로축은 상기 실험 대상물질의 농도를 나타낸다.
또한, 도중의 각종 표기는 아래의 내용을 의미한다.
「control mIgG」: 항 인간 CD34/IgG1 마우스 단일클론항체.
「CD80+ 86 Ab」: 항 CD80 항체와 항 CD86 항체와의 혼합물.
「SA12」: 항 인간 AILIM 마우스 단일클론항체.
「CTLA4-Ig」: 인간 CTLA4-IgFc 키메라분자.
본 발명자들은, 포유동물의 AILIM의 생물학적 기능, AILIM의 여러 가지 세포에서의 발현상태 및 AILIM의 발현과 질환과의 관련성에 관해서, 예의 연구를 거듭한 결과, 상술한 지금까지 얻어지고 있는 AILIM에 관한 사실에 더하여, 더욱이 아래 사실을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
(I) 정상 마우스의 림프조직의 하나인 흉선의 T세포에 있어서는, CD3의 발현이 높은 세포에서 마찬가지로 AILIM이 높은 발현이 보여져, 양자의 발현은 상관성이 인정된다. 한편, 대조적으로, 코스티뮬레이토리 분자인 CD28의 발현은 CD3의 발현이 높을 수록 저하되어 있었다. 정상 마우스 흉선 T세포에 있어서는, AILIM의 발현과 CD28의 발현은 상반되는 동태를 나타냈다. 정상 마우스 흉선 유래 T세포에 있어서는, CD4음성 CD8음성 T세포에서는, AILIM 및 CD28 모두 그 발현이 인정되지 않는다. 정상 마우스 흉선 유래 T세포에 있어서는, CD28의 발현은, CD4양성 CD8양성 T세포에서 최대가 되고, 그 후의 세포분화를 거친 CD4음성 CD8양성 T세포 또는 CD4양성 CD8음성 T세포에 있어서 그 발현이 감소한다. 한편, 정상 마우스 흉선세포에 있어서는, AILIM의 발현은, CD4양성 CD8양성 T세포에서는 조금 밖에 인정되지 않지만, 그 후의 세포분화를 거친 CD4음성 CD8양성 T세포 또는 CD4양성 CD8음성 T세포에서 높은 발현이 인정된다. 정상 마우스흉선 T세포에 있어서의 AILIM의 발현은, CD3 뿐 아니라 CD4 및 CD8 발현과의 상관성면에 있어서도 CD28의 발현과는 다른 것이다.
(II) 정상 마우스의 림프조직의 하나인 비장 및 림프절의 T세포에 있어서의 AILIM의 발현은, 마우스 흉선 유래 T세포에서의 발현과 비교하여 얼마 안 되고, CD4양성 T세포의 극소수(CD4양성 T세포의 약 1~3%)에 있어서 AILIM의 발현이 인정된다.
(III) P.acnes(Propionibacterium acnes) 및 LPS(Lipopolysaccaride)를 투여함으로써 유도한 마우스 간염모델의 간장조직 유래 T세포(단핵세포)에 있어서는, AILIM의 현저한 발현이 인정된다. 그 발현은 정상 마우스 비장 유래의 CD4양성 세포 또는 림프절 유래 T세포에서의 AILIM의 발현에 비교하여 현저히 높은 것이다.
(IV) 정상인의 말초혈 유래 세포에 있어서는, AILIM 양성 세포의 대부분이 CD4양성 CD8음성 세포이고, AILIM 양성 세포의 대부분이 T세포이다. 정상인 말초혈 유래에는, 얼마 안 되기는 하지만 B세포에 있어서도 AILIM의 발현이 인정된다.
(V) 관절류마치스(RA)환자의 관절강액(關節腔液)중의 관절조직 침윤 T세포(CD4양성 T세포 및 CD4음성 T세포)에 있어서는, 동일 환자의 말초혈중 T세포 및 정상인의 말초혈중 T세포의 어느 것에 비교하더라도, 유의하게 높은 AILIM의 발현이 인정된다.
(VI) 변형성 관절증(OA)환자의 관절강액중의 CD4양성 T세포에 있어서도, AILIM 양성 세포의 비율이 유의하게 상승하고 있다. 또한, 진행성 전신성 경화증(PSS)환자의 CD4양성 T세포에 있어서도 AILIM 양성 세포의 비율이 유의하게 상승하고 있다.
(VII) 마우스 림프조직 유래의 T세포에 있어서는, 항 CD3 항체, 콘카나발린 A (Concanavalin A; ConA), 또는 PMA(phorbol myristate acetate)와 이온운반체로 자극하면 약 3~6시간 후에 AILIM의 발현상승이 인정되고, 자극후 약 12시간에서 최대의 AILIM의 발현이 인정된다. 자극으로부터 약 24시간 이후에 있어서도 AILIM의 높은 발현이 인정되고, 그 발현은 약 48시간 후에도 동일한 정도의 발현이 유지된다.
(VIII) 인간 말초혈 T세포(CD4양성 T세포 및 CD8양성 T세포)를 PMA 및 이온운반체로 활성화하면, 자극후 약 8시간 후에 AILIM의 높은 발현이 인정된다. 또한, 인간말초혈 T세포에 있어서는, 항 CD3 항체 및 항 AILIM 항체, 또는 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체의 어느 쪽 자극에 의해서도 AILIM의 높은 발현이 유도된다.
(IX) AILIM은, Th2 타입의 사이토카인산생의 성상을 갖는 주화 T세포(D10, MS202, CD28KO, EL-4 등)에서 구성적인(constitutive) 발현이 인정된다. 또한, 그들의 세포주에서의 AILIM의 발현은, CD28의 발현과 동등 또는 그 이상으로 높은 발현이다.
(X) 정상 마우스 및 쥐의 비장 또는 흉선 유래의 T세포 또는 정상인의 말초혈 유래의 T세포를, 본 발명을 구성하는 항 AILIM 항체 및 항 CD3 항체 양쪽을 코팅한 플레이트중에서 배양하면, 해당 T세포로부터의 사이토카인(IFNγ, IL-4, TNFα, IL-2, IL-10)의 산생 및 T세포의 증식이 유도된다.
(XI) ConA 또는 PMA로 자극한 말초혈 유래 T세포를, 본 발명을 구성하는 항 AILIM 항체 및 항 CD3 항체 양쪽을 코팅한 플레이트중에서 배양하면, 해당 T세포로부터의 사이토카인의 산생 및 세포증식이 촉진된다. 또한, 이 결과는, ConA 또는 PMA로 자극한 말초혈 유래 T세포를, 항 CD28 항체 및 항 CD3 항체의 양쪽을 코팅한 플레이트중에서 배양한 경우의 결과와 동등하다.
(XII) 정상 비장 및 흉선의 각각으로부터 단리한 흉선세포 및 비장세포(각각 점착성 세포를 제거)를 항 CD3 항체를 코팅한 플레이트중에서 배양함으로써 T세포반응을 야기한 T세포에, 본 발명을 구성하는 항 AILIM 항체를 첨가하면, 상기 T세포로부터의 사이토카인(예를 들면, 인터페론γ(IFN-γ), 인터루킨4(IL-4) 등)의 산생이 억제됨과 동시에, 상기 T세포의 증식이 억제된다. 또한, 상기 항 AILIM 항체에 의한 T세포반응(상기 사이토카인 산생, 세포증식 등)의 억제는, 항체의 농도에 의존하는 것이다. 한편, 항 AILIM 항체 대신에 항 CD28 항체를 가하는 경우에는, 항 AILIM 항체를 사용한 경우의 결과는 반대로 상기 T세포반응이 증강된다.
(XIII) P.acnes(Propionibacterium acnes) 및 LPS(Lipopolysaccaride)를 투여함으로써 유도한 간염모델 동물에게, 본 발명을 구성하는 항 AILIM 항체를 투여하면, 항체농도 의존적으로 혈중의 IFN-γ의 상승이 유의하게 억제됨과 동시에, GOT/GPT의 상승이 유의하게 억제된다.
(XIV) 결핵사균을 투여함으로써 유도한 관절염모델 동물에게, 본 발명을 구성하는 항 AILIM 항체를 투여하면, 항체농도 의존적으로 발 부음(paw swelling)이 유의하게 억제됨과 동시에, 관절염의 여러 가지 파라미터의 상승이 유의하게 억제된다.
(XV) 이식편 대 숙주병(graft versus host disease; GVHD)의 모델 동물에게, 본 발명을 구성하는 항 AILIM 항체를 투여하면, 이식편 대 숙주반응(GVH reaction)의 산물인 IgG 및 IgE의 산생이 유의하게 억제됨과 동시에, 자기항체가의 지표인 항 dsDNA항체산생의 상승이 유의하게 억제된다.
(XVI) 외래항원으로서의 양 적혈구(sheep red blood cell; SRBC)를 감작함으로써 유도한 과잉 외래항원에 대한 항체산생을 일으키는 모델 동물에게, 본 발명을 구성하는 항 AILIM 항체를 투여(감작직후 또는 수일후)하면, 외래항원인 상기 SRBC에 대한 항체산생의 상승이 유의하게 억제된다. 또한, 그 억제효과는, CTLA4-Ig를 투여한 경우의 억제효과 보다도 높은 것이다.
(XVII) 외래항원으로서의 NP-KLH를 감작함으로써 유도한 과잉 외래항원에 대한 항체산생을 일으키는 모델 동물에게, 본 발명을 구성하는 항 AILIM 항체를 투여(감작직후 또는 수일후)하면, 외래항원인 상기 NP-KH에 대한 항체산생의 상승이 유의하게 억제된다.
(XVIII) 항 AILIM 항체가, 다른 정상 도너(normal doner) 유래의 말초혈단핵구(PBMC)와 T세포와의 알로제닉혼합 림프구반응(MLR)에 있어서의 T세포의 세포증식을 유의하게 억제한다.
본 발명의 의약조성물은, AILIM을 발현하는 세포로의 AILIM을 매개로 하는 코스티뮬레이토리 시그날(부자극 시그날)의 전달이 관여하는 여러 가지 생체반응(예를 들면, AILIM을 발현하는 세포의 세포증식, AILIM을 발현하는 세포에 의한 사이토카인의 산생, AILIM을 발현하는 세포의 면역세포용해(immune cytolysis) 또는 세포사(apoptosis) 및 AILIM을 발현하는 세포에 대한 항체의존성 세포장해를 유도하는 활성 등)을 제어하기 위한 의약품으로서, 및/또는 상기 AILIM을 매개로 하는 시그날전달이 관여하는 여러 가지 질환의 발증 및/또는 진행을 억제, 저지하여, 상기 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약품으로서 유용하다.
구체적으로는, 본 발명의 의약조성물은, AILIM 발현세포의 증식제어(억제 또는 촉진) 또는 AILIM 발현세포에 의한 사이토카인(예를 들면, 인터페론γ 또는 인터루킨4 등)의 산생을 제어(억제 또는 촉진)하는 것이 가능하고, AILIM을 매개로 하는 시그날전달이 관여하는 여러 가지 생리현상에 의해 야기되는 여러 가지 병적 상태의 억제 및 여러 가지 질환의 치료 또는 예방을 가능하게 한다.
본 발명의 의약조성물을 사용함으로써, 예를 들면, 관절증(예를 들면, 관절류마치스(rheumatoid arthritis; RA), 변형성 관절증(osteoarthritis; OA)), 염증(예를 들면, 간염), 이식편 대 숙주반응(graft versus host reaction; GVH reaction), 이식편 대 숙주병(graft versus host disease; GVHD), 조직 또는 장기의 이식에 동반되는 면역 거절반응, 외래항원 또는 자기항원에 의해 야기되는 면역반응(예를 들면, 상기 항원에 대한 항체의 산생, 세포증식, 사이토카인의 산생 등)을 억제, 예방 및/또는 치료하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 의약조성물은, 항 염증약으로서의 여러 가지 스테로이드제가 적용되고 있는 임의의 염증의 치료 또는 예방에 적용하는 것이 가능하다.
본 발명의 의약조성물의 적용이 가능한 염증성 질환으로서는, 예를 들면, 여러 가지 관절염(관절류마치스, 변형성 관절증 등)에 동반되는 염증, 폐렴, 간염(바이러스성 간염을 포함한다), 감염증에 동반되는 염증, 염증성 장질환, 장염, 신장염(사구체 신장염, 신선유증(腎線維症)에 동반되는 염증), 위염, 혈관염, 췌장염, 복막염, 기관지염, 심근염, 뇌염, 허혈후 재관류장해(심근허혈 재관류장해 등)에 있어서의 염증, 조직이나 장기의 이식후 면역거절에 기인하는 염증, 화상, 여러 가지 피부의 염증(건선, 알레르기성 접촉성 피부염, 만성 염증성 피부질환인 편평태선(lichen planus 등), 다발성 장기장해에 있어서의 염증, PTCA나 PTCR술 후에 있어서의 염증 및 동맥경화증에 동반되는 염증, 자기면역성 갑상선염 등을 들 수 있다.
즉, 본 발명은, 하기 (1)~(32)에 기재되는 바와 같은 발명이다.
(1) AILIM을 매개로 하는 시그날전달을 제어하는 활성을 갖는 물질 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 된 관절증을 억제, 치료 또는 예방하기 위한 의약조성물.
(2) (1)에 있어서, 상기 물질이, AILIM 발현세포의 증식을 억제하던가, 또는 AILIM 발현세포에 의한 사이토카인의 산생을 억제하는 활성을 갖는 물질인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 사이토카인이, Th1 타입의 T세포가 산생하는 사이토카인인 인터페론γ이던가, 또는 Th2 타입의 T세포가 산생하는 사이토카인인 인터루킨4인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 상기 관절증이, 관절류마치스인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(5) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 상기 관절증이, 변형성 관절증인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(6) (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 상기 물질이, 단백성 물질인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(7) (6)에 있어서, 상기 단백성 물질이, 하기군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
a) AILIM에 결합하는 항체 또는 그의 일부;
b) AILIM의 세포외 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드;
c) AILIM의 세포외 영역의 전부 또는 일부와 면역글로불린 중쇄의 정상영역의 전부 또는 일부로 된 융합 폴리펩티드;및
d) AILIM에 결합하는 폴리펩티드.
(8) (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 상기 물질이, 비단백성 물질인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(9) (8)에 있어서, 상기 비단백성 물질이, DNA, RNA 또는 화학적으로 합성된 화합물인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(10) AILIM을 매개로 하는 시그날전달을 제어하는 활성을 갖는 물질 및 화학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 된 염증을 억제, 치료 또는 예방하기 위한 의약조성물.
(11) (10)에 있어서, 상기 물질이, AILIM 발현세포의 증식을 억제하던가, 또는 AILIM 발현세포에 의한 사이토카인의 산생을 억제하는 활성을 갖는 물질인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(12) (11)에 있어서, 상기 사이토카인이, Th1 타입의 T세포가 산생하는 사이토카인인 인터페론γ이던가, 또는 Th2 타입의 T세포가 산생하는 사이토카인인 인터루킨4인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(13) (10) 내지 (12) 중 어느 하나에 있어서, 상기 염증이, 간염인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(14) (10) 내지 (13) 중 어느 하나에 있어서, 상기 물질이, 단백성 물질인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(15) (14)에 있어서, 상기 단백성 물질이, 하기군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 의약조성물:
a) AILIM에 결합하는 항체 또는 그의 일부;
b) AILIM의 세포외 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드;
c) AILIM의 세포외 영역의 전부 또는 일부와 면역글로불린 중쇄의 정상영역의 전부 또는 일부로 된 융합 폴리펩티드;및
d) AILIM에 결합하는 폴리펩티드.
(16) (10) 내지 (13) 중 어느 하나에 있어서, 상기 물질이, 비단백성 물질인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(17) (16)에 있어서, 비단백성 물질이 DNA, RNA 또는 화학적으로 합성된 화합물인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(18) AILIM을 매개로 하는 시그날전달을 제어하는 활성을 갖는 물질 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 되고, 이식편 대 숙주반응, 이식편 대 숙주반응 또는 조직 또는 장기의 이식에 동반되는 면역 거절반응을 억제, 치료 또는 예방하기 위한 의약조성물.
(19) (18)에 있어서, 상기 물질이, AILIM 발현세포의 증식을 억제하던가, 또는 AILIM 발현세포에 의한 사이토카인의 산생을 억제하는 활성을 갖는 물질인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(20) (19)에 있어서, 상기 사이토카인이, Th1 타입의 T세포가 산생하는 사이토카인인 인터페론γ이던가, 또는 Th2 타입의 T세포가 산생하는 사이토카인인 인터루킨4인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(21) (18) 내지 (20) 중 어느 하나에 있어서, 상기 물질이, 단백성 물질인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(22) (21)에 있어서, 상기 단백성 물질이, 하기군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
a) AILIM에 결합하는 항체 또는 그의 일부;
b) AILIM의 세포외 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드;
c) AILIM의 세포외 영역의 전부 또는 일부와 면역글로불린 중쇄의 정상영역의 전부 또는 일부로 된 융합 폴리펩티드;및
d) AILIM에 결합하는 폴리펩티드.
(23) (18) 내지 (20) 중 어느 하나에 있어서, 상기 물질이, 비단백성 물질인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(24) (23)에 있어서, 상기 비단백성 물질이, DNA, RNA 또는 화학적으로 합성된 화합물인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(25) AILIM을 매개로 하는 시그날전달을 제어하는 활성을 갖는 물질 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함되어 되고, 외래항원 또는 자기항원에 의해 야기되는 면역반응을 억제하기 위한 의약조성물.
(26) (25)에 있어서, 상기 면역반응이, 상기 항원에 대한 항체의 산생, 세포증식, 또는 사이토카인의 산생인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(27) (25) 또는 (26)에 있어서, 상기 물질이, AILIM 발현세포의 증식을 억제하던가, 또는 AILIM 발현세포에 의한 사이토카인의 산생을 억제하는 활성을 갖는 물질인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(28) (27)에 있어서, 상기 사이토카인이, Th1 타입의 T세포가 산생하는 사이토카인인 인터페론γ이던가, 또는 Th2 타입의 T세포가 산생하는 사이토카인인 인터루킨4인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(29) (25) 내지 (28) 중 어느 하나에 있어서, 상기 물질이, 단백성 물질인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(30) (29)에 있어서, 상기 단백성 물질이, 하기군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
a) AILIM에 결합하는 항체 또는 그의 일부;
b) AILIM의 세포외 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드;
c) AILIM의 세포외 영역의 전부 또는 일부와 면역글로불린 중쇄의 정상영역의 전부 또는 일부로 된 융합 폴리펩티드;및
d) AILIM에 결합하는 폴리펩티드.
(31) (25) 내지 (28) 중 어느 하나에 있어서, 상기 물질이, 비단백성 물질인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(32) (31)에 있어서, 상기 비단백성 물질이, DNA, RNA 또는 화학적으로 합성된 화합물인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
이하, 본 발명에서 사용되는 항체의 일반적 제조방법 및 본 발명에서 사용하는 어구의 의미를 명확하게 함으로써, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서의 「포유동물」이란, 인간, 소, 염소, 토끼, 마우스, 쥐, 햄스터 및 모르모트 등을 의미하고, 바람직하게는, 인간, 소, 쥐, 마우스 또는 햄스터이고, 특히 바람직하게는 인간이다.
본 발명에 있어서의 「AILIM」이란, 「activation inducible lymphocyte immunomodulatory molecule」의 약칭이다. 이 AILIM은, 최근 본 발명자들이 동정, 단리하여, 일본국특허출원공개평11-29599호 공보(1998년 특허출원 제62217호) 및 대응하는 국제 특허출원 공개 WO98/38216호 공보(국제특허출원번호 PCT/JP98/00837)중에 있어서 보고한 「JTT-1항원」 또는 「JTT-2항원」이라 명명한 포유동물 유래의 신규 세포막 표면분자를 의미한다.
구체적으로는, 상기 특허출원공개공보에 있어서, 서열번호 1에 기재되는 아미노산서열을 갖는 인간 AILIM(인간 JTT-1항원), 서열번호 4 또는 서열번호 6의 어느 하나에 기재되는 아미노산서열을 갖는 쥐 AILIM(쥐 JTT-1항원) 및 서열번호 5에 기재되는 아미노산서열을 갖는 마우스 AILIM(마우스 JTT-1항원)을 의미한다.
인간 AILIM과 완전히 동일한 인간 유래분자에 대해서, 크로체크(Kroczek) 등의 그룹이, 본 발명자들에 의한 상기 2개의 특허출원의 공개공보 공개일보다 나중에 공개된 2개의 문헌중에서 보고하고 있다. 그들은 그 인간 유래분자를, ICOS(inducible co-stimulator) 또는 8F4라 명명하고 있다(국제 특허출원 공개 WO99/15553호 공보 및 Nature, Vol.397, p.263-266, 1999). 해당 ICOS 또는 8F4라 명명된 인간 유래의 분자도 인간 AILIM과 동일분자로서 본 출원에 도입된다.
또한, 본 발명에서 말하는 「AILIM」에는, 상기 기보의 문헌중에 기재된 각각의 포유동물 AILIM의 아미노산서열, 특히 바람직하게는 인간 AILIM의 아미노산서열(일본국특허출원공개평11-29599호 공보 및 해당하는 국제 특허출원 공개 WO98/38216호 공보에 기재되는 서열번호 2에 기재되는 아미노산서열)과 실질적으로동일한 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드도 포함된다.
여기서 「실질적으로 동일한 아미노산서열을 갖는다」라는 것은, 상기 기보의 아미노산서열을 포함하는 폴리펩티드와 실질적으로 동등한 생물학적 성질을 갖는 한, 상기 아미노산서열중 복수개의 아미노산, 바람직하게는 1~10개의 아미노산, 특히 바람직하게는 1~5개의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 수식되어 있는 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드 및 상기 아미노산서열에, 복수개의 아미노산, 바람직하게는 1~10개의 아미노산, 특히 바람직하게는 1~5개의 아미노산이 부가된 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드도 본 출원 발명의 「AILIM」의 범위에 포함되는 것을 의미한다.
그와 같은 아미노산의 치환, 결실, 또는 삽입은 일반적인 방법에 따라 행할 수 있다(실험의학 별책 ·「유전자공학 핸드북」(1992) 등).
예를 들면, 합성 올리고누클레오티드 지정 돌연변이 도입(gapped duplex)법, 아질산 또는 아황산처리에 의해 랜덤하게 점돌연변이를 도입하는 방법, Ba131효소 등에 의해 결실변이체를 제작하는 방법, 카세트변이법, 링커 스캐닝법(linker scanning method), 미스 인코포레이션법(miss incorporation method), 미스매치 프라이머법(mismatch primer method), DNA 세그멘트 합성법 등을 들 수 있다.
합성 올리코누클레오티드 지정 돌연변이도입(gapped duplex)법은, 예를 들면 아래와 같이 행할 수 있다. 앰버변이를 갖는 M13 파지벡터에 변이유발을 희망하는 영역을 클로닝하여, 단일가닥 사슬 파지 DNA를 조제한다. 앰버변이를 갖지 않는 M13 벡터의 RFI DNA를 제한효소처리에 의해 선상으로 하고, 상기의 단일가닥 사슬파지 DNA와 혼합하여 변성후, 어닐링시켜, 「gapped duplex DNA」를 형성시킨다. 이것에 변이를 도입한 합성 올리고누클레오티드를 하이브리다이즈시켜, DNA 폴리메라제와 DNA 리가아제의 반응에 의해 폐환상 두줄가닥 사슬 DNA로 한다. 이 DNA를 미스매치 수식능이 결손되어 있는 대장균 mutS주에 트랜스팩션하고, 증식한 파지를 서프레서(suppressor)기능이 없는 대장균에 감염시켜, 앰버변이를 갖지 않는 파지 만을 선택한다.
또한, 아질산에 의한 점돌연변이를 도입하는 방법은, 예를 들면 아래와 같은 원리를 이용한다. DNA를 아질산처리하면 염기가 탈아미노화 되어, 아데닌은 하이포크산틴으로, 시토신은 우라실로, 구아닌은 크산틴이 된다. 탈아미노화된 DNA를 세포에 도입하면, DNA 복제시에 하이포크산틴은 시토신과, 우라실은 아데닌과 크산틴은 티민과 염기대를 형성하기 때문에, 「A:T」가 「G:C」로, 「G:C」가 「A:T」로 치환한다. 실제로는 아질산처리한 단일가닥 사슬 DNA 단편을 「gapped duplex DNA」에 하이브리다이즈시켜, 이하, 합성 올리고누클레오티드 지정 돌연변이도입(gapped duplex)법과 동일하게 조작하여 변이주를 분리하면 좋다.
본 발명에 있어서의 「마이토젠」이란, 분열촉진제라고도 불리고, 세포분열을 유발하는 물질을 가리킨다. 면역학적으로는, 항원비특이적(다중클론성)으로 림프구를 유약화(幼弱化)하여 분열을 유발시키는 것을 의미한다. 예를 들면, PHA나 PWM 등의 렉틴, 콘카나발린 A(Concanavalin A; ConA), 리포다당, 스트렙토리신S, 항 림프구항체 등을 들 수 있다. 콘카나발린 A나 PHA는, T림프구에만 작용하고, 리포다당은 B림프구에만 작용하며, PWM은 양 림프구에 작용하는 것이 알려져 있다.
본 출원 명세서중에서 사용되는 「림프아구세포」란 용어는, 대림프구, 림포블라스트(lymphoblast) 또는 면역아세포라고도 불리고, 림프성 조직(림프절, 비장, 흉선, 골수, 림프관, 편도선 등)이나 혈액중에 존재하는 림프구내의 대림프구에 속하는 림프구를 가리킨다.
본 출원 명세서중에서 사용되는 「활성화 림프구」란 용어는, 예를 들면 아래와 같은 림프구를 의미하지만 이것에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 어떤 형태의 자극에 의해 활성화된 림프구를 가리킨다. 림프구는, T세포, B세포 및 내츄럴 킬러세포로 분류되고, 더욱이 T세포에 대해서는 CD4양성 세포와 CD8양성 세포로 분류할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 말하는 「활성화 림프구」에는, 주로 활성화 T세포, 활성화 B세포 및 활성화 내츄럴 킬러세포가 포함되고, 활성화 T세포에는 활성화 CD4양성 세포와 활성화 CD8양성 세포가 더 포함된다.
CD4양성 T세포는, 항원제시세포(antigen-presenting cell)에 의해 제시된 항원에 반응시키면, 여러 가지 사이토카인(IFNγ, IL-4 등)을 분비하여, 그들의 사이토카인에 대한 리셉터 등이 새롭게 발현하고, 세포자신도 커져, 분열을 시작해, 증식하여 활성화된다. 활성화 CD4양성 T세포란, 이러한 상태의 CD4양성 T세포를 가리킨다.
CD8양성 T세포는, 항원에 반응시키면 IL-2R을 발현하고, 그것에 IL-2가 작용하면 세포장해성을 갖는 CTL로 분화하고, 다음에 동일한 항원펩티드/MHC 클래스 I 복합체와 만났을 때에 그 표적세포를 파괴하여 죽이게 된다. CD8양성 T세포가 CTL로 분화하면, 세포질내에 과립이 증가된다. 이 과립중에는 여러 가지 고분자 단백질이 포함되어 있고, 퍼포린은 그 대표이다. 퍼포린은 보체의 제5-9성분으로 구성되는 MAC와 많이 비슷하여, 표적세포의 세포막에 구멍을 뚫는 작용이 있다. 그 밖에, 세린프로테아제나 LT, 프로테오글리칸(proteoglycan) 등도 포함되어 있다. 또한, CTL로 분화하여 항원자극을 받으면 IFNγ, LT, TNF 또는 IL-2 등의 림포카인도 분비한다. 활성화 CD8양성 T세포란, 이러한 상태의 CD8양성 T세포를 가리킨다.
T세포는 범혈구 응집소(식물응집소, PHA)나 콘카나발린 A(Con A)에 반응하여 아구화(芽球化)현상을 나타내지만, 이러한 상태의 T세포도 활성화 T세포에 포함된다.
B세포에서는, B7분자를 발현하여, TCR과 함께 표면의 CD28을 자극하여 그 헬퍼 T세포를 활성화하고, CD40L을 발현시키거나, 림포카인을 산생하거나 하여, 자극을 받아 세포가 커지거나, 증식을 일으키는 등의 변화가 보인다. 활성화 B세포란, 이러한 상태의 B세포를 가리키고, 본 발명에 있어서는, 항체를 분비하게 된 B세포(항체분비세포(antibody-secreting cell) 및 형질세포(plasma cell))도 활성화 B세포에 포함된다.
활성화 내츄럴 킬러세포란, 상술한 바와 같이 종양세포나 바이러스 감염세포의 장해작용을 나타내는 내츄럴 킬러세포를 가리킨다. 또한, 본 발명에 있어서는, 콘카나발린 A(Con A)로 자극된 흉선세포도 활성화 림프구에 포함된다.
본 발명에 있어서 사용되는 「활성화 림프아구세포」에는, 상기와 같은 「림프아구」가, 콘카나발린 A와 같은 상기 「마이토젠」으로 자극을 받아 활성화된 림프아구가 포함된다.
본 출원 명세서에서 경우에 따라 사용되는 「정지기 림프구」란 용어는, 상술한 활성화 림프구와 대조적으로, 세포의 활성화를 위한 자극을 받고 있지 않은 비활성화 상태의 림프구를 가리킨다.
본 발명을 구성하는 「AILIM 발현세포에 의한 사이토카인의 산생」에 있어서의 「사이토카인」이란, AILIM을 발현하는 세포(특히, T세포)가 산생하는 임의의 사이토카인을 의미한다.
상기 T세포는, Th1 타입의 T세포 및 Th2 타입의 T세포를 들 수 있고, 본 발명에 있어서의 상기 사이토카인은, 특히 그들 Th1 타입의 T세포가 산생하는 사이토카인 및/또는 Th2 타입의 T세포가 산생하는 임의의 사이토카인을 의미한다.
Th1 타입의 T세포가 산생하는 사이토카인으로서는, IFN-γ, IL-2, TNF, IL-3 등을 들 수 있고, 또한 Th2 타입의 T세포가 산생하는 사이토카인으로서는, IL-3, IL-4, IL-5, IL-10, TNF 등을 들 수 있다(세포, Vol.30, No.9, p.343-346, 1998).
본 발명을 구성하는 「물질」, 구체적으로는 「AILIM을 매개로 하는 시그날전달을 제어하는 활성을 갖는 물질」, 더욱 구체적으로는 「AILIM 발현세포의 증식을 억제하던가, 또는 AILIM 발현세포에 의한 사이토카인의 산생을 억제하는 활성을 갖는 물질」에는, 자연계에 존재하는 천연 물질 또는 인공적으로 조제되는 임의의 물질을 의미한다.
여기서, 「AILIM을 매개로 하는 시그날전달」이란, 상술 또는 후술하는 실시예에서 상세하게 기술하는 바와 같은 AILIM을 발현하는 세포에 임의의 표현형 변화(세포증식, 세포의 활성화, 세포의 불활성화, 세포사 및/또는 AILIM 발현세포로부터의 임의의 사이토카인 산생능의 변화)를 초래하는 AILIM을 통한 시그날전달을 의미한다.
상기 「물질」은, 「단백성 물질」과 「비단백성 물질」로 크게 구별할 수 있다.
상기 「단백성 물질」로서는, 후술하는 폴리펩티드, 항체(다중클론항체, 단일클론항체 또는 상기 단일클론항체의 일부)를 들 수 있다.
상기 물질이 항체인 경우에는, 바람직하게는 단일클론항체이다. 상기 물질이 단일클론항체인 경우에는, 비인간 포유동물 유래의 단일클론항체 뿐 아니라, 후술하는 재조합 키메라 단일클론항체, 재조합 인간형 단일클론항체 및 인간 단일클론항체가 포함된다.
상기 물질이, 폴리펩티드인 경우에는, 후술하는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드의 단편(올리고펩티드), 융합 폴리펩티드 및 그들중 어느 하나의 화학수식체가 포함된다. 올리고펩티드로서는, 5~30개의 아미노산, 바람직하게는 5~20개의 아미노산으로 된 펩티드를 들 수 있다. 상기 화학수식은, 생체에 투여된 경우의 혈중반감기의 증대 또는 경구투여시에 있어서의 소화관에서의 분해에 대한 내성 또는 흡수성 증대목적 등의 여러 가지 목적에 따라 설계할 수 있다.
상기 폴리펩티드의 구체예로서는, 후술하는 아래의 내용을 들 수 있다.
(1) AILIM의 세포외 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드;
(2) AILIM의 세포외 영역의 전부 또는 일부와 면역글로불린 중쇄의 정상영역의 전부 또는 일부로 된 융합 폴리펩티드; 또는,
(3) AILIM에 결합하는 폴리펩티드.
상기 「비단백성 물질」로서는, DNA, RNA 및 화학적으로 합성된 화합물을 들 수 있다.
여기서, 「DNA」란, 상술의 AILIM(바람직하게는 인간 AILIM)을 코드화 하는 DNA(cDNA 및 게놈 DNA를 포함한다)의 염기서열을 토대로 설계되는 안티센스 DNA 의약으로서 유용한 「상기 DNA의 부분 염기서열을 포함하는 DNA 또는 그들을 화학수식한 화학수식 DNA」를 의미한다. 즉, 상기 안티센스 DNA는, AILIM을 코드화 하는 DNA 또는 RNA에 하이브리다이즈함으로서, 상기 AILIM을 코드화 하는 DNA의 mRNA로의 전사 또는 상기 mRNA의 단백으로의 번역을 저해할 수 있다.
여기서, 「부분 염기서열」이란, 임의의 부위에 있어서의 임의의 수의 염기로 된 부분 염기서열을 의미한다. 상기 부분 염기서열로서는, 연속된 5~100염기의 부분 염기서열을 들 수 있고, 바람직하게는, 연속된 5~70염기의 부분 염기서열, 더욱 바람직하게는 연속된 5~50염기의 부분 염기서열, 보다 바람직하게는 연속된 5~30염기의 부분 염기서열을 들 수 있다.
또한, 상기 DNA를 안티센스 의약으로서 사용하는 경우에는, 상기 DNA가 환자의 체내에 투여된 경우의 혈중반감기의 증대(안정성), 세포내막 투과성의 증대, 또는 경구투여인 경우의 소화기관에서의 분해내성의 증대 또는 흡수의 증대 등의 목적을 위해, 상기 DNA 염기서열의 일부에 화학수식을 행하는 것이 가능하다. 화학수식으로서는, 예를 들면, 올리고누클레오티드의 구조중 인산결합, 리보오스, 핵산염기, 당부위, 3’및/또는 5’말단 등의 화학수식을 들 수 있다.
인산결합의 수식으로서는, 1 이상의 상기 결합을, 포스포디에스테르결합(D-올리고), 포스포로티오에이트결합, 포스포로디티오에이트결합(S-올리고), 메틸포스포네이트결합(MP-올리고), 포스포로아미데이트결합, 비인산결합 및 메틸포스포노티오에이트결합의 어느 하나 또는 그들의 조합으로의 변경을 들 수 있다. 리보오스의 수식으로서는, 2'-플루오로리보오스 또는 2'-O-메틸리보오스 등으로의 변경을 들 수 있다. 핵산염기의 수식으로서는, 5-프로피닐우라실 또는 2-아미노아데닌 등으로의 변경을 들 수 있다.
여기서, 「RNA」란, 상술의 AILIM(바람직하게는 인간 AILIM)을 코드화 하는 RNA의 염기서열을 토대로 설계되는 안티센스 RNA 의약으로서 유용한 「상기 RNA의 부분 염기서열을 포함하는 RNA 또는 그들을 화학수식한 화학수식 RNA」를 의미한다. 상기 안티센스 RNA는, AILIM을 코드화 하는 DNA에 하이브리다이즈함으로써, 상기 AILIM을 코드화 하는 DNA 또는 RNA에 하이브리다이즈함으로써, 상기 AILIM을 코드화 하는 DNA의 mRNA로의 전사 또는 상기 mRNA의 단백으로의 번역을 저해할 수 있다.
여기서, 「부분 염기서열」이란, 임의의 부위에 있어서의 임의의 수의 염기로 된 부분 염기서열을 의미한다. 상기 부분 염기서열로서는 연속된 5~100염기의 부분 염기서열을 들 수 있고, 바람직하게는, 연속된 5~70염기의 부분 염기서열, 더욱 바람직하게는 연속된 5~50염기의 부분 염기서열, 보다 바람직하게는 연속된 5~30염기의 부분 염기서열을 들 수 있다.
상기 안티센스 RNA는, 상기 RNA가 환자의 체내에 투여된 경우의 혈중반감기의 증대, 세포내막의 투과성 증대, 또는 경구투여인 경우의 소화기관에서의 분해내성의 증대 또는 흡수의 증대 등의 목적을 위해, 상기 RNA의 염기서열의 일부에 화학수식을 행하는 것이 가능하다. 화학수식으로서는, 예를 들면, 상술의 안티센스 DNA에 적용되는 바와 같은 화학수식을 들 수 있다.
「화학적으로 합성된 화합물」이란, 상술의 DNA, RNA 및 단백성 물질을 제외한 임의의 화합물로서, 분자량 약 100~약 1000 이하의 화합물, 바람직하게는 분자량 약 100~약 800의 화합물이고, 보다 바람직하게는 분자량 약 100~약 600의 화합물을 들 수 있다.
상기 「물질」의 정의에 포함되는 「폴리펩티드」란, AILIM(바람직하게는 인간의 AILIM)을 구성하는 폴리펩티드 사슬의 일부(단편)를 의미하고, 바람직하게는 AILIM을 구성하는 폴리펩티드의 세포외 영역의 전부 또는 그 일부를 의미한다(상기 영역은 목적에 따라 그 N말단 및/또는 C말단에 1~5의 아미노산이 부가되어 있더라도 좋다.).
본 발명의 AILIM은, 1 또는 2의 폴리펩티드 사슬에 의해 구성되는 세포막을 관통하는 세포막 관통분자이다.
여기서 「세포막 관통단백」이란, 많은 수용체 또는 세포막 표면분자에 보여지는 바와 같이, 막지질 2중층을 1회 또는 여러회 관통하는 소수성 펩티드영역에 의해 막과 연결하여, 전체로서 세포외 영역(extracellular region), 막관통영역(transmembrane region) 및 세포질영역(cytoplasmic region)의 3개의 주영역으로 구성되는 구조를 취하는 단백을 가리킨다. 더욱이 그와 같은 막관통성 단백은, 단량체(monomer)로서, 또는, 동일한 아미노산서열을 갖는 다른 단일가닥 사슬 또는 다른 아미노산서열을 갖는 사슬과 함께 각각 호모다이머(homodimer), 헤테로다이머(heterodimer) 또는 올리고머(oligomer)를 형성하여 존재함으로써, 각각의 수용체나 세포 표면분자를 구성한다.
여기서 「세포외 영역」이란, 상술한 바와 같은 세포막 막관통단백의 전체구조중, 상기 막단백이 연결하고 있는 막의 외계측에 존재하는 부분구조(부분영역)의 전부 또는 일부를 의미하고, 바꿔 말하면, 막내에 함입되어 있는 영역(막관통영역) 및 상기 막내의 영역에 이어 세포질내에 존재하는 영역(세포내 영역) 이외의 영역의 전부 또는 일부를 의미한다.
상술의 「단백성 물질」에 포함되는 「융합 폴리펩티드」란, AILIM(바람직하게는 인간의 AILIM)을 구성하는 폴리펩티드의 세포외 영역의 전부 또는 일부와 「면역글로불린(Ig, 바람직하게는 인간의 Ig) 중쇄의 정상영역의 전부 또는 일부」로 된 융합 폴리펩티드이다. 바람직하게는 AILIM의 세포외 영역과 인간 IgG 중쇄의 정상영역의 일부와의 융합 폴리펩티드이고, 특히 바람직하게는 AILIM의 세포외 영역과 인간 IgG 중쇄의 힌지 영역(hinge region), CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 된 영역(Fc)과의 융합 폴리펩티드이다. 또한, IgG로서는, IgG1이 바람직하다. 또한, AILIM으로서는, 인간, 마우스 또는 쥐(바람직하게는 인간)의 AILIM이 바람직하다.
여기서 「면역글로불린(Ig) 중쇄의 정상영역의 전부 또는 일부」란, 바람직하게는 인간 유래의 면역글로불린의 중쇄(Heavy Chain, H사슬)의 정상영역(Constant region), Fc영역 또는 그들의 일부를 의미한다. 상기 면역글로불린은, 어떠한 클래스 및 서브클래스에 속하는 면역글로불린이더라도 좋고, 구체적으로는, IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4), IgM, IgA(IgA1 및 IgA2), IgD 및 IgE를 들 수 있다. 바람직하게는, IgG(IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), 또는 IgM이다. 본 발명에 있어서의 특히 바람직한 예로서는, 인간 유래의 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)에 속하는 면역글로불린이다.
면역글로불린은, 2개의 상동인 경쇄(Light Chain, L사슬)와 2개의 상동인 중쇄(Heavy Chain, H사슬)의 4개의 사슬이, 디술피드결합(S-S결합)으로 결합한 Y자형 구조단위를 갖는다. 경쇄는, 경쇄 가변영역(VL) 및 경쇄 정상영역(CL)으로 구성된다. 중쇄는, 중쇄 가변영역(VH)과 중쇄 정상영역(CH)으로 구성된다.
중쇄 정상영역은, 클래스(IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE) 및 서브클래스(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 마다 각각 고유의 아미노산서열을 갖는 몇개의 도메인으로 구성된다.
IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)의 중쇄는, N말단으로부터 순서대로, VH, CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 구성된다.
마찬가지로 IgG1의 중쇄는, N말단으로부터 순서대로, VH, Cγ11 도메인, 힌지 영역, Cγ12 도메인 및 Cγ13 도메인으로 구성된다. IgG2의 중쇄는, N말단으로부터 순서대로, VH, Cγ21 도메인, 힌지 영역, Cγ22 도메인 및 Cγ23 도메인으로 구성된다. IgG3의 중쇄는, N말단으로부터 순서대로, VH, Cγ31 도메인, 힌지 영역,Cγ32 도메인 및 Cγ33 도메인으로 구성된다. IgG4의 중쇄는, N말단으로부터 순서대로, VH, Cγ41 도메인, 힌지 영역, Cγ42 도메인 및 Cγ43 도메인으로 구성된다.
IgA의 중쇄는, N말단으로부터 순서대로, VH, Cα1 도메인, 힌지 영역, Cα2 도메인 및 Cα3 도메인으로 구성된다.
마찬가지로 IgA1의 중쇄는, N말단으로부타 순서대로, VH, Cα11 도메인, 힌지 영역, Cα12 도메인 및 Cα13 도메인으로 구성된다. IgA2의 중쇄는, N말단으로부터 순서대로, VH, Cα21 도메인, 힌지 영역, Cα22 도메인 및 Cα23 도메인으로 구성된다.
IgD의 중쇄는, N말단으로부터 순서대로, VH, Cδ1 도메인, 힌지 영역, Cδ2 도메인 및 Cδ3 도메인으로 구성된다.
IgM의 중쇄는, N말단으로부터 순서대로, VH, Cμ1 도메인, Cμ2 도메인, Cμ3 도메인 및 Cμ4 도메인으로 구성되고, IgG, IgA 및 IgD에 보여지는 바와 같은 힌지 영역을 갖지 않는다.
IgE의 중쇄는, N말단으로부터 순서대로, VH, Cε1 도메인, Cε2 도메인, Cε3 도메인 및 Cε4 도메인으로 구성되고, IgG, IgA 및 IgD에 보여지는 바와 같은 힌지 영역을 갖지 않는다.
더욱이, IgG를 예로 들자면, IgG를 파파인으로 처리하면, 2개의 중쇄를 연결시키고 있는 힌지 영역중에 존재하는 디술피드결합의 약간 N말단측에서 절단되어, VH및 CH1으로 된 중쇄단편과 하나의 경쇄가 디술피드결합으로 연결된 2개의 상동인 Fab 및 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 된 2개의 상동인 중쇄단편이 디술피드결합으로 연결된 하나의 Fc를 낳는다(이상, 「면역학 일러스트레이티드」, 원서 제2판, 제65∼75페이지, 1992년, 난코도발행 및 「최신 의과학의 초점 「면역계의 인식기구」」, 제4∼7페이지, 1991년, 난코도발행 등 참조).
즉, 상술의 「면역글로불린 중쇄의 정상영역의 일부」란, 상술한 바와 같이 구조적 특징을 갖는 면역글로불린 중쇄의 정상영역 일부를 의미하고, 바람직하게는, C1 도메인을 결하는 정상영역 또는 Fc영역이다. 구체적으로는, IgG, IgA 또는 IgD의 경우에는, 각각의 힌지 영역, C2 도메인 및 C3 도메인으로 된 영역을 들 수 있고, IgM 또는 IgE의 경우에는, 각각의 C2 도메인, C3 도메인 및 C4 도메인으로 된 영역을 들 수 있다. 특히 바람직한 예로서는, 인간 유래의 IgG1의 Fc영역을 들 수 있다.
상술의 융합 폴리펩티드는, 상술한 바와 같은 IgG 등의 면역글로불린의 정상영역의 일부(예를 들면, Fc)를 융합 파트너로서 갖는 것으로부터, 상기 면역글로불린 단편에 특이적으로 결합한다고 하는 프로틴A의 성질을 사용한 친화성 컬럼 크로마토그래피(affinity column chromatography)를 사용함으로써 상기 융합 폴리펩티드를 지극히 용이하게 정제하는 것이 가능하다고 하는 점에서 이점을 갖는다. 더욱이, 여러 가지 면역글로불린의 Fc에 대한 여러 가지 항체가 제공되고 있는 것으로부터, 상기 Fc에 대한 항체를 사용하여, 상기 융합 폴리펩티드의 면역학적 분석을 간편하게 행할 수 있다.
상기 「물질」의 정의에 포함되는 「폴리펩티드」에는, 또한 「AILIM에 결합하는 폴리펩티드」가 포함된다.
「AILIM에 결합하는 폴리펩티드」로서는, 구체적으로는, AILIM과 상호 작용하는 리간드인 기지의 B7h, B7RP-1, GL50 또는 LICOS라 칭해지는 분자(Nature, Vol.402, No.6763, p.827-832, 1999; Nature Medicine, Vol.5, No.12, p.1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol.164, p.1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol.10, No.6, p.333-336, 2000)를 구성하는 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드를 들 수 있다.
바람직하게는, 상기 리간드(B7h, B7RP-1, GL50, LICOS)의 세포외 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드와 면역글로불린(바람직하게는 인간 면역글로불린) 중쇄의 정상영역의 전부 또는 일부로 된 융합 폴리펩티드이다. 여기서, 「세포외 영역」 및 「면역글로불린 중쇄의 정상영역」이란 용어에 대해서는, 상술과 동일한 의미를 갖는다.
상술한 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드의 일부(단편) 및 융합 폴리펩티드는, 후술하는 바와 같은 유전자 재조합기술 외에, 화학적 합성법, 세포배양방법 등과 같은 해당 기술적 분야에서 알려지는 공지의 방법 또는 그 수식방법을 적절히 사용함으로써 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서의 「항체」란, 상기에서 정의한 포유동물의 AILIM(특히 바람직하게는 인간 AILIM)에 대한 다중클론항체(항혈청) 또는 단일클론항체를 의미하고, 바람직하게는 단일클론항체이다.
구체적으로는, AILIM에 결합하여 AILIM 발현세포의 증식을 억제하던가, 또는 AILIM에 결합하여 AILIM 발현세포에 의한 인터페론γ 또는 인터루킨4의 산생을 억제하는 활성을 갖는 항체이다.
본 발명의 「항체」는, 본 발명의 AILIM을 발현하는 세포(천연 세포, 주화세포, 종양세포 등), AILIM을 그 세포표면에 높게 발현하도록 유전자 재조합기술을 사용하여 제작된 형질전환체, AILIM을 구성하는 폴리펩티드, 상기 AILIM 폴리펩티드, 또는 AILIM의 세포외 영역을 포함하는 상술의 융합 폴리펩티드를 항원으로서 사용하여, 상기 항원을 마우스, 쥐, 햄스터, 모르모트 또는 토끼 등의 포유동물에게 면역하여 얻어지는 천연형 항체, 유전자 재조합기술을 사용하여 제조될 수 있는 키메라항체 및 인간형 항체(CDR-grafted 항체) 및 인간항체산생 트랜스제닉 동물 등을 사용하여 제조될 수 있는 인간항체도 포함한다.
단일클론항체에는, IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE 등의 어느 하나의 동기준표본(isotype)을 갖는 단일클론항체도 포함된다. 바람직하게는, IgG 또는 IgM이다.
다중클론항체(항혈청) 또는 단일클론항체는, 기존의 일반적인 제조방법에 의해 제조할 수 있다. 즉, 예를 들면, 상술한 바와 같은 항원을, 필요에 따라 프로인드 아쥬반트(Freund' s Adjuvant)와 함께, 포유동물, 바람직하게는, 마우스, 쥐, 햄스터, 모르모트, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 염소, 말 또는 소, 보다 바람직하게는 마우스, 쥐, 햄스터, 모르모트 또는 토끼에게 면역한다.
다중클론항체는, 상기 면역감작동물로부터 얻은 혈청으로부터 취득할 수 있다. 또한 단일클론항체는, 상기 면역감작동물로부터 얻은 상기 항체산생세포와 자기항체산생능이 없는 골수종계 세포(미엘로마세포)로부터 하이브리도마를 조제하고, 상기 하이브리도마를 클론화 하여, 포유동물의 면역에 사용한 항원에 대해 특이적 친화성을 나타내는 단일클론항체를 산생하는 클론을 선택함으로써 제조된다.
단일클론항체는, 구체적으로는 아래와 같이 하여 제조할 수 있다. 즉, 상술과 같은 항원을 면역원으로 하여, 상기 면역원을, 필요에 따라 프로인드 아쥬반트(Freund' s Adjuvant)와 함께, 비인간 포유동물, 구체적으로는, 마우스, 쥐, 햄스터, 모르모트 또는 토끼, 바람직하게는 마우스, 쥐 또는 햄스터(후술하는 인간 항체산생 트랜스제닉 마우스와 같은 다른 동물 유래의 항체를 산생하도록 작출된 트랜스제닉 동물을 포함한다)의 피하내, 근육내, 정맥내, 풋패드(footpad)내 또는 복강내에 1 내지 수회 주사하던가 또는 이식함으로써 면역감작을 행한다. 통상, 첫회 면역으로부터 약 1~14일 마다 1~4회 면역을 행하여, 최종면역으로부터 약 1~5일후에 면역감작된 상기 포유동물로부터 항체산생세포가 취득된다. 면역을 행하는 회수 및 시간적 간격은, 사용하는 면역원의 성질 등에 따라, 적절히 변경할 수 있다.
단일클론항체를 분비하는 하이브리도마의 조제는, 퀼러 및 밀스테인 등의 방법(네이쳐(Nature), 제256권, 제495∼제497페이지, 1975년) 및 그것에 준하는 수식방법에 따라 행할 수 있다. 즉, 상술과 같이 면역감작된 비인간 포유동물로부터 취득되는 비장, 림프절, 골수 또는 편도 등, 바람직하게는 비장에 포함되는 항체산생세포와, 바람직하게는 마우스, 쥐, 모르모트, 햄스터, 토끼 또는 인간 등의 포유동물, 보다 바람직하게는 마우스, 쥐 또는 인간 유래의 자기항체산생능이 없는 미엘로마세포와 세포융합시킴으로써 조제된다.
세포융합에 사용되는 미엘로마세포로서는, 예를 들면 마우스 유래 미엘로마 P3/X63-AG8.653(653), P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1), P3/X63-Ag8.U1(P3U1), SP2/0-Ag14(Sp2/O, Sp2), PAI, F0 또는 BW5147, 쥐 유래 미엘로마 210 RCY3-Ag.2.3., 인간 유래 미엘로마 U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 또는 CEM-T15를 사용할 수 있다.
단일클론항체를 산생하는 하이브리도마 클론의 스크리닝은, 하이브리도마를, 예를 들면 마이크로타이터 플레이트중에서 배양하여, 증식이 보인 웰의 배양상청의 상술의 면역감작에서 사용한 면역항원에 대한 반응성을, 예를 들면 RIA나 ELISA 등의 효소면역 측정법에 의해 측정함으로써 행할 수 있다.
하이브리도마로부터의 단일클론항체의 제조는, 하이브리도마를 인 비트로, 또는 마우스, 쥐, 모르모트, 햄스터 또는 토끼 등, 바람직하게는 마우스 또는 쥐, 보다 바람직하게는 마우스의 복수중 등에서의 인비보로 행해, 얻어진 배양상청, 또는 포유동물의 복수로부터 단리함으로써 행할 수 있다.
인 비트로로 배양하는 경우에는, 배양하는 세포종의 특성, 시험연구의 목적 및 배양방법 등의 여러 가지 조건에 맞춰, 하이브리도마를 증식, 유지 및 보존시켜, 배양상청중에 단일클론항체를 산생시키기 위해 사용되는 기지 영양배지 또는 기지의 기본배지로부터 유도 조제되는 모든 영양배지를 사용하여 실시하는 것이 가능하다.
기본배지로서는, 예를 들면, Ham'F12배지, MCDB153배지 또는 저칼슘 MEM배지 등의 저칼슘배지 및 MCDB104배지, MEM배지, D-MEM배지, RPMI1640 배지, ASF104배지 또는 RD배지 등의 고칼슘배지 등을 들 수 있고, 상기 기본배지는, 목적에 따라, 예를 들면, 혈청, 호르몬, 사이토카인 및/또는 여러 가지 무기 또는 유기물질 등을 함유할 수 있다.
단일클론항체의 단리, 정제는, 상술의 배양상청 또는 복수를, 포화 황산암모늄, 진성글로불린(euglobulin)침전법, 카프로인법, 카프릴산법, 이온교환 크로마토그래피(DEAE 또는 DE52 등), 항 면역글로불린 컬럼 또는 프로테인A 컬럼 등의 친화성 컬럼 크로마토그래피(affinity column chromatography)에 제공하는 것 등에 의해 행할 수 있다.
「재조합 키메라 단일클론항체」는, 유전자공학적으로 제작되는 단일클론항체로서, 구체적으로는, 그 가변영역이, 비인간 포유동물(마우스, 쥐, 햄스터 등)의 이므노글로불린 유래의 가변영역이고, 또한 그 정상영역이 인간 면역글로불린 유래의 정상영역인 것을 특징으로 하는 마우스/인간 키메라 단일클론항체 등의 키메라 단일클론항체를 의미한다.
인간 면역글로불린 유래의 정상영역은, IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD 및 IgE 등의 동기준표본에 의해 각각 고유의 아미노산서열을 갖지만, 재조합 키메라 단일클론항체의 정상영역은 어느 하나의 동기준표본에 속하는 인간 면역글로불린의 정상영역이더라도 좋다. 바람직하게는, 인간 IgG의 정상영역이다.
재조합 키메라 단일클론항체는, 예를 들면 아래와 같이 하여 제조할 수 있다. 그러나, 그와 같은 제조방법에 한정되는 것이 아니라는 것은 말할 것 까지도 없다.
예를 들면, 마우스/인간 키메라 단일클론항체는, 실험의학(임시 증간호), 제1.6권, 제10호, 1988년 및 특공평3-73280호 공보 등을 참조하면서 제작할 수 있다. 즉, 마우스 단일클론항체를 산생하는 하이브리도마로부터 단리한 상기 마우스 단일클론항체를 코드화 하는 DNA로부터 취득한 활성인 VH유전자(H사슬 가변영역을 코드화 하는 재배열된 VDJ 유전자)의 하류에, 인간 면역글로불린을 코드화 하는 DNA로부터 취득한 CH유전자(H사슬 정상영역을 코드화 하는 C유전자)를, 또한 상기 하이도마로부터 단리한 마우스 단일클론항체를 코드화 하는 DNA로부터 취득한 활성인 VL유전자(L사슬 가변영역을 코드화 하는 재배열된 VJ 유전자)의 하류에 인간 면역글로불린을 코드화 하는 DNA로부터 취득한 CL유전자(L사슬 정상영역을 코드화 하는 C유전자)를, 각각 발현 가능하도록 배열하여 하나 또는 따로 따로의 발현벡터에 삽입하여, 상기 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여, 상기 형질전환세포를 배양함으로써 제작할 수 있다.
구체적으로는, 먼저, 마우스 단일클론항체산생 하이도마로부터 일반적인 방법에 의해 DNA를 추출후, 상기 DNA를 적절한 제한효소(예를 들면 EcoRI, Hind III 등)를 사용하여 소화하고, 전기영동에 걸어(예를 들면 0.7% 아가로우스 겔 사용) 서던 블로팅법(southern blotting method)을 행한다. 영동한 겔을 예를 들면 브롬화 에티듐(ethidium bromide) 등으로 염색하고, 사진촬영후, 마커의 위치를 붙여, 겔을 2회 수세하고, 0.25 M의 HCl 용액에 15분간 담근다. 이어서, 0.4 N의 NaOH 용액에 10분간 담그고, 그 동안 완만하게 진탕한다. 일반적인 방법에 의해, 필터로 옮기고, 4시간후 필터를 회수하여 2×SSC에서 2회 세정한다. 필터를 충분히 건조한 후, 베이킹(75℃, 3시간)을 행한다. 베이킹 종료후에, 상기 필터를 0.1×SSC/0.1% SDS 용액에 넣고, 65℃에서 30분간 처리한다. 이어서, 3×SSC/0.1% SDS 용액에 담근다. 얻어진 필터를 프레하이브리다이제이션액(prehybridization solution)과 함께 비닐자루에 넣고, 65℃에서 3∼4시간 처리한다.
다음에, 이 속에32P 표지한 프로브 DNA 및 하이브리다이제이션액을 넣고, 65℃에서 12시간 정도 반응시킨다. 하이브리다이제이션 종료후, 적절한 염농도, 반응온도 및 시간(예를 들면, 2×SSC/0.1% SDS 용액, 실온 10분간)을 기초로, 필터를 씻는다. 상기 필터를 비닐자루에 넣어, 2×SSC를 소량 가하고, 밀봉하여, 오토라디오그래피를 행한다.
상기 서던 블로팅법에 의해, 마우스 단일클론항체의 H사슬 및 L사슬을 각각 코드화 하는 재배열된 VDJ 유전자 및 VJ 유전자를 동정한다. 동정한 DNA 단편을 포함하는 영역을 수크로오스밀도 구배원심으로 분획하여, 파지벡터(예를 들면, Charon 4A, Charon 28, λEMBL3, λEMBL4 등)에 짜 넣고, 상기 파지벡터로 대장균(예를 들면, LE392, NM539 등)을 형질전환하여, 게놈라이브러리를 제작한다. 그 게놈라이브러리를 적당한 프로브(H사슬 J유전자, L사슬(κ) J유전자 등)를 사용하여,예를 들면 벤톤 데이비스법(Benton-Davis method)(Science, 제196권, 제180∼제182페이지, 1977년)에 따라, 플라크하이브리다이제이션을 행하여, 재배열된 VDJ 유전자 또는 VJ 유전자를 각각 포함하는 포지티브 클론을 얻는다. 얻어진 클론의 제한효소지도를 제작하고, 염기서열을 결정하여, 목적으로 하는 재배열된 VH(VDJ)유전자 또는 VL(VJ)유전자를 포함하는 유전자가 얻어지고 있는 것을 확인한다.
한편, 키메라화에 사용하는 인간 CH유전자 및 인간 CL유전자를 따로 단리한다. 예를 들면, 인간 IgG1과의 키메라항체를 제작하는 경우에는, CH유전자인 Cγ1유전자와 CL유전자인 Cκ 유전자를 단리한다. 이들 유전자는 마우스 면역글로불린 유전자와 인간 면역글로불린 유전자의 염기서열의 높은 상동성을 이용하여 인간 Cγ1 유전자 및 인간 Cκ유전자에 상당하는 마우스 Cγ1 유전자 및 마우스 Cκ유전자를 프로브로서 사용하여, 인간 게놈라이브러리로부터 단리함으로써 얻을 수 있다.
구체적으로는, 예를 들면, 클론 Ig146(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제75권, 제4709∼제4713페이지, 1978년)으로부터의 3 kb의 Hind III-BamHI 단편과 클론 MEP10(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제78권, 제474∼제478페이지, 1981년)으로부터의 6.8 kb의 EcoRI 단편을 프로브로서 사용하여, 인간의 λ Charon 4A 의 Hae III-AluI 게놈라이브러리(Cell, 제15권, 제1157∼제1174페이지, 1978년)중에서, 인간 Cκ유전자를 포함하여, 엔헨서영역을 유지하고 있는 DNA 단편을 단리한다. 또한, 인간 Cγ1유전자는, 예를 들면 인간 태아간세포 DNA를 Hind III으로 절단하여, 아가로우스 겔 전기영동으로 분획한 후, 5.9 kb의 밴드를 λ788에 삽입하고, 상기 프로브를 사용하여 단리한다.
이렇게 하여 단리된 마우스 VH유전자와 마우스 VL유전자 및 인간 CH유전자와 인간 CL유전자를 사용하여, 프로모터영역 및 엔헨서영역 등을 고려하면서 마우스 VH유전자의 하류에 인간 CH유전자를, 또한 마우스 VL유전자의 하류에 인간 CL유전자를, 적절한 제한효소 및 DNA 리가아제를 사용하여, 예를 들면 pSV2gpt 또는 pSV2neo 등의 발현벡터에 일반적인 방법에 따라 짜 넣는다. 이 때, 마우스 VH유전자/인간 CH유전자와 마우스 VL유전자/인간 CL유전자의 키메라유전자는, 하나의 발현벡터에 동시에 배치되더라도 좋고, 각각 별개의 발현벡터에 배치할 수도 있다.
이렇게 하여 제작한 키메라유전자 삽입 발현벡터를, 예를 들면 P3X63 ·Ag8 ·653세포 또는 SP210세포라는, 스스로는 항체를 산생하지 않는 골수종세포에 프로트플라스트융합법, DEAE-덱스트란법, 인산칼슘법 또는 전기천공법 등에 의해 도입한다. 형질전환세포는, 발현벡터에 도입된 약물내성 유전자에 해당하는 약물 함유 배지중에서의 배양에 의해 선별하여, 목적으로 하는 키메라 단일클론항체 산생세포를 취득한다.
이렇게 하여 선별된 항체 산생세포의 배양상청중으로부터 목적으로 하는 키메라 단일클론항체를 취득한다.
「인간형 단일클론항체(CDR-grafted 항체)」는, 유전자공학적으로 제작되는 단일클론항체로서, 구체적으로는, 그 초가변영역의 상보성 결정영역의 일부 또는 전부가 비인간 포유동물(마우스, 쥐, 햄스터 등)의 단일클론항체에 유래하는 초가변영역의 상보성 결정영역으로, 그 가변영역의 골격영역이 인간 면역글로불린 유래의 가변영역의 골격영역이고, 또한 그 정상영역이 인간 면역글로불린 유래의 정상영역인 것을 특징으로 하는 인간형 단일클론항체를 의미한다.
여기서, 초가변영역의 상보성 결정영역이란, 항체의 가변영역중 초가변영역에 존재하여, 항원과 상보적으로 직접 결합하는 부위인 3개의 영역 (Complementarity-determining residue; CDR1, CDR2, CDR3)을 가리키고, 또한 가변영역의 골격영역이란, 상기 3개 상보성 결정영역의 전후에 개재하는 비교적 보존된 4개의 영역(Framework region; FR1, FR2, FR3, FR4)을 가리킨다.
바꿔 말하면, 비인간 포유동물 유래의 단일클론항체의 초가변영역의 상보성 결정영역의 일부 또는 전부 이외의 모든 영역이, 인간 면역글로불린의 대응영역과 대체한 단일클론항체를 의미한다.
인간 면역글로불린 유래의 정상영역은, IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD 및 IgE 등의 동기준표본에 의해 각각 고유의 아미노산서열을 갖지만, 본 발명에 있어서는, 상기 인간형 단일클론항체의 정상영역은 어느 하나의 동기준표본에 속하는 인간 면역글로불린의 정상영역이더라도 좋다. 바람직하게는, 인간 IgG의 정상영역이다. 또한, 인간 면역글로불린 유래 가변영역의 골격영역에 대해서도 한정되는 것은 아니다.
인간형 단일클론항체는, 예를 들면 아래와 같이 하여 제조할 수 있다. 그러나, 그와 같은 제조방법에 한정되는 것이 아닌 것은 말할 필요도 없다.
예를 들면, 마우스 단일클론항체에 유래하는 재조합 인간형 단일클론항체는, 특표평4-506458호 공보 및 특개소62-296890호 공보 등을 참조하여, 유전자공학적으로 제작할 수 있다. 즉, 마우스 단일클론항체를 산생하는 하이브리도마로부터, 적어도 하나의 마우스 H사슬 CDR 유전자와 상기 마우스 H사슬 CDR 유전자에 대응하는 적어도 하나의 마우스 L사슬 CDR 유전자를 단리하고, 또한 인간 면역글로불린 유전자로부터 상기 마우스 H사슬 CDR에 대응하는 인간 H사슬 CDR 이외의 전영역을 코드화 하는 인간 H사슬 유전자와, 전 마우스 L사슬 CDR에 대응하는 인간 L사슬 CDR 이외의 전영역을 코드화 하는 인간 L사슬 유전자를 단리한다.
단리한 상기 마우스 H사슬 CDR 유전자와 상기 인간 H사슬 유전자를 발현 가능하도록 적당한 발현벡터에 도입하고, 마찬가지로 상기 마우스 L사슬 CDR 유전자와 상기 인간 L사슬 유전자를 발현 가능하도록 적당한 또 하나의 발현벡터에 도입한다. 또는, 상기 마우스 H사슬 CDR 유전자/인간 H사슬 유전자와 마우스 L사슬 CDR 유전자/인간 L사슬 유전자를 동일한 발현벡터에 발현 가능하도록 도입할 수도 있다. 이렇게 하여 제작된 발현벡터로 숙주세포를 형질전환함으로써 인간형 단일클론항체산생 형질전환세포를 얻고, 상기 형질전환세포를 배양함으로써 배양상청중으로부터 목적으로 하는 인간형 단일클론항체를 얻는다.
「인간 단일클론항체」란, 면역글로불린을 구성하는 H사슬의 가변영역 및 H사슬의 정상영역 및 L사슬의 가변영역 및 L사슬의 정상영역을 포함하는 모든 영역이 인간 면역글로불린을 코드화 하는 유전자에 유래하는 면역글로불린이다.
인간항체(바람직하게는 인간 단일클론항체)는, 일반적인 방법에 따라, 예를 들면, 적어도 인간 면역글로불린 유전자를 마우스 등 인간 이외의 포유동물의 유전자 좌중에 짜 넣음으로써 제작된 트랜스제닉동물을, 항원으로 면역감작함으로써, 상술한 다중클론항체 또는 단일클론항체의 제작법과 동일하게 하여 제조할 수 있다.
예를 들면, 인간항체를 산생하는 트랜스제닉 마우스는, Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994; Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997; 특표평4-504365호 공보; 특표평7-509137호 공보; 닛케이사이엔스, 6월호, 제40∼제50페이지, 1995년; 국제출원공개 WO94/25585호 공보; Nature, Vol.368, p.856-859, 1994; 및 특표평6-500233호 공보 등에 기재의 방법에 따라 제작할 수 있다.
또한, 작금 개발된 기술인 트랜스제닉 소나 돼지의 밀크중으로부터 인간 유래 단백의 제조방법을 적용하는 것도 가능하다(닛케이사이엔스, 1997년 4월호, 제78페이지~84페이지).
본 발명에 있어서의 「항체의 일부」란, 상술한 바와 같은 단일클론항체의 일부분의 영역을 의미하고, 구체적으로는 F(ab')2, Fab', Fab, Fv(variable fragment of antibody), sFv, dsFv(disulphide stabilized Fv) 또는 dAb(single domain antibody) 등을 의미한다(Exp. Opin. Ther. Patents, 제6권, 제5호, 제441∼456페이지, 1996년).
여기서, 「F(ab')2」 및 「Fab'」란, 면역글로불린(단일클론항체)을, 단백분해효소인 펩신 또는 파파인 등으로 처리함으로써 제조되고, 힌지 영역중의 두가닥의 H사슬 사이에 존재하는 디술피드결합의 전후에서 소화되어 생성되는 항체 프래그먼트를 의미한다. 예를 들면, IgG를 파파인으로 처리하면, 힌지 영역중의 두가닥의 H사슬 사이에 존재하는 디술피드결합의 상류에서 절단되어 VL(L사슬 가변영역)과 CL(L사슬 정상영역)로 된 L사슬 및 VH(H사슬 가변영역)와 CHγ1(H사슬 정상영역중의 γ1영역)로 된 H사슬 프래그먼트가 C말단영역에서 디술피드결합에 의해 결합한 상동인 2개의 항체 프래그먼트를 제조할 수 있다. 이들 2개의 상동인 항체 프래그먼트를 각각 Fab'라고 한다. 또한 IgG를 펩신으로 처리하면, 힌지 영역중의 두가닥의 H사슬 사이에 존재하는 디술피드결합의 하류에서 절단되어 상기 2개의 Fab'가 힌지 영역에서 이어진 것 보다 약간 큰 항체 프래그먼트를 제조할 수 있다. 이 항체 프래그먼트를 F(ab')2라고 한다.
본 발명의 「의약조성물」이란, 상기에서 정의되는 「물질」, 구체적으로는「AILIM을 매개로 하는 시그날전달을 제어하는 활성을 갖는 물질」, 더욱 구체적으로는 「AILIM 발현세포의 증식을 억제하던가, 또는 AILIM 발현세포에 의한 사이토카인의 산생을 억제하는 활성을 갖는 물질」 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 된 의약조성물이다. 구체적으로는, 상기에서 정의한 「단백성 물질」 또는 「비단백성 물질」 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 된 의약조성물이다. 더욱 구체적으로는, 상기에 정의한 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드의 일부(단편), 융합 폴리펩티드, 다중클론항체, 단일클론항체 또는 상기 단일클론항체의 일부의 어느 하나와 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 된 의약조성물이다.
여기서 「약학적으로 허용될 수 있는 담체」란, 부형제, 희석제, 증량제, 붕괴제, 안정제, 보존제, 완충제, 유화제, 방향제, 착색제, 감미제, 점조제(粘稠劑), 교미제(矯味劑), 용해보조제 또는 그 밖의 첨가제 등을 들 수 있다. 그와 같은 담체의 하나 이상을 사용함으로써, 정제, 환제, 산제, 과립제, 주사제, 액제, 캡슐제, 트로키제, 엘릭시르제, 현탁제, 유제 또는 시럽제 등의 형태의 의약조성물을 조제할 수 있다.
이들 의약조성물은, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구투여를 위한 그 밖의 형태로서는, 하나 또는 그 이상의 활성물질을 포함하고, 일반적인 방법에 의해 처방되는 외용액제, 장용내 투여를 위한 좌제 및 페싸리(pessary) 등이 포함된다.
투여량은, 환자의 연령, 성별, 체중 및 증상, 치료효과, 투여방법, 처리시간, 또는 상기 의약조성물에 함유되는 활성 성분(상기 폴리펩티드나 항체 등)의 종류 등에 따라 다르지만, 통상 성인 1인당, 1회 마다 10 ㎍~1000 mg(또는 10 ㎍~500 mg)의 범위로 투여할 수 있다. 그러나, 투여량은 여러 가지 조건에 의해 변동되기 때문에, 상기 투여량 보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또한 상기의 범위를 초과하는 투여량이 필요한 경우도 있다.
특히 주사제의 경우에는, 예를 들면 생리식염수 또는 시판의 주사용 증류수등의 비독성 약학적으로 허용될 수 있는 담체중에 0.1 ㎍항체/ml담체∼10 mg항체/ml담체의 농도가 되도록 용해 또는 현탁함으로써 제조할 수 있다. 이렇게 하여 제조된 주사제는, 처치를 필요로 하는 인간환자에 대해, 1회 투여에 있어서 1 kg체중당, 1 ㎍∼100 mg의 비율로, 바람직하게는 50 ㎍∼50 mg의 비율로, 1일당 1회∼수회 투여할 수 있다. 투여형태로서는, 정맥내 주사, 피하 주사, 피내 주사, 근육내 주사 또는 복강내 주사와 같은 의료상 적당한 투여형태를 예시할 수 있다. 바람직하게는 정맥내 주사이다.
또한, 주사제는, 경우에 따라, 비수성(非水性) 희석제(예를 들면 프로필렌글리콜, 프로에틸렌글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 에탄올과 같은 알코올류 등), 현탁제 또는 유탁제로서 조제할 수도 있다.
그와 같은 주사제의 무균화는, 박테리아 보류필터를 통과시키는 여과멸균, 살균제의 배합 또는 조사에 의해 행할 수 있다. 주사제는, 용시조제(用時調制)의 형태로서 제조할 수 있다. 즉, 동결건조법 등에 의해 무균의 고체조성물로 하여, 사용전에 무균의 주사용 증류수 또는 다른 용매에 용해하여 사용할 수 있다.
본 발명의 의약조성물은, T세포 등의 림프구의 활성화 및 활성화 림프구의 기능제어의 이상에 기인하는 여러 가지 자기면역성 질환, 알레르기성 질환 또는 염증성 질환의 치료 및 예방에 유용하다.
상기 질환으로서는 예를 들면, 관절증(예를 들면, 관절류마치스, 변형성 관절증 등), 염증(예를 들면, 뇌염, 기관지염, 혈관염, 폐렴, 간염, 심근염, 췌장염, 장염, 위염, 복막염, 신장염(사구체신장염 등), 관절염(관절류마치스 등), 허혈후재관류장해(심근허혈 재관류장해 등)에 있어서의 염증, 이식후 면역거절에 기인하는 염증, 염증성 장질환, 화상, 다발성 장기장해에 있어서의 염증, PTCA나 PTCR술후에 있어서의 염증 및 동맥경화증에 동반되는 염증 등), 세균이나 바이러스에 의한 감염에 의해 야기되는 여러 가지 증상(예를 들면, 염증), 이식편 대 숙주반응, 조직이나 장기의 이식에 동반되는 면역 거절반응, 외래항원에 의한 면역감작에 의해 야기되는 상기 항원에 대한 항체의 과잉산생을 동반하는 여러 질환, 다발성 경화증, 자기면역성 갑상선염, 여러 가지 피부질환(예를 들면, 알레르기성 접촉성 피부염, 만성 염증성 피부질환인 편평태선, 건선, 강피증), 전신성 에리테마토데스(erythematosus) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 「염증」에는, 급성 염증 및 만성 염증 모두 포함된다.
일반적으로 급성 염증이란, 염증반응이 비교적 급속히 발현되고 진행이 빨라, 그 종료가 명확한 염증이다. 한편, 만성 염증이란, 염증반응이 비교적 천천히 또는 서서히 발현되고, 또는 그 발현의 존재 조차 불명확할 정도로 발현되어, 수주간 내지 수년간에 걸쳐 지속되고, 그 종료도 불명확한 염증이다.
또한, 본 발명에 있어서의 염증에는, 임의의 조직에서 일어나는 염증도 포함된다. 구체적으로는, 뇌, 안, 기관, 혈관, 폐, 간장, 심장, 췌장, 위, 장, 장간막, 신장, 피부, 비염막 또는 관절 등의 조직에 있어서의 염증이 포함된다.
본 발명의 의약조성물의 여러 가지 질환증상의 치료효과에 대해서는, 일반적인 방법에 따라, 기지의 질환 모델 동물에게 투여함으로써 시험, 검토할 수 있다.
실시예
이하, 실시예로 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명이 상기 실시예에 기재되는 태양에만 한정되는 것은 아닌 것은 말할 필요도 없다.
실시예 1실험재료의 준비
이하에 기술하는 시험에서 사용한 실험재료(동물, 항체, 세포)는 특별히 기술이 없는 한 아래와 같이 하여 조제했다.
<1-1> 동물
C57BL/6 마우스(수컷, 5~8주 연령) 및 BALB/c 마우스(수컷, 5~8주 연령)는, 일본 SLC(주)로부터 구입했다. Wistar 쥐(수컷, 5~6주 연령)는, 일본 찰스리버(주)로부터 구입했다.
<1-2> 항 쥐 AILIM 단일클론항체의 조제
이전 본 발명자가 작성하여 보고한 마우스 항 쥐 AILIM 단일클론항체(마우스 항 쥐 JTT-1항원 단일클론항체)를 산생하는 「JTT-1」 및 「JTT-2」라고 각각 명명한 하이브리도마(2개의 하이브리도마는 1996년 10월 11일부로 부다페스트조약하에서 인정된 국제기탁기관인 일본국 통산성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(우편번호 305-8566 일본국 이바라기켄 쯔쿠바시 히가시 1-1-3)에 국제기탁되어 있다. <JTT-1> 국제기탁번호 FERM BP-5707 및 <JTT-2> 국제기탁번호 FERM BP-5708)를 인 비트로 또는 인 비보에서 배양하여 얻어지는 배양상청 또는 복수로부터 정제한 단일클론항체를 이하의 시험에서 사용했다(일본국 특허출원 공개 11-29599호 공보(실시예 1 및 2) 및 국제 특허출원 공개 WO98/38216호(실시예 1 및 2)).
이하, 이들의 마우스 항 쥐 AILIM 단일클론항체를, 각각 「JTT-1항체」 및「JTT-2항체」(IgG1)라고 부른다. 또한, 「JTT-1항체」 및 「JTT-2항체」는, 각각 「JMab49」 및 「JMab50」이라고도 별칭한다.
또한, 이하의 시험에서 사용되는 항 쥐 AILIM 항체는 특별히 기술하지 않는 한 「JTT-2항체」(JMab50으로 별칭; IgG1)이다.
<1-3> 항 인간 AILIM 단일클론항체의 조제
이전 본 발명자가 작성하여 보고한 마우스 항 인간 AILIM 단일클론항체(마우스 항 인간 JTT-1항원 단일클론항체)를 산생하는 각각 「SA12」 및 「SG430」이라고 명명한 하이브리도마(각각 106~107개/0.5 ml/마우스)를, ICR nu/nu 마우스(암컷, 7~8주 연령)의 복강내에 주사했다. 10~20일 후, 마우스를 마취하에서 개복하여, 일반적인 방법에 따라 채취한 복수로부터 각각의 마우스 항 인간 AILIM 단일클론항체를 대량 조제했다(일본국 특허출원 공개 11-29599호 공보(실시예 12) 및 국제 특허출원 공개 WO98/38216호(실시예 12)).
이하, 이들 2종류의 마우스 항 인간 AILIM 단일클론항체의 각각을 「SA12항체」(IgG1) 및 「SG430항체」(IgG1)라고 부르고, 이하의 시험에서 사용했다.
<1-4> 항 마우스 AILIM 단일클론항체의 조제
이하와 같이 하여 조제했다.
이전 본 발명자들이 클로닝한 마우스 AILIM(마우스 JTT-1항원)(일본국 특허출원 공개 11-29599호 공보(서열번호 5) 및 국제 특허출원 공개 WO98/38216호(서열번호 5))의 전장 아미노산서열을 코드화 하는 cDNA를 사용하고, 유전자 재조합기술을 사용하여 일반적인 방법에 따라 마우스 AILIM을 발현하는 형질전환세포를 조제했다.
상기 형질전환세포를 호모게나이즈하여, 초원심분리(100,000×g)하고, 세포막 획분을 포함하는 원심잔사를 회수하여, PBS에 현탁시켰다. 얻어진 세포막 획분을, 완전 프로인드 아쥬반트와 함께 Wistar 쥐의 풋패드내에 주사함으로써 첫회 면역(0일)했다. 상기 세포막 획분항원을 7일째, 14일째 및 28일째 간격으로 풋패드내에 더 투여했다. 최후 면역으로부터 2일후에 림프절세포를 채취했다.
상기 림프절세포와 마우스 미엘로마세포 PAI(JCR No.B0113; Res. Disclosure, Vol.217, p.155, 1982)를 5:1로 혼합하여, 융합제로서 폴리에틸렌글리콜 4000(Boehringer Mannheim 제)을 사용하여 세포융합시킴으로써 단일클론항체산생 하이브리도마를 제작했다. 하이브리도마의 선택은, 10% 소태아혈청과 아미노프테린을 함유하는 HAT 함유 ASF104배지(아지노모토제)중에서 배양함으로써 행했다.
각각의 하이브리도마의 배양상청중에 생성된 단일클론항체의 마우스 AILIM(마우스 JTT-1항원)에 대한 반응성을, 각각의 배양상청을, 상기 재조합 마우스 AILIM 발현 형질전환세포에 반응시킨 후, FITC 표지 항 쥐 IgG(Cappel제)와 반응시킴으로써 염색된 세포의 형광강도를 EPICS-ELITE 플로 사이토미터로 측정함으로써 확인했다. 이 결과, 마우스 AILIM(마우스 JTT-1항원)에 반응성을 갖는 단일클론항체를 산생하는 복수의 하이브리도마를 얻었다.
그들의 하이브리도마중 2개를 각각 「B10.5」 및 「B9B6」이라고 명명했다.이들 하이브리도마의 각각(각각 106~107개/0.5 ml/마우스)을, ICR nu/nu 마우스(암컷, 7~8주 연령)의 복강내에 주사했다. 10~20일후, 마우스를 마취하에서 개복하여, 일반적인 방법에 따라 채취한 복수로부터 각각의 쥐 항 마우스 AILIM 단일클론항체를 대량 조제했다. 이하, 이들 하이브리도마 「B10.5」 및 「B9B6」의 각각이 산생하는 쥐 항 마우스 AILIM 단일클론항체를 「B10.5항체」(IgG2a) 및 「B9B6항체」(IgG2a)라고 부르고, 이하의 시험에서 사용했다.
<1-5> 림프구의 조제
마우스를 단두 치사시킨 후, 일반적인 방법에 따라 흉선 및 말초 림프조직(비장, 림프절)을 각각 채취하여, 스테인레스제 메쉬상에서 잘게 잘랐다. 얻어진 잘게 잘려진 조직을 10% FCS(소태아혈청)를 함유하는 RPMI1640 배지에 현탁시켜 세포현탁액을 조제했다. 세포현탁액(각각 1×107~3×107/ml)을 샬레에 파종하여 CO2인큐베이터내에서 2시간 배양했다. 배양후, 샬레로부터 조심스럽게 비점착성 세포를 회수하여, RPMI1640 배지에서 세정하여 각종 조직구성세포를 취득했다.
쥐의 흉선 및 말초 림프조직(비장, 림프절)의 각종 조직구성세포도, 상기와 동일하게 하여 취득했다.
인간(정상인 및 환자)의 말초혈 T세포는, 일반적인 방법에 따라, 정상인 및 환자의 각각으로부터 채취한 헤파린 채혈액을 림포프레프(Nycomed제)로 분리하여 말초혈단핵구를 취득한 후, Pan T cell 격리 키트(isolation kit)(밀테니제)를 사용하여 회수했다.
<1-6> 주화 T세포의 조제
본 발명자들이 수립한 각종 마우스 T세포주(D10, MS202, CD28KO, EL-4, 2L2, BC3C13) 및 마우스 T세포 유래 하이브리도마 BW5147에 유래하는 여러 가지 마우스 T세포 유래 하이브리도마(KV24, DO.11.10, 8-4-31, 3H10-11, 61-21-25, 1-2-66, 6-13-64)를 이하의 시험에 있어서 사용했다.
실시예 2각종 조직 구성세포 및 각종 세포주에서의 AILIM의 발현 해석
동물(마우스, 쥐 또는 인간)의 정상조직 및 병변조직으로부터 얻어지는 세포에서의 AILIM의 발현상태의 차위, 미자극 T세포 및 자극한 T세포(활성화 T세포)에서의 AILIM의 발현상태의 차위 및 각종 T세포주에서의 AILIM 발현상태의 차위를 일반적인 방법에 따라 세포염색 및 플로 사이토메트리(flow cytometry)에 의해 해석했다.
하기 시험에서 얻어진 결과를 토대로, AILIM의 조직 및 세포에서의 발현패턴을, CD28의 발현패턴과 비교하면서, 모식적으로 나타냈다(도23). 단, 해당 모식도는, 단순한 예시로서 하기 시험에서 얻어진 데이터를 한정적으로 해석하기 위해 사용되는 것은 아니라는 것은 말할 필요도 없다.
<2-1> 세포염색 및 플로 사이토메트리(flow cytometry)
세포염색 및 플로 사이토미터(flow cytometer)에 의한 해석은 특별히 기술하지 않는 한 아래와 동일하게 하여 행했다.
상기한 바와 같이 취득한 각종 조직 구성세포, 자극물질(항 CD3 항체, ConA, 또는 PMA와 이온운반체 등)으로 자극 또는 미자극의 T세포, 또는 각종 T세포주를,0.5% 소혈청알부민(BSA) 및 5 mM의 EDTA를 함유하는 인산 완충액(Ca2+및 Mg2+를 포함하지 않는다. PBS-)에 재분산시킨 후, 하기(A) 또는 (B)의 1차항체를 가하여, 4℃에서 30분간 반응시켰다.
(A) 상기의 각종 AILIM 항체(항 마우스 AILIM 항체, 항 쥐 AILIM 항체, 항 인간 AILIM 항체)를 FITC 또는 PE(피코에리트린)로 표지한 표지항체.
(B) 미표지의 상기 각종 AILIM 항체(항 마우스 AILIM 항체, 항 쥐 AILIM 항체, 항 인간 AILIM 항체).
이어서, 세포를 상기 인산 완충액으로 3회 세정한 후, 동완충액에 재분산시켰다.
또한, 1차항체로서 미표지의 항 AILIM 항체(상기(B))를 사용한 경우에는, FITC, PE 또는 바이오틴(Biotin)으로 표지한 항 마우스 Ig 항체 또는 항 쥐 Ig 항체를 2차항체로서 세포분산액에 더 가하고, 상기와 동일하게 하여 반응시켰다.
또한, 2차항체로서 바이오틴 표지항체를 사용한 경우에는, PE 표지한 스트렙트아비딘(Streptavidine; pharmingen제)을 세포분산액에 가하여 동일하게 하여 반응시킨 후, 상기 인산 완충액에 재분산시켰다.
상기 염색에 의해 염색된 세포의 크기 및 형광강도를 FACSort(Becton Dekinson제)를 사용해 측정하여, AILIM의 발현분포를 LysisII 해석 소프트웨어를 사용하여 해석했다.
<2-2> 마우스 흉선조직 유래 T세포에 있어서의 AILIM의 발현의 해석
상기 <2-1>의 방법에 의해 마우스의 정상 림프조직인 흉선으로부터 단리한 T세포에 있어서의 AILIM의 발현을 해석했다. 또한 동시에 AILIM 발현양식의, 다른 분자(T세포로의 1차 시그날전달을 담당하는 CD3 분자, 부자극 시그날전달을 담당하는 CD28 분자, T세포 표면 마커인 CD4 및 CD8) 발현과의 상관성에 대해서도 동일하게 하여 해석했다.
결과를, 도1 및 도2에 나타낸다. 이 결과 아래의 새로운 사실이 얻어졌다.
먼저, CD3 분자와 AILIM 분자와의 발현 상관성에 대해서는, AILIM의 발현은 CD3의 발현이 높은 세포에서 마찬가지로 높은 발현이 인정되어, 양 분자의 발현이 상관하고 있었다(도1(a)). 한편, 전자와는 대조적으로, 코스티뮬레이토리 분자인 CD28의 발현은 CD3의 발현이 높을 수록 그 발현이 저하되고 있었다(도1(b)). 이들 결과로부터, 적어도 정상 흉선 T세포에 있어서는, AILIM 및 CD28의 발현양식은, CD3의 발현과의 상관성면에서 비교한 경우, 서로 상반되는 것이었다.
흉선 T세포의 분화 및 성숙단계는, 대체로 다음과 같은 단계를 거친다.
(1) CD4음성 CD8음성 세포(도2의 R2)로부터 양 분자의 발현이 조금 인정되는 CD4약양성 CD8약양성 세포(도2의 R3)로 이행.
(2) CD4약양성 CD8약양성 세포(도2의 R3)로부터 양 분자를 완전히 발현하는 CD4양성 CD8양성 세포(도2의 R4)로 분화.
(3) 포지티브 셀렉션(positive selection)에 의해 CD4 또는 CD8 어느 한쪽 분자의 발현이 감약되어(도2의 R5 또는 R7), 최종적인 CD4양성 CD8음성(도2의 R6) 또는 CD4음성 CD8양성(도2의 R8)으로의 분화 및 성숙의 완료.
CD4음성 CD8음성 세포에 있어서는, AILIM 및 CD28 모두 발현이 보이지 않고, CD4약양성 CD8약양성 세포로 되어 모두 약간의 발현이 보였다. CD28의 발현은, CD4양성 CD8양성 세포에서 최대가 되고, 그 후의 분화, 성숙에 동반되어 발현이 저하되었다.
한편, AILIM의 발현은, CD4양성 CD8양성 세포에 있어서도 조금 밖에 인정되지 않지만, 그 후의 세포의 분화, 즉, CD4 또는 CD8의 발현량의 저하에 동반하여 증가하여, 림프구의 포지티브 셀렉션이 달성되는 SP세포(CD4양성 CD8음성 세포 또는 CD4음성 CD8양성 세포)로 최종분화된 시점에서 최대의 발현이 인정되었다.
이 결과, AILIM의 발현양식은, CD3 뿐 아니라 CD4 및 CD8 발현과의 상관성면에 있어서도, CD28과 다른 것이 명백해졌다.
<2-3> 마우스 정상 림프조직 유래 T세포에 있어서의 AILIM의 발현의 해석
상기 방법에 의해, 마우스의 정상 림프조직인 비장 및 림프절 각각의 T세포에 있어서의 AILIM의 발현을 해석했다.
결과를 도3에 나타낸다.
비장조직 유래 T세포에 있어서의 AILIM 양성 T세포는, 흉선에서의 그것과 비교하고 소수이고, 그 비율은 약 1~3%였다. 또한, AILIM 양성 세포의 대부분은, CD4양성 CD8음성 세포였다.
림프절 유래 T세포에 있어서의 AILIM의 발현은, 발현양식 및 발현세포의 비율 모두, 상기 비장 유래 T세포에서의 그것과 동일했다.
<2-4> 마우스 간염모델 동물의 병변조직 유래 T세포에서의 AILIM 발현의 해석
간염모델 마우스를 아래와 같이 제작했다.
C57BL/6 마우스에 P.acnes(Propionibacterium acnes; 5 mg/ml)를 포함하는 인산 완충액(PBS-;0.2 ml)용액을 꼬리에 정맥 주사했다. 1주일후, 상기 마우스에 LPS(Lipopolysaccaride; 1.5 ㎍/ml)를 포함하는 인산 완충액(PBS-;0.2 ml)을 정맥 주사함으로써 간염을 유도했다. 이 마우스를 간염모델 동물로서 사용했다.
LPS 투여로부터 6.5시간 후, 간장을 채취하여, 상기 방법에 의해 T세포를 취득하여, AILIM의 발현을 해석했다.
결과를 도4에 나타낸다.
해당 간염모델 마우스의 간장조직 유래 T세포(단핵세포)에 있어서의 AILIM의 발현은 지극히 높은 것으로, T세포의 대부분에 있어서 현저한 발현이 인정되었다. 간염모델 간장 유래 T세포에서의 AILIM의 발현 정도는, 정상 마우스 비장 유래 T세포(CD4양성 세포) 및 림프절 유래 T세포에서의 그것에 비해 현저히 높은 것이었다. <2-5> 정상인의 말초혈 유래 T세포에 있어서의 AILIM 발현의 해석
정상인 말초혈 유래 T세포에 있어서의 AILIM의 발현 및 정상인 말초혈로부터 분리한 인간 단핵구세포에서의 AILIM 발현의 레벨 및 각종 세포 표면 마커의 발현을 플로 사이토미터에 의해 해석했다. 정상인의 말초혈 T세포는, 상기 방법에 의해 취득했다.
한편, AILIM을 발현하고 있는 T세포(AILIM 양성 세포)는, 다음과 같이 취득했다. 정상인 말초혈로부터 분리한 단핵구의 분획을, 0.5% BSA 및 5 mM의 EDTA를 포함하는 PBS-로 분산한 후, 항 AILIM 항체(SG430; 50 ㎍)를 가하여 4℃에서 30분간 반응시켰다. 이어서, 동 완충액으로 3회 세정후, 염소 항 마우스 IgG를 고정화 한 마이크로비드(100~500 ㎕; 밀테니제)를 가하여 동일한 반응을 행하고, 동 완충액으로 세정했다. 이어서, 세포를, 일반적인 방법에 따라 자기분리 컬럼조작(2회)하여, AILIM 양성 세포를 회수했다. 회수한 AILIM 양성 세포를, 각종 표지항체 또는 항 AILIM 항체에 의해 염색하고, 플로 사이토미터에 의해 해석했다.
결과를, 도24에 나타낸다.
말초혈 T세포는, 주로 CD4양성 CD8음성 세포와 CD4음성 CD8양성 세포로 나뉜다. FITC 표지 항 AILIM 항체(SA12)와 항 CD4항체와의 공염색에서는, 주로 CD4양성 세포에서 AILIM의 발현이 인정되었다. 항 CD28 항체와의 2중염색에 의해, 말초혈 AILIM 양성 세포의 거의 전부가 CD28을 발현하고 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 말초혈 T세포에 있어서의 AILIM 양성 세포의 비율은, 대략 0.5~5% 정도였다.
한편, 인간 말초혈 단핵구분획으로부터 직접 분리한 AILIM 양성 세포에 있어서의 표면 마커의 해석 결과로부터, 아래와 같은 사실이 판명되었다.
(1) AILIM 양성 세포의 대부분이, CD4양성 CD8음성 세포였다.
(2) AILIM 양성 세포중에는, CD4음성 CD8양성 세포 및 CD4음성 CD8음성 세포가 조금 인정되었다.
(3) 항 CD28 항체와의 공염색에 의해, AILIM 양성 세포의 대부분이 CD28을 발현하고 있어, AILIM 양성 세포의 대부분이 T세포로 분류되었다.
(4) AILIM 양성 세포중에는, B세포 표면 마커인 CD19에 대한 항체로 염색되는 세포가 인정된 것으로부터, B세포에도 AILIM이 조금 발현하고 있는 것이 나타내어졌다.
(5) AILIM 양성 세포의 대부분에 있어서, 코스티뮬레이토리 분자인 CTLA4의 발현이 인정되었다.
더욱이, 말초혈 T세포 및 AILIM 양성 세포의 각각에서의 AILIM의 발현레벨에 대해서도 같이 검토했다.
결과를 도25에 나타낸다.
AILIM 양성 세포에서의 AILIM의 발현을, 말초혈 T세포에서의 그것과 비교하면 피크 시프트(peak shift)가 인정되는 것으로부터, AILIM 양성 세포에서는 AILIM에 발현레벨이 높은 것이 확인되었다.
또한, 동일한 비교를 CD4양성 세포 및 CD8양성 세포의 각각에 대해서 행한 결과, 어느 분획에 있어서도, 동일한 정도의 AILIM의 발현이 인정되었다. CD8양성 세포는, AILIM 양성 세포중에서의 비율은 적지만, 동일한 AILIM의 발현이 인정되었다.
<2-6> 각종 관절염 또는 자기면역질환에 이환하고 있는 환자의 T세포에 있어서의 AILIM의 발현해석
상기 방법과 동일하게 하여, 관절염(만성 관절류마치스(rheumatoid arthritis; RA) 및 변형성 관절염(osteoarthritis; OA) 및 자기면역질환(진행성 전신성 경화증(progressive systemic sclerosis; PSS) 및 전신성 에리테마토데스 systemic lupus erythematosus; SLE)에 이환하고 있는 환자의 T세포에 있어서의 AILIM의 발현 및 AILIM을 발현하고 있는 세포의 비율을 분석했다.
관절염환자에 대해서는, 관절강액 및 말초혈의 각각으로부터 분리한 T세포를 사용했다. 한편, 자기면역질환 환자로부터는 말초혈로부터 분리한 T세포를 사용했다. 또한, 대조로서, 정상인 말초혈의 T세포를 사용했다.
결과를 도5 및 도26에 나타냈다.
RA 환자의 말초혈 유래 T세포에 있어서의 AILIM의 발현은, CD4양성 T세포 및 CD4음성 T세포(즉 CD4음성 CD8양성 T세포)의 어느 것에 있어서도, 정상인의 말초혈 유래 T세포에 있어서의 AILIM의 발현과 비교하여 유의한 차이는 인정되지 않았다.
그러나, RA 환자의 관절강액 유래 T세포에 있어서는, CD4양성 T세포 및 CD4음성 T세포의 어느 것에 있어서도 AILIM이 발현하고 있는 세포의 비율이 유의하게 상승하고 있었다. 특히, CD4양성 T세포집단에 있어서는, AILIM 발현의 평균값이 약 20%까지 상승하고 있었다. 또한, RA 환자의 관절강액 유래의 CD4양성 T세포 및 CD4음성 T세포의 각각에 있어서의 AILIM의 발현레벨은, 정상인의 말초혈 유래의 CD4양성 T세포 및 CD4음성 T세포의 각각과 비교하여 유의한 상승이 인정되었다. RA 환자의 CD4양성 T세포에 있어서는, CD28의 발현레벨의 변화는 인정되지 않았다.
한편, OA 환자에 대해서는, 일례이기는 하지만, 관절강액 유래 CD4양성 세포에 있어서 AILIM 양성 세포의 비율이 현저히 상승하고 있었다.
자기면역질환 환자의 말초혈 유래 T세포에 대해서는, CD4음성 T세포에 있어서의 AILIM 양성 세포의 비율은 정상인의 그것에 비해 차이가 인정되지 않지만, PSS 환자 유래 CD4양성 T세포에 있어서는 정상인에 비해 AILIM 양성 세포의 비율이 유의하게 상승하고 있었다.
<2-7> 아쥬반트 유발성 관절염 쥐모델에 있어서의 AILIM의 발현 해석
유동 파라핀(와코준야쿠제)으로 10 mg/ml의 농도로 조제한 결핵사균(M.Tuberculosis H37Ra; Difco)을 아쥬반트로서, 1 mg/0.1 ml/마리의 농도로 Wistar 쥐(수컷, 5주 연령, 찰스리버제)의 미근부(尾根部)에 피내 투여하여 관절염을 유발시켰다. 프레시즈모미터를 사용하여 양 뒷쪽 지족(肢足)의 용적을 계측하여 해당 용적을 지표로서 관절염의 발증을 확인했다.
아쥬반트의 투여일(0일)로부터 경시적으로 흉선, 비장, 림프절 및 말초혈을 채취하여, 상기 방법에 따라 T세포 분산액을 조제했다. T세포를, 상기 방법에 의해 항 CD4 항체, 항 CD8 항체 및 항 AILIM 항체의 각각으로 염색하여, CD4, CD8 및 AILIM 각각의 발현을 플로 사이토미터를 사용하여 해석했다.
또한, 대조에는, 정상 쥐의 흉선, 비장, 림프절 및 말초혈 유래의 T세포를 사용했다.
결과를 도27에 나타낸다.
흉선, 비장 및 말초혈의 각각에 유래하는 T세포에 대해서는, CD4양성 T세포 및 CD8양성 T세포의 어느 것에 있어서도, 대조와 비교하여 AILIM 발현의 유의한 차위를 인정받을 수 없었다.
한편, 림프절 유래 T세포에 대해서는, CD4양성 T세포 및 CD8양성 T세포의 어느 것에 있어서도, 대조와 비교하여 AILIM 양성 세포의 비율이 유의하게 상승하고 있었다. 특히, CD4양성 T세포에 있어서는, 아쥬반트 투여로부터 5일째에는, AILIM 발현의 피크가 인정되었다.
<2-8> 마우스 T세포의 활성화에 동반되는 AILIM 발현의 변화 해석
마우스의 림프조직으로부터 채취한 T세포를 각종 조건하에서 활성화하여, T세포의 활성화에 동반되는 AILIM의 발현변화를 해석했다.
T세포의 활성화는, 10% FCS 함유 RPMI1640 배지에 분산한 T세포에, 항 CD3 항체(최종농도: 1~10 ㎍/ml), 콘카나발린 A(Concanavalin A; ConA; 최종농도: 1~5 ㎍/ml), 또는 PMA(phorbol myristate acetate; 최종농도: 20 ng/ml)와 Ca 이온운반체(최종농도: 200 ng/ml)를 가하여 자극함으로써 행했다. 상기 활성화제의 첨가로부터 경시적(0, 6, 12, 24 및 48시간)으로 AILIM의 발현을 해석했다.
결과를 도6에 나타낸다.
어느 활성화의 조건에 있어서도, 자극후 약 3~6시간 후에 AILIM 발현의 상승이 인정되고, 자극으로부터 12시간의 시점에서 최대의 AILIM 발현이 인정되었다. AILIM의 발현은, 자극으로부터 약 24시간 이후에 있어서도 AILIM의 높은 발현이 인정되고, 자극후 48시간의 시점에서도 동일한 정도의 발현레벨이 지속되고 있었다.
<2-9> 인간 T세포의 활성화에 동반되는 AILIM 발현유도의 해석
상기와 동일하게 하여 취득한 정상인의 말초혈 유래 T세포를, 하기(A) 및 (B)의 방법에 의해 활성화함으로써 T세포의 활성화에 동반되는 AILIM 및 코시티뮬레이토리 분자인 CTLA-4의 각각의 발현을 해석했다.
(A) PMA와 Ca 이온운반체에 의한 T세포의 활성화
10% FCS 함유 RPMI1640 배지에 분산한 상기 인간 T세포(1×105개)에, 활성화제로서 PMA(최종농도: 20 ng/ml) 및 Ca 이온운반체(최종농도: 200 ng/ml)를 가하여 자극했다. 활성화제 첨가로부터 8시간 후에, AILIM 및 CTLA-4 각각의 발현을 플로 사이토미터에 의해 해석했다.
(B) 항 CD3 항체/항 AILIM 항체 또는 항 CD3 항체/항 CD28 항체에 의한 활성화 96웰 마이크로플레이트의 각 웰에, D-PBS로 희석한 (1) 항 CD3 항체(클론 OKT3; 200 ng/웰) 및 항 AILIM 항체(클론 SA12; 1 ㎍/웰) 또는 (2) 항 CD3 항체(클론 OKT3; 200 ng/웰) 및 항 CD28 항체(클론 CD28.2; 1 ㎍/웰)를 가하여, 실온에서 3시간 반응시킴으로써, 상기 플레이트를 각각의 항체로 코팅했다.
각 플레이트에, 10 % FCS 함유 RPMI1640 배지에 분산한 인간 말초혈 유래 T세포(1×105개/ml, 0.1 ml/웰)를 가하여, 2~3일간 배양했다. 세포를 회수하여, 상기와 동일하게 하여 AILIM 및 CTLA-4의 발현을 플로 사이토미터를 사용하여 해석했다.
결과를 도28에 나타낸다.
PMA와 이온운반체에 의한 T세포의 활성화에 있어서는, 자극후 8시간 후에 현저히 높은 AILIM의 발현이 유도되었다. 또한, 그 발현레벨은, 동일하게 유도되는 CTLA-4의 발현레벨에 비해 지극히 높은 것이었다. 더욱이, 거의 모든 T세포에 있어서 AILIM의 발현이 유도되었다. 더욱이, CD4와 AILIM, 또는 CD8과 AILIM의 2중염색시험의 결과로부터, 이 활성화에 의해, CD4양성 T세포 및 CD8양성 T세포의 어느 것에 있어서도 AILIM의 유의한 발현이 유도되는 것을 알 수 있었다.
한편, 마이크로 플레이트에 코팅한 항 CD3 항체/항 AILIM 항체, 또는 항 CD3 항체/항 CD28 항체에 의한 활성화의 시험에 있어서는, 아래의 결과가 얻어졌다.
(1) 항 CD3 항체/항 AILIM 항체에 의해 활성화된 T세포 및 항 CD3 항체/항 CD28 항체에 의해 활성화된 T세포의 어느 것에 있어서도 현저한 AILIM의 발현유도가 인정되었다. 그 발현유도의 정도는, 항 CD3 항체/항 AILIM 항체에 의해 활성화된 T세포에서의 발현유도의 정도 보다도, 항 CD3 항체/항 CD28 항체에 의해 활성화된 T세포에 있어서의 발현의 정도가 높은 것이었다.
(2) 항 CD3 항체/항 AILIM 항체에 의해 활성화된 T세포 및 항 CD3 항체/항 CD28 항체에 의해 활성화된 T세포의 어느 것에 있어서도 CTLA-4의 발현유도가 인정되었다. 그러나, 항 CD3 항체/항 AILIM 항체에 의해 활성화된 T세포에서의 발현유도의 정도와, 항 CD3 항체/항 CD28 항체에 의해 활성화된 T세포에 있어서의 발현의 정도에 유의한 차이는 인정되지 않았다.
<2-10> 각종 T세포주에서의 AILIM 발현의 해석
T세포주는, 주로 자연발생적으로 불사화되던가, 또는 과학적으로 처리하여 불사화된 T세포주, 또는 T세포를 미엘로마세포와 세포융합하여 불사화된 T세포 하이브리도마가 알려져 있다. 또한, T세포주는, 상기 세포의 사이토카인산생의 특성에 따라 Th1형 T세포주 및 Th2형 T세포주로 분류된다.
상기 <1-6>에 기재한 각종 기지의 마우스 T세포주에 있어서의 AILIM 및 CD28의 발현을 상기와 동일하게 하여 플로 사이토미터를 사용하여 해석했다.
결과를 도7에 나타낸다.
AILIM은, Th2형 T세포주의 사이토카인산생의 성상을 갖는 주화 T세포(D10, MS202, CD28KO, EL-4 등)에서 구성적인(constitutive) 발현이 인정되었다. 또한, 그들 세포주에서의 AILIM의 발현은, CD28의 발현과 동등 또는 그 이상으로 높은 발현이었다.
한편, Th1형 T세포주에서는, 6-13-64를 제외하고 CD28의 발현은 높지만, AILIM의 발현은 인정되지 않았다.
실시예 3항 AILIM 항체에 의한 T세포반응의 제어능 유무의 검토
본 발명의 일부를 구성하는 항 AILIM 항체가, T세포반응(IFN-γ나 IL-4 등의 사이토카인의 산생 및 세포증식 등)을 제어(촉진 및/또는 억제)하는 능력을 갖는지의 여부, 즉 AILIM을 매개로 한 코스티뮬레이토리 시그날(co-stimulatory signal)의 세포내로의 전달의 제어능을 갖는지의 여부를, 상기 세포로부터의 사이토카인(IFN-γ 및 IL-4)의 산생량 및 상기 세포의 증식정도를 지표로 해석했다.
<3-1> 시험방법
시험의 목적에 따라, 상술에서 준비한 1 또는 2종류의 항체(항 CD3 항체만, 항 CD28 항체만, 항 CD3 항체와 항 AILIM 항체, 또는 항 CD3 항체와 항 CD28 항체)를 96웰 마이크로 플레이트에 가하고, 37℃에서 1시간 이상 반응시켜, 상기 플레이트를 1 또는 2의 상기 항체로 코팅했다. 플레이트를 PBS로 충분히 세정한 후, 상기에서 조제한 흉선세포(5×105개/웰), 비장세포(2×105개/웰) 또는 정제T세포(1×105~3×105개/웰)를 파종했다.
항 AILIM 항체 또는 항 CD28 항체 플레이트로 코팅하는 대신에, 어느 하나를 나중에 첨가하는 시험에 있어서는, 상기 항 AILIM 항체 또는 항 CD28 항체는, 플레이트로의 세포의 파종후에 첨가했다. 또한, 이 시험에 있어서는, 대조로서 항 AILIM 항체 대신에, CTLA4-Ig(CTLA4의 가용성 영역과 IgFc와의 융합단백)를 사용하여 동일하게 하여 시험했다.
플레이트를 CO2인큐베이터속에서 2~4일간 배양하여, 배양상청중의 사이토카인(IFN-γ 또는 IL-4)의 농도를 일반적인 방법에 따라 ELISA로 측정했다. 또한, 배양후 세포증식의 정도를, 일반적인 방법에 따라 3중수소(tritium) 표지 티미딘(3H-TdR) 함입 시험에 의해 평가했다.
<3-2> 항 CD3 항체와 항 AILIM 항체에서의 T세포내로의 코스티물레이토리 시그날전달에 의한 사이토카인산생 유도의 해석
T세포는, T세포수용체를 매개로 하는 1차시그날 및 CD28이나 CTLA-4 등의 코스티뮬레이토리 분자를 매개로 하는 부시그날을 받음으로써 특징적인 사이토카인을 산생하는 것이 알려져 있다.
상기 <3-1>의 시험방법에 따라, 마우스, 쥐 및 인간의 각각으로부터 취득한 말초혈 T세포, 흉선세포 또는 비장세포를 사용하여, 여러 가지 항체자극에 의한 여러 가지 사이토카인산생의 유도를 해석했다.
<3-2-1> 마우스 비장 유래 T세포로부터의 IFNγ의 유도
(1) 항 CD3 항체(클론 145-2C11; Pharmingen제; 0~3 ㎍/ml) 및 항 CD28 항체(클론 CD28.2; 1 ㎍/well)를 코팅한 마이크로 플레이트, (2) 항 CD3 항체 및 항 마우스 AILIM 항체(클론 B10.5; 1 ㎍/well)로 코팅한 마이크로 플레이트 및 (3) 항 CD3 항체만으로 코팅한 마이크로 플레이트의 각각에, 마우스 비장 유래 T세포를 가해 배양하여, 배양상청중의 IFNγ의 양을 ELISA에 의해 측정했다.
결과를 도8에 나타낸다.
항 CD3 항체만의 자극으로는 IFNγ의 산생은 유도되지 않지만, 항 CD3 항체/항 AILIM 항체에 의한 자극 및 항 CD3 항체/항 CD28 항체에 의한 자극의 어느 것에 있어서도 IFNγ의 유의한 산생유도가 인정되었다. 또한, 그 산생유도는, 항 CD3 항체의 농도에 의존하여 증대했다.
<3-2-2> 쥐 비장 유래 T세포로부터의 IFNγ의 산생유도
(1) 항 CD3 항체(클론 G4.18; 50 ng/well) 및 항 CD28 항체(클론 JJ316; 1 ㎍/well)를 코팅한 마이크로 플레이트, (2) 항 CD3 항체 및 항 쥐 AILIM 항체(클론 JTT1; 1 ㎍/well)로 코팅한 마이크로 플레이트 및 (3) 항 CD3 항체만으로 코팅한 마이크로 플레이트, (4) 항 AILIM 항체만으로 코팅한 마이크로 플레이트 및 (5) 항 CD28 항체만으로 코팅한 마이크로 플레이트의 각각에, 쥐 비장 유래 T세포를 가해 배양하여, 배양상청중의 IFNγ의 양을 ELISA에 의해 측정했다.
결과를 도9에 나타낸다.
항 CD3 항체만, 항 AILIM 항체만 및 항 CD28 항체만의 자극으로는, 어는 경우도 IFNγ의 유의한 산생은 인정되지 않지만, 항 CD3 항체/항 AILIM 항체에 의한자극 및 항 CD3 항체/항 CD28 항체에 의한 자극 어느 것에 있어서도 IFNγ의 유의한 산생유도가 인정되었다. 또한, 그 산생유도는, 경시적으로 증대했다.
<3-2-3> 인간 말초혈 유래 T세포로부터의 IFNγ의 산생유도
(1) 항 CD3 항체(클론 OKT3; 일정 농도) 및 항 AILIM 항체(클론 SA12; 각종 농도)를 코팅한 마이크로 플레이트 및 (2) 항 CD3 항체만으로 코팅한 마이크로 플레이트 각각에, 인간 말초혈 유래 T세포를 가해 배양하여, 배양상청중의 IFNγ의 양을 ELISA에 의해 측정했다. 또한, (2)의 시험에 있어서는, 항 AILIM 항체를 용액으로서 세포첨가 후에 가했다.
결과를 도10에 나타낸다.
일정 농도의 항 CD3 항체만을 코팅한 마이크로 플레이트에 T세포를 가하여, 항 AILIM 항체를 용액으로서 세포 첨가후에 가한 시험에 있어서는, 항 AILIM 항체의 농도를 20 ㎍/ml까지 증가시키더라도 세포로부터의 IFNγ의 산생유도는 인정되지 않았다.
한편, 항 CD3 항체와 항 AILIM 항체를 함께 코팅한 마이크로 플레이트에서 배양한 인간 T세포로부터는, 항 AILIM 항체의 농도가 5 ㎍/ml 이상인 경우에, 현저한 IFNγ의 산생유도가 인정되었다.
또한, ConA 또는 PMA로 자극한 말초혈 유래 T세포를, 상기와 동일하게 하여 항 AILIM 항체 및 항 CD3 항체 양쪽을 코팅한 플레이트중에서 배양하자, 해당 T세포로부터의 사이토카인의 산생 및 세포증식이 촉진되었다. 또한, 이 결과는, ConA 또는 PMA로 자극한 말초혈 유래 T세포를, 항 CD28 항체 및 항 CD3 항체 양쪽을 코팅한 플레이트중에서 배양한 경우의 결과와 동등했다.
<3-2-4> 인간 말초혈 유래 T세포로부터의 TNFα, IFNγ, IL-2, IL-4 및 IL-10의 산생유도
(1) 항 CD3 항체(클론 OKT3; 200 ng/well)만을 코팅한 마이크로 플레이트, (2) 항 CD28 항체(클론 CD28.2; 1 ㎍/well)만을 코팅한 마이크로 플레이트, (3) 항 인간 AILIM 항체(클론 SA12; 1 ㎍/well)로 코팅한 마이크로 플레이트, (4) 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체로 코팅한 마이크로 플레이트, (5) 항 CD3 항체 및 항 AILIM 항체로 코팅한 마이크로 플레이트 및 (6) 항 CD3 항체, 항 AILIM 항체 및 항 CD28 항체로 코팅한 마이크로 플레이트의 각각에, 다른 2명의 정상인 도너의 말초혈로부터 취득한 T세포 각각을 가해 배양하여, 경시적(18, 40 및 64시간)으로 배양상청중의 TNFα(tumor necrosis factor-α), IFNγ(interferon-γ), IL-2(interleukin-2), IL-4(interleukin-4)및 IL-10(interleukin-10) 각각의 양을 ELISA에 의해 측정했다.
또한, TNFα, IFNγ 및 IL-2는, Th1형 T세포가 산생하는 사이토카인이고, IL-4 및 IL-10은 Th2형 T세포가 산생하는 사이토카인이다.
결과를 도29에 나타낸다. 아래의 결과가 얻어졌다.
(1) TNFα, IFNγ 및 IL-2의 산생유도에 대해서는, 도너 사이에서의 차위는 인정되지 않았다.
(2) TNFα 및 IFNγ에 대해서는, 항 CD3 항체 단독에 의한 자극으로도 양자의 산생유도가 인정되었다.
(3) 항 CD3 항체 단독 자극에 의한 TNFα 및 IFNγ 각각의 산생유도의 정도에 비해, 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체에 의한 자극 및 항 CD3 항체 및 항 AILIM 항체에 의한 자극의 어느 자극에 의해서도, TNFα 및 IFNγ 각각의 산생유도가 상가적(相加的)으로 상승했다.
(4) IL-2에 대해서는, 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체에 의한 자극, 항 CD3 항체 및 항 AILIM 항체에 의한 자극 및 항 CD3 항체, 항 CD28 항체 및 항 AILIM 항체에 의한 자극에 의해 그 산생이 유도되었다. 또한, 항 CD3 항체, 항 CD28 항체 및 항 AILIM 항체에 의한 자극에 의해 가장 높은 IL-2의 산생유도가 인정되었다.
(5) Th2 사이토카인인 IL-4 및 IL-10에 대해서는, 그들 산생유도에 도너 사이의 차위가 인정되었다. 이는, 인간 개체사이에서의 구성 T세포의 차위를 반영하고 있을 가능성이 추찰되었다.
(6) IL-4에 대해서는, 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체에 의한 자극, 항 CD3 항체 및 항 AILIM 항체에 의한 자극 및 항 CD3 항체, 항 CD28 항체 및 항 AILIM 항체에 의한 자극에 의해 그 산생이 유도되었다. 또한, 항 CD3 항체, 항 CD28 항체 및 항 AILIM 항체에 의한 자극에 의해 가장 높은 IL-4의 산생유도가 인정되었다.
(7) IL-10에 대해서는, 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체에 의한 자극, 항 CD3 항체 및 항 AILIM 항체에 의한 자극 및 항 CD3 항체, 항 CD28 항체 및 항 AILIM 항체에 의한 자극에 의해 그 산생이 유도되었다. 또한, 항 CD28 항체 및 항 AILIM 항체에 의한 자극에 의해, IL-10의 현저한 산생유도가 인정되었다. 더욱이, 항 CD3 항체, 항 CD28 항체 및 항 AILIM 항체의 3항체에 의한 자극에 의해 가장 높은 IL-10의 산생유도가 인정되었다.
상기 시험의 결과는, 플레이트에 코팅한 항 CD3 항체가 항원제시세포상의 MHC로서 작용하고, 동 코팅한 항 AILIM 항체가 AILIM의 리간드로서 작용하여, 결과로서, 가한 T세포의 세포내에, T세포의 활성화에 필요한 제1시그날과 부자극 시그날(코스티뮬레이토리 시그날)이 전달된 것을 나타내고 있다.
<3-3> CD3를 매개로 한 시그날에 의해 유도된 T세포반응으로서의 사이토카인산생 유도의 항 AILIM 항체에 의한 억제
T세포를, 항 CD3 항체를 코팅한 마이크로 플레이트중에서 배양함으로써 유도되는 T세포반응으로서의 IFNγ 및 IL-4의 산생유도를, 항 AILIM 항체 및 항 CD28 항체 각각이 억제하는지의 여부를 검토했다.
항 CD3 항체만을 코팅한 마이크로 플레이트에, 말초혈 유래 T세포, 흉선 유래 T세포 또는 비장 유래 T세포를 뿌리고, 이어서 항 AILIM 항체(각종 농도), 항 CD28 항체(각종 농도) 또는 CTLA4-IgFc(대조) 어느 것인가를 가하여, 배양상청중의 IFNγ 또는 IL-4의 양을 상기 <3-1>의 방법에 따라 해석했다.
결과를 도11, 도12, 도13 및 도14에 나타낸다.
항 CD3 항체에 의한 자극에 의해 유도되는 말초혈 유래 T세포로부터의 IFNγ 및 IL-4의 산생 어느 것도, 항 AILIM 항체의 첨가에 의해 유의하게 억제되었다(도11 및 도12). 또한, 항 AILIM 항체의 첨가에 의해 세포증식도 억제되었다. 한편, 항 CD28 항체의 첨가에서는, 사이토카인산생의 억제 및 세포증식의 억제 어느 것도 인정되지 않았다.
항 CD3 항체에 의한 자극에 의해 유도되는 흉선 유래 T세포로부터의 IL-4의 산생은, 항 AILIM 항체의 첨가에 의해 현저히 저해되었다(도13). 또한, 항 AILIM 항체의 첨가에 의해 세포증식도 억제되었다. 한편, 대조로서의 CTLA4-IgFc의 첨가에 의해서는, IL-4 산생의 유의한 억제 및 세포증식의 억제는 인정되지 않았다.
항 CD3 항체에 의한 자극에 의해 유도되는 비장 유래 T세포로부터의 IL-4의 산생은, 항 AILIM 항체의 첨가에 의해 현저히 저해되었다(도14). 또한, 항 AILIM 항체의 첨가에 의해 세포증식도 억제되었다. 한편, 대조로서의 CTLA4-IgFc의 첨가에 의해서는, IL-4 산생의 유의한 억제 및 세포증식의 억제는 인정되지 않았다.
<3-4> 항 CD3 항체와 항 AILIM 항체에서의 T세포내로의 코스티뮬레이토리 시그날전달에 의한 T세포의 세포증식 유도의 해석
T세포는, T세포 수용체를 매개로 하는 1차시그날 및 CD28이나 CTLA-4 등의 코스티뮬레이토리 분자를 매개로 하는 부시그날을 받음으로써 증식한다.
상기 <3-1>의 시험방법에 따라, 정상인의 말초혈 유래 T세포, 마우스 비장세포, 마우스 비장 유래 T세포 및 쥐 림프절 T세포 각각을 사용하여, 여러 가지 항체자극에 의한 세포증식의 유도를 해석했다.
<3-4-1> 인간 말초혈 유래 T세포의 증식 유도
(1) 항 CD3 항체(클론 OKT3; 200 ng/well; Ortho Diagnostic Systems제)만을 코팅한 마이크로 플레이트, (2) 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체(클론 CD28.2; 여러 농도; Pharmingen제)를 코팅한 마이크로 플레이트, (3) 항 CD3 항체(200 ng/well) 및 항 AILIM 항체(클론 SA12; 각종 농도)를 코팅한 마이크로 플레이트 및 (4) 항CD3 항체(200 ng/well), 항 인간 AILIM 항체(여러 농도) 및 항 CD28 항체(1 ㎍/well)로 코팅한 마이크로 플레이트의 각각에, 인간 말초혈 유래 T세포를 가해 배양하여, 세포증식의 정도를, 일반적인 방법에 따라 3중수소 표지 티미딘(3H-TdR) 함입 시험에 의해 경시적으로 평가했다.
결과를 도30에 나타낸다. 본 시험에 의해 아래의 결과가 얻어졌다.
(i) 인간 말초혈 유래 T세포는, 상기 (2) 내지 (4) 중 어느 하나의 자극에 의해서도 유의하게 증식했다. 또한, 상기 증식은, 플레이트에 코팅한 항 AILIM 항체 또는 항 CD28 항체의 농도에 의존하는 것이었다.
(ii) T세포의 최대증식 유도활성은, 상기 (2) 내지 (4) 중 어느 하나의 항체코팅 플레이트에 의한 자극이더라도 거의 동일한 정도였다.
이어서, 상기 각종 항체의 자극에 의한 인간 말초혈 유래 T세포의 경시적인 증식 유도활성을 검토하기 위해, 하기 (5), (6) 및 (7)의 마이크로 플레이트를 사용하여 상기와 동일하게 하여 T세포 증식의 정도를 측정했다.
(5) 항 CD3 항체(200 ng/well) 및 항 CD28 항체(1 ㎍/well)를 코팅한 마이크로 플레이트, (6) 항 CD3 항체(200 ng/well) 및 항 AILIM 항체(1 ㎍/well)를 코팅한 마이크로 플레이트 및 (7) 항 CD3 항체(200 ng/well), 항 인간 AILIM 항체(1 ㎍/well) 및 항 CD28 항체(1 ㎍/well)로 코팅한 마이크로 플레이트.
결과를 도31에 나타낸다.
T세포의 증식은, 어느 조합의 항체에 의한 자극에 있어서도 자극후 18시간째이후에서 인정되었다. 항체에 의한 자극후 40시간에 있어서는, 항 CD3 항체와 항체 CD28 항체와의 조합에 의한 자극(상기(5))에 있어서 가장 강한 T세포의 증식유도가 인정됐지만, 해당 조합에 의한 T세포 증식 유도활성은 이미 평형에 달해 있었다.
한편, 항 CD3 항체와 항 AILIM 항체에 의한 자극(상기(6)) 및 3종류의 항체에 의한 자극(상기(7))에서의 T세포의 증식 유도활성은, 자극후 60시간째에 피크가 인정되었다. 또한, 이들 2개의 조합에 의한 자극후 60시간째의 T세포의 증식 유도활성은, 항 CD3 항체와 항 CD28 항체의 조합에 의한 그것 보다도 유의하게 높은 것이었다.
<3-4-2> 마우스 비장세포 및 마우스 비장 유래 T세포의 증식유도
<3-4-2-1> 항체고정화 마이크로 플레이트에서의 세포 증식유도
96웰 마이크로 플레이트를 항 CD3 항체(클론 145-2C11; Pharmingen제; 50 ng/well)로 코팅했다. 이어서, 상기 플레이트를 각종 농도의 항 마우스 AILIM 항체(클론 B10.5) 또는 대조항체인 항 NP-KLH 항체로 코팅했다. 각각의 항체에, 마우스 비장세포 및 마우스 비장 유래 T세포의 각각을 가해 배양하여, 일반적인 방법에 따라 3중수소 표지 티미딘(3H-TdR) 함입 시험에 의해 세포증식의 정도를 측정했다.
또한, 대조항체인 항 NP-KLH 항체의 조제를 위한 항원으로서는, KLH(keyhole limpet hemocyanin, 피어스(PIERCE)사제)에 합텐(hapten)인 NP(Nitrophenol)를 결합시킨 NP-KLH를 사용했다.
결과를 도32에 나타낸다.
마우스 비장세포 및 마우스 비장 유래 T세포의 어느 것도, 대조항체인 항 NP-KLH 항체의 자극에 의해서는 증식이 인정되지 않았다. 한편, 어느 세포에 있어서도, 항 AILIM 항체의 자극에 의해 항 AILIM 항체의 농도 의존적으로 유의한 증식이 인정되었다.
<3-4-2-2> 항체고정화 마이크로 비드에서의 세포 증식유도(그 첫번 째)
항체를 고정화 하는 담체로서 마이크로 플레이트 대신에 라텍스 마이크로 비드를 사용하여 상기와 동일한 세포 증식시험을 행했다.
D-PBS중에서, 1×107개의 비드당, (1) 1 ㎍/ml의 항 CD3 항체(클론 145-2C11; Pharmingen제)와 각종 농도의 항 AILIM 항체(클론 B10.5), 또는 (2) 1 ㎍/ml의 항 CD3 항체와 각종 농도의 항 NP-KLH 항체를 가해 1시간 이상 반응시켜, D-PBS로 세정하고 항체를 비드에 고정화했다.
96웰 마이크로 플레이트를 사용하여, 10% FCS 함유 RPMI1640 배지중에 분산시킨 C57BL/6 마우스의 비장세포(1×105/well)에, 상기 비드(1×105개/well)를 가하여 56시간 반응시켰다. 반응후의 세포증식의 정도를, 일반적인 방법에 따라 3중수소 표지 티미딘(3H-TdR) 함입 시험에 의해 세포증식의 정도를 측정했다.
결과를 도33에 나타낸다.
C57BL/6 마우스 비장세포는, 항 CD3 항체와 항 AILIM 항체에 의한 자극 및 항 CD3 항체와 항 CD28 항체에 의한 자극의 어느 것에 의해서도 증식이 유도되었다. 또한, 세포증식의 정도는, 비드에 고정화한 항 AILIM 항체 또는 항 CD28 항체농도의 증대(항 CD3 항체의 농도에 대한 항 AILIM 항체 또는 항 CD28 항체농도 비율의 증대)에 의존하여 상승했다. 또한, 세포증식의 정도는, 항 CD3 항체의 농도와 항 AILIM 항체농도의 비율 및 항 CD3 항체의 농도와 항 CD28 항체 농도의 비율이 모두 1:9에 있어서 최대였다.
<3-4-2-3> 항체고정화 마이크로 비드에서의 세포 증식유도(그 두번 째)
상기 <3-4-2-2>의 결과를 토대로, 항 CD3 항체의 농도와 항 AILIM 항체의 농도비율 및 항 CD3 항체의 농도와 항 CD28 항체의 농도비율이 모두 1:9의 조건에서 항체코팅한 라텍스 비드를 사용하여, 상기와 동일하게 마우스 세포의 세포증식을 해석했다.
또한, 본 시험에 있어서는, 마우스 비장세포의 분산액(1×105/well)에 가하는 항체코팅 마이크로 비드의 농도를 각종 농도로 설정했다.
또한, 본 시험에 있어서는, 마우스 세포로서, BALB/C 마우스의 비장세포 및 BALB/C 마우스의 비장 유래 T세포의 각각을 사용했다.
또한, 대조로서, 항 CD3 항체만을 고정화한 마이크로 비드를 사용하여 동일하게 하여 시험을 행했다.
결과를 도34 및 도35에 나타낸다.
BALB/C 마우스 비장세포 및 BALB/C 마우스 비장 유래 T세포의 어느 것도, (1) 항 CD3 항체 단독에 의한 자극, (2) 항 CD3 항체와 항 AILIM 항체에 의한 자극및 (3) 항 CD3 항체와 항 CD28 항체에 의한 자극의 어느 것에 의해서도 증식이 유도되었다.
또한, 그 세포증식은, 세포에 가한 마이크로 비드의 농도(즉, 항체의 농도)의 증대에 의존하여 상승했다.
BALB/C 마우스 비장세포 및 BALB/C 마우스 비장 유래 T세포의 어느 것에 있어서도, 세포에 가한 마이크로 비드의 농도가 30,000개/well일 때에 최대의 세포증식이 유도되었다. 이 결과는, 항 CD3 항체와 항 AILIM 항체를 코팅한 비드를 사용한 경우도, 항 CD3 항체와 항 CD28 항체를 코팅한 마이크로 비드를 사용한 경우도 동일했다.
<3-4-3> 쥐 림프절 T세포의 증식유도
(1) 항 CD3 항체(클론 G4.18; 50 ng/well)와 항 CD28 항체(클론 JJ319; 여러 농도; Pharmingen제)를 코팅한 마이크로 플레이트, (2) 항 CD3 항체(50 ng/well) 및 항 AILIM 항체(각종 농도)를 코팅한 마이크로 플레이트 및 (3) 항 CD3 항체(50 ng/well) 및 음성 대조항체 MOPC21(여러 농도; Pharmingen제)을 코팅한 마이크로 플레이트 각각에, 10% FCS 함유 RPMI1640 배지중에 분산한 쥐 림프절 T세포(1×105개/well)를 가하여 37℃에서 44시간 배양하고, 배양종료 6시간 전에 0.5 μCi/well의 3중수소 표지 티미딘(3H-TdR)을 가했다. 배양후, 세포를 회수하여, TOPCOUNT(PACKARD제)에서 리튬 표지 티미딘(3H-TdR)의 세포로의 함입량을 측정하여, 상기 함입량을 지표로서 세포증식의 정도를 해석했다.
결과를 도36에 나타낸다. 본 시험에 의해 아래의 결과가 얻어졌다.
쥐 림프절 T세포는, 항 CD3 항체 단독에 의한 자극만으로는 증식이 유도되지 않지만, 항 CD3 항체와 항 AILIM 항체에 의한 자극 및 항 CD3 항체와 항 CD28 항체에 의한 자극의 어느 자극에 의해서도 유의하게 증식했다. 또한, 상기 증식은, 플레이트에 코팅한 항 AILIM 항체 또는 항 CD28 항체의 농도에 의존하는 것이었다.
실시예 4항 AILIM 항체에 의한 관절증의 치료효과
<4-1> 항 AILIM 항체의 복수회 투여시험
Wistar 쥐(수컷, 5주 연령, 챨스리버제)에, 유동 파라핀으로 10 mg/ml로 조제한 결핵사균(M.Tuberculosis H37Ra; Difco)을 아쥬반트로서 사용하여, 0.1 ml/마리의 농도로 미근부에 피내 투여하여(1 mg/0.1 ml/마리) 관절증을 유도했다. 아쥬반트 투여일(0일)로부터 7일후에 양 뒷쪽 지족용적을 프레시즈모미터(plethysmometer)로 측정하여, 양 뒷쪽 지족용적을 지표로 군을 나눴다(각군 8마리).
아쥬반트 투여일(0일)로부터 7일후에, 그 중의 1군에 항 쥐 AILIM 항체(JTT-2항체; JMab50이라고도 별칭한다; 20 mg/kg)를 정맥 주사했다. 상기 항체는, 첫회 투여후는 1주일에 2회의 비율로 첫회 투여로부터 20일째 까지 투여했다. 아쥬반트 투여로부터 경시적으로 양 뒷쪽 지족용적을 프레시즈모미터로 측정했다.
또한, 아쥬반트 및 항체 어느 것도 투여하지 않는 정상 쥐군(4마리) 및 음성 대조로서 항 쥐 AILIM 항체 대신에 마우스 항 인간 CETP 항체(클론 JHC1; JMab109라고도 별칭한다; 일본 특허출원 공개 제9-20800호 공보)를 동일하게 하여 투여한군을 대조로 하고, 동일하게 하여 프레시즈모미터로 양 뒷쪽 지족용적을 측정했다.
결과를 도15에 나타낸다.
놀랍게도, 항 AILIM 항체를 투여한 군에서는, 발 부음이 완전히 억제되어, 관절염을 유도하지 않은 정상 쥐군과 거의 동일한 결과였다.
<4-2> 항 AILIM 항체의 단회 투여시험(그 첫번 째)
상기에서 얻은 결과를 토대로, 항 AILIM 항체의 단회 투여에 의한 관절염의 치료효과를 상기와 동일하게 하여 검토했다.
단, 본 시험에 있어서는, 항 AILIM 항체 또는 음성 대조항체의 투여는, 아쥬반트 투여일(0일)로부터 3, 5 또는 7일후에, 항 쥐 AILIM 항체(JTT-2항체; JMab50이라고도 별칭한다; 20 mg/kg) 또는 음성 대조 항 쥐 CETP 항체(JHC1; 20 mg/kg)를 1회만 정맥 주사했다.
결과를 도37에 나타낸다.
항 AILIM 항체의 투여가 단회임에도 불구하고, 아쥬반트 투여로부터 3, 5 및 7일째의 어느 단회 투여에 의해서도, 발 부음이 유의하게 억제되고, 특히 아쥬반트 투여로부터 7일째에 항 AILIM 항체를 투여한 군에서는, 발 부음이 거의 100% 억제되었다. 이 억제의 정도는, 관절염을 유도하지 않은 정상 쥐군의 값과 거의 동일했다.
<4-3> 항 AILIM 항체의 단회 투여시험(그 두번 째)
상기 <4-2>의 결과를 토대로, 본 시험에서 사용한 관절염모델에 있어서 항 AILIM 항체가 관절염 치료효과를 발휘하기 위한 항 AILIM 항체의 용량을 동일한 방법에 의해 검토했다.
본 시험에 있어서는, 아쥬반트 투여로부터 7일째에, 항 쥐 AILIM 항체(JTT-2항체; JMab50이라고도 별칭한다)를, 1, 3, 10 또는 20 mg/kg의 농도로 1회만 정맥 주사했다.
또한, 비교를 위해, JTT-2와는 별도의 항 쥐 AILIM 항체(JTT-1; JMab-49라고 별칭한다; 20 mg/kg)를 마찬가지로 단회 투여했다.
음성 대조에 대해서는, 항 쥐 CETP 항체(JHC1; 20 mg/kg)를 1회만 정맥 주사했다.
결과를 도38에 나타낸다.
항 AILIM 항체를 1, 3, 10 또는 20 mg/kg의 어느 용량으로 단회 투여한 경우에도, 발 부음이 거의 100% 억제되어, 관절염을 유도하지 않은 정상 쥐와 동일한 레벨까지 억제했다. 또한, 놀랍게도, 이 억제효과는, 지극히 저용량인 1 mg/kg에서도 발휘되고 있었다.
실시예 5항 AILIM 항체에 의한 간염의 치료효과
C57BL/6 마우스에, P.acnes(Propionibacterium acnes)의 인산 완충액(PBS)용액을 정맥 주사했다. P.acnes 투여(0일)로부터 1주일후, 상기 마우스에 LPS (Lipopolysaccaride)의 PBS 용액을 정맥 주사하여 간염을 유발했다. LPS 투여의 6.5시간 후에 안저(眼底)로부터 채혈하여, 혈장중 IFN-γ의 농도를 ELISA에 의해 측정했다. 또한, 혈장중의 GOT(glutamic-oxaloacetic transaminase) 및 GPT(glutamic-pyruvic transaminase)의 농도를 생화학 검사장치(Fara)로 측정했다.
P.acnes 투여(0일)로부터 1, 2 및 3일째에, 항 마우스 AILIM 단일클론항체(B10.5항체;5, 50, 500 ㎍/마리)를 복강내 투여하여, 항 AILIM 항체에 의한 간염의 개선효과를 평가했다.
또한, 항 마우스 AILIM 항체를 투여하지 않는 군을 대조로 했다.
결과를 도16 및 도17에 나타낸다.
항 AILIM 항체의 투여에 의해, 항체농도 의존적으로 혈중의 IFN-γ의 상승이 유의하게 억제되었다. 또한 항 AILIM 항체(50 ㎍/마리)를 투여한 경우에, GOT 및 GPT의 상승이 유의하게 억제되었다.
실시예 6항 AILIM 항체에 의한 이식편 대 숙주병(GVHD)의 치료효과
<6-1> 시험 1
BALB/c 마우스와 C57BL/6 마우스를 교배하여 얻은 F1 마우스(8~10주 연령, 3마리)에, BALB/c 마우스의 비장세포(8×107개/마리)를 정맥 주사하여 GVHD를 유도했다. 상기 비장세포 투여직후(0시간) 및 12시간 후의 각각에 항 마우스 AILIM 단일클론항체(B10.5항체; 400 ㎍/마리)를 정맥 주사하고, 상기 비장세포 투여의 24, 48 및 72시간 후의 각각에 동 B10.5항체(200 ㎍/마리)를 복강내 투여했다.
상기 비장세포 투여직후(0일), 1, 2, 3 및 6주일 후의 각각에 채혈하여, 혈청중의 IgG1, IgE 및 항 dsDNA 항체가를 일반적인 방법에 의해 측정했다. 또, 항 dsDNA 항체가의 단위는, 자기면역질환 자연발증 마우스의 혈청중 항 dsDNA 항체를 스탠다드로서 표준화 했다.
또한, 항 AILIM 항체 대신에, hCTLA4-Ig(인간 CTLA4의 가용성 영역과 면역글로불린의 정상영역으로 된 융합단백)를 동일하게 하여 투여한 군을 양성 대조로 했다. 또한, 항 AILIM 항체 대신에 PBS를 동일하게 하여 투여한 군을 음성 대조로 했다.
결과를 도18, 도19 및 도20에 나타낸다.
항 AILIM 항체를 투여한 군에서는, 음성 대조군에 비해, GVH 반응(graft versus host reaction)의 지표인 혈청중 IgG의 상승, IgE의 상승 및 항 dsDNA 항체가의 상승이 유의하게 억제되었다. 또한, 그 억제의 효과는, hCTLA4-Ig를 투여한 양성 대조군의 값과 거의 동등했다.
<6-2> 시험 2
BALB/c 마우스와 C57BL/6 마우스를 교배하여 얻은 F1 마우스(8~10주 연령, 3마리)에, BALB/c 마우스의 비장세포(1×108개/마리)를 정맥 주사하여 GVHD를 유도했다. 상기 비장세포 투여직후(0시간) 및 12시간 후의 각각에 항 마우스 AILIM 단일클론항체(B10.5항체; 200 ㎍/마리)를 정맥 주사하고, 상기 비장세포 투여의 24, 48 및 72시간 후의 각각에 동 B10.5항체(100 ㎍/마리)를 복강내 투여했다.
상기 비장세포 투여직후(0일), 1, 2, 3, 6, 9 및 12주일 후의 각각에 채혈하여, 혈청중의 IgG1, IgE 및 항 dsDNA 항체가를 일반적인 방법에 의해 측정했다. 또한, 항 dsDNA 항체가의 단위는, 자기면역질환 자연발증 마우스의 혈청중 항 dsDNA 항체를 스탠다드로서 표준화 했다.
또한, 항 AILIM 항체 대신에, hCTLA4-Ig(인간 CTLA4의 가용성 영역과 면역글로불린의 정상영역으로 된 융합단백)를 동일하게 하여 투여한 군을 양성 대조로 했다. 또한, 항 AILIM 항체 대신에 PBS를 동일하게 하여 투여한 군을 음성 대조로 했다.
결과를 도39, 도40 및 도41에 나타낸다.
항 AILIM 항체를 투여한 군에서는, 음성 대조군에 비해, GVH 반응(graft versus host reaction)의 지표인 혈청중 IgG의 상승, IgE의 상승 및 항 dsDNA 항체가의 상승이 유의하게 억제되었다. 또한, 그 억제의 효과는, hCTLA4-Ig를 투여한 양성 대조군의 값과 거의 동등했다.
실시예 7항 AILIM 항체에 의한 항 외래항원 항체산생의 억제효과
<7-1> 양 적혈구(SRBC)로 면역감작한 마우스에서의 항 SRBC 항체산생의 항 AILIM 항체에 의한 억제효과
BALB/c 마우스(암컷, 5주 연령)에, 양 적혈구(SRBC; Sheep red blood cell; 1×108개/마리)를 정맥 주사했다. SRBC 투여(0일)직후 또는 SRBC 투여로부터 7일후에 항 마우스 AILIM 단일클론항체(B10.5항체; 50 또는 500 ㎍/마리)를 정맥 주사했다. SRBC 투여로부터 경시적으로 채혈하여 혈청중의 항 SRBC 항체의 산생량을 일반적인 방법에 따라 ELISA에 의해 측정했다.
또한, 항 AILIM 항체 대신에, hCTLA4-Ig(인간 CTLA4의 가용성 영역과 면역글로불린의 정상영역으로 된 융합단백)를 동일하게 하여 투여한 군을 양성 대조로 했다. 또한, 항 AILIM 항체 대신에 PBS를 동일하게 하여 투여한 군을 음성 대조로 했다.
결과를 도21 및 도22에 나타낸다.
항 AILIM 항체를 투여한 군에서는, 상기 항체를 SRBC에 의한 감작직후 투여한 군에 있어서도 또한 7일에 투여한 군에 있어서도, 음성 대조군에 비해, 외래항원으로서의 SRBC에 특이적인 IgG 항체의 산생이 유의하게 억제되었다. 또한, 그 억제효과는, hCTLA4-Ig를 투여한 양성 대조군의 값 보다도 높은 것이었다.
한편, hCTLA4-Ig를 투여한 군에서는, 상기 hCTLA4-Ig를 SRBC에 의한 감작직후에 투여한 군에서는, 음성 대조에 비해 항 SRBC 항체의 산생이 유의하게 억제되었지만, SRBC 감작으로부터 7일후의 투여에서는 유의한 억제는 보이지 않았다.
<7-2> NP-KLH로 면역감작한 마우스에서의 항 NP-KLH 항체산생의 항 AILIM 항체에 의한 억제효과
C57BL/6 마우스에, CFA(완전 프로인드 아쥬반트) 및 NP-KLH(KLH(keyhole limpet hemocyanin)에 합텐인 NP(Nitrophenol)를 결합시킨 것. 100 ㎍/마우스)를 복강내 투여했다. 상기 항원의 투여직후(0시간) 및 12시간 후의 각각에, 항 마우스 AILIM 항체(클론 B10.5 또는 B9.B6의 어느 것인가; 200 ㎍/마우스)를 꼬리정맥에 투여했다. 또한, 상기 항원 투여로부터 24 및 48시간 후의 각각에 상기 항 AILIM 항체의 어느 것인가를 복강내 투여했다.
NP-KLH 투여로부터 경시적으로 채혈하여 혈청중의 NP-KLH에 특이적인 항체(IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgM의 각각)의 산생량을 일반적인 방법에 따라 ELISA에 의해 측정했다. 또한, 상기 ELISA에는, NP를 결합시킨 소혈청 알부민(BSA)을 포착 항원(capture antigen)으로서 사용했다.
또한, 음성 대조로서는, 인산 완충액을 사용하고, 또 양성 대조로서는, hCTLA4-Ig(인간 CTLA4의 가용성 영역과 면역글로불린의 정상영역으로 된 융합단백)를 사용하여 상기와 동일하게 하여 시험했다.
결과를 도42, 도43, 도44, 도45 및 도46에 나타낸다.
음성 대조항체의 투여군에서는, 항 NP-KLH 항체의 산생이 경시적으로 상승하고 있어, 상기 음성 대조항체는 항 NP-KLH 항체의 산생을 억제하지 않았다.
한편, 항 AILIM 항체 투여군에서는, 항 NP-KLH 항체의 산생도 유의하게 억제되어, 이 억제효과는, 양성 대조인 CTLA4-IgFc에 의한 항 NP-KLH 항체의 억제효과와 거의 동일했다.
또한, 항 AILIM 항체 투여군에서는, IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgM의 어느 항체 클래스에 속하는 항 NP-KLH 항체의 산생도 유의하게 억제되었다.
실시예 8항 AILIM 항체의 혼합 림프구반응(MLR)의 제어활성의 해석
항 AILIM 항체가, T 세포반응(IFN-γ이나 IL-4 등의 사이토카인의 산생 및 세포증식 등)을 제어(촉진 및/또는 억제)하는 능력을 갖는지의 여부, 즉 AILIM을 매개로 한 코스티뮬레이토리 시그날(co-stimulatory signal)의 세포내로의 전달 제어능을 갖는지의 여부를, 알로제닉 혼합 림프구반응(allogenic mixed lymphocyte reaction; allogenic MLR)에 있어서의 T세포의 증식(즉, 세포내에서의 DNA 합성)을 제어하는 활성의 유무를 지표로 해석했다.
<8-1> 인간 PBMC 및 T세포의 조제
정상인(7명; 도너 A, B, C, D, E, F 및 G)의 각각으로부터 채취한 각각의 말초혈(200 ml)을, 마이크로 튜브(50 ml; Falcon제)에 분주한 Lymphoprep(15 ml; Nycomed제)에 중층했다. 이어서, 원심분리(1600회전, 10분)후, 중간층을 회수했다. 회수한 세포를, 인산 완충액으로 2배 이상으로 희석한 후, 원심분리(1,800회전, 10분)하여, PBMC(말초혈 단핵구세포; 2×108∼5×108세포)를 조제했다. 혈구계수판을 사용하여 세포수를 계수하고, MLR 시험에 필요한 세포수(1.08×108세포/9 마이크로 플레이트)를 분취하여, 빙상에 보존했다. 나머지 세포는, 이하의 T 세포의 분리에 사용했다.
PBMC으로부터의 T세포의 분리에는, PanT Isolation 키트(Miltenyi Biotech 제)를 사용했다. 상기 키트 첨부의 실험조작 메뉴얼에 따라, 상기 나머지 PBMC를, 상기 키트에 부속의 용액에 첨가하여, 반응시켰다. 이어서, 세포를 5 mM의 EDTA 및 0.5% BSA 함유 PBS로 세정한 후, 상기 PBS중에 재현탁했다. 이어서, 상기 세포현탁액을, 상기 PBS로 팽윤시킨 Positive Selection Column VS+(Miltenyi Biotech제)에 첨가하여, 비흡착 획분을 회수했다. 또한, 상기 컬럼에 상기 PBS를 첨가하여, 세정액을 회수했다. 동일한 조작을 재차 행했다. 회수액을 합쳐, T세포 획분으로 했다. 상기 T세포 획분을, 원심한 후, 상기 PBS중에 재현탁했다. 얻어진 T세포의 세포수를, 혈구계수판을 사용하여 계수하여, 이하의 시험에 사용했다.
<8-2> 혼합 림프구반응(MLR)
앞서 말한 바와 같이, T세포 등의 림프구의 활성화에 필요한 코스티뮬레이토리 시그날의 전달경로에는, 이미 비교적 충분한 해석이 되어 있는 CD28과 CD80(B7-1)/CD86(B7-2)과의 사이의 시그날 전달경로 및 CTLA4와 CD80(B7-1)/CD86(B7-2)과의 사이의 시그날 전달경로의 2개의 경로가 알려져 있다.
즉, 혼합 림프구반응(MLR)에 있어서의 T세포의 증식은, 상기 기지의 2개의 경로를 매개로 하는 시그날전달에 의해서도 유도된다.
따라서, 본 시험에서는, 아래의 실험 대상물질을 사용하여, (1) CTLA4를 매개로 하는 시그날 전달경로의 차단에 의한 MLR의 억제, (2) CD80(B7-1)/CD86(B7-2)을 매개로 하는 시그날 전달경로의 차단에 의한 MLR의 억제 및 (3) AILIM이 담당하는 제3의 시그날 전달경로의 차단에 의한 MLR 억제의 각각에 대해서 해석했다.
아래의 것을, 실험 대상물질로서 사용했다.
(1) 항 인간 AILIM 마우스 단일클론항체 SA12(상기 실시예와 동일)
(2) 마우스 IgG 항체(항 인간 CD34; 음성 대조; Immunotech제).
(3) 항 인간 CD80 단일클론항체(Pharmingen제)와 항 인간 CD86 단일클론항체(Pharmingen제)와의 혼합물.
(4) 인간 CTLA4-IgFc 키메라분자(Ancell제).
상기 <8-1>에서 얻은 각 도너로부터 조제한 PBMC 및 T세포를 사용하여, 아래의 여섯 가지의 조합에 의한 혼합 림프구반응(MLR)을 행했다.
(i) T세포(도너 A)/PBMC(도너 D)
(ii) T세포(도너 D)/PBMC(도너 B)
(iii) T세포(도너 C)/PBMC(도너 A)
(iv) T세포(도너 E)/PBMC(도너 G)
(v) T세포(도너 F)/PBMC(도너 E)
(vi) T세포(도너 G)/PBMC(도너 F)
시험에 사용하는 PBMC 및 T세포는, 아래의 농도로 조정했다.
PBMC를 PBS중에 분산한 후, 배양접시(60 mm)로 옮겨, 방사선 조사장치(히타치 메디코제)로 X선 조사(50 Gy)했다. 세포를 회수하여 원심한 후, 10% FCS 함유 RPMI1640 배지에 가하여, 세포수를 2×105세포/50 ㎕로 조정했다.
또한, 상기에서 얻은 각각의 도너로부터의 T세포를, 10% FCS 함유 RPMI1640 배지에 가하여, 세포수를 1×105세포/50 ㎕로 조정했다.
<8-2-1> MLR에 대한 항 AILIM 항체에 의한 MLR의 억제
96웰 U바닥 마이크로 플레이트의 각웰에 10% FCS 함유 PRMI1640배지를 가한후, 10% FCS 함유 RPMI1640 배지에서 각종 농도로 희석한 항 인간 AILIM 마우스 단일클론항체 SA12의 용액을 가했다(최종 농도: 0, 0.31, 1.25, 5 및 20 ㎍/ml). 이어서, T세포(50 ㎕)를 가하고, CO2인큐베이터(NAPCO제)내에서, 37℃로 1시간 배양했다. 반응종료후, 별도의 도너 유래의 PBMC(50 ㎕)를 가하여, MLR을 개시시켰다.
또한, 실험 대상물질로서 항 인간 AILIM 항체 이외의 것을 사용한 경우의 MLR은, PBMC와 상기 실험 대상물질과의 배양후에, 별도의 도너 유래의 T세포를 가하여 반응을 행했다.
배양 5일째에, 각웰에, 10% FCS 함유 RPMI1640 배지에서 희석한 3중수소 표지 티미딘(3H-Thymidine; 20 ㎕; 1μCi/well)을 첨가한 후 1일 더 배양하고, 배양후, Cell Harvester(Packard제)를 사용하여 세포를 회수하여, β카운터(TOP COUNT; Packard제)를 사용하고, 세포에 넣어져 있는3H의 방사활성을 측정하여, 배양후 T세포증식의 정도를 해석했다.
결과를 도47, 도48, 도49, 도50, 도51 및 도52에 나타낸다.
이 결과, 아래의 사항이 명백해졌다.
(1) CTLA4-IgFc는, CTLA-4를 매개로 하는 시그날전달을 차단함으로써 알로제닉 MLR에 의한 T세포의 증식을 억제한다.
(2) 항 CD80 항체 및 항 CD86 항체는, CTLA4 및 CD28의 리간드인 CD80/CD86을 매개로 하는 시그날전달을 저해함으로써 알로제닉 MLR에 의한 T세포의 증식이 억제된다.
(3) CTLA4-IgFc, 항 CD80 항체 및 항 CD86 항체와 마찬가지로, 인간 AILIM 에 대한 항체가 항체농도 의존적으로, AILIM을 매개로 하는 시그날전달에 의한 알로제닉 MLR에서의 T세포의 증식을 유의하게 억제한다.
(4) 항 AILIM 항체에 의한 MLR의 억제는, 어느 도너 유래의 PBMC 및 T세포에서의 조합에 있어서도 유의하게 인정된다.
이 결과는, 즉, T세포의 활성화에 필요한 코스티뮬레이토리 시그날의 전달경로에는, 기지의 CTLA4/CD80/CD86을 매개로 하는 경로 및 CD28/CD80/CD86을 매개로하는 경로 외에, AILIM과 그 리간드를 매개로 하는 제3의 경로가 존재하는 것 및 상기 AILIM을 매개로 하는 시그날 전달경로가, AILIM에 대한 항체에 의해 저해되는 것을 나타내는 것이다.
더욱이, 상기 시그날전달에 있어서의 AILIM을 매개로 하는 경로의 공헌도는, CTLA4/CD80/CD86을 매개로 하는 경로 및 CD28/CD80/CD86을 매개로 하는 경로의 그것과 동일한 정도일 가능성이 나타내어졌다.
본 발명의 의약조성물은, T세포 등의 림프구의 활성화 및 활성화 림프구의 기능제어의 이상에 기인하는 아래에 들 수 있는 여러 가지 자기면역성 질환, 알레르기성 질환 또는 염증성 질환의 치료 및 예방에 유용하다.
상기 질환으로서는 예를 들면, 관절증(예를 들면, 관절류마치스, 변형성 관절증 등), 염증(예를 들면, 뇌염, 기관지염, 혈관염, 폐렴, 간염, 심근염, 췌장염, 장염, 위염, 복막염, 신장염(사구체신장염 등), 관절염(관절류마치스 등), 허혈후 재관류장해(심근허혈 재관류장해 등)에 있어서의 염증, 이식후 면역거절에 기인하는 염증, 염증성 장질환, 화상, 다발성 장기장해에 있어서의 염증, PTCA나 PTCR술후에 있어서의 염증 및 동맥경화증에 동반되는 염증 등), 세균이나 바이러스에 의한 감염에 의해 야기되는 여러 가지 증상(예를 들면, 염증), 이식편 대 숙주반응, 조직이나 장기의 이식에 동반되는 면역 거절반응, 외래항원에 의한 면역감작에 의해 야기되는 상기 항원에 대한 항체의 과잉산생을 동반하는 여러 가지 질환, 다발성 경화증, 자기면역성 갑상선염, 여러 가지의 피부질환(예를 들면, 알레르기성 접촉성 피부염, 만성 염증성 피부질환인 편평태선, 건선, 강피증), 전신성 에리테마토데스 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 의약조성물에 포함되는 AILIM에 대한 인간항체를 포함하여 된 의약조성물은, 마우스 유래의 항체를 인간에게 투여할 때의 알레르기 등의 부작용을 전혀 야기하지 않는 것으로부터 의약품으로서 지극히 유용하다.

Claims (16)

  1. 하기 군으로부터 선택되는 어느 하나 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 되는 관절증을 억제, 치료 또는 예방하기 위한 의약조성물:
    a) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖고, AILIM의 세포외 영역의 전부 또는 일부로 된 폴리펩티드;
    b) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖고, AILIM의 세포외 영역의 전부 또는 일부와 면역글로불린의 중쇄의 정상영역의 전부 또는 일부로 된 융합 폴리펩티드;
    c) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖고, AILIM에 결합하는 폴리펩티드;
    d) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖는 DNA;
    e) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖는 RNA; 또는
    f) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성이, AILIM 발현세포의 증식을 억제하는 활성 또는 AILIM 발현세포에 의한 사이토카인의 산생을 억제하는 활성인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 사이토카인이, Th1 타입의 T세포가 산생하는 사이토카인인 인터페론γ이던가, 또는 Th2 타입의 T세포가 산생하는 사이토카인인 인터루킨4인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관절증이 관절류마치스인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관절증이 변형성 관절증인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  6. 하기 군으로부터 선택되는 어느 하나 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 되는 염증을 억제, 치료 또는 예방하기 위한 의약조성물:
    a) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖고, AILIM의 세포외 영역의 전부 또는 일부로 된 폴리펩티드;
    b) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖고, AILIM의 세포외 영역의 전부 또는 일부와 면역글로불린의 중쇄의 정상영역의 전부 또는 일부로 된 융합 폴리펩티드;
    c) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖고, AILIM에 결합하는 폴리펩티드;
    d) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖는 DNA;
    e) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖는 RNA; 또는
    f) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성이, AILIM 발현세포의 증식을 억제하는 활성 또는 AILIM 발현세포에 의한 사이토카인의 산생을 억제하는 활성인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 사이토카인이, Th1 타입의 T세포가 산생하는 사이토카인인 인터페론γ이던가, 또는 Th2 타입의 T세포가 산생하는 사이토카인인 인터루킨4인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증이 간염인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  10. 하기 군으로부터 선택되는 어느 하나 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 되는 이식편 대 숙주반응, 이식편 대 숙주반응 또는 조직 또는 장기의 이식에 동반되는 면역 거절반응을 억제, 치료 또는 예방하기 위한 의약조성물:
    a) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖고, AILIM의 세포외 영역의 전부 또는 일부로 된 폴리펩티드;
    b) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖고, AILIM의 세포외 영역의 전부 또는 일부와 면역글로불린의 중쇄의 정상영역의 전부 또는 일부로 된 융합 폴리펩티드;
    c) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖고, AILIM에 결합하는 폴리펩티드;
    d) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖는 DNA;
    e) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖는 RNA; 또는
    f) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성이, AILIM 발현세포의 증식을 억제하는 활성 또는 AILIM 발현세포에 의한 사이토카인의 산생을 억제하는 활성인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 사이토카인이, Th1 타입의 T세포가 산생하는 사이토카인인 인터페론γ이던가, 또는 Th2 타입의 T세포가 산생하는 사이토카인인 인터루킨4인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  13. 하기 군으로부터 선택되는 어느 하나 및 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하여 되는 외래항원 또는 자기항원에 의해 야기되는 면역반응을 억제하기 위한의약조성물:
    a) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖고, AILIM의 세포외 영역의 전부 또는 일부로 된 폴리펩티드;
    b) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖고, AILIM의 세포외 영역의 전부 또는 일부와 면역글로불린의 중쇄의 정상영역의 전부 또는 일부로 된 융합 폴리펩티드;
    c) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖고, AILIM에 결합하는 폴리펩티드;
    d) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖는 DNA;
    e) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖는 RNA; 또는
    f) AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 AILIM을 매개로 하는 시그날 전달을 제어하는 활성이, AILIM 발현세포의 증식을 억제하는 활성 또는 AILIM 발현세포에 의한 사이토카인의 산생을 억제하는 활성인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 사이토카인이, Th1 타입의 T세포가 산생하는 사이토카인인 인터페론γ이던가, 또는 Th2 타입의 T세포가 산생하는 사이토카인인 인터루킨4인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  16. 제13항에 있어서, 상기 면역반응이, 상기 항원에 대한 항체의 산생, 세포증식, 또는 사이토카인의 산생인 것을 특징으로 하는 의약조성물.
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